CN106659769A - 用于通过抑制激活素b和/或gdf11来提高红细胞水平和治疗无效性红细胞生成的方法 - Google Patents

用于通过抑制激活素b和/或gdf11来提高红细胞水平和治疗无效性红细胞生成的方法 Download PDF

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Abstract

在某些方面，本公开提供了用于在有此需要的个体中提高红细胞和/或血红蛋白水平的组合物和方法，包括施用有效量的抑制激活素B和/或GDF11的试剂。有需要的个体包括，例如，患有贫血的个体和患有无效性红细胞生成疾病的个体。

Description

用于通过抑制激活素B和/或GDF11来提高红细胞水平和治疗 无效性红细胞生成的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2014年3月21日提交的美国临时专利申请序列号61/969,073和于2014年7月8日提交的美国临时专利申请序列号62/021,923的权益。以上参考的专利申请的全部教导通过引用并入本文中。
发明背景
成熟的红细胞（red blood cell或erythrocyte）负责脊椎动物循环系统中的氧气输送。红细胞含有高浓度的血红蛋白，该蛋白质在肺部于相对高的氧气分压(pO2)下结合氧气并将氧气递送到体内具有相对低pO2的区域。
成熟的红细胞在被称为红细胞生成的过程中由多能造血干细胞产生。后天红细胞生成主要在骨髓和脾红髓中进行。各种信号通路的协同作用控制细胞增殖、分化、存活和死亡的平衡。在正常条件下，红细胞以维持体内恒定的红细胞量的速率产生，并且产量可能响应于各种刺激（包括氧分压或组织需求的升高或降低）而增加或减少。红细胞生成的过程从形成谱系确定的前体细胞开始并历经一系列不同的前体细胞类型。红细胞生成的最终阶段发生在：网织红细胞被释放到血流中并失去其线粒体和核糖体，同时呈现出成熟红细胞的形态。血液中升高的网织红细胞水平或升高的网织红细胞:红细胞比率表明红细胞产生速率升高。
促红细胞生成素(EPO)被广泛认为是脊椎动物后天红细胞生成的最重要的正向调控因子。EPO调节对组织氧分压降低（组织缺氧）和低红细胞水平或低血红蛋白水平的代偿性红细胞生成反应。在人类中，升高的EPO水平通过刺激骨髓和脾脏中的红系祖细胞生成而促进红细胞形成。在小鼠中，EPO主要增强脾脏中的红细胞生成。
EPO的影响通过属于细胞因子受体超家族的细胞表面受体介导。人类EPO受体基因编码含483个氨基酸的跨膜蛋白；然而，活化的EPO受体被认为甚至在不存在配体的情况下以多聚复合体的形式存在[参见，例如，美国专利号6,319,499]。在哺乳动物细胞中表达的克隆的全长EPO受体以类似于红系祖细胞上的天然受体的亲和力结合EPO。EPO与其受体的结合引起构象变化，导致受体活化和生物效应，包括不成熟的幼红细胞的增殖增加、不成熟的幼红细胞的分化增加以及红系祖细胞中的细胞凋亡减少[参见，例如，Liboi 等人，(1993) Proc Natl Acad Sci USA 90:11351-11355 和 Koury 等人，(1990) Science248:378-381]。
医生使用各种形式的重组EPO以在各种临床环境下（特别是在治疗贫血中）提高红细胞水平。贫血是广义的状况，其特征在于血液中的血红蛋白或红细胞低于正常水平。在某些情况下，贫血是由红细胞产生或存活的原发性疾病（例如，地中海贫血病和镰状细胞贫血病）引起的。更常见地，贫血是继发于其它系统的疾病[参见，例如，Weatherall & Provan(2000) Lancet 355, 1169-1175]。贫血可由红细胞产生率降低或破损率升高造成或由失血导致的红细胞损耗造成。贫血可由多种疾病造成，包括例如，急性或慢性肾衰竭或肾病晚期、化学治疗、骨髓增生异常综合征、类风湿性关节炎和骨髓移植。
采用EPO治疗通常引起健康人的血红蛋白在数周内升高约1-3 g/dL。当向贫血个体施用时，此治疗方案经常使得血红蛋白和红细胞水平大幅升高并导致生活质量的提高和更长的生存期。然而，EPO并非普遍有效，而且许多个体即使采用高剂量也难以治疗[参见，例如，Horl 等人，(2000) Nephrol Dial Transplant 15, 43-50]。例如，超过50%的癌症患者对EPO反应不足，大约10%的肾病晚期患者对EPO是低反应性的[参见，例如，Glaspy 等人，(1997) J Clin Oncol 15, 1218-1234 和 Demetri 等人，(1998) J Clin Oncol 16,3412-3425]，并且低于10%的骨髓增生异常综合征患者对EPO反应良好[参见Estey (2003)Curr Opin Hematol 10, 60-670]。若干因素，包括炎症、铁和维生素缺乏、透析不足、铝中毒和甲状旁腺机能亢进，可能预示治疗反应不佳。EPO抗性的分子机制尚不清楚。最近的证据表明，更高剂量的EPO可能与一些患者人群中心血管发病率、肿瘤生长和死亡率的风险增加相关[参见，例如，Krapf 等人，(2009) Clin J Am Soc Nephrol 4:470-480 和 Glaspy(2009) Annu Rev Med 60:181-192]。因此，已经建议以所需的最低剂量施用基于EPO的治疗化合物（例如，促红细胞生成素刺激剂，ESA）以避免红细胞输注[参见，例如，Jelkmann 等人，(2008) Crit Rev Oncol.Hematol 67:39-61]。
无效性红细胞生成是用于描述一类红细胞疾病的术语，其中尽管更早期红系细胞数目增加但红细胞产量减少[参见，例如，Tanno (2010) Adv Hematol 2010:358283]。无效性红细胞生成经常引起贫血、促红细胞生成素水平升高、形成过量数目的红细胞前体以及铁过载。如果这些状况持续，其可以导致脾肿大、肝脏和心脏疾病以及骨损坏和其它并发症。因为无效性红细胞生成患者体内的内源性促红细胞生成素水平通常很高，所以基于EPO的治疗剂经常将无法治疗这些患者的贫血并且/或者可能造成该疾病其它方面的加重（如脾肿大和铁过载）。
因此，本公开的目标是提供用于提高红细胞水平和/或应对无效性红细胞生成背景下的其它疾病的替代方法。
发明概述
在某些方面，本公开提供了用于在个体中提高红细胞水平、治疗或预防贫血并且/或者治疗或预防无效性红细胞生成的方法，包括向有此需要的个体施用有效量的拮抗（抑制）至少激活素B和/或GDF11的试剂或试剂组合。在一些实施方案中，所述抑制激活素B的试剂或试剂组合还抑制一种或多种另外的配体，所述另外的配体结合ActRIIB并通过Smad 2/3转导信号。在一些实施方案中，所述抑制GDF11的试剂或试剂组合还抑制一种或多种另外的配体，所述另外的配体结合ActRIIB并通过Smad 2/3转导信号。例如，所述抑制激活素B和/或GDF11的试剂或试剂组合还可能抑制GDF8。任选地，所述抑制激活素B和/或GDF11的试剂或试剂组合不抑制激活素A。在某些实施方案中，所述抑制激活素B和/或GDF11的试剂或试剂组合还抑制GDF8、激活素A、激活素E、激活素C和BMP6中的一种或多种。在某些实施方案中，所述试剂或试剂组合还可能抑制GDF15、Nodal、GDF3、BMP3和BMP3B中的一种或多种。在某些实施方案中，所述抑制激活素B和/或GDF11的试剂或试剂组合还抑制BMP9与TGFβ超家族的II型受体（例如，ActRIIA和/或ActRIIB）间的相互作用并且/或者抑制BMP10与TGFβ超家族的II型受体（例如，ActRIIA和/或ActRIIB）间的相互作用。优选地，根据本公开的方法所用的试剂或试剂组合不抑制或基本上不抑制BMP9与ALK1之间和/或BMP10与ALK1之间的相互作用（例如，结合、活化Smad 2/3信号转导，等）。可通过本领域已知的多种生物化学测定法以及本文所提供的那些（例如，基于蛋白质的测定法、基于细胞的测定法，等）来评估抑制作用。
在一些实施方案中，所述试剂或试剂组合在基于细胞的测定法中抑制至少激活素B和/或GDF11信号转导（Smad 2/3信号转导）。在一些实施方案中，所述试剂或试剂组合结合激活素B和/或GDF11。在一些实施方案中，所述试剂或试剂组合在基于细胞的测定法中基本上不抑制激活素A信号转导。在一些实施方案中，所述试剂或试剂组合基本上不结合激活素A。在一些实施方案中，所述在基于细胞的测定法中抑制GDF11和/或激活素B信号转导的试剂或试剂组合在基于细胞的测定法中还抑制GDF8、BMP6、激活素C、激活素A、激活素E、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10信号转导中的一种或多种。在一些实施方案中，所述结合GDF11和/或激活素B的试剂或试剂组合还结合GDF8、BMP6、激活素C、激活素A、激活素E、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述试剂是多特异性抗体或多特异性抗体的组合，其结合并且/或者抑制至少GDF11和激活素B。在一些实施方案中，所述多特异性抗体或多特异性抗体的组合基本上不结合并且/或者抑制激活素A。在一些实施方案中，所述多特异性抗体或多特异性抗体的组合还结合并且/或者抑制GDF8。在一些实施方案中，所述结合并且/或者抑制GDF11和/或激活素B的多特异性抗体或多特异性抗体的组合还结合并且/或者抑制激活素C、激活素E、激活素A、GDF8、ActRIIA、ActRIIB、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述多特异性抗体是双特异性抗体或双特异性抗体的组合。在一些实施方案中，所述双特异性抗体或双特异性抗体的组合结合并且/或者抑制至少GDF11和激活素B。在一些实施方案中，所述双特异性抗体或双特异性抗体的组合基本上不结合并且/或者抑制激活素A。
在一些实施方案中，双特异性抗体包含彼此相连的两种不同的单特异性抗体。在一些实施方案中，所述抗体是嵌合抗体。在一些实施方案中，所述抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，所述抗体是人抗体。
在一些实施方案中，所述抗体是单链抗体。在一些实施方案中，所述抗体是F(ab’)2片段。在一些实施方案中，所述抗体是单链双抗体、串联单链Fv片段、串联单链双抗体、或包含单链双抗体和至少一部分免疫球蛋白重链恒定区的融合蛋白。
在一些实施方案中，所述抗体是双可变域免疫球蛋白。
在一些实施方案中，所述抗体包含异源部分。在一些实施方案中，所述异源部分是糖、可检测标记物或稳定部分。
在一些实施方案中，所述试剂是GDF11/激活素B陷阱，其包含与SEQ ID NO:1的氨基酸29-109至少80%（例如，至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%）相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述GDF11/激活素B陷阱基本上不结合并且/或者抑制激活素A。在一些实施方案中，所述GDF11/激活素A陷阱在对应于SEQ ID NO:1的位置79的位置不包含酸性氨基酸。在一些实施方案中，所述试剂是GDF11/激活素B陷阱，其包含与SEQ ID NO:1的氨基酸29-109至少80%（例如，至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%）相同的氨基酸序列，并且其中所述GDF11/激活素B陷阱以小于100 pM、小于10 pM或小于1 pM的KD 结合激活素B。在一些实施方案中，所述GDF11/激活素B陷阱以1 nM-750 pM、750 pM-500 pM、500pM-250 pM、250pM-100 pM、100 pM – 50 pM、50-25 pM、25-10 pM或10-1 pM的KD 结合激活素B。在一些实施方案中，所述试剂是GDF11/激活素B陷阱，其包含与SEQ ID NO:1的氨基酸29-109至少80%（例如，至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%）相同的氨基酸序列，并且其中所述GDF11/激活素B陷阱对GDF11的结合亲和力比ActRIIB受体的野生型配体结合域的结合亲和力高3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍或20倍。在一些实施方案中，所述试剂是GDF11/激活素B陷阱，其包含与SEQ ID NO:1的氨基酸29-109至少80%（例如，至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%）相同的氨基酸序列，并且其中所述GDF11/激活素B陷阱对激活素B的结合亲和力比ActRIIB受体的野生型配体结合域的结合亲和力高3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍或20倍。
在一些实施方案中，所述GDF11/激活素B陷阱包含与SEQ ID NO:1的氨基酸29-109至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述GDF11/激活素B陷阱包含与SEQ ID NO:1的氨基酸25-131至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述GDF11/激活素B陷阱包含与SEQID NO: 3或4的氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述GDF11/激活素B陷阱包含多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:5或6的氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述GDF11/激活素B陷阱包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述GDF11/激活素B陷阱包含与SEQ ID NO:48的氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述GDF11/激活素B陷阱包含与SEQ ID NO:49的氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述试剂是GDF11/激活素B陷阱，其包含与SEQ ID NO:9的氨基酸30-110至少80%相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述试剂是GDF11/激活素B陷阱，其包含与SEQ ID NO:9的氨基酸30-110至少80%相同的氨基酸序列，并且其中所述GDF11/激活素陷阱对GDF11的结合亲和力比ActRIIA受体的野生型配体结合域的结合亲和力高3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍或20倍。在一些实施方案中，所述试剂是GDF11/激活素B陷阱，其包含与SEQ ID NO:9的氨基酸30-110至少80%相同的氨基酸序列，并且其中所述GDF11/激活素B陷阱对激活素B的结合亲和力比ActRIIA受体的野生型配体结合域的结合亲和力高3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍或20倍。在一些实施方案中，所述GDF11/激活素B陷阱包含与SEQ ID NO:9的氨基酸30-110至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述GDF11/激活素B陷阱包含与SEQ ID NO:10的氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述GDF11/激活素B陷阱包含多肽，所述多肽包含与SEQ IDNO:11的氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述GDF11/激活素B陷阱包含与SEQ ID NO:20的氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述试剂可以是本文公开的GDF11陷阱、激活素B陷阱和GDF11/激活素B陷阱中的任何一种或其组合。
在一些实施方案中，所述GDF11/激活素B陷阱是融合蛋白，其除GDF11/激活素B陷阱多肽域之外还包含一个或多个异源多肽域，所述一个或多个异源多肽域增强下列中的一项或多项：体内半衰期、体外半衰期、摄入/施用、组织定位或分布、形成蛋白复合体、该融合蛋白的多聚化和/或纯化。在一些实施方案中，所述GDF11/激活素B陷阱融合蛋白包含异源多肽域，所述异源多肽域选自：免疫球蛋白Fc域和血清白蛋白。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc域是IgG1 Fc域。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc域包含选自SEQ ID NO:16或17的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白还包含位于所述陷阱多肽域和所述免疫球蛋白Fc域之间的接头域。在一些实施方案中，所述接头域是TGGG接头(SEQ ID NO:45)。在一些实施方案中，所述接头域可以是本文公开的接头域中的任何一种。在一些实施方案中，融合蛋白可包含纯化子序列如表位标签、FLAG标签、多组氨酸序列和GST融合。在某些实施方案中，GDF11/激活素B陷阱融合包含前导序列。所述前导序列可以是天然前导序列或异源前导序列。在某些实施方案中，所述前导序列是组织纤维蛋白溶酶原激活因子（TPA）前导序列。在实施方案中，GDF11/激活素B陷阱融合蛋白包含如式A-B-C所示的氨基酸序列。B部分是本公开的GDF11/激活素B陷阱。A和C部分可独立地为零个、一个或不止一个氨基酸，而A和C部分均与B是异源的。A和/或C部分可通过接头序列被附接至B部分。在一些实施方案中，所述GDF11/激活素B陷阱融合蛋白可包含本文公开的任何融合蛋白。
在一些实施方案中，所述GDF11/激活素B陷阱包含选自以下的一种或多种氨基酸修饰：糖基化的氨基酸、聚乙二醇化的氨基酸、法呢基化的氨基酸、乙酰化的氨基酸、生物素酰化的氨基酸、结合至脂质部分的氨基酸、结合至有机衍生剂的氨基酸。在一些实施方案中，所述GDF11/激活素B陷阱是糖基化的并具有哺乳动物糖基化模式。在一些实施方案中，所述GDF11/激活素B陷阱具有可得自中国仓鼠卵巢细胞系的糖基化模式。通常，GDF陷阱优选在适当地介导所述GDF陷阱的天然糖基化的哺乳动物细胞系中表达，以便减弱患者体内不利的免疫应答。已经成功使用了人和CHO细胞系，并且预计其它常用的哺乳动物表达载体将是可用的。在一些实施方案中，所述GDF11/激活素B陷阱可包含本文公开的任何氨基酸修饰或其组合。
在某些方面，本公开提供了编码GDF11/激活素B陷阱多肽的核酸。分离的多核苷酸可包含如上所述的可溶性GDF陷阱多肽的编码序列。本文公开的核酸可被可操作地连接至启动子用于表达，并且本公开提供了用此类重组多核苷酸转化的细胞。优选地，所述细胞是哺乳动物细胞如CHO细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞可选自本文公开的用于此目的的任何细胞。
在某些方面，本公开提供了制备GDF11/激活素B陷阱多肽的方法。此类方法可包括在合适的细胞（如中国仓鼠卵巢（CHO）细胞）中表达本文公开的任何核酸。此类方法可包括：a) 在适于表达GDF11/激活素B陷阱多肽的条件下培养细胞，其中所述细胞经GDF11/激活素B陷阱表达构建体转化；以及b) 回收由此表达的GDF11/激活素B陷阱多肽。可使用从细胞培养物中获得蛋白质的任何众所周知的技术以粗级分、部分纯化级分或高度纯化级分的形式回收GDF11/激活素B陷阱多肽。
在某些方面，本公开提供了用于在个体中提高红细胞水平或治疗或预防贫血的方法，包括向有此需要的个体施用有效量的抑制激活素B和GDF11信号转导的试剂组合。在一些实施方案中，所述试剂组合在基于细胞的测定法中抑制激活素B和GDF11信号转导。在一些实施方案中，所述试剂组合基本上不抑制激活素A信号转导。在一些实施方案中，所述试剂组合在基于细胞的测定法中基本上不抑制激活素A信号转导。在一些实施方案中，所述试剂组合基本上不结合激活素A。在一些实施方案中，所述抑制GDF11和/或激活素B的试剂中的一种或多种还抑制GDF8、BMP6、激活素A、激活素C、激活素E、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3B、BMP9和BMP10中的一种或多种的信号转导。
在一些实施方案中，所述试剂组合包含至少一种试剂，所述至少一种试剂是结合GDF11的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述试剂组合包含至少一种试剂，所述试剂是结合激活素B的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述试剂组合包含两种或多种抗体或其抗原结合片段的组合，所述两种或多种抗体或其抗原结合片段针对本文公开的两种或多种靶标（例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、GDF11、GDF8、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10）。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是嵌合抗体或其片段。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是人源化抗体或其片段。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是人抗体或其片段。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是单链抗体。在一些实施方案中，所述抗原结合片段选自：Fab、Fab′、F(ab′)2、F(ab′)3、Fd、Fv、域抗体。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含异源部分。在一些实施方案中，所述异源部分是糖、可检测标记物或稳定部分。
在一些实施方案中，所述试剂组合包含至少一种试剂，所述至少一种试剂是GDF11陷阱，并且其中所述GDF11陷阱包含多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:1的氨基酸29-109至少80%（例如，至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%）相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述试剂组合包含至少一种试剂，所述至少一种试剂是激活素B陷阱，并且其中所述激活素B陷阱包含多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:1的氨基酸29-109至少80%（例如，至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%）相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述试剂组合包含至少一种GDF11陷阱或激活素B陷阱，所述至少一种GDF11陷阱或激活素B陷阱包含与SEQ ID NO:1的氨基酸29-109至少80%（例如，至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%）相同的氨基酸序列，并且其中所述GDF11陷阱或激活素B陷阱在对应于SEQ ID NO:1的位置79的位置不包含酸性氨基酸。在一些实施方案中，所述试剂是GDF11陷阱，其包含与SEQ ID NO:1的氨基酸29-109至少80%（例如，至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%）相同的氨基酸序列，并且其中所述GDF11陷阱以小于100 pM、小于10 pM或小于1 pM的KD 结合激活素B。在一些实施方案中，所述GDF11陷阱以1 nM-750 pM、750 pM-500 pM、500 pM-250 pM、250pM-100 pM、100 pM – 50 pM、50-25pM、25-10 pM或10-1 pM的KD 结合激活素B。在一些实施方案中，所述试剂是GDF11陷阱，其包含与SEQ ID NO:1的氨基酸29-109至少80%（例如，至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%）相同的氨基酸序列，并且其中所述GDF11陷阱对GDF11的结合亲和力比ActRIIB受体的野生型配体结合域的结合亲和力高3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍或20倍。在一些实施方案中，所述试剂是激活素B陷阱，其包含与SEQ ID NO:1的氨基酸29-109至少80%（例如，至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%）相同的氨基酸序列，并且其中所述GDF11陷阱对激活素B的结合亲和力比ActRIIB受体的野生型配体结合域的结合亲和力高3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍或20倍。
在一些实施方案中，所述GDF11陷阱或激活素B陷阱包含与SEQ ID NO:1的氨基酸29-109至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述GDF11陷阱或激活素B陷阱包含与SEQ ID NO:1的氨基酸25-131至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述GDF11陷阱或激活素B陷阱包含与SEQ ID NO: 3或4的氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述GDF11陷阱或激活素B陷阱包含多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO: 5或6的氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述GDF11陷阱或激活素B陷阱包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述试剂组合包含至少一种试剂，所述至少一种试剂是GDF11陷阱，并且其中所述GDF11陷阱包含多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:9的氨基酸30-110至少80%（例如，至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%）相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述试剂组合包含至少一种试剂，所述至少一种试剂是激活素B陷阱，并且其中所述激活素B陷阱包含多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:9的氨基酸30-110至少80%（例如，至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%）相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述试剂是GDF陷阱，其包含与SEQ ID NO:9的氨基酸30-110至少80%相同的氨基酸序列，并且其中所述GDF11陷阱对GDF11的结合亲和力比ActRIIA受体的野生型配体结合域的结合亲和力高3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍或20倍。在一些实施方案中，所述试剂是激活素B陷阱，其包含与SEQ ID NO:9的氨基酸30-110至少80%相同的氨基酸序列，并且其中所述激活素B陷阱对激活素B的结合亲和力比ActRIIA受体的野生型配体结合域的结合亲和力高3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍或20倍。在一些实施方案中，所述GDF11陷阱或激活素B陷阱包含与SEQ ID NO:9的氨基酸30-110至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述GDF11陷阱或激活素B陷阱包含与SEQ ID NO:10的氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述GDF11陷阱或激活素B陷阱包含多肽，所述多肽包含与SEQID NO:11的氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述GDF11陷阱或激活素B陷阱包含与SEQ ID NO:20的氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述GDF11陷阱或激活素B陷阱是融合蛋白，其除GDF11陷阱或激活素B陷阱多肽域之外还包含一个或多个异源多肽域，所述异源多肽域增强下列中的一项或多项：体内半衰期、体外半衰期、摄入/施用、组织定位或分布、形成蛋白复合体、该融合蛋白的多聚化和/或纯化。在一些实施方案中，所述GDF11陷阱或激活素B陷阱融合蛋白包含异源多肽域，所述异源多肽域选自：免疫球蛋白Fc域和血清白蛋白。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc域是IgG1 Fc域。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc域包含选自SEQ IDNO: 16或17的氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白还包含位于所述陷阱多肽域和所述免疫球蛋白Fc域之间的接头域。在一些实施方案中，所述接头域是TGGG接头。在一些实施方案中，所述接头域可以是本文公开的接头域中的任何一种。在一些实施方案中，融合蛋白可包含纯化子序列如表位标签、FLAG标签、多组氨酸序列和GST融合。在某些实施方案中，GDF11陷阱或激活素B陷阱融合包含前导序列。所述前导序列可以是天然前导序列或异源前导序列。在某些实施方案中，所述前导序列是组织纤维蛋白溶酶原激活因子（TPA）前导序列。在实施方案中，GDF11陷阱或激活素B陷阱融合蛋白包含如式A-B-C所示的氨基酸序列。B部分是本公开的GDF11陷阱或激活素B陷阱。A和C部分可独立地为零个、一个或不止一个氨基酸，而A和C部分均与B是异源的。A和/或C部分可通过接头序列被附接至B部分。在一些实施方案中，所述GDF11陷阱或激活素B陷阱融合蛋白可包含本文公开的任何融合蛋白。
在一些实施方案中，所述GDF11陷阱或激活素B陷阱包含选自以下的一种或多种氨基酸修饰：糖基化的氨基酸、聚乙二醇化的氨基酸、法呢基化的氨基酸、乙酰化的氨基酸、生物素酰化的氨基酸、结合至脂质部分的氨基酸、结合至有机衍生剂的氨基酸。在一些实施方案中，所述GDF11陷阱或激活素B陷阱是糖基化的并具有哺乳动物糖基化模式。在一些实施方案中，所述GDF11陷阱或激活素B陷阱具有可得自中国仓鼠卵巢细胞系的糖基化模式。通常，GDF11陷阱优选在适当地介导所述GDF11陷阱的天然糖基化的哺乳动物细胞系中表达，以便减弱患者体内不利的免疫应答。已经成功使用了人和CHO细胞系，并且预计其它常用的哺乳动物表达载体将是可用的。在一些实施方案中，所述GDF11陷阱或激活素B陷阱可包含本文公开的任何氨基酸修饰或其组合。
在某些方面，本公开提供了编码GDF11陷阱或激活素B陷阱多肽的核酸。分离的多核苷酸可包含如上所述的可溶性GDF11陷阱多肽或激活素B陷阱多肽的编码序列。本文公开的核酸可被可操作地连接至启动子用于表达，并且本公开提供了用此类重组多核苷酸转化的细胞。优选地，所述细胞是哺乳动物细胞如CHO细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞可选自本文公开的用于此目的的任何细胞。
在某些方面，本公开提供了制备GDF11陷阱或激活素B陷阱多肽的方法。此类方法可包括在合适的细胞（如中国仓鼠卵巢（CHO）细胞）中表达本文公开的任何核酸。此类方法可包括：a) 在适于表达GDF11陷阱或激活素B陷阱多肽的条件下培养细胞，其中所述细胞经GDF11陷阱或激活素B陷阱表达构建体转化；以及b) 回收由此表达的GDF11/激活素B陷阱多肽。可使用从细胞培养物中获得蛋白质的任何众所周知的技术以粗级分、部分纯化级分或高度纯化级分的形式回收GDF11/激活素B陷阱多肽。
在一些实施方案中，可以将本文公开的GDF11陷阱、激活素B陷阱和GDF11/激活素B陷阱中的任何两种或多种组合起来。
在一些实施方案中，所述GDF11和/或激活素B拮抗剂是小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合。在一些实施方案中，所述试剂组合包含至少一种试剂，所述至少一种试剂是激活素B的小分子拮抗剂。在一些实施方案中，所述试剂组合包含至少一种试剂，所述至少一种试剂是GDF11的小分子拮抗剂。在一些实施方案中，所述GDF11和/或激活素B小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合不结合并且/或者抑制激活素A。在一些实施方案中，所述GDF11和/或激活素B小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合还结合并且/或者抑制GDF8。在一些实施方案中，所述GDF11和/或激活素B小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合还结合并且/或者抑制激活素A、激活素C、激活素E、GDF8、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3和BMP10中的一种或多种。
在另一方面，本公开的拮抗试剂或试剂组合是抑制至少GDF11和/或激活素B的多核苷酸拮抗剂。在一些实施方案中，本公开的拮抗剂多核苷酸抑制至少GDF11和/或激活素B的表达（例如，转录、翻译和/或细胞分泌）。任选地，本公开的多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂组合不抑制激活素A（例如，不抑制激活素A的表达和/或活性）。任选地，本公开的多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂组合还抑制GDF8（例如，抑制GDF8的表达和/或活性）。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂组合（其抑制GDF11和/或激活素B（例如，GDF11和/或激活素B的表达和/或活性））还抑制（例如，抑制表达和／或活性）激活素E、激活素C、激活素A、GDF8、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3和BMP3B中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述多核苷酸分子是反义寡核苷酸，其杂交至基因转录物以抑制该基因的表达，所述基因选自：激活素B、激活素C、激活素E、GDF11和GDF8、激活素A、GDF15、GDF3、Nodal、BMP3和BMP3B。在一些实施方案中，所述试剂组合包含反义寡核苷酸，其杂交至激活素B的转录物并抑制激活素B表达。在一些实施方案中，所述试剂组合包含反义寡核苷酸，其杂交至GDF11的转录物并抑制GDF11表达。在一些实施方案中，所述试剂组合包含两种或多种反义寡核苷酸的组合，所述两种或多种反义寡核苷酸抑制本公开的两种或多种靶标（例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、GDF11、GDF8、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3和BMP3B）的表达。
在一些实施方案中，所述多核苷酸分子包含靶向基因转录物的RNAi分子，所述基因选自：激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、BMP6、GDF11、GDF8、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3和BMP3B。在一些实施方案中，所述多核苷酸分子包含靶向GDF11转录物的RNAi分子。在一些实施方案中，所述多核苷酸分子包含靶向激活素B转录物的RNAi分子。在一些实施方案中，所述试剂组合包含两种或多种RNAi分子的组合，所述两种或多种RNAi分子抑制本公开的两种或多种靶标（例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、GDF11、GDF8、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3和BMP3B）的表达。
在一些实施方案中，所述RNAi分子包括siRNA。在一些实施方案中，所述siRNA长约19至约45个核苷酸。在一些实施方案中，所述siRNA长约25至约30个核苷酸。在一些实施方案中，所述siRNA长约10至约20个核苷酸。在一些实施方案中，所述RNAi分子包括shRNA。在一些实施方案中，所述shRNA分子的茎长为19-29个核苷酸。在一些实施方案中，所述shRNA分子的茎长为19-23个核苷酸。在一些实施方案中，所述shRNA的环区长为5-9个核苷酸。
在一些实施方案中，本文公开的任何GDF11拮抗剂（例如，GDF11陷阱多肽、抗-GDF11抗体、小分子拮抗剂、多肽或多核苷酸拮抗剂）均可以与本公开的激活素B拮抗剂（例如，激活素B陷阱多肽、抗-激活素B抗体、小分子拮抗剂、多肽或多核苷酸拮抗剂）组合以同时抑制GDF11和激活素B活性（例如，结合并且/或者活化ActRIIA和/或ActRIIB受体的能力）。
在一些实施方案中，本公开的方法是用于在有此需要的个体中提高红细胞。在一些实施方案中，所述方法是用于在有此需要的个体中治疗或预防贫血。在一些实施方案中，贫血与以下一项或多项有关：多发性骨髓瘤、慢性或急性肾病或衰竭、对该个体的化学治疗、骨髓增生异常综合征以及地中海贫血。在一些实施方案中，所述地中海贫血为β-地中海贫血。在一些实施方案中，所述肾衰竭为晚期肾衰竭。在一些实施方案中，所述个体患有镰状细胞贫血。
附图简述
本专利或申请文件包含至少一幅彩图。当应要求并支付必要费用时，专利局将提供包含彩图的本专利或专利申请公布的拷贝。
图1示出了包含本文基于对多个ActRIIB和ActRIIA晶体结构的综合分析所推断出的残基的人ActRIIA(SEQ ID NO: 36)与人ActRIIB(SEQ ID NO: 46)的胞外域的比对，所述残基（用框标明）直接接触配体（配体结合口袋）。
图2示出了各种脊椎动物ActRIIB蛋白与人ActRIIA的多序列比对(SEQ ID NO:37-44)。
图3A和3B描绘了人GDF11 cDNA序列(NCBI参考序列号NM_005811.3) (SEQ ID NO:24)。
图4描绘了人GDF11前体蛋白序列的氨基酸序列(NCBI参考序列号NP_005802.1)(SEQ ID NO: 25)。
图5A和5B描绘了人激活素B cDNA序列(NCBI参考序列号NM_002193.2) (SEQ IDNO: 26)。
图6描绘了人激活素B前体蛋白的氨基酸序列(NCBI参考序列号NP_002184.2)(SEQ ID NO: 27)。
图7描绘了人激活素E cDNA序列(GenBank登录号NM_031479.3) (SEQ ID NO:28)。
图8描绘了人激活素E前体蛋白的氨基酸序列(GenBank登录号 NP_113667.1)(SEQ ID NO: 29)。
图9A和9B描绘了人激活素C cDNA序列(NCBI参考序列号NM_005538.3) (SEQ IDNO: 30)。
图10描绘了人激活素C前体蛋白的氨基酸序列(NCBI参考序列号NP_005529.1)(SEQ ID NO: 31)。
图11描绘了人GDF8 cDNA序列(NCBI参考序列号NM_005259.2) (SEQ ID NO: 32)。
图12描绘了人GDF8前体蛋白的氨基酸序列(NCBI参考序列号NP_005250.1) (SEQID NO: 33)。
图13描述了ActRIIB(L79D 25-131)-Fc的配体结合概况(参见，例如，美国专利号8,058,229)，其相对于各种ActRII配体(GDF11、GDF8、激活素A、激活素B、BMP10、BMP6和BMP9)表征，如通过表面等离子体共振测定的。
图14描绘了人BMP6 cDNA序列(NCBI参考序列号NM_001718.4) (SEQ ID NO: 34)。
图15描绘了人BMP6前体蛋白的氨基酸序列(NCBI参考序列号NP_001709.1) (SEQID NO: 35)。
图16描绘了人GDF15前体蛋白的氨基酸序列(NCBI参考序列号NP_004855.2) (SEQID NO: 50)。
图17描绘了人GDF15 cDNA序列(NCBI参考序列号NM_004864.2) (SEQ ID NO:51)。
图18描绘了人Nodal前体蛋白的氨基酸序列(NCBI参考序列号NP_060525.3) (SEQID NO: 52)。
图19描绘了人Nodal cDNA序列(NCBI参考序列号NM_018055.4) (SEQ ID NO:53)。
图20描绘了人GDF3前体蛋白的氨基酸序列(NCBI参考序列号NP_065685.1) (SEQID NO: 54)。
图21描绘了人GDF3 cDNA序列(NCBI参考序列号NM_020634.1) (SEQ ID NO: 55)。
图22描绘了人BMP3前体蛋白的氨基酸序列(NCBI参考序列号NP_001192.2) (SEQID NO: 56)。
图23A和23B描绘了人BMP3 cDNA序列(NCBI参考序列号NM_001201.2) (SEQ IDNO: 57)。
图24描绘了人BMP3B前体蛋白的氨基酸序列(NCBI参考序列号NP_004953.1) (SEQID NO: 58)。
图25描绘了人BMP3B cDNA序列(NCBI参考序列号NM_004962.3) (SEQ ID NO:59)。
图26描绘了人BMP9前体蛋白的氨基酸序列(NCBI参考序列号NP_057288.1) (SEQID NO: 60)。
图27描绘了人BMP9 cDNA序列(NCBI参考序列号NM_016204.2) (SEQ ID NO: 61)。
图28描绘了人BMP10前体蛋白的氨基酸序列(NCBI参考序列号NP_055297.1) (SEQID NO: 62)。
图29描绘了人BMP10 cDNA序列(NCBI参考序列号NM_014482.1) (SEQ ID NO:63)。
图30示出了用抗-激活素B抗体(Ab)、抗-GDF8 Ab、双特异性抗-GDF8/GDF11 Ab或抗-激活素B Ab与双特异性抗-GDF8/GDF11 Ab的组合治疗对C57BL6小鼠(n = 5只小鼠/组)中红细胞水平的影响。数据以相对于在用媒介物（PBS）治疗的个体中观察到的红细胞水平的百分比增加示出。
发明详述
1.概述
转化生长因子（TGF-β）超家族包括多种生长因子，其分享共同的序列元件和结构基序。已知这些蛋白质在脊椎动物和无脊椎动物中各种各样的细胞类型上发挥生物学效应。该超家族的成员于胚胎发育期间在图式形成和组织特化上发挥重要功能，并且可以影响多种分化过程，包括脂肪生成、肌发生、软骨发生、心脏发生、血生成、神经发生和上皮细胞分化。通过操纵TGF-β家族成员的活性，经常有可能引起生物体内显著的生理变化。例如，皮埃蒙特牛（Piedmontese）和比利时蓝牛（Belgian Blue）品种在GDF8（也称为肌肉生长抑制素）基因中携带功能丧失型突变，其引起肌肉质量的显著增加[参见，例如，Grobet 等人，(1997)Nat Genet.17(1):71-4]。此外，在人类中，失活的GDF8等位基因与肌肉质量增加以及（据报道）出色的力量相关［参见，例如，Schuelke 等人，(2004) N Engl J Med, 350:2682-8］。
TGF-β信号由I型和II型丝氨酸/苏氨酸激酶受体的异源复合体介导，在配体刺激下，其磷酸化并活化下游Smad蛋白（例如，Smad蛋白1、2、3、5和8）[参见，例如，Massagué(2000) Nat. Rev. Mol.Cell Biol.1:169-178]。这些I型和II型受体是跨膜蛋白，由具有半胱氨酸富集区的配体结合胞外域、跨膜域和具有预测的丝氨酸/苏氨酸特异性的胞质域构成。I型受体对于信号转导是必需的。II型受体对于结合配体和表达I型受体是必需的。I型和II型激活素受体在配体结合后形成稳定复合体，导致I型受体被II型受体磷酸化。
激活素是二聚多肽生长因子，属于TGF-β超家族。存在三种主要的激活素形式（A、B和AB），其为两种密切相关的β亚基的同源/异源二聚体（分别为βAβA、βBβB和βAβB）。人类基因组还编码激活素C和激活素E，其主要在肝脏中表达，并且含有βC或βE的异源二聚形式也是已知的。
已经识别出两种相关的II型激活素受体，ActRIIA（由ACVR2A基因编码）和ActRIIB（由ACVR2B基因编码）[参见，例如，Mathews 和 Vale (1991) Cell 65:973-982; 以及Attisano等人，(1992) Cell 68: 97-108]。除了激活素，ActRIIA和ActRIIB还可以与若干种其它TGF-β家族蛋白在生物化学上相互作用，这些蛋白包括，例如，BMP7、Nodal、GDF8和GDF11[参见，例如，Yamashita 等人，(1995) J. Cell Biol.130:217-226;Lee 和McPherron (2001) Proc.Natl.Acad.Sci.98:9306-9311; Yeo 和 Whitman (2001)Mol.Cell 7: 949-957; 以及 Oh 等人，(2002) Genes Dev.16:2749-54]。激活素样激酶-4（ALK4）是主要的I型激活素受体，特别是对于激活素A，而ALK7也可作为其它激活素的受体，特别是对于激活素B。在某些实施方案中，本公开涉及用本文公开的一种或多种试剂（特别是可以拮抗GDF11和/或激活素B的试剂）拮抗ActRIIA或ActRIIB受体的配体（也称为ActRIIA配体或ActRIIB配体）。
如本文所述，结合“激活素B”的试剂是特异性结合βB亚基的试剂，无论是在分离的βB 亚基还是在作为二聚复合体（例如，βBβB同源二聚体或βAβB异源二聚体）的上下文中。就异源二聚体复合体（例如，βAβB异源二聚体）而言，结合“激活素B”的试剂对存在于βB亚基内的表位具有特异性，但不结合存在于该复合体的非βB亚基（例如，该复合体的βA亚基）内的表位。类似地，本文公开的拮抗（抑制）“激活素B”的试剂是抑制βB亚基介导的一种或多种活性的试剂，无论是在分离的βB 亚基还是在作为二聚复合体（例如，βBβB同源二聚体或βAβB异源二聚体）的上下文中。就βAβB异源二聚体而言，抑制“激活素B”的试剂是特异性抑制βB亚基的一种或多种活性的试剂，但不抑制该复合体的非βB亚基（例如，该复合体的βA亚基）的活性。此原则也适用于结合并且/或者抑制“激活素A”、“激活素C”和“激活素E”的试剂。
在TGF-β超家族中，激活素是独特且多功能的因子，其可以刺激卵巢和胎盘细胞中的激素生成、支持神经元细胞的存活、根据细胞类型积极或消极地影响细胞周期进展以及至少在两栖类胚胎中诱导中胚层分化[DePaolo 等人，(1991) Proc Soc Ep BiolMed.198:500-512; Dyson等人，(1997) Curr Biol.7:81-84; 以及 Woodruff (1998)Biochem Pharmacol.55:953-963]。此外，据发现，分离自激活的人类单核细胞白血病细胞的红细胞分化因子（EDF）与激活素A是相同的[Murata 等人，(1988) PNAS, 85:2434]。已经指出，激活素A促进骨髓中的红细胞生成。在若干种组织中，激活素信号转导被其相关的异源二聚体，抑制素，所拮抗。例如，在促卵泡激素（FSH）从垂体释放的过程中，激活素促进FSH分泌与合成，而抑制素阻止FSH分泌与合成。可能调节激活素生物活性并且/或者结合激活素的其它蛋白包括卵泡抑素（FS）、卵泡抑素相关蛋白（FSRP）和α2-巨球蛋白。
生长和分化因子-8（GDF8）也被称为肌肉生长抑制素。GDF8是骨骼肌质量的负调控因子。GDF8在发育中的和成年的骨骼肌中高度表达。小鼠中GDF8基因缺失的特征在于骨骼肌的明显肥大和增生[McPherron 等人, Nature (1997) 387:83-90]。类似的骨骼肌质量增加在牛中[参见，例如，Ashmore 等人，(1974) Growth, 38:501-507; Swatland 和Kieffer (1994) J. Anim.Sci.38:752-757; McPherron 和 Lee (1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:12457-12461; 以及 Kambadur 等人，(1997) GenomeRes.7:910-915]以及惊人地，在人中[参见，例如，Schuelke等人，(2004) N Engl J Med350:2682-8]GDF8的天然存在的突变中得到证实。研究还表明，人类中与HIV感染相关的肌肉萎缩伴随有GDF8蛋白表达增加[参见，例如，Gonzalez-Cadavid 等人，(1998) PNAS 95:14938-43]。另外，GDF8可以调节肌肉特异性酶（例如，肌酸激酶）的产生并且调节成肌细胞增殖[参见，例如，国际专利申请公布号WO 00/43781]。GDF8前肽可以非共价结合成熟的GDF域二聚体，钝化其生物活性[参见，例如，Miyazono等人，(1988)J.Biol.Chem.,263:6407-6415;Wakefield 等人，(1988) J.Biol.Chem.,263:7646-7654; 以及 Brown 等人，(1990)Growth Factors, 3: 35-43]。结合GDF8或结构相关蛋白并且抑制其生物活性的其它蛋白包括卵泡抑素以及可能地卵泡抑素相关蛋白[参见，例如，Gamer等人，(1999) Dev.Biol.,208: 222-232]。
生长和分化因子-11（GDF11），也称为骨形态发生蛋白-11（BMP11），是最早识别为脊椎动物发育调控因子的分泌型蛋白[McPherron 等人，(1999) Nat. Genet.22: 260-264]。在小鼠胚胎发育期间，GDF11在尾芽、肢芽、上颌弓和下颌弓、背根神经节中表达[参见，例如，Nakashima 等人，(1999) Mech.Dev.80: 185-189]。GDF11在中胚层和神经组织的图式化中均发挥独特的作用[参见，例如，Gamer 等人，(1999) Dev Biol., 208:222-32]并且经证明是鸡胚肢发育过程中软骨发生和肌发生的负调控因子[参见，例如，Gamer 等人，(2001) Dev Biol.229:407-20]。GDF11还被认为是出生后组织稳态调控因子。例如，GDF11在肌肉中的表达还表明此配体以类似于GDF8的方式在调节肌肉生长方面起作用。另外，GDF11在脑部的表达表明GDF11还可能调节神经系统功能，并且据发现，GDF11抑制嗅上皮中的神经形成[参见，例如，Wu 等人，(2003) Neuron.37:197-207]。
骨形态发生蛋白（BMP7），也称为成骨蛋白-1（OP-1），众所周知会诱导软骨和骨形成。另外，BMP7调节广泛的生理过程。例如，BMP7可能是负责上皮性成骨现象的骨诱导因子。BMP7还在钙调节和骨稳态中发挥作用。与激活素类似，BMP7结合ActRIIA和ActRIIB。然而，BMP7和激活素召募不同的I型受体构成异源二聚受体复合体。激活素通过ALK4信号转导，而BMP7优先通过ALK2信号转导。这种差别使得BMP7和激活素能够活化不同的Smad途径并引发不同的生物反应[参见，例如，Macias-Silva 等人，(1998) J Biol Chem.273:25628-36]。
此前已经报道了变体ActRIIB-Fc融合蛋白在体外和体内均具有特定生物特性，一种变体包含本发明的SEQ ID NO:1的氨基酸20-134，其在相对于SEQ ID NO:1的位置79处具有酸性氨基酸[在下文中称为“ActRIIB(L79D 20-134)-Fc”融合蛋白]，而第二种截短的变体包含本发明的SEQ ID NO: 1的氨基酸25-131并且也在位置79处包含酸性氨基酸[在下文中称为“ActRIIB(L79D 25-131)-Fc”]。参见，例如，美国专利号8,058,229。相比未经修饰的融合蛋白ActRIIB(20-134)-Fc和ActRIIB(25-131)-Fc，对应的L79D变体[分别是ActRIIB(L79D 20-134)-Fc和ActRIIB(L79D 25-131)-Fc]的特征部分在于基本上丧失了对激活素A的结合亲和力，并且因此拮抗激活素A活性的能力显著减弱，但保持了近乎野生型水平的对GDF11的结合和抑制。据发现，ActRIIB(L79D 20-134)-Fc和ActRIIB(L79D 25-131)-Fc变体在提高体内红细胞水平的能力上，分别相比未经修饰的ActRIIB(20-134)-Fc和ActRIIB(25-131)-Fc融合蛋白，明显更有效。因此，这些数据表明，所观察到的生物活性与激活素A的抑制无关。
本申请部分涉及这样的认识：美国专利号8,058,229中公开的ActRIIB(L79D 20-134)-Fc和ActRIIB(L9D 25-131)-Fc变体，虽然对激活素A的结合亲和力显著降低，但能够抑制激活素B以及GDF11。因此，申请人在本文中得出结论：同时拮抗GDF11和激活素B活性的试剂或试剂组合可以增加红细胞生成。尽管抑制激活素A不一定促进红细胞形成，但已知抑制激活素A的ActRII-Fc融合蛋白也促进红细胞形成。因此，抑制激活素A的试剂包括在本公开的范围内。
如本文所示，多种ActRII配体（例如，激活素B、GDF11和GDF8）似乎都是红细胞生成调控因子，因为当这些配体中的越多种被抑制，各项血液参数（例如，红细胞压积、血红蛋白和红细胞水平）的水平有升高的趋势。例如，本文提供的数据证明，相比仅拮抗GDF8的试剂，施用抑制GDF8和GDF11活性的试剂对提高体内红细胞水平有更实质性的影响。另外表明，相比用GDF8/GDF11拮抗剂治疗，使用抑制激活素B、GDF8和GDF11的试剂的组合疗法对增加红细胞有甚至更大的影响。因此，本文提供的数据表明，促进个体中红细胞生成的有效策略是靶向多种（即，两种或更多种）ActRII配体。
因此，本公开部分提供了用于在有此需要的个体中用试剂或试剂组合提高红细胞水平、治疗或预防贫血并且/或者治疗或预防无效性红细胞生成的方法，所述试剂或试剂组合拮抗（抑制）GDF11（例如，GDF11介导的通过ActRIIA和/或ActRIIB的对Smad 2/3信号转导的活化）和/或激活素B（例如，激活素B介导的通过ActRIIA和/或ActRIIB的对Smad 2/3信号转导的活化）。任选地，拮抗GDF11和/或激活素B的本公开的试剂或试剂组合基本上不拮抗激活素A（例如，激活素A介导的通过ActRIIA和/或ActRIIB的对Smad 2/3信号转导的活化）。任选地，拮抗GDF11和/或激活素B的本公开的试剂或试剂组合还可抑制GDF8活性。在某些实施方案中，拮抗GDF11和/或激活素B的本公开的试剂或试剂组合还可抑制GDF8、BMP6、激活素C、激活素E、激活素A、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10中的一种或多种。
在一些实施方案中，抑制GDF11和/或激活素B活性的试剂或试剂组合是直接结合GDF11和/或激活素B的试剂，包括例如：多特异性抗体（例如，双特异性抗体），其结合至少GDF11和激活素B（任选的此类试剂或试剂组合，基本上不结合激活素A）；抗体组合，包含抗-GDF11抗体和抗-激活素B抗体；变体ActRII多肽（例如，变体ActRIIA或ActRIIB多肽），其结合GDF11和激活素B（任选地可不结合激活素A）；变体ActRII多肽（例如，变体ActRIIA或ActRIIB多肽）的组合，包含至少一种结合GDF11（但基本上不结合激活素B）的变体ActRII多肽和至少一种结合激活素B（但基本上不结合GDF11）的可溶性变体ActRII多肽（任选地所述结合GDF的和结合激活素B的ActRII多肽中的一者或两者可基本上不结合激活素A）；小分子，其直接结合GDF11和/或激活素B（任选地可基本上不结合激活素A）；以及小分子的组合，包含至少一种结合GDF11（但基本上不结合激活素B）的小分子和一种结合激活素B（但基本上不结合GDF11）的小分子（所述结合GDF的和结合激活素B的小分子中的一者或两者可基本上不结合激活素A）。
在可供选择的实施方案中，抑制GDF11和/或激活素B活性的试剂或试剂组合是不直接结合GDF11和/或激活素B的间接拮抗试剂。例如，间接拮抗试剂可以是这样的抗体，其结合天然ActRII受体（例如，ActRIIA或ActRIIB受体）并阻止GDF11和/或激活素B结合并且/或者活化该ActRII受体。任选地，此类试剂或试剂组合基本上不抑制激活素A结合并且/或者活化ActRII受体。本公开的其它间接拮抗试剂包括这样的试剂或试剂组合，其抑制GDF11和/或激活素B的表达（例如，转录、翻译和/或细胞分泌）。任选地，此类试剂或试剂组合基本上不影响激活素A的表达。此类间接试剂包括，例如，GDF11和/或激活素B的表达的小分子抑制剂以及使用各种多核苷酸拮抗剂[例如，反义DNA、RNA或化学类似物以及靶向GDF11和/或激活素B的mRNA的干扰RNA分子，包括小干扰RNA（siRNA）、小发夹RNA（shRNA）或微RNA（miRNA）分子]以抑制GDF11和/或激活素B的表达。
在一些实施方案中，抑制GDF11和/或激活素B活性的本公开的试剂或试剂组合任选地结合以下中的一种或多种并且/或者抑制其活性：GDF8、激活素A、激活素C、激活素E、激活素A、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10。
另外，本公开的方法涉及组合使用本文所述的一种或多种拮抗试剂（例如，抑制GDF11和激活素B的试剂或试剂组合）与EPO受体活化剂以增加红细胞形成以及治疗或预防各种贫血和无效性红细胞生成疾病及相关状况。应当注意的是，造血是由各种因子（包括促红细胞生成素、G-CSF和铁稳态）调节的复杂过程。术语“提高红细胞水平”和“促进红细胞形成”指代临床上可观测的指标，如红细胞压积、红细胞计数和血红蛋白测量，并且旨在对于此类变化发生的机制是中性的。
EPO是涉及红系祖细胞向红细胞的生长和成熟的糖蛋白激素。EPO在胚胎期由肝脏产生而在成人中由肾脏产生。EPO产量降低（在成人中通常是肾衰竭的结果）导致贫血。已经通过基因工程技术基于从用EPO基因转染的宿主细胞表达和分泌蛋白来生产EPO。施用此类重组EPO已经可以有效地治疗贫血。例如，Eschbach 等人，(1987, N Engl J Med 316:73)描述了使用EPO以纠正由慢性肾衰竭引起的贫血。
EPO的作用是通过其对细胞表面受体的结合和活化而介导的，所述细胞表面受体属于细胞因子受体超家族并被指定为EPO受体。已经克隆并表达了人和小鼠EPO受体[参见，例如，D’Andrea 等人，(1989) Cell 57:277; Jones 等人，(1990) Blood 76:31;Winkelman 等人，(1990) Blood 76:24; 以及美国专利号5,278,065]。人EPO受体基因编码具有483个氨基酸的跨膜蛋白，其包含具有约224个氨基酸的胞外域并与小鼠EPO受体具有约82%的氨基酸序列同一性[参见，例如，美国专利No. 6,319,499]。在哺乳动物细胞中表达的克隆的全长EPO受体（66-72 kDa）以类似于红系祖细胞上的天然受体的亲和力（KD =100-300 nM）结合EPO。因此，这种形式被认为含有主要的EPO结合决定簇并被称为EPO受体。由其它密切相关的细胞因子受体类推，EPO受体被认为在激动剂结合时二聚化。然而，EPO受体的详细结构（可能为多聚复合体）及其具体活化机制尚不完全清楚[参见，例如，美国专利号6,319,499]。
EPO受体的活化导致若干生物效应。这些包括：不成熟红细胞的增殖增加、不成熟红细胞的分化增加以及红系祖细胞的细胞凋亡减少[参见，例如，Liboi 等人，(1993) ProcNatl Acad Sci USA 90:11351-11355; Koury 等人，(1990) Science 248:378-381]。EPO受体信号转导途径介导的增殖和分化似乎是不同的[参见，例如，Noguchi 等人，(1988)Mol Cell Biol 8:2604; Patel等人，(1992) J Biol Chem, 267:21300; 以及 Liboi 等人，(1993) Proc Natl Acad Sci USA 90:11351-11355)]。一些结果表明，分化信号的介导可能需要辅助蛋白[参见，例如，Chiba 等人，(1993) Nature 362:646; 以及 Chiba 等人，(1993) Proc Natl Acad Sci USA 90:11593]。然而，关于辅助蛋白在分化中的作用存在争议，因为受体的组成性活化形式可以同时刺激增殖和分化[参见，例如，Pharr 等人，(1993)Proc Natl Acad Sci USA 90:938]。
EPO受体活化剂包括小分子红细胞生成刺激剂（ESA）以及基于EPO的化合物。前者的实例是共价连接至聚乙二醇（专有名称为Hematide）的基于二聚肽的激动剂，其在健康志愿者和患有慢性肾病的患者以及具有内源性抗EPO抗体的患者中具有红细胞生成刺激特性[参见，例如，Stead 等人，(2006) Blood 108:1830-1834; 以及 Macdougall等人，(2009)N Engl J Med 361:1848-1855]。其它实例包括基于非肽的ESA[参见，例如，Qureshi 等人，(1999) Proc Natl Acad Sci USA 96:12156-12161]。
EPO受体活化剂还包括这样的化合物，其通过提高内源性EPO的产量，间接刺激红细胞生成而不与EPO受体本身接触。例如，缺氧诱导转录因子（HIF）是EPO基因表达的内源性刺激剂，其在常氧条件下被细胞调节机制所抑制（不稳定化）。因此，正在研究HIF脯氨酰羟化酶抑制剂的体内诱导EPO的活性。EPO受体的其它间接活化剂包括GATA-2转录因子抑制剂[参见，例如，Nakano 等人，(2004) Blood 104:4300-4307]，其紧张性抑制EPO基因表达；以及造血细胞磷酸酶抑制剂（HCP或SHP-1），其作为EPO受体信号转导的负调控因子起作用[参见，例如，Klingmuller 等人，(1995) Cell 80:729-738]。
本说明书中所用的术语，在本公开的上下文中以及在使用各术语的具体上下文中，一般具有其在本领域中的通常含义。在下文或本说明书中别处讨论了某些术语，以在描述本公开的组合物和方法以及如何制造并使用它们方面，为实践者提供额外指导。术语的任何使用的范围或含义从具体上下文中将是显而易见的。
“同源”（包括其所有语法形式和拼写变型）指代具有“共同进化起源”的两种蛋白质之间的关系，包括来自同种生物体中超家族的蛋白质，以及来自不同种生物体的同源蛋白质。此类蛋白质（及其编码核酸）具有序列同源性，正如其序列相似性所反映的，无论是就百分比同一性而言或通过特定残基或基序和保守位置的存在。
术语“序列相似性”（包括其所有语法形式）指代可能分享或可能不分享共同进化起源的核酸或氨基酸序列之间的相同或对应的程度。
然而，在本申请的一般用法中，术语“同源”，当由副词“高度地”修饰时，可指代序列相似性并可能涉及或可能不涉及共同进化起源。
相对于参考多肽（或核苷酸）序列的“百分比（%）序列同一性”被定义为与参考多肽（核苷酸）序列中氨基酸残基相同的候选序列中氨基酸残基（或核酸）的百分比，在比对序列并（如果需要）引入空位后，以实现最大百分比序列同一性，并且不将任何保守置换视为序列同一性的一部分。出于确定百分比氨基酸序列同一性的目的的比对可以本领域技术范围内的各种方式实现，例如，使用公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的合适参数，包括实现在被比较序列的全长上的最大比对所需的任何算法。然而，就本文的目的而言，使用序列比较计算机程序ALIGN-2生成了％氨基酸（核酸）序列同一性值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech, Inc.编写，并且源代码已经连同用户文档在美国版权局（Washington D.C.，20559）备案，在那里其以美国版权注册号TXU510087注册。ALIGN-2程序可从Genentech,Inc.（南旧金山，加州）公开获得，或可以从源代码编译。ALIGN-2程序应当编译用于UNIX操作系统，包括Digital UNIX V4.0D。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设定并且没有变化。
如本文所用，“基本上不结合X”旨在意指试剂对于“X”的KD大于约10-7、10-6、10-5、10-4或更大（例如，用于测定KD的测定法无法检测到结合）。
2.拮抗试剂
A. 抗体拮抗剂
在某些方面，本公开的拮抗试剂或试剂组合是结合至少激活素B和/或GDF11并且/或者抑制其活性（例如，活化基于ActRIIA或ActRIIB的Smad 2/3信号转导）的抗体。任选地，本公开的抗体或抗体组合不结合激活素A并且/或者抑制其活性（例如，激活素A介导的基于ActRIIA或ActRIIB的Smad 2/3信号转导的活化）。任选地，本公开的抗体或抗体组合还结合GDF8并且/或者抑制其活性（例如，GDF8介导的ActRIIA或ActRIIB的Smad 2/3信号转导的活化）。在一些实施方案中，结合至少激活素B和/或GDF11并且/或者抑制其活性的本公开的抗体或抗体组合还结合GDF8、激活素C、激活素E、BMP6、激活素A、GDF15、Nodal、GDf3、BMP3、BMP3B、BMP9或BMP10中的一种或多种并且/或者抑制其活性（例如，活化基于ActRIIA或ActRIIB的Smad 2/3和/或Smad 1/5/8信号转导）。
在另一方面，本公开的抗体或抗体组合是抗-ActRII受体抗体（例如，ActRIIA或ActRIIB受体抗体），其结合ActRII受体并阻止至少激活素B和/或GDF11结合并且/或者活化ActRII受体。任选地，本公开的抗-ActRII受体抗体或抗体组合基本上不抑制激活素A结合并且/或者活化ActRII受体。任选地，本公开的抗-ActRII受体抗体或抗体组合还阻止GDF8结合并且/或者活化ActRII受体。在一些实施方案中，结合ActRII受体并阻止激活素B和/或GDF11结合并且/或者活化该ActRII受体的本公开的抗-ActRII受体抗体或抗体组合还阻止激活素A、激活素C、激活素E、GDF8、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10中的一种或多种结合并且/或者活化该ActRII受体。
术语抗体在本文中采用的是最广泛的意义并且涵盖了各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体（例如，双特异性抗体）和抗体片段，只要其具有所需的抗原结合活性。抗体片段指代包含完整抗体的一部分而不同于完整抗体的分子，其结合该完整抗体所结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于：Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体[参见，例如，Hudson 等人，(2003) Nat. Med.9:129-134; Pluckthun, 在ThePharmacology of Monoclonal Antibodies, 113卷 Rosenburg 和 Moore 编撰,（Springer-Verlag, New York）, 第269-315页 (1994)中; WO 93/16185; 以及美国专利号5,571,894; 5,587,458; 和5,869,046]。本文公开的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。在某些实施方案中，本公开的抗体包含附接其上并能够被检测到的标记物（例如，该标记物可以是放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子）。在优选的实施方案中，本公开的抗体是分离的抗体。
双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可能是双价的或双特异性的[参见，例如，EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson 等人，(2003) Nat. Med.9:129-134(2003); 以及 Hollinger等人，(1993) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90: 6444-6448]。三抗体和四抗体也在Hudson等人，(2003) Nat. Med.9:129-134 中有述。
单域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变域或全部或部分轻链可变域的抗体片段。在某些实施方案中，单域抗体是人单域抗体[参见，例如，美国专利号6,248,516]。
抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于蛋白水解消化完整抗体以及如本文所述由重组宿主细胞（例如，大肠杆菌或噬菌体）产生。
本文的抗体可以是任何类别的。抗体类别指代其重链所具有的恒定域或恒定区的类型。存在五种主要的抗体类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，而这些中的若干种可以进一步分为亚类（同种型），例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定域被称为α、δ、ε、γ和µ。
通常，用于本公开的方法中抗体优选以高结合亲和力特异性结合其靶抗原。亲和力可以KD值表示并反映固有的结合亲和力（例如，具有最小化的亲和效应）。通常，在无细胞或结合细胞的设定中体外测量结合亲和力。多种本领域已知测定法（包括本文公开的那些）中的任一种均可以用于获得结合亲和力测量结果，包括，例如，Biacore、放射标记的抗原结合测定法（RIA）和ELISA。在一些实施方案中，本公开的抗体以至少1x 10-7或更强、1x10-8或更强、1x10-9或更强、1x10-10或更强、1x10-11或更强、1x10-12或更强、1x10-13或更强或1x10-14或更强的KD结合其靶抗原（例如，GDF11、激活素B、GDF8、激活素E、激活素C、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9或BMP10）。
在某些实施方案中，KD通过用目标抗体的Fab版本及其靶抗原如以下测定所述进行的RIA测量。Fab对抗原的溶液结合亲和力通过如下测量：在存在滴定系列的未标记抗原的情况下，用最小浓度的放射标记抗原（例如，125I标记的）平衡Fab，然后用抗-Fab抗体涂布的平板捕获结合的抗原[参见，例如，Chen 等人，(1999) J. Mol.Biol.293:865-881]。为了建立测定条件，用捕获抗-Fab抗体（例如，来自Cappel Labs）涂布（例如，过夜）多孔板（例如，来自Thermo Scientific的MICROTITER®），并随后优选在室温下（约23°C）用牛血清白蛋白阻断。在非吸附平板中，将放射标记抗原与目标Fab的连续稀释液混合[例如，与抗-VEGF抗体，Fab-12的评估一致，在Presta 等人，(1997) Cancer Res.57:4593-4599中]。然后将目标Fab温育，优选过夜，但该温育可持续更长时间（例如，约65小时）以确保达到平衡。之后，将混合物转移至捕获平板上温育，优选室温下约一小时。然后移除溶液并将平板优选用聚山梨醇酯20和PBS的混合物洗涤若干次。在平板干燥后，加入闪烁剂（例如，来自Packard的MICROSCINT®），并在γ计数器（例如，来自Packard的TOPCOUNT®）上给平板计数。
根据另一个实施方案，使用表面等离子体共振测定法测量KD，其以约10个反应单位(RU)使用例如具有固定的抗原CM5芯片的BIACORE® 2000或BIACORE® 3000 (BIAcore,Inc., Piscataway, N.J.)。简而言之，根据供应商说明，用N-乙基-N’-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)激活羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片（CM5, BIACORE, Inc.）。例如，可以在以5 µl/分钟的流速注射前，用10 mM 醋酸钠（pH4.8）将抗原稀释至5 µg/ml（约0.2 µM），以达到约10个反应单位(RU)的偶联蛋白。在注射抗原后，注射1 M 乙醇胺以阻断未反应的基团。对于动力学测量而言，以约25 µl/min的流速将Fab的两倍连续稀释液（0.78 nM至500 nM）注射入含有0.05% 聚山梨醇酯20(TWEEN-20®)表面活性剂的PBS(PBST)中。结合速率(kon)和解离速率(koff)用例如简单的一对一Langmuir结合模型(BIACORE® 评价软件 版本3.2)通过同时拟合结合与解离传感图来计算。平衡解离常数(KD)被计算为koff/kon的比率[参见，例如，Chen 等人， (1999) J. Mol.Biol.293:865-881]。通过以上表面等离子体共振测定法，如果结合速率超过，例如，106 M-1 s-1，则结合速率通过如下测定：使用荧光猝灭技术，其在抗原浓度（如光谱仪所测）渐增的情况下，测量PBS中20 nM 抗-抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度（例如，激发=295 nm；发射=340 nm，16 nm 带通）的增大或减小，所述光谱仪为如装配了停流的光谱仪(Aviv Instruments)或具有搅拌比色皿的8000系列SLM-AMINCO®分光光度计(ThermoSpectronic)。
通常，抗-GDF11抗体指代能够以足够的亲和力结合GDF11抗体，所述足够的亲和力使得该抗体可用作靶向GDF11的诊断和/或治疗剂。在某些实施方案中，抗-GDF11抗体对不相关的非GDF11蛋白的结合程度小于如例如通过放射性免疫测定法（RIA）测得的该抗体对GDF11的结合的约10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或小于其1%。在某些实施方案中，抗-GDF11抗体结合GDF11的表位，所述表位在来自不同物种的直系同源GDF11蛋白中是保守的。在优选的实施方案中，本公开的抗-GDF11抗体是可以基本上抑制GDF11活性的拮抗剂抗体。例如，本公开的抗-GDF11抗体可基本上抑制GDF11结合同源受体（例如，ActRIIA或ActRIIB受体）并且/或者基本上抑制GDF11介导的同源受体的信号转导（活化），如通过ActRIIA或ActRIIB受体的Smad2/3信号转导。在一些实施方案中，本公开的抗-GDF11抗体基本上不结合激活素A并且/或者抑制其活性。应当注意的是，GDF11与GDF8在氨基酸水平上具有高度的序列同一性，因而结合并且/或者抑制GDF11的抗体，在许多情况下，也可能结合并且/或者抑制GDF8。
通常，抗-激活素B抗体指代能够以足够的亲和力结合激活素B的抗体，所述足够的亲和力使得该抗体可用作靶向激活素B的诊断和/或治疗剂。在某些实施方案中，抗-激活素B抗体对不相关的非激活素B蛋白的结合程度小于如例如通过放射性免疫测定法（RIA）测得的该抗体对激活素B的结合的约10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或小于其1%。在某些实施方案中，抗-激活素B抗体结合激活素B的表位，所述表位在来自不同物种的直系同源激活素B蛋白中是保守的。在优选的实施方案中，本公开的抗-激活素B抗体是可以基本上抑制激活素B活性的拮抗剂抗体。例如，本公开的抗-激活素B抗体可基本上抑制激活素B结合同源受体（例如，ActRIIA或ActRIIB受体）并且/或者基本上抑制激活素B介导的同源受体的信号转导（活化），如通过ActRIIA或ActRIIB受体的Smad2/3信号转导。在一些实施方案中，本公开的抗-激活素B抗体基本上不结合激活素A并且/或者抑制其活性。
通常，抗-激活素C抗体指代能够以足够的亲和力结合激活素C的抗体，所述足够的亲和力使得该抗体可用作靶向激活素C的诊断和/或治疗剂。在某些实施方案中，抗-激活素C抗体对不相关的非激活素C蛋白的结合程度小于如例如通过放射性免疫测定法（RIA）测得的该抗体对激活素C的结合的约10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或小于其1%。在某些实施方案中，抗-激活素C抗体结合激活素C的表位，所述表位在来自不同物种的直系同源激活素C蛋白中是保守的。在优选的实施方案中，本公开的抗-激活素C抗体是可以基本上抑制激活素C活性的拮抗剂抗体。例如，本公开的抗-激活素C抗体可基本上抑制激活素C结合同源受体（例如，ActRIIA或ActRIIB受体）并且/或者基本上抑制激活素C介导的同源受体的信号转导（活化），如通过ActRIIA或ActRIIB受体的Smad2/3信号转导。在一些实施方案中，本公开的抗-激活素C抗体基本上不结合激活素A并且/或者抑制其活性。
通常，抗-激活素A抗体指代能够以足够的亲和力结合激活素A的抗体，所述足够的亲和力使得该抗体可用作靶向激活素A的诊断和/或治疗剂。在某些实施方案中，抗-激活素A抗体对不相关的非激活素A蛋白的结合程度小于如例如通过放射性免疫测定法（RIA）测得的该抗体对激活素A的结合的约10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或小于其1%。在某些实施方案中，抗-激活素A抗体结合激活素A的表位，所述表位在来自不同物种的直系同源激活素A蛋白中是保守的。在优选的实施方案中，本公开的抗-激活素A抗体是可以基本上抑制激活素A活性的拮抗剂抗体。例如，本公开的抗-激活素A抗体可基本上抑制激活素A结合同源受体（例如，ActRIIA或ActRIIB受体）并且/或者基本上抑制激活素A介导的同源受体的信号转导（活化），如通过ActRIIA或ActRIIB受体的Smad2/3信号转导。
通常，抗-激活素E抗体指代能够以足够的亲和力结合激活素E的抗体，所述足够的亲和力使得该抗体可用作靶向激活素E的诊断和/或治疗剂。在某些实施方案中，抗-激活素E抗体对不相关的非激活素E蛋白的结合程度小于如例如通过放射性免疫测定法（RIA）测得的该抗体对激活素E的结合的约10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或小于其1%。在某些实施方案中，抗-激活素E抗体结合激活素E的表位，所述表位在来自不同物种的直系同源激活素E蛋白中是保守的。在优选的实施方案中，本公开的抗-激活素E抗体是可以基本上抑制激活素E活性的拮抗剂抗体。例如，本公开的抗-激活素E抗体可基本上抑制激活素E结合同源受体（例如，ActRIIA或ActRIIB受体）并且/或者基本上抑制激活素E介导的同源受体的信号转导（活化），如通过ActRIIA或ActRIIB受体的Smad2/3信号转导。在一些实施方案中，本公开的抗-激活素E抗体基本上不结合激活素A并且/或者抑制其活性。
通常，抗-GDF8抗体指代能够以足够的亲和力结合GDF8抗体，所述足够的亲和力使得该抗体可用作靶向GDF8的诊断和/或治疗剂。在某些实施方案中，抗-GDF8抗体对不相关的非GDF8蛋白的结合程度小于如例如通过放射性免疫测定法（RIA）测得的该抗体对GDF8的结合的约10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或小于其1%。在某些实施方案中，抗-GDF8抗体结合GDF8的表位，所述表位在来自不同物种的直系同源GDF8蛋白中是保守的。在优选的实施方案中，本公开的抗-GDF8抗体是可以基本上抑制GDF8活性的拮抗剂抗体。例如，本公开的抗-GDF8抗体可基本上抑制GDF8结合同源受体（例如，ActRIIA或ActRIIB受体）并且/或者基本上抑制GDF8介导的同源受体的信号转导（活化），如通过ActRIIA或ActRIIB受体的Smad2/3信号转导。在一些实施方案中，本公开的抗-GDF8抗体基本上不结合激活素A并且/或者抑制其活性。应当注意的是，GDF8与GDF11具有高度的序列同源性，因而结合并且/或者抑制GDF8的抗体，在许多情况下，也可能结合并且/或者抑制GDF11。
通常，抗-BMP6抗体指代能够以足够的亲和力结合BMP6抗体，所述足够的亲和力使得该抗体可用作靶向BMP6的诊断和/或治疗剂。在某些实施方案中，抗-BMP6抗体对不相关的非BMP6蛋白的结合程度小于如例如通过放射性免疫测定法（RIA）测得的该抗体对BMP6的结合的约10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或小于其1%。在某些实施方案中，抗-BMP6抗体结合BMP6的表位，所述表位在来自不同物种的直系同源BMP6蛋白中是保守的。在优选的实施方案中，本公开的抗-BMP6抗体是可以基本上抑制BMP6活性的拮抗剂抗体。例如，本公开的抗-BMP6抗体可基本上抑制BMP6结合同源受体（例如，ActRIIA或ActRIIB受体）并且/或者基本上抑制BMP6介导的同源受体的信号转导（活化），如通过ActRIIA或ActRIIB受体的Smad2/3信号转导。在一些实施方案中，本公开的抗-BMP6抗体基本上不结合激活素A并且/或者抑制其活性。
通常，抗-GDF15抗体指代能够以足够的亲和力结合GDF15抗体，所述足够的亲和力使得该抗体可用作靶向GDF15的诊断和/或治疗剂。在某些实施方案中，抗-GDF15抗体对不相关的非GDF15蛋白的结合程度小于如例如通过放射性免疫测定法（RIA）测得的该抗体对GDF15的结合的约10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或小于其1%。在某些实施方案中，抗-GDF15抗体结合GDF15的表位，所述表位在来自不同物种的直系同源GDF15蛋白中是保守的。在优选的实施方案中，本公开的抗-GDF15抗体是可以基本上抑制GDF15活性的拮抗剂抗体。例如，本公开的抗-GDF15抗体可基本上抑制GDF15结合同源受体（例如，ActRIIA或ActRIIB受体）并且/或者基本上抑制GDF15介导的同源受体的信号转导（活化），如通过ActRIIA或ActRIIB受体的Smad 2/3信号转导。在一些实施方案中，本公开的抗-GDF15抗体基本上不结合激活素A并且/或者抑制其活性。
通常，抗-Nodal抗体指代能够以足够的亲和力结合Nodal抗体，所述足够的亲和力使得该抗体可用作靶向Nodal的诊断和/或治疗剂。在某些实施方案中，抗-Nodal抗体对不相关的非Nodal蛋白的结合程度小于如例如通过放射性免疫测定法（RIA）测得的该抗体对Nodal的结合的约10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或小于其1%。在某些实施方案中，抗-Nodal抗体结合Nodal的表位，所述表位在来自不同物种的直系同源Nodal蛋白中是保守的。在优选的实施方案中，本公开的抗-Nodal抗体是可以基本上抑制Nodal活性的拮抗剂抗体。例如，本公开的抗-Nodal抗体可基本上抑制Nodal结合同源受体（例如，ActRIIA或ActRIIB受体）并且/或者基本上抑制Nodal介导的同源受体的信号转导（活化），如通过ActRIIA或ActRIIB受体的Smad 2/3信号转导。在一些实施方案中，本公开的抗-Nodal抗体基本上不结合激活素A并且/或者抑制其活性。
通常，抗-GDF3抗体指代能够以足够的亲和力结合GDF3抗体，所述足够的亲和力使得该抗体可用作靶向GDF3的诊断和/或治疗剂。在某些实施方案中，抗-GDF3抗体对不相关的非GDF3蛋白的结合程度小于如例如通过放射性免疫测定法（RIA）测得的该抗体对GDF3的结合的约10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或小于其1%。在某些实施方案中，抗-GDF3抗体结合GDF3的表位，所述表位在来自不同物种的直系同源GDF3蛋白中是保守的。在优选的实施方案中，本公开的抗-GDF3抗体是可以基本上抑制GDF3活性的拮抗剂抗体。例如，本公开的抗-GDF3抗体可基本上抑制GDF3结合同源受体（例如，ActRIIA或ActRIIB受体）并且/或者基本上抑制GDF3介导的同源受体的信号转导（活化），如通过ActRIIA或ActRIIB受体的Smad2/3信号转导。在一些实施方案中，本公开的抗-GDF3抗体基本上不结合激活素A并且/或者抑制其活性。
通常，抗-BMP3抗体指代能够以足够的亲和力结合BMP3抗体，所述足够的亲和力使得该抗体可用作靶向BMP3的诊断和/或治疗剂。在某些实施方案中，抗-BMP3抗体对不相关的非BMP3蛋白的结合程度小于如例如通过放射性免疫测定法（RIA）测得的该抗体对BMP3的结合的约10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或小于其1%。在某些实施方案中，抗-BMP3抗体结合BMP3的表位，所述表位在来自不同物种的直系同源BMP3蛋白中是保守的。在优选的实施方案中，本公开的抗-BMP3抗体是可以基本上抑制BMP3活性的拮抗剂抗体。例如，本公开的抗-BMP3抗体可基本上抑制BMP3结合同源受体（例如，ActRIIA或ActRIIB受体）并且/或者基本上抑制BMP3介导的同源受体的信号转导（活化），如通过ActRIIA或ActRIIB受体的Smad2/3信号转导。在一些实施方案中，本公开的抗-BMP3抗体基本上不结合激活素A并且/或者抑制其活性。
通常，抗-BMP3B抗体指代能够以足够的亲和力结合BMP3B抗体，所述足够的亲和力使得该抗体可用作靶向BMP3B的诊断和/或治疗剂。在某些实施方案中，抗-BMP3B抗体对不相关的非BMP3B蛋白的结合程度小于如例如通过放射性免疫测定法（RIA）测得的该抗体对BMP3B的结合的约10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或小于其1%。在某些实施方案中，抗-BMP3B抗体结合BMP3B的表位，所述表位在来自不同物种的直系同源BMP3B蛋白中是保守的。在优选的实施方案中，本公开的抗-BMP3B抗体是可以基本上抑制BMP3B活性的拮抗剂抗体。例如，本公开的抗-BMP3B抗体可基本上抑制BMP3B结合同源受体（例如，ActRIIA或ActRIIB受体）并且/或者基本上抑制BMP3B介导的同源受体的信号转导（活化），如通过ActRIIA或ActRIIB受体的Smad 2/3信号转导。在一些实施方案中，本公开的抗-BMP3B抗体基本上不结合激活素A并且/或者抑制其活性。
通常，抗-BMP9抗体指代能够以足够的亲和力结合BMP9抗体，所述足够的亲和力使得该抗体可用作靶向BMP9的诊断和/或治疗剂。在某些实施方案中，抗-BMP9抗体对不相关的非BMP9蛋白的结合程度小于如例如通过放射性免疫测定法（RIA）测得的该抗体对BMP9的结合的约10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或小于其1%。在某些实施方案中，抗-BMP9抗体结合BMP9的表位，所述表位在来自不同物种的直系同源BMP9蛋白中是保守的。在优选的实施方案中，本公开的抗-BMP9抗体是可以基本上抑制BMP9活性的拮抗剂抗体。例如，本公开的抗-BMP9抗体可基本上抑制BMP9结合同源受体（例如，ActRIIA或ActRIIB受体）并且/或者基本上抑制BMP9介导的同源受体的信号转导（活化），如通过ActRIIA或ActRIIB受体的Smad2/3信号转导。在一些实施方案中，本公开的抗-BMP9抗体基本上不结合激活素A并且/或者抑制其活性。在某些实施方案中，抗-BMP9抗体抑制BMP9与TGFβ超家族的II型受体（例如，ActRIIA和/或ActRIIB）之间的相互作用。优选地，抗-BMP9抗体不抑制或基本上不抑制BMP9与ALK1之间的相互作用。
通常，抗-BMP10抗体指代能够以足够的亲和力结合BMP10抗体，所述足够的亲和力使得该抗体可用作靶向BMP10的诊断和/或治疗剂。在某些实施方案中，抗-BMP10抗体对不相关的非BMP10蛋白的结合程度小于如例如通过放射性免疫测定法（RIA）测得的该抗体对BMP10的结合的约10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或小于其1%。在某些实施方案中，抗-BMP10抗体结合BMP10的表位，所述表位在来自不同物种的直系同源BMP10蛋白中是保守的。在优选的实施方案中，本公开的抗-BMP10抗体是可以基本上抑制BMP10活性的拮抗剂抗体。例如，本公开的抗-BMP10抗体可基本上抑制BMP10结合同源受体（例如，ActRIIA或ActRIIB受体）并且/或者基本上抑制BMP10介导的同源受体的信号转导（活化），如通过ActRIIA或ActRIIB受体的Smad 2/3信号转导。在一些实施方案中，本公开的抗-BMP10抗体基本上不结合激活素A并且/或者抑制其活性。在某些实施方案中，抗-BMP10抗体抑制BMP10与TGFβ超家族的II型受体（例如，ActRIIA和/或ActRIIB）之间的相互作用。优选地，抗-BMP10抗体不抑制或基本上不抑制BMP10与ALK1之间的相互作用。
抗-ActRIIA抗体指代能够以足够的亲和力结合ActRIIA抗体，所述足够的亲和力使得该抗体可用作靶向ActRIIA的诊断和/或治疗剂。在某些实施方案中，抗-ActRIIA抗体对不相关的非ActRIIA蛋白的结合程度小于如例如通过放射性免疫测定法（RIA）测得的该抗体对ActRIIA的结合的约10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或小于其1%。在某些实施方案中，抗-ActRIIA抗体结合ActRIIA的表位，所述表位在来自不同物种的直系同源ActRIIA蛋白中是保守的。在优选的实施方案中，本公开的抗-ActRIIA抗体是可以抑制ActRIIA活性的拮抗剂抗体。例如，本公开的抗-ActRIIA抗体可抑制选自激活素B、激活素C、激活素E、GDF11、GDF8、激活素A、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9或BMP10中的一种或多种ActRIIA配体结合ActRIIA受体并且/或者抑制这些配体之一活化ActRIIA信号转导（例如，通过Smad2/3和/或Smad 1/5/8途径）。在优选的实施方案中，本公开的抗-ActRIIA抗体抑制GDF11和/或激活素B结合ActRIIA受体并且/或者抑制GDF11和/或激活素B活化ActRIIA信号转导。任选地，本公开的抗-ActRIIA抗体还抑制GDF8结合ActRIIA受体并且/或者抑制GDF8活化ActRIIA信号转导。任选地，本公开的抗-ActRIIA抗体基本上不抑制激活素A结合ActRIIA受体并且/或者基本上不抑制激活素A介导的ActRIIA信号转导的活化。在一些实施方案中，抑制GDF11和/或激活素B结合并且/或者活化ActRIIA受体的本公开的抗-ActRIIA抗体还抑制激活素C、激活素E、激活素A、GDF8、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10中的一种或多种结合并且/或者活化该ActRIIA受体。
抗-ActRIIB抗体指代能够以足够的亲和力结合ActRIIB抗体，所述足够的亲和力使得该抗体可用作靶向ActRIIB的诊断和/或治疗剂。在某些实施方案中，抗-ActRIIB抗体对不相关的非ActRIIB蛋白的结合程度小于如例如通过放射性免疫测定法（RIA）测得的该抗体对ActRIIB的结合的约10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或小于其1%。在某些实施方案中，抗-ActRIIB抗体结合ActRIIB的表位，所述表位在来自不同物种的直系同源ActRIIB蛋白中是保守的。在优选的实施方案中，本公开的抗-ActRIIB抗体是可以抑制ActRIIB活性的拮抗剂抗体。例如，本公开的抗-ActRIIB抗体可抑制选自激活素B、激活素C、激活素E、GDF11、GDF8、激活素A、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10中的一种或多种ActRIIB配体结合ActRIIB受体并且/或者抑制这些配体之一活化ActRIIB信号转导（例如，通过Smad2/3和/或Smad 1/5/8途径）。在优选的实施方案中，本公开的抗-ActRIIB抗体抑制GDF11和/或激活素B结合ActRIIB受体并且/或者抑制GDF11和/或激活素B活化ActRIIB信号转导。任选地，本公开的抗-ActRIIB抗体还抑制GDF8结合ActRIIB受体并且/或者抑制GDF8活化ActRIIB信号转导。任选地，本公开的抗-ActRIIB抗体基本上不抑制激活素A结合ActRIIB受体并且/或者基本上不抑制激活素A介导的ActRIIB信号转导的活化。在一些实施方案中，抑制GDF11和/或激活素B结合并且/或者活化ActRIIB受体的本公开的抗-ActRIIB抗体还抑制激活素C、激活素E、激活素A、GDF8、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10中的一种或多种结合并且/或者活化该ActRIIB受体。
人GDF11、激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、GDF8、BMP6、ActRIIB、ActRIIA、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP9的核酸和氨基酸序列是本领域熟知的。另外，许多用于生成抗体的方法是本领域熟知的，其中一些在本文中有述。因此，根据本公开所用的抗体拮抗剂可以由本领域技术人员基于本领域的知识和本文提供的教导常规地制备。
在某些实施方案中，本文提供的抗体（例如，抗-GDF11抗体、抗-激活素B抗体、抗-ActRIIA抗体或抗-ActRIIB抗体）是嵌合抗体。嵌合抗体指代这样的抗体，其中重链和/或轻链的一部分来源于特定的来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分来源于不同的来源或物种。某些嵌合抗体在例如美国专利号4,816,567和Morrison 等人，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 81:6851-6855中有述。在一些实施方案中，嵌合抗体包含非人可变区（例如，来源于小鼠、大鼠、仓鼠、兔子或非人灵长类如猴子的可变区）和人恒定区。在一些实施方案中，嵌合抗体是“类别转换的”抗体，其中类别或亚类已经从亲本抗体发生了改变。通常，嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，本文提供的嵌合抗体（例如，抗-GDF11抗体、抗-激活素B抗体、抗-ActRIIA抗体或抗-ActRIIb抗体）是人源化抗体。人源化抗体指代这样的嵌合抗体，其包含来自非人高变区（HVR）的氨基酸残基和来自人框架区（FR）的氨基酸残基。在某些实施方案中，人源化抗体将包含基本上所有至少一个（而通常是两个）可变域，其中所有或基本上所有HVR（例如，CDR）均对应于非人抗体的那些，而所有或基本上所有FR均对应于人抗体的那些。任选地，人源化抗体可包含来源于人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体（例如，非人抗体）的“人源化形式”指代已经经历了人源化的抗体。
人源化抗体及其制备方法在例如Almagro 和 Fransson (2008)Front.Biosci.13:1619-1633中有述，并且在以下中进一步描述，例如Riechmann 等人，(1988) Nature 332:323-329; Queen 等人，(1989) Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86:10029-10033; 美国专利号5,821,337; 7,527,791; 6,982,321; 和7,087,409; Kashmiri等人，(2005) Methods 36:25-34 [描述SDR (a-CDR)接枝]; Padlan, Mol.Immunol.(1991) 28:489-498 (描述“再现”); Dall’Acqua 等人，(2005) Methods 36:43-60 (描述“FR改组”); Osbourn 等人，(2005) Methods 36:61-68; 以及Klimka 等人，Br. J.Cancer (2000) 83:252-260 (描述FR改组的“定向选择”方法)。
可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳-适配”方法所选择的框架区[参见，例如，Sims 等人，(1993) J. Immunol.151:2296 ]；来源于具有特定亚类的轻链或重链可变区的人抗体的共有序列的框架区[参见，例如，Carter 等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 89:4285; 以及 Presta 等人，(1993) J. Immunol., 151:2623]；人成熟(体细胞突变的)框架区或人种系框架区[参见，例如，Almagro 和 Fransson(2008) Front.Biosci.13:1619-1633]；以及来源于筛查FR文库的框架区[参见，例如，Baca等人，(1997) J. Biol.Chem.272:10678-10684; 以及 Rosok 等人，(1996) J.Biol.Chem.271:22611-22618]。
在某些实施方案中，本文提供的抗体（例如，抗-GDF11抗体、抗-激活素B抗体、抗-ActRIIA抗体或抗-ActRIIB抗体）是人抗体。可以使用本领域已知的各种技术生产人抗体。人抗体在van Dijk 和 van de Winkel (2008) Curr.Opin.Pharmacol.5: 368-74 (2001)以及 Lonberg, Curr.Opin.Immunol.20:450-459 中有一般性描述。
人抗体可通过如下制备：向转基因动物施用免疫原（例如，GDF11多肽、激活素B多态、ActRIIA多肽或ActRIIB多肽），所述转基因动物已经过修饰以响应于抗原激发而产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常含有人免疫球蛋白基因座的全部或部分，其取代内源性免疫球蛋白基因座，或其存在于染色体外或随机整合入该动物的染色体中。在此类转基因动物中，内源性免疫球蛋白基因座通常已被失活。关于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见，例如，Lonberg (2005) Nat. Biotech.23:1117-1125; 美国专利号6,075,181和6,150,584 (描述XENOMOUSE™ 技术); 美国专利号5,770,429 (描述HuMab® 技术); 美国专利号7,041,870 (描述K-M MOUSE® 技术); 以及美国专利申请公布号2007/0061900 (描述VelociMouse® 技术)。来自通过此类动物生成的完整抗体的人可变区可例如通过与不同的人恒定区结合而进一步修饰。
本文提供的人抗体还可以通过基于杂交瘤的方法制备。已经描述了用于生产人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系[参见，例如，Kozbor J. Immunol.,(1984) 133: 3001; Brodeur 等人，(1987) Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications, 第51-63页, Marcel Dekker, Inc., New York; 以及Boerner 等人，(1991) J. Immunol., 147: 86]。通过人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体也在Li 等人，(2006) Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 103:3557-3562中有述。另外的方法包括例如在美国专利号7,189,826 (描述从杂交瘤细胞系生产单克隆人IgM抗体)和Ni, XiandaiMianyixue (2006) 26(4):265-268 (2006) (描述人-人杂交瘤)中所述的那些。人杂交瘤技术（三源杂交瘤技术）也在Vollmers 和 Brandlein (2005) Histol.Histopathol., 20(3):927-937 (2005) 以及 Vollmers 和 Brandlein (2005) Methods FindExp.Clin.Pharmacol., 27(3):185-91中有述。
本文提供的人抗体（例如，抗-GDF11抗体、抗-激活素B抗体、抗-ActRIIA抗体或抗-ActRIIB抗体）还可通过分离选自源自人的噬菌体展示文库的Fv克隆可变域序列而生成。然后，可将此类可变域序列与所需的人恒定域结合。本文描述了用于从抗体文库中选择人抗体的技术。
例如，可通过针对具有所需活性的抗体筛选组合文库而分离本公开的抗体。本领域已知多种方法可用于生成噬菌体展示文库并针对具有所需结合特性的抗体筛选此类文库。此类方法例如在Hoogenboom 等人，(2001)于 Methods in Molecular Biology 178:1-37，O’Brien 等人，编撰, Human Press, Totowa, N.J.中有综述，并在以下中有进一步描述，例如 McCafferty 等人，(1991) Nature 348:552-554; Clackson 等人，(1991)Nature 352: 624-628; Marks 等人，(1992) J. Mol.Biol.222:581-597; Marks 和Bradbury (2003) 于 Methods in Molecular Biology 248:161-175, Lo, 编撰., HumanPress, Totowa, N.J.中; Sidhu 等人，(2004) J. Mol.Biol.338(2):299-310; Lee 等人，(2004) J. Mol.Biol.340(5):1073-1093; Fellouse (2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472; 以及 Lee 等人，(2004) J.Immunol.Methods 284(1-2): 119-132。
在某些噬菌体展示方法中，VH和VL基因库由聚合酶链式反应（PCR）分别克隆并在噬菌体文库中随机重组，然后可针对抗原结合噬菌体筛选所述噬菌体文库，如在Winter等人，(1994) Ann.Rev. Immunol., 12: 433-455中所述。噬菌体通常以单链Fv(scFv)片段或Fab片段的形式展示抗体片段。来自免疫源的文库针对免疫原（例如，GDF11、激活素B、ActRIIA或ActRIIB）提供高亲和力抗体而不需要构建杂交瘤。作为另外一种选择，可以克隆天然库（例如，从人）以针对广泛的非自体以及自体抗原提供单一来源的抗体而无任何免疫，如Griffiths 等人，(1993) EMBO J, 12: 725-734所述。最后，还可以通过从干细胞克隆未重排的V基因节段并使用含有随机序列的PCR引物来合成制备天然文库，以编码高度可变的CDR3区并完成体外重排，如Hoogenboom 和 Winter (1992) J. Mol.Biol., 227: 381-388所述。描述人抗体噬菌体文库的专利文献包括，例如：美国专利号5,750,373以及美国专利公布号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。
在某些实施方案中，本文提供的抗体是多特异性抗体，例如，双特异性抗体。多特异性抗体（通常为单克隆抗体）对在一种或多种（例如，两种、三种、四种、五种或六种或更多种）抗原上的至少两种不同表位（例如，两种、三种、四种、五种或六种或更多种）具有结合特异性。
在某些实施方案中，本公开的多特异性抗体具有两种或多种结合特异性，其中至少一种结合特异性是针对GDF11表位，并任选地一种或多种另外的结合特异性是针对在不同ActRII配体（例如，GDF8、激活素B、激活素C、激活素E、激活素A、GDF15、Nodal、GDF3、GDF3B、BMP9、BMP10和/或BMP6）和/或ActRII受体（例如，ActRIIA和/或ActRIIB）上的表位。在某些实施方案中，多特异性抗体可结合两种或多种不同的GDF11表位。优选地，针对GDF11表位具有部分结合亲和力的本公开的多特异性抗体可以用于抑制GDF11活性（例如，结合并且/或者活化ActRIIA和/或ActRIIB受体的能力），并任选地抑制一种或多种不同的ActRII配体（例如，GDF8、激活素B、激活素C、激活素E、激活素A、GDF15、Nodal、GDF3、GDF3B、BMP9、BMP10和/或BMP6)和/或ActRII受体（例如，ActRIIA或ActRIIB受体）的活性。在优选的实施方案中，结合并且/或者抑制GDF11的本公开的多特异性抗体还结合并且/或者抑制至少激活素B。任选地，结合并且/或者抑制GDF11的本公开的多特异性抗体不结合并且/或者抑制激活素A。在一些实施方案中，结合并且/或者抑制GDF11的本公开的多特异性抗体还结合并且/或者抑制至少GDF8。
在某些实施方案中，本公开的多特异性抗体具有两种或多种结合特异性，其中至少一种结合特异性是针对激活素B表位，并任选地一种或多种另外的结合特异性是针对在不同ActRII配体（例如，GDF8、GDF11、激活素C、激活素E、激活素A、GDF15、Nodal、GDF3、GDF3B、BMP9、BMP10和/或BMP6）和/或ActRII受体（例如，ActRIIA和/或ActRIIB）上的表位。在某些实施方案中，多特异性抗体可结合两种或多种不同的激活素B表位。优选地，针对激活素B表位具有部分结合亲和力的本公开的多特异性抗体可以用于抑制激活素B活性（例如，结合并且/或者活化ActRIIA和/或ActRIIB受体的能力），并任选地抑制一种或多种不同的ActRII配体（例如，GDF8、GDF11、激活素C、激活素E、激活素A、GDF15、Nodal、GDF3、GDF3B、BMP9、BMP10和/或BMP6)和/或ActRII受体（例如，ActRIIA或ActRIIB受体）的活性。在优选的实施方案中，结合并且/或者抑制激活素B的本公开的多特异性抗体还结合并且/或者抑制至少GDF11。任选地，结合并且/或者抑制激活素B的本公开的多特异性抗体不结合并且/或者抑制激活素A。在一些实施方案中，结合并且/或者抑制激活素B的本公开的多特异性抗体还结合并且/或者抑制至少GDF8。
在某些实施方案中，本公开的多特异性抗体具有两种或多种结合特异性，其中至少一种结合特异性是针对GDF8表位，并任选地一种或多种另外的结合特异性是针对在不同ActRII配体（例如，GDF11、激活素B、激活素C、激活素E、激活素A、GDF15、Nodal、GDF3、GDF3B、BMP9、BMP10和/或BMP6）和/或ActRII受体（例如，ActRIIA和/或ActRIIB）上的表位。在某些实施方案中，多特异性抗体可结合两种或多种不同的GDF8表位。优选地，针对GDF8表位具有部分结合亲和力的本公开的多特异性抗体可以用于抑制GDF8活性（例如，结合并且/或者活化ActRIIA和/或ActRIIB受体的能力），并任选地抑制一种或多种不同的ActRII配体（例如，GDF11、激活素B、激活素C、激活素E、激活素A、GDF15、Nodal、GDF3、GDF3B、BMP9、BMP10和/或BMP6)和/或ActRII受体（例如，ActRIIA或ActRIIB受体）的活性。在优选的实施方案中，结合并且/或者抑制GDF8的本公开的多特异性抗体还结合并且/或者抑制至少GDF11和/或激活素B。任选地，结合并且/或者抑制GDF8的本公开的多特异性抗体不结合并且/或者抑制激活素A。
在某些实施方案中，本公开的多特异性抗体具有两种或多种结合特异性，其中至少一种结合特异性是针对激活素C表位，并任选地一种或多种另外的结合特异性是针对在不同ActRII配体（例如，GDF8、GDF11、激活素B、激活素E、激活素A、GDF15、Nodal、GDF3、GDF3B、BMP9、BMP10和/或BMP6）和/或ActRII受体（例如，ActRIIA和/或ActRIIB）上的表位。在某些实施方案中，多特异性抗体可结合两种或多种不同的激活素C表位。优选地，针对激活素C表位具有部分结合亲和力的本公开的多特异性抗体可以用于抑制激活素C活性（例如，结合并且/或者活化ActRIIA和/或ActRIIB受体的能力），并任选地抑制一种或多种不同的ActRII配体（例如，GDF8、GDF11、激活素B、激活素E、激活素A、GDF15、Nodal、GDF3、GDF3B、BMP9、BMP10和/或BMP6)和/或ActRII受体（例如，ActRIIA或ActRIIB受体）的活性。在优选的实施方案中，结合并且/或者抑制激活素C的本公开的多特异性抗体还结合并且/或者抑制至少GDF11和/或激活素B。任选地，结合并且/或者抑制激活素C的本公开的多特异性抗体不结合并且/或者抑制激活素A。任选地，结合并且/或者抑制激活素C的本公开的多特异性抗体还结合并且/或者抑制GDF8。
在某些实施方案中，本公开的多特异性抗体具有两种或多种结合特异性，其中至少一种结合特异性是针对激活素E表位，并任选地一种或多种另外的结合特异性是针对在不同ActRII配体（例如，GDF8、GDF11、激活素C、激活素B、激活素A、GDF15、Nodal、GDF3、GDF3B、BMP9、BMP10和/或BMP6）和/或ActRII受体（例如，ActRIIA和/或ActRIIB）上的表位。在某些实施方案中，多特异性抗体可结合两种或多种不同的激活素E表位。优选地，针对激活素E表位具有部分结合亲和力的本公开的多特异性抗体可以用于抑制激活素E活性（例如，结合并且/或者活化ActRIIA和/或ActRIIB受体的能力），并任选地抑制一种或多种不同的ActRII配体（例如，GDF8、GDF11、激活素C、激活素A、GDF15、Nodal、GDF3、GDF3B、BMP9、BMP10和/或BMP6)和/或ActRII受体（例如，ActRIIA或ActRIIB受体）的活性。在优选的实施方案中，结合并且/或者抑制激活素E的本公开的多特异性抗体还结合并且/或者抑制至少GDF11和/或激活素B。任选地，结合并且/或者抑制激活素E的本公开的多特异性抗体不结合并且/或者抑制激活素A。任选地，结合并且/或者抑制激活素E的本公开的多特异性抗体还结合并且/或者抑制GDF8。
在某些实施方案中，本公开的多特异性抗体具有两种或多种结合特异性，其中至少一种结合特异性是针对BMP6表位，并任选地一种或多种另外的结合特异性是针对在不同ActRII配体（例如，GDF11、激活素B、激活素C、激活素E、GDF8、激活素A、GDF15、Nodal、GDF3、GDF3B、BMP9和BMP10）和/或ActRII受体（例如，ActRIIA和/或ActRIIB）上的表位。在某些实施方案中，多特异性抗体可结合两种或多种不同的BMP6表位。优选地，针对BMP6表位具有部分结合亲和力的本公开的多特异性抗体可以用于抑制BMP6活性（例如，结合并且/或者活化ActRIIA和/或ActRIIB受体的能力），并任选地抑制一种或多种不同的ActRII配体（例如，GDF11、激活素B、激活素C、激活素E、GDF8、激活素A、GDF15、Nodal、GDF3、GDF3B、BMP9和BMP10)和/或ActRII受体（例如，ActRIIA或ActRIIB受体）的活性。在优选的实施方案中，结合并且/或者抑制BMP6的本公开的多特异性抗体还结合并且/或者抑制至少GDF11和/或激活素B。任选地，结合并且/或者抑制BMP6的本公开的多特异性抗体不结合并且/或者抑制激活素A。任选地，结合并且/或者抑制BMP6的本公开的多特异性抗体还结合并且/或者抑制GDF8。
在某些实施方案中，本公开的多特异性抗体具有两种或多种结合特异性，其中至少一种结合特异性是针对BMP9表位，并任选地一种或多种另外的结合特异性是针对在不同ActRII配体（例如，GDF11、激活素B、激活素C、激活素E、GDF8、激活素A、GDF15、Nodal、GDF3、GDF3B和BMP10）和/或ActRII受体（例如，ActRIIA和/或ActRIIB）上的表位。在某些实施方案中，多特异性抗体可结合两种或多种不同的BMP9表位。优选地，针对BMP9表位具有部分结合亲和力的本公开的多特异性抗体可以用于抑制BMP9活性（例如，结合并且/或者活化ActRIIA和/或ActRIIB受体的能力），并任选地抑制一种或多种不同的ActRII配体（例如，GDF11、激活素B、激活素C、激活素E、GDF8、激活素A、GDF15、Nodal、GDF3、GDF3B和BMP10)和/或ActRII受体（例如，ActRIIA或ActRIIB受体）的活性。在优选的实施方案中，结合并且/或者抑制BMP9的本公开的多特异性抗体还结合并且/或者抑制至少GDF11和/或激活素B。任选地，结合并且/或者抑制BMP9的本公开的多特异性抗体不结合并且/或者抑制激活素A。任选地，结合并且/或者抑制BMP9的本公开的多特异性抗体还结合并且/或者抑制GDF8。在某些实施方案中，结合BMP9的多特异性抗体抑制BMP9与TGFβ超家族的II型受体（例如，ActRIIA和/或ActRIIB）之间的相互作用。优选地，结合BMP9的多特异性抗体不抑制或基本上不抑制BMP9与ALK1之间的相互作用。
在某些实施方案中，本公开的多特异性抗体具有两种或多种结合特异性，其中至少一种结合特异性是针对BMP10表位，并任选地一种或多种另外的结合特异性是针对在不同ActRII配体（例如，GDF11、激活素B、激活素C、激活素E、GDF8、激活素A、GDF15、Nodal、GDF3、GDF3B和BMP9）和/或ActRII受体（例如，ActRIIA和/或ActRIIB）上的表位。在某些实施方案中，多特异性抗体可结合两种或多种不同的BMP10表位。优选地，针对BMP10表位具有部分结合亲和力的本公开的多特异性抗体可以用于抑制BMP10活性（例如，结合并且/或者活化ActRIIA和/或ActRIIB受体的能力），并任选地抑制一种或多种不同的ActRII配体（例如，GDF11、激活素B、激活素C、激活素E、GDF8、激活素A、GDF15、Nodal、GDF3、GDF3B和BMP9)和/或ActRII受体（例如，ActRIIA或ActRIIB受体）的活性。在优选的实施方案中，结合并且/或者抑制BMP10的本公开的多特异性抗体还结合并且/或者抑制至少GDF11和/或激活素B。任选地，结合并且/或者抑制BMP10的本公开的多特异性抗体不结合并且/或者抑制激活素A。任选地，结合并且/或者抑制BMP10的本公开的多特异性抗体还结合并且/或者抑制GDF8。在某些实施方案中，结合BMP10的多特异性抗体抑制BMP10与TGFβ超家族的II型受体（例如，ActRIIA和/或ActRIIB）之间的相互作用。优选地，结合BMP10的多特异性抗体不抑制或基本上不抑制BMP10与ALK1之间的相互作用。
在某些实施方案中，本公开的多特异性抗体具有两种或多种结合特异性，其中至少一种结合特异性是针对GDF11表位，并且一种其它的结合特异性是针对激活素B表位。优选地，针对GDF11表位和激活素B表位具有部分结合亲和力的本公开的多特异性抗体可以用于同时抑制GDF11和激活素B活性（例如，结合并且/或者活化ActRIIA和/或ActRIIB受体的能力）。在一些实施方案中，结合GDF11和激活素B并且/或者抑制其活性的多特异性抗体还结合并且/或者抑制GDF8、激活素A、激活素C、激活素E、GDF15、Nodal、GDF3、GDF3B、BMP9、BMP10和/或BMP6中的一种或多种。任选地，结合并且/或者抑制GDF11和激活素B的多特异性抗体基本上不结合并且/或者抑制激活素A。
用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于重组共表达具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链/轻链对[参见，例如，Milstein 和 Cuello (1983) Nature 305: 537; 国际专利公布号WO 93/08829; 以及 Traunecker 等人，(1991) EMBO J. 10: 3655, 和美国专利号5,731,168 (“杵臼”工程)]。多特异性抗体还可通过以下制备：工程改造静电转向效应用于制备抗体Fc-异源二聚分子（参见，例如，WO 2009/089004A1）；交联两种或多种抗体或片段[参见，例如，美国专利号4,676,980; 以及 Brennan 等人，(1985) Science, 229:81]；使用亮氨酸拉链以生产双特异性抗体[参见，例如，Kostelny 等人，(1992) J.Immunol., 148(5):1547-1553]；使用“双抗体”技术用于制备双特异性抗体片段[参见，例如，Hollinger 等人，(1993) Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:6444-6448]；使用单链Fv(sFv)二聚体[参见，例如，Gruber 等人，(1994) J. Immunol., 152:5368]；以及制备三特异性抗体（参见，例如，Tutt 等人，(1991) J. Immunol.147: 60）。多特异性抗体可以被制备成全长抗体或抗体片段。
具有三个或更多个功能性抗原结合位点的经工程改造的抗体，包括“章鱼抗体”，也包括在本文中[参见，例如，US 2006/0025576A1]。
在某些实施方案中，本文公开的抗体（例如，抗-GDF11抗体、抗-激活素B抗体、抗-ActRIIA抗体或抗-ActRIIB抗体）是单克隆抗体。单克隆抗体指代得自基本上均一的抗体群体的抗体，即，除了可能的变体抗体（例如，含有天然存在的突变或在生产单克隆抗体制备物期间发生突变，此类变体通常以微量存在）外，构成该群体的单个抗体是相同的并且/或者结合相同的表位。与多克隆抗体制备物（其通常包括针对不同表位的不同抗体）相反，单克隆抗体制备物中的每个抗体均针对抗原上的单一表位。因此，修饰语“单克隆”表明了抗体的特点是其得自一组基本上均一的抗体，并且不应将其理解为需要通过任何特定的方法来生产该抗体。例如，根据本发明的方法所用的单克隆抗体可通过各种技术制备，包括但不限于：杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法以及利用含有人免疫球蛋白基因座的全部或部分的转基因动物的方法，此类方法和本文所述的用于制备单克隆抗体的其它示例性方法。
例如，通过使用源自GDF11或激活素B的免疫原，抗-蛋白质/抗-肽抗血清或单克隆抗体可以通过标准方案制备[参见，例如，Antibodies: A Laboratory Manual，Harlow 和Lane 编撰，(1988) Cold Spring Harbor Press: 1988]。哺乳动物，如小鼠、仓鼠或兔子，可以用GDF11或激活素B多肽的免疫原性形式、能够诱发抗体应答的抗原片段、或融合蛋白进行免疫。用于赋予蛋白质或肽免疫原性的技术包括结合至载体或本领域熟知的其它技术。可以在存在佐剂的情况下施用GDF11或激活素B多肽的免疫原性部分。可以通过检测血浆或血清中的抗体效价来监测免疫的进展。标准ELISA或其它免疫测定法可以与免疫原（作为抗原）一起使用以评估抗体产生水平和/或结合亲和力水平。
在用GDF11或激活素B的抗原制备物对动物进行免疫后，可以获得抗血清，并且如果需要，可以从血清中分离出多克隆抗体。为了生产单克隆抗体，可以从经过免疫的动物中收获产生抗体的细胞（淋巴细胞）并通过标准体细胞融合程序用永生化细胞（如骨髓瘤细胞）融合以得到杂交瘤细胞。此类技术是本领域熟知的，并且包括，例如，杂交瘤技术[参见，例如，Kohler 和 Milstein (1975) Nature, 256: 495-497]、人B细胞杂交瘤技术[参见，例如，Kozbar 等人，(1983) Immunology Today, 4:72]和生产人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术[Cole 等人，(1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss,Inc. pp. 77-96]。可以免疫化学筛选杂交瘤细胞用于生产与GDF11或激活素B多肽特异性反应的抗体，以及分离自包含此类杂交瘤细胞的培养物的单克隆抗体。
在某些实施方案中，可向本文提供的抗体（例如，抗-GDF11抗体、抗-激活素B抗体、抗-ActRIIA抗体或抗-ActRIIB抗体）的Fc区中引入一种或多种氨基酸修饰，从而生成Fc区变体。所述Fc区变体可包含人Fc区序列（例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区），所述序列在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰（例如，置换、缺失和/或添加）。
例如，本公开设想了这样的抗体变体，其具有一些但非全部效应功能，这使其成为如下应用的理想候选者：其中该抗体的体内半衰期是重要的而某些效应功能[例如，补体依赖型细胞毒性（CDC）和抗体依赖型细胞毒性（ADCC）]是不必要的或是有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定法以确认CDC和/或ADCC活性的降低/耗尽。例如，可以进行Fc受体（FcR）结合测定法以确保抗体缺乏FcγR结合（因而很可能缺乏ADCC活性）但保留了FcRn结合能力。用于介导ADCC的主要细胞，NK细胞，仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达汇总于例如Ravetch 和 Kinet (1991) Annu.Rev.Immunol.9:457-492中。评估目标分子的ADCC活性的体外测定法的非限制性实例在美国专利号5,500,362; Hellstrom, I. 等人，(1986) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:7059-7063]; Hellstrom, I 等人，(1985) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:1499-1502; 美国专利号5,821,337; Bruggemann, M. 等人，(1987) J. Exp.Med.166:1351-1361 中有述。作为另外一种选择，可采用非放射性测定方法（例如，ACTI™, 用于流式细胞术的非放射性细胞毒性测定法; CellTechnology, Inc. Mountain View, Calif.; 和 CytoTox 96® 非放射性细胞毒性测定法, Promega, Madison, Wis.）。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单核细胞（PBMC）和自然杀伤（NK）细胞。作为另外一种选择或除此之外，可以例如在动物模型中体内评估目标分子的ADCC活性，如在Clynes 等人，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:652-656中所公开的。也可进行C1q结合测定法以确认抗体无法结合C1q并因而缺乏CDC活性[参见，例如，WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA]。为了评估补体活化，可进行CDC测定[参见，例如，Gazzano-Santoro 等人，(1996) J. Immunol.Methods 202:163; Cragg, M. S. 等人，(2003) Blood 101:1045-1052; 以及 Cragg, M. S, 和 M. J. Glennie (2004) Blood 103:2738-2743]。还可以使用本领域已知的方法进行FcRn结合及体内清除/半衰期测定[参见，例如，Petkova, S. B.等人，(2006) Intl. Immunol.18(12):1759-1769]。
具有减少的效应功能的本公开的抗体（例如，抗-GDF11抗体、抗-激活素B抗体、抗-ActRIIA抗体或抗-ActRIIB抗体）包括在Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个处被置换的那些（美国专利号6,737,056）。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两处或更多处具有置换的Fc突变体，包括残基265和297被置换成丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体（美国专利号7,332,581）。
在某些实施方案中，可能期望生成半胱氨酸工程改造的抗体，例如，“thioMAb”，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基所置换。在特定的施方案中，被置换的残基位于该抗体的可及位点。通过用半胱氨酸置换那些残基，从而将反应性巯基设置在该抗体的可及位点，并可用于将该抗体结合至其它部分，如药物部分或接头-药物部分，以生成免疫偶联物，如本文进一步所述。在某些实施方案中，可用半胱氨酸置换下列残基中的任何一个或多个：轻链的V205（Kabat编号）；重链的A118（EU编号）；以及重链Fc区的S400（EU编号）。可如，例如，美国专利No. 7,521,541中所述，生成半胱氨酸工程改造的抗体。
另外，用于筛选抗体从而识别所需抗体的技术可能影响所获得抗体的性质。例如，如果抗体是将用于在溶液中结合抗原，则可能期望测试溶液结合。存在各种不同的技术可用于测试抗体与抗原之间的相互作用以识别特别期望的抗体。此类技术包括：ELISA、表面等离子体共振结合测定法（例如，Biacore结合测定法，Biacore AB，Uppsala, Sweden)、夹心测定法（例如，顺磁性微珠系统，IGEN International, Inc., Gaithersburg,Maryland）、Western印迹、免疫沉淀测定法以及免疫组织化学。
在某些实施方案中，设想了本文提供的抗体和/或结合多肽的氨基酸序列变体。例如，可能期望改善抗体和/或结合多肽的结合亲和力和/或其它生物特性。抗体和/或结合多肽的氨基酸序列变体可通过向编码该抗体和/或结合多肽的核苷酸序列中引入适当的修饰，或通过肽合成制备。此类修饰包括，例如，从抗体和/或结合多肽的氨基酸序列内缺失和/或向其中插入和/或置换其中的残基。可尝试缺失、插入和置换的任何组合以得到最终的构建体，前提是该最终构建体具有所需的特性，例如，靶标结合（GDF11和/或激活素B结合）。
可在HVR中制造变换（例如，置换），例如，以改善抗体亲和力。可在HVR“热点”（即，由在体细胞的成熟过程中经历高频率突变的密码子所编码的残基）[参见，例如，Chowdhury(2008) Methods Mol.Biol.207:179-196 (2008)]和/或SDR(a-CDR)中制造此类变换，并测试所得变体VH或VL的结合亲和力。本领域已经描述了通过构建二级文库并从中重新选择来实现亲和力成熟[参见，例如，Hoogenboom 等人，在 Methods in Molecular Biology 178:1-37中, O’Brien 等人，编撰，Human Press, Totowa, N.J., (2001)]。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法（例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸定点诱变）中的任一种向针对成熟选定的可变基因中引入多样性。然后创建二级文库。然后筛选该文库以识别出具有所需亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法涉及HVR定向的方法，其中将若干HVR残基（例如，4-6个残基/次）随机化。涉及抗原结合的HVR残基可例如使用丙氨酸扫描诱变或建模而被特别地识别出。特别是CDR-H3和CDR-L3经常被靶向。
在某些实施方案中，置换、插入或缺失可在一个或多个HVR内发生，只要此类变换基本上不降低抗体结合抗原的能力。例如，可在HVR中制造基本上不降低结合亲和力的保守变换（例如，如本文提供的保守置换）。此类变换可以是在HVR“热点”或SDR之外。在以上提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，各个HVR要么未改变，要么含有不超过一个、两个或三个氨基酸置换。
可用于识别诱变可能靶向的抗体和/或结合多肽的残基或区的方法被称为“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham 和 Wells (1989) Science, 244:1081-1085所述。在此方法中，残基或一组靶标残基（例如，带电残基如arg、asp、his、lys和glu）被识别出并由中性或带负电的氨基酸（例如，丙氨酸或聚丙氨酸）替换以确定抗体-抗原相互作用是否受到影响。可在对初始的置换表现出功能敏感性的氨基酸位置引入另外的置换。作为另外一种选择或除此之外，确定抗原-抗体复合体的晶体结构以识别出抗体与抗原之间的接触点。此类接触残基及相邻残基可作为置换的候选者而被靶向或消除。可筛选变体以确定其是否具有所需特性。
氨基酸序列插入包括：长度从一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N-末端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其它插入变体包括：抗体的N-或C-末端与酶（例如，针对ADEPT）或多肽的融合，其增加了该抗体的血清半衰期。
在某些实施方案中，本文提供的抗体和/或结合多肽可经进一步修饰以含有额外的本领域已知并易得的非蛋白质部分。适用于抗体和/或结合多肽的衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于：聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羟甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性可能在生产中有优势。所述聚合物可以具有任何分子量并可以是支链的或非支链的。附接至抗体和/或结合多肽的聚合物的数量可以变化，并且如果附接了不止一个聚合物，则其可以是相同或不同的分子。通常，用于衍生化的聚合物的数量和/或类型可以基于以下考量而确定，包括但不限于：待改善的抗体和/或结合多肽的具体性质或功能、抗体衍生物和/或结合多肽衍生物是否将在规定条件下被用于治疗。
本文公开的任何抗体(例如，抗-GDF11抗体、抗-激活素A抗体、抗-激活素B抗体、抗-激活素C抗体、抗-激活素E抗体、抗-GDF8抗体、抗-BMP6抗体、抗-ActRIIA抗体、抗-GDF15抗体、抗-Nodal抗体、抗-GDF3抗体、抗-BMP3抗体、抗-BMP3B抗体、抗-BMP9抗体、抗-BMP10抗体或抗-ActRIIB抗体)可以与本公开的一种或多种另外的拮抗试剂组合以达到所需效果。本文公开的抗体(例如，抗-GDF11抗体、抗-激活素A抗体、抗-激活素B抗体、抗-激活素C抗体、抗-激活素E抗体、抗-GDF11抗体、抗-GDF8抗体、抗-BMP6抗体、抗-ActRIIA抗体、抗-GDF15抗体、抗-Nodal抗体、抗-GDF3抗体、抗-BMP3抗体、抗-BMP3B抗体、抗-BMP9抗体、抗-BMP10抗体或抗-ActRIIB抗体)可以与本文公开的另一种抗体或本文公开的配体陷阱多肽(例如，GDF11陷阱多肽、激活素B陷阱多肽或GDF11/激活素B陷阱多肽)或针对本公开的任何靶标的小分子拮抗剂(例如，激活素A小分子拮抗剂、激活素B小分子拮抗剂、GDF11小分子拮抗剂、激活素C小分子拮抗剂、激活素E小分子拮抗剂、GDF8小分子拮抗剂、BMP6小分子拮抗剂、GDF15小分子拮抗剂、Nodal小分子拮抗剂、GDF3小分子拮抗剂、BMP3B小分子拮抗剂、BMP3B小分子拮抗剂、BMP9小分子拮抗剂或BMP10小分子拮抗剂)或本公开的多核苷酸拮抗剂(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、GDF11、GDF8、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B或BMP6的多核苷酸拮抗剂)或本文公开的非抗体结合多肽(例如，GDF11结合多肽、激活素A结合多肽、激活素B结合多肽、激活素E结合多肽、激活素C结合多肽、GDF8结合多肽、GDF15结合多肽、Nodal结合多肽、a GDF3结合多肽、BMP3结合多肽、BMP3B多肽、BMP9结合多肽、BMP10结合多肽或BMP6结合多肽)组合。例如，抗-GDF11抗体可以与本公开的激活素B拮抗剂(例如，激活素B陷阱多肽、激活素B抗体、激活素B的小分子拮抗剂、激活素B的多核苷酸拮抗剂或激活素B的非抗体多肽拮抗剂)组合以同时抑制GDF11和激活素B活性(例如，结合并且/或者活化ActRIIA和/或ActRIIB受体的能力)。在可供选择的实施方案中，抗-激活素B抗体可以与本公开的GDF11拮抗剂(例如，GDF陷阱多肽、抗-GDF11抗体、GDF11的小分子拮抗剂、GDF11的多核苷酸拮抗剂或GDF11的非抗体多肽拮抗剂)组合以同时抑制GDF11和激活素B活性。
B. GDF11、激活素B以及GDF11/激活素B陷阱多肽
在一个方面，本公开的拮抗（抑制）试剂是ActRII多肽及其变体。如本文所用，术语“ActRII”指代II型激活素受体家族。此家族既包括激活素受体IIA型（ActRIIA）也包括激活素受体IIB型（ActRIIB）。在一些实施方案中，本公开的方法涉及一种或多种变体ActRII多肽（例如，变体ActRIIA和ActRIIB多肽）的用途，其结合以下中的一种或多种并且/或者拮抗（抑制）其活性：GDF11、GDF8、激活素B、激活素C、激活素E、激活素A、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3和BMP3B(例如，活化ActRIIA和/或ActRIIB Smad2/3和/或Smad 1/5/8信号转导).在一些实施方案中，变体ActRII多肽是配体“陷阱” 多肽(例如，GDF11陷阱多肽、激活素B陷阱多肽、GDF11/激活素B陷阱多肽)。在一些实施方案中，变体ActRII多肽及其融合构建体针对BMP9和/或BMP10具有降低的结合亲和力。
如本文所用，术语“ActRIIB”指代来自任何物种的激活素受体IIB型（ActRIIB）蛋白以及通过诱变或其它修饰而衍生自此类ActRIIB蛋白的变体的家族。本文对ActRIIB的引用应当理解为对任一种当前已识别出的形式的引用。ActRIIB家族的成员通常是跨膜蛋白，由具有半胱氨酸富集区的配体结合胞外域、跨膜域和具有预测的丝氨酸/苏氨酸激酶活性的胞质域构成。在图1中示出了人ActRIIB可溶性胞外域和相关的ActRIIA可溶性胞外域的氨基酸序列比对。
术语“ActRIIB多肽”包括这样的多肽，其包含ActRIIB家族成员的任何天然存在的多肽及其保持可用活性的任何变体（包括突变体、片段、融合体和肽模拟物形式）[参见，例如，国际专利申请公布号WO 2006/012627]。本文所述的所有ActRIIB相关多肽的氨基酸编号都是基于SEQ ID NO:1的编号，除非另有特别指定。
申请人已经确定，具有由Hilden 等人[Blood (1994) 83(8): 2163-2170]公开的序列的Fc融合蛋白（其在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸64的位置具有丙氨酸(A65)）针对激活素和GDF11具有相对低的亲和力。相反，在该位置具有精氨酸（R65）的同样的Fc融合蛋白针对激活素和GDF11的亲和力在低纳摩尔至高皮摩尔的范围内。因此，具有R64的序列被用作本公开中人ActRIIB的“野生型”参考序列。
人ActRIIB前体蛋白序列如下：
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信号肽以单下划线标明；胞外域以粗体标明；而可能的天然N-连接的糖基化位点以双下划线标明。
在文献中也报道了在位置64具有丙氨酸的形式，如下：
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人ActRIIB的可溶性（胞外）、经加工的多肽序列如下：
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具有A64的替代形式如下：
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在一些实施方案中，可以生产在N-末端具有“SGR…”序列的蛋白。胞外域的C-末端“尾部”由单下划线标明。具有“尾部”缺失的序列（Δ15序列）如下：
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具有A64的替代形式如下：
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编码人ActRIIB前体蛋白的核酸序列如下：（Genbank条目NM_001106的核苷酸5-1543；所示序列在位置64提供了丙氨酸，并且可以经修饰而提供精氨酸）
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编码ActRIIB可溶性（胞外）多肽的核酸序列如下（所示序列在位置64提供了丙氨酸，并且可以经修饰而提供精氨酸）：
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在某些实施方案中，本公开涉及ActRIIA多肽。如本文所用，术语“ActRIIA”指代来自任何物种的激活素受体IIA型（ActRIIA）蛋白以及通过诱变或其它修饰而衍生自此类ActRIIA蛋白的变体的家族。本文对ActRIIA的引用应当理解为对任一种当前已识别出的形式的引用。ActRIIA家族的成员通常是跨膜蛋白，由具有半胱氨酸富集区的配体结合胞外域、跨膜域和具有预测的丝氨酸/苏氨酸激酶活性的胞质域构成。
术语“ActRIIA多肽”包括这样的多肽，其包含ActRIIA家族成员的任何天然存在的多肽及其保持可用活性的任何变体（包括突变体、片段、融合体和肽模拟物形式）（参见，例如，国际专利申请公布号WO 2006/012627）。本文所述的所有ActRIIA相关多肽的氨基酸编号都是基于SEQ ID NO:9的编号，除非另有特别指定。
人ActRIIA前体蛋白序列如下：
。
信号肽以单下划线标明；胞外域以粗体标明；而可能的N-连接的糖基化位点以双 下划线标明。
人ActRIIA的可溶性（胞外）、经加工的多肽序列如下：
。
胞外域的C-末端“尾部”由单下划线标明。具有“尾部”缺失的序列（Δ15序列）如下：
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编码人ActRIIA前体蛋白的核酸序列如下（Genbank条目NM_001616的核苷酸164-1705）：
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编码人ActRIIA可溶性（胞外）多肽的核酸序列如下：
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在某些实施方案中，本公开涉及ActRII多肽（ActRIIA和ActRIIB多肽），其为可溶性ActRII多肽。如本文所述，术语“可溶性ActRII多肽”通常指代包含ActRII蛋白的胞外域的多肽。术语“可溶性ActRII多肽”，如本文所用，包括ActRII蛋白的任何天然存在的胞外域及其保持可用活性（例如，如本文所述的GDF11陷阱、激活素B陷阱以及GDF11/激活素B陷阱）的任何变体（包括突变体、片段和肽模拟物形式）。可溶性ActRII多肽的其它实例在ActRII蛋白的胞外域之外还包含信号序列。例如，所述信号序列可以是ActRIIA或ActRIIB蛋白的天然信号序列或来自另一种蛋白的信号序列（包括，例如，组织纤维蛋白溶酶原激活因子（TPA）信号序列或蜜蜂蜂毒肽（HBM）信号序列）。
HBM信号序列的实例如下：
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TPA信号序列的实例如下：
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在某些实施方案中，本公开设想了在ActRII多肽的胞外域（也称为配体结合域）中制造突变，使得所述ActRII多肽具有改变的配体结合活性（例如，结合特异性）。在某些方面，此类“配体陷阱”多肽针对一种或多种特定的ActRII配体具有改变的（升高的或降低的）结合亲和力。在其它方面，配体陷阱多肽针对一种或多种ActRII配体具有改变的结合特异性。
例如，本公开提供了使用优先结合至少GDF11和/或激活素B的配体陷阱多肽的方法，特别是用于在有此需要的个体中提高红细胞水平并且/或者治疗贫血的方法。任选地，本公开的陷阱多肽不结合并且/或者抑制激活素A。任选地，本公开的陷阱多肽还结合GDF8。在一些实施方案中，结合并且/或者抑制GDF11和/或激活素B的本公开的陷阱多肽还结合并且/或者抑制激活素C、激活素E、激活素A、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B和GDF8中的一种或多种。任选地，本公开的陷阱多肽针对BMP9和/或BMP10具有降低的（乃至没有）结合亲和力。
如本文所公开，GDF11/激活素B陷阱是同时结合GDF11和激活素B并且/或者拮抗（抑制）其活性（例如，GDF11介导的和激活素B介导的ActRIIA或ActRIIB Smad2/3信号转导途径的活化）的变体ActRII多肽（例如，变体ActRIIA或ActRIIB多肽）。因此，本公开提供了包含ActRII受体的改变的配体结合域[例如，包含一个或多个氨基酸突变（例如，氨基酸置换、添加或缺失）]的GDF11/激活素B陷阱，其特征部分在于，相对于ActRII受体的未修饰的（野生型）配体结合域，其对GDF11和激活素B具有增加的选择性。任选地，GDF11/激活素B陷阱基本上不结合激活素A并且/或者抑制其活性（例如，激活素A介导的ActRIIA或ActRIIBSmad2/3信号转导途径的活化）。
在一些实施方案中，相对于ActRII受体的未修饰的（野生型）配体结合域，本公开的GDF11/激活素B陷阱针对GDF11和/或激活素B具有相等的或升高的结合亲和力（例如，升高了2、3、10、100、1000倍的结合亲和力）。任选地，所述GDF11/激活素B陷阱包含改变的ActRII配体结合域，其结合激活素A的KD对结合GDF11的KD的比率相对于未修饰的（野生型）ActRII配体结合域的比率大至少2、5、10、100或甚至1000倍。任选地，所述GDF11/激活素B陷阱包含改变的ActRII配体结合域，其结合激活素A的KD对结合激活素B的KD的比率相对于未修饰的（野生型）ActRII配体结合域的比率大至少2、5、10、100或甚至1000倍。任选地，所述GDF11/激活素B陷阱包含改变的ActRII配体结合域，其抑制激活素A的IC50对抑制GDF11的IC50的比率相对于未修饰的（野生型）ActRII配体结合域大至少2、5、10、100或甚至1000倍。任选地，所述GDF11/激活素B陷阱包含改变的ActRII配体结合域，其抑制激活素A的IC50对抑制激活素B的IC50的比率相对于未修饰的（野生型）ActRII配体结合域大至少2、5、10、100或甚至1000倍。任选地，所述GDF11/激活素B陷阱包含改变的ActRII配体结合域，其以相比抑制激活素A的IC50小至少2、5、10或甚至100倍的IC50抑制GDF11。任选地，所述GDF11/激活素B陷阱包含改变的ActRII配体结合域，其以相比抑制激活素A的IC50小至少2、5、10或甚至100倍的IC50抑制激活素B。
在一些实施方案中，本公开的GDF11/激活素B陷阱任选地还结合BMP6、激活素C、激活素E、激活素A、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10以及GDF8中的一种或多种并且/或者抑制其活性。
在一些实施方案中，本公开的GDF11/激活素B陷阱包含与SEQ ID NO:1或2的氨基酸29-109至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列。在优选的实施方案中，本公开的GDF11/激活素B陷阱不包含SEQ ID NO:1或2的氨基酸29-109或不由其组成。在其它优选的实施方案中，本公开的GDF11/激活素B陷阱在相对于SEQ ID NO: 1或2的位置79处不包含酸性氨基酸[例如，天冬氨酸（D）或谷氨酸（E）]。
在其它实施方案中，所述GDF11/激活素B陷阱包含与SEQ ID NO: 3、4、5、6、21、23、48和49中的任一者至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列。在优选的实施方案中，本公开的GDF11/激活素B陷阱不包含SEQ ID NO: 3、4、5、6、21、23、48和49中的任一者的氨基酸序列或不由其组成。
在一些实施方案中，本公开的GDF11/激活素B陷阱包含与SEQ ID NO:9的氨基酸30-110至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列。在优选的实施方案中，本公开的GDF11/激活素B陷阱不包含SEQ ID NO:9的氨基酸30-110或不由其组成。在其它实施方案中，所述GDF11/激活素陷阱包含与SEQ ID NO: 10、11、18和20中的任一者至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列。在优选的实施方案中，本公开的GDF11/激活素B陷阱不包含SEQ ID NO: 10、11、18和20中的任一者的氨基酸序列或不由其组成。
如本文所公开，GDF11陷阱是这样的的变体ActRII多肽（例如，变体ActRIIA或ActRIIB多肽），其结合GDF11并且/或者拮抗（抑制）其活性（例如，GDF11介导的ActRIIA或ActRIIB Smad2/3信号转导途径的活化），但基本上不结合激活素B并且/或者抑制其活性（例如，激活素B介导的ActRIIA或ActRIIB Smad2/3信号转导途径的活化）。因此，本公开提供了包含ActRII受体的改变的配体结合域[例如，包含一个或多个氨基酸突变（例如，氨基酸置换、添加或缺失）]的GDF11陷阱，其特征部分在于，相对于ActRII受体的未修饰的（野生型）配体结合域，其对GDF11具有增加的选择性。任选地，GDF11陷阱不结合激活素A并且/或者抑制其活性（例如，激活素A介导的ActRIIA或ActRIIB Smad2/3信号转导途径的活化）。
在一些实施方案中，相对于ActRII受体的未修饰的（野生型）配体结合域，本公开的GDF11陷阱针对GDF11具有相等的或增强的结合亲和力（例如，升高了2、3、10、100、1000倍的结合亲和力）。任选地，所述GDF11陷阱包含改变的ActRII配体结合域，其结合激活素A的KD对结合GDF11的KD的比率相对于未修饰的（野生型）ActRII配体结合域的比率大至少2、5、10、100或甚至1000倍。任选地，所述GDF11陷阱包含改变的ActRII配体结合域，其结合激活素B的KD对结合GDF11的KD的比率相对于未修饰的（野生型）ActRII配体结合域的比率大至少2、5、10、100或甚至1000倍。任选地，所述GDF11陷阱包含改变的ActRII配体结合域，其抑制激活素A的IC50对抑制GDF11的IC50的比率相对于未修饰的（野生型）ActRII配体结合域大至少2、5、10、100或甚至1000倍。任选地，所述GDF11陷阱包含改变的ActRII配体结合域，其抑制激活素B的IC50对抑制GDF11的IC50的比率相对于未修饰的（野生型）ActRII配体结合域大至少2、5、10、100或甚至1000倍。任选地，所述GDF11陷阱包含改变的ActRII配体结合域，其以相比抑制激活素A的IC50小至少2、5、10或甚至100倍的IC50抑制GDF11。任选地，所述GDF11陷阱包含改变的ActRII配体结合域，其以相比抑制激活素B的IC50小至少2、5、10或甚至100倍的IC50抑制GDF11。
在一些实施方案中，本公开的GDF11陷阱任选地还结合BMP6、激活素C、激活素E、激活素A、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9、BMP10和GDF8中的一种或多种并且/或者抑制其活性。
在一些实施方案中，本公开的GDF11陷阱包含与SEQ ID NO:1或2的氨基酸29-109至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列。在优选的实施方案中，本公开的GDF11陷阱不包含SEQ ID NO:1或2的氨基酸29-109或不由其组成。在其它优选的实施方案中，本公开的GDF11陷阱在相对于SEQ ID NO: 1或2的位置79处不包含酸性氨基酸[例如，天冬氨酸（D）或谷氨酸（E）]。
在其它实施方案中，所述GDF11陷阱包含与SEQ ID NO: 3、4、5、6、21、23、48和49中的任一者至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列。在优选的实施方案中，本公开的GDF11陷阱不包含SEQ ID NO: 3、4、5、6、21、23、48和49中的任一者的氨基酸序列或不由其组成。
在一些实施方案中，本公开的GDF11陷阱包含与SEQ ID NO:9的氨基酸30-110至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列。在优选的实施方案中，本公开的GDF11陷阱不包含SEQ ID NO:9的氨基酸30-110或不由其组成。在其它实施方案中，所述GDF11陷阱包含与SEQ ID NO: 10、11、18和20中的任一者至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列。在优选的实施方案中，本公开的GDF11陷阱不包含SEQ ID NO: 10、11、18和20中的任一者的氨基酸序列或不由其组成。
如本文所公开，激活素B陷阱是这样的的变体ActRII多肽（例如，变体ActRIIA或ActRIIB多肽），其结合激活素B并且/或者拮抗（抑制）其活性（例如，激活素B介导的ActRIIA或ActRIIB Smad2/3信号转导途径的活化），但基本上不结合GDF11并且/或者抑制其活性（例如，GDF11介导的ActRIIA或ActRIIB Smad2/3信号转导途径的活化）。因此，本公开提供了包含ActRII受体的改变的配体结合域[例如，包含一个或多个氨基酸突变（例如，氨基酸置换、添加或缺失）]的激活素B陷阱，其特征部分在于，相对于ActRII受体的未修饰的（野生型）配体结合域，其对激活素B具有增加的选择性。任选地，激活素B陷阱基本上不结合激活素A并且/或者抑制其活性（例如，激活素A介导的ActRIIA或ActRIIB Smad2/3信号转导途径的活化）。
在一些实施方案中，相对于ActRII受体的未修饰的（野生型）配体结合域，本公开的激活素B陷阱针对激活素B具有相等的或升高的结合亲和力（例如，升高了2、3、10、100、1000倍的结合亲和力）。任选地，所述激活素B陷阱包含改变的ActRII配体结合域，其结合激活素A的KD对结合激活素B的KD的比率相对于未修饰的（野生型）ActRII配体结合域的比率大至少2、5、10、100或甚至1000倍。任选地，所述激活素B陷阱包含改变的ActRII配体结合域，其结合GDF11的KD对结合激活素B的KD的比率相对于未修饰的（野生型）ActRII配体结合域的比率大至少2、5、10、100或甚至1000倍。任选地，所述激活素B陷阱包含改变的ActRII配体结合域，其抑制激活素A的IC50对抑制激活素B的IC50的比率相对于未修饰的（野生型）ActRII配体结合域大至少2、5、10、100或甚至1000倍。任选地，所述激活素B陷阱包含改变的ActRII配体结合域，其抑制GDF11的IC50对抑制激活素B的IC50的比率相对于未修饰的（野生型）ActRII配体结合域大至少2、5、10、100或甚至1000倍。任选地，所述激活素B陷阱包含改变的ActRII配体结合域，其以相比抑制激活素A的IC50小至少2、5、10或甚至100倍的IC50抑制激活素B。任选地，所述激活素B陷阱包含改变的ActRII配体结合域，其以相比抑制GDF11的IC50小至少2、5、10或甚至100倍的IC50抑制激活素B。
在一些实施方案中，本公开的激活素B陷阱任选地还结合BMP6、激活素C、激活素E、激活素A、GDF15、Nodal、BMP3、GDF3、BMP3B、BMP9、BMP10和GDF8中的一种或多种并且/或者抑制其活性。
在一些实施方案中，本公开的激活素B陷阱包含与SEQ ID NO:1或2的氨基酸29-109至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列。在优选的实施方案中，本公开的激活素B陷阱不包含SEQ ID NO:1或2的氨基酸29-109或不由其组成。在其它优选的实施方案中，本公开的GDF11陷阱在相对于SEQ ID NO: 1或2的位置79处不包含酸性氨基酸[例如，天冬氨酸（D）或谷氨酸（E）]。
在其它实施方案中，所述激活素B陷阱包含与SEQ ID NO: 3、4、5、6、21、23、48和49中的任一者至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列。在优选的实施方案中，本公开的激活素B陷阱不包含SEQ ID NO: 3、4、5、6、21、23、48和49中的任一者的氨基酸序列或不由其组成。
在一些实施方案中，本公开的激活素B陷阱包含与SEQ ID NO:9的氨基酸30-110至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列。在优选的实施方案中，本公开的激活素B陷阱不包含SEQ ID NO:9的氨基酸30-110或不由其组成。在其它实施方案中，所述激活素B陷阱包含与SEQ ID NO: 10、11、18和20中的任一者至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列。在优选的实施方案中，本公开的激活素B陷阱不包含SEQ ID NO: 10、11、18和20中的任一者的氨基酸序列或不由其组成。
正如本领域技术人员将认识到的，大多数所述突变、变体或修饰可在核酸水平或，在一些情况下，通过翻译后修饰或化学合成来完成。此类技术是本领域熟知的并在本文中有述。
ActRII蛋白于本领域在结构和功能特性，尤其是对于配体结合方面已经充分表征[参见，例如，Attisano 等人，(1992) Cell 68(1):97-108; Greenwald 等人，(1999)Nature Structural Biology 6(1): 18-22; Allendorph 等人，(2006) PNAS 103(20:7643-7648; Thompson 等人，(2003) The EMBO Journal 22(7): 1555-1566; 以及美国专利号7,709,605; 7,612,041; 和 7,842,663]。例如，Attisano等人证明，ActRIIB的胞外域C-末端的脯氨酸结的缺失降低了该受体对激活素的亲和力。相对于包含所述脯氨酸结区和完整近膜域的ActRIIB(20-134)-Fc，含有SEQ ID NO:1的氨基酸20-119的ActRIIB-Fc融合蛋白，“ActRIIB(20-119)-Fc”，针对GDF-11和激活素具有降低的结合（参见，例如，美国专利号7,842,663）。然而，尽管所述脯氨酸结区被破坏，但相对于野生型，ActRIIB(20-129)-Fc仍保留了相似的但在一定程度上降低的活性。因此，预计终止于氨基酸134、133、132、131、130和129(相对于SEQ ID NO:1或2)的ActRIIB胞外域都是有活性的，但终止于134或133的构建体可能最有活性。类似地，预计在残基129-134中的任一处的突变都不会大幅度地改变配体结合亲和力。作为对这一观点的支持，P129和P130的突变（相对于SEQ ID NO:1或2）基本上不降低配体结合。因此，本公开的ActRIIB陷阱多肽可最早终止于氨基酸109（最后的半胱氨酸），然而，预计终止于109或109至119之间的形式具有降低的配体结合。氨基酸119（相对于SEQ ID NO:1或2）的保守程度低，因而易于改变或截短。终止于128或之后(相对于SEQID NO:1或2)的基于ActRIIB的配体陷阱保留了配体结合活性。终止于119或119至127之间(相对于SEQ ID NO:1或2)的基于ActRIIB的配体陷阱将具有中等的结合能力。取决于临床或实验设定，可能期望使用任何这些形式。
在ActRIIB的N-末端，预计起始于氨基酸29或之前（相对于SEQ ID NO:1或2）的蛋白将保留配体结合活性。氨基酸29表示初始的半胱氨酸。在位置24（相对于SEQ ID NO:1或2）的丙氨酸至天冬酰胺突变引入N-连接的糖基化序列而基本上不影响配体结合（参见，例如，美国专利号7,842,663）。这确认了在信号裂解肽与半胱氨酸交联区之间的区域（对应于氨基酸20-29）中的突变是充分容许的。具体来说，起始于位置20、21、22、23和24（相对于SEQID NO:1或2）的基于ActRIIB的配体陷阱构建体将保留一般性的配体结合活性，而预计起始于位置25、26、27、28和29（相对于SEQ ID NO:1或2）的基于ActRIIB的配体陷阱构建体也会保留配体结合活性。在例如美国专利号7,842,663中所示的数据表明，令人惊讶地，从22、23、24或25起始的ActRIIB构建体将具有最大活性。
综上，ActRIIB的活性部分（例如，配体结合活性）包含SEQ ID NO:1或2的氨基酸29-109。因此，本公开的基于ActRIIB的配体陷阱构建体可例如包含这样的氨基酸序列，其与起始于对应于SEQ ID NO: 1或2的氨基酸20-29的残基（例如，从氨基酸20、21、22、23、24、25、26、27、28或29起始）并终止于对应于SEQ ID NO: 1或2的氨基酸109-134的位置（例如，终止于氨基酸109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134）的ActRIIB的一部分至少80%、85%、90%、95%、 96%、97%、98%、99%或100%相同。在优选的实施方案中，本公开的基于ActRIIB的配体陷阱多肽在对应于SEQ ID NO: 1或2的位置79的位置不包含酸性氨基酸[例如，天冬氨酸（D）或谷氨酸（E）]。在其它优选的实施方案中，本公开的基于ActRIIB的配体陷阱多肽不包含SEQ ID NO:1或2的氨基酸29-109或不由其组成。其它实例包括起始于SEQ ID NO: 1或2的位置20-29（例如，位置20、21、22、23、24、25、26、27、28或29）或21-29（例如，位置21、22、23、24、25、26、27、28或29）并终止于位置119-134（例如，119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134）、119-133（例如，119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132或133）、129-134（例如，129、130、131、132、133或134）或129-133（例如，129、130、131、132或133）的基于ActRIIB的配体陷阱构建体。其它实例包括起始于SEQ ID NO: 1或2的位置20-24（例如，20、21、22、23或24）、21-24（例如，21、22、23或24）或22-25（例如，22、23、24或25）并终止于位置109-134（例如，109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134）、119-134（例如，119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134）或129-134（例如，129、130、131、132、133或134）的构建体。还设想了在这些范围内的变体，尤其是与SEQ ID NO: 1或2的对应部分具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的那些，任选地此类基于ActRIIB的配体陷阱多肽：i) 在对应于SEQ ID NO: 1或2的位置79的位置不包含酸性氨基酸[例如，天冬氨酸（D）或谷氨酸（E）]，并且ii) 不包含SEQ ID NO NO: 1或2的氨基酸29-109或不由其组成。在某些实施方案中，所述基于ActRIIB的配体陷阱多肽包括这样的多肽，其具有与SEQ ID NO: 1或2的氨基酸25-131至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列。在优选的实施方案中，基于ActRIIB的配体陷阱多肽不包含SEQ ID NO: 1或2的氨基酸25-131或不由其组成。在某些实施方案中，所述基于ActRIIB的陷阱多肽包括这样的多肽，其具有与SEQ ID NO:3、4、5、6、21和23至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列，前提是：i) 所述基于ActRIIB的陷阱多肽在对应于SEQ ID NO: 1或2的位置79的位置不包含酸性氨基酸[例如，天冬氨酸（D）或谷氨酸（E）]，并且ii) 所述基于ActRIIB的陷阱多肽不包含SEQ ID NO NO: 1或2的氨基酸29-109或不由其组成。
本公开包括了复合ActRIIB结构的分析结果，示于图1中，证实了配体结合口袋部分地由以下残基限定：Y31、N33、N35、L38至T41、E47、E50、Q53至K55、L57、H58、Y60、S62、K74、W78至N83、Y85、R87、A92以及E94至F101。在这些位置，预计保守突变将是容许的，但K74A突变是充分容许的，而R40A、K55A、F82A和在位置L79的突变也是如此。R40在爪蟾中是K，表明碱性氨基酸在此位置将是容许的。Q53在牛ActRIIB中是R，而在爪蟾ActRIIB中是K，因而在此位置，包括R、K、Q、N和H在内的氨基酸将是容许的。因此，基于ActRIIB的配体陷阱蛋白的通式是这样的：其包含与SEQ ID NO: 1或2的氨基酸29-109至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列，任选地起始于位置20-24（例如，20、21、22、23或24）或22-25（例如，22、23、24或25）并终止于位置129-134（例如，129、130、131、132、133或134），并且在配体结合口袋中包含不超过1、2、5、10或15个保守氨基酸变化，并且在配体结合口袋中的位置40、53、55、74、79和/或82包含零个、一个或更多个非保守变换。在优选的实施方案中，本公开的基于ActRIIB的陷阱多肽在对应于SEQ ID NO: 1或2的位置79的位置不包含酸性氨基酸[例如，天冬氨酸（D）或谷氨酸（E）]。在其它优选的实施方案中，本公开的基于ActRIIB的配体陷阱多肽不包含SEQ ID NO:1或2的氨基酸29-109或不由其组成。处于所述结合口袋外的位点（在该处的可变性可以是特别充分容许的）包括所述胞外域（如上所述）的氨基和羧基末端，以及位置42-46和65-73（相对于SEQ ID NO:1）。在位置65的天冬酰胺至丙氨酸变换（N65A）事实上改善了A64背景中的配体结合，并因此预计对于R64背景中的配体结合没有不利影响（参见，例如，美国专利号7,842,663）。此变化可能消除了A64背景中N65处的糖基化，因此表明，在此区域内的显著变化很可能是容许的。虽然R64A不太被容许，但R64K是充分容许的，因而另一种碱性残基如H可能在位置64是容许的（参见，例如，美国专利号7,842,663）。
ActRIIB在整个几乎所有的脊椎动物中是充分保守的，其中大段的所述胞外域是完全保守的。许多结合ActRIIB的配体也是高度保守的。因此，对来自各种脊椎动物生物体的ActRIIB序列的比较提供了对可能被改变的残基的深入了解。因此，可用于根据本文公开的方法的有活性的人ActRIIB变体多肽可在对应的位置包含来自另一种脊椎动物ActRIIB序列的一个或多个氨基酸，或可包含类似于人或其它脊椎动物序列中的残基。以下实例说明了这种定义有活性的ActRIIB变体的方法。L46在爪蟾ActRIIB中是缬氨酸，因而此位置可能被改变，并任选地可能被改变成另一种疏水性残基（如V、I或F）或非极性残基（如A）。E52在爪蟾中是K，表明此位点可能容许多种变化，包括极性残基（如E、D、K、R、H、S、T、P、G、Y以及可能的A）。T93在爪蟾中是K，表明此位点容许广泛的结构变化，其中倾向于极性残基（如S、K、R、E、D、H、G、P、G和Y）。F108在爪蟾中是Y，并因此Y或其它疏水性基团（如I、V或L）应当是容许的。E111在爪蟾中是K，表明带电残基在此位置将是容许的，包括D、R、K和H，以及Q和N。R112在爪蟾中是K，表明碱性残基在此位置是容许的，包括R和H。位置119处的A相对不太保守，并且在啮齿类动物中是P，而在爪蟾中是V，因此在此位置，基本上任何氨基酸都应当是容许的。
此前已经证实，相对于ActRIIB(R64)-Fc形式，添加另外的N-连接的糖基化位点(N-X-S/T)是充分容许的（参见，例如，美国专利号7,842,663）。通过在位置24引入天冬酰胺（A24N构建体；相对于SEQ ID NO:1），产生NXT序列，其可赋予更长的半衰期。在42-44(NQS)和65-67(NSS)存在其它的NX(T/S)序列，但后者由于位置64的R而可能无法被有效地糖基化。可在图1中所限定的配体结合口袋外的位置普遍引入N-X-S/T序列。特别适合引入非内源性N-X-S/T序列的位点包括氨基酸20-29、20-24、22-25、109-134、120-134或129-134（相对于SEQ ID NO:1）。也可在ActRIIB序列与Fc域或其它融合组分之间的接头中引入N-X-S/T序列。此类位点可通过如下以最低影响而引入：在相对于已存在S或T的正确位置引入N，或在对应于已存在N的位置引入S或T。因此，将生成N-连接的糖基化位点的所需变换是：A24N、R64N、S67N（可能与N65A变换组合）、E105N、R112N、G120N、E123N、P129N、A132N、R112S和R112T（相对于SEQ ID NO:1）。由于糖基化所提供的保护，可将任何预测将被糖基化的S变为T而不生成免疫原性位点。同样，可将任何预测将被糖基化的T变为S。因此设想了变换S67T和S44T（相对于SEQ ID NO:1）。同样，在A24N变体中，可使用S26T变换。因此，本公开的基于ActRIIB的配体陷阱多肽可以是具有如上所述一种或多种额外的非内源性N-连接的糖基化共有序列的ActRIIB变体。
所述变体可以各种方式组合。另外，本文所述的诱变程序的结果表明，ActRIIB中存在这样的氨基酸位置，将其保留常常是有利的。相对于SEQ ID NO:1，这些包括位置64（碱性氨基酸）、位置80（酸性或疏水性氨基酸）、位置78（疏水性，并特别是色氨酸）、位置37（酸性，并特别是天冬氨酸或谷氨酸）、位置56（碱性氨基酸）、位置60（疏水性氨基酸，特别是苯丙氨酸或酪氨酸）。因此，在本文公开的每种陷阱中，本公开均提供了可能是保守的氨基酸的框架。可能期望保留的其它位置如下：位置52（酸性氨基酸）、位置55（碱性氨基酸）、位置81（酸性）、98（极性或带电的，特别是E、D、R或K），均相对于SEQ ID NO:1。
有活性的ActRIIA多肽的通式是这样的：其包含与SEQ ID NO:9的氨基酸30-110至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的多肽。因此，本公开的基于ActRIIA的配体陷阱可包含与SEQ ID NO:9的氨基酸30-110至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的多肽。在优选的实施方案中，本公开的基于ActRIIA的配体陷阱不包含SEQ IDNO:9的氨基酸30-110或不由其组成。任选地，本公开的基于ActRIIA的配体陷阱多肽包含与SEQ ID NO:9的氨基酸12-82至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的多肽，任选地起始于位置1-5（例如，1、2、3、4或5）或3-5（例如，3、4或5）并分别终止于位置110-116（例如，110、111、112、113、114、115或116）或110-115（例如，110、111、112、113、114或115），并且在配体结合口袋中包含不超过1、2、5、10或15个保守氨基酸变化，并且在配体结合口袋中的位置40、53、55、74、79和/或82（相对于SEQ ID NO:9）包含零个、一个或更多个非保守变换。
本公开的配体陷阱（例如，GDF11陷阱、激活素B陷阱或GDF11/激活素B陷阱）的功能活性片段可以通过筛选由对应的编码配体陷阱多肽的核酸片段重组产生的多肽而获得。另外，可以使用本领域已知的技术（如常规的Merrifield固相f-Moc或t-Boc化学）化学合成片段。可以生产（重组或通过化学合成）并测试所述片段以识别出那些可以用作GDF11和/或激活素B拮抗剂（抑制剂）但基本上不结合激活素A并且/或者抑制其活性的肽片段。
可出于提高治疗功效或稳定性（例如，保质期和对体内蛋白水解降解的耐受）的目的，通过修饰本公开的配体陷阱（例如，GDF11陷阱、激活素B陷阱或GDF11/激活素B陷阱）的结构来生成功能性变体。当此类经修饰的配体陷阱多肽被选中以保持GDF11和/或激活素B结合时，则其被视为天然存在的ActRII多肽的功能性等同物。经修饰的配体陷阱多肽还可以例如通过氨基酸置换、缺失或添加来产生。例如，有理由认为，单独的用异亮氨酸或缬氨酸替换亮氨酸、用谷氨酸替换天冬氨酸、用丝氨酸替换苏氨酸，或用结构相关的氨基酸进行氨基酸的相似替换（例如，保守突变）将不会对所得分子的生物活性有重大影响。保守替换是在其侧链上相关的氨基酸的家族内发生的那些。配体陷阱多肽的氨基酸序列中的变化是否会得到功能性同系物可以通过以下方式容易地确定：评估所述变体配体陷阱多肽以类似于野生型ActRII多肽的方式在细胞内产生应答的能力，或相比未修饰的ActRII多肽或野生型ActRII多肽，其结合一种或多种配体（如GDF11、激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、GDF8、BMP6、BMP9、BMP10、GDF3、BMP3、BMP3B、Nodal和GDF15）的能力。
在某些实施方案中，本公开设想了本公开的配体陷阱多肽（例如，GDF11陷阱、激活素B陷阱或GDF11/激活素B陷阱）的特定突变以改变多肽的糖基化。可选择此类突变以引入或消除一个或多个糖基化位点，如O-连接的或N-连接的糖基化位点。天冬酰胺连接的糖基化识别位点通常包含三肽序列：天冬酰胺-X-苏氨酸或天冬酰胺-X-丝氨酸（其中“X”是任何氨基酸），其由适当的细胞糖基化酶特异性识别。还可通过向配体陷阱多肽序列（针对O-连接的糖基化位点）中添加或置换一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来实现所述变换。在糖基化识别位点的第一或第三氨基酸位置之一或两者的各种氨基酸置换或缺失（和/或在第二位置的氨基酸缺失）导致经修饰的三肽序列处的非糖基化。增加配体陷阱多肽上糖类部分数量的另一种方法是通过糖苷与多肽的化学或酶促偶联。根据所用的偶联模式，所述糖可被附接至(a) 精氨酸和组氨酸；(b) 游离的羧基；(c) 游离的巯基（如半胱氨酸的那些）；(d) 游离的羟基（如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的那些）；(e) 芳族残基（如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的那些）；或(f) 谷氨酰胺的酰胺基。移除ActRII多肽上存在的一个或多个糖类部分可化学和/或酶促实现。化学去糖基化可能涉及例如将配体陷阱多肽暴露于化合物三氟甲磺酸或等同的化合物。这种处理导致除了连接糖（N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基半乳糖胺）以外的大多数或全部糖类的裂解，而保留了完整的氨基酸序列。配体陷阱多肽上糖类部分的酶促裂解可以通过使用各种内切和外切糖苷酶实现，如Thotakura 等人[Meth.Enzymol.(1987) 138:350]所述。配体陷阱多肽的序列可以根据所用表达系统的类型而适当调整，因为哺乳动物、酵母、昆虫和植物细胞都可能引入不同的糖基化模式，其可以受到所述肽的氨基酸序列的影响。通常，用于人的配体陷阱蛋白可在提供正确糖基化的哺乳动物细胞系（如HEK293或CHO细胞系）中表达，但预计其它哺乳动物表达细胞系也是可用的。
本公开还设想了生成突变体的方法，特别是多组配体陷阱多肽（例如，GDF11陷阱、激活素B陷阱或GDF11/激活素B陷阱）的组合突变体以及截短突变体；组合突变体的集合对于识别配体陷阱序列尤其有用。筛选此类组合文库的目的可在于生成，例如，结合激活素B、GDF11以及任选地其它配体但基本上不结合激活素A的配体陷阱多肽。以下提供了各种筛选测定法，而此类测定法可用于评价变体。例如，可针对以下各项筛选配体陷阱：结合ActRII配体（例如，GDF11和/或激活素B）的能力、阻止ActRII配体结合ActRII多肽的能力或干扰由ActRII配体引起的信号转导的能力。
配体陷阱（例如，GDF11陷阱、激活素B陷阱或GDF11/激活素B陷阱）或其变体的活性还可在基于细胞的或体内测定法中测试。例如，可评估配体陷阱对涉及造血的基因的表达的影响。根据需要，这可在存在一种或多种重组ActRII配体蛋白（例如，GDF11和/或激活素B）的情况下进行，并可转染细胞以产生配体陷阱多肽和/或其变体，以及任选地，ActRII配体。同样，可向小鼠或其它动物施用配体陷阱，并可使用本领域认可的方法评估一项或多项血液测量结果（如RBC计数、血红蛋白或网织红细胞计数）。
可以生成组合来源的配体陷阱（例如，GDF11陷阱、激活素B陷阱或GDF11/激活素B陷阱），其相对于参考配体陷阱具有选择性或通常增加的效力。此类变体，当由重组DNA构建体表达时，可以用在基因疗法方案中。同样，诱变可以产生变体，其具有明显不同于对应的未修饰的配体陷阱的细胞内半衰期。例如，可以使得所述改变的蛋白对于蛋白水解降解或导致未修饰的配体陷阱被破坏或失活的其它细胞过程更稳定或更不稳定。此类变体及其编码基因可以通过调节配体陷阱的半衰期而用于配体陷阱多肽水平。例如，短半衰期可以产生更多的瞬时生物效应，并且当作为可诱导表达系统的一部分时，可以允许更严密地控制细胞内的重组配体陷阱多肽水平。在Fc融合蛋白中，可以在接头（如果有的话）和/或Fc部分中制造突变以改变所述蛋白的半衰期。
组合文库可以通过编码多肽（其中每者包含可能的ActRII多肽序列的至少一部分）文库的基因的简并文库产生。例如，可以将合成的寡核苷酸的混合物酶促连接到基因序列中，使得可能的ActRII多肽核苷酸序列的简并组可作为个体多肽表达，或作为另外一种选择，可作为一组更大的融合蛋白（例如，对于噬菌体展示而言）表达。
有许多方法可以从简并的寡核苷酸序列生成可能的同系物的文库。简并的基因序列的化学合成可以在自动DNA合成仪中进行，而随后可以将合成的基因连接到合适的载体中用于表达。简并寡核苷酸的合成是本领域熟知的[参见，例如，Narang, SA (1983)Tetrahedron 39:3; Itakura 等人，(1981) Recombinant DNA, Proc.3rd ClevelandSympos.Macromolecules, 编撰 AG Walton, Amsterdam: Elsevier 第273-289页;Itakura 等人，(1984) Annu.Rev. Biochem.53:323; Itakura 等人，(1984) Science198:1056; Ike 等人，(1983) Nucleic Acid Res.11:477]。已经在其它蛋白质的定向进化中采用了此类技术[参见，例如，Scott 等人，(1990) Science 249:386-390; Roberts 等人，(1992) PNAS USA 89:2429-2433; Devlin 等人，(1990) Science 249: 404-406;Cwirla 等人，(1990) PNAS USA 87: 6378-6382; 以及美国专利号5,223,409; 5,198,346; 和5,096,815]。
作为另外一种选择，可以利用其它形式的诱变来生成组合文库。例如，可以通过使用例如丙氨酸扫描诱变筛选[参见，例如，Ruf 等人，(1994) Biochemistry 33:1565-1572;Wang 等人，(1994) J. Biol.Chem.269:3095-3099; Balint 等人，(1993) Gene 137:109-118; Grodberg 等人，(1993) Eur.J. Biochem.218:597-601; Nagashima 等人，(1993)J. Biol.Chem.268:2888-2892; Lowman 等人，(1991) Biochemistry 30:10832-10838;以及 Cunningham 等人，(1989) Science 244:1081-1085]、通过接头扫描诱变[参见，流入，Gustin 等人，(1993) Virology 193:653-660; 以及 Brown 等人，(1992) Mol.CellBiol.12:2644-2652; McKnight 等人，(1982) Science 232:316)]、通过饱和诱变[参见，例如，Meyers 等人，(1986) Science 232:613]、通过PCR诱变[参见，例如，Leung 等人，(1989) Method Cell Mol Biol 1:11-19]或通过随机诱变（包括化学诱变）[参见，例如，Miller 等人，(1992) A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, ColdSpring Harbor, NY; 以及 Greener 等人，(1994) Strategies in Mol Biol 7:32-34]生成并从文库中分离本公开的配体陷阱。接头扫描诱变（尤其是在组合设定中）是有吸引力的方法，用于识别ActRII多肽的截短（有生物活性的）形式。
在本领域中已知许多技术可用于筛选由点突变和截短产生的组合文库的基因产物，并且就此而言，用于针对具有某种特性的基因产物而筛选cDNA文库。此类技术将通常可适用于快速筛选由本公开的配体陷阱的组合诱变生成的基因文库。最广泛使用的筛选大基因文库的技术通常包括：将基因文库克隆到可复制的表达载体中，用所得的载体文库转化合适的细胞，以及在一定条件下（其中检测到所需活性有利于相对容易分离编码检测到其产物的基因的载体）表达组合基因。优选的测定法包括：GDF11、激活素B和/或激活素结合测定法以及GDF11介导的、激活素B介导的和/或激活素介导的细胞信号转导测定法。
在某些实施方案中，本公开的配体陷阱（例如，GDF11陷阱、激活素B陷阱或GDF11/激活素B陷阱）还可包含除任何天然存在于ActRII多肽（例如，ActRIIA或ActRIIB多肽）中之外的翻译后修饰。此类修饰包括但不限于：乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂化和酰化。因此，所述经修饰的配体陷阱多肽可含有非氨基酸元件，如聚乙二醇、脂质、聚糖或单糖以及磷酸。此类非氨基酸元件对配体陷阱多肽的功能性的影响可如本文针对其它配体陷阱多肽变体所述进行测试。当通过裂解配体陷阱多肽的原生形式而在细胞中产生配体陷阱多肽时，翻译后加工对于蛋白的正确折叠和/或功能也可能是重要的。不同细胞（例如，CHO、HeLa、MDCK、293、WI38、NIH-3T3或HEK293）针对此类翻译后活动具有特定的细胞器和特征机制并可经选择以确保所述配体陷阱多肽的正确修饰和加工。
在某些方面，本公开的配体陷阱（例如，GDF11陷阱、激活素B陷阱或GDF11/激活素B陷阱）包括融合蛋白，其具有ActRII多肽（例如，ActRIIA或ActRIIB多肽）的至少一部分（域）和一个或多个异源部分（域）。此类融合域的众所周知的实例包括但不限于：聚组氨酸、Glu-Glu、谷胱甘肽S转移酶(GST)、硫氧还蛋白、A蛋白、G蛋白、免疫球蛋白重链恒定区(Fc)、麦芽糖结合蛋白(MBP)或人血清白蛋白。可选择融合域以赋予所需特性。例如，一些融合域对于通过亲和层析分离融合蛋白特别有用。出于亲和纯化的目的，使用了亲和层析的相关基质，如谷胱甘肽树脂、淀粉酶树脂以及镍或钴结合树脂。许多此类基质可以“试剂盒”形式获得，如Pharmacia GST 纯化系统和QIAexpressTM 系统(Qiagen)，可与(HIS6)融合伴侣一起使用。作为另一个实例，可选择融合域以有利于检测所述配体陷阱多肽。此类检测域的实例包括各种荧光蛋白（例如，GFP）以及“表位标签”，其通常为短的肽序列，并存在针对所述肽序列的特定抗体。熟知的表位标签（针对其的特定单克隆抗体容易获得）包括FLAG、流感病毒血凝素（HA）和c-myc标签。在一些情况下，所述融合域具有蛋白酶裂解位点，如针对Xa因子或凝血酶，其允许相关蛋白酶部分消化所述融合蛋白并从而从其释放重组蛋白。然后可以通过后续的层析分离从所述融合域分离所释放的蛋白。在某些优选的实施方案中，将配体陷阱与体内稳定所述配体陷阱多肽的域融合。所谓“稳定”是指延长血清半衰期的任何方式，无论这是否是由于通过肾脏的破坏减少、清除减少或其它药代动力学作用。已知与免疫球蛋白Fc部分的融合会给众多蛋白质赋予所需的药代动力学特性。同样，融合至人血清白蛋白可以赋予所需特性。可能选择的其它类型的融合域包括多聚（例如，二聚、四聚）域和功能域（其赋予额外的生物功能，如进一步刺激肌肉生长）。
在某些实施方案中，本公开提供了配体陷阱融合蛋白，其包含ActRII蛋白的变体胞外域（例如，配体结合域），所述变体胞外域融合至如下Fc域：
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在其它实施方案中，本公开提供了配体陷阱融合蛋白，其包含ActRIIB的变体胞外域（例如，配体结合域），所述变体胞外域融合至Fc域：
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具有A64置换的替代形式如下：
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任选地，所述Fc域在残基如Asp-265、赖氨酸322和Asn-434处具有一个或多个突变。在某些情况下，具有一个或多个这些突变（例如，Asp-265突变）的突变体Fc域相对于野生型Fc域具有降低的结合Fcγ受体的能力。在其它情况下，具有一个或多个这些突变（例如，Asn-434突变）的突变体Fc域相对于野生型Fc域具有提高的结合MHC I类相关的Fc受体（FcRN）的能力。
应当理解，所述融合蛋白的不同元件可以符合所需功能性的任何方式排列。例如，配体陷阱（例如，GDF11陷阱、激活素B陷阱或GDF11/激活素B陷阱）可被置于异源域的C-末端，或作为另外一种选择，异源域可被置于配体陷阱域的C-末端。在融合蛋白中，配体陷阱域和异源域不必相邻，而额外的域或氨基酸序列可被包含在这两个域中任一者的C-或N-末端或在其之间。
在某些实施方案中，本公开的配体陷阱（例如，GDF11陷阱、激活素B陷阱或GDF11/激活素B陷阱）含有能够稳定所述配体陷阱多肽的一种或多种修饰。例如，此类修饰延长所述配体陷阱多肽的体外半衰期、延长所述配体陷阱多肽的循环半衰期并且/或者减少所述配体陷阱多肽的蛋白水解降解。此类稳定化修饰包括但不限于：融合蛋白（包括，例如，包含配体陷阱和稳定域的融合蛋白）、糖基化位点修饰（包括，例如，向配体陷阱多肽添加糖基化位点）和糖类部分修饰（包括，例如，从配体陷阱多肽移除糖类部分）。如本文所用，术语“稳定域”不仅指代如在融合蛋白的情况中的融合域（例如，免疫球蛋白Fc域），还包括非蛋白质修饰（如糖类部分）或非蛋白质部分（如聚乙二醇）。
下面提供了包含TPA接头的ActRIIA-Fc融合蛋白的实例：
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TPA前导序列以单下划线标明；TGGG接头域以双下划线标明；而免疫球蛋白Fc域以粗体标明。
此多肽由如下核酸序列编码：
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下面提供了从CHO细胞系纯化的成熟的ActRIIA-Fc融合蛋白的实例：
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TGGG接头域以双下划线标明；而免疫球蛋白Fc域以粗体标明。
下面提供了包含TPA接头的ActRIIB-Fc融合蛋白的实例：
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TPA前导序列以单下划线标明；TGGG接头域以双下划线标明；而免疫球蛋白Fc域以粗体标明。
此多肽由如下核酸序列编码：
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下面提供了从CHO细胞系纯化的成熟的ActRIIAB-Fc融合蛋白[本文中称为ActRIIB(20-134)-Fc]的实例：
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免疫球蛋白Fc域以单下划线标明。
具有L79D置换的替代形式[本文中称为ActRIIB(L79D 20-134)-Fc]如下：
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免疫球蛋白Fc域以单下划线标明。
包含双截短的ActRIIB域和L79D置换的替代形式[本文中称为ActRIIB(L79D 25-131)-Fc]如下：
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免疫球蛋白Fc域以单下划线标明。
在某些实施方案中，本公开的配体陷阱融合蛋白（例如，GDF11陷阱、激活素B陷阱或GDF11/激活素B陷阱）包含与SEQ ID NO: 18、20、21、23、48和49中任一者的氨基酸序列至少80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列。在优选的实施方案中，本公开的配体陷阱融合蛋白不包含SEQ ID NO: 18、20、21、23、48和49中任一者的氨基酸序列或不由其组成。在其它优选的实施方案中，基于ActRIIB的配体陷阱融合蛋白包含与SEQ ID NO:21或23的氨基酸序列至少80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列，并且在对应于SEQ ID NO: 1或2的位置79的位置不包含酸性氨基酸。
在某些实施方案中，本公开提供了分离和/或纯化形式的ActRII多肽，其与其它蛋白质分离或者说基本上不含其它蛋白质。
在某些实施方案中，本公开的配体陷阱多肽可以由多种本领域已知的技术生产。例如，配体陷阱多肽可以使用标准蛋白质化学技术合成，如在Bodansky, M. Principlesof Peptide Synthesis, Springer Verlag, Berlin (1993) 和 Grant G. A. (ed.),Synthetic Peptides: A User’s Guide, W. H. Freeman and Company, New York(1992)中描述的那些。另外，自动化肽合成仪是可商购的（参见，例如，Advanced ChemTechModel 396; Milligen/Biosearch 9600）。作为另外一种选择，所述配体陷阱多肽、片段或其变体可使用本领域熟知的各种表达系统（例如，大肠杆菌、中国仓鼠卵巢（CHO）细胞、COS细胞、杆状病毒）重组产生。在另外的实施方案中，所述经修饰或未修饰的配体陷阱多肽可通过使用例如蛋白酶（例如，胰蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶或成对碱性氨基酸转化酶（PACE））通过消化重组产生的全长配体陷阱多肽来产生。计算机分析（使用商购的软件，例如，MacVector, Omega, PCGene, Molecular Simulation, Inc.）可以被用于识别蛋白水解裂解位点。作为另外一种选择，此类配体陷阱多肽可使用本领域已知的标准技术如通过化学裂解（例如，溴化氰、羟胺）从重组产生的全长配体陷阱多肽产生。
在优选的实施方案中，将根据本文所述的方法使用的本公开的所有蛋白质和多肽（例如，GDF11/激活素B陷阱、GDF11陷阱和激活素B陷阱）都是分离的蛋白质和多肽。如本文所用，分离的蛋白质或多肽是那些已经从其天然环境的组分中被分离的。在一些实施方案中，蛋白质或多肽被纯化至大于95%、96%、97%、98%或99%的纯度，如通过例如电泳（例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳）或层析（例如，离子交换或反相HPLC）所测定。用于评估抗体纯度的方法是本领域熟知的[参见，例如，Flatman 等人, (2007) J.Chromatogr.B 848:79-87]。
本文公开的任何配体陷阱多肽（例如，GDF11陷阱、激活素B陷阱或GDF11/激活素B陷阱）可以与本公开的一种或多种额外的拮抗试剂组合以达到所需效果。本文公开的配体陷阱多肽（例如，GDF11陷阱多肽、激活素B陷阱多肽或GDF11/激活素B陷阱多肽）可以与本文公开的另一种配体陷阱多肽或针对本公开的任何靶标的抗体（例如，抗-GDF11抗体、抗-激活素A抗体、抗-激活素B抗体、抗-激活素C抗体、抗-激活素E抗体、抗-GDF8抗体、抗-BMP6抗体、抗-ActRIIA抗体、抗-ActRIIB抗体、抗-GDF15抗体、抗-Nodal抗体、抗-GDF3抗体、抗-BMP3抗体、抗-BMP3B抗体、抗-BMP9抗体或抗-BMP10抗体）或针对本公开的任何靶标的小分子拮抗剂（例如，激活素B小分子拮抗剂、激活素B小分子拮抗剂、GDF11小分子拮抗剂、激活素C小分子拮抗剂、激活素E小分子拮抗剂、GDF8小分子拮抗剂、BMP6小分子拮抗剂、GDF15小分子拮抗剂、Nodal小分子拮抗剂、GDF3小分子拮抗剂、BMP3小分子拮抗剂、BMP3B小分子拮抗剂、BMP9小分子拮抗剂或BMP10小分子拮抗剂）或本公开的多核苷酸拮抗剂（例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、GDF11、GDF8或BMP6的多核苷酸拮抗剂）或本文公开的非抗体结合多肽（例如，GDF11结合多肽、激活素B结合多肽、激活素B结合多肽、激活素E结合多肽、激活素C结合多肽、GDF8结合多肽、BMP6结合多肽、GDF15结合多肽、Nodal结合多肽、BMP3结合多肽、GDF3结合多肽、BMP3B结合多肽、BMP9结合多肽或BMP10结合多肽）组合。例如，GDF11陷阱多肽可以与本公开的激活素B拮抗剂(例如，激活素B陷阱多肽、激活素B抗体、激活素B的小分子拮抗剂、激活素B的多核苷酸拮抗剂或激活素B的非抗体多肽拮抗剂)组合以同时抑制GDF11和激活素B活性(例如，结合并且/或者活化ActRIIA和/或ActRIIB受体的能力)。在可供选择的实施方案中，激活素B陷阱多肽可以与本公开的GDF11拮抗剂(例如，GDF陷阱多肽、抗-GDF11抗体、GDF11的小分子拮抗剂、GDF11的多核苷酸拮抗剂或GDF11的非抗体多肽拮抗剂)组合以同时抑制GDF11和激活素B活性。
C. 编码陷阱多肽的核酸及重组方法
在某些实施方案中，本公开提供了分离和/或重组的核酸，其编码本文公开的ActRII多肽（例如，可溶性ActRIIA多肽和可溶性ActRIIB多肽），包括片段、功能性变体和融合蛋白。例如，SEQ ID NO:12编码天然存在的人ActRIIA前体多肽，而SEQ ID NO:13编码ActRIIA的经加工的胞外域。例如，SEQ ID NO:7编码天然存在的人ActRIIB前体多肽（上述的A64变体），而SEQ ID NO:8编码ActRIIB的经加工的胞外域（上述的A64变体）。所讨论的核酸可以是单链的或双链的。此类核酸可以是DNA或RNA分子。这些核酸可用于例如制备本公开的基于ActRII的配体陷阱多肽的方法中。
如本文所用，分离的核酸指代已经从其天然环境的组分中被分离出的核酸分子。分离的核酸包括细胞中含有的核酸分子，所述细胞通常含有所述核酸分子，但该核酸分子存在于染色体外或处在不同于其天然的染色体位置的染色体位置上。
在某些实施方案中，编码本公开的基于ActRIIA的配体陷阱多肽的核酸据信包括这样的核酸，其为SEQ ID NO: 12或13的变体。在某些方面，编码本公开的基于ActRIIB的配体陷阱多肽的核酸据信包括这样的核酸，其为SEQ ID NO: 7或8的变体。变体核苷酸序列包括差异在于一个或多个核苷酸置换、添加或缺失的序列，如等位变体。本公开的核酸编码结合至少GDF11和/或激活素A并且/或者拮抗其活性的基于ActRIIA的和基于ActRIIB的配体陷阱多肽。任选地，本公开的核酸编码基本上不结合并且/或者抑制激活素A的基于ActRIIA的和基于ActRIIB的配体陷阱多肽。在一些实施方案中，编码结合并且/或者抑制GDF11和/或激活素B的基于ActRIIA的和基于ActRIIB的配体陷阱多肽的本公开的核酸还结合并且/或者抑制激活素A、激活素C、激活素E、GDF8、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B和BMP6中的一种或多种。
在某些实施方案中，本公开的基于ActRIIA的和基于ActRIIB的配体陷阱由分离或重组的核酸序列编码，所述核酸序列与SEQ ID NO: 8、13、19和22至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%相同。在优选的实施方案中，本公开的基于ActRIIA的和基于ActRIIB的配体陷阱不由这样的核酸序列编码，所述核酸序列包含SEQ ID NO: 8、13、19和22中的任一者或由其组成。本领域普通技术人员将认识到，与SEQ ID NO: 8、13、19和22的互补序列至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%相同的核酸序列及其变体也在本公开的范围内，前提是所述序列不包含SEQ ID NO:8、13、19和22的互补序列或不由其组成。在另外的实施方案中，本公开的核酸序列可以是分离的、重组的和/或与异源核苷酸序列融合的或是在DNA文库中。
在其它实施方案中，本公开的核酸还包括这样的核苷酸序列，其在高度严格条件下杂交至命名为SEQ ID NO: 8、13、19和22的核苷酸序列、SEQ ID NO: 8、13、19和22的补体序列或其片段，前提是其不包含SEQ ID NO: 8、13、19和22的核苷酸或不由其组成。如上所述，本领域普通技术人员将容易理解，促进DNA杂交的适当严格条件可以变化。例如，可在如下条件下进行杂交：6.0 x 氯化钠/柠檬酸钠(SSC)、约45℃，然后用2.0 x SSC、50℃洗涤。例如，所述洗涤步骤中的盐浓度可以从低严格性的约2.0 x SSC、50℃到高严格性的约0.2x SSC、50℃中选择。另外，所述洗涤步骤中的温度可以从低严格条件的室温约22℃提高到高严格条件的约65℃。温度和盐可同时变化，或是当其中另一个变量被改变时，温度或盐浓度可保持恒定。在一个实施方案中，本公开提供了在低严格条件下杂交的核酸，所述低严格条件是：6 x SSC、室温，然后用2 x SSC洗涤、室温。
由于遗传密码的简并性而不同于如SEQ ID NO: 8、13、19和22中所示的核酸的分离核酸也在本公开的范围内。例如，许多氨基酸由不止一种三联体指定。规定相同氨基酸的密码子或同义密码子（例如，CAU和CAC是组氨酸的同义密码子）可导致“沉默”突变，其不影响该蛋白质的氨基酸序列。然而，预计DNA序列多态性（其确实导致所讨论的蛋白质的氨基酸序列的变化）将存在于哺乳动物细胞之间。本领域技术人员将认识到，编码特定蛋白质的核酸的一个或多个核苷酸（最多约3-5%的核苷酸）的这些变型形式可能由于天然的等位变化而存在于给定物种的个体之间。任何及所有此类核苷酸变型形式以及所得氨基酸多态性均在本公开的范围内。
在某些实施方案中，本公开的重组核酸可被可操作地连接至表达构建体内的一个或多个调控核苷酸序列。调控核苷酸序列将通常适合用于表达的宿主细胞。对于各种宿主细胞而言，许多类型的合适的表达载体和适用的调控序列是本领域已知的。通常，所述一个或多个调控核苷酸序列可包括但不限于：启动子序列、前导或信号序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或活化因子序列。本公开设想了如本领域已知的组成型或诱导型启动子。所述启动子可以是天然存在的启动子或组合了不止一种启动子的元件的杂交启动子。表达构建体可存在于细胞内的附加体（如质粒）上，或者所述表达构建体可被插入到染色体中。在一些实施方案中，所述表达载体含有选择标记基因以允许选择经转化的宿主细胞。选择标记基因是本领域熟知的并且将随所使用的宿主细胞而变化。
在本公开的某些方面，所讨论的核酸在包含编码ActRII多肽的核苷酸序列的表达载体中提供并且被可操作地连接到至少一个调控序列。调控序列是本领域认可的并经选择以指导所述ActRII多肽的表达。因此，术语调控序列包括启动子、增强子和其它表达控制元件。示例性调控序列在Goeddel;Gene Expression Technology: Methods in Enzymology,Academic Press, San Diego, CA (1990)中有述。例如，当控制DNA序列表达的各种表达控制序列中的任一者被可操作地连接时，其可被用在这些载体中以表达编码ActRII多肽的DNA序列。此类有用的表达控制序列包括，例如，SV40的早期和晚期启动子、tet启动子、腺病毒或巨细胞病毒的立即早期启动子、RSV启动子、lac系统、trp系统、TAC或TRC系统、T7启动子（其表达由T7 RNA聚合酶指导）、λ噬菌体的主要操纵子和启动子区、fd外壳蛋白的控制区、3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的启动子、酸性磷酸酶的启动子（例如，Pho5）、酵母α-交配因子的启动子、杆状病毒系统的多面体启动子以及已知控制原核或真核细胞或其病毒的基因表达的其它序列，及其各种组合。应当理解，所述表达载体的设计可取决于下列因素，如待转化的宿主细胞的选择和/或期望表达的蛋白质的类型。此外，载体的拷贝数、控制该拷贝数的能力以及由该载体编码的任何其它蛋白质（如抗生素标记）的表达，也应当被考虑到。
本公开的重组核酸可以通过将克隆的基因或其部分连接到适于在原核细胞、真核细胞（酵母、禽类、昆虫或哺乳动物）或二者中表达的载体中而产生。用于生产重组ActRII多肽的表达媒介物包括质粒和其它载体。例如，合适的载体包括以下类型的质粒：pBR322衍生的质粒、pEMBL衍生的质粒、pEX衍生的质粒、pBTac衍生的质粒和pUC衍生的质粒，用于在原核细胞（如大肠杆菌）中的表达。
一些哺乳动物表达载体既含有原核序列以有利于载体在细菌中的增殖，又含有一个或多个在真核细胞中表达的真核转录单元。衍生自pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2-dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko-neo和pHyg的载体是适于真核细胞转染的哺乳动物表达载体的实例。这些载体中的一些经过了来自细菌质粒（如pBR322）的序列的修饰，以有利于在原核和真核细胞中的复制和药物抗性选择。作为另外一种选择，病毒如牛乳头状瘤病毒(BPV-1)或Epstein-Barr病毒(pHEBo、pREP衍生的和p205)的衍生物可以用于真核细胞中蛋白质的瞬时表达。其它病毒（包括逆转录病毒）表达系统的实例可见于以下对基因疗法递送系统的描述中。用于制备质粒和转化宿主生物体的各种方法是本领域熟知的。关于其它适用于原核和真核细胞的表达系统以及一般重组程序[参见，例如，Molecular Cloning A Laboratory Manual, 第3版，Sambrook, Fritsch 和Maniatis 编撰 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)]。在某些情况下，可能期望通过使用杆状病毒表达系统来表达重组多肽。此类杆状病毒表达系统的实例包括pVL衍生的载体（如pVL1392、pVL1393和pVL941）、pAcUW衍生的载体（如pAcUW1）和pBlueBac衍生的载体（如含有ß-gal的pBlueBac III）。
在一些实施方案中，载体将被设计用于在CHO细胞中生产所讨论的ActRII多肽，如Pcmv-Script载体(Stratagene, La Jolla, Calif.)、pcDNA4载体(Invitrogen,Carlsbad, Calif.)和pCI-neo载体(Promega, Madison, Wisc.)。正如将是显而易见的，所讨论的基因构建体可以用于在培养繁殖的细胞中造成所讨论的ActRII多肽的表达，例如，以生产蛋白质，包括融合蛋白或变体蛋白，用于纯化。
本公开还涉及用重组基因（包括一种或多种所讨论的ActRII多肽的编码序列）转染的宿主细胞。所述宿主细胞可以是任何原核或真核细胞。例如，本公开的ActRII多肽可在细菌细胞如大肠杆菌细胞（例如，使用杆状病毒表达系统）、酵母或哺乳动物细胞中表达。其它合适的宿主细胞是本领域技术人员已知的。
因此，本公开还涉及生产所讨论的ActRII多肽的方法。例如，用编码ActRIIA或ActRIIB多肽的表达载体转染的宿主细胞可以在适当条件下培养以允许发生ActRII多肽的表达。所述ActRII多肽可被分泌并从细胞和含有所述ActRII多肽的培养液的混合物中分离。作为另外一种选择，所述ActRII多肽可被保持在细胞质中或在膜组分和收获、裂解的细胞以及分离的蛋白质中。细胞培养物包含宿主细胞、培养液和其它副产物。合适的细胞培养液是本领域熟知的。可以从细胞培养液、宿主细胞或二者中分离所讨论的ActRII多肽，使用本领域已知的用于纯化蛋白质的技术，包括离子交换层析、凝胶过滤层析、超滤、电泳、使用特异于所述ActRII多肽的特定表位的抗体的免疫亲和纯化以及使用结合融合至所述ActRII多肽的域的试剂的亲和纯化（例如，A蛋白柱可用于纯化ActRIIA-Fc或ActRIIB-Fc融合体）。在一些实施方案中，所述ActRII多肽是含有有利于其纯化的域的融合蛋白。在一些实施方案中，纯化是通过一系列柱层析步骤实现的，包括，例如，下列中的三种或更多种（以任何次序）：A蛋白层析、Q琼脂糖凝胶层析、苯基琼脂糖凝胶层析、尺寸排阻层析以及阳离子交换层析。所述纯化可以病毒过滤和缓冲液交换作为结束。可纯化ActRIIB-hFc或ActRIIA-hFc蛋白至>90%、>95%、>96%、>98%或>99%的纯度（如通过尺寸排阻层析测定）和>90%、>95%、>96%、>98%或>99%的纯度（如通过SDS PAGE测定）。目标纯度水平应当足以在哺乳动物系统中，特别是在非人灵长类、啮齿类（小鼠）和人中，实现所需结果。
在另一个实施方案中，编码纯化前导序列（如在所述重组ActRII多肽的所需部分的N-末端的聚(His)/肠激酶裂解位点序列）的融合基因可以允许使用Ni2+金属树脂通过亲和层析纯化所表达的融合蛋白。然后，可以通过用肠激酶处理随后移除所述纯化前导序列以提供纯化的ActRII多肽。（参见，例如，Hochuli 等人，(1987) J.Chromatography 411:177; 以及 Janknecht 等人，PNAS USA 88:8972）。
用于制备融合基因的技术是众所周知的。编码不同多肽序列的各种DNA片段的接合基本上是根据常规技术进行的：采用了用于连接的平头或交错末端、限制性酶切从而得到合适的末端、填入合适的粘性端、碱性磷酸酶处理以避免不期望的接合、以及酶促连接。在另一个实施方案中，所述融合基因可以通过常规技术（包括自动化DNA合成仪）合成。作为另外一种选择，可以使用锚定引物进行基因片段的PCR扩增，所述锚定引物在两个连续的基因片段之间产生互补突出端，其可以随后被退火而生成嵌合基因序列[参见，例如，CurrentProtocols in Molecular Biology, 编撰Ausubel 等人，John Wiley & Sons: 1992]。
D. 其它结合多肽
在另一方面，本公开的拮抗试剂或试剂组合是结合至少GDF11和/或激活素B并且/或者抑制其活性（例如，活化ActRIIA或ActRIIB Smad 2/3信号转导）的非抗体结合多肽。任选地，本公开的非抗体结合多肽或非抗体结合多肽组合不结合激活素A并且/或者抑制其活性（例如，激活素A介导的ActRIIA或ActRIIB Smad 2/3信号转导的活化）。任选地，本公开的非抗体结合多肽或非抗体结合多肽组合还结合GDF8并且/或者抑制其活性（例如，GDF8介导的ActRIIA或ActRIIB Smad 2/3信号转导的活化）。在一些实施方案中，结合GDF11和/或激活素B并且/或者抑制其活性的本公开的非抗体结合多肽或非抗体结合多肽组合还结合激活素E、激活素C、激活素A、GDF8、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10中的一种或多种并且/或者抑制其活性（例如，活化ActRIIA或ActRIIB Smad 2/3和/或Smad 1/5/8信号转导）。在某些实施方案中，结合BMP9和/或BMP10的非抗体结合多肽抑制BMP9与TGFβ超家族的II型受体（例如，ActRIIA和/或ActRIIB）间的相互作用并且/或者抑制BMP10与TGFβ超家族的II型受体（例如，ActRIIA和/或ActRIIB）间的相互作用。优选地，结合BMP9和/或BMP10的非抗体结合多肽不抑制或基本上不抑制BMP9与ALK1之间以及/或者BMP10与ALK1之间的相互作用。
本公开的结合多肽可使用已知的多肽合成方法化学合成或可使用重组技术制备并纯化。结合多肽通常长至少约5个氨基酸，或者长至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个氨基酸或更长，其中此类结合多肽能够优选地特异性结合如本文所述的靶标（例如，GDF11、激活素B、激活素E、激活素C、GDF8、激活素A、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10）。可使用熟知的技术识别出结合多肽而无需过度实验。就此而言，值得注意的是，用于针对能够特异性结合多肽靶标的结合多肽而筛选多肽文库的技术是本领域熟知的，包括，例如，美国专利号5,556,762; 5,750,373; 4,708,871; 4,833,092; 5,223,409; 5,403,484; 5,571,689; 和 5,663,143; PCT公布号WO84/03506 和 WO84/03564; Geysen 等人，(1984) Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 81:3998-4002; Geysen 等人，(1985) Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 82:178-182; Geysen等人，(1986) in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149; Geysen 等人，(1987) J.Immunol.Meth, 102:259-274; Schoofs 等人，(1988) J. Immunol., 140:611-616,Cwirla,S.E.等人，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:6378; Lowman,H.B.等人，(1991)Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. 等人，(1991) Nature, 352: 624; Marks, J.D. 等人，(1991), J. Mol.Biol., 222:581; Kang, A. S. 等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 88:8363, 以及 Smith, G. P. (1991) CurrentOpin.Biotechnol., 2:668。
就此而言，细菌噬菌体（噬菌体）展示是一项众所周知的技术，其允许人们筛选大的多肽文库以识别出能够特异性结合靶标多肽（例如，GDF11、激活素B、激活素E、激活素C、GDF8、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10）的那些文库成员。噬菌体展示是这样一项技术：通过该技术，变体多肽以其与细菌噬菌体颗粒表面上的外壳蛋白的融合蛋白的形式展示[参见，例如，Scott, J. K. 和 Smith, G. P. (1990) Science, 249:386]。噬菌体展示的实用性在于可以快速并高效地从选择性随机化的蛋白变体（或随机克隆的cDNA）的大文库中分选出以高亲和力结合靶分子的那些序列。肽[参见，例如，Cwirla,S. E. 等人，(1990) Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 87:6378]或蛋白质[Lowman, H. B. 等人，(1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. 等人，(1991) Nature, 352: 624;Marks, J. D. 等人，(1991), J. Mol.Biol., 222:581; Kang, A. S. 等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 88:8363]文库的噬菌体展示已经被用于从数百万的多肽或寡肽中筛选出具有特异性结合特性的那些[参见，例如，Smith, G. P. (1991) CurrentOpin.Biotechnol., 2:668]。分选随机突变体的噬菌体文库需要：用于构建并增殖大量变体的策略、使用靶受体的亲和纯化程序以及评价结合富集结果的装置（参见，例如，美国专利号5,223,409; 5,403,484; 5,571,689; 和 5,663,143）。
尽管大多数噬菌体展示方法使用了丝状噬菌体，但λ形噬菌体展示系统（参见，例如，WO 95/34683; 以及美国专利号5,627,024）、T4噬菌体展示系统[参见，例如，Ren 等人，(1998) Gene, 215: 439; Zhu 等人，(1998) Cancer Research, 58(15): 3209-3214;Jiang 等人，(1997) Infection & Immunity, 65(11): 4770-4777; Ren 等人，(1997)Gene, 195(2):303-311; Ren (1996) Protein Sci., 5: 1833; Efimov 等人，(1995)Virus Genes, 10: 173]和T7噬菌体展示系统[参见，例如，Smith 和 Scott (1993)Methods in Enzymology, 217: 228-257; 以及美国专利号5,766,905]也是已知的。
对增强展示系统从肽文库中筛选对选定靶分子的结合以及展示功能性蛋白质（有可能针对所需特性筛选这些蛋白质）的能力的另外的改进是本领域已知的。已经开发了用于噬菌体展示反应的组合反应装置（参见，例如，WO 98/14277）并且噬菌体展示文库已经被用于分析和控制双分子相互作用（参见，例如，WO 98/20169; 和 WO 98/20159）以及受约束螺旋肽的特性（参见，例如，WO 98/20036）。国际专利公布号WO 97/35196描述了分离亲和配体的方法，其中使噬菌体展示文库与一种溶液（其中所述配体将结合靶分子）和第二溶液（其中所述亲和配体将不结合所述靶分子）接触，以选择性地分离结合配体。国际专利公布号WO 97/46251描述了这样的方法：用亲和纯化的抗体生物淘选随机噬菌体展示文库并随后分离结合噬菌体，接着是使用微板孔的微生物淘选过程以分离高亲和结合噬菌体。也已经报道了使用金黄色葡萄球菌蛋白质A作为亲和标签[参见，例如，Li 等人，(1998)Mol.Biotech., 9:187]。
WO 97/47314描述了使用底物消减文库以使用组合文库区分酶特异性，所述组合文库可以是噬菌体展示文库。用于使用噬菌体展示选择适用于去垢剂的酶的方法在国际专利公布号WO 97/09446中有述。选择特异性结合蛋白的另外的方法在例如美国专利号5,498,538; 5,432,018; 以及国际专利公布号WO 98/15833中有述。
生成肽文库并筛选这些文库的方法也在例如美国专利号5,723,286; 5,432,018;5,580,717; 5,427,908; 5,498,530; 5,770,434; 5,734,018; 5,698,426; 5,763,192;和 5,723,323中公开。
任何本文公开的非抗体结合多肽（例如，GDF11结合多肽、激活素B结合多肽、激活素B结合多肽、激活素E结合多肽、激活素C结合多肽、GDF8结合多肽、BMP6结合多肽、GDF15结合多肽、Nodal结合多肽、GDF3结合多肽、BMP3结合多肽、BMP3B结合多肽、BMP9结合多肽或BMP6结合多肽）均可以与本公开的一种或多种另外的拮抗试剂组合以达到所需效果。本文公开的非抗体结合多肽（例如，GDF11结合多肽、激活素A结合多肽、激活素B结合多肽、激活素E结合多肽、激活素C结合多肽、GDF8结合多肽、BMP6结合多肽、GDF15结合多肽、Nodal结合多肽、GDF3结合多肽、BMP3结合多肽、BMP3B结合多肽、BMP9结合多肽或BMP6结合多肽）可以与本公开的另一种非抗体结合多肽组合，或与针对本公开的任何靶标的抗体（例如，抗-GDF11抗体、抗-激活素B抗体、抗-激活素B抗体、抗-激活素C抗体、抗-激活素E抗体、抗-GDF11抗体、抗-GDF8抗体、抗-BMP6抗体、抗-ActRIIA抗体、抗-ActRIIB抗体、抗-GDF15抗体、抗-Nodal抗体、抗-GDF3抗体、抗-BMP3抗体、抗-BMP3B抗体、抗-BMP9抗体或抗-BMP10抗体）或本文公开的配体陷阱多肽（例如，GDF11陷阱多肽、激活素B陷阱多肽或GDF11/激活素B陷阱多肽）或针对本公开的任何靶标的小分子或针对本公开的任何靶标的小分子拮抗剂（例如，激活素B小分子拮抗剂、激活素B小分子拮抗剂、GDF11小分子拮抗剂、激活素C小分子拮抗剂、激活素E小分子拮抗剂、GDF8小分子拮抗剂、BMP6小分子拮抗剂、GDF15小分子拮抗剂、Nodal小分子拮抗剂、GDF3小分子拮抗剂、BMP3小分子拮抗剂、BMP3B小分子拮抗剂、BMP9小分子拮抗剂或BMP10小分子拮抗剂）或本公开的多核苷酸拮抗剂（例如，激活素B的多核苷酸拮抗剂、激活素B、激活素C、激活素E、GDF11、GDF8或BMP6的多核苷酸拮抗剂）组合。例如，GDF11结合多肽可以与本公开的激活素B拮抗剂(例如，激活素B陷阱多肽、激活素B抗体、激活素B的小分子拮抗剂、激活素B的多核苷酸拮抗剂或激活素B的非抗体多肽拮抗剂)组合以同时抑制GDF11和激活素B活性(例如，结合并且/或者活化ActRIIA和/或ActRIIB受体的能力)。在可供选择的实施方案中，激活素B结合多肽可以与本公开的GDF11拮抗剂(例如，GDF陷阱多肽、抗-GDF11抗体、GDF11的小分子拮抗剂、GDF11的多核苷酸拮抗剂或GDF11的非抗体多肽拮抗剂)组合以同时抑制GDF11和激活素B活性。
E. 小分子拮抗剂
在另一方面，本公开的拮抗试剂或试剂组合是抑制至少GDF11和/或激活素B表达（例如，转录、翻译和/或细胞分泌）的小分子拮抗剂。任选地，本公开的小分子拮抗剂或小分子拮抗剂组合不抑制激活素A表达。任选地，本公开的小分子拮抗剂或小分子拮抗剂组合还抑制GDF8表达。在一些实施方案中，抑制GDF11和/或激活素B表达的本公开的小分子拮抗剂或小分子拮抗剂组合还抑制激活素E、激活素C、激活素A、GDF8、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3和BMP3B中的一种或多种的表达。
在另一方面，本公开的拮抗试剂或试剂组合是结合至少GDF11和/或激活素B并且/或者抑制其活性（例如，活化ActRIIA和/或ActRIIB Smad 2/3信号转导）的小分子试剂。任选地，本公开的小分子拮抗剂或小分子拮抗剂组合不结合激活素A并且/或者抑制其活性（例如，激活素A介导的ActRIIA和/或ActRIIB Smad 2/3信号转导的活化）。任选地，本公开的小分子拮抗剂或小分子拮抗剂组合还结合GDF8并且抑制其活性（例如，GDF8介导的ActRIIA和/或ActRIIB Smad 2/3信号转导的活化）。在一些实施方案中，结合GDF11和/或激活素B并且抑制其活性的本公开的小分子拮抗剂或小分子拮抗剂组合还结合GDF8、激活素E、激活素C、激活素A、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10中的一种或多种并且抑制其活性（例如，活化ActRIIA和/或ActRIIB Smad 2/3和/或Smad 1/5/8信号转导）。在某些实施方案中，结合BMP9和/或BMP10的小分子抑制BMP9与TGFβ超家族的II型受体（例如，ActRIIA和/或ActRIIB）间的相互作用并且/或者抑制BMP10与TGFβ超家族的II型受体（例如，ActRIIA和/或ActRIIB）间的相互作用。优选地，结合BMP9和/或BMP10的小分子不抑制或基本上不抑制BMP9与ALK1之间以及/或者BMP10与ALK1之间的相互作用。
在另外的方面，本公开的拮抗试剂或试剂组合是间接拮抗至少GDF11和/或激活素B活性的小分子试剂。在一些实施方案中，本公开的间接小分子拮抗剂或间接小分子拮抗剂组合是这样的小分子，其结合ActRII受体（例如，ActRIIA和/或ActRIIB受体）并抑制至少GDF11和/或激活素B结合并且/或者活化ActRII受体（例如，活化ActRIIA和/或ActRIIBSmad2/3信号转导）。任选地，本公开的间接小分子拮抗剂或间接小分子拮抗剂组合基本上不抑制激活素A结合并且/或者活化ActRII受体（例如，激活素A介导的ActRIIA和/或ActRIIB Smad 2/3信号转导）。任选地，本公开的间接小分子拮抗剂或间接小分子拮抗剂组合结合ActRII受体并进一步抑制GDF8结合并且/或者活化该ActRII受体。在一些实施方案中，结合ActRII受体并抑制至少GDF11和/或激活素B结合并且/或者活化ActRII受体的本公开的间接小分子拮抗剂或间接小分子拮抗剂组合还抑制激活素C、激活素E、GDF8、BMP6、激活素A、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10中的一种或多种结合并且/或者活化该ActRII受体（例如，活化ActRIIA和/或ActRIIB Smad 2/3和/或Smad 1/5/8信号转导）。
可使用已知方法识别并化学合成本公开的结合有机小分子拮抗剂（参见，例如，PCT公布号WO 00/00823 和 WO 00/39585）。一般来讲，本公开的小分子拮抗剂的大小通常小于约2000道尔顿，或者小于约1500、750、500、250或200道尔顿，其中此类有机小分子能够优选地特异性结合如本文所述的多肽（激活素B、激活素C、激活素E、GDF11、GDF8和BMP6）。可使用熟知的技术识别出此类小分子拮抗剂而无需过度实验。就此而言，值得注意的是，用于针对能够结合多肽靶标的分子而筛选有机小分子文库的技术是本领域熟知的（参见，例如，国际专利公布号WO00/00823 和 WO00/39585）。
本公开的结合有机小分子可以是，例如，醛、酮、肟、腙、缩氨脲，卡巴肼、伯胺、仲胺、叔胺、N-取代的肼、肼、醇、醚、硫醇、硫醚、二硫醚、羧酸、酯、酰胺、脲、氨基甲酸酯、碳酸酯、缩酮、酮缩硫醇、缩醛、硫缩醛、芳基卤化物、芳基磺酸盐、烷基卤化物、烷基磺酸盐、芳香族化合物、杂环化合物、苯胺、烯烃、炔烃、二元醇、氨基醇、噁唑烷、噁唑啉、噻唑烷类、噻唑啉、烯胺、磺胺、环氧化物、氮杂环丙烷、异氰酸酯、磺酰氯、重氮化合物和酸性氯化物。
任何本文公开的小分子拮抗剂（例如，激活素B、激活素C、激活素E、GDF11、GDF8、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9或BMP10的小分子拮抗剂）均可以与本公开的一种或多种另外的拮抗试剂组合以达到所需效果。本文公开的小分子拮抗剂（例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、GDF11、GDF8、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9或BMP10的小分子拮抗剂）可以与本公开的另一种小分子拮抗剂或针对本公开的任何靶标的抗体（例如，抗-GDF11抗体、抗-激活素B抗体、抗-激活素B抗体、抗-激活素C抗体、抗-激活素E抗体、抗-GDF8抗体、抗-BMP6抗体、抗-ActRIIA抗体、抗-ActRIIB抗体、抗-ActRIIB抗体、抗-GDF15抗体、抗-Nodal抗体、抗-GDF3抗体、抗-BMP3抗体、抗-BMP3B抗体、抗-BMP9抗体或抗-BMP10抗体）或本文公开的非抗体结合多肽（例如，GDF11结合多肽、激活素B结合多肽、激活素B结合多肽、激活素E结合多肽、激活素C结合多肽、GDF8结合多肽、BMP6结合多肽、GDF15结合多肽、Nodal结合多肽、GDF3结合多肽、BMP3结合多肽、BMP3B结合多肽、BMP9结合多肽或BMP10结合多肽）或本文公开的配体陷阱多肽（例如，GDF11陷阱多肽、激活素B陷阱多肽或GDF/激活素B陷阱多肽）或本公开的多核苷酸拮抗剂（例如，激活素A的多核苷酸拮抗剂、激活素B、激活素C、激活素E、GDF11、GDF8、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3或BMP3B的多核苷酸拮抗剂）组合。例如，GDF11的小分子拮抗剂可以与本公开的激活素B拮抗剂(例如，激活素B陷阱多肽、激活素B抗体、激活素B的小分子拮抗剂、激活素B的多核苷酸拮抗剂或激活素B的非抗体多肽拮抗剂)组合以同时抑制GDF11和激活素B活性(例如，结合并且/或者活化ActRIIA和/或ActRIIB受体的能力)。在可供选择的实施方案中，激活素B抗体的小分子拮抗剂可以与本公开的GDF11拮抗剂(例如，GDF陷阱多肽、抗-GDF11抗体、GDF11的小分子拮抗剂、GDF11的多核苷酸拮抗剂或GDF11的非抗体多肽拮抗剂)组合以同时抑制GDF11和激活素B活性。
F. 拮抗剂多核苷酸
在另一方面，本公开的拮抗试剂或试剂组合是抑制至少GDF11和/或激活素B的多核苷酸拮抗剂。在一些实施方案中，本公开的拮抗剂多核苷酸抑制至少GDF11和/或激活素B的表达（例如，转录、翻译和/或细胞分泌）。任选地，本公开的多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂组合不抑制激活素A（例如，不抑制激活素A的表达和/或活性）。任选地，本公开的多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂组合还抑制GDF8（例如，抑制GDF8的表达和/或活性）。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂组合（其抑制GDF11和/或激活素B（例如，GDF11和/或激活素B的表达和/或活性））还抑制（例如，抑制表达和／或活性）激活素E、激活素C、激活素A、GDF8、BMP6、Nodal、GDF3、BMP3和GDF3B中的一种或多种。
本公开的多核苷酸拮抗剂可以是反义核酸、RNAi分子[例如，小干扰RNA (siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)]、适体和/或核酶。人GDF11、激活素B、激活素C、激活素E、GDF8、激活素A、BMP6、Nodal、GDF3、BMP3和GDF3B的核酸和氨基酸序列是本领域已知的。另外，生成多核苷酸拮抗剂的许多不同方法是本领域熟知的。因此，根据本公开所用的多核苷酸拮抗剂可以由本领域技术人员基于本领域的知识和本文提供的教导常规地制备。
反义技术可以被用于通过反义DNA或RNA或通过三螺旋的形成来控制基因表达。反义技术在例如，Okano (1991) J. Neurochem.56:560; Oligodeoxynucleotides asAntisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, Fla.(1988)中有讨论。三螺旋的形成在例如，Cooney 等人，(1988) Science 241:456; 以及 Dervan 等人，(1991) Science 251:1300中有讨论。这些方法是基于多核苷酸与互补DNA或RNA的结合。在一些实施方案中，所述反义核酸包含单链RNA或DNA序列，其与本文公开的基因（例如，GDF11、激活素B、激活素C、激活素E、GDF8、激活素A、BMP6、Nodal、GDF3、BMP3和GDF3B）的RNA转录物的至少一部分互补。然而，尽管优选，但并不要求绝对的互补性。
本文所说的“与RNA的至少一部分互补”的序列意指这样的序列，其具有足够的互补性从而能够与所述RNA杂交，形成稳定的双联体；就本文公开的基因（例如，GDF11、激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、GDF8、激活素A、BMP6、Nodal、GDF3、BMP3和GDF3B）的双链反义核酸而言，因而可测试双联DNA的单链，或测定三联体的形成。杂交能力将同时取决于互补程度和所述反义核酸的长度。一般来讲，杂交核酸越大，与其可能含有的RNA的碱基错配就越多，并仍然形成稳定的双联体（或三联体，视情况而定）。本领域技术人员可以通过使用标准程序确定可容许的错配程度以确定杂交复合体的熔点。
与信使（例如，最多上溯至并包括AUG启示密码子的5’-未翻译序列）的5’端互补的多核苷酸应当在抑制翻译上效率最高。然而，已经证明，与mRNA的3’-未翻译序列互补的序列在抑制mRNA翻译上也是有效的[参见，例如，Wagner, R., (1994) Nature 372:333-335]。因此，与本公开的基因（例如，GDF11、激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、GDF8、BMP6、Nodal、GDF3、BMP3和GDF3B）的5’-或3’-非翻译非编码区互补的寡核苷酸可以被用在反义方法中以抑制内源性mRNA（例如，GDF11、激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、GDF8、激活素A、BMP6、Nodal、GDF3、BMP3和GDF3B）的翻译。与mRNA的5’-未翻译区互补的多核苷酸应当包含AUG起始密码子的补体。与mRNA编码区互补的反义多核苷酸是效率更低的翻译抑制剂，但可以用于根据本公开的方法。无论被设计成杂交本公开的mRNA（例如，GDF11、激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、GDF8、激活素A、BMP6、Nodal、GDF3、BMP3和GDF3B）的5’-、3’-或是编码区，反义核酸都应当长至少六个核苷酸，并优选地为长6至约50个核苷酸的寡核苷酸。在特定方面，所述寡核苷酸长至少10个核苷酸、至少17个核苷酸、至少25个核苷酸或至少50个核苷酸。
在一个实施方案中，本公开的反义核酸（例如，GDF11、激活素B、激活素C、激活素E、GDF8、激活素A、BMP6、Nodal、GDF3、BMP3和GDF3B的反义核酸）通过从外源性序列转录而细胞内产生。例如，转录载体或其部分，产生本公开的基因的反义核酸（RNA）。此类载体将含有编码所需反义核酸的序列。此类载体可以保持在附加体上或被整合到染色体中，只要其可以被转录以产生所需的反义RNA。此类载体可以通过本领域的标准重组DNA技术方法构建。载体可以是质粒、病毒或本领域已知的用于在脊椎动物细胞中复制和表达的其它载体。编码所需的本公开的基因或其片段的序列可以通过本领域已知的在脊椎动物（优选人）细胞中起作用的任何启动子来表达。此类启动子可以是诱导型或组成型。此类启动子包括但不限于：SV40早期启动子区[参见，例如，Benoist 和 Chambon (1981) Nature 290:304-310]、包含在劳氏肉瘤病毒的3’长末端重复序列中的启动子[参见，例如，Yamamoto 等人，(1980)Cell 22:787-797]、疱疹胸苷启动子[参见，例如，Wagner 等人，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:1441-1445]和金属硫蛋白基因的调控序列[参见，例如，Brinster, 等人，(1982) Nature 296:39-42]。
在一些实施方案中，所述多核苷酸拮抗剂是干扰RNA（RNAi）分子，其靶向以下中的一种或多种的表达：GDF11、激活素B、激活素C、激活素E、GDF8、激活素A、BMP6、Nodal、GDF3、BMP3和GDF3B。RNAi指代干扰所靶向mRNA的表达的RNA的表达。具体地讲，RNAi经由与特定mRNA通过siRNA(小干扰RNA)相互作用而沉默所靶向基因。然后，该ds RNA复合体被细胞靶向降解。siRNA分子是长度为10至50个核苷酸的双链RNA双联体，其干扰充分互补的靶基因（例如，与该基因至少80%相同）的表达。在一些实施方案中，所述siRNA分子包含与所述靶基因的核苷酸序列至少85、90、95、96、97、98、99或100%相同的核苷酸序列。
另外的RNAi分子包括短发夹RNA(shRNA)；还有短干扰发夹和微RNA(miRNA)。所述shRNA分子含有来自靶基因的由环连接的有义和反义序列。所述shRNA被从细胞核转运到细胞质中，并且其与所述mRNA一同降解。可以使用Pol III或U6启动子表达用于RNAi的RNA。Paddison 等人，[Genes & Dev.(2002) 16:948-958, 2002]已经使用折叠成发夹的小RNA分子作为影响RNAi的手段。因此，在本文所述的方法中使用此类短发夹RNA(shRNA)分子也是有利的。功能性shRNA的茎和环的长度是变化的；茎长可以是约25至约30 nt，而环的大小可以是在4至约25 nt之间而不影响沉默活性。尽管不希望受任何具体理论的束缚，据信，这些shRNA类似于DICER核糖核酸酶的双链RNA（dsRNA）产物，并且在任何情况下，都具有相同的抑制特定基因表达的能力。所述shRNA可以从慢病毒载体表达。miRNA是长度为约10至70个核苷酸的单链RNA，其最初被转录成具有“茎-环”特征结构的前miRNA，随后通过RISC进一步加工后被加工为成熟miRNA。
介导RNAi的分子（包括但不限于siRNA）可以通过化学合成（Hohjoh, FEBS Lett521:195-199, 2002）、dsRNA水解（Yang 等人，Proc Natl Acad Sci USA 99:9942-9947,2002）、通过用T7 RNA聚合酶体外转录（Donzeet 等人，Nucleic Acids Res 30:e46, 2002;Yu 等人，Proc Natl Acad Sci USA 99:6047-6052, 2002）以及通过使用核酸酶如大肠杆菌核糖核酸酶III水解双链RNA（Yang 等人，Proc Natl Acad Sci USA 99:9942-9947,2002）而体外生产。
根据另一方面，本公开提供了下列多核苷酸拮抗剂，包括但不限于：陷阱DNA（decoy DNA）、双链DNA、单链DNA、复合DNA、包封DNA、病毒DNA、质粒DNA、裸RNA、包封RNA、病毒RNA、双链RNA、能够产生RNA干扰的分子或其组合。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸拮抗剂是适体。适体是核酸分子（包括双链DNA和单链RNA分子），其结合并形成特异性结合靶分子（如GDF11、激活素B、激活素C、激活素E、GDF8、激活素A、BMP6、Nodal、GDF3、BMP3或GDF3B多肽）的三级结构。适体的生成和治疗用途是本领域充分确定的（参见，例如，美国专利号5,475,096）。关于适体的额外信息可见于美国专利申请公布号20060148748。使用本领域已知的方法选择核酸适体，例如经由通过指数富集的配体系统进化（SELEX）方法。SELEX是用于以高特异性结合靶分子的核酸分子体外进化的方法，如美国专利号5,475,096; 5,580,737; 5,567,588; 5,707,796; 5,763,177;6,011,577; 和 6,699,843中所述。另一种识别适体的筛选方法在美国专利No. 5,270,163中有述。SELEX方法是基于核酸与几乎任何化学合成物（无论单体的还是聚合的，包括其它核酸分子和多肽）形成各种二维和三维结构的能力以及在充当配体的核苷酸单体内可用的化学多功能性（形成特异性结合对）。具有任何大小或组成的分子均可以充当靶标。SELEX方法涉及从候选寡核苷酸的混合物中选择以及结合、分割和扩增的分步迭代，使用相同的一般选择方案，以达到所需的结合亲和力和选择性。从核酸混合物（其可以包含随机化序列的节段）开始，SELEX方法包括以下步骤：使所述混合物与所述靶标在有利于结合的条件下接触；将未结合的核酸从已经特异性结合至靶分子的那些核酸分割；使所述核酸-靶标复合体解离；扩增从所述核酸-靶标复合体解离的核酸以得到配体富集的核酸混合物。将结合、分割、解离和扩增的步骤按需要重复多个循环以得到以高亲和力和特异性结合靶分子的核酸配体。
通常，将此类结合分子单独施用给动物[参见，例如，O’Connor (1991) J.Neurochem.56:560]，但此类结合分子也可以从由宿主细胞摄取并体内表达的多核苷酸体内表达[参见，例如，Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of GeneExpression, CRC Press, Boca Raton, Fla.(1988)]。
任何本文公开的多核苷酸拮抗剂（例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、GDF11、GDF8、BMP6、Nodal、GDF3、BMP3或GDF3B的多核苷酸拮抗剂）均可以与本公开的一种或多种另外的拮抗试剂组合以达到所需效果。本文公开的多核苷酸拮抗剂（例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、GDF11、GDF8、BMP6、Nodal、GDF3、BMP3或GDF3B的多核苷酸拮抗剂）可以与本公开的另一种多核苷酸拮抗剂或针对本公开的任何靶标的抗体（例如，抗-GDF11抗体、抗-激活素B抗体、抗-激活素B抗体、抗-GDF8抗体、抗-激活素C抗体、抗-激活素E抗体、抗-BMP6抗体、抗-BMP6抗体、抗-GDF15抗体、抗-Nodal抗体、抗-GDF3抗体、抗-BMP3抗体、抗-BMP3B抗体、抗-BMP9抗体或抗-BMP10抗体）或本文公开的非抗体结合多肽（例如，GDF11结合多肽、激活素B结合多肽、激活素B结合多肽、激活素E结合多肽、激活素C结合多肽、GDF8结合多肽、BMP6结合多肽、GDF15结合多肽、Nodal结合多肽、GDF3结合多肽、BMP3结合多肽、BMP3B结合多肽、BMP9结合多肽或BMP10结合多肽）或本文公开的配体陷阱多肽（例如，GDF11陷阱多肽、激活素B陷阱多肽或GDF11/激活素B陷阱多肽）或针对本公开的任何靶标的小分子拮抗剂（例如，激活素A小分子拮抗剂、激活素B小分子拮抗剂、GDF11小分子拮抗剂、激活素C小分子拮抗剂、激活素E小分子拮抗剂、GDF8小分子拮抗剂、BMP6小分子拮抗剂、BMP6小分子拮抗剂、GDF15小分子拮抗剂、Nodal小分子拮抗剂、GDF3小分子拮抗剂、BMP3小分子拮抗剂、BMP3B小分子拮抗剂、BMP9小分子拮抗剂或BMP10小分子拮抗剂）组合。例如，GDF11的反义拮抗剂可以与本公开的激活素B拮抗剂(例如，激活素B陷阱多肽、激活素B抗体、激活素B的小分子拮抗剂、激活素B的多核苷酸拮抗剂或激活素B的非抗体多肽拮抗剂)组合以同时抑制GDF11和激活素B活性(例如，结合并且/或者活化ActRIIA和/或ActRIIB受体的能力)。在可供选择的实施方案中，激活素B抗体的反义拮抗剂可以与本公开的GDF11拮抗剂(例如，GDF陷阱多肽、抗-GDF11抗体、GDF11的小分子拮抗剂、GDF11的多核苷酸拮抗剂或GDF11的非抗体多肽拮抗剂)组合以同时抑制GDF11和激活素B活性。
3.筛选测定法
在某些方面，本公开涉及使用所公开的ActRII多肽（例如，可溶性ActRIIA和ActRIIB多肽及其变体）以识别GDF11、激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、GDF8、激活素A、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10中的一种或多种的拮抗剂，特别是抑制这些配体中的一种或多种结合并且/或者活化ActRII受体（例如，ActRIIA和/或ActRIIB受体）但不抑制激活素A结合并且/或者活化ActRII受体的拮抗剂。可以测试通过本文公开的筛选测定法识别出的化合物以评估其调节体内或体外红细胞、血红蛋白和/或网织红细胞水平的能力。可以在例如动物模型中测试这些化合物。
有许多方法可筛选用于通过靶向ActRII信号转导而提高红细胞或血红蛋白水平的治疗剂。在某些实施方案中，可以进行高通量的化合物筛选以识别出干扰ActRII介导的对选定细胞系的影响的试剂。在某些实施方案中，进行所述测定法以筛选和识别这样的化合物，其特异性抑制或减少ActRII多肽与其结合伴侣如ActRII配体（例如，GDF11、激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、GDF8、激活素A、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10）的结合。作为另外一种选择，所述测定法可以用于识别这样的化合物，其基本上不影响ActRII多肽与其结合伴侣如ActRII配体（例如，激活素A）的结合。在另外的实施方案中，所述化合物可以通过其与ActRII多肽相互作用的能力来识别。
多种测定形式将满足要求，并且按照本公开，而那些在本文中未明确描述的也将为本领域普通技术人员所理解。如本文所述，本公开的受试化合物（试剂）可由任何组合化学方法制备。作为另外一种选择，所讨论的化合物可以是体内或体外合成的天然存在的生物分子。待测试其充当组织生长调节剂的能力的化合物（试剂）可以例如由细菌、酵母、植物或其它生物体（例如，天然产物）化学产生（例如，小分子，包括肽模拟物）或重组产生。本公开设想的测试化合物包括：非肽有机分子、肽、多肽、肽模拟物、糖类、激素和核酸分子。在特定的实施方案中，所述受试试剂是分子量小于约2,000道尔顿的小有机分子。
本公开的受试化合物可以单个分立实体的形式提供，或在具有更大复杂性的文库（如通过组合化学制备的）中提供。这些文库可以包含，例如，醇、烷基卤化物、胺、酰胺、酯、醛、醚以及其它类别的有机化合物。可以分离形式或化合物混合物的形式将受试化合物提供给测试系统，尤其是在初始筛选步骤中。任选地，所述化合物可衍生带有其它化合物并具有有利于分离该化合物的衍生基团。衍生基团的非限制性实例包括：生物素、荧光素、地高辛、绿色荧光蛋白、同位素、聚组氨酸、磁微珠、谷胱甘肽S转移酶（GST）、光激活的交联剂或其任何组合。
在许多测试化合物和天然提取物文库的药物筛选程序中，需要高通量测定法以使在给定时间段内所调查的化合物数量最大化。在不含细胞的系统（如可能衍生带有纯化或半纯化的蛋白质）中进行的测定法，常常被优选作为“主要”筛选，因为可生成其以允许快速进展并相对容易检测由受试化合物介导的分子靶标中的改变。此外，在体外系统中通常可以忽略受试化合物的细胞毒性或生物利用率的影响，该测定法相反主要关注药物对分子靶标的影响，其可能表现为ActRII多肽与其结合伴侣（例如，GDF11、激活素A、激活素B等）之间结合亲和力的改变。
仅仅出于说明，在本公开的示例性筛选测定法中，在适合所述测定法的意图时，使目标化合物与分离并纯化的ActRIIB多肽接触，所述ActRIIB多肽通常能够结合ActRIIB配体（例如，GDF11、激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、GDF8、BMP6、激活素A、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和/或BMP10）。然后向化合物和ActRIIB多肽的混合物中加入含有ActRIIB配体的组合物。对ActRIIB/ActRIIB配体复合体的检测和定量提供了用于测定化合物抑制（或增强）ActRIIB多肽与其结合蛋白之间的复合体形成的功效的手段。化合物的功效可以通过从使用各种浓度的受试化合物所获得的数据生成剂量反应曲线来评估。此外，还可以进行对照测定以提供用于比较的基线。例如，在对照测定中，将分离并纯化的ActRIIB配体加入含有ActRIIB多肽的组合物中，并在不存在受试化合物的情况下对ActRIIB/ActRIIB配体复合体的形成进行定量。应当理解，一般来讲，混合反应物的次序可以变化，并且可以同时混合。此外，可使用细胞提取物和裂解物代替纯化的蛋白质以提供合适的不含细胞的测定系统。
ActRII多肽与其结合蛋白之间的复合体形成可通过多种技术检测。例如，复合体形成的调节可以使用例如可检测标记蛋白如放射性标记的（例如，32P、35S、14C或3H）、荧光标记的（例如，FITC）或酶标记的ActRII多肽或其结合蛋白，通过免疫测定法或通过层析检测进行定量。
在某些实施方案中，本公开设想了使用荧光极化测定法和荧光共振能量转移（FRET）测定法直接或间接测量ActRII多肽及其结合蛋白之间的相互作用程度。另外，其它检测模式，如基于光学波导（参见，例如，PCT公布WO 96/26432和美国专利号5,677,196）、表面等离子体共振(SPR)、表面电荷传感器以及表面力传感器的那些，与本公开的许多实施方案是相容的。
此外，本公开设想了使用相互作用陷阱测定法（也称为“双杂交测定法”）用于识别破坏或增强ActRIIB多肽及其结合伴侣之间的相互作用的试剂[参见，例如，美国专利号5,283,317; Zervos 等人，(1993) Cell 72:223-232; Madura 等人，(1993) J Biol Chem268:12046-12054; Bartel 等人，(1993) Biotechniques 14:920-924; 以及 Iwabuchi等人，(1993) Oncogene 8:1693-1696)]。在某些实施方案中，本公开设想了使用反向双杂交系统以识别解离ActRII多肽及其结合蛋白之间的相互作用的化合物（例如，小分子或肽）[参见，例如，Vidal 和 Legrain, (1999) Nucleic Acids Res 27:919-29; Vidal 和Legrain (1999) Trends Biotechnol 17:374-81; 以及美国专利号5,525,490; 5,955,280; 和5,965,368]。
在某些实施方案中，所讨论的化合物通过其与ActRII多肽相互作用的能力来识别。化合物与ActRII多肽之间的相互作用可以是共价的或非共价的。例如，此类相互作用可以在蛋白质水平被识别，使用体外生物化学方法，包括光交联、放射性标记配体结合以及亲和层析[参见，例如，Jakoby WB 等人，(1974) Methods in Enzymology 46: 1]。在某些情况下，可在基于机制的测定法（如检测结合ActRII多肽的化合物的测定法）中筛选所述化合物。这可包括固相或液相结合事件。作为另外一种选择，可以将编码ActRII多肽的基因连同报道系统（例如，β-半乳醣苷酶、荧光素酶或绿色荧光蛋白）转染至细胞中并优选通过高通量筛选或用文库的个体成员针对文库进行筛选。可使用其它基于机制的结合测定法，例如，检测自由能变化的结合测定法。结合测定法可以用固定在孔、微珠或芯片上或被固定的抗体捕获的或被毛细管电泳分解的靶标进行。结合的化合物通常可使用比色法或荧光或表面等离子体共振检测。
4.示例性治疗用途
在某些方面，抑制至少GDF11和/或激活素B的本公开的拮抗试剂或试剂组合可以用于在有此需要的个体中提高红细胞水平、治疗或预防贫血并且/或者治疗或预防无效性红细胞生成。任选地，根据本文的方法所用的拮抗试剂或试剂组合不抑制激活素A。任选地，根据本文的方法所用的拮抗试剂或试剂组合还抑制GDF8。在某些方面，根据本文的方法所用的拮抗试剂或试剂组合，除了抑制GDF11和/或激活素B外，还抑制GDF8、激活素C、激活素E、激活素A、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10中的一种或多种。
术语“个体（subject）”、“个体（individual）”或“患者”在整个说明书中是可互换的，并且通常指代哺乳动物。哺乳动物包括但不限于：驯养动物（例如，奶牛、绵羊、猫、狗和马）、灵长类（例如，人和非人灵长类如猴子）、兔子和啮齿类动物（例如，小鼠和大鼠）。在某些方面，本公开的拮抗试剂可与用于提高红细胞水平的常规治疗方法（特别是用于治疗具有多因素起源的贫血的那些）组合使用。用于提高红细胞水平的常规治疗方法包括，例如，红细胞输注、施用一种或多种EPO受体活化剂、造血干细胞移植、免疫抑制性生物制品和药物（例如，皮质类固醇）。在某些实施方案中，本公开的拮抗试剂可以用于在有此需要的个体中治疗或预防贫血。在某些实施方案中，本公开的拮抗试剂可以用于在有此需要的个体中治疗或预防无效性红细胞生成和/或与无效性红细胞生成相关的疾病。在某些方面，本公开的拮抗试剂可与用于治疗或预防贫血或无效性红细胞生成疾病的常规治疗方法（特别是用于治疗具有多因素起源的贫血的那些）组合使用。
如本文所用，“预防”疾病或状况的治疗剂指代这样的化合物：在统计样本中，其在被治疗样本中相对于未治疗的对照样本降低该疾病或状况的发生率，或相对于未治疗的对照样本推迟该疾病或状况的一种或多种症状的发作或降低其严重程度。
术语“治疗”，如本文所用，包括在一旦状况已经出现时将其改善或消除。
在任一种情况下，预防或治疗均可在由医生或其它健康护理提供者所提供的诊断以及施用该治疗剂的期望结果中被辨别出。
通常，治疗或预防如本公开所述的疾病或状况是通过如下实现的：施用“有效量”的本公开的一种或多种GDF11和/或激活素B拮抗试剂（任选地，GDF8、激活素A、激活素C、激活素E、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10中的一种或多种的另外的拮抗剂）。试剂的有效量指代这样的量，其在剂量中和必要的时间周期内有效，以达到所需的治疗或预防结果。本公开的试剂的“治疗有效量”可根据多种因素（如个体的疾病状态、年龄、性别和重量以及所述试剂在个体中诱发所需反应的能力）而变化。“预防有效量”指代这样的量，其在剂量中和必要的时间周期内有效，以达到所需的预防结果。
在某些实施方案中，本公开的一种或多种GDF11和/或激活素B拮抗试剂（任选地，GDF8、激活素A、激活素C、激活素E、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10中的一种或多种的另外的拮抗剂）可任选地与EPO受体活化剂组合用于在健康个体和选定的患者群体中提高红细胞、血红蛋白或网织红细胞水平。合适的患者群体的实例包括：具有不期望的低红细胞或血红蛋白水平的那些（如贫血患者）以及具有发展出不期望的低红细胞或血红蛋白水平的风险的那些（如即将经历大手术或可能导致大量失血的其它程序的那些患者）。在一个实施方案中，用一种或多种GDF11和/或激活素B拮抗试剂（任选地，GDF8、激活素A、激活素C、激活素E、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10中的一种或多种的另外的拮抗剂）治疗具有足够红细胞水平的患者以提高红细胞水平并随后抽血并保存以用在以后的输注中。
本公开的一种或多种GDF11和/或激活素B拮抗试剂（任选地，GDF8、激活素A、激活素C、激活素E、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10中的一种或多种的另外的拮抗剂）可任选地与EPO受体活化剂组合用于在贫血患者中提高红细胞水平、血红蛋白水平和/或红细胞压积水平。当观测人体内血红蛋白和/或红细胞压积水平时，低于适当年龄和性别组别的正常水平可能指示贫血，但要考虑到个体差异。例如，10-12.5 g/dl并且通常约11.0 g/dl的血红蛋白水平被视为在健康成人的正常范围内，但就治疗而言，更低的靶标水平可能引起更少的心血管副作用[参见，例如，Jacobs 等人，(2000) Nephrol DialTransplant 15, 15-19]。作为另外一种选择，红细胞压积水平（细胞占血样的体积百分比）可以用作贫血的量度。健康个体的红细胞压积水平为约41-51%（成年男性）和35-45%（成年女性）。在某些实施方案中，可用旨在将患者的红细胞、血红蛋白和/或红细胞压积恢复至靶标水平的剂量方案治疗该患者。由于血红蛋白和红细胞压积水平因人而异，所以最好是可以针对每名个体对靶标血红蛋白和/或红细胞压积水平进行个体化。
贫血常见于具有组织损伤、感染和/或慢性疾病（特别是癌症）的患者中。在一些个体中，通过骨髓中的低促红细胞生成素水平和/或对促红细胞生成素反应不足来辨别贫血[参见，例如，Adamson (2008) Harrison’s Principles of Internal Medicine, 第17版;McGraw Hill, New York, 第628-634页]。贫血的可能成因包括，例如，失血、营养不良（例如，蛋白质的膳食摄入减少）、药物反应、与骨髓相关的各种问题以及许多疾病。更具体地讲，已经将贫血与多种疾病和状况相关联，包括，例如，骨髓移植；实体肿瘤（例如，乳腺癌、肺癌和结肠癌）；淋巴系统的肿瘤（例如，慢性淋巴细胞白血病、非霍奇金氏淋巴瘤和霍奇金氏淋巴瘤）；造血系统的肿瘤（例如，白血病、骨髓增生异常综合征和多发性骨髓瘤）；放射治疗；化疗（例如，含铂方案）；炎症性和自身免疫性疾病，包括，但不限于，类风湿性关节炎、其他炎症性关节炎，系统性红斑狼疮（SLE）、急性或慢性皮肤病（例如，银屑病）、炎症性肠疾病（例如，克罗恩氏病和溃疡性结肠炎）；急性或慢性肾脏疾病或衰竭，包括特发性或先天性状况；急性或慢性肝脏疾病；急性或慢性出血；由于患者的异体或自体抗体和/或宗教原因（例如，一些耶和华见证人）而不可能输注红细胞的情形；感染（例如，疟疾和骨髓炎）；血红蛋白病，包括，例如，镰状细胞病（贫血）、地中海贫血；药物使用或滥用（例如，酗酒）；任何原因引起的贫血患儿避免输血；以及由于循环过载问题而无法接受输血的老年患者或具有潜在心肺疾病和贫血的患者[参见，例如，Adamson (2008) Harrison’s Principles of InternalMedicine, 第17版; McGraw Hill, New York, 第628-634页]。在一些实施方案中，本公开的一种或多种GDF11和/或激活素B拮抗试剂（任选地，GDF8、激活素A、激活素C、激活素E和BMP6中的一种或多种的另外的拮抗剂）可用于治疗或预防与本文公开的一种或多种疾病或状况相关的贫血。
许多因素可促进癌症相关的贫血。一些与疾病过程自身以及炎性细胞因子（如白细胞介素-1、干扰素-γ和肿瘤坏死因子）的生成相关[Bron 等人，(2001) Semin Oncol 28(Suppl 8):1-6]。在其众多影响之中，炎症诱导关键的铁调控肽，铁调素，从而抑制铁从巨噬细胞逸出并总体上限制可用于红细胞生成的铁[参见，例如，Ganz (2007) J Am SocNephrol 18:394-400]。通过各种途径的失血也可促进癌症相关的贫血。由于癌症进展导致的贫血患病率根据癌症类型而不同，从前列腺癌中的5%最高到多发性骨髓瘤中的90%。癌症相关的贫血对于患者具有严重后果，包括疲劳和生活质量降低、治疗功效降低以及死亡率上升。在一些实施方案中，本公开的一种或多种GDF11和/或激活素B拮抗试剂（任选地，GDF8、激活素A、激活素C、激活素E、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10中的一种或多种的另外的拮抗剂）可任选地与EPO受体活化剂组合用于治疗癌症相关的贫血。
低增生性贫血可以由骨髓的原发性功能障碍或衰竭造成。低增生性贫血包括：慢性疾病的贫血、肾脏疾病的贫血、与低代谢状态相关的贫血以及与癌症相关的贫血。在这些类型中的每一者中，内源性促红细胞生成素水平均与所观察到的贫血程度不相称的低。其它低增生性贫血包括：早期缺铁性贫血和由骨髓损坏造成的贫血。在这些类型中，内源性促红细胞生成素水平均与所观察到的贫血程度相称地升高。突出的实例将是由癌症和/或化疗药物或癌症放射疗法造成的骨髓抑制。对临床试验的全面回顾发现，轻度贫血可以在100%的化疗后患者中发生，而更严重的贫血可以在最高达80%的此类患者中发生[参见，例如，Groopman 等人，(1999) J Natl Cancer Inst 91:1616-1634]。骨髓抑制药物包括，例如：1) 烷化剂，如氮芥（例如，马法兰）和亚硝基脲（例如，链脲菌素）；2) 抗代谢药物，如叶酸拮抗剂（例如，甲氨蝶呤）、嘌呤类似物（例如，硫鸟嘌呤）和嘧啶类似物（例如，吉西他滨）；3) 细胞毒性抗生素，如蒽环类药物（例如，多柔比星）；4) 激酶抑制剂（例如，吉非替尼）；5)有丝分裂抑制剂，如紫杉烷（例如，紫杉醇）和长春花生物碱（例如，长春瑞滨）；6) 单克隆抗体（例如，利妥昔单抗）；和 7) 拓扑异构酶抑制剂（例如，拓扑替康和依托泊苷）。另外，导致低代谢率的状况可以产生轻度至中度的低增生性贫血。内分泌缺乏状态是此类状况之一。例如，贫血可以在艾迪生氏病、甲状腺功能减退、甲状旁腺机能亢进、或阉割的或用雌激素治疗过的男性中发生。在一些实施方案中，本公开的一种或多种GDF11和/或激活素B拮抗试剂（任选地，GDF8、激活素A、激活素C、激活素E、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10中的一种或多种的另外的拮抗剂）可任选地与EPO受体活化剂组合用于治疗高增生性贫血。
慢性肾病有时伴有低增生性贫血，而贫血的严重程度随肾损伤水平而变化。此类贫血主要是由于促红细胞生成素生产不足和红细胞存活率降低。慢性肾病通常在数年或数十年的时期上逐渐进展至晚期（阶段-5）疾病，在该情况下，患者需要透析或肾移植而得以存活。贫血通常发生在此过程的早期并随疾病进展而恶化。肾脏疾病的贫血的临床后果有充分的记录并且包括发生如下状况：左心室肥大、认知功能损伤、生活质量降低以及免疫功能改变[参见，例如，Levin 等人，(1999) Am J Kidney Dis 27:347-354; Nissenson(1992) Am J Kidney Dis 20(Suppl 1):21-24; Revicki 等人，(1995) Am J Kidney Dis25:548-554; Gafter 等人，(1994) Kidney Int 45:224-231]。在一些实施方案中，一种或多种GDF11和/或激活素B拮抗试剂（任选地，GDF8、激活素A、激活素C、激活素E、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10中的一种或多种的另外的拮抗剂）可任选地与EPO受体活化剂组合用于治疗与急性或慢性肾脏疾病或衰竭相关的贫血。
急性大量失血（如创伤或产后出血）导致的贫血被称为急性失血性贫血。急性失血最初造成低血容量而非贫血，因为RBC与其它血液组分一起成比例耗减。然而，低血容量将迅速触发生理机制使流体从血管外转移至血管腔隙中，这导致血液稀释和贫血。如果是慢性的，则失血会逐渐耗尽体内的铁储备而最终导致缺铁。在一些实施方案中，一种或多种GDF11和/或激活素B拮抗试剂（任选地，GDF8、激活素A、激活素C、激活素E、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10中的一种或多种的另外的拮抗剂）可任选地与EPO受体活化剂组合用于治疗由急性失血造成的贫血。
缺铁性贫血是铁缺乏增加的分级进展（其包括负的铁平衡和缺铁性红细胞生成作为中间阶段）的最终阶段。缺铁可以由铁需求增加、铁摄入减少或铁丢失增加而造成，如在以下状况中举例说明的：怀孕、膳食不足、肠吸收障碍、急性或慢性炎症以及急性或慢性失血。在轻度至中度贫血的类型中，骨髓保持低增生性，而RBC形态大体正常；然而，即使轻度贫血也可以导致一些小细胞低色素性RBC，而向严重的缺铁性贫血的过渡则伴有骨髓的高增生性和越来越普遍的小细胞及低色素性RBC[参见，例如，Adamson (2008) Harrison’sPrinciples of Internal Medicine, 第17版; McGraw Hill, New York, 第628-634页]。缺铁性贫血的合适疗法取决于其成因和严重程度，其中口服铁制备物、肠胃外铁制剂和RBC输注是主要的常规选项。在一些实施方案中，本公开的一种或多种GDF11和/或激活素B拮抗试剂（任选地，GDF8、激活素A、激活素C、激活素E、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10中的一种或多种的另外的拮抗剂）可任选地与EPO受体活化剂组合用于治疗慢性缺铁。
骨髓增生异常综合征（MDS）是血液学状况的多样化集合，其特征在于无效的骨髓红细胞生产和转化成急性髓细胞性白血病的风险。在MDS患者中，血液干细胞不会熟化成健康的红细胞、白细胞或血小板。MDS疾病包括，例如，难治性贫血、伴有环形铁粒幼红细胞的难治性贫血、伴有过量幼红细胞的难治性贫血、伴有过量转化中的幼红细胞的难治性贫血、伴有多系发育异常难治性血细胞减少以及与孤立的5q染色体异常相关的骨髓增生异常综合征。由于这些疾病表现为造血细胞数量和质量的不可逆的缺陷，所以大多数MDS患者受到慢性贫血的折磨。因此，MDS患者最终需要输血和/或用生长因子（例如，促红细胞生成素或G-CSF）治疗以提高红细胞水平。然而，由于此类疗法的频率，许多MDS患者发展出副作用。例如，接受频繁的红细胞输注的患者可以由于额外铁的积聚而表现出组织和器官损坏。因此，本公开的一种或多种GDF11和/或激活素B拮抗试剂（任选地，GDF8、激活素A、激活素C、激活素E和BMP6中的一种或多种的另外的拮抗剂）可用于治疗MDS患者。在某些实施方案中，可使用本公开的一种或多种GDF11和/或激活素B拮抗试剂（任选地，GDF8、激活素A、激活素C、激活素E、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10中的一种或多种的另外的拮抗剂）任选地与EPO受体活化剂组合治疗MDS患者。在其它实施方案中，可使用本公开的一种或多种GDF11和/或激活素B拮抗试剂（任选地，GDF8、激活素A、激活素C、激活素E、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10中的一种或多种的另外的拮抗剂）与一种或多种另外的用于治疗MDS的治疗剂（包括，例如，沙利度胺、来那度胺、阿扎胞苷、地西他滨、促红细胞生成素、去铁胺、抗胸腺细胞球蛋白和非格司亭（G-CSF））的组合治疗MDS患者。
根据铁动力学研究从再生障碍性贫血、出血或外周性溶血中最初辨别出的[参见，例如，Ricketts 等人，(1978) Clin Nucl Med 3:159-164]无效性红细胞生成描述了贫血的多样化组别，其中成熟RBC的产量低于从给定的骨髓中存在的红细胞前体（幼红细胞）的数量将预计的[Tanno 等人，(2010) Adv Hematol 2010:358283]。在此类贫血中，由于无效性生产成熟RBC，尽管促红细胞生成素水平升高，组织依旧持续缺氧。最终发展成恶性循环，其中升高的促红细胞生成素水平驱使幼红细胞大幅扩张，可能导致由于髓外红细胞生成而造成的脾肿大（脾脏扩大）[参见，例如，Aizawa 等人，(2003) Am J Hematol 74:68-72]、幼红细胞诱导的骨病变[参见，例如，Di Matteo 等人，(2008) J Biol Regul HomeostAgents 22:211-216]以及组织铁过载（即使在不存在治疗性RBC输注的情况下）[参见，例如，Pippard 等人，(1979) Lancet 2:819-821]。因此，通过增强红细胞生辰有效性，本公开的GDF11和/或激活素B拮抗剂可打破上述循环，从而不仅缓解基础贫血，还缓解升高的促红细胞生成素水平的相关并发症、脾肿大、骨病变和组织铁过载。在一些实施方案中，本公开的一种或多种拮抗试剂（例如，GDF11、激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、GDF8、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和/或BMP10拮抗剂）可以用于治疗或预防无效性红细胞生成，包括贫血和升高的EPO水平以及并发症如脾肿大、幼红细胞诱导的骨病变、铁过载及其随之而来的病变。伴随着脾肿大，此类病变包括胸部或腹部疼痛以及网状内皮增生。髓外造血不仅可以发生在脾脏中也可能以髓外造血假瘤的形式发生在其它组织中[参见，例如，Musallam 等人，(2012) Cold Spring Harb Perspect Med 2:a013482]。伴随着幼红细胞诱导的骨病变，随之而来的病变包括低骨矿物质密度、骨质疏松和骨痛[参见，例如，Haidar 等人，(2011) Bone 48:425-432]。伴随着铁过载，随之而来的病变包括铁调素抑制和膳食铁吸收过多[参见，例如，Musallam 等人，(2012) Blood Rev 26(Suppl 1):S16-S19]、多发性内分泌病和肝脏纤维化/硬化[参见，例如，Galanello 等人，(2010) OrphanetJ Rare Dis 5:11]以及铁过载心肌病[Lekawanvijit等人，2009, Can J Cardiol 25:213-218]。
无效性红细胞生成的最常见成因是地中海贫血综合征、遗传性血红蛋白病，其中完整的α和β血红蛋白链的生产不平衡导致幼红细胞成熟期间的细胞凋亡增加[参见，例如，Schrier (2002) Curr Opin Hematol 9:123-126]。地中海贫血总体上是世界上最常见的遗传病之一，其具有变化的流行病学模式，据预测其助长了美国和世界上的增长的公共健康问题[Vichinsky (2005) Ann NY Acad Sci 1054:18-24]。地中海贫血综合征是根据其严重程度命名的。因此，α-地中海贫血包括：轻型α-地中海贫血（也称为α-地中海贫血特征；两个受影响的α-珠蛋白基因）、血红蛋白H病（三个受影响的α-珠蛋白基因）和重型α-地中海贫血（也称为胎儿水肿；四个受影响的α-珠蛋白基因）。β-地中海贫血包括：轻型β-地中海贫血（也称为β-地中海贫血特征；一个受影响的β-珠蛋白基因）、中间型β-地中海贫血（两个受影响的β-珠蛋白基因）、血红蛋白E地中海贫血（两个受影响的β-珠蛋白基因）和重型β-地中海贫血（也称为库利氏贫血；两个受影响的β-珠蛋白基因，导致完全没有β-珠蛋白）。β-地中海贫血影响多个器官，关系到可观的发病率和死亡率，并且目前需要终生护理。虽然由于组合使用了定期输血和铁螯合，使得近年来β-地中海贫血患者的预期寿命有所增加，但是输血和铁的过量胃肠吸收导致的铁过载可以引起严重的并发症，如心脏病、血栓形成、性腺功能减退、甲状腺功能减退、糖尿病、骨质疏松和骨质减少[参见，例如，Rund 等人，(2005) NEngl J Med 353:1135-1146]。在某些实施方案中，本公开的一种或多种GDF11和/或激活素B拮抗试剂（任选地，GDF8、激活素A、激活素C、激活素E、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10中的一种或多种的另外的拮抗剂）可任选地与EPO受体活化剂组合用于治疗或预防地中海贫血综合征。
在一些实施方案中，本公开的一种或多种GDF11和/或激活素B拮抗试剂（任选地，GDF8、激活素A、激活素C、激活素E、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10中的一种或多种的另外的拮抗剂）可任选地与EPO受体活化剂组合用于治疗除地中海贫血综合征以外的无效性红细胞生成疾病。此类疾病包括：铁粒幼红细胞性贫血（先天的或后天的）；纯红细胞再生障碍性贫血（I型和II型）；镰状细胞性贫血；遗传性球形红细胞增多症；丙酮酸激酶缺乏症；巨幼红细胞性贫血，可能由多种状况如叶酸缺乏引起（由于先天性疾病、摄入减少或需求增加）、钴胺素缺乏（由于先天性疾病、恶性贫血、吸收障碍、胰腺功能不全或摄入减少）、某些药物或无法解释的原因（先天性纯红细胞再生障碍性贫血、难治性巨幼红细胞性贫血或红白血病）；骨髓痨性贫血，包括，例如，骨髓纤维化（髓样化生）和脊髓痨；先天性红细胞生成性卟啉症；以及铅中毒。
在某些实施方案中，本公开的一种或多种GDF11和/或激活素B拮抗试剂（任选地，GDF8、激活素A、激活素C、激活素E、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10中的一种或多种的另外的拮抗剂）可与无效性红细胞生成的支持疗法组合使用。此类疗法包括输注红细胞或全血以治疗贫血。在慢性或遗传性贫血中，铁稳态的正常机制被反复的输血压垮，最终导致有毒的和可能致命的铁积聚在重要组织（如心脏、肝脏和内分泌腺）中。因此，针对长期受无效性红细胞生成折磨的患者的支持疗法还包括用一种或多种铁螯合分子治疗以促进铁排泄到尿液和/或粪便中，并从而预防或逆转组织铁过载[参见，例如，Hershko (2006) Haematologica 91:1307-1312; Cao 等人，(2011), Pediatr Rep 3(2):e17]。有效的铁螯合剂应当能够选择性结合并中和三价铁（非转铁蛋白结合的铁的氧化形式），所述三价铁很可能导致大部分的铁毒性（通过催化产生羟基自由基和氧化产物）[参见，例如，Esposito 等人，(2003) Blood 102:2670-2677]。这些试剂在结构上是多样化的，但都具有能够与单个铁原子以1:1（六齿配位剂）、2:1（三齿配位剂）或3:1（双齿配位剂）的化学计量形成中和八面体配合物的氧或氮供体原子[Kalinowski 等人，(2005) PharmacolRev 57:547-583]。一般来讲，有效的铁螯合剂还具有相对低的分子量（例如，小于700道尔顿），既可溶于水也可溶于脂质中以使得能够触及到受影响的组织。铁螯合分子的特定实例包括：去铁胺（一种源于细菌的六齿配位剂，需要每天肠胃外施用）以及口服的活性合成试剂去铁酮（二齿配位剂）和地拉罗司（三齿配位剂）。由同日施用两种铁螯合剂组成的组合疗法显示在对螯合物单一疗法无反应的患者中以及还在克服仅使用去铁胺的不良患者顺从性问题上是有希望的[Cao 等人，(2011) Pediatr Rep 3(2):e17; Galanello 等人，(2010) Ann NY Acad Sci 1202:79-86]。
如本文所用，“与…结合”或“联合施用”指代任何形式的施用，其使得第二疗法在体内仍然有效（例如，所述两种化合物在患者体内同时起效，其可包括所述两种化合物的协同增强效应）。有效性可能与所述试剂在血液、血清或血浆中的可测量的浓度不相关。例如，不同的治疗化合物可以在同一制剂中或单独制剂中、同时或顺序地以及按不同的计划表施用。因此，接受此类治疗的个体可以受益于不同疗法的组合效应。本公开的一种或多种GDF11和/或激活素B拮抗试剂（任选地，GDF8、激活素A、激活素C、激活素E、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10中的一种或多种的另外的拮抗剂）可与一种或多种其它另外的试剂或支持疗法同时、在其之前或之后施用。一般来讲，每种治疗剂将以一个剂量并且/或者按照针对该特定试剂所确定的时间计划表施用。在方案中采用的特定组合将考虑到本公开的拮抗剂与疗法和/或期望达到的治疗效果的相容性。
在某些实施方案中，本公开的一种或多种GDF11和/或激活素B拮抗试剂（任选地，GDF8、激活素A、激活素C、激活素E、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10中的一种或多种的另外的拮抗剂）可与铁调素或铁调素激动剂组合用于无效性红细胞生成。作为主要在肝脏中产生的循环多肽，铁调素由于其诱导膜铁转运蛋白（一种位于吸收性肠细胞、肝细胞和巨噬细胞上的铁运出蛋白）降解的能力而被视为铁代谢的主要调控因子。广义地讲，铁调素降低细胞外的铁的可利用性，所以铁调素激动剂可能在治疗无效性红细胞生成中是有益的[参见，例如，Nemeth (2010) Adv Hematol 2010:750643]。此观点得到了在β-地中海贫血的小鼠模型中增加的铁调素表达的有益效果的支持[Gardenghi 等人，(2010) J Clin Invest 120:4466-4477]。
本公开的一种或多种GDF11和/或激活素B拮抗试剂（任选地，GDF8、激活素A、激活素C、激活素E、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10中的一种或多种的另外的拮抗剂）将任选地与EPO受体活化剂组合而适合用于治疗RBC成熟障碍的贫血，其特征部分在于过小（小细胞）、过大（大细胞）、畸形或颜色异常（低色素）的RBC。
在某些实施方案中，本公开提供了在有此需要的个体中通过向该个体施用治疗有效量的本公开的一种或多种GDF11和/或激活素B拮抗试剂（任选地，GDF8、激活素A、激活素C、激活素E、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10中的一种或多种的另外的拮抗剂）和EPO受体活化剂而治疗或预防贫血的方法。在某些实施方案中，本公开的一种或多种GDF11和/或激活素B拮抗试剂（任选地，GDF8、激活素A、激活素C、激活素E、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10中的一种或多种的另外的拮抗剂）可与EPO受体活化剂组合用于减少这些活化剂在易受EPO的副作用影响的患者中所要求的剂量。这些方法可用于患者的治疗性和预防性治疗。
本公开的一种或多种GDF11和/或激活素B拮抗试剂（任选地，GDF8、激活素A、激活素C、激活素E、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10中的一种或多种的另外的拮抗剂）可与EPO受体活化剂（尤其是以更低剂量范围的EPO受体活化剂）组合用于实现红细胞增加。这可能有利于减小已知的与高剂量EPO受体活化剂相关的脱靶效应和风险。EPO的主要副作用包括，例如， 红细胞压积或血红蛋白水平的过度增加以及红细胞增多症。升高的红细胞压积水平可以导致高血压（更具体地讲，高血压加重）和血管血栓形成。已经报道的EPO的其它副作用中涉及高血压的一些是：头痛、类流感综合征、分流梗阻、心肌梗死和由于血栓形成、高血压脑病造成的脑惊厥以及红细胞再生障碍性贫血。（参见，例如，Singibarti (1994) J. Clin Investig 72(suppl 6), S36-S43; Horl 等人，(2000)Nephrol Dial Transplant 15(suppl 4), 51-56; Delanty 等人，(1997) Neurology 49,686-689; 以及 Bunn (2002) N Engl J Med 346(7), 522-523）。
由于本公开的拮抗剂通过不同于EPO的机制起作用，所以这些拮抗剂可用于在对EPO反应不良的患者中提高红细胞和血红蛋白水平。例如，本公开的拮抗剂可能有利于这样的患者：向该患者施用正常到增加剂量的EPO（>300 IU/kg/周）无法令血红蛋白水平上升至靶标水平。对EPO反应不足的患者可见于所有类型的贫血中，但在癌症患者和晚期肾病患者中已经特别频繁地观察到更高数量的非应答者。对EPO反应不足可以是组成性的（在第一次用EPO治疗时即观察到）或获得性的（在用EPO反复治疗后观察到）。
在某些实施方案中，本公开提供了用于通过测量患者体内一项或多项血液学参数来管理患者的方法，所述患者已经用（或是作为候选者即将用）本公开的一种或多种GDF11和/或激活素B拮抗试剂（任选地，GDF8、激活素A、激活素C、激活素E、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10中的一种或多种的另外的拮抗剂）治疗。所述血液学参数可用于评价适合患者（其为用本公开的拮抗剂治疗的候选者）的剂量、用于监测治疗期间的血液学参数、用于评价在用本公开的一种或多种拮抗剂治疗期间是否调整剂量并且/或者用于评价本公开的一种或多种拮抗剂的合适的保持剂量。如果所述血液学参数中的一项或多项在正常水平之外，则本公开的一种或多种GDF11和/或激活素B拮抗试剂（任选地，GDF8、激活素A、激活素C、激活素E、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10中的一种或多种的另外的拮抗剂）的给药可能减少、推迟或终止。
可根据本文提供的方法（使用本领域认可的方法）测量的血液学参数包括，例如，红细胞水平、血压、铁储备以及与红细胞水平升高相关的存在于体液中的其它试剂。此类参数可使用患者血样测定。红细胞水平、血红蛋白水平和/或红细胞压积水平的升高可能引起血压升高。
在一个实施方案中，如果作为用本公开的一种或多种GDF11和/或激活素B拮抗试剂（任选地，GDF8、激活素A、激活素C、激活素E、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10中的一种或多种的另外的拮抗剂）治疗的候选者的患者的一项或多项血液学参数在正常范围之外或在正常的高位，则开始施用本公开的一种或多种拮抗剂可能被推迟直到所述血液学参数已经自然地或通过治疗干预回到正常或可接受水平。例如，如果候选患者有高血压或高血压前期，则可能用降血压剂治疗所述患者以降低该患者的血压。可使用适合该个体患者状况的任何降血压剂，包括，例如，利尿剂、肾上腺素抑制剂（包括α阻断剂和β阻断剂）、血管扩张剂、钙通道阻断剂、血管紧张素转换酶（ACE）抑制剂或血管紧张素II受体阻断剂。作为另外一种选择，可使用饮食和锻炼方案治疗血压。类似地，如果候选患者具有低于正常的或在正常的低位的铁储备，则可用合适的饮食方案和/或铁补充剂治疗所述患者直到该患者的铁储备已经回到正常或可接受水平。对于具有高于正常的红细胞水平和/或血红蛋白水平的患者而言，则施用本公开的一种或多种拮抗剂可能被推迟直到所述水平已经回到正常或可接受水平。
在某些实施方案中，如果作为用本公开的一种或多种GDF11和/或激活素B拮抗试剂（任选地，GDF8、激活素A、激活素C、激活素E、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10中的一种或多种的另外的拮抗剂）治疗的候选者的患者的一项或多项血液学参数在正常范围之外或在正常的高位，则开始施用可能不会推迟。然而，本公开的一种或多种拮抗剂的剂量或给药频率可能被设定为这样的量，其将降低在施用本公开的一种或多种拮抗剂时产生血液参数的不可接受的升高的风险。作为另外一种选择，可开发针对所述患者的治疗方案，其将本公开的一种或多种GDF11和/或激活素B拮抗试剂（任选地，GDF8、激活素A、激活素C、激活素E、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10中的一种或多种的另外的拮抗剂）与应对不期望水平的血液学参数的治疗剂组合。例如，如果所述患者具有升高的血压，则可设计这样的治疗方案，其涉及施用本公开的一种或多种GDF11和/或激活素B拮抗试剂（任选地，GDF8、激活素A、激活素C、激活素E、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10中的一种或多种的另外的拮抗剂）和降血压剂。对于具有低于所需铁储备的患者而言，可开发这样的治疗方案，其包括一种或多种GDF11和/或激活素B拮抗试剂（任选地，GDF8、激活素A、激活素C、激活素E、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10中的一种或多种的另外的拮抗剂）和铁补充剂。
在一个实施方案中，可确立患者的一项或多项血液学参数的基线参数，所述患者作为候选者即将用本公开的一种或多种GDF11和/或激活素B拮抗试剂（任选地，GDF8、激活素A、激活素C、激活素E、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10中的一种或多种的另外的拮抗剂）以及基于所述基线值确立的适合所述患者的剂量方案进行治疗，作为另外一种选择，基于患者的病史确立的基线参数可用于了解适合患者的拮抗剂剂量方案。例如，如果健康患者的确立的基线血压读数高于定义的正常范围，则可能在用本公开的一种或多种拮抗剂治疗前不必将所述患者的血压降到被认为对于普通人群是正常的范围。在用本公开的一种或多种GDF11和/或激活素B拮抗试剂（任选地，GDF8、激活素A、激活素C、激活素E、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10中的一种或多种的另外的拮抗剂）治疗之前患者的一项或多项血液学参数的基线值还可用作相关比较值用于监测在用本公开的一种或多种拮抗剂治疗期间所述血液学参数的任何变化。
在某些实施方案中，测量了患者的一项或多项血液学参数，所述患者正在接受本公开的一种或多种GDF11和/或激活素B拮抗试剂（任选地，GDF8、激活素A、激活素C、激活素E、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10中的一种或多种的另外的拮抗剂）的治疗。所述血液学参数可用于在治疗期间监测所述患者并允许调整或终止施用本公开的一种或多种拮抗剂或额外施用另一种治疗剂。例如，如果施用本公开的一种或多种GDF11和/或激活素B拮抗试剂（任选地，GDF8、激活素A、激活素C、激活素E、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10中的一种或多种的另外的拮抗剂）导致血压、红细胞水平或血红蛋白水平升高或铁储备减少，则可减少本公开的一种或多种拮抗剂的剂量或施用频率以降低本公开的一种或多种拮抗剂对所述一项或多项血液学参数的影响。如果施用本公开的一种或多种GDF11和/或激活素B拮抗试剂（任选地，GDF8、激活素A、激活素C、激活素E、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10中的一种或多种的另外的拮抗剂）导致一项或多项血液学参数出现对患者不利的变化，则可暂时终止本公开的一种或多种拮抗剂的剂量直到所述血液学参数回到可接受水平，或永久终止。类似地，如果在减少本公开的一种或多种拮抗剂的剂量或施用频率之后，一项或多项血液学参数仍未回到可接受的范围内，则可终止给药。作为减少或终止施用本公开的一种或多种拮抗剂的替代形式或在此之外，可向所述患者施用应对不期望水平的血液学参数的另外的治疗剂，如例如，降血压剂或铁补充剂。例如，如果正在接受本公开的一种或多种GDF11和/或激活素B拮抗试剂（任选地，GDF8、激活素A、激活素C、激活素E、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10中的一种或多种的另外的拮抗剂）治疗的患者具有升高的血压，则可以相同水平继续施用本公开的一种或多种拮抗剂并向治疗方案中加入降血压剂、可减少施用（例如，量和/或频率）本公开的一种或多种拮抗剂并向治疗方案中加入降血压剂、或可终止施用本公开的一种或多种拮抗剂并可用降血压剂治疗所述患者。
5.药物组合物
在某些实施方案中，本公开的一种或多种GDF11和/或激活素B拮抗试剂（任选地，GDF8、激活素A、激活素C、激活素E、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10中的一种或多种的另外的拮抗剂）可以单独施用或作为药物制剂（治疗组合物或药物组合物）的组分施用。药物制剂指代具有这样形式的制备物，其允许其中所含活性成分的生物活性起效并且其不含对所述制剂将施用的个体具有不可接受的毒性的附加组分。所讨论的化合物可被配制成用于人或兽医用药中以任何便利的方式施用。例如，本公开的一种或多种GDF11和/或激活素B拮抗试剂（任选地，GDF8、激活素A、激活素C、激活素E、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10中的一种或多种的另外的拮抗剂）可与药学上可接受的载体配制在一起。药学上可接受的载体指代药物制剂中活性成分之外的成分，其通常对于个体是无毒的。药学上可接受的载体包括但不限于：缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。通常，用于本公开中的药物制剂当向个体施用时是无热原、生理学上可接受的形式。可任选地包含在如上所述的制剂中的不同于本公开的拮抗剂的可用于治疗的试剂可与本公开的方法中所讨论的化合物组合施用。
通常，化合物将是肠胃外施用[例如，通过静脉内(I.V.) 注射、动脉内注射、骨内注射、肌内注射、鞘内注射、皮下注射或皮内注射]。适用于肠胃外施用的药物组合物可包含本公开的一种或多种GDF11和/或激活素B拮抗试剂（任选地，GDF8、激活素A、激活素C、激活素E、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10中的一种或多种的另外的拮抗剂）与一种或多种药学上可接受的无菌等渗水溶液或非水溶液、分散液、悬浮液或乳液或无菌粉末（其可在使用前一刻重构成无菌注射液或分散液）的组合。注射液或分散液可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、悬浮剂、增稠剂或溶质（其使得所述制剂与预定接受者的血液等渗）。可用于本公开的药物制剂中的合适的水性或非水性载体的实例包括：水、乙醇、多元醇（例如，甘油、丙二醇、聚乙二醇等）、植物油（例如，橄榄油）、注射用有机酯（例如，油酸乙酯）及其合适的混合物。可以例如通过使用包衣材料（例如，卵磷脂）、通过在分散的情况下保持所需的粒径以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。
在某些实施方案中，本公开的治疗方法包括从植入物或装置全身或局部施用所述制剂。另外，所述组合物可以一定形式包封或注射用于递送至靶组织部位（例如，骨髓或肌肉）。在某些实施方案中，本公开的组合物可包含能够将本公开的一种或多种GDF11和/或激活素B拮抗试剂（任选地，GDF8、激活素A、激活素C、激活素E、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10中的一种或多种的另外的拮抗剂）递送至靶组织部位（例如，骨髓或肌肉）的基质，其为发育中的组织提供结构并最好能够被身体再吸收。例如，所述基质可提供本公开的一种或多种GDF11和/或激活素B拮抗试剂（任选地，GDF8、激活素A、激活素C、激活素E、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10中的一种或多种的另外的拮抗剂）的缓慢释放。此类基质可由目前用于其它植入的医疗应用的材料形成。
对基质材料的选择可基于以下中的一项或多项：生物相容性、可生物降解性、机械性能、外观和界面性能。所讨论的组合物的具体应用将限定合适的制剂。可能用于组合物的基质可以是可生物降解的并且化学限定的硫酸钙、磷酸三钙、羟基磷灰石、聚乳酸和聚酸酐。其它可能的材料是可生物降解的并且生物学上充分限定的，包括，例如，骨或真皮胶原。另外的基质由纯蛋白质或细胞外基质组分构成。其它可能的基质是非可生物降解的并且化学限定的，包括，例如，烧结的羟基磷灰石、生物玻璃、氧化铝或其它陶瓷。基质可由任何上述类型材料组合构成，包括，例如，聚乳酸和羟基磷灰石、或胶原和磷酸三钙。可改变生物陶瓷的组成（例如，铝酸钙磷酸盐）和加工工艺以改变下列的一项或多项：孔径、粒径、颗粒形状和可生物降解性。
在某些实施方案中，本公开的制剂（组合物）可以下列形式口服施用：例如，胶囊、扁囊剂、丸剂、片剂、含片（使用调味基底如蔗糖和阿拉伯树胶或黄蓍胶）、粉末、颗粒剂、水性或非水性液体中的溶液或悬浮液、水包油或油包水液态乳液或酏剂或糖浆或锭剂（使用惰性基底如明胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯树胶）和/或漱口水，其各自含有预定量的本公开的化合物和任选地一种或多种其它活性成分。本公开的化合物和任选地一种或多种其它活性成分还可作为大药丸、膏剂或糊剂施用。
在用于口服施用的固体剂型（例如，胶囊、片剂、丸剂、糖衣丸、粉末和颗粒剂）中，本公开的一种或多种化合物可与一种或多种药学上可接受的载体（包括，例如，柠檬酸钠、磷酸二钙）、填料或扩链剂（例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸）、粘结剂（例如，羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯树胶）、保湿剂（例如，甘油）、崩解剂（例如，琼脂-琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、褐藻酸、硅酸盐和碳酸钠）、溶液阻滞剂（例如，石蜡）、吸收促进剂（例如，季铵化合物）、润湿剂（例如，鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯）、吸收剂（例如，高岭土和膨润土）、润滑剂（例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固态聚乙二醇、月桂基硫酸钠）、着色剂及其混合物混合。就胶囊、片剂和丸剂而言，所述药物制剂（组合物）还可包含缓冲剂。相似类型的固体组合物也可用作软填充和硬填充明胶胶囊中的填料，使用一种或多种赋形剂，包括，例如，乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇。
本制剂（组合物）的口服液体剂型可包含药学上可接受的乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除活性成分以外，所述液体剂型还可含有本领域常用的惰性稀释剂，例如，水或其它溶剂、增溶剂和/或乳化剂[例如，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇或1,3-丁二醇、油（例如，棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油）、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇、脂肪酸酯、失水山梨醇脂肪酸酯及其混合物]。在惰性稀释剂之外，所述口服制剂还可以包含佐剂，包括，例如，润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂、着色剂、加香剂、防腐剂及其组合。
悬浮液，在活性化合物之外，还可含有悬浮剂，包括，例如，乙氧基化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇、失水山梨醇酯、微晶纤维素、铝金属氢氧化物、膨润土、琼脂-琼脂、黄蓍胶及其组合。
可通过添加各种抗菌剂和抗真菌剂（包括，例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇和苯酚山梨酸）来确保对微生物作用和/或生长的抑制。
在某些实施方案中，可能期望在所述组合物中包含等渗剂（包括，例如，糖或氯化钠）。另外，可通过添加延迟吸收的试剂（例如，单硬脂酸铝和明胶）带来注射药物形式的延长吸收。
应当理解，剂量方案将由主治医生考虑到改变本公开的一种或多种GDF11和/或激活素B拮抗试剂（任选地，GDF8、激活素A、激活素C、激活素E、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10中的一种或多种的另外的拮抗剂）的作用的各种因素而确定。所述各种因素包括但不限于：患者的红细胞计数、血红蛋白水平、期望的靶标红细胞计数、患者的年龄、患者的性别、患者的饮食、可能促使红细胞水平下降的任何疾病的严重程度、施用时间以及其它临床因素。向最终组合物中加入其它已知活性试剂也可能影响剂量。可以通过周期性评估红细胞水平、血红蛋白水平、网织红细胞水平以及造血过程的其它指标中的一项或多项来监测进展。
在某些实施方案中，本公开还提供了基因疗法，用于体内生产本公开的一种或多种GDF11和/或激活素B拮抗试剂（任选地，GDF8、激活素A、激活素C、激活素E、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10中的一种或多种的另外的拮抗剂）。此类疗法将通过将拮抗剂序列引入具有如上所列的一种或多种疾病的细胞或组织中来达到其治疗效果。所述拮抗剂序列的递送可以例如通过使用重组表达载体（如嵌合病毒）或胶体分散体系来实现。本公开的一种或多种GDF11和/或激活素B拮抗试剂（任选地，GDF8、激活素A、激活素C、激活素E、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10中的一种或多种的另外的拮抗剂）的优选的治疗递送是使用靶向的脂质体。
如本文教导的可以用于基因疗法的各种病毒载体包括：腺病毒、疱疹病毒、牛痘或RNA病毒（例如，逆转录病毒）。所述逆转录病毒载体可以是小鼠或禽类逆转录病毒的衍生物。逆转录病毒载体（其中可以插入单个外来基因）的实例包括但不限于：Moloney小鼠白血病病毒(MoMuLV)、Harvey小鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、小鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)和劳氏肉瘤病毒(RSV)。许多另外的逆转录病毒载体都可以整合多个基因。所有这些载体都可以转移或整合选择标记基因，使得经转导的细胞可以被识别并生产。逆转录病毒载体可以通过附接例如糖、糖脂或蛋白质而具有靶特异性。优选的靶向是通过使用抗体完成。本领域技术人员将认识到，可以将特定的多核苷酸序列插入到逆转录病毒基因组中或附接至病毒包膜以允许靶特异性递送含有本公开的一种或多种GDF11和/或激活素B拮抗试剂（任选地，GDF8、激活素A、激活素C、激活素E、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10中的一种或多种的另外的拮抗剂）的逆转录病毒载体。
作为另外一种选择，可以通过常规的磷酸钙转染用编码逆转录病毒结构基因（gag、pol和env）的质粒直接转染组织培养细胞。然后用含有目标基因的载体质粒转染这些细胞。所得的细胞将逆转录病毒载体释放到培养液中。
本公开的一种或多种GDF11和/或激活素B拮抗试剂（任选地，GDF8、激活素A、激活素C、激活素E、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10中的一种或多种的另外的拮抗剂）的另一种靶向递送系统是胶体分散体系。胶体分散体系包括，例如，大分子复合物、纳米微囊、微球、微珠和基于脂质的系统（包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体）。在某些实施方案中，本公开的优选的胶体系统是脂质体。脂质体是人工膜囊泡，其可用作体外和体内递送媒介物。RNA、DNA和完整的病毒粒子可以被包封在水性内部并以具有生物活性的形式被递送至细胞[参见，例如，Fraley, 等人，(1981) Trends Biochem.Sci., 6:77]。使用脂质体媒介物有效转移基因的方法是本领域已知的[参见，例如，Mannino, 等人，(1988) Biotechniques, 6:682, 1988]。
脂质体的组成通常是磷脂的组合，其可包括类固醇（例如，胆固醇）。脂质体的物理特性取决于pH、离子强度和二价阳离子的存在。也可使用其它磷脂或其它脂质，包括，例如，磷脂酰基化合物（例如，磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘脂、脑苷脂和神经节苷脂）、卵磷脂、二棕榈酰卵磷脂和二硬脂酰磷脂酰胆碱。对脂质体的靶向还可能基于例如，器官特异性、细胞特异性和细胞器特异性，并且是本领域已知的。
实施例
到现在经一般性描述的本发明，通过参考下列实施例，将更容易理解。所包括的实施例仅出于说明某些实施方案以及本发明的实施方案的目的，而并不旨在限制本发明。
实施例1：表征ActRIIB(L79D 20-134)-Fc和ActRIIB(L79D 25-131)-Fc的配体结 合特异性
此前已经报道了变体ActRIIB-Fc融合蛋白，其包含本发明的SEQ ID NO:1的氨基酸20-134，其中在相对于SEQ ID NO:1的位置79处具有酸性氨基酸[在本文中被称为“ActRIIB(L79D 20-134)-Fc”融合蛋白、构建体、变体等；参见本公开的SEQ ID NO:23]，其特征在于独特的体外和体内生物学特性（参见，例如，美国专利号8,058,229）。相比未经修饰的融合蛋白（ActRIIB(20-134)-Fc融合蛋白）的对应的样品，ActRIIB(L79D 20-134)-Fc变体的特征部分在于基本上丧失了对激活素A的结合亲和力，并且因此拮抗激活素A活性的能力显著减弱，但保持了近乎野生型水平的对GDF11的结合和抑制。据发现，在体内，ActRIIB(L79D20-134)-Fc变体在提高红细胞水平的能力上，相比未经修饰的ActRIIB(20-134)-Fc融合蛋白，明显更有效。因此，这些数据表明，所观察到的生物活性与激活素A的抑制无关。
此前就双截短的变体ActRIIB(L79D 25-131)-Fc报道了类似结果（参见，例如，本公开的SEQ ID NO:49以及美国专利号8,058,229），并且通过表面等离子体共振进一步表征了ActRIIB(L79D 25-131)-Fc相对于各种ActRII配体（例如，GDF11、GDF8、激活素A、激活素B、BMP10、BMP6和BMP9）的配体结合概况。结果描述于图13中。
基于对本数据和其它数据的考量，申请人已经确定，应当被抑制从而促进红细胞水平提高的ActRII配体是GDF11和激活素B。此数据还表明，在用于提高个体内红细胞水平的方法的上下文中也允许拮抗（抑制）激活素A、激活素C、激活素E、BMP6和GDF8。
实施例2：GDF-11、GDF-8、激活素B、激活素C以及激活素E介导的信号转导的生物测 定
使用A-204报道基因测定法评价抗-GDF11/激活素B双特异性抗体对通过GDF11、激活素B、激活素A和/或GDF8的信号转导的影响。此测定法此前已经在本领域有述（参见，例如，美国专利申请号2013/0243743）。简而言之，A-204报道基因测定法使用人横纹肌肉瘤细胞系（其已取自肌肉）和报道载体pGL3(CAGA)12，如Dennler 等人，(1998) EMBO 17: 3091-3100中所述。TGF-β应答基因（例如，PAI-1基因）中存在CAGA12基序，所以此载体普遍用于通过Smad2和3的因子信号转导（例如，GDF11、激活素B、激活素A和GDF8）。
在第1天，将A-204细胞转移到一个或多个48孔平板中。在第2天，用10 µg pGL3(CAGA)12 或 pGL3(CAGA)12(10 µg) + pRLCMV (1 µg) 和 Fugene转染这些A-204细胞。在第3天，将稀释到培养液 + 0.1% BSA中的配体因子（例如，GDF11、激活素B、激活素A）连同所述抗-GDF11/激活素B双特异性抗体加入到这些细胞中。通常，所述抗-GDF11/激活素B双特异性抗体在加入到细胞中之前需要与因子一起预温育1小时。大约六小时之后，用PBS冲洗细胞，并裂解。
然后，使细胞裂解物经受荧光素酶测定以确定Smad2/3活化的程度。相对于合适的对照确定所述抗-GDF11/激活素B双特异性抗体的抑制程度。
实施例3：用抗-GDF11/抗-激活素B双特异性抗体治疗
将十九周龄的雄性C57BL/6NTac小鼠随机分配到两个组之一。在三周内每周两次通过皮下注射向小鼠施用媒介物（10 mM Tris缓冲生理盐水，TBS）或抗-GDF11/抗-激活素B双特异性抗体。在基线和三周的施用之后采集血液。将使用血液分析仪（例如，HM2, Abaxis,Inc.）分析血样的细胞分布。具体地讲，将监测小鼠的红细胞参数变化，包括，例如， 红细胞计数（RBC）、血红蛋白（HGB）和红细胞压积（HCT）。
实施例4：联合施用抗-GDF11抗体和抗-激活素B抗体
将十九周龄的雄性C57BL/6NTac小鼠随机分配到四个组之一：向小鼠施用媒介物(10mM TBS)、抗-GDF11抗体、抗-激活素B抗体、或同时抗-GDF11和抗-激活素B的抗体。在基线和三周的施用之后采集血液。将使用血液分析仪（例如，HM2, Abaxis, Inc.）分析血样的细胞分布。具体地讲，将监测小鼠的红细胞参数变化，包括，例如， 红细胞计数（RBC）、血红蛋白（HGB）和红细胞压积（HCT）。
实施例5：抗-激活素B、抗-GDF8和抗-GDF8/GDF11抗体对红细胞生成的影响
评价了三种抗体（抗-激活素B、抗-GDF8抗体和双特异性抗-GDF8/GDF11抗体）在小鼠中刺激红细胞生成的能力（例如，提高红细胞、血红蛋白和红细胞压积水平）。将C57BL6小鼠(8-10周龄)分入五个治疗组之一：i) 用媒介物治疗(TBS, 每周两次; 皮下注射)、ii) 用抗-激活素B抗体治疗(10 mg/kg; 每周两次; 皮下注射)、iii) 用抗-GDF8抗体治疗 (10mg/kg, 每周两次; 皮下注射)、iv) 用双特异性抗-GDF8/GDF11抗体治疗(10 mg/kg, 每周两次; 皮下注射)以及 v) 用抗-激活素B抗体 (10 mg/kg, 每周两次; 皮下注射)与双特异性抗-GDF8/GDF11抗体(10 mg/kg, 每周两次; 皮下注射)的组合治疗。在两周的治疗后，将小鼠安乐死并测量完整的血细胞计数参数。
相比媒介物治疗的（对照）个体，在仅用抗-激活素B抗体治疗以及仅用抗-GDF8抗体治疗的小鼠中，红细胞水平略有上升。参见图16。在用双特异性抗-GDF8/GDF11抗体治疗的小鼠中，观察到了对红细胞水平更实质性的影响。参见图16。然而，在用抗-激活素B抗体与双特异性抗-GDF8/GDF11抗体的组合治疗的小鼠中，观察到了对红细胞生成最大的影响，例如，相比对照个体，所述组合疗法显著提高了红细胞水平（8.8%）。参见图16。另外，据观察，相比对照个体，用抗-激活素B抗体与双特异性抗-GDF8/GDF11抗体的组合治疗导致血红蛋白(9.6%)和红细胞压积(9.1%)水平升高。
因此，在所检查的配体中，随着向动物施用额外的ActRII配体拮抗剂（抑制剂），血细胞、红细胞压积和血红蛋白水平有明显的上升趋势。有趣的是，抑制单一的ActRII配体不会显著影响红细胞水平。然而，看起来抑制至少两种ActRII配体可以刺激红细胞生成，并且当三种ActRII配体被抑制时，对红细胞水平以及血红蛋白和红细胞压积水平会有甚至更大的影响。综上，这些数据表明，多种ActRII配体参与红细胞生成，并且进一步表明，仅抑制这些配体之一可能不足以实现红细胞压积、血红蛋白和/或红细胞水平的显著提升。因此，从这些实验看来，促进个体中红细胞生成的有效策略是靶向多种（即，至少两种）ActRII配体。
通过引用的并入
本文提及的所有出版物和专利均以引用的方式全文并入本文，其程度如同每个单独的出版物或专利被专门并单独指明引用作为参考。
虽然已经讨论了本发明主题的特定实施方案，但以上说明书是示例性而非限制性的。在回顾本说明书和以下权利要求的基础上，许多变型形式对于本领域技术人员将变得显而易见。本发明的整个范围应当参考权利要求连同其等同形式的整个范围以及说明书连同此类变型形式而确定。

Claims (136)

1.用于在个体中提高红细胞水平或治疗或预防贫血的方法，包括向有此需要的个体施用有效量的抑制激活素B和GDF11的试剂。
2.权利要求1的方法，其中所述试剂在基于细胞的测定法中抑制激活素B和GDF11信号转导。
3.权利要求1或2的方法，其中所述试剂基本上不抑制激活素A。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述试剂在基于细胞的测定法中基本上不抑制激活素A信号转导。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述试剂基本上不结合激活素A。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述试剂还抑制GDF8、激活素A、激活素C、激活素E、GDF15、Nodal、BMP3、BMP3B、BMP9或BMP10中的一种或多种。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述试剂是多特异性抗体。
8.权利要求7的方法，其中所述多特异性抗体结合以下中的两种或更多种：激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、GDF11、GDF8、GDF15、Nodal、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10。
9.权利要求8的方法，其中所述试剂是结合激活素B和GDF11的双特异性抗体。
10.权利要求9的方法，其中所述双特异性抗体包含彼此相连的两种不同的单特异性抗体。
11.权利要求7-10中任一项的方法，其中所述抗体是嵌合抗体。
12.权利要求7-10中任一项的方法，其中所述抗体是人源化抗体。
13.权利要求7-10中任一项的方法，其中所述抗体是人抗体。
14.权利要求7-13中任一项的方法，其中所述抗体是单链抗体。
15.权利要求7-13中任一项的方法，其中所述抗体是F(ab’)2片段。
16.权利要求7-13中任一项的方法，其中所述抗体是单链双抗体、串联单链Fv片段、串联单链双抗体、或包含单链双抗体和至少一部分免疫球蛋白重链恒定区的融合蛋白。
17.权利要求7-16中任一项的方法，其中所述抗体是双可变域免疫球蛋白。
18.权利要求7-17中任一项的方法，其中所述抗体包含异源部分。
19.权利要求18的方法，其中所述异源部分是糖、可检测标记物或稳定部分。
20. 权利要求1-6中任一项的方法，其中所述试剂是包含与SEQ ID NO:1的氨基酸29-109至少80%相同的氨基酸序列的GDF11/激活素B陷阱，并且其中所述GDF11/激活素B陷阱在SEQ ID NO:1的位置79处不包含酸性氨基酸。
21. 权利要求1-6中任一项的方法，其中所述试剂是包含与SEQ ID NO:1的氨基酸29-109至少80%相同的氨基酸序列的GDF11/激活素B陷阱，并且其中所述GDF11/激活素B陷阱以小于100 pM的KD 结合激活素B。
22. 权利要求1-6中任一项的方法，其中所述试剂是包含与SEQ ID NO:1的氨基酸29-109至少80%相同的氨基酸序列的GDF11/激活素B陷阱，并且其中所述GDF11/激活素B陷阱对GDF11的KD 比ActRIIB受体的野生型配体结合域的所述KD 小至少2倍。
23. 权利要求1-6中任一项的方法，其中所述试剂是包含与SEQ ID NO:1的氨基酸29-109至少80%相同的氨基酸序列的GDF11/激活素B陷阱，并且其中所述GDF11/激活素B陷阱对激活素B的KD 比ActRIIB受体的野生型配体结合域的所述KD 小至少2倍。
24. 权利要求20-23中任一项的方法，其中所述GDF11/激活素B陷阱包含与SEQ ID NO:1的氨基酸29-109至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列。
25. 权利要求20-23中任一项的方法，其中所述GDF11/激活素B陷阱包含与SEQ ID NO:1的氨基酸25-131至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列。
26. 权利要求20-23中任一项的方法，其中所述GDF11/激活素B陷阱包含与SEQ ID NO:3或4的氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列。
27. 权利要求20-23中任一项的方法，其中所述GDF11/激活素B陷阱包含多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO: 5或6的氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列。
28.权利要求20-27中任一项的方法，其中所述GDF11/激活素B陷阱是融合蛋白，所述融合蛋白除GDF/激活素B陷阱多肽域之外还包含一个或多个异源多肽域，所述一个或多个异源多肽域增强下列中的一项或多项：体内半衰期、体外半衰期、施用、组织定位或分布、形成蛋白复合体以及纯化。
29.权利要求28的方法，其中所述融合蛋白包含异源多肽域，所述异源多肽域选自：免疫球蛋白Fc域和血清白蛋白。
30. 权利要求29的方法，其中所述免疫球蛋白Fc域是IgG1 Fc域。
31. 权利要求30的方法，其中所述免疫球蛋白Fc域包含SEQ ID NO: 16的氨基酸序列。
32.权利要求29或30的方法，其中融合蛋白还包含位于所述陷阱多肽域和所述免疫球蛋白Fc域之间的接头域。
33.权利要求32的方法，其中所述接头域是TGGG接头。
34. 权利要求30-33中任一项的方法，其中所述GDF11/激活素B陷阱包含与SEQ ID NO:49的氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列。
35. 权利要求1-6的方法，其中所述试剂是GDF11/激活素B陷阱，所述GDF11/激活素B陷阱包含与SEQ ID NO:9的氨基酸30-110至少80%相同的氨基酸序列。
36. 权利要求1-6的方法，其中所述试剂是包含与SEQ ID NO:9的氨基酸30-110至少80%相同的氨基酸序列的GDF11/激活素B陷阱，并且其中所述GDF11/激活素陷阱对GDF11的KD 比ActRIIA受体的野生型配体结合域的所述KD 小至少2倍。
37. 权利要求1-6的方法，其中所述试剂是包含与SEQ ID NO:9的氨基酸30-110至少80%相同的氨基酸序列的GDF11/激活素B陷阱，并且其中所述GDF11/激活素B陷阱对激活素B的KD 比ActRIIA受体的野生型配体结合域的所述结合亲和力小至少2倍。
38. 权利要求35-37中任一项的方法，其中所述GDF11/激活素B陷阱包含与SEQ ID NO:9的氨基酸30-110至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列。
39. 权利要求35-37中任一项的方法，其中所述GDF11/激活素B陷阱包含与SEQ ID NO:10的氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列。
40. 权利要求35-37中任一项的方法，其中所述GDF11/激活素B陷阱包含多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列。
41.权利要求35-40中任一项的方法，其中所述GDF11/激活素B陷阱是融合蛋白，所述融合蛋白除GDF/激活素B陷阱多肽域之外还包含一个或多个异源多肽域，所述一个或多个异源多肽域增强下列中的一项或多项：体内半衰期、体外半衰期、施用、组织定位或分布、形成蛋白复合体以及纯化。
42.权利要求41的方法，其中所述融合蛋白包含异源多肽域，所述异源多肽域选自：免疫球蛋白Fc域和血清白蛋白。
43. 权利要求42的方法，其中所述免疫球蛋白Fc域是IgG1 Fc域。
44. 权利要求43的方法，其中所述免疫球蛋白Fc域包含选自SEQ ID NO: 16的氨基酸序列。
45.权利要求43或44的方法，其中融合蛋白还包含位于所述陷阱多肽域和所述免疫球蛋白Fc域之间的接头域。
46.权利要求45的方法，其中所述接头域是TGGG接头。
47. 权利要求42-46中任一项的方法，其中所述GDF11/激活素B陷阱包含与SEQ ID NO:20的氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列。
48.权利要求20-47中任一项的方法，其中所述GDF11/激活素B陷阱包含选自以下的一种或多种氨基酸修饰：糖基化的氨基酸、聚乙二醇化的氨基酸、法呢基化的氨基酸、乙酰化的氨基酸、生物素酰化的氨基酸、结合至脂质部分的氨基酸、结合至有机衍生剂的氨基酸。
49.权利要求48的方法，其中所述GDF11/激活素B陷阱是糖基化的并具有哺乳动物糖基化模式。
50.权利要求49的方法，其中所述GDF11/激活素B陷阱具有可得自中国仓鼠卵巢细胞系的糖基化模式。
51.权利要求1-50中任一项的方法，其中所述方法是用于在有此需要的个体中增加红细胞。
52.权利要求1-50中任一项的方法，其中所述方法是用于在有此需要的个体中治疗或预防贫血。
53.权利要求52的方法，其中所述贫血与以下一项或多项有关：多发性骨髓瘤、慢性或急性肾病或衰竭、对所述个体的化学治疗、骨髓增生异常综合征以及地中海贫血。
54.权利要求53的方法，其中所述地中海贫血是β-地中海贫血。
55.权利要求53的方法，其中所述肾衰竭是晚期肾衰竭。
56.权利要求1-50中任一项的方法，其中所述个体患有镰状细胞性贫血。
57.用于在个体中提高红细胞水平或治疗或预防贫血的方法，包括向有此需要的个体施用有效量的抑制激活素B和GDF11的试剂组合。
58.权利要求57的方法，其中所述试剂组合在基于细胞的测定法中抑制激活素B和GDF11信号转导。
59.权利要求57或58的方法，其中所述试剂组合基本上不抑制激活素A。
60.权利要求57-59中任一项的方法，其中所述试剂组合在基于细胞的测定法中基本上不抑制激活素A信号转导。
61.权利要求57-60中任一项的方法，其中所述试剂组合基本上不结合激活素A。
62.权利要求57-61中任一项的方法，其中所述试剂中的一种或多种还抑制GDF8、激活素A、激活素C、激活素E、GDF15、Nodal、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10中的一种或多种。
63.权利要求57-62中任一项的方法，其中所述试剂组合包含至少一种试剂，所述至少一种试剂是结合GDF11的抗体或其抗原结合片段。
64.权利要求57-63中任一项的方法，其中所述试剂组合包含至少一种试剂，所述至少一种试剂是结合激活素B的抗体或其抗原结合片段。
65.权利要求57-64中任一项的方法，其中所述试剂组合包含至少一种试剂，所述至少一种试剂是结合以下的一种或多种的抗体或其抗原结合片段：GDF11、GDF8、激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、GDF15、Nodal、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10。
66.权利要求63-65中任一项的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是嵌合抗体或其片段。
67.权利要求63-65中任一项的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是人源化抗体或其片段。
68.权利要求63-65中任一项的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是人抗体或其片段。
69.权利要求63-68中任一项的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是单链抗体。
70.权利要求63-68中任一项的方法，其中所述抗原结合片段选自：Fab、Fab′、F(ab′)2、F(ab′)3、Fd和Fv。
71.权利要求63-70中任一项的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含异源部分。
72.权利要求71的方法，其中所述异源部分是糖、可检测标记物或稳定部分。
73. 权利要求57-72中任一项的方法，其中所述试剂组合包含至少一种是GDF11陷阱的试剂，并且其中所述GDF11陷阱包含多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:1的氨基酸29-109至少80%相同的氨基酸序列。
74. 权利要求57-73中任一项的方法，其中所述试剂组合包含至少一种是激活素B陷阱的试剂，并且其中所述激活素B陷阱包含多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:1的氨基酸29-109至少80%相同的氨基酸序列。
75. 权利要求57-74中任一项的方法，其中所述试剂组合包含至少一种是GDF11陷阱的试剂，并且其中所述GDF11陷阱包含多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:9的氨基酸30-110至少80%相同的氨基酸序列。
76. 权利要求57-75中任一项的方法，其中所述试剂组合包含至少一种是激活素B陷阱的试剂，并且其中所述激活素B陷阱包含多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:9的氨基酸30-110至少80%相同的氨基酸序列。
77.权利要求57-76中任一项的方法，其中所述试剂组合包含至少一种是小分子拮抗剂的试剂，所述小分子拮抗剂是以下的一种或多种的小分子拮抗剂：激活素B、激活素C、激活素E、GDF11和GDF8。
78.权利要求57-77中任一项的方法，其中所述试剂组合包含至少一种是激活素B的小分子拮抗剂的试剂。
79.权利要求57-78中任一项的方法，其中所述试剂组合包含至少一种是GDF11的小分子拮抗剂的试剂。
80.权利要求57-79中任一项的方法，其中所述试剂组合包含至少一种多核苷酸序列，所述至少一种多核苷酸序列抑制以下的一种或多种的表达：激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、GDF11、GDF8、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10。
81.权利要求80的方法，其中所述多核苷酸序列是反义寡核苷酸，其杂交至基因转录物以抑制所述基因的表达，所述基因选自：激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、GDF11、GDF8、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10。
82.权利要求81的方法，其中所述试剂组合包含杂交至激活素B转录物的反义寡核苷酸。
83.权利要求81的方法，其中所述试剂组合包含杂交至GDF11转录物的反义寡核苷酸。
84.权利要求80的方法，其中所述多核苷酸序列包含靶向基因转录物的RNAi序列，所述基因选自：激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、GDF11、GDF8、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3B、BMP9和BMP10。
85.权利要求84的方法，其中所述多核苷酸分子包含靶向激活素B转录物的RNAi序列。
86.权利要求84的方法，其中所述多核苷酸序列包含靶向GDF11转录物的RNAi序列。
87.权利要求84-86中任一项的方法，其中所述RNAi序列是siRNA。
88.权利要求87的方法，其中所述siRNA长约19至约45个核苷酸。
89.权利要求87的方法，其中所述siRNA长约25至约30个核苷酸。
90.权利要求87的方法，其中所述siRNA长约10至约20个核苷酸。
91.权利要求84-86中任一项的方法，其中所述RNAi序列是shRNA。
92.权利要求91的方法，其中所述shRNA的茎长为19-29个核苷酸。
93.权利要求92的方法，其中所述shRNA的茎长为19-23个核苷酸。
94.权利要求91-93中任一项的方法，其中所述shRNA的环区长为5-9个核苷酸。
95.权利要求6的方法，其中所述试剂在基于细胞的测定法中抑制GDF8、激活素A、激活素C、激活素E、GDF15、Nodal、GDF3、GDF3B、BMP9和BMP10信号转导中的一种或多种。
96.权利要求57的方法，其中所述试剂组合在基于细胞的测定法中抑制GDF8、激活素A、激活素C、激活素E、GDF15、Nodal、GDF3、GDF3B、BMP9和BMP10信号转导中的一种或多种。
97. 权利要求1-96中任一项的方法，其中所述试剂或试剂组合抑制Smad 2/3信号转导。
98. 用于在个体中提高红细胞水平或治疗或预防贫血的方法，包括向有此需要的个体施用有效量的试剂或试剂组合，所述试剂或试剂组合抑制GDF11和一种或多种另外的配体，所述一种或多种另外的配体结合ActRIIB并通过Smad 2/3转导信号。
99.权利要求98的方法，其中所述一种或多种另外的配体选自：GDF8、激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10。
100. 用于在个体中提高红细胞水平或治疗或预防贫血的方法，包括向有此需要的个体施用有效量的试剂或试剂组合，所述试剂或试剂组合抑制激活素B和一种或多种另外的配体，所述一种或多种另外的配体结合ActRIIB并通过Smad 2/3转导信号。
101.权利要求100的方法，其中所述一种或多种另外的配体选自：GDF8、GDF11、激活素A、激活素C、激活素E、BMP6、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10。
102.权利要求98-101中任一项的方法，其中所述试剂或试剂组合基本上不抑制激活素A信号转导。
103.权利要求98-102中任一项的方法，其中所述试剂或试剂组合在基于细胞的测定法中基本上不抑制激活素A信号转导。
104.权利要求98-103中任一项的方法，其中所述试剂或试剂组合基本上不结合激活素A。
105.权利要求98-104中任一项的方法，其中所述试剂或所述试剂中的至少一种包含至少一种试剂，所述至少一种试剂是结合GDF11的抗体或其抗原结合片段。
106.权利要求98-105中任一项的方法，其中所述试剂或所述试剂中的至少一种是结合激活素B的抗体或其抗原结合片段。
107.权利要求98-106中任一项的方法，其中所述试剂或所述试剂中的至少一种是结合以下的一种或多种的多特异性抗体或其抗原结合片段：GDF11、GDF8、激活素B、激活素C、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9、BMP10和激活素E。
108.权利要求105-107中任一项的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是嵌合抗体或其片段。
109.权利要求105-107中任一项的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是人源化抗体或其片段。
110.权利要求105-107中任一项的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是人抗体或其片段。
111.权利要求105-110中任一项的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是单链抗体。
112.权利要求105-111中任一项的方法，其中所述抗原结合片段选自：Fab、Fab′、F(ab′)2、F(ab′)3、Fd和Fv。
113.权利要求105-112中任一项的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含异源部分。
114.权利要求113的方法，其中所述异源部分是糖、可检测标记物或稳定部分。
115. 权利要求98-114中任一项的方法，其中所述试剂或所述试剂中的至少一种是GDF11陷阱，并且其中所述GDF11陷阱包含多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:1的氨基酸29-109至少80%相同的氨基酸序列。
116. 权利要求98-115中任一项的方法，其中所述试剂或所述试剂中的至少一种是激活素B陷阱，并且其中所述激活素B陷阱包含多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:1的氨基酸29-109至少80%相同的氨基酸序列。
117. 权利要求98-116中任一项的方法，其中所述试剂或所述试剂中的至少一种是GDF11陷阱，并且其中所述GDF11陷阱包含多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:9的氨基酸30-110至少80%相同的氨基酸序列。
118. 权利要求98-117中任一项的方法，其中所述试剂或所述试剂中的至少一种是激活素B陷阱，并且其中所述激活素B陷阱包含多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:9的氨基酸30-110至少80%相同的氨基酸序列。
119.权利要求98-118中任一项的方法，其中所述试剂或所述试剂中的至少一种是以下的一种或多种的小分子拮抗剂：激活素B、激活素C、激活素E、GDF11、GDF8、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10。
120.权利要求98-119中任一项的方法，其中所述试剂或所述试剂中的至少一种是激活素B的小分子拮抗剂。
121.权利要求98-120中任一项的方法，其中所述试剂或所述试剂中的至少一种是GDF11的小分子拮抗剂。
122.权利要求98-121中任一项的方法，其中所述试剂或所述试剂中的至少一种包含多核苷酸，所述多核苷酸抑制以下的一种或多种的表达：激活素B、激活素C、激活素E、GDF11、GDF8、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10。
123.权利要求122的方法，其中所述多核苷酸或至少一种多核苷酸是反义寡核苷酸，其杂交至基因转录物以抑制所述基因的表达，所述基因选自：激活素B、激活素C、激活素E、GDF11、GDF8、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10。
124.权利要求123的方法，其中所述多核苷酸或所述多核苷酸中的至少一种是杂交至激活素B转录物的反义寡核苷酸。
125.权利要求123的方法，其中所述多核苷酸或所述多核苷酸中的至少一种是杂交至GDF11转录物的反义寡核苷酸。
126.权利要求122的方法，其中所述多核苷酸或所述多核苷酸中的至少一种是靶向基因转录物的RNAi序列，所述基因选自：激活素B、激活素C、激活素E、GDF11、GDF8、GDF15、Nodal、GDF3、BMP3、BMP3B、BMP9和BMP10。
127.权利要求126的方法，其中所述多核苷酸或所述多核苷酸中的至少一种是靶向激活素B转录物的RNAi序列。
128.权利要求126的方法，其中所述多核苷酸或所述多核苷酸中的至少一种是靶向GDF11转录物的RNAi序列。
129.权利要求126-128中任一项的方法，其中所述RNAi序列或所述RNAi序列中的至少一种是siRNA。
130.权利要求129的方法，其中所述siRNA序列或所述siRNA序列中的至少一种长约19至约45个核苷酸。
131.权利要求130的方法，其中所述siRNA序列或所述siRNA序列中的至少一种长约25至约30个核苷酸。
132.权利要求130的方法，其中所述siRNA序列或所述siRNA序列中的至少一种长约10至约20个核苷酸。
133.权利要求126-128中任一项的方法，其中所述RNAi序列或所述RNAi序列中的至少一种是shRNA。
134.权利要求133的方法，其中所述shRNA序列或所述shRNA序列中的至少一种的茎长为19-29个核苷酸。
135.权利要求134的方法，其中所述shRNA序列或所述shRNA序列中的至少一种的茎长为19-23个核苷酸。
136.权利要求133-135中任一项的方法，其中所述shRNA序列或所述shRNA序列中的至少一种的环区长为5-9个核苷酸。
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