CN107641647A

CN107641647A - Acat1基因及acat1基因或蛋白的干扰物的应用和应用干扰物的产品

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Publication number: CN107641647A
Application number: CN201710945927.6A
Authority: CN
Inventors: 郭磊
Original assignee: Hangzhou Plieux Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Beijing Baiti Biotechnology Co ltd
Priority date: 2017-10-11
Filing date: 2017-10-11
Publication date: 2018-01-30
Anticipated expiration: 2037-10-11
Also published as: CN107641647B

Abstract

本发明提供了一种ACAT1基因及ACAT1基因或蛋白的干扰物的应用和应用干扰物的产品，涉及医学工程技术领域，本发明提供的ACAT1基因通过实验发现在IgA肾病患者肾脏病变区域中表达急剧上升，通过对ACAT1基因进行特异性检测能够达到诊断肾脏疾病的目的。同时，ACAT1的干扰物具有抑制ACAT1基因或蛋白表达的作用，将ACAT1基因的干扰物作为药物，能够起到预防和/或治疗IgA肾病的作用。因此，ACAT1基因可以作为一种新的生物标志物，应用于肾脏疾病的诊断；而与之相对应的ACAT1基因或蛋白的干扰物，可以作为一种新型的药物，对IgA肾病具有潜在的预防和治疗价值。

Description

ACAT1基因及ACAT1基因或蛋白的干扰物的应用和应用干扰物的产品

技术领域

本发明涉及医学工程技术领域，尤其是涉及一种ACAT1基因及ACAT1基因或蛋白的干扰物的应用和应用干扰物的产品。

背景技术

IgA肾病是最为常见的一种原发性肾小球疾病，是指肾小球系膜区以IgA或IgA沉积为主，伴或不伴有其他免疫球蛋白在肾小球系膜区沉积的原发性肾小球病。病变类型包括局灶节段性病变、毛细血管内增生性病变、系膜增生性病变、新月体病变及硬化性病变等。其临床表现为反复发作性肉眼血尿或镜下血尿，可伴有不同程度蛋白尿，部分患者可以出现严重高血压或者肾功能不全。近年来，IgA肾病及其引起的终末期肾病发病率逐年提高，成为危害公众健康的重大公共卫生问题。并且，早、中期很多患者几乎无任何症状、体征。有些患者往往在作例行体检，或因其他疾病时作常规检查时被其他专业的医师发现，因此，对早期IgA肾病的诊断往往因其操作繁琐成本较高而被忽视。IgA肾病患者胰岛素抵抗现象备受关注。胰岛素抵抗可以引起患者血脂和血糖代谢紊乱，这些紊乱已被证明能增加IgA肾病患者心血管疾病的危险性，导致死亡率增加。

研究认为游离脂肪酸(free fatty acid，FFA)、细胞因子与胰岛素抵抗密切相关。研究表明，胰岛素抵抗可以通过下列机制导致肾损害：①使血压的钠敏感性增加，肾小球内压力增高，从而导致微量白蛋白尿。②促进胰岛素样生长因子(insulin-like growthfactor-1，IGF-1)、转化生长因子-β1(Transforming Growth Factor-β1，TGF-β1)、结缔组织生长因子(connective tissue growth fac-tor，CTGF)、纤溶酶原激活抑制物-1(plasminogen ac-tivator inhibitor-1，PAI-1)等物质分泌而加重肾损害。③激活肾素-血管紧张素系统(renin-angioten-sin system，RAS)，改变血管内皮细胞内皮素-1(en-dothelin，ET-1)和一氧化氮(nitric oxide，NO)的比例加重肾损害。④激活氧化应激反应加重肾损害。

酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶(ACATs)是唯一在人体细胞内合成胆固醇酯的酶，能够催化游离胆固醇和长链脂肪酸形成胆固醇酯，主要在胆固醇的吸收、转运和贮存等方面起到调节血脂的作用。哺乳动物有两种ACATs酶：ACAT1和ACAT2。ACAT1(酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶1)存在于人体内几乎所有细胞中，巨噬细胞以及分泌类固醇激素的细胞中ACAT1的表达最为丰富。

目前，IgA肾病仍然存在预后差、花费高的问题，现代医学尚无逆转或阻断IgA肾病进展的特效药物和满意方法。而调控ACAT1的表达与治疗IgA肾病之间的关联，国内外尚未见报道。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供ACAT1基因在制备用于诊断肾脏疾病的产品中的应用，本发明的第二个目的在于提供一种用于诊断肾病的试剂盒，以缓解现有技术中存在的对肾脏疾病的诊断操作繁琐且成本较高的技术问题。本发明的第三个目的在于提供ACAT1的干扰物在制备预防和/或治疗IgA肾病的产品中的应用，本发明的第四个目的在于提供一种用于预防和/或治疗肾脏疾病的药物，以缓解现有技术中存在的治疗IgA肾病预后差、花费高，现代医学尚无逆转或阻断IgA肾病进展的特效药物和满意方法的技术问题。

本发明提供了ACAT1基因在制备用于诊断肾脏疾病的产品中的应用，所述ACAT1基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

进一步的，所述肾脏疾病为IgA肾病。

进一步的，所述产品为试剂盒。

本发明还提供了一种用于诊断肾病的试剂盒，所述试剂盒包括用于特异性检测ACAT1基因的引物；

所述ACAT1基因的上游引物具有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，所述ACAT1基因的下游引物具有如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。

本发明还提供了如下(1)或(2)所述的ACAT1的干扰物在制备预防和/或治疗IgA肾病的产品中的应用：

(1)用于抑制ACAT1基因转录或表达的核糖核酸；

(2)用于抑制ACAT1蛋白活性的蛋白质或小分子化合物。

进一步的，所述产品为药物。

另外，本发明还提供了一种用于预防和/或治疗肾脏疾病的药物，所述药物包括如下(1)或(2)中所述的ACAT1的干扰物：

(1)用于抑制ACAT1基因转录或表达的核糖核酸；

(2)用于抑制ACAT1蛋白活性的蛋白质或小分子化合物。

进一步的，所述用于抑制ACAT1基因转录或表达的核糖核酸为siRNA或shRNA。

进一步的，所述用于抑制ACAT1基因转录或表达的核糖核酸具有如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的正义链和如SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的反义链。

进一步地，所述用于抑制ACAT1蛋白活性的蛋白质具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。

本发明提供的ACAT1基因通过实验发现在IgA肾病患者肾脏病变区域中表达急剧上升，通过对ACAT1基因进行特异性检测能够达到诊断肾脏疾病的目的。同时，ACAT1的干扰物具有抑制ACAT1基因或蛋白表达的作用，将ACAT1基因的干扰物作为药物，能够起到预防和/或治疗IgA肾病的作用。因此，ACAT1基因可以作为一种新的生物标志物，应用于肾脏疾病的诊断和/或预后评估；而与之相对应的ACAT1基因或蛋白的干扰物，可以作为一种新型的药物，对肾脏疾病具有潜在的预防和治疗价值。

附图说明

图1A为本发明实施例2提供的空白对照组细胞油红O染色的结果图；

图1B为本发明实施例2提供的PA 0.25mmol/L浓度组细胞油红O染色的结果图；

图1C为本发明实施例2提供的PA 0.5mmol/L浓度组细胞油红O染色的结果图；

图1D为本发明实施例2提供的PA 1mmol/L浓度组细胞油红O染色的结果图；

图2为本发明实施例3提供的不同浓度PA对G-401细胞ACAT1 mRNA表达的影响；

图3为本发明实施例3提供的不同浓度PA对G-401细胞ACAT1蛋白表达的影响；

图4为本发明实施例4提供的转染siRNA后ACAT1 mRNA相对表达量的结果图；

图5A为本发明实施例4提供的PA 0.25mmol/L浓度组ACAT1 mRNA沉默细胞油红O染色的结果图；

图5B为本发明实施例4提供的PA 0.5mmol/L浓度组ACAT1 mRNA沉默细胞油红O染色的结果图；

图5C为本发明实施例4提供的PA 1mmol/L浓度组ACAT1 mRNA沉默细胞油红O染色的结果图；

图6为本发明实施例5提供的转导抑制ACAT1蛋白活性的蛋白质后ACAT1蛋白表达量的结果图；

图7A为本发明实施例5提供的PA 0.25mmol/L浓度组抑制ACAT1蛋白活性细胞油红O染色的结果图；

图7B为本发明实施例5提供的PA 0.5mmol/L浓度组抑制ACAT1蛋白活性细胞油红O染色的结果图；

图7C为本发明实施例5提供的PA 1mmol/L浓度组抑制ACAT1蛋白活性细胞油红O染色的结果图；

图8A为本发明对比例1提供的PA 0.25mmol/L浓度组ACAT1抑制剂组细胞油红O染色的结果图；

图8B为本发明对比例1提供的PA 0.5mmol/L浓度组ACAT1抑制剂组细胞油红O染色的结果图；

图8C为本发明对比例1提供的PA 1mmol/L浓度组ACAT1抑制剂组细胞油红O染色的结果图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了ACAT1基因在制备用于诊断肾脏疾病的产品中的应用，其中，ACAT1基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

其中，本发明中涉及的ACAT1基因可以为：与SEQ ID NO.1所示序列完全相同的序列，或者含有SEQ ID NO.1所示序列的序列，或者SEQ ID NO.1所示序列的生物活性功能片段，或者SEQ ID NO.1所示序列的变体。凡是具备SEQ ID NO.1所示序列功能的序列，都应当理解为本发明的保护范围，而不应当仅理解为与SEQ ID NO.1所示序列完全相同的序列。

在一个优选的实施方式中，肾脏疾病为慢性肾病。

在一个更优选的实施方式中，肾脏疾病为IgA肾病。

其中，产品为试剂盒。

本发明还提供了一种用于诊断和/或预后评估肾病的试剂盒，包括用于特异性检测ACAT1基因的引物。

其中，ACAT1基因的上游引物的核苷酸序列为：

CATCGACGGCGTCTTACATTGAG(SEQ ID NO.5)；

ACAT1基因的下游引物的核苷酸序列为：

TCAGGAATTGGCCTGTCCCAAT(SEQ ID NO.6)。

本发明还提供了如下(1)或(2)中的ACAT1的干扰物在制备预防和/或治疗IgA肾病的产品中的应用：

(1)用于抑制ACAT1基因转录或表达的核糖核酸；

(2)用于抑制ACAT1蛋白活性的蛋白质或小分子化合物。

在一个优选的实施方式中，用于抑制ACAT1基因转录或表达的核糖核酸为siRNA或shRNA。

其中，用于抑制ACAT1基因转录或表达的siRNA具有如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的正义链和如SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的反义链。

需要说明的是，涉及的抑制ACAT1基因转录或表达的siRNA可以为：与SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示序列完全相同的序列，或者含有SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示序列的序列，或者SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示序列的生物活性功能片段，或者SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示序列的变体。凡是具备SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示序列功能的序列，都应当理解为本发明的保护范围，而不应当仅理解为与SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示序列完全相同的序列。

在一个优选的实施方式中，用于抑制ACAT1蛋白活性的蛋白质具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。

需要说明的是，涉及的抑制ACAT1蛋白活性的蛋白质可以为：与SEQ ID NO.4所示序列完全相同的序列，或相对于SEQ ID NO.4所示序列的序列有一个或多个氨基酸缺失、替代或增加的氨基酸序列，而不应当仅理解为与SEQ ID NO.4所示序列完全相同的序列。

在一个优选的实施方式中，用于抑制ACAT1蛋白活性的小分子化合物例如可以为，但不限于阿伐麦布、purpactins、pactimibe、CI-976、CI-999或CL-283。

需要说明的是，涉及用于抑制ACAT1蛋白活性的小分子化合物可以为上述小分子化合物中的一种或多种，或者以上述小分子化合物为有效成分的物质，或者其他可起到类似功能的物质，而不应当仅理解为上述小分子化合物单体物质本身。

其中，产品为药物。

另外，本发明还提供了一种用于预防和/或治疗肾脏疾病的药物，包括如下(1)或(2)中所述的ACAT1的干扰物：

(1)用于抑制ACAT1基因转录或表达的核糖核酸；

(2)用于抑制ACAT1蛋白活性的蛋白质或小分子化合物。

在一个优选的实施方式中，药物还包括药学上可接受的载剂或辅料。

其中，载剂例如可以为，但不限于壳聚糖、胆固醇、脂质体和纳米颗粒中的一种或多种。

药物的给药方式包括口服给药或注射给药。

其中，注射给药的方式例如可以为，但不限于静脉注射、肌肉注射、或直接胃内注射。

为了有助于更清楚的理解本发明的内容，现结合具体的实施例详细介绍如下。

实施例1人肾癌Wilms细胞(G-401)的培养

细胞培养

使用含10％胎牛血清的DMEM培养基，培养于37℃、5％CO₂的细胞培养箱中，根据细胞状态决定更换细胞培养液的时间，及时传代。

细胞传代

将培养瓶中原有的的DMEM培养液倒掉，用1mL PBS冲洗两遍，然后加入0.5mL的0.25％胰蛋白酶，盖好瓶盖后放置1min左右，以便胰蛋白酶能将贴壁细胞消化完全。之后加入4mL DMEM培养液充分吹打细胞贴附的瓶壁，使细胞完全分散并悬浮于培养液中，根据试验所需调整传代比例，放入新的培养瓶继续培养。

实施例2 IgA肾病模型的建立

(1)脂肪酸浓度的选择

调整G-401细胞密度为5×10⁴个/mL，接种于96孔板，每孔200μL细胞悬液，6h后更换培养液，于培养箱中孵育至细胞融合度为80％-90％。

弃掉培养板孔内的培养液，对照组加入正常DMEM培养液，试验组分别加入按浓度为0、0.25、0.5、1、2和4mmol/L的软脂酸(palmitic acid，PA)培养液。每个浓度设6个重复，对照孔加入100μL正常DMEM培养基。

培养24h后，每孔加入0.5％浓度的MTT溶液10μL，孵育4h后加入100μL DMSO，紫色结晶溶解充分后，设定波长为490nm的酶标仪检测，计算不同浓度PA对G-401细胞活性的影响：

抑制率＝(1-试验组OD值/对照组OD值)×100％。

MTT试验结果如表1所示，与空白对照组相比，随着脂肪酸浓度的逐渐增加，对细胞活性的抑制也逐渐增强，在脂肪酸浓度为2mmol/L和4mmol/L时，脂肪酸能显著抑制G-401细胞的活性(P<0.05)，脂肪酸浓度为0.25mmol/L、0.5mmol/L和1mmol/L时，与空白对照组相比差异不显著(P>0.05)，故选其用于下一步试验的浓度。

表1 PA不同浓度(mmol/L)对G-401细胞细胞活性的影响

(2)油红O染色

将G-401细胞置于6孔板中培养至融合度达到80％-90％时，对照组加入正常DMEM培养液，其他各组加入适量PA的储备液，使终浓度分别为0.25mmol/L、0.5mmol/L和1mmol/L。培养箱中培养24h，吸去6孔板中细胞培养液，PBS漂洗3次，加入10％多聚甲醛固定30min。吸去多聚甲醛，加入稀释好的油红O染色液染色10min，使用75％酒精脱色。细胞内的中性脂肪可被染成桔红色或红色。显微镜下观察各组细胞内脂滴形成情况，并拍照。

结果如图1A、图1B、图1C和图1D所示，从图中可以看出，PA作用24h，经油红O染色后，在光学显微镜下观察，各组均可见G-401细胞有不同程度的形态变化，胞浆内有细小脂滴，细胞内甚至出现脂肪空泡。说明PA的加入能够建立IgA肾病进程中脂肪酸代谢异常的细胞模型。

实施例3 ACAT1 mRNA表达量

PA刺激诱导IgA肾病细胞模型中ACAT1表达水平

将G-401细胞置于6孔板中培养至融合度达到80％-90％时，对照组加入正常DMEM培养液，其他各组加入适量PA的储备液，使终浓度分别为0.25mmol/L、0.5mmol/L和1mmol/L。培养箱中培养24h，收集各组细胞。

(1)ACAT1 mRNA水平的表达

在专用的操作台(DEPC水清洁)中进行TRIzol法提取G-401细胞中的总RNA。提取前离心管和枪头等实验耗材均用DEPC水浸泡，以便除去RNase。

提取G-401细胞中RNA主要包括以下步骤：

a.将六孔板中每孔加入1mL Trizol，用细胞刮刀将细胞刮下，收集于1.5mL离心管中。

b.每管加入200μl氯仿，剧烈震荡20s，静置5min。

c.12000r/min于4℃离心机中离心10min，小心吸取上清至1.5mL离心管中，加入等体积的冰异丙醇，上下翻转混匀，-20℃静置30min。

d.12000r/min于4℃离心机中离心15min，弃上清。加入500μL 75％的乙醇溶液，混匀后，12000r/min于4℃离心机中离心10min，弃上清，用75％的乙醇溶液洗涤两次。待酒精挥发完全后，加入80μL DEPC水，溶解提取的RNA，-80℃封装保存。

引物设计和合成

根据NCBI公布的cDNA文库，确定ACAT1和内参基因β-actin基因的碱基序列。通过Primer premer5.0和Oligo 6.0软件设计和评价引物，如表2所示，引物均由Invitrogen公司合成。

表2引物序列

引物名称	序号	碱基序列(5’-3’)
			ACAT1-F	SEQ ID NO.5	CATCGACGGCGTCTTACATTGAG
ACAT1-R	SEQ ID NO.6	TCAGGAATTGGCCTGTCCCAAT
			β-actin-F	SEQ ID NO.7	GATCCACCTGAGAGGAAGG
β-actin-R	SEQ ID NO.8	AAGTGTGCCCTCTTGATCCG

SYBR Green实时荧光定量PCR检测基因表达

按照cDNA反转录试剂盒说明书，将已经提取的总RNA反转录成cDNA，反应体系20μL：

试剂	用量
		Total RNA	5μg
Anchored Oligo-(dT)(0.5μg/μl)	1μL
		2×TS Reaction Mix	10μL
TransScript RT	1μL
		RNase-free水	to 20.0μL

cDNA的反转录反应程序为：42℃30min，85℃5min，4℃所得即为cDNA，-80℃冰箱保存。

按SYBR荧光定量试剂盒说明书操作，待测模板为上述合成的cDNA，根据不同处理组合目的基因分类，每个孔都对应一个内参基因。每个样品设置三个重复，以平均值作为最后结果。对照组用ddH₂O代替cDNA模板。

按说明书配置反应体系：

试剂	用量(μL)
		SYBR Premix Ex TaqTM(2×)	10
PCR Forward Primer(10μmol/L)	0.8
		PCR Reverse Primer(10μmol/L)	0.8
ROX Reference Dye(50×)	0.4
		cDNA	1
ddH₂O	7
		Total	20

应用ABI7500Real Time PCR荧光定量仪器，反应条件如下：预变性温度94℃30s，1个循环，94℃变性5s、60℃退火34s(二步法)、循环次数40次。

应用ABI7500SDS Software软件分析数据，Ct值以软件自动生成为准。数据处理是通过2^-ΔΔT法进行分析，最后得出数据为各个基因的相对表达量变化的倍数。

利用RT-PCR法分析PA与G-401细胞共孵育24h后的对细胞ACAT1 mRNA表达量的影响，结果如表3和图2所示，当PA浓度为0.25、0.5和1mmol/L时，与空白对照组相比，ACAT1mRNA分别升高了15.68、23.80和27.51倍，差异显著(P<0.01)。

表3不同浓度PA(mmol/L)对ACAT1 mRNA表达量的影响

脂肪酸	对照组	0.25	0.5	1
					PA	1.0±0.08	15.45±1.02	23.67±2.81	27.35±2.04

从表3和图2的结果可以看出，随着PA浓度的增加，ACAT1 mRNA表达量成剂量依赖性上升，说明在IgA肾病疾病进程中，随着脂肪酸堆积的加重，ACAT1 mRNA的表达量呈上升趋势。

(2)ACAT1蛋白水平的表达

用RIPA裂解法提取细胞总蛋白，将G-401细胞用冰PBS冲洗2次，加入80μL含有0.8μL PMSF的RIPA裂解液，静置5min。用细胞刮刀将细胞刮下，收集于1.5mL离心管中。4℃14000r/min离心30min。吸取上层清液。

应用BCA法测定蛋白浓度，用RIPA裂解液和PMSF混合的溶液稀释浓度为5mg/mL的蛋白标准品，使稀释后浓度分别为0.5mg/mL、0.4mg/mL、0.3mg/mL、0.2mg/mL、0.1mg/mL、0.05mg/mL和0.025mg/mL，用于制备标准曲线。分别取20μL稀释后的标准品加入96孔板中，对照组只加RIPA和PMSF的混合液。试验孔按说明书加入体积比为50:1的A液和B液200μL，每个浓度三个重复，37℃放置30min。酶标仪595nm测OD值，以蛋白标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线，得到蛋白标准品的线性回归方程，R²值大于0.995可用。

常规方法制备SDS-PAGE凝胶，上部为5％的浓缩胶，下部为10％的分离胶。待完全凝固后，适量的蛋白上清液和5×Loding Buffer混和，100℃，煮5min后加入电泳缓冲液进行电泳。样品在浓缩胶：恒压80V，大约30min；进入分离胶后电压调至恒压120V继续电泳。电泳结束后将凝胶转移至硝酸纤维素(NC)膜采用350mA恒流，持续2h。将完成转膜的NC膜用TBS溶液震荡洗5min，共3次，之后放入封闭液中，于平缓摇动的摇床上37℃封闭2h。弃去封闭液，用TTBS震荡洗涤10min，共3次。将NC膜放入塑料自封袋中，加入5mL封闭液，按抗体说明稀释比例稀释一抗，注意避免产生气泡，在摇床上4℃过夜。用TTBS震荡洗10min，共3次；最后用TBS震荡洗10min。二抗孵育操作，与一抗相同，孵育条件为室温2小时。取出后用TTBS震荡洗10min，共3次，最后用TBS震荡洗涤。将孵育后的NC膜轻轻晃动，以便除去膜上多余的TBS。将ECL显色液均匀滴加在NC膜上。反应1min后，将膜上液体洗净，并用保鲜膜覆盖，防治荧光簇灭。在黑暗的暗室内，使NC膜显影，并且根据NC膜的亮度，调整曝光时间，以得到最佳结果。

结果如图3所示，其中，第一泳道为细胞对照组(cell)，第二泳道为浓度为0.25mmol/L的PA诱导，第三泳道为浓度为0.5mmol/L的PA诱导，第四泳道为浓度为1mmol/L的PA诱导。从图中可以看出，与对照组相比，浓度为0.25、0.5和1mmol/L PA诱导使G-401细胞ACAT1蛋白质表达量呈剂量依赖性增加，说明在IgA肾病疾病进程中，随着脂肪酸堆积的加重，ACAT1蛋白的表达量呈上升趋势。

实施例4转染siRNA后对IgA肾病模型细胞的影响

本实施例中所用的ACAT1siRNA由上海吉玛公司设计和生产。所用siRNA序列为：siRNA-ACAT1-F：5'-GCAAGTAATTGAGATCCAT-3'(SEQ ID NO.2)，siRNA-ACAT1-R：5'-CAAUAAGGUUGCAAUTT-3'(SEQ ID NO.3)。设计的siRNA规格为1管中含有1OD(1OD duplex＝3.0nmols＝40μg)的siRNA oligo，用150μL DEPC H₂O去重悬siRNA，溶解后得至20μM的样品。

将0.5×10⁵-2×10⁵个细胞接种于24孔板中，每孔加入500μL无抗生素的培养基，培养至细胞浓度为30％-50％。取两个1.5mL的EP管，先向一个EP管中加入300μL的无血清培养基，再加入6μL Lipofectamine 2000转染试剂，轻轻混合；向另一个EP管加入250μL无血清培养基，再加入18μL 20μM的siRNA悬液，轻轻混合。把两个EP管中的溶液相混合，等待20-25分钟，让脂质体转染试剂与siRNA充分结合，最后把混合液加入六孔板，48h后再进行后续操作。

利用实施例3提供的方法提取细胞总RNA并检测ACAT1 mRNA表达水平的变化，结果如图4所示，说明本发明提供的siRNA能够有效抑制ACAT1的表达。

将上述ACAT1沉默后的G-401细胞继续培养至融合度达到80％-90％时，实验组各组加入适量PA的储备液，使终浓度分别为0.25mmol/L、0.5mmol/L和1mmol/L。培养箱中培养24h，应用实施例2提供的方法进行油红O染色，并拍照。

siRNA组的细胞结果如图5A、5B和5C所示，从图中可以看出，与图1B、1C和1D相比，ACAT1沉默后各组细胞受脂肪酸影响明显减小，说明抑制ACAT1的表达能够减少脂肪酸对G-401细胞的损伤作用，进一步说明抑制ACAT1的表达能够缓解IgA肾病细胞模型中脂肪酸的异常代谢，从而达到治疗IgA肾病的效果。

实施例5转导抑制ACAT1蛋白活性的蛋白质对IgA肾病模型细胞的影响

选择多肽分子QCSYAK作为蛋白载体，利用切割试剂1％1TFA/DCM先切割Lys(Mtt)的侧链Mtt，利用丁二酸酐与Lys暴露的氨基进行耦合，DCM洗涤5次后，使用HATU/HOBT与抑制ACAT1蛋白活性的蛋白质偶联，偶联之后进行切割，所使用的切割试剂为：TFA/TIS/水，比例为：95:2.5:2.5。

将上述偶联蛋白载体的抑制ACAT1蛋白活性的蛋白质配置为20μM的悬液。取270μL无血清培养基，再加入30μL抑制ACAT1蛋白活性的蛋白质悬液，轻轻混合后，将混合液加入六孔板，48h后再进行后续操作。

利用实施例3提供的方法提取细胞总蛋白并检测ACAT1蛋白表达水平的变化，结果如图6所示，说明本发明提供的抑制ACAT1蛋白活性的蛋白质能够有效抑制ACAT1的表达。

将上述抑制ACAT1蛋白表达后的G-401细胞继续培养至融合度达到80％-90％时，实验组各组加入适量PA的储备液，使终浓度分别为0.25mmol/L、0.5mmol/L和1mmol/L。培养箱中培养24h，应用实施例2提供的方法进行油红O染色，并拍照。

蛋白抑制组的细胞结果如图7A、7B和7C所示，从图中可以看出，与图1B、1C和1D相比，抑制ACAT1蛋白活性后各组细胞受脂肪酸影响明显减小，说明抑制ACAT1的表达能够减少脂肪酸对G-401细胞的损伤作用，进一步说明抑制ACAT1的表达能够缓解IgA肾病细胞模型中脂肪酸的异常代谢，从而达到治疗IgA肾病的效果。

对比例1 ACAT1抑制剂IC-976对IgA肾病模型细胞的影响

设置常规ACAT1抑制剂IC-976为对比例，具体操作为：将0.5×10⁵-2×10⁵个细胞接种于24孔板中，每孔加入500μL无抗生素的培养基，培养至细胞浓度为30％-50％。配置含IC-976的细胞培养液，使IC-976在无血清培养基中的浓度达到30μg/mL。取含有IC-976的细胞培养液300μL加入六孔板，48h后再进行后续操作。

IC-976组的细胞结果如图8A、8B和8C所示，从图中可以看出，与图1B、1C和1D相比，通过抑制剂抑制ACAT1表达后各组细胞受脂肪酸影响略有减小，但与siRNA组和蛋白抑制组相比这种保护作用尚不十分明显。说明在抑制ACAT1表达以达到减少脂肪酸损伤的作用时，通过转染siRNA或抑制性蛋白效果更好。

综上所述，ACAT1基因可以作为一种新的生物标志物，应用于肾脏疾病的诊断；而与之相应的ACAT1基因或蛋白的干扰物，可以作为一种新型的药物，对肾脏疾病具有潜在的预防和治疗价值。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 杭州普略生物科技有限公司

<120> ACAT1基因及ACAT1基因或蛋白的干扰物的应用和应用干扰物的产品

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2149

<212> DNA

<213> 智人种（Homo sapiens）

<400> 1

ggccgctagg ggtgcggggt tggggaggag gccgctagtc tacgcctgtg gagccgatac 60

tcagccctct gcgaccatgg ctgtgctggc ggcacttctg cgcagcggcg cccgcagccg 120

cagccccctg ctccggaggc tggtgcagga aataagatat gtggaacgga gttatgtatc 180

aaaacccact ttgaaggaag tggtcatagt aagtgctaca agaacaccca ttggatcttt 240

tttaggcagc ctttccttgc tgccagccac taagcttggt tccattgcaa ttcagggagc 300

cattgaaaag gcagggattc caaaagaaga agtgaaagaa gcatacatgg gtaatgttct 360

acaaggaggt gaaggacaag ctcctacaag gcaggcagta ttgggtgcag gcttacctat 420

ttctactcca tgtaccacca taaacaaagt ttgtgcttca ggaatgaaag ccatcatgat 480

ggcctctcaa agtcttatgt gtggacatca ggatgtgatg gtggcaggtg ggatggagag 540

catgtccaat gttccatatg taatgaacag aggatcaaca ccatatggtg gggtaaagct 600

tgaagatttg attgtaaaag acgggctaac tgatgtctac aataaaattc atatgggcag 660

ctgtgctgag aatacagcaa agaagctgaa tattgcacga aatgaacagg acgcttatgc 720

tattaattct tataccagaa gtaaagcagc atgggaagct gggaaatttg gaaatgaagt 780

tattcctgtc acagttacag taaaaggtca accagatgta gtggtgaaag aagatgaaga 840

atataaacgt gttgatttta gcaaagttcc aaagctgaag acagttttcc agaaagaaaa 900

tggcacagta acagctgcca atgccagtac actgaatgat ggagcagctg ctctggttct 960

catgacggca gatgcagcga agaggctcaa tgttacacca ctggcaagaa tagtagcatt 1020

tgctgacgct gctgtagaac ctattgattt tccaattgct cctgtatatg ctgcatctat 1080

ggttcttaaa gatgtgggat tgaaaaaaga agatattgca atgtgggaag taaatgaagc 1140

ctttagtctg gttgtactag caaacattaa aatgttggag attgatcccc aaaaagtgaa 1200

tatcaatgga ggagctgttt ctctgggaca tccaattggg atgtctggag ccaggattgt 1260

tggtcatttg actcatgcct tgaagcaagg agaatacggt cttgccagta tttgcaatgg 1320

aggaggaggt gcttctgcca tgctaattca gaagctgtag acaacctctg ctatttaagg 1380

agacaaccct atgtgaccag aaggcctgct gtaatcagtg tgactactgt gggtcagctt 1440

atattcagat aagctgtttc attttttatt attttctatg ttaactttta aaaatcaaaa 1500

tgatgaaatc ccaaaacatt ttgaaattaa aaataaattt cttcttctgc ttttttcttg 1560

gtaaccttga aaagtttgat acatttttgc attctgagtc tatacttatc gaaatatggt 1620

agaaatacca atgtgtaata ttagtgactt acataagtag ctagaagttt ccatttgtga 1680

gaacacattt atatttttga ggattgttaa aggtcaagtg aatgctcttt ataggtaatt 1740

tacatttagt aaattacggt aaattaaatt acttctcttt acagtaagag ttggctattc 1800

tggacaaact agcagtgctt catataatca ctcaaaccac agtgtgtgca gcagtactag 1860

aaacaagaca gaagcccatg tcctcagggt ctagagtggg ggcaatttct tataacctca 1920

acattcaggg ttgggggagg tcaagcagaa aaccctggag tttgggctct gaattactat 1980

agcagcatag agagtgggaa gggaggtaga aactgatatg ctgaatggat atataaaaaa 2040

gggaacagat caccacttcc aatacacgac aatgcctgtt cttaagcagg acagactgta 2100

acagaagtat ctcgcattgc attttatctg ggaaaaaaaa aaaaaaaaa 2149

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcaagtaatt gagatccat 19

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

caauaagguu gcaautt 17

<210> 4

<211> 559

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Ala Thr Gly Ala Thr Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Thr Gly Met

1 5 10 15

Glu Thr Met Glu Thr Gly Leu Tyr Gly Leu Val Ala Leu Cys Thr Gly

20 25 30

Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Thr Ala Ala Gly Ala Ser Glu Arg Ala

35 40 45

Leu Ala Ala Ser Asn Ser Glu Arg Ala Ser Asn Ala Leu Ala Ala Ser

50 55 60

Pro His Ile Ser Gly Leu Gly Leu Tyr Gly Ala Cys Thr Cys Ala Cys

65 70 75 80

Ala His Ile Ser Ser Glu Arg Ala Arg Gly Met Glu Thr Gly Leu Ala

85 90 95

Arg Gly Ser Glu Arg Val Ala Leu Pro His Glu Met Glu Thr Pro Arg

100 105 110

Ala Arg Gly Pro Arg Gly Leu Asn Ala Leu Ala Ala Ala Thr Cys Ala

115 120 125

Gly Cys Ser Glu Arg Ile Leu Glu Ser Glu Arg Ala Ser Pro Cys Ala

130 135 140

Thr Cys Ala Gly Cys Cys Thr Thr Gly Thr Thr Cys Ala Cys Ala Ala

145 150 155 160

Gly Ala Thr Thr Ala Thr Gly Cys Gly Ala Gly Cys Ala Ala Ala Gly

165 170 175

Thr Gly Val Ala Leu Ala Ser Asn Gly Leu Gly Leu Ser Glu Arg Leu

180 185 190

Glu Ala Ala Ala Gly Ala Thr Cys Gly Gly Ala Gly Gly Ala Ala Gly

195 200 205

Ala Ala Ala Gly Thr Thr Thr Tyr Arg Ala Arg Gly Gly Leu Gly Leu

210 215 220

Asn Val Ala Leu Cys Thr Cys Ala Cys Cys Cys Gly Cys Ala Thr Cys

225 230 235 240

Cys Thr Cys Gly Gly Cys Gly Cys Cys Ala Ala Cys Ala Ala Thr Thr

245 250 255

Cys Thr Ser Glu Arg Thr His Arg Ala Leu Ala Ala Ser Asn Ala Ser

260 265 270

Asn Ser Glu Arg Ala Gly Ala Cys Cys Ala Ala Ala Cys Cys Gly Cys

275 280 285

Ala Gly Gly Thr Ala Thr Ala Ala Thr Cys Ala Ala Thr Cys Ala Cys

290 295 300

Thr Thr Gly Cys Thr Ala Thr Thr Cys Cys Cys Gly Leu Tyr Ala Ser

305 310 315 320

Asn Thr Ala Leu Ala Pro His Glu Ser Glu Arg Pro Arg Ala Arg Gly

325 330 335

Gly Ala Thr Cys Cys Thr Gly Cys Ala Gly Ala Gly Thr Cys Cys Cys

340 345 350

Cys Thr Cys Ala Thr Ala Gly Cys Gly Ala Ala Thr Ala Cys Thr Cys

355 360 365

Ala Cys Ala Thr Thr Cys Ala Ala Ala Gly Ala Ala Thr Ala Ser Pro

370 375 380

Pro Arg Ala Leu Ala Gly Leu Ser Glu Arg Pro Arg His Ile Ser Ser

385 390 395 400

Glu Arg Gly Leu Thr Tyr Arg Ser Glu Arg His Ile Ser Ser Glu Arg

405 410 415

Leu Tyr Ser Ala Ser Asn Met Glu Thr Ser Glu Arg Thr Tyr Arg Ser

420 425 430

Glu Arg Gly Leu Tyr Pro His Glu Ser Glu Arg Ala Leu Ala Gly Leu

435 440 445

His Arg Thr Ala Cys Ala Ala Ala Gly Thr Gly Thr Cys Thr Thr Cys

450 455 460

Ala Gly Thr Gly Thr Thr Thr Thr Thr Thr Gly Ala Cys Ala Ala Gly

465 470 475 480

Gly Ala Thr Gly Gly Ala Gly Leu Asn Val Ala Leu Thr Tyr Arg Ala

485 490 495

Ser Asn Ala Leu Ala Leu Glu Val Ala Leu Gly Leu Asn Ala Leu Ala

500 505 510

Val Ala Leu Cys Tyr Ser Ala Leu Ala Ala Ser Pro Val Ala Leu Ala

515 520 525

Ser Asn Leu Tyr Ser Leu Glu Ala Arg Leu Met Glu Thr Pro Arg Ser

530 535 540

Glu Arg Gly Leu Ser Glu Arg Leu Glu Gly Leu Gly Ala Arg Gly

545 550 555

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

catcgacggc gtcttacatt gag 23

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tcaggaattg gcctgtccca at 22

Claims

1.ACAT1基因在制备用于诊断肾脏疾病的产品中的应用，其特征在于，所述ACAT1基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肾脏疾病为IgA肾病。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述产品为试剂盒。

4.一种用于诊断肾病的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于特异性检测ACAT1基因的引物；

5.如下(1)或(2)所述的ACAT1的干扰物在制备预防和/或治疗IgA肾病的产品中的应用：

(1)用于抑制ACAT1基因转录或表达的核糖核酸；

(2)用于抑制ACAT1蛋白活性的蛋白质或小分子化合物。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述产品为药物。

7.一种用于预防和/或治疗肾脏疾病的药物，其特征在于，所述药物包括如下(1)或(2)中所述的ACAT1的干扰物：

(1)用于抑制ACAT1基因转录或表达的核糖核酸；

(2)用于抑制ACAT1蛋白活性的蛋白质或小分子化合物。

8.根据权利要求5所述的应用或权利要求7所述的药物，其特征在于，所述用于抑制ACAT1基因转录或表达的核糖核酸为siRNA或shRNA。

9.根据权利要求5所述的应用或权利要求7所述的药物，其特征在于，所述用于抑制ACAT1基因转录或表达的核糖核酸具有如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的正义链和如SEQID NO.3所示核苷酸序列的反义链。

10.根据权利要求5所述的应用或权利要求7所述的药物，其特征在于，所述用于抑制ACAT1蛋白活性的蛋白质具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。