发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点,本发明的目的在于提供可用于肿瘤免疫治疗的联合用药物组合。
本发明第一方面提供了一种用于肿瘤免疫治疗的联合用药物组合,包括有效量的酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶ACAT1抑制剂和有效量的免疫检测点阻断抗体。
本发明提供了酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶ACAT1抑制剂在制备与免疫检测点阻断抗体联合用药的药物组合中的用途。
所述酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶ACAT1的抑制剂是指对于酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶ACAT1具有抑制效果的化合物。
对于酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶ACAT1具有抑制效果包括但不限于:抑制酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶ACAT1活性,或者抑制酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶ACAT1的基因转录或表达。
所述的酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶ACAT1抑制剂可为siRNA、shRNA、抗体、小分子化合物。
如本发明实施例列举的,所述酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶ACAT1抑制剂选自:Avasimibe、K604、CP113,818,所述酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶ACAT1抑制剂还可选自:purpactins、manassantin A、diphenylpyridazine derivatives、glisoprenin A、pactimibe、CI976、TMP-153、YM 750、GERI-BP002-A、Sandoz 58-035、VULM 1457、CL-283,546、CI-999、E5324、YM17E,FR182980、PD132301-2、F-1394、HL-004、F-12511(eflucimibe)、cinnamic acid derivatives、Dup 128、RP-73163、pyripyropene C、FO-1289、AS-183、SPC-15549、BeauI、BeauIII、FO-6979、Angelica、ginseng、Decursin、terpendole C、beauvericin、spylidone、pentacecilides、CL-283,546、cinnamic derivatives、betulinic acid、shikonin derivatives、esculeogenin A和Wu-V-23等。
所述免疫检测点阻断抗体可选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体等之一或其组合。在本发明优选的实施例中,所述免疫检测点阻断疗法药物为α-PD-1抗体。
所述联合治疗药物组合可以是以下形式中的任意一种:
一)将酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶ACAT1抑制剂和免疫检测点阻断抗体分别制成独立的制剂,制剂的剂型可相同或不同,给药途径亦可相同或不同。
二)将酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶ACAT1抑制剂和免疫检测点阻断抗体配置成复方制剂。在将酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶ACAT1抑制剂和免疫检测点阻断抗体采用相同给药途径给药并同时施加时,可采用将两者配置成复方制剂的形式。
本发明第二方面提供了一种肿瘤免疫治疗联合用药治疗方法,为向对象联合施用有效量的酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶ACAT1抑制剂,以及有效量的免疫检测点阻断抗体。
所述的对象为哺乳动物或所述哺乳动物的CD8T细胞。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或智人。
所述对象可以是罹患肿瘤的患者或期待提高抗肿瘤免疫力的个体,或者为罹患肿瘤的患者或期待提高抗肿瘤免疫力的个体的离体CTL细胞。
可以同步的或顺序地给予有效量的酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶ACAT1抑制剂和有效量的免疫检测点阻断抗体。
基于酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶ACAT1为新发现的肿瘤免疫治疗靶点,本发明经研究发现,在与免疫检测点阻断抗体联合用药中,两者可以起到协同效果,进一步增强对于肿瘤的抑制。
所述肿瘤免疫治疗针对的肿瘤包括实体瘤和非实体瘤,包括但不限于:鼻腔及鼻窦恶性肿瘤、鼻咽癌、口腔癌、喉癌、涎腺肿瘤、颅内肿瘤、甲状腺癌、舌癌、肺癌、食管癌、贲门癌、乳腺癌、纵膈肿瘤、胃癌、大肠癌、乙状结肠和直肠癌、肝癌、胰腺癌与壶腹周围癌、胆道癌、小肠肿瘤、肾癌、前列腺癌、膀胱癌、睾丸恶性肿瘤、阴茎癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、纤维组织细胞瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤、黑色素瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、白血病等。
所述酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶ACAT1抑制剂及免疫检测点阻断疗法药物可以在接受肿瘤免疫治疗前、中、后向对象施用。
本发明的优点在于:
(1)通过一系列体外实验,发现ACAT1在调控CD8T细胞免疫应答反应上起着关键作用,抑制ACAT1的活性可以增强CD8T细胞的抗原特异性免疫应答反应,增强其对靶细胞的杀伤能力,而不影响CD8T细胞对自身抗原的响应;
(2)经体外实验发现抑制ACAT1活性增强CD8T细胞抗肿瘤能力;
(3)在动物水平上,T细胞特异性基因敲除ACAT1或者通过抑制剂抑制ACAT1活性可以增强CD8T细胞免疫应答能力,在小鼠黑色素瘤模型和小鼠肺癌模型中增强CD8T细胞的抗肿瘤活性;在与抗PD-1抗体的联合治疗小鼠黑色素瘤实验中,ACAT1抑制剂Avasimibe可以与抗PD-1抗体协同促进CD8T细胞的抗肿瘤活性。
(4)现有技术虽然论证了酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶ACAT1抑制剂的用药安全性,但是酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶ACAT1抑制剂原适应症的临床效果并不理想。本发明在肿瘤免疫治疗领域给酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶ACAT1抑制剂提供了新的临床应用价值,不仅为其进一步的市场应用开辟了广阔的前景,也为肿瘤患者提供了更有效的治疗方案。
附图说明
图1.ACAT1敲除增强OT-I CD8T细胞对特异性抗原的免疫应答,且并不引发对自身抗原的免疫应答
a.C57BL/6小鼠来源的脾脏细胞呈递外来抗原(N4,A2,T4和G4)或者自身抗原(R4和Catnb)后作为抗原递呈细胞(Antigen-presenting cell,APC)刺激野生型(WT OT-I)或者Acat1CKO OT-I CD8T细胞(CKO OT-I)。胞内染色和流式检测细胞因子IFNγ的表达(n=4)。
b.C57BL/6小鼠来源的脾脏细胞呈递OVA抗原(OVA257-264)后作为抗原递呈细胞刺激野生型(WT OT-I)或者Acat1CKO OT-I CD8T细胞(CKO OT-I),5天后产生成熟的杀伤型T细胞(CTLs)。为检测CTL的细胞杀伤能力,用递呈OVA抗原的EL-4作为靶细胞,与CTL混合培养4小时后,通过检测LDH(Lactic Dehydrogenase,乳酸脱氢酶)的释放来测定杀伤效率。
c.取3月龄小鼠血清,ELISA方法检测血清中细胞因子IFNγ和自身抗体抗双链DNA抗体水平。
图2.ACAT1敲除增强CD8T细胞抗肿瘤活性
a-b.野生型小鼠和Acat1CKO小鼠中黑色素瘤生长速度以及小鼠的生存曲线分析。肿瘤生长曲线用two-way ANOVA统计方法分析,小鼠的生存曲线用log-rank(Mantel-Cox)统计方法分析;
c-d.野生型和Acat1CKO小鼠在注射B16F10黑色素瘤细胞后,在第16天将肿瘤取出,通过流式分析CD8T细胞中CD44、颗粒酶B、IFNγ和TNFα的表达,同时对肿瘤浸润的CD8T细胞进行计数,通过流式检测CD8/CD4T细胞比比率以及CD8T细胞增殖标志物Ki-67的表达;
e.流式检测肿瘤浸润CD8T细胞表面免疫检测点受体PD-1和CTLA-4的表达;
f.胞内染色和流式检测肿瘤浸润的Treg细胞(CD4+FoxP3+)的比例;
g-h.流式检测引流淋巴结中CD8T细胞中CD44、IFNγ的表达,同时对CD8T细胞进行计数,通过流式检测CD8/CD4T细胞比比率;
i-k.黑色素瘤肺转移模型,在注射黑色素瘤细胞后第20天,检测肺脏中肿瘤数量,同时继续记录剩余小鼠的生存率和生存时间,小鼠的生存曲线用log-rank(Mantel-Cox)统计方法分析;
l.黑色素瘤肺转移模型中,苏木精-伊红染色观察肿瘤细胞在肺脏中的浸润情况;
m.黑色素瘤肺转移模型中,流式检测肺脏中CD8T细胞CD44、颗粒酶B、IFNγ和TNFα的表达;
n-p.将体外诱导分化成熟的野生型和Acat1CKO OT-I CTL尾静脉注射到荷瘤B16F10-OVA(B16F10黑色素瘤细胞中表达Ovalbumin)的C57BL/6野生型小鼠中,检测肿瘤的生长以及小鼠的生存率。
图3.ACAT抑制剂Avasimibe处理增强CD8T细胞抗肿瘤能力
a.野生型CD8T细胞用Avasimibe处理(37℃,6小时,即于RPMI 1640完全培养基中加药后,37℃CO2培养箱中培养处理6小时,处理完之后用培养基或PBS离心清洗3次),随后通过铺板抗体α-CD3(5μg/ml)+α-CD28(5μg/ml)刺激24小时,然后胞内染色和流式检测颗粒酶B,细胞因子IFNγ和TNFα的表达;
b.Avasimibe处理OT-I CTL(37℃,6小时)处理方式同a,通过检测LDH的释放分析OT-I CTL对靶细胞EL-4的杀伤效率;
c.MTS方法检测Avasimibe处理对黑色素瘤细胞B16F10细胞活率的影响;
d-f.Avasimibe处理B16F10黑色素瘤荷瘤C57BL/6野生型小鼠,检测肿瘤生长曲线和小鼠生存率;
g-h.在注射肿瘤后第18天将肿瘤取出,通过流式分析肿瘤浸润的CD8T细胞中CD44、颗粒酶B、IFNγ和TNFα的表达,同时对肿瘤浸润的CD8T细胞进行计数,通过流式检测CD8/CD4T细胞比比率以及CD8T细胞增殖标志物Ki-67的表达;
i.流式检测肿瘤浸润CD8T细胞表面免疫检测点受体PD-1和CTLA-4的表达;
j.胞内染色和流式检测肿瘤浸润的Treg细胞(CD4+FoxP3+)的比例;
k.流式检测肿瘤组织中MDSC细胞(Gr1+CD11b+CD45+)的比例。
图4.Avasimibe处理上调CD8T细胞质膜上胆固醇水平,促进TCR微簇和免疫突触形成,增强TCR信号通路的活化
a-b.Avasimibe处理CD8T细胞(37℃,6小时),Filipin III染色检测CD8T细胞游离胆固醇的分布;细胞质膜胆固醇的相对定量结果通过Leica LAS AF软件处理获取;
c.Avasimibe处理CD8T细胞后,通过STORM对CD8T细胞质膜表面TCR的分布进行分析;
d-e.对图c获得的成像信息进行Ripley’K function分析,r代表TCR微簇的大小,L(r)-r代表TCR微簇形成的程度;
f-g.Avasimibe处理CD8T细胞后,通过TIRFM检测CD8T细胞免疫突触的形成;
h.Avasimibe处理OT-I CTL细胞后,用2μg/mlα-CD3和2μg/mlα-CD28激活CTL,然后Western-blotting检测TCR近端信号通路和下游信号通路的活化情况;
i-k.STORM对肿瘤浸润的CD8T细胞进行成像以及Ripley’K function分析。
图5.ACAT1基因敲除和Avasimibe抑制小鼠LLC肺癌发展进程
a-c.LLC肺癌在野生型小鼠和ACAT1基因敲除小鼠中的进程,小鼠生存曲线用Log-rank(Mantel-Cox)统计方法进行分析;
d-g.Avasimibe处理LLC(Lewis Lung Carcinoma)肺癌荷瘤的小鼠,评估Avasimibe在治疗小鼠肺癌中的功效,给药路径、给药天数及每日剂量见图d,小鼠生存曲线用Log-rank(Mantel-Cox)统计方法进行分析;
图6.ACAT抑制剂增强人PBMC中CD8+T细胞的效应功能
*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。
图7.Avasimibe与α-PD-1抗体联合处理抑制小鼠黑色素瘤发展进程
a-c.对B16F10黑色素瘤荷瘤的野生型C57BL/6小鼠进行Avasimibe与α-PD-1抗体联合治疗,检测肿瘤生长曲线和小鼠生存率,比较联合治疗与单一疗法效果的差异,给药路径、给药天数及每日剂量见图a,小鼠生存曲线用Log-rank(Mantel-Cox)统计方法进行分析(n=10)。
d.在注射肿瘤后第18天(Avasimibe给药4次)将肿瘤取出,通过流式分析肿瘤浸润的PD-1高表达和低表达的dCD8T细胞中CD44、颗粒酶B、IFNγ和TNFα的表达;
e.在抗PD-1抗体给药3次后(注射肿瘤后18天),通过磁珠分选得到肿瘤浸润的CD8
T细胞,抽提RNA,检测相关基因的表达水平。
i.g.-灌胃给药,i.p.-腹腔注射给药
具体实施方式
本发明经研究发现,抑制酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶ACAT1可以增强CD8T细胞对肿瘤的杀伤活性。因此认为酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶ACAT1抑制剂可用作肿瘤免疫治疗剂与其他肿瘤免疫治疗剂联合使用以提高肿瘤免疫治疗疗效。进一步的研究表明,在与抗PD-L1抗体联合用药中,两者可以起到协同效果,可进一步增强对于肿瘤的抑制。
酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶ACAT
酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶ACAT是调控细胞内胆固醇代谢的平衡的一种酶,在生物体内催化胆固醇与长链脂肪酸形成胆固醇酯。在哺乳动物细胞中发现两种同工异构酶ACAT1和ACAT2。ACAT1选择性地在组织与细胞中表达,与细胞内胆固醇代谢平衡有关;而ACAT2则广泛存在于肝脏、胃肠道等细胞中,主要参与饮食中胆固醇的吸收和载脂蛋白的装配。
酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶ACAT1抑制剂
是指对于酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶ACAT1具有抑制效果的化合物。对于酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶ACAT1具有抑制效果包括但不限于:抑制酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶ACAT1活性,或者抑制酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶ACAT1的基因转录或表达。
所述的酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶ACAT1抑制剂包括但不限于为siRNA、shRNA、抗体、小分子化合物。
所述酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶ACAT1抑制剂可以是对ACAT1与ACAT2没有选择性的ACAT抑制剂,已知的例如Avasimibe、CP113,818、purpactins、manassantin A、diphenylpyridazine derivatives、glisoprenin A、pactimibe、CI 976、TMP-153、YM 750、GERI-BP002-A、Sandoz 58-035、VULM 1457、CL-283,546、CI-999、E5324、YM17E,FR182980、PD132301-2、F-1394、HL-004、F-12511(eflucimibe)、cinnamic acid derivatives、Dup 128、RP-73163、pyripyropene C、FO-1289、AS-183、SPC-15549、BeauI、BeauIII、FO-6979、Angelica、ginseng、Decursin、terpendole C、beauvericin、spylidone、pentacecilides、CL-283,546、cinnamicderivatives、betulinic acid、shikonin derivatives、esculeogenin A和Wu-V-23等,也可以是对ACAT1具有选择性抑制的抑制剂如K604等。
抑制酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶ACAT1活性是指使酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶ACAT1酶活力下降。优选的,相比抑制前,酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶ACAT1酶活力降低至少10%,较佳的降低至少30%,再佳的降低至少50%,更佳的降低至少70%,最佳的降低至少90%。
抑制酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶ACAT1的基因转录或表达是指:使酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶ACAT1的基因不转录,或降低酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶ACAT1的基因的转录活性,或者使酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶ACAT1的基因不表达,或降低酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶ACAT1的基因的表达活性。
本领域技术人员可以使用常规方法对ACAT1基因转录或表达进行调节,如基因敲除、同源重组,干扰RNA等。
酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶ACAT1的基因转录或表达的抑制可以通过PCR及Western Blot检测表达量验证。
优选地,与野生型相比,ACAT1基因转录或表达降低至少10%,较佳的降低至少30%,再佳的降低至少50%,更佳的降低至少70%,又佳的降低至少90%,最佳地ACAT1基因完全没有表达。
小分子化合物
本发明中指由几个或几十个原子组成,分子质量在1000以下的化合物。
Avasimibe(CI-1011)
化学名称:2,6-diisopropylphenyl 2-(2,4,6-triisopropylphenyl)acetylsulfamate
分子式:C29H43NO4S
IC50:ACAT,3.3μM;CYP2C9,2.9μM;CYP1A2,13.9μM;CYP2C19,26.5μM
Cas No.166518-60-1
结构式如下
K604
化学名称:
2-[4-[2-(benzimidazol-2-ylthio)ethyl]piperazin-1yl]-N-[2,4-bis(methyllthio)-6-methyl-3-pyridyl]
acetamide
IC50:ACAT1,0.45μM;ACAT2,102.85μM
结构式:
在文献Ikenoya,M.et al.A selective ACAT-1inhibitor,K-604,suppresses fatty streak lesions infat-fed hamsters without affecting plasma cholesterol levels..Atherosclerosis 191,290-297,doi:10.1016/j.atherosclerosis.2006.05.048(2007)中公开。
CP113,818
化学名称:(-)-N-(2,4-bis(methylthio)-6-methylpyridin-3-yl)-2-(hexylthio)decanoic amide
IC50:17-75nM
结构式:
在文献Hutter-Paier,B.etal.The ACAT inhibitor CP-113,818markedlly reduces amyloidpathology in a mouse model of Alzheimer's disease.Neuron 44,227-238,doi:10.1016/j.neuron.2004.08.043(2004)中公开
U18666A
Cas No.3039-71-2
CI 976
化学名称:2,2-Dimethyl-N-(2,4,6-trimethoxyphenyl)dodecanamide
分子式:C23H39NO4
Cas No.114289-47-3;
IC50:SOAT1:IC50=73nM(human);Acyl coenzyme A:cholesterol acyltransferase 1:IC50=73nM(rat);Sterol O-acyltransferase,Soat:IC50=110nM(rat);Foam cell formation:IC50=3.8μM(rat peritoneal macrophages);Golgi-associated LPAT activity:IC50=15μM
结构式
TMP-153
分子式:C24H18CIF2N3O
Cas No.128831-46-9
IC50:cholesterol acyltransferase(ACAT):IC50=5-10nM;Acyl coenzyme A:cholesterolacyltransferase 1:IC50=5.8nM(Rattus norvegicus)
YM 750
分子式:C31H36N2O
Cas No.138046-43-2
IC50:0.18μM
GERI-BP002-A
化学名称:2,2'-Methylenebis(6-tert-butyl-4-methyl-phenol);
分子式C23H32O2
Cas No.119-47-1
Sandoz 58-035
化学名称:
3-[Decyldimethylsilyl]-N-[2-(4-methylphenyl)-1-phenethyl]propanamiideSA 58-035
分子式:C30H47NOSi
Cas No.78934-83-5
IC50:ACAT1,0.3μM(Rat)
VULM 1457
化学名称:
N-[2,6-bis(1-Methylethyl)phenyl]-N”-[4-[(4-nitrophenyl)thio]phenyl]urea;分子式:C25H27N3O3S
Cas No.228544-65-8
CTL细胞
CTL细胞即为细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte,CTL),是一种终末分化的CD8T细胞,可以通过其TCR识别相应抗原并对表达相应抗原的肿瘤细胞或者受感染的细胞进行杀伤。
CD8T细胞
CD8T细胞即为CD8阳性T细胞。CD8(群集分化8)是作为协同受体的T细胞受体(TCR)的跨膜糖蛋白。
联合治疗药物组合和施用方法
所述联合治疗药物组合可以是以下形式中的任意一种:
一)将酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶ACAT1抑制剂和免疫检测点阻断抗体分别制成独立的药物制剂,制剂的剂型可相同或不同,给药途径亦可相同或不同。使用时,可两种药同时使用,也可两种药先后使用。先后给药时,应当在先用药物仍对机体有效的期间内向机体施加其他药物。
二)将酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶ACAT1抑制剂和免疫检测点阻断抗体配置成复方制剂。在将酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶ACAT1抑制剂和免疫检测点阻断抗体采用相同给药途径给药并同时施加时,可采用将两者配置成复方制剂的形式。
免疫检测点阻断抗体常用的用药方法为静脉注射、静脉滴注或动脉灌注。其用法用量可参考现有技术。
小分子化合物常用的用药方法可以是胃肠道给药或者是胃肠外给药。siRNA、shRNA、抗体则一般采用胃肠外给药。可以是局部给药亦可以为全身给药。Avasimibe为已知用于治疗动脉粥样硬化以及阿尔茨海默病的药物,其用法用量可参考现有技术,其他酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶ACAT1抑制剂的用法用量亦可参考Avasimibe。
可以同步的或顺序地给予有效量的酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶ACAT1抑制剂和有效量的免疫检测点阻断抗体。在部分实施例中,酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶ACAT1抑制剂采用胃肠道给药剂型,免疫检测点阻断抗体采用胃肠外给药剂型。或者,酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶ACAT1抑制剂及免疫检测点阻断抗体均采用胃肠外给药剂型。或者,酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶ACAT1抑制剂对离体的CTL细胞进行处理,并在体外扩大培养CTL细胞后回输机体,而免疫检测点阻断抗体直接对机体采用胃肠外给药。使用时,可两种药同时使用,也可两种药先后使用。先后给药时,应当在先用药物仍对生物体有效的期间内向生物体施加其他药物。
在以酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶ACAT1抑制剂为主要活性成分或主要活性成分之一制备药物或药物组合物时。通常,药物中除了有效成分外,根据不同剂型的需要,还会包括一种或多种药学上可接受的载体或辅料。
“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时,它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。
“药学上可接受的载体或辅料”应当与酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶ACAT1抑制剂相容,即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物组合物的效果。可作为药学上可接受的载体或辅料的一些物质的具体例子是糖类,如乳糖、葡萄糖和蔗糖;淀粉,如玉米淀粉和土豆淀粉;纤维素及其衍生物,如甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素;西黄蓍胶粉末;麦芽;明胶;滑石;固体润滑剂,如硬脂酸和硬脂酸镁;硫酸钙;植物油,如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油;多元醇,如丙二醉、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇;海藻酸;乳化剂,如Tween;润湿剂,如月桂基硫酸钠;着色剂;调味剂;压片剂、稳定剂;抗氧化剂;防腐剂;无热原水;等渗盐溶液;和磷酸盐缓冲液等。这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。
本发明中,除非特别说明,药物剂型并无特别限定,可以被制成针剂、口服液、片剂、胶囊、滴丸、喷剂等剂型,可通过常规方法进行制备。药物剂型的选择应与给药方式相匹配。
在进一步描述本发明具体实施方式之前,应理解,本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案;还应当理解,本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案,而不是为了限制本发明的保护范围。
除非另外定义,本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外,根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载,还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明,本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明,具体可参见Sambrook等MOLECULARCLONING:A LABORATORY MANUAL,Second edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989and Third edition,2001;Ausubel等,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John Wiley&Sons,New York,1987and periodic updates;the series METHODS INENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego;Wolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION,Third edition,Academic Press,San Diego,1998;METHODS IN ENZYMOLOGY,Vol.304,Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe,eds.),Academic Press,San Diego,1999;和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,Vol.119,Chromatin Protocols(P.B.Becker,ed.)HumanaPress,Totowa,1999等。
1.材料和试剂
细胞培养基(DMEM)、胎牛血清(FBS)购自Life Technologies;Filipin III,MβCD,MβCD-Cholesterol购自Sigma;α-CD3和α-CD28购自Biolegend;流式分析抗体α-mCD4(RM4-5),α-mCD8(53-6.7),α-mCD3ε(145-2C11),α-IFN-γ(XMG1.2),α-TNF-α(MP6-XT22),α-Granzyme B(NGZB),α-CD44(IM7),α-CD69(H1.2F3),α-PD-1(J43),α-CTLA-4(UC10-4B9),α-Ki67(16A8),α-Foxp3(FJK-16s),α-Gr1(RB6-8C5),α-CD11b(M1/70)和α-CD45(30-F11)购自eBioscience;Western-blotting抗体α-pCD3ζ购自Abcam,α-CD3ζ购自Santa Cruze,α-pZAP70,α-ZAP70,α-pLAT,α-LAT,α-pErk1/2和α-Erk1/2购自Cell Signaling;MTS检测试剂盒购自Promega;Avasimibe购自Selleck;K604由中科院上海药物研究所合成;CP113,818由Pierre Fabre提供;B16F10细胞系和LLC(Lewis Lung Carcinoma)细胞系最初来源于ATCC,由中国科学院细胞库提供。
2.实验动物
C57BL/6小鼠购自SLAC;OT-I TCR转基因小鼠来自Jax mice;CD4cre转基因小鼠由中国科学院生物化学与细胞生物研究所刘小龙研究组提供(最初来源于Jax mice);Acat1flox/flox来自InGeneious Labs,该试验动物在Acat1基因的14号外显子毗邻的两个内含子上分别有一个LoxP位点,该外显子编码有His460位点,该位点是ACAT1的酶活所必需的,Acat1flox/flox可采用现有常规技术构建。实验中所有的动物都饲养在SPF设施中。
3.T细胞分离,培养和流式检测
T细胞来自小鼠脾脏和淋巴结,通过CD8或者CD4阴性筛选磁珠(Stem Cell)进行分离得到。对于肿瘤浸润T细胞的分离,小鼠在注射肿瘤后14-18天,将肿瘤取出,剪成1-2mm碎片,胶原酶IV(Sigma)消化1小时,然后通过40–70%Percoll(GE)密度梯度离心得到肿瘤浸润白细胞群。为进一步得到肿瘤浸润的CD8T细胞,进一步用CD8阳性磁珠分选试剂盒(Stem Cell)进行分离。
分离得到的细胞用含50μMβ-巯基乙醇的RPMI 1640完全培养基在37℃CO2培养箱培养。为进一步分析T细胞的功能表型,针对细胞表面标志物如CD8,CD44,CD69,细胞离心后直接用PERCP-α-CD8,FITC-α-CD44,PE-α-CD69进行染色,然后流式检测;而针对胞内颗粒酶和细胞因子的检测,分离到的细胞继续用1μM ionomycin和50ng/ml PMA刺激培养4个小时,在培养过程中加入5μg/ml BFA(Brefeldin A),以阻断颗粒酶和细胞因子向胞外分泌。刺激结束后,4%多聚甲醛(PFA)室温固定10分钟,然后胞内染色检测胞内颗粒酶和细胞因子的水平。
4.胆固醇定量
a.Filipin染色和激光共聚焦成像技术对细胞质膜胆固醇进行相对定量
Filipin III溶于甲醇中至5mg/ml。T细胞用4%PFA固定,然后用50μg/ml Filipin III于4℃染色30分钟,然后PBS洗5次以去除游离Filipin。成像图片由Leica SP8激光共聚焦显微成像系统获取,相对定量结果由Leica LAS AF软件分析得到。
b.基于胆固醇氧化的胆固醇定量方法
细胞经0.1%戊二醛固定15分钟后,PBS洗3次,然后用2U/ml胆固醇氧化酶室温处理15分钟以氧化细胞质膜上游离胆固醇;氧化反应结束后PBS洗3次以去除残留的胆固醇氧化酶,细胞内未被氧化的游离胆固醇用甲醇/氯仿(V:V=1:2)提取,然后用Amplex RedCholesterol检测试剂盒(Life technology)对游离胆固醇进行定量。细胞质膜胆固醇的含量由未被氧化酶处理的样品胆固醇含量减去氧化酶处理过的样品胆固醇含量得到。
5.OVA抗原激活OT-I CD8T细胞
将C57BL/6小鼠脾脏细胞中的T细胞用T细胞阳性磁珠分选试剂盒(Miltenyibiotech)去除,然后分别递呈OVA抗原OVA257-264(SIINFEKL,简称N4),及突变体SAINFEKL(简称A2),SIITFEKL(简称T4),SIIGFEKL(简称G4)以及自身抗原RTYTYEKL(简称Catnb)和阳性选择抗原SIIRFEKL(简称R4)作为抗原递呈细胞(APC)。具体的,为分别将OVA抗原OVA257-264,A2,T4,G4,R4和自身抗原Catnb与前述处理后的小鼠脾脏细胞一起在37℃孵育以得到抗原呈递细胞,同时;将阴性磁珠分选得到的OT-I CD8T细胞与抗原递呈细胞共同培养(1:5)24小时,在培养的最后4小时加入5μg/ml BFA(Brefeldin A,布雷菲德菌素A),以阻止细胞因子向胞外分泌,最后通过胞内染色和流式检测细胞因子的表达。
6.检测CD8T细胞(CTL)的细胞杀伤能力。
分离OT-I转基因小鼠的脾脏,红细胞裂解液去除红细胞后用5nM OVA257-264(N4)刺激,并在培养基中加入10ng/ml IL-2,3天后换液补加IL-2并继续培养2天得到分化成熟的杀伤性CD8T细胞(CTL)。将EL-4小鼠淋巴瘤细胞分别与2nM抗原肽OVA257-264及其突变体A2,T4,G4,R4和自身抗原Catnb在37℃孵育30分钟以递呈相关抗原,PBS洗3次后将递呈抗原的EL-4细胞和CTL重悬在无酚红RPMI1640培养基(含2%FBS)中,然后以1:1,1:2,1:5比例混合(EL-4细胞数量为1×105)加入96孔板中,200g离心2分钟。37℃CO2培养箱培养4小时,200g离心5分钟,取培养上清液,通过CytoTox 96Non-Radioactive Cytotoxicity试剂盒(Promega)检测培养基中乳酸脱氢酶LDH的释放以计算CTL对靶细胞的杀伤效率。
7.小鼠B16黑色素瘤模型
B16F10黑色素瘤细胞用胰酶消化后,PBS洗3次后过40μm滤网,计数用PBS稀释至2×106/ml,然后皮下注射(s.c.)到8-10周雄鼠背部左侧(100μl体积),从第10天开始,游标卡尺测量肿瘤大小,每两天测一次,肿瘤大小=长度×宽度。当肿瘤其最长轴超过20mm时,将小鼠安乐死,并记录死亡时间点。
8.小鼠黑色素瘤T细胞过继治疗
表达鸡卵清蛋白Ovalbumin的B16F10-OVA黑色素瘤细胞(Ref)(可参考文献:Yang J etal.,Kuper-type immunological synapse characteristics do not predict anti-brain tumor cytolyticT-cell function in vivo.Proc Natl Acad Sci U S A.2010.197(10):4716-21;获Zhou P et al.,In vivodiscovery of immunotherapy targets in the tumour microenvironment.Nature.2014,506(7486):52-7获得)用胰酶消化后,PBS洗3次后过40μm滤网,计数用PBS稀释至2×106/ml,然后皮下注射(s.c.)到8-10周雄鼠背部左侧(100μl)。在注射肿瘤细胞后第10天,将成瘤且肿瘤大小一致的小鼠随机分成3组,以尾静脉注射(i.v.)的方式分别注射200μl PBS,野生型OT-I CTL和ACAT1基因敲除的OT-I CTL(1.5×106),3天后开始测量肿瘤大小,每两天测一次。当肿瘤其最长轴超过20mm时,将小鼠安乐死,并记录死亡时间点。
ACAT1基因敲除的OT-I小鼠的获得:CD4Cre小鼠与Acat1flox/flox小鼠交配获得CD4Cre-Acat1flox/flox,然后与OT I TCR转基因小鼠交配,最终获得OT-I-CD4Cre-Acat1flox/flox小鼠和相应的对照小鼠OT-I-e-Acat1flox/flox小鼠。
CTL的诱导方法是:取野生型或ACAT1基因敲除的OT I小鼠脾脏,分别用10nM的OVA257-264(N4)肽段刺激,并提供10ng/ml IL-2,刺激2天后,在第3天换无N4肽段的培养基(含10ng/ml IL-2)继续培养2天即可获得成熟的CTL。
9.Avasimibe,α-PD-1抗体治疗小鼠黑色素瘤
B16F10黑色素瘤细胞用胰酶消化后,PBS洗3次后过40μm滤网,计数用PBS稀释至2×106/ml,然后皮下注射(s.c.)到8-10周雄鼠背部左侧(100μl),在注射肿瘤细胞后第10天,将成瘤且肿瘤大小一致的小鼠随机分成4组,以腹腔注射(i.p.)或者灌胃(i.g.)对小鼠进行治疗,Avasimibe剂量为15mg/kg,每两天一次;α-PD-1抗体(J43,Bio X Cell)剂量为200μg/次,每三天一次;在注射肿瘤第12天开始测量肿瘤大小,每两天测一次。当肿瘤其最长轴超过20mm时,将小鼠安乐死,并记录死亡时间点。
10.小鼠LLC肺癌模型
LLC(Lewis Lung Carcinoma)肺癌细胞用胰酶消化后,PBS洗3次后过40μm滤网,计数用PBS稀释至107/ml,然后尾静脉注射(i.v.)到8-10周雄鼠体内(200μl体积)。在注射肿瘤细胞后第11天,将荷瘤小鼠随机分成2组,以腹腔注射(i.p.)的方式给小鼠注射Avasimibe,剂量为15mg/kg,3天注射一次,连续给药9次。在注射肿瘤细胞后7周,取部分小鼠的肺脏,对肿瘤斑点进行计数,以评估肿瘤治疗效果,同时记录剩余小鼠的死亡时间点。
11.超高分辨率随机光学重构显微镜STORM(Super-resolution Stochastical OpticalReconstruction Microscopy)检测细胞质膜上TCR(抗原受体)的分布。
超高分辨率随机光学重构显微镜STORM成像在Nikon N-STORM成像系统上进行,该系统配有ECLIPSE Ti-E电动相差显微镜,Apochromat 100倍TIRF油镜和EMCCD。荧光染料选用Alexa647,通过647nm连续可见光激光器(200mW)和450nm二极管激光器激发荧光染料。成像时TIRF角度参数在3900-4000,以保证样品成像深度在1μm左右。CD8T细胞和激活的CD8T细胞(10μg/mlα-CD3抗体37℃刺激10分钟)通过多聚赖氨酸贴在Ibidi 35mmμ-Dish上,然后4%PFA固定;PBS洗3次后用2μg/ml Alexa647-α-CD34℃标记2小时。成像前,将PBS替换成成像缓冲液(TBS,含100mm MEA)。成像速度保持在90-95帧/秒,重构的图像用NIS Elements AR获取,图像信息由20,000-25,000帧图片组成。
为了分析TCR在质膜上的成簇情况,对图片中TCR微簇的位置信息用Ripley’s K function和Matlab分析,L(r)-r值代表在一定半径(r)内分子聚集的概率,而L(r)-r最大值对应的r即分析选定区域内TCR微簇的半径。
12.全内反射荧光显微成像TIRFM(Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy,)方法动态检测T细胞免疫突触形成过程。
DOPC(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)与生物素标记的DOPE(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-cap-biotin)以25:1的摩尔比混合,超声形成脂质体。使用No.1.5H厚度玻璃底的细胞培养皿,食人鱼酸液处理玻璃底表面并用双蒸水清洗干净。用浓度0.1mM的生物素标记的脂质体孵育玻片20分钟。PBS充分清洗后,用链霉亲和素(streptavidin)孵育30分钟。PBS充分清洗后,用生物素标记的小鼠CD3ε抗体(bionylatedα-mCD3ε,145-2C11)孵育30分钟。PBS充分清洗后,用1%酪蛋白封闭20分钟。PBS充分清洗,平面脂双分子层准备完毕。
α-mTCRβ抗体(Biolegend)进行荧光染料标记(Alexa Fluor 568NHS Ester,LifeTechnologies),经脱盐柱脱盐后使用Papain蛋白酶酶切(Pierce Fab Micro Preparation Kit,Thermo Scientific),最后经Protein A柱分离(Protein A Plus Spin Column,Thermo Scientific)得到Alexa 568-α-mTCRβ-Fab。
新鲜分离的小鼠脾脏淋巴细胞用Alexa568-α-mTCRβ-Fab和FITC-α-mCD8a(eBioscience)冰上染色,PBS清洗2次。重悬的细胞加入如上所述的铺有平面脂双分子层的培养皿,置于37℃加热台,以3秒每帧的速度拍摄,进行活细胞全内反射荧光显微镜成像。或者重悬的细胞加入上文所述铺有平面脂双分子层的培养皿,置于37℃培养箱,刺激一定时间后用4%PFA固定,全内反射荧光显微镜成像。FITC阳性的CD8T细胞用Image Pro Plus software(Media Cybernetics)、ImageJ(NIH)和MATLAB(MathWorks)软件经行数据分析。
13.MTS方法检测肿瘤细胞活率。
B16F10细胞(5×103)重悬于100μl含有1μM Avasimibe或DMSO对照的培养基中。37℃培养24、48、或72小时。加入20μl MTS试剂(Promega),孵育1-3小时后,测量490nm吸光度。490nm处的吸光值与培养中的活细胞数成正比。Avasimibe对细胞活性的影响通过以DMSO处理的细胞为对照组进行归一化处理得到,设定DMSO处理组的细胞活性为1。
14.数据统计分析
除在图释中特别注明外,本文所有数据统计都是用GraphPad Prism(GraphPad Software,Inc.)进行统计分析,分析方法采用two-tailed unpaired Student’s t-test;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,ns:无显著差异(no significant difference)。
15.T细胞特异性敲除ACAT1小鼠的构建及Acat1CKO CD8T、Acat1CKO CD4T细胞的获得
将ACAT1flox/flox小鼠与CD4Cre小鼠交配,获得的小鼠经PCR及Western Blot检测表达量验证为T细胞特异性敲除ACAT1小鼠(CD4Cre-Acat1flox/flox,简称Acat1CKO)。
Acat1CKO CD8T细胞的获得:采用CD8磁珠分选得到(分选试剂盒来自Stemcell)
Acat1CKO CD4T细胞的获得:采用CD4磁珠分选得到(分选试剂盒来自Stemcell)
16.CD8T细胞活化方法
通过磁珠分选得到的新鲜T细胞,重悬于RPMI 1640完全培养基中,α-CD3(5μg/ml)和α-CD28()铺板刺激,37℃CO2培养箱中培养刺激24小时,为进一步用胞内染色-流式细胞术检测细胞因子的表达,在最后4小时补加5mg/ml Brefeldin A以阻断细胞因子向细胞外分泌。
17.ACAT抑制剂增强人PBMC中CD8+T细胞的效应功能
通过Ficoll从健康志愿者体内获得的外周血中分离PBMC,然后用5μg/ml PHA刺激获得CD8+杀伤性T细胞。3天后换成不含PHA的培养液继续培养24小时,以降低本底信号。在使用相应浓度的Avasimibe或CP113,818孵育处理12小时,细胞换液并通过铺板刺激的方式用5μg/mlα-CD3+5μg/mlα-CD28抗体刺激24小时,最后通过胞内染色和流式细胞术检测CD8+T细胞中细胞因子IFNγ和TNFα的表达。