CN109689085A

CN109689085A - 用于治疗肺高血压的组合物和方法

Info

Publication number: CN109689085A
Application number: CN201780056829.5A
Authority: CN
Inventors: R.库马; J.克诺普夫
Original assignee: Acceleron Pharma Inc
Current assignee: Acceleron Pharma Inc
Priority date: 2016-07-15
Filing date: 2017-07-14
Publication date: 2019-04-26
Also published as: MD3496739T2; EP3496739A1; HRP20210694T1; JP2024009166A; US20210299216A1; RU2019104084A3; EP3496739B1; MX2019000618A; US11497794B2; RU2021114098A; CY1124277T1; RS62011B1; AU2017296040C1; US10722558B2; MX2021000276A; LT3496739T; US20210299220A1; JP2022107775A; RU2019104084A; US11622992B2

Abstract

在一些方面，本公开内容涉及GDF/BMP拮抗剂和使用GDF/BMP拮抗剂来治疗、预防或降低肺高血压(PH)的进展率和/或严重程度、特别是治疗、预防或降低一种或多种PH相关并发症的进展率和/或严重程度的方法。本公开内容还提供了使用GDF/BMP拮抗剂来治疗、预防或降低多种状况(包括但不限于肺血管重建、肺纤维化和右心室肥大)的进展率和/或严重程度的方法。本公开内容进一步提供了使用GDF/BMP拮抗剂来降低有需要的主体中的右心室收缩压的方法。

Description

用于治疗肺高血压的组合物和方法

与相关申请的交叉参考

本申请要求2016年7月15日提交的美国临时申请系列号62/362,955；2017年2月2日提交的美国临时申请系列号62/453,888；和2017年5月24日提交的美国临时申请系列号62/510,403的优先权。前述申请的公开内容特此以其整体引入作为参考。

发明背景

肺高血压（pulmonary hypertension）(PH)是一种特征在于肺血管系统(包括肺动脉、肺静脉和肺毛细血管)中的高血压的疾病。通常，PH被定义为静息时肺动脉平均(PA)压≧25mm Hg或运动时≧30 mm Hg [Hill等人, Respiratory Care 54(7):958-68 (2009)]。主要的PH症状是呼吸困难或气促，且其他症状包括疲劳、头晕、昏厥、外周性水肿(足、腿或踝的肿胀)、嘴唇和皮肤发青（bluish）、胸痛、心绞痛、运动期间头晕、非排痰性咳嗽、心跳加速（racing pulse）和心悸。PH可以是引起心力衰竭的严重疾病，其为具有肺高血压的人中最常见的死亡原因之一。手术后肺高血压可能使许多类型的外科手术或操作复杂化，并且呈现与高死亡率相关的挑战。

可以基于在病理生理学机制、临床表现和治疗方法中共享相似性的疾病的不同表现来对PH进行分组[Simonneau等人, JACC 54(1):S44-54 (2009)]。PH的临床分类在1973年首次提出，并且最近更新的临床分类在2008年由世界卫生组织(WHO)认可。根据更新的PH临床分类，存在五个主要的PH组：肺动脉高压(PAH)，其特征在于PA楔压≦15 mm Hg；由于左心脏病导致的PH(也称为肺静脉高压或充血性心力衰竭)，其特征在于PA楔压>15 mm Hg；由于肺病和/或缺氧导致的PH；慢性血栓栓塞性PH；和具有不确定或多因子病因的PH[Simonneau等人, JACC 54(1):S44-54 (2009); Hill等人, Respiratory Care 54(7):958-68 (2009)]。PAH被进一步分为特发性PAH (IPAH)，一种散发性疾病，其中既没有PAH家族史，也没有鉴定的危险因素；遗传性PAH；由药物和毒素诱导的PAH；与结缔组织病、HIV感染、门静脉高压、先天性心脏病、血吸虫病和慢性溶血性贫血相关的PAH；和新生儿的持续性PH [Simonneau等人, JACC 54(1):S44-54 (2009)]。各种类型的PH的诊断需要一系列测试。

通常，PH治疗取决于PH的原因或分类。在PH由已知的药物或医疗状况引起的情况下，其被称为继发性PH，并且其治疗通常针对潜在的疾病。肺静脉高压的治疗通常涉及通过施用利尿剂、β受体阻滞剂和ACE抑制剂来最优化左心室功能，或修复或置换二尖瓣或主动脉瓣。PAH疗法包括肺血管扩张剂、地高辛、利尿剂、抗凝剂和氧气疗法。肺血管扩张剂靶向不同途径，包括前列环素途径(例如，前列环素，包括静脉内依前列醇，皮下或静脉内曲前列环素（treprostinil）和吸入的伊洛前列素（iloprost）)，氧化氮途径(例如，磷酸二酯酶-5抑制剂，包括西地那非（sildenafil）和他达拉非（tadalafil）)和内皮素-1途径(例如，内皮素受体拮抗剂，包括口服波生坦（bosentan）和口服安立生坦（ambrisentan）)[Humbert, M.Am. J. Respir. Crit. Care Med. 179:650-6 (2009); Hill等人, Respiratory Care54(7):958-68 (2009)]。然而，目前的疗法不能治愈PH，并且它们并不直接治疗许多PH患者中观察到的潜在的血管重建（vascular remodeling）和血管肌组织化。

因此，对用于治疗肺高血压的有效疗法存在高度、未满足的需要。因此，本公开内容的目的是提供用于治疗、预防或降低PH的进展率和/或严重程度，特别是治疗、预防或降低一种或多种PH相关并发症的进展率（progression rate）和/或严重程度的方法。

发明概述

部分地，本文呈现的数据证明GDF/BMP拮抗剂(抑制剂)可用于治疗肺高血压。例如，显示可以一个一个单独地使用可溶性ActRIIA多肽和ALK4:ActRIIB异二聚体来降低单野百合碱诱导的肺动脉高压(PAH)模型中的血压、心脏肥大和肺重量。在Sugen缺氧PAH模型中对于ActRIIA多肽观察到类似的阳性效应。组织学分析进一步揭示，在单野百合碱诱导的PAN模型和Sugen缺氧PAN模型两者中，ActRIIA多肽对减少血管重建和血管肌组织化具有令人惊讶且显著的作用。此外，与西地那非(一种批准用于治疗PAH的药物)相比，ActRIIA多肽和ALK4:ActRIIB异二聚体两者都令人惊讶地对改善PAH的各种并发症具有更大的作用。因此，本公开内容确立了ActRII (ActRIIA和ActRIIB)信号传导途径的拮抗剂可用于降低肺高血压的严重程度。尽管可溶性ActRIIa多肽和ALK4:ActRIIB异多聚体可通过除了ActRIIA/B配体拮抗作用以外的机制影响肺高血压，但本公开内容仍然证明可以基于ActRII信号传导拮抗剂活性选择期望的治疗剂。因此，在一些实施方案中，本公开内容提供了使用各种ActRII信号传导拮抗剂用于治疗高血压、特别是肺高血压的方法，包括例如抑制一种或多种ActRIIA/B配体[例如，激活蛋白(激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白AB、激活蛋白C、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白E、激活蛋白AE和/或激活蛋白BE)、GDF8、GDF11、GDF3、BMP6、BMP15和BMP10]的拮抗剂；抑制一种或多种I型和/或II型受体(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7和ALK5)的拮抗剂；和抑制一种或多种下游信号传导组分(例如，Smad蛋白如Smads 2和3)的拮抗剂。如本文所用的，这种信号传导拮抗剂被统称为“GDF/BMP拮抗剂”或“GDF/BMP抑制剂”。因此，本公开内容部分提供了GDF/BMP拮抗剂组合物和用于治疗肺高血压(例如，PAH)、特别是治疗肺高血压的一种或多种并发症(例如，升高的血压、心脏肥大、血管重建和血管肌组织化)的方法。待根据本公开内容的方法和用途使用的GDF/BMP拮抗剂包括，例如，配体捕获物（trap）(例如，可溶性ActRIIA多肽、ActRIIB多肽、ALK4:ActRIIB异二聚体、促滤泡素抑制素多肽和FLRG多肽)、抗体拮抗剂、小分子拮抗剂和核苷酸拮抗剂。任选地，GDF/BMP拮抗剂可以与一种或多种用于治疗肺高血压的支持疗法和/或额外活性剂组合。

在某些方面，本公开内容涉及治疗肺动脉高压的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的ActRIIA多肽。在一些实施方案中，所述ActRIIA多肽包含与如下氨基酸序列具有至少70%(例如，至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的氨基酸序列，所述如下氨基酸序列开始于SEQ ID NO: 9的氨基酸21、22、23、24、25、26、27、28、29或30中任一个且结束于SEQ ID NO: 9的氨基酸110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134或135中任一个。在一些实施方案中，所述ActRIIA多肽包含与SEQ ID NO: 10的氨基酸序列具有至少70% (例如，至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述ActRIIA多肽包含与SEQ ID NO: 11的氨基酸序列具有至少70% (例如，至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述ActRIIA多肽是包含ActRIIA结构域和一个或多个与ActRIIA异源的多肽结构域的融合蛋白。在一些实施方案中，所述ActRIIA多肽是包含免疫球蛋白的Fc结构域的融合蛋白。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白的Fc结构域是IgG1免疫球蛋白的Fc结构域。在一些实施方案中，所述ActRIIA融合蛋白进一步包含位于ActRIIA多肽结构域和一个或多个异源结构域(例如，Fc免疫球蛋白结构域)之间的接头结构域。在一些实施方案中，所述接头结构域选自：TGGG (SEQ ID NO: 23)、TGGGG (SEQID NO: 21)、SGGGG (SEQ ID NO: 22)、GGGGS (SEQ ID NO: 25)、GGG (SEQ ID NO: 19)、GGGG (SEQ ID NO: 20)和SGGG (SEQ ID NO: 24)。在一些实施方案中，所述ActRIIA多肽包含与SEQ ID NO: 32的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述ActRIIA多肽包含SEQ ID NO: 32的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述ActRIIA多肽由SEQ ID NO: 32的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，所述ActRIIA多肽是同二聚体蛋白复合体的一部分。在一些实施方案中，所述ActRIIA多肽是糖基化的。在一些实施方案中，所述ActRIIA多肽具有可通过在中国仓鼠卵巢细胞中表达获得的糖基化模式。在一些实施方案中，所述ActRIIA多肽的施用降低患者中的肺动脉压。在一些实施方案中，所述ActRIIA多肽的施用使患者中的肺动脉压降低至少10%(例如，10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或至少80%)。在一些实施方案中，所述ActRIIA多肽的施用降低患者中的心室肥大。在一些实施方案中，所述ActRIIA多肽的施用使患者中的心室肥大降低至少10%(例如，10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或至少80%)。在一些实施方案中，所述ActRIIA多肽的施用降低患者中的平滑肌肥大。在一些实施方案中，所述ActRIIA多肽的施用使患者中的平滑肌肥大降低至少10%(例如，10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或至少80%)。在一些实施方案中，所述ActRIIA多肽的施用降低患者中的肺小动脉肌型化（muscularity）。在一些实施方案中，所述ActRIIA多肽的施用使患者中的肺小动脉肌型化降低至少10%(例如，10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或至少80%)。在一些实施方案中，所述ActRIIA多肽的施用降低患者中的肺血管阻力。在一些实施方案中，所述ActRIIA多肽的施用使患者中的肺血管阻力降低至少10%(例如，10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或至少80%)。在一些实施方案中，所述ActRIIA多肽的施用使患者中的肺血管阻力降低至少25-30%。在一些实施方案中，所述患者具有肺动脉高压并且具有根据世界卫生组织的肺高血压功能分类系统的功能II类或III类肺高血压。在一些实施方案中，所述患者具有肺动脉高压，所述肺动脉高压被分类为选自以下的一种或多种亚型：特发性或遗传性肺动脉高压、药物和/或毒素诱导的肺高血压、与结缔组织疾病相关的肺高血压和与分流修复后至少1年的先天性全身至肺分流相关的肺高血压。在一些实施方案中，所述患者已经用一种或多种血管扩张剂治疗。在一些实施方案中，所述患者已经用一种或多种选自以下的药剂治疗：磷酸二酯酶5型抑制剂、可溶性鸟苷酸环化酶刺激剂、前列环素受体激动剂和内皮素受体拮抗剂。在一些实施方案中，所述一种或多种药剂选自：波生坦、西地那非、贝拉普罗（beraprost）、马西替坦（macitentan）、赛乐西帕（selexipag）、依前列醇、曲前列环素、伊洛前列素、安立生坦和他达拉非。在一些实施方案中，所述方法进一步包括施用一种或多种血管扩张剂。在一些实施方案中，所述方法进一步包括施用一种或多种选自以下的药剂：磷酸二酯酶5型抑制剂、可溶性鸟苷酸环化酶刺激剂、前列环素受体激动剂和内皮素受体拮抗剂。在一些实施方案中，所述一种或多种药剂选自：波生坦、西地那非、贝拉普罗、马西替坦、赛乐西帕、依前列醇、曲前列环素、伊洛前列素、安立生坦和他达拉非。在一些实施方案中，所述患者具有150至400米的6-分钟步行距离。在一些实施方案中，所述方法将患者的6-分钟步行距离增加至少10米(例如，至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300或多于400米)。在一些实施方案中，所述患者具有>8且<15 g/dl的血红蛋白水平。在一些实施方案中，所述方法延迟肺动脉高压的临床恶化。在一些实施方案中，所述方法根据世界卫生组织的肺高血压的功能分类系统延迟肺高血压的临床恶化。在一些实施方案中，所述方法降低与肺动脉高压相关的一种或多种并发症的住院的风险。在一些实施方案中，所述ActRIIA多肽结合一种或多种选自以下的配体：激活蛋白A、激活蛋白B、GDF11、GDF8、BMP10和BMP6。

在一些实施方案中，本公开内容涉及治疗肺高血压的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的GDF/BMP拮抗剂或GDF/BMP拮抗剂的组合。在某些方面，本公开内容涉及预防肺高血压的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的GDF/BMP拮抗剂或GDF/BMP拮抗剂的组合。在某些方面，本公开内容涉及降低肺高血压的进展率的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的GDF/BMP拮抗剂或GDF/BMP拮抗剂的组合。在一些实施方案中，本公开内容提供了治疗间质性肺病的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的GDF/BMP拮抗剂，其中所述GDF/BMP拮抗剂抑制激活蛋白、GDF8、GDF11、GDF3、BMP6、BMP15、BMP10、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5和ALK7中的一种或多种。在一些实施方案中，本公开内容提供了治疗、预防或降低间质性肺病的一种或多种并发症的进展率和/或严重程度的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的GDF/BMP拮抗剂，其中所述GDF/BMP拮抗剂抑制激活蛋白、GDF8、GDF11、GDF3、BMP6、BMP15、BMP10、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5和ALK7中的一种或多种。在一些实施方案中，所述间质性肺病是特发性肺纤维化。在某些方面，本公开内容涉及降低肺高血压的严重程度的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的GDF/BMP拮抗剂或GDF/BMP拮抗剂的组合。在某些方面，本公开内容涉及治疗肺高血压的一种或多种并发症(例如，肺动脉中的平滑肌和/或内皮细胞增殖、肺动脉中的血管发生、呼吸困难、胸痛、肺血管重建、右心室肥大和肺纤维化)的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的GDF/BMP拮抗剂或GDF/BMP拮抗剂的组合。在某些方面，本公开内容涉及预防肺高血压的一种或多种并发症(例如，肺动脉中的平滑肌和/或内皮细胞增殖、肺动脉中的血管发生、呼吸困难、胸痛、肺血管重建、右心室肥大和肺纤维化)的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的GDF/BMP拮抗剂或GDF/BMP拮抗剂的组合。在某些方面，本公开内容涉及降低肺高血压的一种或多种并发症(例如，肺动脉中的平滑肌和/或内皮细胞增殖、肺动脉中的血管发生、呼吸困难、胸痛、肺血管重建、右心室肥大和肺纤维化)的进展率的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的GDF/BMP拮抗剂或GDF/BMP拮抗剂的组合。在某些方面，本公开内容涉及降低肺高血压的一种或多种并发症(例如，肺动脉中的平滑肌和/或内皮细胞增殖、肺动脉中的血管发生、呼吸困难、胸痛、肺血管重建、右心室肥大和肺纤维化)的严重程度的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的GDF/BMP拮抗剂或GDF/BMP拮抗剂的组合。在某些优选实施方案中，本文描述的方法涉及具有肺动脉高压的患者。在一些实施方案中，本文所述的方法涉及具有至少25 mm Hg(例如，至少25、30、35、40、45或50 mm Hg)的静息肺动脉压(PAP)的患者。在一些实施方案中，本文描述的方法降低具有肺高血压的患者中的PAP。例如，所述方法可以将具有肺高血压的患者中的PAP降低至少3 mmHg(例如，至少3、5、7、10、12、15、20或25 mm Hg)。在一些实施方案中，本文描述的方法降低具有肺高血压的患者中的肺血管阻力。在一些实施方案中，本文描述的方法增加具有肺高血压的患者中的肺毛细血管楔压。在一些实施方案中，本文描述的方法增加具有肺高血压的患者中的左心室舒张期末压。在一些实施方案中，本文描述的方法增加(改善)具有肺高血压的患者中的运动能力(能力、耐性)。例如，所述方法可以增加具有肺高血压的患者中的6-分钟步行距离，任选地将6-分钟步行距离增加至少10米(例如，至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多米)。此外，所述方法可以降低患者的Borg呼吸困难指数(BDI)，其任选地可以在6-分钟步行测试之后评估。在一些实施方案中，所述方法将患者的Borg呼吸困难指数(BDI)降低至少0.5个指数点(例如，至少0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10个指数点)。在一些实施方案中，本文所述的方法涉及具有如世界卫生组织所认可的I类、II类、III类或IV类肺高血压的患者。在一些实施方案中，本文所述的方法涉及延迟肺高血压的临床进展(恶化)(例如，如通过世界卫生组织标准所测量的进展)。在一些实施方案中，所述方法预防或延迟肺高血压类别进展(例如，预防或延迟从I类进展至II类，从II类进展至III类，或从III类进展至IV类肺高血压(如世界卫生组织所认可的))。在一些实施方案中，所述方法促进或增加肺高血压类别倒退(例如，促进或增加从IV类倒退至III类，从III类倒退至II类，或从II类倒退至I类肺高血压(如世界卫生组织所认可的))。在一些实施方案中，除了一种或多种GDF/BMP拮抗剂以外，向所述患者进一步施用一种或多种用于治疗肺高血压的支持疗法或活性剂。例如，还可以向所述患者施用一种或多种选自以下的支持疗法或活性剂：前列环素及其衍生物(例如，依前列醇、曲前列环素和伊洛前列素)；前列环素受体激动剂(例如，赛乐西帕)；内皮素受体拮抗剂(例如，西他生坦（thelin）、安立生坦、马西替坦和波生坦)；钙通道阻滞剂(例如，阿洛地平、地尔硫和硝苯地平；抗凝剂(例如，华法林)；利尿剂；氧气疗法；心房间隔切开术；肺动脉血栓动脉内膜切除术；磷酸二酯酶5型抑制剂(例如，西地那非和他达拉非)；可溶性鸟苷酸环化酶的活化剂(例如，cinaciguat和利奥西呱（riociguat）)；ASK-1抑制剂(例如，CIIA；SCH79797；GS-4997；MSC2032964A；3H-萘并[1,2,3-de]喹啉-2,7-二酮，NQDI-1；2-硫代-噻唑烷，5-溴-3-(4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基)-1,3-二氢-吲哚-2-酮)；NF-κB拮抗剂(例如，dh404、CDDO-环氧化物；2.2-二氟丙酰胺；C28咪唑(CDDO-Im)；2-氰基-3,12-二氧代齐墩果-1,9-二烯-28-酸(CDDO)；3-乙酰基齐墩果酸；3-三氟乙酰基齐墩果酸；28-甲基-3-乙酰基齐墩果烷；28-甲基-3-三氟乙酰基齐墩果烷；28-甲氧基齐墩果酸；SZC014；SCZ015；SZC017；齐墩果酸的加入聚乙二醇的衍生物；3-O-(β-D-吡喃葡糖基)齐墩果酸；3-O-[β-D-吡喃葡糖基-(1-->3)-β-D-吡喃葡糖基]齐墩果酸；3-O- [β-D-吡喃葡糖基-(1-->2)-β-D-吡喃葡糖基]齐墩果酸；3-O- [β-D-吡喃葡糖基-(1-->3)-β-D-吡喃葡糖基]齐墩果酸28-O-β-D-吡喃葡糖基酯；3-O-[β-D-吡喃葡糖基-(1-->2)-β-D-吡喃葡糖基]齐墩果酸28-O-β-D-吡喃葡糖基酯；3-O-[a-L-吡喃鼠李糖基-(1-->3)-β-D-吡喃葡糖醛酸基]齐墩果酸；3-O-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1-->3)-β-D-吡喃葡糖醛酸基]齐墩果酸28-O-β-D-吡喃葡糖基酯；28-O-β-D-吡喃葡糖基-齐墩果酸；3-O-β-D-吡喃葡糖基(1→3)-β-D-吡喃葡糖苷酸(CS1)；齐墩果酸3-O-β-D-吡喃葡糖基(1→3)-β-D-吡喃葡糖苷酸(CS2)；3,11-二氧代齐墩果-12-烯-28-酸甲酯(DIOXOL)；ZCVI₄-2；3-脱羟基-1,2,5-二唑并[3',4':2,3]齐墩果酸苄酯)；肺和/或心脏移植。在一些实施方案中，还可以向所述患者施用BMP9多肽。在一些实施方案中，所述BMP9多肽是成熟BMP9多肽。在一些实施方案中，所述BMP9多肽包含BMP9前域（prodomain）多肽。在一些实施方案中，所述BMF9多肽在药物制剂中施用，所述药物制剂任选地可包含BMP9前域多肽。在包含BMP9前域多肽的这种BMP9药物制剂中，所述BMP9多肽可以与BMP9前域多肽非共价缔合。在一些实施方案中，BMP9药物制剂基本上不含或不含BMP9前域多肽。在一些实施方案中，还可以向所述患者施用齐墩果酸或其衍生物。

在某些方面，待根据本文所述的方法和用途使用的GDF/BMP拮抗剂或拮抗剂的组合是至少抑制GDF11的药剂(例如，GDF11拮抗剂)。可以例如使用基于细胞的测定、包括本文所述的那些(例如，Smad信号传导报道分子测定)测定对GDF11抑制的影响。因此，在一些实施方案中，本公开内容的GDF/BMP拮抗剂或拮抗剂的组合可以结合至少GDF11。配体结合活性可以例如使用结合亲和力测定(包括本文所述的那些)来测定。在一些实施方案中，本公开内容的GDF/BMP拮抗剂或拮抗剂的组合以至少1 x 10^-7 M (例如，至少1 x 10^-8 M，至少1x 10^-9 M，至少1 x 10^-10 M，至少 1 x 10^-11 M，或至少1 x 10^-12 M)的K_D结合至少GDF11。如本文所述的，各种抑制GDF11的GDF/BMP拮抗剂可以根据本文所述的方法和用途使用，包括例如配体捕获物(例如，ActRII多肽、GDF捕获物、促滤泡素抑制素多肽、FLRG多肽和ALK4:ActRIIB异多聚体)、抗体、小分子、核苷酸序列及其组合。在某些实施方案中，抑制GDF11的GDF/BMP拮抗剂或拮抗剂的组合可以进一步抑制以下中的一种或多种：激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白AB、激活蛋白C、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白E、激活蛋白AE和/或激活蛋白BE)、GDF8、GDF3、BMP6、BMP15、BMP10、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7和一种或多种Smads (例如，Smads 2和3)。

在某些方面，待根据本文所述的方法和用途使用的GDF/BMP拮抗剂或拮抗剂的组合是至少抑制GDF8的药剂(例如，GDF8拮抗剂)。可以例如使用基于细胞的测定、包括本文所述的那些(例如，Smad信号传导报道分子测定)测定对GDF8抑制的影响。因此，在一些实施方案中，本公开内容的GDF/BMP拮抗剂或拮抗剂的组合可以结合至少GDF8。配体结合活性可以例如使用结合亲和力测定(包括本文所述的那些)来测定。在一些实施方案中，本公开内容的GDF/BMP拮抗剂或拮抗剂的组合以至少1 x 10^-7 M (例如，至少1 x 10^-8 M，至少1 x 10^-9M，至少1 x 10^-10 M，至少 1 x 10^-11 M，或至少1 x 10^-12 M)的K_D结合至少GDF8。如本文所述的，各种抑制GDF8的GDF/BMP拮抗剂可以根据本文所述的方法和用途使用，包括例如配体捕获物(例如，ActRII多肽、GDF捕获物、促滤泡素抑制素多肽、FLRG多肽和ALK4:ActRIIB异多聚体)、抗体、小分子、核苷酸序列及其组合。在某些实施方案中，抑制GDF8的GDF/BMP拮抗剂或拮抗剂的组合可以进一步抑制以下中的一种或多种：激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白AB、激活蛋白C、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白E、激活蛋白AE和/或激活蛋白BE)、GDF11、GDF3、BMP6、BMP15、BMP10、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7和一种或多种Smads (例如，Smads 2和3)。

在某些方面，待根据本文所述的方法和用途使用的GDF/BMP拮抗剂或拮抗剂的组合是至少抑制GDF3的药剂(例如，GDF3拮抗剂)。可以例如使用基于细胞的测定、包括本文所述的那些(例如，Smad信号传导报道分子测定)测定对GDF3抑制的影响。因此，在一些实施方案中，本公开内容的GDF/BMP拮抗剂或拮抗剂的组合可以结合至少GDF3。配体结合活性可以例如使用结合亲和力测定(包括本文所述的那些)来测定。在一些实施方案中，本公开内容的GDF/BMP拮抗剂或拮抗剂的组合以至少1 x 10^-7 M (例如，至少1 x 10^-8 M，至少1 x 10^-9M，至少1 x 10^-10 M，至少 1 x 10^-11 M，或至少1 x 10^-12 M)的K_D结合至少GDF3。如本文所述的，各种抑制GDF3的GDF/BMP拮抗剂可以根据本文所述的方法和用途使用，包括例如配体捕获物(例如，ActRII多肽、GDF捕获物、促滤泡素抑制素多肽、FLRG多肽和ALK4:ActRIIB异多聚体)、抗体、小分子、核苷酸序列及其组合。在某些实施方案中，抑制GDF3的GDF/BMP拮抗剂或拮抗剂的组合可以进一步抑制以下中的一种或多种：激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白AB、激活蛋白C、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白E、激活蛋白AE和/或激活蛋白BE)、GDF8、GDF11、BMP6、BMP15、BMP10、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7和一种或多种Smads (例如，Smads 2和3)。

在某些方面，待根据本文所述的方法和用途使用的GDF/BMP拮抗剂或拮抗剂的组合是至少抑制BMP6的药剂(例如，BMP6拮抗剂)。可以例如使用基于细胞的测定、包括本文所述的那些(例如，Smad信号传导报道分子测定)测定对BMP6抑制的影响。因此，在一些实施方案中，本公开内容的GDF/BMP拮抗剂或拮抗剂的组合可以结合至少BMP6。配体结合活性可以例如使用结合亲和力测定(包括本文所述的那些)来测定。在一些实施方案中，本公开内容的GDF/BMP拮抗剂或拮抗剂的组合以至少1 x 10^-7 M (例如，至少1 x 10^-8 M，至少1 x 10^-9M，至少1 x 10^-10 M，至少 1 x 10^-11 M，或至少1 x 10^-12 M)的K_D结合至少BMP6。如本文所述的，各种抑制BMP6的GDF/BMP拮抗剂可以根据本文所述的方法和用途使用，包括例如配体捕获物(例如，ActRII多肽、GDF捕获物、促滤泡素抑制素多肽、FLRG多肽和ALK4:ActRIIB异多聚体)、抗体、小分子、核苷酸序列及其组合。在某些实施方案中，抑制BMP6的GDF/BMP拮抗剂或拮抗剂的组合可以进一步抑制以下中的一种或多种：激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白AB、激活蛋白C、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白E、激活蛋白AE和/或激活蛋白BE)、GDF8、GDF3、GDF11、BMP15、BMP10、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7和一种或多种Smads (例如，Smads 2和3)。

在某些方面，待根据本文所述的方法和用途使用的GDF/BMP拮抗剂或拮抗剂的组合是至少抑制BMP15的药剂(例如，BMP15拮抗剂)。可以例如使用基于细胞的测定、包括本文所述的那些(例如，Smad信号传导报道分子测定)测定对BMP15抑制的影响。因此，在一些实施方案中，本公开内容的GDF/BMP拮抗剂或拮抗剂的组合可以结合至少BMP15。配体结合活性可以例如使用结合亲和力测定(包括本文所述的那些)来测定。在一些实施方案中，本公开内容的GDF/BMP拮抗剂或拮抗剂的组合以至少1 x 10^-7 M (例如，至少1 x 10^-8 M，至少1x 10^-9 M，至少1 x 10^-10 M，至少 1 x 10^-11 M，或至少1 x 10^-12 M)的K_D结合至少BMP15。如本文所述的，各种抑制BMP15的GDF/BMP拮抗剂可以根据本文所述的方法和用途使用，包括例如配体捕获物(例如，ActRII多肽、GDF捕获物、促滤泡素抑制素多肽、FLRG多肽和ALK4:ActRIIB异多聚体)、抗体、小分子、核苷酸序列及其组合。在某些实施方案中，抑制BMP15的GDF/BMP拮抗剂或拮抗剂的组合可以进一步抑制以下中的一种或多种：激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白AB、激活蛋白C、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白E、激活蛋白AE和/或激活蛋白BE)、GDF8、GDF3、GDF11、BMP6、BMP10、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7和一种或多种Smads (例如，Smads 2和3)。

在某些方面，待根据本文所述的方法和用途使用的GDF/BMP拮抗剂或拮抗剂的组合是至少抑制BMP10的药剂(例如，BMP10拮抗剂)。可以例如使用基于细胞的测定、包括本文所述的那些(例如，Smad信号传导报道分子测定)测定对BMP10抑制的影响。因此，在一些实施方案中，本公开内容的GDF/BMP拮抗剂或拮抗剂的组合可以结合至少BMP10。配体结合活性可以例如使用结合亲和力测定(包括本文所述的那些)来测定。在一些实施方案中，本公开内容的GDF/BMP拮抗剂或拮抗剂的组合以至少1 x 10^-7 M (例如，至少1 x 10^-8 M，至少1x 10^-9 M，至少1 x 10^-10 M，至少 1 x 10^-11 M，或至少1 x 10^-12 M)的K_D结合至少BMP10。如本文所述的，各种抑制BMP10的GDF/BMP拮抗剂可以根据本文所述的方法和用途使用，包括例如配体捕获物(例如，ActRII多肽、GDF捕获物、促滤泡素抑制素多肽和FLRG多肽和ALK4:ActRIIB异多聚体FLRG多肽)、抗体、小分子、核苷酸序列及其组合。在某些实施方案中，抑制BMP10的GDF/BMP拮抗剂或拮抗剂的组合可以进一步抑制以下中的一种或多种：激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白AB、激活蛋白C、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白E、激活蛋白AE和/或激活蛋白BE)、GDF8、GDF3、GDF11、BMP6、BMP15、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7和一种或多种Smads (例如，Smads 2和3)。

在某些方面，待根据本文所述的方法和用途使用的GDF/BMP拮抗剂或拮抗剂的组合是至少抑制激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白AB、激活蛋白C、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白E、激活蛋白AE和/或激活蛋白BE)的药剂(例如，激活蛋白拮抗剂)。可以例如使用基于细胞的测定、包括本文所述的那些(例如，Smad信号传导报道分子测定)测定对激活蛋白抑制的影响。因此，在一些实施方案中，本公开内容的GDF/BMP拮抗剂或拮抗剂的组合可以结合至少激活蛋白。配体结合活性可以例如使用结合亲和力测定(包括本文所述的那些)来测定。在一些实施方案中，本公开内容的GDF/BMP拮抗剂或拮抗剂的组合以至少1 x 10^-7 M (例如，至少1 x 10^-8 M，至少1 x 10^-9 M，至少1 x 10^-10 M，至少 1 x10^-11 M，或至少1 x 10^-12 M)的K_D结合至少激活蛋白。如本文所述的，各种抑制激活蛋白的GDF/BMP拮抗剂可以根据本文所述的方法和用途使用，包括例如配体捕获物(例如，ActRII多肽、GDF捕获物、促滤泡素抑制素多肽、FLRG多肽和ALK4:ActRIIB异多聚体)、抗体、小分子、核苷酸序列及其组合。在某些实施方案中，抑制激活蛋白的GDF/BMP拮抗剂或拮抗剂的组合可以进一步抑制以下中的一种或多种：BMP15、GDF8、GDF3、GDF11、BMP6、BMP10、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7和一种或多种Smads (例如，Smads 2和3)。在某些优选实施方案中，待根据本文所述的方法和用途使用的GDF/BMP拮抗剂或拮抗剂的组合是至少抑制激活蛋白B的药剂。在一些实施方案中，待根据本文所述的方法和用途使用的GDF/BMP拮抗剂或拮抗剂的组合基本上不结合激活蛋白A(例如，以高于1 x 10^-7 M的K_D结合激活蛋白A或具有相对适度的结合，例如，约1 x 10^-8 M或约1 x 10^-9 M)和/或抑制激活蛋白A活性。在某些优选实施方案中，待根据本文所述的方法和用途使用的GDF/BMP拮抗剂或拮抗剂的组合是至少抑制激活蛋白B、但基本上不结合激活蛋白A(例如，以高于1 x 10^-7 M的K_D结合激活蛋白A或具有相对适度的结合，例如，约1 x 10^-8 M或约1 x 10^-9 M)和/或抑制激活蛋白A活性的药剂。

在某些方面，待根据本文所述的方法和用途使用的GDF/BMP拮抗剂或拮抗剂的组合是至少抑制ActRII (例如，ActRIIA和/或ActRIIB)的药剂(例如，ActRII拮抗剂)。可以例如使用基于细胞的测定、包括本文所述的那些(例如，Smad信号传导报道分子测定)测定对ActRII抑制的影响。因此，在一些实施方案中，本公开内容的GDF/BMP拮抗剂或拮抗剂的组合可以结合至少ActRII。配体结合活性可以例如使用结合亲和力测定(包括本文所述的那些)来测定。在一些实施方案中，本公开内容的GDF/BMP拮抗剂或拮抗剂的组合以至少1 x10^-7 M (例如，至少1 x 10^-8 M，至少1 x 10^-9 M，至少1 x 10^-10 M，至少 1 x 10^-11 M，或至少1 x 10^-12 M)的K_D结合至少ActRII。如本文所述的，各种抑制ActRII的GDF/BMP拮抗剂可以根据本文所述的方法和用途使用，包括例如配体捕获物(例如，ActRII多肽、GDF捕获物、促滤泡素抑制素多肽、FLRG多肽和ALK4:ActRIIB异多聚体)、抗体、小分子、核苷酸序列及其组合。在某些实施方案中，抑制ActRII的GDF/BMP拮抗剂或拮抗剂的组合可以进一步抑制以下中的一种或多种：激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白AB、激活蛋白C、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白E、激活蛋白AE和/或激活蛋白BE)、GDF8、GDF3、GDF11、BMP6、BMP15、BMP10、ALK4、ALK5、ALK7和一种或多种Smads (例如，Smads 2和3)。

在某些方面，待根据本文所述的方法和用途使用的GDF/BMP拮抗剂或拮抗剂的组合是至少抑制ALK4的药剂(例如，ALK4拮抗剂)。可以例如使用基于细胞的测定、包括本文所述的那些(例如，Smad信号传导报道分子测定)测定对ALK4抑制的影响。因此，在一些实施方案中，本公开内容的GDF/BMP拮抗剂或拮抗剂的组合可以结合至少ALK4。配体结合活性可以例如使用结合亲和力测定(包括本文所述的那些)来测定。在一些实施方案中，本公开内容的GDF/BMP拮抗剂或拮抗剂的组合以至少1 x 10^-7 M (例如，至少1 x 10^-8 M，至少1 x 10^-9M，至少1 x 10^-10 M，至少 1 x 10^-11 M，或至少1 x 10^-12 M)的K_D结合至少ALK4。如本文所述的，各种抑制ALK4的GDF/BMP拮抗剂可以根据本文所述的方法和用途使用，包括例如配体捕获物(例如，ActRII多肽、GDF捕获物、促滤泡素抑制素多肽、FLRG多肽和ALK4:ActRIIB异多聚体)、抗体、小分子、核苷酸序列及其组合。在某些实施方案中，抑制ALK4的GDF/BMP拮抗剂或拮抗剂的组合可以进一步抑制以下中的一种或多种：激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白AB、激活蛋白C、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白E、激活蛋白AE和/或激活蛋白BE)、GDF8、GDF3、GDF11、BMP6、BMP15、BMP10、ActRIIA、ActRIIB、ALK5、ALK7和一种或多种Smads (例如，Smads 2和3)。

在某些方面，待根据本文所述的方法和用途使用的GDF/BMP拮抗剂或拮抗剂的组合是至少抑制ALK5的药剂(例如，ALK5拮抗剂)。可以例如使用基于细胞的测定、包括本文所述的那些(例如，Smad信号传导报道分子测定)测定对ALK5抑制的影响。因此，在一些实施方案中，本公开内容的GDF/BMP拮抗剂或拮抗剂的组合可以结合至少ALK5。配体结合活性可以例如使用结合亲和力测定(包括本文所述的那些)来测定。在一些实施方案中，本公开内容的GDF/BMP拮抗剂或拮抗剂的组合以至少1 x 10^-7 M (例如，至少1 x 10^-8 M，至少1 x 10^-9M，至少1 x 10^-10 M，至少 1 x 10^-11 M，或至少1 x 10^-12 M)的K_D结合至少ALK5。如本文所述的，各种抑制ALK5的GDF/BMP拮抗剂可以根据本文所述的方法和用途使用，包括例如配体捕获物(例如，ActRII多肽、GDF捕获物、促滤泡素抑制素多肽、FLRG多肽和ALK4:ActRIIB异多聚体)、抗体、小分子、核苷酸序列及其组合。在某些实施方案中，抑制ALK5的GDF/BMP拮抗剂或拮抗剂的组合可以进一步抑制以下中的一种或多种：激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白AB、激活蛋白C、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白E、激活蛋白AE和/或激活蛋白BE)、GDF8、GDF3、GDF11、BMP6、BMP15、BMP10、ActRIIA、ActRIIB、ALK7、ALK4和一种或多种Smads (例如，Smads 2和3)。

在某些方面，待根据本文所述的方法和用途使用的GDF/BMP拮抗剂或拮抗剂的组合是至少抑制ALK7的药剂(例如，ALK7拮抗剂)。可以例如使用基于细胞的测定、包括本文所述的那些(例如，Smad信号传导报道分子测定)测定对ALK7抑制的影响。因此，在一些实施方案中，本公开内容的GDF/BMP拮抗剂或拮抗剂的组合可以结合至少ALK7。配体结合活性可以例如使用结合亲和力测定(包括本文所述的那些)来测定。在一些实施方案中，本公开内容的GDF/BMP拮抗剂或拮抗剂的组合以至少1 x 10^-7 M (例如，至少1 x 10^-8 M，至少1 x 10^-9M，至少1 x 10^-10 M，至少 1 x 10^-11 M，或至少1 x 10^-12 M)的K_D结合至少ALK7。如本文所述的，各种抑制ALK7的GDF/BMP拮抗剂可以根据本文所述的方法和用途使用，包括例如配体捕获物(例如，ActRII多肽、GDF捕获物、促滤泡素抑制素多肽、FLRG多肽和ALK4:ActRIIB异多聚体)、抗体、小分子、核苷酸序列及其组合。在某些实施方案中，抑制ALK7的GDF/BMP拮抗剂或拮抗剂的组合可以进一步抑制以下中的一种或多种：激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白AB、激活蛋白C、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白E、激活蛋白AE和/或激活蛋白BE)、GDF8、GDF3、GDF11、BMP6、BMP15、BMP10、ActRIIA、ActRIIB、ALK5、ALK4和一种或多种Smads (例如，Smads 2和3)。

在某些方面，待根据本文所述的方法和用途使用的GDF/BMP拮抗剂或拮抗剂的组合是抑制至少一种或多种Smad蛋白(例如，Smads 2和3)的药剂。可以例如使用基于细胞的测定、包括本文所述的那些(例如，Smad信号传导报道分子测定)测定对Smad抑制的影响。因此，在一些实施方案中，本公开内容的GDF/BMP拮抗剂或拮抗剂的组合可以结合至少一种或多种Smad蛋白(例如，Smads 2和3)。配体结合活性可以例如使用结合亲和力测定(包括本文所述的那些)来测定。在一些实施方案中，本公开内容的GDF/BMP拮抗剂或拮抗剂的组合以至少1 x 10^-7 M (例如，至少1 x 10^-8 M，至少1 x 10^-9 M，至少1 x 10^-10 M，至少 1 x 10^-11M，或至少1 x 10^-12 M)的K_D结合至少一种或多种Smad蛋白(例如，Smads 2和3)。如本文所述的，各种抑制一种或多种Smad蛋白(例如，Smads 2和3)的GDF/BMP拮抗剂可以根据本文所述的方法和用途使用，包括例如配体捕获物(例如，ActRII多肽、GDF捕获物、促滤泡素抑制素多肽、FLRG多肽和ALK4:ActRIIB异多聚体)、抗体、小分子、核苷酸序列及其组合。在某些实施方案中，抑制一种或多种Smad蛋白(例如，Smads 2和3)的GDF/BMP拮抗剂或拮抗剂的组合可以进一步抑制以下中的一种或多种：激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白AB、激活蛋白C、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白E、激活蛋白AE和/或激活蛋白BE)、GDF8、GDF3、GDF11、BMP6、BMP15、BMP10、ActRIIA、ActRIIB、ALK5和ALK4。

在某些方面，待根据本文所述的方法和用途使用的GDF/BMP拮抗剂是ActRII多肽。术语“ActRII多肽”总起来说是指天然存在的ActRIIA和ActRIIB多肽以及其截短物（truncations）和变体，诸如本文所述的那些(例如，GDF捕获物多肽)。优选地，ActRII多肽包含ActRII多肽的配体结合结构域或其修饰(变体)形式，基本上由其组成或由其组成。例如，在一些实施方案中，ActRIIA多肽包含ActRIIA多肽的ActRIIA配体结合结构域(例如，ActRIIA细胞外结构域的一部分)，基本上由其组成或由其组成。类似地，ActRIIB多肽可以包含ActRIIB多肽的ActRIIB配体结合结构域(例如，ActRIIB细胞外结构域的一部分)，基本上由其组成或由其组成。优选地，待根据本文描述的方法使用的ActRII多肽是可溶性多肽。

在某些方面，本公开内容涉及包含ActRIIA多肽的组合物及其用途。例如，在一些实施方案中，本公开内容的ActRIIA多肽包含与SEQ ID NO: 9的氨基酸30-110的序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开内容的ActRIIA多肽包含与ActRIIA的部分具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列，所述ActRIIA的部分开始于对应于SEQ ID NO: 9的氨基酸21-30中任一个的残基(例如，开始于氨基酸21、22、23、24、25、26、27、28、29或30中任一个)且结束于对应于SEQ ID NO: 9的氨基酸110-135中任一个的位置(例如，结束于氨基酸110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134或135中任一个)。在其他实施方案中，ActRIIA多肽可以包含与SEQ ID NO: 9的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在其他实施方案中，ActRIIA多肽可以包含与SEQ ID NO: 10的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在甚至其他实施方案中，ActRIIA多肽可以包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在还有其他实施方案中，ActRIIA多肽可以包含与SEQ ID NO:32的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在还有甚至其他实施方案中，ActRIIA多肽可以包含与SEQ IDNO: 36的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。在还有甚至其他实施方案中，ActRIIA多肽可以包含与SEQ ID NO: 39的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。

在其他方面，本公开内容涉及包含ActRIIB多肽的组合物及其用途。例如，在一些实施方案中，本公开内容的ActRIIB多肽包含与SEQ ID NO: 1的氨基酸29-109的序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO: 1的氨基酸29-109的序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列，其中所述ActRIIB多肽在关于SEQ ID NO: 1的位置79处包含酸性氨基酸[天然存在的(E或D)或人工酸性氨基酸]。在其他实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ IDNO: 1的氨基酸25-131的序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQID NO: 1的氨基酸25-131的序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列，其中所述ActRIIB多肽在关于SEQ ID NO: 1的位置79处包含酸性氨基酸。在一些实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与如下序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列，所述如下序列开始于对应于SEQ ID NO: 1的氨基酸20、21、22、23、24、25、26、27、28或29中任一个的残基且结束于对应于SEQ ID NO: 1的氨基酸109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134中任一个的残基。在其他实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与如下序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列，所述如下序列开始于对应于SEQ ID NO: 1的氨基酸20、21、22、23、24、25、26、27、28或29中任一个的残基且结束于对应于SEQ ID NO: 1的氨基酸109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134中任一个的残基，其中所述ActRIIB多肽在关于SEQ ID NO: 1的位置79处包含酸性氨基酸。在其他实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO: 1的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO: 1的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列，其中所述ActRIIB多肽在关于SEQ ID NO: 1的位置79处包含酸性氨基酸。在甚至其他实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO: 2的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在其他实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO: 2的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列，其中所述ActRIIB多肽在关于SEQ ID NO: 1的位置79处包含酸性氨基酸。在还有其他实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO: 3的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在其他实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO: 3的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列，其中所述ActRIIB多肽在关于SEQ ID NO: 1的位置79处包含酸性氨基酸。在其他实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO: 4的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO: 4的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列，其中所述ActRIIB多肽在关于SEQ ID NO: 4的位置79处包含酸性氨基酸。在其他实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO: 5的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO: 5的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列，其中所述ActRIIB多肽在关于SEQ ID NO: 5的位置79处包含酸性氨基酸。在其他实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO: 6的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO: 6的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列，其中所述ActRIIB多肽在关于SEQ ID NO: 6的位置79处包含酸性氨基酸。在还有甚至其他实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO: 40的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在还有甚至其他实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO: 42的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在还有甚至其他实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO: 45的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在还有甚至其他实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO: 46的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO: 46的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列，其中所述ActRIIB多肽在关于SEQ ID NO: 1的位置79处包含酸性氨基酸。在还有甚至其他实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO: 47的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO: 47的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列，其中所述ActRIIB多肽在关于SEQ ID NO: 1的位置79处包含酸性氨基酸。在还有甚至其他实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO: 48的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO: 48的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列，其中所述ActRIIB多肽在关于SEQ ID NO: 1的位置79处包含酸性氨基酸。在还有甚至其他实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO: 69的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在还有甚至其他实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO: 74的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO: 74的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列，其中所述ActRIIB多肽在关于SEQ ID NO: 1的位置79处包含酸性氨基酸。在还有甚至其他实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO: 77的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO: 77的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列，其中所述ActRIIB多肽在关于SEQ ID NO: 1的位置79处包含酸性氨基酸。在还有甚至其他实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO: 78的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO: 78的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列，其中所述ActRIIB多肽在关于SEQ ID NO: 1的位置79处包含酸性氨基酸。在还有甚至其他实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO: 79的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO: 79的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列，其中所述ActRIIB多肽在关于SEQ IDNO: 1的位置79处包含酸性氨基酸。在某些实施方案中，待根据本文所述的方法和用途使用的ActRIIB多肽在对应于SEQ ID NO: 1的L79的位置处不包含酸性氨基酸。

如本文所述的，ActRII多肽、ALK4多肽及其变体(GDF捕获物)可以是同多聚体，例如同二聚体、同三聚体、同四聚体、同五聚体和更高级的同多聚体复合体。在某些优选实施方案中，ActRII多肽及其变体是同二聚体。在某些实施方案中，本文所述的ActRII多肽二聚体包含与第二ActRII多肽共价或非共价缔合的第一ActRII多肽，其中第一多肽包含ActRII结构域和相互作用对的第一成员(或第二成员)的氨基酸序列(例如，免疫球蛋白的恒定结构域)，且第二多肽包含ActRII多肽和相互作用对的第二成员(或第一成员)的氨基酸序列。

在某些方面，待根据本文所述的方法和用途使用的GDF/BMP拮抗剂是ALK4:ActRIIB异多聚体。如本文所述的，已发现ALK4:ActRIIB异二聚体蛋白复合体与相应的ActRIIB和ALK4同二聚体相比具有不同的配体-结合概况/选择性。具体而言，ALK4:ActRIIB异二聚体与任一同二聚体相比展示与激活蛋白B增强的结合，保留如用ActRIIB同二聚体所观察到的与激活蛋白A、GDF8和GDF11的强结合，且表现出与BMP9、BMP10和GDF3显著减少的结合。具体而言，BMP9展示低至无可观察到的对ALK4:ActRIIB异二聚体的亲和力，而该配体强烈结合ActRIIB同二聚体。与ActRIIB同二聚体一样，ALK4:ActRIIB异二聚体保留与BMP6的中等水平结合。参见图19。这些结果因此证明与ActRIIB同二聚体相比，ALK4:ActRIIB异二聚体是激活蛋白A、激活蛋白B、GDF8和GDF11的更有选择性的拮抗剂(抑制剂)。因此，在其中这种选择性拮抗作用有利的某些应用中，ALK4:ActRIIB异二聚体将比ActRIIB同二聚体更有用。实例包括治疗应用，其中期望保留激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白AB、激活蛋白AC)、GDF8和GDF11中的一种或多种的拮抗作用，但使BMP9、BMP10和GDF3中的一种或多种的拮抗作用最小化。此外，已显示ALK4:ActRIIB异二聚体治疗患者中的PAH。尽管不希望受特定作用机制束缚，但预期结合激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白AB和激活蛋白AC)、GDF8和/或GDF11中的至少一种或多种的ALK4:ActRIIB异多聚体以及其变体将是用于促进PAH患者中的有益效果的有用药剂。

因此，本公开内容提供了异多聚体复合体(异多聚体)，其包含至少一个ALK4多肽和至少一个ActRIIB多肽(ALK4:ActRIIB异多聚体)以及其用途。优选地，ALK4多肽包含ALK4受体的配体-结合结构域，例如，ALK4细胞外结构域的一部分。类似地，ActRIIB多肽通常包含ActRIIB受体的配体-结合结构域，例如，ActRIIB细胞外结构域的一部分。优选地，这种ALK4和ActRIIB多肽以及其所得异多聚体是可溶性的。

在某些方面，ALK4:ActRIIB异多聚体包含与SEQ ID NO: 100的氨基酸34-101具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在其他实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体包含与SEQ ID NO:101具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的ALK4氨基酸序列。在其他实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体包含与SEQ ID NO: 105具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的ALK4氨基酸序列。在其他实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体包含与SEQ ID NO: 122具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的ALK4氨基酸序列。在其他实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体包含与SEQ ID NO: 124具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的ALK4氨基酸序列。在其他实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体包含与SEQ ID NO: 116具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的ALK4氨基酸序列。在还有其他实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体包含与SEQ ID NO: 117具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的ALK4氨基酸序列。在其他实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体包含与SEQ ID NO:111具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的ALK4氨基酸序列。在还有其他实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体包含与SEQ ID NO: 113具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的ALK4氨基酸序列。

在某些方面，ALK4:ActRIIB异多聚体包含与SEQ ID NO: 1的氨基酸29-109具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的ActRIIB氨基酸序列。在其他实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体包含与SEQID NO: 2具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的ActRIIB氨基酸序列。在其他实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体包含与SEQ ID NO: 3具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的ActRIIB氨基酸序列。在其他实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体包含与SEQ ID NO: 5具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的ActRIIB氨基酸序列。在其他实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体包含与SEQ ID NO: 6具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的ActRIIB氨基酸序列。在其他实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体包含与SEQ ID NO: 118具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的ActRIIB氨基酸序列。在还有甚至其他实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体包含与SEQ ID NO: 120具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的ActRIIB氨基酸序列。在其他实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体包含与SEQ ID NO: 114具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的ActRIIB氨基酸序列。在其他实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体可以包含与SEQ ID NO: 115具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的ActRIIB氨基酸序列。在其他实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体包含与SEQ ID NO: 108具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的ActRIIB氨基酸序列。在其他实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体可以包含与SEQ ID NO: 110具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的ActRIIB氨基酸序列。在某些优选实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体不包含在对应于SEQ ID NO: 1的L79的位置处包含酸性氨基酸(例如，E或D)的ActRIIB多肽。

如本文所述的，ALK4:ActRIIB异多聚体结构包括例如，异二聚体、异三聚体、异四聚体、异五聚体和更高级异多聚体复合体。参见，例如，图21-23。在某些优选实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体是异二聚体。在某些方面，ALK4和/或ActRIIB多肽可以是融合蛋白。

在某些方面，ActRII多肽，ALK4多肽，包括其变体(例如，GDF捕获物)可以是融合蛋白。例如，在一些实施方案中，ActRII (或ALK4)多肽可以是包含ActRII (或ALK4)多肽结构域和一个或多个异源(非-ActRII)多肽结构域的融合蛋白。在一些实施方案中，ActRII (或ALK4)多肽可以是融合蛋白，其具有作为一个结构域的衍生自ActRII (或ALK4)多肽的氨基酸序列(例如，ActRII (或ALK4)受体的配体结合结构域或其变体)和一个或多个提供所期望的性质(诸如改善的药物代谢动力学、更容易的纯化、靶向特定组织等)的异源结构域。例如，融合蛋白的结构域可以增强体内稳定性、体内半衰期、摄取/施用、组织定位或分布、蛋白复合体的形成、融合蛋白的多聚化和/或纯化中的一种或多种。任选地，融合蛋白的ActRII (或ALK4)多肽结构域直接连接(融合)至一个或多个异源多肽结构域，或间插序列(诸如接头)，可以位于ActRII (或ALK4)多肽的氨基酸序列和一个或多个异源结构域的氨基酸序列之间。在某些实施方案中，ActRII (或ALK4)融合蛋白包含位于异源结构域和ActRII (或ALK4)结构域之间的相对非结构性接头。该非结构性接头可以对应于ActRII(或ALK4)的细胞外结构域的C-末端处的大致15个氨基酸的非结构性区域，或者其可以是3至15、20、30、50或更多相对不含二级结构的氨基酸的人工序列。接头可以富含甘氨酸和/或脯氨酸残基，并且可以例如含有苏氨酸/丝氨酸和甘氨酸的重复序列。接头的实例包括，但不限于，序列TGGG (SEQ ID NO: 23)、SGGG (SEQ ID NO: 24)、TGGGG (SEQ ID NO: 21)、SGGGG (SEQ ID NO: 22)、GGGGS (SEQ ID NO: 25)、GGGG (SEQ ID NO: 20)和GGG (SEQ IDNO: 19)。在一些实施方案中，ActRII (或ALK4)融合蛋白可以包含免疫球蛋白的恒定结构域，包括例如免疫球蛋白的Fc部分。例如，衍生自IgG (IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)、IgA (IgA1或IgA2)、IgE或IgM免疫球蛋白的Fc结构域的氨基酸序列。例如，免疫球蛋白结构域的Fc部分可以包含与SEQ ID NO: 14-18中任一个具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。这种免疫球蛋白结构域可以包含一种或多种氨基酸修饰(例如，缺失、添加和/或取代)，其赋予改变的Fc活性，例如，一种或多种Fc效应子功能的降低。在一些实施方案中，ActRII (或ALK4)融合蛋白包含如式A-B-C中所示的氨基酸序列。例如，B部分是N-和C-末端截短的ActRII (或ALK4)多肽，例如，如本文所述的。A和C部分可以独立地为零个、一个或多于一个氨基酸，且A和C部分两者对B都是异源的。A和/或C部分可以经由接头序列附着至B部分。在某些实施方案中，ActRII (或ALK4)融合蛋白包含前导序列。所述前导序列可以是天然ActRII (或ALK4)前导序列或异源前导序列。在某些实施方案中，所述前导序列是组织纤溶酶原激活物(TPA)前导序列(例如，SEQ ID NO: 34)。

ActRII多肽或ALK4多肽，包括其变体，可以包含纯化子序列，诸如附加表位、FLAG标记物、多组氨酸序列和GST融合物（fusion）。任选地，ActRII多肽或ALK4多肽包含一个或多个修饰的氨基酸残基，其选自：糖基化氨基酸、加入聚乙二醇的氨基酸、法呢基化氨基酸、乙酰化氨基酸、生物素化氨基酸和/或与脂质部分缀合的氨基酸。ActRII多肽和ALK4多肽可以包含至少一种N-连接的糖，且可以包括两种、三种或更多种N-连接的糖。这种多肽还可以包含O-连接的糖。通常，优选ActRII和ALK4多肽在哺乳动物细胞系中表达，所述哺乳动物细胞系合适地介导多肽的天然糖基化以减少患者中不利的免疫应答的可能性。ActRII和ALK4多肽可以在以适合于患者使用的方式将蛋白糖基化的多种细胞系(包括人工改造的昆虫或酵母细胞，和哺乳动物细胞如COS细胞、CHO细胞、HEK细胞和NSO细胞)中产生。在一些实施方案中，ActRII或ALK4多肽被糖基化且具有可获得自中国仓鼠卵巢细胞系的糖基化模式。在一些实施方案中，本公开内容的ActRII或ALK4多肽在哺乳动物(例如，小鼠或人)中表现出至少4、6、12、24、36、48或72小时的血清半衰期。任选地，ActRII或ALK4多肽在哺乳动物(例如，小鼠或人)中可以表现出至少6、8、10、12、14、20、25或30天的血清半衰期。

在某些方面，本公开内容提供了包含一种或多种本公开内容的GDF/BMP拮抗剂和药学上可接受的载体的药物制剂。药物制剂还可以包含一种或多种额外活性剂，诸如用于治疗肺高血压、特别是治疗或预防肺高血压的一种或多种并发症(例如，肺动脉中的平滑肌和/或内皮细胞增殖、肺动脉中的血管发生、呼吸困难、胸痛、肺血管重建、右心室肥大和肺纤维化)的化合物，包括例如血管扩张剂如前列环素、依前列醇和西地那非；内皮素受体拮抗剂诸如波生坦；钙通道阻滞剂如阿洛地平、地尔硫和硝苯地平；抗凝剂如华法林；利尿剂；BMP9多肽；BMP10多肽；甲基巴多索隆（bardoxolone methyl）；和齐墩果酸。通常，药物制剂优选地将是无致热原的(意味着无致热原至管理用于治疗用途的产品质量的规章需要的程度)。

在某些情况下，当将本公开内容的GDF/BMP拮抗剂或拮抗剂的组合施用于本文所述的病症或状况时，可期望监控在施用GDF/BMP拮抗剂期间对红细胞的作用，或确定或调整GDF/BMP拮抗剂的给药，以减少对红细胞的不期望的作用。例如，红细胞水平、血红蛋白水平或血细胞比容水平的增加可以引起血压的不期望的增加。

在某些方面，待根据本公开内容的方法和用途使用的GDF/BMP拮抗剂是抗体或抗体的组合。在一些实施方案中，所述抗体结合至少ActRII (ActRIIA和/或ActRIIB)。在某些实施方案中，结合ActRII的抗体抑制ActRII信号传导，任选地如在基于细胞的测定、诸如本文所述的那些中所测量的。在某些实施方案中，结合ActRII的抗体抑制一种或多种GDF/BMP配体、I型受体或共同受体与ActRII的结合。在某些实施方案中，结合ActRII的抗体抑制一种或多种选自以下的GDF/BMP配体与ActRII的结合：激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白E、激活蛋白AE和激活蛋白BE)、GDF8、GDF11、BMP6、BMP15、BMP10和GDF3。在一些实施方案中，所述抗体结合至少ALK4。在某些实施方案中，结合ALK4的抗体抑制ALK4信号传导，任选地如在基于细胞的测定、诸如本文所述的那些中所测量的。在某些实施方案中，结合ALK4的抗体抑制一种或多种GDF/BMP配体、II型受体或共同受体与ALK4的结合。在某些实施方案中，结合ALK4的抗体抑制一种或多种选自以下的GDF/BMP配体与ALK4的结合：激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白E、激活蛋白AE和激活蛋白BE)、GDF8、GDF11、BMP6、BMP15、BMP10和GDF3。在一些实施方案中，所述抗体结合至少ALK5。在某些实施方案中，结合ALK5的抗体抑制ALK5信号传导，任选地如在基于细胞的测定、诸如本文所述的那些中所测量的。在某些实施方案中，结合ALK5的抗体抑制一种或多种GDF/BMP配体、II型受体或共同受体与ALK5的结合。在某些实施方案中，结合ALK5的抗体抑制一种或多种选自以下的GDF/BMP配体与ALK5的结合：激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白E、激活蛋白AE和激活蛋白BE)、GDF8、GDF11、BMP6、BMP15、BMP10和GDF3。在一些实施方案中，所述抗体结合至少ALK7。在某些实施方案中，结合ALK7的抗体抑制ALK7信号传导，任选地如在基于细胞的测定、诸如本文所述的那些中所测量的。在某些实施方案中，结合ALK7的抗体抑制一种或多种GDF/BMP配体、II型受体或共同受体与ALK7的结合。在某些实施方案中，结合ALK7的抗体抑制一种或多种选自以下的GDF/BMP配体与ALK7的结合：激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白E、激活蛋白AE和激活蛋白BE)、GDF8、GDF11、BMP6、BMP15、BMP10和GDF3。在一些实施方案中，所述抗体结合至少GDF11。在某些实施方案中，结合GDF11的抗体抑制ActRII信号传导，任选地如在基于细胞的测定、诸如本文所述的那些中所测量的。在某些实施方案中，结合GDF11的抗体抑制GDF11-ActRII结合和/或GDF11-ALK结合(例如，GDF11-ALK4、GDF11-ALK5和/或GDF11-ALK7结合)。在一些实施方案中，所述抗体结合至少GDF8。在某些实施方案中，结合GDF8的抗体抑制ActRII信号传导，任选地如在基于细胞的测定、诸如本文所述的那些中所测量的。在某些实施方案中，结合GDF8的抗体抑制GDF8-ActRII结合和/或GDF8-ALK结合(例如，GDF8-ALK4、GDF8-ALK5和/或GDF8-ALK7结合)。在一些实施方案中，所述抗体结合至少BMP6。在某些实施方案中，结合BMP6的抗体抑制ActRII信号传导，任选地如在基于细胞的测定、诸如本文所述的那些中所测量的。在某些实施方案中，结合BMP6的抗体抑制BMP6-ActRII结合和/或BMP6-ALK结合(例如，BMP6-ALK4、BMP6-ALK5和/或BMP6-ALK7结合)。在一些实施方案中，所述抗体结合至少BMP15。在某些实施方案中，结合BMP15的抗体抑制ActRII信号传导，任选地如在基于细胞的测定、诸如本文所述的那些中所测量的。在某些实施方案中，结合BMP15的抗体抑制BMP15-ActRII结合和/或BMP15-ALK结合(例如，BMP15-ALK4、BMP15-ALK5和/或BMP15-ALK7结合)。在一些实施方案中，所述抗体结合至少GDF3。在某些实施方案中，结合GDF3的抗体抑制ActRII信号传导，任选地如在基于细胞的测定、诸如本文所述的那些中所测量的。在某些实施方案中，结合GDF3的抗体抑制GDF3-ActRII结合和/或GDF3-ALK结合(例如，GDF3-ALK4、GDF3-ALK5和/或GDF3-ALK7结合)。在一些实施方案中，所述抗体结合至少BMP10。在某些实施方案中，结合BMP10的抗体抑制ActRII信号传导，任选地如在基于细胞的测定、诸如本文所述的那些中所测量的。在某些实施方案中，结合BMP10的抗体抑制BMP10-ActRII结合和/或BMP10-ALK结合(例如，BMP10-ALK4、BMP10-ALK5和/或BMP10-ALK7结合)。在一些实施方案中，所述抗体结合激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白E、激活蛋白AE和激活蛋白BE)。在某些实施方案中，结合激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白E、激活蛋白AE和激活蛋白BE)的抗体抑制ActRII信号传导，任选地如在基于细胞的测定、诸如本文所述的那些中所测量的。在某些实施方案中，结合激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白E、激活蛋白AE和激活蛋白BE)的抗体抑制激活蛋白-ActRII结合和/或激活蛋白-ALK结合(例如，激活蛋白-ALK4、激活蛋白-ALK5和/或激活蛋白-ALK7结合)。在一些实施方案中，所述抗体结合激活蛋白B。在某些实施方案中，结合激活蛋白B的抗体抑制ActRII信号传导，任选地如在基于细胞的测定、诸如本文所述的那些中所测量的。在某些实施方案中，结合激活蛋白B的抗体抑制激活蛋白B-ActRII结合和/或激活蛋白B-ALK结合(例如，激活蛋白B-ALK4、激活蛋白B-ALK5和/或激活蛋白B-ALK7结合)。在一些实施方案中，所述抗体是多特异性抗体或多特异性抗体的组合，其结合ActRIIB、ActRIIA、ALK4、ALK5、ALK7、GDF11、GDF8、激活蛋白、BMP6、GDF3、BMP10和BMP15中的一种或多种。在某些方面，所述多特异性抗体或多特异性抗体的组合在基于细胞的测定中抑制以下中的一种或多种的信号传导：ActRIIB、GDF11、GDF8、激活蛋白、BMP6、GDF3、BMP10和BMP15。在一些实施方案中，抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一些实施方案中，所述抗体是单链抗体、F(ab’)₂片段、单链双抗体、串联单链Fv片段、串联单链双抗体或包含单链双抗体和免疫球蛋白重链恒定区的至少一部分的融合蛋白。

在某些方面，所述GDF/BMP拮抗剂是小分子抑制剂或小分子抑制剂的组合。在一些实施方案中，所述小分子抑制剂是至少ActRII(例如ActRIIA和/或ActRIIB)的抑制剂。在一些实施方案中，所述小分子抑制剂是至少ALK4的抑制剂。在一些实施方案中，所述小分子抑制剂是至少ALK5的抑制剂。在一些实施方案中，所述小分子抑制剂是至少ALK7的抑制剂。在一些实施方案中，所述小分子抑制剂是至少GDF11的抑制剂。在一些实施方案中，所述小分子抑制剂是至少GDF8的抑制剂。在一些实施方案中，所述小分子抑制剂是至少BMP6的抑制剂。在一些实施方案中，所述小分子抑制剂是至少BMP15的抑制剂。在一些实施方案中，所述小分子抑制剂是至少BMP10的抑制剂。在一些实施方案中，所述小分子抑制剂是至少GDF3的抑制剂。在一些实施方案中，所述小分子抑制剂是至少激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白E、激活蛋白AE和激活蛋白BE)的抑制剂。在一些实施方案中，所述小分子抑制剂是至少激活蛋白B的抑制剂。在一些实施方案中，所述小分子抑制剂是至少一种或多种Smad蛋白(例如，Smads 2和3)的抑制剂。

在某些方面，所述GDF/BMP拮抗剂是核酸抑制剂或核酸抑制剂的组合。在一些实施方案中，所述核酸抑制剂是至少ActRII(例如，ActRIIA和/或ActRIIB)的抑制剂。在一些实施方案中，所述核酸抑制剂是至少ALK4的抑制剂。在一些实施方案中，所述核酸抑制剂是至少ALK5的抑制剂。在一些实施方案中，所述核酸抑制剂是至少ALK7的抑制剂。在一些实施方案中，所述核酸抑制剂是至少GDF11的抑制剂。在一些实施方案中，所述核酸抑制剂是至少GDF8的抑制剂。在一些实施方案中，所述核酸抑制剂是至少BMP6的抑制剂。在一些实施方案中，所述核酸抑制剂是至少BMP15的抑制剂。在一些实施方案中，所述核酸抑制剂是至少BMP10的抑制剂。在一些实施方案中，所述核酸抑制剂是至少GDF3的抑制剂。在一些实施方案中，所述核酸抑制剂是至少激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白E、激活蛋白AE和激活蛋白BE)的抑制剂。在一些实施方案中，所述核酸抑制剂是至少激活蛋白B的抑制剂。在一些实施方案中，所述核酸抑制剂是至少一种或多种Smads (例如，Smads 2和3)的抑制剂。

在某些方面，所述GDF/BMP拮抗剂是促滤泡素抑制素多肽。在一些实施方案中，所述促滤泡素抑制素多肽包含与SEQ ID NO: 26的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述促滤泡素抑制素多肽包含与SEQ ID NO: 27的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述促滤泡素抑制素多肽包含与SEQ ID NO: 28的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述促滤泡素抑制素多肽包含与SEQ ID NO: 29的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述促滤泡素抑制素多肽包含与SEQ ID NO: 30的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。

在某些方面，所述GDF/BMP拮抗剂是FLRG多肽。在一些实施方案中，所述FLRG多肽包含与SEQ ID NO: 31的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。

附图简述

图1显示人ActRIIB (SEQ ID NO: 2)和人ActRIIA (SEQ ID NO: 10)的细胞外结构域的比对，其中基于多个ActRIIB和ActRIIA晶体结构的复合分析，本文推论直接接触配体的残基用方框表示。

图2显示各种脊椎动物ActRIIB蛋白(SEQ ID NO: 53-58)和人ActRIIA (SEQ IDNO: 59)的多重序列比对以及衍生自比对的共有ActRII序列(SEQ ID NO: 60)。

图3显示各种脊椎动物ActRIIA蛋白和人ActRIIA (SEQ ID NO: 61-68)的多重序列比对。

图4显示使用Clustal 2.1，来自人IgG同种型的Fc结构域的多重序列比对。铰链区通过虚下划线表示。双下划线表示在IgG1 Fc中人工改造以促进不对称的链配对的位置和关于其他同种型IgG2、IgG3和IgG4的相应位置的实例。

图5显示在CHO细胞中表达的ActRIIA-hFc的纯化。蛋白纯化为单一的、清晰的峰，如通过尺寸分析柱(上图)和考马斯染色的SDS-PAGE(下图)(左泳道：分子量标准；右泳道：ActRIIA-hFc)所显现的。

图6显示ActRIIA-hFc与激活蛋白(上图)和GDF-11(下图)的结合，如通过Biacore^TM测定所测量的。

图7显示ActRIIB(25-131)-hFc的完整、未加工的氨基酸序列(SEQ ID NO: 69)。TPA前导序列(残基1-22)和双截短的ActRIIB细胞外结构域(残基24-131，使用基于SEQ IDNO: 1中的天然序列的编号)各自加下划线。突出显示的是通过测序揭示为成熟融合蛋白的N-末端氨基酸的谷氨酸，其相对于SEQ ID NO: 1在位置25。

图8A和8B显示编码ActRIIB(25-131)-hFc的核苷酸序列(编码链显示在顶部，SEQID NO: 70，且互补序列（complement）显示在底部3’-5’，SEQ ID NO: 71)。编码TPA前导序列(核苷酸1-66)和ActRIIB细胞外结构域(核苷酸73-396)的序列加下划线。还显示ActRIIB(25-131)的相应氨基酸序列。

图9A和9B显示编码ActRIIB(25-131)-hFc的备择核苷酸序列(编码链显示在顶部，SEQ ID NO: 72，且互补序列显示在底部3’-5’，SEQ ID NO: 73)。该序列赋予最初转化体中的更高水平的蛋白表达，从而使细胞系开发成为更快速的过程。编码TPA前导序列(核苷酸1-66)和ActRIIB细胞外结构域(核苷酸73-396)的序列加下划线，且突出显示了ECD的野生型核苷酸序列中的取代(参见图8)。还显示ActRIIB (25-131)的相应氨基酸序列。

图10显示GDF捕获物ActRIIB(L79D 20-134)-hFc的完整氨基酸序列(SEQ ID NO:74)，包括TPA前导序列(双下划线)、ActRIIB细胞外结构域(SEQ ID NO: 1中的残基20-134；单下划线)和hFc结构域。天然序列中位置79处取代的天冬氨酸加双下划线且突出显示，通过测序揭示为成熟融合蛋白中的N-末端残基的甘氨酸也这样。

图11A和11B显示编码ActRIIB(L79D 20-134)-hFc的核苷酸序列。SEQ ID NO: 75对应于有义链，且SEQ ID NO: 76对应于反义链。TPA前导序列(核苷酸1-66)加双下划线，且ActRIIB细胞外结构域(核苷酸76-420)加单下划线。

图12显示截短的GDF捕获物ActRIIB(L79D 25-131)-hFc的完整氨基酸序列(SEQID NO: 77)，包括TPA前导序列(双下划线)、截短的ActRIIB细胞外结构域(SEQ ID NO: 1中的残基25-131；单下划线)和hFc结构域。天然序列中位置79处取代的天冬氨酸加双下划线且突出显示，通过测序揭示为成熟融合蛋白中的N-末端残基的谷氨酸也这样。

图13显示没有前导序列的截短的GDF捕获物ActRIIB(L79D 25-131)-hFc的氨基酸序列(SEQ ID NO: 78)。截短的ActRIIB细胞外结构域(SEQ ID NO: 1中的残基25-131)加下划线。天然序列中位置79处取代的天冬氨酸加双下划线且突出显示，通过测序揭示为成熟融合蛋白中的N-末端残基的谷氨酸也这样。

图14显示没有前导序列、hFc结构域和接头的截短的GDF捕获物ActRIIB(L79D 25-131)的氨基酸序列(SEQ ID NO: 79)。天然序列中位置79处取代的天冬氨酸加下划线且突出显示，通过测序揭示为成熟融合蛋白中的N-末端残基的谷氨酸也这样。

图15A和15B显示编码ActRIIB(L79D 25-131)-hFc的核苷酸序列。SEQ ID NO: 80对应于有义链，且SEQ ID NO: 81对应于反义链。TPA前导序列(核苷酸1-66)加双下划线，且截短的ActRIIB细胞外结构域(核苷酸76-396)加单下划线。还显示ActRIIB细胞外结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 1中的残基25-131)。

图16A和16B显示编码ActRIIB(L79D 25-131)-hFc的备择核苷酸序列。SEQ ID NO:82对应于有义链，且SEQ ID NO: 83对应于反义链。TPA前导序列(核苷酸1-66)加双下划线，截短的ActRIIB细胞外结构域(核苷酸76-396)加下划线，且细胞外结构域的野生型核苷酸序列中的取代加双下划线且突出显示(与SEQ ID NO: 81相比，图15)。还显示ActRIIB细胞外结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 1中的残基25-131)。

图17显示图16中所示的备择核苷酸序列(SEQ ID NO: 82)的核苷酸76-396 (SEQID NO: 84)。图16中所示的相同核苷酸取代在此处也加下划线且突出显示。SEQ ID NO: 84仅编码具有L79D取代的截短的ActRIIB细胞外结构域(对应于SEQ ID NO: 1中的残基25-131)，例如ActRIIB(L79D 25-131)。

图18显示各种脊椎动物ALK4蛋白和人ALK4 (SEQ ID NO: 126-132)的多重序列比对。

图19显示ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚的蛋白复合体与ActRIIB-Fc同二聚体和ALK4-Fc同二聚体相比的比较配体结合数据。对于各蛋白复合体，配体根据k_off(与配体信号传导抑制良好相关的动力学常数)进行排列，且以结合亲和力递减顺序列出(最紧密结合的配体列于顶部)。在左侧，黄色、红色、绿色和蓝色线表示解离速率常数的量级。黑色实线表示与同二聚体相比，与异二聚体的结合增强或未改变的配体，而红色虚线表示与同二聚体相比，显著减少的结合。如所示的，ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体与任一同二聚体相比展示与激活蛋白B增强的结合，保留如用ActRIIB-Fc同二聚体所观察到的与激活蛋白A、GDF8和GDF11的强结合，且表现出与BMP9、BMP10和GDF3显著减少的结合。与ActRIIB-Fc同二聚体一样，异二聚体保留与BMP6的中等水平结合。

图20显示比较ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体/ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc同二聚体IC₅₀数据，如通过如本文所述的A-204报道基因测定所测定的。ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体与ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc同二聚体类似地抑制激活蛋白A、激活蛋白B、GDF8和GDF11信号传导途径。然而，与ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc同二聚体相比，BMP9和BMP10信号传导途径的ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体抑制显著降低。这些数据证明与相应的ActRIIB:ActRIIB同二聚体相比，ALK4:ActRIIB异二聚体是激活蛋白A、激活蛋白B、GDF8和GDF11的更有选择性的拮抗剂。

图21A和21B显示包含I型受体和II型受体多肽的异聚（heteromeric）蛋白复合体的两个示意性实例。图21A描述包含一个I型受体融合多肽和一个II型受体融合多肽的异二聚的蛋白复合体，其可以通过各多肽链内含有的多聚化结构域共价或非共价装配。两个装配的多聚化结构域构成相互作用对，其可以是指导的或未指导的。图21B描绘包含如图21A中所描绘的两个异二聚的复合体的异四聚的蛋白复合体。可以预见更高级的复合体。

图22显示异聚蛋白复合体的示意性实例，所述异聚蛋白复合体包含I型受体多肽(显示为“I”) (例如，与来自人或其他物种如本文所述的那些的ALK4蛋白的细胞外结构域具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、97%、98%、99%或100%同一性的多肽)和II型受体多肽(显示为“II”) (例如，与来自人或其他物种如本文所述的那些的ActRIIB蛋白的细胞外结构域具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、97%、98%、99%或100%同一性的多肽)。在举例说明的实施方案中，I型受体多肽是包含相互作用对的第一成员(“C₁”)的融合多肽的一部分，且II型受体多肽是包含相互作用对的第二成员(“C₂”)的融合多肽的一部分。在各融合多肽中，接头可以位于I型或II型受体多肽和相互作用对的相应成员之间。相互作用对的第一和第二成员可以是指导的(不对称的)对，从而意味着该对的成员优先与彼此缔合，而非自缔合，或相互作用对可以是未指导的，从而意味着该对的成员可以在没有显著的优先选择的情况下与彼此缔合或自缔合，且可以具有相同或不同的氨基酸序列。传统的Fc融合蛋白和抗体是未指导的相互作用对的实例，而多种人工改造的Fc结构域已被设计为指导的(不对称的)相互作用对[例如，Spiess等人 (2015)Molecular Immunology 67(2A): 95-106]。

图23A-23D显示异聚蛋白复合体的示意性实例，所述异聚蛋白复合体包含ALK4多肽(例如，与来自人或其他物种如本文所述的那些的ALK4蛋白的细胞外结构域具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、97%、98%、99%或100%同一性的多肽)和ActRIIB多肽(例如，与来自人或其他物种如本文所述的那些的ActRIIB蛋白的细胞外结构域具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、97%、98%、99%或100%同一性的多肽)。在举例说明的实施方案中，ALK4多肽是包含相互作用对的第一成员(“C₁”)的融合多肽的一部分，且ActRIIB多肽是包含相互作用对的第二成员(“C₂”)的融合多肽的一部分。合适的相互作用对包括例如，重链和/或轻链免疫球蛋白相互作用对、其截短物和变体，如本文所述的那些[例如，Spiess等人 (2015) Molecular Immunology 67(2A): 95-106]。在各融合多肽中，接头可以位于ALK4或ActRIIB多肽和相互作用对的相应成员之间。相互作用对的第一和第二成员可以是未指导的，从而意味着该对的成员可以在没有显著的优先选择的情况下与彼此缔合或自缔合，且它们可以具有相同的或不同的氨基酸序列。参见，图23A。另一方面，相互作用对可以是指导的(不对称的)对，从而意味着该对的成员优先与彼此缔合而不是自缔合。参见，图23B。可以预见更高级的复合体。参见图23C和23D。

发明详述

1. 综述

TGF-β超家族包含超过30种分泌的因子，包括TGF-β、激活蛋白、nodals、骨形态发生蛋白(BMP)、生长和分化因子(GDF)和抗-米勒激素（anti-Mullerian hormone）(AMH) [Weiss等人(2013) Developmental Biology，2(1): 47-63]。存在于脊椎动物和无脊椎动物两者中的该超家族的成员在各种各样的组织中遍在表达且在整个动物寿命期间的最早发育阶段期间发挥功能。实际上，TGF-β超家族蛋白是干细胞自我更新、原肠胚形成、分化、器官形态发生和成体组织体内稳态的关键介质。与这种遍在活性一致，异常的TGF-β超家族信号传导与广泛的人病理学(包括，例如，自身免疫性疾病、心血管疾病、纤维化疾病和癌症)相关。

TGF-β超家族的配体共有相同的二聚体结构，其中一种单体的中心3-1/2转角螺旋贴着由另一种单体的β-链形成的凹面堆积。大部分TGF-β家族成员通过分子间二硫键进一步稳定化。该二硫键横过由两个其他二硫键形成的环，从而产生所谓的‘半胱氨酸结（cysteine knot）’基序[Lin等人(2006) Reproduction 132: 179-190；和Hinck等人(2012) FEBS Letters 586: 1860-1870]。

TGF-β超家族信号传导由I型和II型丝氨酸/苏氨酸激酶受体的异聚复合体介导，在配体刺激时其磷酸化和活化下游SMAD蛋白(例如，SMAD蛋白1、2、3、5和8) [Massagué(2000) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1:169-178]。这些I型和II型受体是跨膜蛋白，由具有富含半胱氨酸的区域的配体-结合细胞外结构域、跨膜结构域和具有预期的丝氨酸/苏氨酸激酶特异性的胞质结构域构成。通常，I型受体介导细胞内信号传导，而II型受体是结合TGF-β超家族配体所必需的。在配体结合后I型和II受体形成稳定的复合体，从而导致I型受体被II型受体磷酸化。

基于它们结合的I型受体和它们活化的Smad蛋白，TGF-β家族可分为两个系统发生分支。一个是较近进化的分支，其包括例如，TGF-β、激活蛋白、GDF8、GDF9、GDF11、BMP3和nodal，其通过活化Smads 2和3的I型受体进行信号传导[Hinck (2012) FEBS Letters586:1860-1870]。另一分支包括较远相关的超家族蛋白，且包括例如，BMP2、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP8b、BMP9、BMP10、GDF1、GDF5、GDF6和GDF7，其通过Smads 1、5和8进行信号传导。

激活蛋白是TGF-β超家族的成员，并且最初作为促卵泡激素分泌的调节物发现，但随后已表征了各种生殖和非-生殖作用。有三种主要的激活蛋白形式(A、B和AB)，其是两个紧密相关的β亚基的同/异二聚体(分别为β_Aβ_A、β_Bβ_B和β_Aβ_B)。人基因组还编码激活蛋白C和激活蛋白E，其主要在肝中表达，且含有β_C或β_E的异二聚体形式也是已知的。在TGF-β超家族中，激活蛋白是独特和多功能的因子，其可在卵巢和胎盘细胞中刺激激素产生，支持神经元细胞存活，取决于细胞类型正面或负面影响细胞周期进展，且至少在两栖动物胚胎中诱导中胚层分化[DePaolo等人(1991) Proc Soc Ep Biol Med. 198:500-512; Dyson等人(1997)Curr Biol. 7:81-84;和Woodruff (1998) Biochem Pharmacol. 55:953-963]。在几种组织中，激活蛋白信号传导被其相关的异二聚体抑制素拮抗。例如，在促卵泡激素(FSH)从垂体分泌的调节中，激活蛋白促进FSH合成和分泌，而抑制素减少FSH合成和分泌。可调节激活蛋白生物活性和/或结合激活蛋白的其他蛋白包括促滤泡素抑制素(FS)、促滤泡素抑制素-相关蛋白(FSRP，也称为FLRG或FSTL3)和α₂-巨球蛋白。

如本文所述的，结合“激活蛋白A”的试剂是特异性结合β_A亚基的试剂，无论是在分离的β_A亚基的情况下还是作为二聚的复合体(例如，β_Aβ_A同二聚体或β_Aβ_B异二聚体)。在异二聚体复合体(例如，β_Aβ_B异二聚体)的情况下，结合“激活蛋白A”的试剂对β_A亚基内存在的表位是特异性的，但不结合复合体的非-β_A亚基(例如，复合体的β_B亚基)内存在的表位。类似地，本文公开的拮抗(抑制) “激活蛋白A”的试剂是抑制由β_A亚基介导的一种或多种活性的试剂，无论是在分离的β_A亚基的情况下还是作为二聚的复合体(例如，β_Aβ_A同二聚体或β_Aβ_B异二聚体)。在β_Aβ_B异二聚体的情况下，抑制“激活蛋白A”的试剂是特异性抑制β_A亚基的一种或多种活性，但不抑制复合体的非-β_A亚基(例如，复合体的β_B亚基)的活性的试剂。这个原理也适用于结合和/或抑制“激活蛋白B”、“激活蛋白C”和“激活蛋白E”的试剂。本文公开的拮抗“激活蛋白AB”的试剂是抑制由β_A亚基介导的一种或多种活性和由β_B亚基介导的一种或多种活性的试剂。

BMP和GDF合起来形成半胱氨酸-结细胞因子的家族，其共有TGF-β超家族的特征性折叠[Rider等人(2010) Biochem J.，429(1):1-12]。该家族包括例如，BMP2、BMP4、BMP6、BMP7、BMP2a、BMP3、BMP3b (也称为GDF10)、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8、BMP8a、BMP8b、BMP9(也称为GDF2)、BMP10、BMP11 (也称为GDF11)、BMP12 (也称为GDF7)、BMP13 (也称为GDF6)、BMP14 (也称为GDF5)、BMP15、GDF1、GDF3 (也称为VGR2)、GDF8 (也称为肌肉生长抑制素（myostatin）)、GDF9、GDF15和decapentaplegic。除了诱导骨形成的能力(这给予了其BMP名称)之外，BMP/GDF还展示在广泛的组织的发育中的形态发生活性。BMP/GDF同和异二聚体与I型和II型受体二聚体的组合相互作用，以产生多种可能的信号传导复合体，从而导致两个竞争性的SMAD转录因子组之一的活化。BMP/GDF具有高度特异性和局部化的功能。这些以许多方式受到调节，包括BMP/GDF表达的发育限制，和通过几种特定的BMP拮抗剂蛋白的分泌，所述蛋白以高亲和力结合所述细胞因子。奇怪的是，这些拮抗剂中的许多类似于TGF-β超家族配体。

生长和分化因子-8 (GDF8)也称为肌肉生长抑制素。GDF8是骨骼肌质量的负调节物，且在发育中的和成体骨骼肌中高度表达。在转基因小鼠中GDF8无效突变特征在于骨骼肌的显著肥大和增生[McPherron等人，Nature (1997) 387:83-90]。在家畜中以及引人注目地在人中，在天然存在的GDF8突变中骨骼肌质量的类似增加是明显的[Ashmore等人(1974) Growth，38:501-507; Swatland和Kieffer，J. Anim. Sci. (1994) 38:752-757;McPherron和Lee，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94:12457-12461; Kambadur等人，Genome Res. (1997) 7:910-915；和Schuelke等人(2004) N Engl J Med，350:2682-8]。研究也已经显示，在人中与HIV-感染相关的肌肉消瘦伴随有GDF8蛋白表达的增加[Gonzalez-Cadavid等人，PNAS (1998) 95:14938-43]。此外，GDF8可以调节肌肉-特异性的酶(例如，肌酸激酶)的产生和调节成肌细胞细胞增殖[国际专利申请公开号WO 00/43781]。GDF8前肽可非共价结合成熟的GDF8结构域二聚体，从而灭活其生物学活性[Miyazono等人(1988) J. Biol. Chem.，263: 6407-6415; Wakefield等人(1988) J. Biol. Chem.，263;7646-7654;和Brown等人(1990) Growth Factors，3: 35-43]。结合GDF8或结构相关蛋白且抑制它们的生物学活性的其他蛋白包括促滤泡素抑制素，和可能地，促滤泡素抑制素-相关蛋白[Gamer等人(1999) Dev. Biol.，208: 222-232]。

GDF11，也称为BMP11，是一种在小鼠发育期间在尾芽、肢芽、上颌和下颌弓和背根神经节中表达的分泌蛋白[McPherron等人(1999) Nat. Genet.，22: 260-264;和Nakashima等人(1999) Mech. Dev.，80: 185-189]。GDF11在中胚层和神经组织两者的图式发育（patterning）中起独特的作用[Gamer等人(1999) Dev Biol.，208:222-32]。GDF11已显示是在鸡肢体发育中软骨发生和肌发生的负调节物[Gamer等人(2001) Dev Biol.，229:407-20]。GDF11在肌肉中的表达也提示其以类似于GDF8的方式在调节肌肉生长中的作用。此外，GDF11在脑中的表达提示GDF11还可具有与神经系统的功能相关的活性。有趣的是，发现GDF11在嗅上皮中抑制神经发生[Wu等人(2003) Neuron.，37:197-207]。因此，GDF11可具有在治疗疾病如肌肉疾病和神经变性疾病(例如，肌萎缩性侧索硬化症)中的体外和体内应用。

如本文所证明的，可溶性ActR1IA多肽和ALK4:ActRIIB异二聚体(其均结合各种ActRIIA和ActRnB相互作用配体)在PAH模型中降低血压和心脏肥大中是有效的。尽管不希望受任何特定机制束缚，但预期这些药剂的作用主要由ActRIIA/B信号传导拮抗剂作用引起。无论机制如何，从本文呈现的数据显而易见的是，ActRIIA/B信号传导拮抗剂(GDF/BMP拮抗剂)的确降低血压、降低心脏肥大，并且在治疗肺高血压中具有其他积极作用。应当注意的是，血压和肥大是动态的，其变化取决于增加血压和肥大的因素以及降低血压和肥大的因素的平衡。可以通过增加降低血压和心脏肥大的因素、降低促进升高的血压和心脏肥大的因素或两者来降低血压和心脏肥大。术语降低血压或降低心脏肥大是指血压和心脏组织的可观察的实际变化，并且就变化发生的机制而论被规定为中性的。

用于本文所述的研究中的PAH的大鼠模型被认为预测在人中的功效，且因此，本公开内容提供了使用ActRIIA多肽、ALK4:ActRIIB异多聚体和其他GDF/BMP拮抗剂来治疗肺高血压(例如，PAH)、特别是治疗、预防或降低人中的肺高血压的一种或多种并发症的严重程度或持续时间的方法。如本文所公开的，术语GDF/BMP拮抗剂是指可用于拮抗ActRIIA/B信号传导的多种药剂，包括例如，抑制一种或多种ActRIIA/B配体[例如，激活蛋白(激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白AB、激活蛋白C、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白E、激活蛋白AE和/或激活蛋白BE)、GDF8、GDF11、GDF3、BMP6、BMP15、BMP10]的拮抗剂；抑制一种或多种I型和/或II型受体(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7和ALK5)的拮抗剂；和抑制一种或多种下游信号传导组分(例如，Smad蛋白，如Smads 2和3)的拮抗剂。待根据本公开内容的方法和用途使用的GDF/BMP拮抗剂包括多种形式，例如配体捕获物(例如，可溶性ActRIIA多肽、ActRIIB多肽、ALK4:ActRIIB异二聚体、促滤泡素抑制素多肽和FLRG多肽)，抗体拮抗剂(例如，抑制激活蛋白、GDF8、GDF11、GDF3、BMP6、BMP15、BMP10、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7和ALK5中的一种或多种的抗体)，小分子拮抗剂[例如，抑制激活蛋白、GDF8、GDF11、GDF3、BMP6、BMP15、BMP10、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7、ALK5和一种或多种Smad蛋白(例如，Smads 2和3)中的一种或多种的小分子]，和核苷酸拮抗剂[例如，抑制激活蛋白、GDF8、GDF11、GDF3、BMP6、BMP15、BMP10、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7、ALK5和一种或多种Smad蛋白(例如，Smads 2和3)中的一种或多种的核苷酸序列]。

在本公开内容的上下文中和在使用每个术语的特定上下文中，本说明书中使用的术语通常具有其在本领域中的普通含义。下文或说明书别处讨论了某些术语，以在描述本公开内容的组合物和方法和如何制备和使用它们方面，向实施者提供另外的指导。术语的任何使用的范围或含义将根据使用其的具体上下文而显而易见。

就其所有的语法形式和拼写变化形式而论的“同源的”是指两种蛋白之间的关系，所述蛋白具有“共同的进化来源”，包括来自相同的生物物种的超家族的蛋白，以及来自不同生物物种的同源蛋白。这种蛋白(和它们的编码核酸)具有序列同源性，如通过它们的序列相似性所反映的，无论是在百分比同一性方面，还是通过特定残基或基序和保守位置的存在。然而，在通常使用中和在本申请中，术语“同源的”当被副词诸如“高度地”修饰时，可以指序列相似性，且可能或可能不涉及共同的进化来源。

就其所有的语法形式而论的术语“序列相似性”是指核酸或氨基酸序列之间同一性或一致性的程度，所述序列可能或可能不共有共同的进化来源。

相对于参考多肽(或核苷酸)序列的“百分比(%)序列同一性”被定义为在比对序列和如果需要，引入缺口以实现最大百分比序列同一性，且不把任何保守取代看做序列同一性的一部分后，在候选序列中与在参考多肽(核苷酸)序列中氨基酸残基(或核酸)相同的氨基酸残基(或核酸)的百分数。为了确定百分比氨基酸序列同一性起见的比对可以以在本领域的技能范围内的各种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定合适的用于比对序列的参数，包括在所比较的序列的整个长度上实现最大比对所需的任何算法。然而，对本文来说，%氨基酸(核酸)序列同一性值使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech，Inc.设计，且源代码已同用户文件一道提交至U.S. Copyright Office，Washington D.C.，20559，在那里它注册为U.S. Copyright Registration No.TXU510087。ALIGN-2程序可公开获得自Genentech，Inc.，South San Francisco，Calif.，或可从源代码编译。ALIGN-2程序应经编译以在UNIX操作系统上使用，包括digital UNIXV4.0D。所有的序列比较参数由ALIGN-2程序设置，并且不改变。

就其所有语法形式而论的“激动”是指活化蛋白和/或基因(例如，通过活化或放大蛋白的基因表达或通过诱导失活的蛋白进入活性状态)或增加蛋白和/或基因的活性的过程。

就其所有语法形式而论的“拮抗”是指抑制蛋白和/或基因(例如，通过抑制或降低蛋白的基因表达或通过诱导活性蛋白进入失活状态)或降低蛋白和/或基因的活性的过程。

在整个说明书和权利要求书全文中结合数值使用的术语“约”和“近似”表示本领域技术人员熟悉和可接受的准确度的区间。通常，这种准确度区间是± 10%。另一方面和特别是在生物学系统中，术语“约”和“近似”可意指在给定值的一个数量级内的值，优选地≤5倍，和更优选地 ≤ 2倍。

本文公开的数值范围包括定义该范围的数字。

术语“一个/种(a)”和“一个/种(an)”包括复数对象，除非使用该术语的上下文明确地另外指明。术语“一个/种(a)”(或“一个/种(an)”)以及术语“一个/种或多个/种”和“至少一个/种”在本文中可互换使用。此外，本文使用的“和/或”应被认为具体公开了两个/种或更多个/种指定的特征或组分的每一个/种，含或不含另一个特征或组分。因此，在本文的短语如“A和/或B”中使用的术语“和/或”意图包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样地，在短语如“A、B和/或C”中使用的术语“和/或”意图包括以下方面的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A (单独)；B (单独)；和C (单独)。

在整个说明书中，词语“包含（comprise）”或变化形式如“包括（comprises）”或“含有（comprising）”将被理解为意思是包括所述的整体（integer）或整体组，但不排除任何其他整体或整体组。

2. ActRII多肽、ALK4多肽、ALK4:ActRIIB异多聚体及其变体

在某些方面，本公开内容涉及ActRII多肽及其用途(例如，治疗、预防或降低肺高血压或肺高血压的一种或多种并发症和/或间质性肺病(例如，特发性肺纤维化)的进展率和/或严重程度的用途)。如本文所用的，术语“ActRII”是指II型激活蛋白受体的家族。该家族包括激活蛋白受体IIA型(ActRIIA)和激活蛋白受体IIB型(ActRIIB)。

如本文所用的，术语“ActRIIB”是指来自任何物种的激活蛋白受体IIB型(ActRIIB)蛋白家族，和通过诱变或其他修饰衍生自这种ActRIIB蛋白的变体。本文提及ActRIIB应理解为提及任何一种目前鉴定的形式。ActRIIB家族的成员通常是跨膜蛋白，其由包含富含半胱氨酸的区域的配体-结合细胞外结构域、跨膜结构域和具有预测的丝氨酸/苏氨酸激酶活性的胞质结构域构成。

术语“ActRIIB多肽”包括包含ActRIIB家族成员的任何天然存在的多肽以及其保留有用活性的任何变体(包括突变体、片段、融合物和肽模拟物（peptidomimetic）形式)的多肽。这种变体ActRIIB多肽的实例在整个本公开内容中以及国际专利申请公开号WO2006/012627、WO 2008/097541、WO 2010/151426和WO 2011/020045(其整体引入本文作为参考)中提供。本文所述的所有ActRIIB-相关多肽的氨基酸编号基于下文提供的人ActRIIB前体蛋白序列(SEQ ID NO: 1)的编号，除非另外特别指出。

人ActRIIB前体蛋白序列如下：

信号肽用单下划线表示；细胞外结构域以粗体表示；且潜在的内源N-连接的糖基化位点用双下划线表示。

加工的(成熟)细胞外ActRIIB多肽序列如下：

。

在一些实施方案中，可以产生具有在N-端的“SGR…”序列的所述蛋白。细胞外结构域的C-端“尾”通过单下划线表示。“尾”缺失的序列(Δ15序列)如下：

。

在SEQ ID NO: 1的位置64处具有丙氨酸(A64)的ActRIIB的形式也报道于文献中。参见，例如，Hilden等人 (1994) Blood, 83(8): 2163-2170。申请人已经确定，包含具有A64取代的ActRIIB的细胞外结构域的ActRIIB-Fc融合蛋白具有对激活蛋白和GDF11相对低的亲和力。对比起来，在位置64处具有精氨酸(R64)的相同的ActRIIB-Fc融合蛋白具有对激活蛋白和GDF11的低纳摩尔至高皮摩尔范围的亲和力。因此，在本公开内容中，具有R64的序列用作人ActRIIB的“野生型”参考序列。

在位置64处具有丙氨酸的ActRIIB的形式如下：

信号肽通过单下划线表示，且细胞外结构域通过粗体表示。

备择的A64形式的加工的(成熟)细胞外ActRIIB多肽序列如下：

编码人ActRIIB前体蛋白的核酸序列在下文显示(SEQ ID NO: 7)，代表Genbank参考序列NM_001106.3的核苷酸25-1560，其编码ActRIIB前体的氨基酸1-513。所示的序列提供位置64处的精氨酸，且可经修饰以代之以提供丙氨酸。信号序列加下划线。

编码加工的细胞外人ActRIIB多肽的核酸序列如下(SEQ ID NO: 8)。所示的序列提供位置64处的精氨酸，且可被修饰以代之以提供丙氨酸。

人ActRIIB细胞外结构域和人ActRIIA细胞外结构域的氨基酸序列比对在图1中图解说明。该比对显示了两种受体内被认为直接接触ActRII配体的氨基酸残基。例如，复合ActRII结构表明ActRIIB-配体结合袋部分地由残基Y31、N33、N35、L38至T41、E47、E50、Q53至K55、L57、H58、Y60、S62、K74、W78至N83、Y85、R87、A92和E94至F101定义。在这些位置，预期保守突变将是耐受的。

此外，ActRIIB在脊椎动物中是充分保守的，其中一大段细胞外结构域完全保守。例如，图2描绘人ActRIIB细胞外结构域与各种ActRIIB直向同源物相比的多重序列比对。许多结合ActRIIB的配体也是高度保守的。因此，根据这些比对，可能预测配体-结合结构域内对于正常的ActRIIB-配体结合活性重要的关键氨基酸位置以及预测可能在不显著改变正常的ActRIIB-配体结合活性的情况下耐受取代的氨基酸位置。因此，根据本文公开的方法有用的活性的人ActRIIB变体多肽可以包括来自另一种脊椎动物ActRIIB的序列的相应位置的一个或多个氨基酸，或可以包括类似于人或其他脊椎动物序列中的残基。不意图进行限制，以下实例举例说明这种定义活性ActRIIB变体的方法。人细胞外结构域(SEQ ID NO:2)中的L46在非洲爪蟾属（Xenopus）ActRIIB (SEQ ID NO: 58)中是缬氨酸，因此该位置可被改变和任选地可被改变为另一疏水残基，如V、I或F或非极性残基如A。在人细胞外结构域中的E52在非洲爪蟾属中是K，从而表明该位点可耐受多种变化，包括极性残基如E、D、K、R、H、S、T、P、G、Y和可能A。在人细胞外结构域中的T93在非洲爪蟾属中是K，从而表明在该位置处广泛的结构变异是耐受的，其中极性残基是有利的，如S、K、R、E、D、H、G、P、G和Y。在人细胞外结构域中的F108在非洲爪蟾属中是Y，且因此Y或其他疏水基团，如I、V或L应是耐受的。在人细胞外结构域中的E111在非洲爪蟾属中是K，从而表明带电荷残基在该位置处将是耐受的，包括D、R、K和H，以及Q和N。在人细胞外结构域中的R112在非洲爪蟾属中是K，从而表明碱性残基在该位置处是耐受的，包括R和H。人细胞外结构域的位置119处的A相对地保守性差，且在啮齿类动物中作为P和在非洲爪蟾属中作为V出现，因此基本上任何氨基酸在该位置处都应该是耐受的。

此外，在结构和功能特征方面，特别是关于配体结合，ActRII蛋白已在本领域中被表征[Attisano等人(1992) Cell 68(1):97-108；Greenwald等人(1999) NatureStructural Biology 6(1): 18-22；Allendorph等人(2006) PNAS 103(20: 7643-7648；Thompson等人(2003) The EMBO Journal 22(7): 1555-1566;以及美国专利号: 7,709,605、7,612,041和7,842,663]。除了本文的教导之外，这些参考文献对于如何生成保留一种或多种正常活性(例如，配体-结合活性)的ActRIIB变体提供了充足的指导。

例如，称为三指毒素折叠的限定性结构基序对于通过I型和II型受体的配体结合是重要的且通过位于各单体受体的细胞外结构域内的不同位置处的保守半胱氨酸残基形成[Greenwald等人 (1999) Nat Struct Biol 6:18-22; 和Hinck (2012) FEBS Lett586:1860-1870]。因此，由这些保守半胱氨酸的最外端所划界的人ActRIIB的核心配体-结合结构域对应于SEQ ID NO: 1(ActRIIB前体)的位置29-109。侧接这些半胱氨酸-划界的核心序列的结构较不有序的氨基酸可以在N-末端截短1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28个残基和/或在C-末端截短1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个残基，而不必定改变配体结合。N-末端和/或C-末端截短的示例性ActRIIB细胞外结构域包括SEQ ID NO: 2、3、5和6。

Attisano等人显示ActRIIB的细胞外结构域的C-末端的脯氨酸结的缺失减少受体对激活蛋白的亲和力。相对于包含脯氨酸结区域和完整的近膜结构域的ActRIIB(20-134)-Fc，包含本发明的SEQ ID NO: 1的氨基酸20-119的ActRIIB-Fc融合蛋白，“ActRIIB(20-119)-Fc”，具有减少的对DF11和激活蛋白的结合(参见，例如，美国专利号7,842,663)。然而，相对于野生型，ActRIIB(20-129)-Fc蛋白保留类似的但稍微减少的活性，即使脯氨酸结区域被破坏。

因此，在氨基酸134、133、132、131、130和129处终止(相对于SEQ ID NO: 1)的ActRIIB细胞外结构域全部预期是有活性的，但在134或133处终止的构建体可最具有活性。类似地，残基129-134的任一个处的突变(相对于SEQ ID NO: 1)不预期大幅度改变配体-结合亲和力。为支持此观点，本领域已知P129和P130的突变(相对于SEQ ID NO: 1)不显著降低配体结合。因此，本公开内容的ActRIIB多肽可早在氨基酸109 (最后一个半胱氨酸)处终止，然而，在109和119处或其之间(例如，109、110、111、112、113、114、115、116、117、118或119)终止的形式预期具有减少的配体结合。氨基酸119 (相对于本发明的SEQ ID NO: 1)保守性差，且因此容易被改变或截短。在128 (相对于SEQ ID NO: 1)处或更后终止的ActRIIB多肽应保留配体-结合活性。相对于SEQ ID NO: 1在119和127处或其之间(例如，119、120、121、122、123、124、125、126或127)终止的ActRIIB多肽将具有中等结合能力。取决于临床或实验背景，任何这些形式对于使用都可能是期望的。

在ActRIIB的N-末端，预期在氨基酸29处或之前(相对于SEQ ID NO: 1)开始的蛋白将保留配体-结合活性。氨基酸29表示最初的半胱氨酸。位置24处 (相对于SEQ ID NO:1)的丙氨酸至天冬酰胺突变在基本上不影响配体结合的情况下引入N-连接的糖基化序列[美国专利号7,842,663]。这证实了信号切割肽和半胱氨酸交联区之间的区域(对应于氨基酸20-29)中的突变是良好耐受的。具体而言，在位置20、21、22、23和24 处(相对于SEQ IDNO: 1)开始的ActRIIB多肽应保留一般的配体-结合活性，且在位置25、26、27、28和29处(相对于SEQ ID NO: 1)开始的ActRIIB多肽也被预期保留配体-结合活性。已经证实，例如，美国专利号7,842,663，令人惊讶地，在22、23、24或25处开始的ActRIIB构建体将具有最大活性。

合起来，ActRIIB的活性部分(例如，配体-结合部分)的通式包含SEQ ID NO: 1的氨基酸29-109。因此，ActRIIB多肽可以例如包含与ActRIIB的部分具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成，所述ActRIIB的部分开始于对应于SEQ ID NO: 1的氨基酸20-29中任一个的残基(例如，开始于氨基酸20、21、22、23、24、25、26、27、28或29中任一个)且结束于对应于SEQ ID NO: 1的任一个氨基酸109-134的位置(例如，结束于氨基酸109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134中任一个)。其他实例包括这样的多肽，其开始于SEQ IDNO: 1的20-29 (例如，位置20、21、22、23、24、25、26、27、28或29中任一个)或21-29 (例如，位置21、22、23、24、25、26、27、28或29中任一个)的位置且结束于SEQ ID NO: 1的119-134(例如，位置119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134中任一个)、119-133 (例如，位置119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132或133中任一个)、129-134 (例如，位置129、130、131、132、133或134中任一个)或129-133 (例如，位置129、130、131、132或133中任一个)的位置。其他实例包括这样的构建体，其开始于SEQ ID NO: 1的20-24 (例如，位置20、21、22、23或24中任一个)、21-24 (例如，位置21、22、23或24中任一个)或22-25 (例如，位置22、22、23或25中任一个)的位置且结束于SEQ ID NO: 1的109-134 (例如，位置109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134中任一个)、119-134 (例如，位置119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134中任一个)或129-134 (例如，位置129、130、131、132、133或134中任一个)的位置。还预期在这些范围内的变体，特别是包含与SEQ ID NO: 1的相应部分具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的那些。

本文所述的变异可以以各种方式组合。在一些实施方案中，ActRIIB变体包含在配体-结合袋中仅仅1、2、5、6、7、8、9、10或15个保守氨基酸变化，任选地在配体-结合袋的位置40、53、55、74、79和/或82处的0、1或多个非保守改变。结合袋外的位点(在所述位点处变异性可特别良好耐受)包括细胞外结构域的氨基和羧基末端(如上文所指出的)，和位置42-46和65-73 (相对于SEQ ID NO: 1)。在位置65处的天冬酰胺至丙氨酸的改变(N65A)似乎不降低R64背景中的配体结合[美国专利号7,842,663]。这种改变可能消除A64背景中N65的糖基化，因此证明该区域中显著改变可能是耐受的。尽管R64A变化耐受性差，但R64K是良好耐受的，且因此另一碱性残基诸如H可在位置64处耐受[美国专利号7,842,663]。另外，本领域描述的诱变程序的结果表明，存在经常对于保守是有利的ActRIIB中的氨基酸位置。相对于SEQ ID NO: 1，这些包括位置80 (酸性或疏水氨基酸)、位置78 (疏水的，且特别是色氨酸)、位置37 (酸性的，且特别是天冬氨酸或谷氨酸)、位置56 (碱性氨基酸)、位置60 (疏水氨基酸，特别是苯丙氨酸或酪氨酸)。因此，本公开内容提供了在ActRIIB多肽中可能是保守的氨基酸构架。可能期望保守的其他位置如下：位置52 (酸性氨基酸)、位置55 (碱性氨基酸)、位置81 (酸性)、98 (极性或带电荷的，特别是E、D、R或K)，全部相对于SEQ ID NO: 1。

先前已经证明，将进一步的N-连接的糖基化位点(N-X-S/T)添加至ActRIIB细胞外结构域被良好耐受(参见，例如，美国专利号7,842,663)。因此，N-X-S/T序列通常可以在本公开内容的ActRIIB多肽中的图1中限定的配体结合袋外部的位置引入。用于引入非内源性N-X-S/T序列的特别合适的位点包括氨基酸20-29、20-24、22-25、109-134、120-134或129-134(相对于SEQ ID NO: 1)。还可以将N-X-S/T序列引入ActRIIB序列和Fc结构域或其他融合组分之间的接头中，以及任选地引入融合组分本身中。通过在就预先存在的S或T而言的正确位置引入N，或者通过在对应于预先存在的N的位置处引入S或T，可以以最小的努力引入这种位点。因此，将产生N-连接的糖基化位点的期望的改变是：A24N、R64N、S67N (可能与N65A改变组合)、E105N、R112N、G120N、E123N、P129N、A132N、R112S和R112T (相对于SEQ IDNO: 1)。由于糖基化提供的保护，任何预测被糖基化的S都可以在不产生免疫原性位点的情况下改变为T。同样地，预测被糖基化的任何T都可以改变为S。因此，预期改变S67T和S44T(相对于SEQ ID NO: 1)。同样地，在A24N变体中，可以使用S26T改变。因此，本公开内容的ActRIIB多肽可以是具有一个或多个如上所述的额外的非内源性N-连接的糖基化共有序列的变体。

在某些实施方案中，本公开内容涉及包含ActRIIB多肽(其包括其片段、功能变体和修饰形式)的GDF/BMP拮抗剂(抑制剂)以及其用途(例如，治疗或预防PH或一种或多种PH-相关的并发症)。优选地，ActRIIB多肽是可溶性的(例如，包含ActRIIB的细胞外结构域)。在一些实施方案中，ActRIIB多肽拮抗一种或多种GDF/BMP配体[例如，GDF11、GDF8、激活蛋白(激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白AB、激活蛋白C、激活蛋白E) BMP6、GDF3、BMP15和BMP10]的活性(例如，Smad信号传导)。因此，在一些实施方案中，ActRIIB多肽结合一种或多种GDF/BMP配体[例如，GDF11、GDF8、激活蛋白(激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白AB、激活蛋白C、激活蛋白E) BMP6、GDF3、BMP15和BMP10]。在一些实施方案中，本公开内容的ActRIIB多肽包含与ActRIIB的部分具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成，所述ActRIIB的部分开始于对应于SEQ ID NO: 1的氨基酸20-29的残基(例如，开始于氨基酸20、21、22、23、24、25、26、27、28或29中任一个)和结束于对应于SEQ ID NO: 1的氨基酸109-134的位置(例如，结束于氨基酸109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134中任一个)。在一些实施方案中，ActRIIB多肽包含与SEQ ID NO: 1的氨基酸29-109具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列，由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，本公开内容的ActRIIB多肽包含与SEQ IDNO: 1的氨基酸29-109具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列，由其组成或基本上由其组成，其中对应于SEQ ID NO: 1的L79的位置是酸性氨基酸(天然存在的酸性氨基酸D和E或人工酸性氨基酸)。在某些实施方案中，本公开内容的ActRIIB多肽包含与SEQ ID NO: 1的氨基酸25-131具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列，由其组成或基本上由其组成。在某些实施方案中，本公开内容的ActRIIB多肽包含与SEQ ID NO: 1的氨基酸25-131具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列，由其组成或基本上由其组成，其中对应于SEQ ID NO: 1的L79的位置是酸性氨基酸。在一些实施方案中，本公开内容的ActRIIB多肽包含与SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、40、42、45、46、47、48、69、74、77、78、79、108、110、114、115、118和120中的任一个的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列，由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，本公开内容的ActRIIB多肽包含与SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、40、42、45、46、47、48、69、74、77、78、79、108、110、114、115、118和120中的任一个的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列，由其组成或基本上由其组成，其中对应于SEQ ID NO: 1的L79的位置是酸性氨基酸。在一些实施方案中，本公开内容的ActRIIB多肽包含至少一种ActRIIB多肽，由其组成，或基本上由其组成，其中对应于SEQ ID NO: 1的L79的位置不是酸性氨基酸(即，不是天然存在的酸性氨基酸D或E或人工酸性氨基酸残基)。

在某些实施方案中，本公开内容涉及ActRIIA多肽。如本文所用的，术语“ActRIIA”是指来自任何物种的激活蛋白受体IIA型(ActRIIA)蛋白家族，和通过诱变或其他修饰衍生自这种ActRIIA蛋白的变体。本文提及ActRIIA应理解为提及任何一种目前鉴定的形式。ActRIIA家族的成员通常是跨膜蛋白，其由包含富含半胱氨酸的区域的配体-结合细胞外结构域、跨膜结构域和具有预测的丝氨酸/苏氨酸激酶活性的胞质结构域构成。

术语“ActRIIA多肽”包括包含ActRIIA家族成员的任何天然存在的多肽以及其保留有用活性的任何变体(包括突变体、片段、融合物和肽模拟物形式)的多肽。这种变体ActRIIA多肽的实例在整个本公开内容以及国际专利申请公开号WO 2006/012627和WO2007/062188(其整体引入本文作为参考)中提供。本文所述的所有ActRIIA-相关多肽的氨基酸编号基于下文提供的人ActRIIA前体蛋白序列(SEQ ID NO: 9)的编号，除非另外特别指出。

规范人ActRIIA前体蛋白序列如下：

信号肽通过单下划线表示；细胞外结构域以粗体表示；且潜在的内源N-连接的糖基化位点通过双下划线表示。

加工的(成熟)细胞外人ActRIIA多肽序列如下：

细胞外结构域的C-端“尾”通过单下划线表示。“尾”缺失的序列(Δ15序列)如下：

编码人ActRIIA前体蛋白的核酸序列在下文显示(SEQ ID NO: 12)，如下Genbank参考序列NM_001616.4的核苷酸159-1700所述。信号序列加下划线。

编码加工的可溶性(细胞外)人ActRIIA多肽的核酸序列如下：

ActRIIA在脊椎动物中是充分保守的，其中一大段细胞外结构域完全保守。例如，图3描绘人ActRIIA细胞外结构域与各种ActRIIA直向同源物相比的多重序列比对。许多结合ActRIIA的配体也是高度保守的。因此，根据这些比对，可能预测配体-结合结构域内对于正常的ActRIIA-配体结合活性重要的关键氨基酸位置以及预测可能在不显著改变正常的ActRIIA-配体结合活性的情况下耐受取代的氨基酸位置。因此，根据本文公开的方法有用的活性的人ActRIIA变体多肽可以包括来自另一种脊椎动物ActRIIA的序列的相应位置的一个或多个氨基酸，或可以包括类似于人或其他脊椎动物序列中的残基。

不意图进行限制，以下实例举例说明这种定义活性ActRIIA变体的方法。如图3中所举例说明的，人细胞外结构域中的F13在绵羊(Ovis aries)(SEQ ID NO: 62)、原鸡(Gallus gallus)(SEQ ID NO: 65)、牛(Bos Taurus)(SEQ ID NO: 66)、仓鸮(Tyto alba)(SEQ ID NO: 67)和大卫鼠耳蝠(Myotis davidii)(SEQ ID NO: 68) ActRIIA中是Y，从而表明在该位置的芳族残基是耐受的，包括F、W和Y。人细胞外结构域中的Q24在牛ActRIIA中是R，从而表明在该位置处带电荷的残基是耐受的，包括D、R、K、H和E。人细胞外结构域中的S95在原鸡和仓鸮ActRIIA中是F，从而表明该位点可耐受多种变化，包括极性残基，如E、D、K、R、H、S、T、P、G、Y和可能疏水残基如L、I或F。人细胞外结构域中的E52在绵羊ActRIIA中是D，从而表明在该位置处酸性残基是耐受的，包括D和E。人细胞外结构域中的P29相对地保守性差，在绵羊ActRIIA中作为S且在大卫鼠耳蝠ActRIIA中作为L出现，因此基本上任何氨基酸在该位置处都应该是耐受的。

此外，如上文所讨论的，在结构/功能特征方面，特别是关于配体结合，ActRII蛋白已在本领域中被表征[Attisano等人. (1992) Cell 68(1):97-108; Greenwald等人.(1999) Nature Structural Biology 6(1): 18-22; Allendorph等人. (2006) PNAS 103(20: 7643-7648; Thompson等人. (2003) The EMBO Journal 22(7): 1555-1566; 以及美国专利号：7,709,605、7,612,041和7,842,663]。除了本文的教导之外，这些参考文献对于如何生成保留一种或多种期望活性(例如，配体-结合活性)的ActRII变体提供了充足的指导。

例如，称为三指毒素折叠的限定性结构基序对于通过I型和II型受体的配体结合是重要的且通过位于各单体受体的细胞外结构域内的不同位置处的保守半胱氨酸残基形成[Greenwald等人 (1999) Nat Struct Biol 6:18-22;和Hinck (2012) FEBS Lett 586:1860-1870]。因此，由这些保守半胱氨酸的最外端所划界的人ActRIIA的核心配体-结合结构域对应于SEQ ID NO: 9(ActRIIA前体)的位置30-110。因此，侧接这些半胱氨酸-划界的核心序列的结构较不有序的氨基酸可以在N-末端截短约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个残基和在C-末端截短约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个残基，而不必定改变配体结合。示例性ActRIIA细胞外结构域截短物包括SEQ ID NO: 10和11。

因此，ActRIIA的活性部分(例如，配体结合)的通式是包含SEQ ID NO: 9的氨基酸30-110、基本上由其组成或由其组成的多肽。因此，ActRIIA多肽可以例如包含与ActRIIA的部分具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成，所述ActRIIA的部分开始于对应于SEQ ID NO: 9的氨基酸21-30中任一个的残基(例如，开始于氨基酸21、22、23、24、25、26、27、28、29或30中任一个)且结束于对应于SEQ ID NO: 9的氨基酸110-135中任一个的位置(例如，结束于氨基酸110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134或135中任一个)。其他实例包括这样的构建体，其开始于选自SEQ ID NO: 9的21-30(例如，开始于氨基酸21、22、23、24、25、26、27、28、29或30中任一个)、22-30 (例如，开始于氨基酸22、23、24、25、26、27、28、29或30中任一个)、23-30 (例如，开始于氨基酸23、24、25、26、27、28、29或30中任一个)、24-30(例如，开始于氨基酸24、25、26、27、28、29或30中任一个)的位置，且结束于选自SEQ ID NO:9的111-135 (例如，结束于氨基酸111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134或135中任一个)、112-135 (例如，结束于氨基酸112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134或135中任一个)、113-135 (例如，结束于氨基酸113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134或135中任一个)、120-135 (例如，结束于氨基酸120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134或135中任一个)、130-135 (例如，结束于氨基酸130、131、132、133、134或135中任一个)、111-134 (例如，结束于氨基酸110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134中任一个)、111-133 (例如，结束于氨基酸110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132或133中任一个)、111-132 (例如，结束于氨基酸110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131或132中任一个)或111-131 (例如，结束于氨基酸110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130或131)的位置。还预期在这些范围内的变体，特别是包含与SEQ ID NO: 9的相应部分具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的那些。因此，在一些实施方案中，ActRIIA多肽可以包含与SEQ ID NO: 9的氨基酸30-110具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的多肽，基本上由其组成或由其组成。任选地，ActRIIA多肽包含与SEQ ID NO: 9的氨基酸30-110具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性且在配体结合袋中包含仅仅1、2、5、10或15个保守氨基酸变化的多肽。

在某些实施方案中，本公开内容涉及包含ActRIIA多肽(其包括其片段、功能变体和修饰形式)的GDF/BMP拮抗剂(抑制剂)以及其用途(例如，增加有需要的患者中的免疫应答和治疗癌症)。优选地，ActRIIA多肽是可溶性的(例如，ActRIIA的细胞外结构域)。在一些实施方案中，ActRIIA多肽抑制一种或多种GDF/BMP配体[例如，GDF11、GDF8、激活蛋白(激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白AB、激活蛋白C、激活蛋白E) BMP6、GDF3、BMP15和/或BMP10]的(例如，Smad信号传导)。在一些实施方案中，ActRIIA多肽结合一种或多种GDF/BMP配体[例如，GDF11、GDF8、激活蛋白(激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白AB、激活蛋白C、激活蛋白E)BMP6、GDF3、BMP15和/或BMP10]。在一些实施方案中，本公开内容的ActRIIA多肽包含与ActRIIA的部分具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成，所述ActRIIA的部分开始于对应于SEQ ID NO: 9的氨基酸21-30的残基(例如，开始于氨基酸21、22、23、24、25、26、27、28、29或30中任一个)和结束于对应于SEQ ID NO: 9的任一氨基酸110-135的位置(例如，结束于氨基酸110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134或135中任一个)。在一些实施方案中，ActRIIA多肽包含与SEQ ID NO: 9的氨基酸30-110具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列，由其组成或基本上由其组成。在某些实施方案中，ActRIIA多肽包含与SEQ ID NO: 9的氨基酸21-135具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列，由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，ActRIIB多肽包含与SEQ ID NO: 9、10、11、32、36和39中任一个的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列，由其组成或基本上由其组成。

在某些方面，本公开内容涉及GDF捕获物多肽(也称为“GDF捕获物”)。在一些实施方案中，本公开内容的GDF捕获物是在ActRII多肽(例如，“野生型”或未修饰的ActRII多肽)的细胞外结构域(也称为配体结合结构域)中包含一个或多个突变(例如，氨基酸添加、缺失、取代和其组合)的变体ActRII多肽(例如，ActRIIA和ActRIIB多肽)，从而使得变体ActRII多肽与相应的野生型ActRII多肽相比具有一种或多种改变的配体结合活性。在优选实施方案中，本公开内容的GDF捕获物多肽保留至少一种与相应的野生型ActRII多肽类似的活性。例如，优选的GDF捕获物结合并抑制(例如拮抗)GDF11和/或GDF8的功能。在一些实施方案中，本公开内容的GDF捕获物进一步结合并抑制GDF/BMP的配体中的一种或多种。因此，本公开内容提供了对一种或多种ActRII配体具有改变的结合特异性的GDF捕获物多肽。

为了举例说明，可以选择一种或多种突变，其增加对GDF11和/或GDF8比起一种或多种ActRII结合配体如激活蛋白(激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白AB、激活蛋白C、和/或激活蛋白E)、特别是激活蛋白A来改变的配体结合结构域的选择性。任选地，改变的配体结合结构域对激活蛋白结合的K_d与对GDF11和/或GDF8结合的K_d的比率为野生型配体结合结构域的比率的至少2-、5-、10-、20、50-、100-或甚至1000-倍。任选地，改变的配体结合结构域对抑制激活蛋白的IC₅₀与对抑制GDF11和/或GDF8的IC₅₀的比率为野生型配体结合结构域的至少2-、5-、10-、20-、50-、100-或甚至1000-倍。任选地，改变的配体结合结构域抑制GDF11和/或GDF8的IC₅₀为抑制激活蛋白的IC₅₀的至多1/2、1/5、1/10、1/20、1/50、1/100或甚至1/1000。

ActRIIB蛋白的氨基酸残基(例如，相对于SEQ ID NO: 1的E39、K55、Y60、K74、W78、L79、D80和F101)在ActRIIB配体结合袋中且有助于介导与其配体(包括例如激活蛋白A、GDF11和GDF8)结合。因此，本公开内容提供了GDF捕获物多肽，其包含ActRIIB受体的改变的配体结合结构域(例如，GDF8/GDF11结合结构域)，其在那些氨基酸残基处包含一个或多个突变。

作为具体实例，ActRIIB的配体结合结构域的带正电荷的氨基酸残基Asp (D80)可以突变为不同的氨基酸残基，以产生优先结合GDF8而不是激活蛋白的GDF捕获物多肽。优选地，将相对于SEQ ID NO: 1的D80残基改变为选自以下的氨基酸残基：不带电荷的氨基酸残基、负氨基酸残基和疏水性氨基酸残基。作为进一步的具体实例，可以改变SEQ ID NO: 1的疏水残基L79以赋予改变的激活蛋白-GDF11/GDF8结合性质。例如，L79P取代比激活蛋白结合在更大程度上降低GDF11结合。相反，用酸性氨基酸[天冬氨酸或谷氨酸；L79D或L79E取代]置换L79 大大降低激活蛋白A结合亲和力，同时保留GDF11结合亲和力。在示例性实施方案中，本文所述的方法利用GDF捕获物多肽，其为在对应于SEQ ID NO: 1的位置79的位置处包含酸性氨基酸(例如，D或E)的变体ActRIIB多肽，其任选地与一个或多个额外氨基酸取代、添加或缺失组合。

在某些方面，本公开内容涉及ALK4多肽及其用途。如本文所用的，术语“ALK4”是指来自任何物种的激活蛋白受体样激酶-4蛋白的家族，和通过诱变或其他修饰衍生自这种ALK4蛋白的变体。本文提及ALK4应理解为提及任何一种目前鉴定的形式。ALK4家族的成员通常是跨膜蛋白，其由具有富含半胱氨酸的区域的配体-结合细胞外结构域、跨膜结构域和具有预测的丝氨酸/苏氨酸激酶活性的胞质结构域构成。

术语“ALK4多肽”包括包含ALK4家族成员的任何天然存在的多肽以及其保留有用活性的任何变体(包括突变体、片段、融合物和肽模拟物形式)的多肽。本文所述的所有ALK4-相关多肽的氨基酸编号基于下文的人ALK4前体蛋白序列(SEQ ID NO: 100)的编号，除非另外特别指出。

人ALK4前体蛋白序列(NCBI Ref Seq NP_004293)如下：

信号肽通过单下划线表示，且细胞外结构域以粗体表示。

加工的细胞外人ALK4多肽序列如下：

编码ALK4前体蛋白的核酸序列在下文显示(SEQ ID NO: 102)，对应于Genbank参考序列NM_004302.4的核苷酸78-1592。信号序列加下划线且细胞外结构域以粗体表示。

编码细胞外ALK4多肽的核酸序列如下：

人ALK4前体蛋白序列的备择同种型，同种型B (NCBI Ref Seq NP_064732.3)如下：

细胞外结构域以粗体表示。

加工的细胞外ALK4多肽序列如下：

编码ALK4前体蛋白(同种型B)的核酸序列在下文显示(SEQ ID NO: 106)，对应于Genbank参考序列NM_020327.3的核苷酸186-1547。编码细胞外结构域的核苷酸以粗体表示。

编码细胞外ALK4多肽(同种型B)的核酸序列如下：

ALK4在脊椎动物中是充分保守的，其中一大段细胞外结构域完全保守。例如，图18描绘人ALK4细胞外结构域与各种ALK4直向同源物相比的多重序列比对。许多结合ALK4的配体也是高度保守的。因此，根据这些比对，可能预测配体-结合结构域内对于正常的ALK4-配体结合活性重要的关键氨基酸位置以及预测可能在不显著改变正常的ALK4-配体结合活性的情况下耐受取代的氨基酸位置。因此，根据本文公开的方法有用的活性的人ALK4变体多肽可以包括来自另一种脊椎动物ALK4的序列的相应位置的一个或多个氨基酸，或可以包括类似于人或其他脊椎动物序列中的残基。

不意图进行限制，以下实例举例说明这种定义活性ALK4变体的方法。如图18中所举例说明的，人ALK4细胞外结构域(SEQ ID NO: 126)中的V6在小鼠（Mus muculus）ALK4(SEQ ID NO: 130)中是异亮氨酸，且因此该位置可以改变，且任选地可以改变为另一种疏水残基如L、I或F或非极性残基如A，如原鸡ALK4 (SEQ ID NO: 129)中所观察到的。人细胞外结构域中的E40在原鸡ALK4中是K，从而表明该位点可耐受多种变化，包括极性残基如E、D、K、R、H、S、T、P、G、Y和可能非极性残基如A。人细胞外结构域中的S15在原鸡ALK4中是D，从而表明在该位置处广泛的结构变化是耐受的，其中极性残基是有利的，如S、T、R、E、K、H、G、P、G和Y。人细胞外结构域中的E40在原鸡ALK4中是K，从而表明在该位置处带电荷的残基是耐受的，包括D、R、K、H以及Q和N。人细胞外结构域中的R80在星鼻鼹(Condylura cristata)ALK4 (SEQ ID NO: 127)中是K，从而表明在该位置处碱性残基是耐受的，包括R、K和H。人细胞外结构域中的Y77在野猪(Sus scrofa) ALK4 (SEQ ID NO: 131)中是F，从而表明在该位置处芳族残基是耐受的，包括F、W和Y。人细胞外结构域中的P93相对地保守性差，在刺猬(Erinaceus europaeus) ALK4 (SEQ ID NO: 128)中作为S且在原鸡ALK4中作为N出现，因此基本上任何氨基酸在该位置处都应该是耐受的。

此外，在结构和功能特征方面，特别是关于配体结合，ALK4蛋白已在本领域中被表征[例如，Harrison等人 (2003) J Biol Chem 278(23):21129-21135; Romano等人(2012) J Mol Model 18(8):3617-3625;和Calvanese等人 (2009) 15(3):175-183]。除了本文的教导之外，这些参考文献对于如何生成保留一种或多种正常活性(例如，配体-结合活性)的ALK4变体提供了充足的指导。

例如，称为三指毒素折叠的限定性结构基序对于通过I型和II型受体的配体结合是重要的且通过位于各单体受体的细胞外结构域内的不同位置处的保守半胱氨酸残基形成[Greenwald等人 (1999) Nat Struct Biol 6:18-22; 和Hinck (2012) FEBS Lett586:1860-1870]。因此，由这些保守半胱氨酸的最外端所划界的人ALK4的核心配体-结合结构域对应于SEQ ID NO: 100(ALK4前体)的位置34-101。侧接这些半胱氨酸-划界的核心序列的结构较不有序的氨基酸可以在N-末端截短1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33个残基和/或在C-末端截短1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个残基，而不必定改变配体结合。N-末端和/或C-末端截短的示例性ALK4细胞外结构域包括SEQ ID NO:101和105。

因此，ALK4的活性部分(例如，配体-结合部分)的通式包含相对于SEQ ID NO: 100的氨基酸34-101。因此，ALK4多肽可以例如包含与ALK4的部分具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成，所述ALK4的部分开始于对应于SEQ ID NO: 100的氨基酸24-34中任一个的残基(例如，开始于氨基酸24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34中任一个)且结束于对应于SEQ ID NO: 100的氨基酸101-126中任一个的位置(例如，结束于氨基酸101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125或126中任一个)。其他实例包括这样的构建体，其开始于SEQ ID NO: 100的24-34 (例如，位置24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34中任一个)、25-34 (例如，位置25、26、27、28、29、30、31、32、33或34中任一个)或26-34 (例如，位置26、27、28、29、30、31、32、33或34中任一个)的位置且结束于SEQ ID NO: 100的101-126 (例如，位置101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125或126中任一个)、102-126 (例如，位置102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125或126中任一个)、101-125 (例如，位置101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124或125中任一个)、101-124(例如，位置101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123或124中任一个)、101-121 (例如，位置101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120或121中任一个)、111-126 (例如，位置111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125或126中任一个)、111-125 (例如，位置111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124或125中任一个)、111-124 (例如，位置111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123或124中任一个)、121-126 (例如，位置121、122、123、124、125或126中任一个)、121-125 (例如，位置121、122、123、124或125中任一个)、121-124 (例如，位置121、122、123或124中任一个)或124-126 (例如，位置124、125或126中任一个)的位置。还预期在这些范围内的变体，特别是与SEQ ID NO: 100的相应部分具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的那些。

本文所述的变化可以以各种方式组合。在一些实施方案中，ALK4变体在配体-结合袋中包含仅仅1、2、5、6、7、8、9、10或15个保守氨基酸变化。结合袋外的位点(在所述位点处变异性可特别良好耐受)包括细胞外结构域的氨基和羧基末端(如上文所指出的)。

在某些实施方案中，本公开内容涉及作为包含至少一种ALK4多肽(其包括其片段、功能变体和修饰形式)的异多聚体的BMP/GDF拮抗剂以及其用途(例如，治疗、预防或降低PAH或PAH的一种或多种并发症的严重程度)。优选地，ALK4多肽是可溶性的(例如，ALK4的细胞外结构域)。在一些实施方案中，包含ALK4多肽的异多聚体抑制一种或多种TGFβ超家族配体[例如，GDF11、GDF8、激活蛋白(激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白AB、激活蛋白C、激活蛋白E) BMP6、GDF3、BMP10和/或BMP9]的(例如，Smad信号传导)。在一些实施方案中，包含ALK4多肽的异多聚体结合一种或多种TGFβ超家族配体[例如，GDF11、GDF8、激活蛋白(激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白AB、激活蛋白C、激活蛋白E) BMP6、GDF3、BMP10和/或BMP9]。在一些实施方案中，异多聚体包含至少一种ALK4多肽，所述ALK4多肽与相对于SEQ ID NO: 100的氨基酸34-101具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、97%、98%、99%、100%同一性。在一些实施方案中，异多聚体包含至少一种ALK4多肽，所述ALK4多肽与SEQ ID NO: 100、101、104、105、111、113、116、117、122和124的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、97%、98%、99%或100%同一性。在一些实施方案中，异多聚体包含至少一种ALK4多肽，所述ALK4多肽由至少一种与SEQID NO: 100、101、104、105、111、113、116、117、122和124的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、97%、98%、99%或100%同一性的ALK4多肽组成，或基本上由其组成。

在某些方面，本公开内容涉及包含一种或多种ALK4受体多肽(例如，SEQ ID NO:100、101、104、105、111、113、116、117、122和124及其变体)和一种或多种ActRIIB受体多肽(例如，SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、58、59、60、63、64、65、66、68、69、70、71、73、77、78、108、110、114、115、118和120和1及其变体)的异多聚体复合体，其在本文通常称为“ALK4:ActRIIB异多聚体复合体”或“ALK4:ActRIIB异多聚体”，包括其用途(例如，增加有需要的患者中的免疫应答和治疗癌症)。优选地，ALK4:ActRIIB异多聚体是可溶性的[例如，异多聚体复合体包含ALK4受体的可溶性部分(结构域)和ActRIIB受体的可溶性部分(结构域)]。通常，ALK4和ActRIIB的细胞外结构域对应于这些受体的可溶性部分。因此，在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体包含ALK4受体的细胞外结构域和ActRIIB受体的细胞外结构域。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体抑制一种或多种TGFβ超家族配体[例如，GDF11、GDF8、激活蛋白(激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白AB、激活蛋白C、激活蛋白E) BMP6、GDF3、BMP10和/或BMP9]的(例如，Smad信号传导)。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体结合一种或多种TGFβ超家族配体[例如，GDF11、GDF8、激活蛋白(激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白AB、激活蛋白C、激活蛋白E) BMP6、GDF3、BMP10和/或BMP9]。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体包含至少一种ALK4多肽，所述ALK4多肽包含与SEQ ID NO: 100、101、104、105、111、113、116、117、122和124的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94% 95%、97%、98%、99%或100%同一性的序列，基本上由其组成或由其组成。在一些实施方案中，本公开内容的ALK4:ActRIIB异多聚体复合体包含至少一种ALK4多肽，所述ALK4多肽包含与ALK4的部分具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、97%、98%、99%或100%同一性的序列，基本上由其组成，或由其组成，所述ALK4的部分开始于对应于SEQ ID NO: 100的氨基酸24-34、25-34或26-34中任一个的残基且结束于SEQ ID NO: 100的101-126、102-126、101-125、101-124、101-121、111-126、111-125、111-124、121-126、121-125、121-124或124-126的位置。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体包含至少一种ALK4多肽，所述ALK4多肽包含与相对于SEQ ID NO:100的氨基酸34-101具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、97%、98%、99%或100%同一性的序列，基本上由其组成或由其组成。在一些实施方案中，ALK4-ActRIIB异多聚体包含至少一种ActRIIB多肽，所述ActRIIB多肽包含与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、58、59、60、63、64、65、66、68、69、70、71、73、77、78、108、110、114、115、118和120中任一个的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、97%、98%、99%或100%同一性的序列，基本上由其组成或由其组成。在一些实施方案中，本公开内容的ALK4:ActRIIB异多聚体复合体包含至少一种ActRIIB多肽，所述ActRIIB多肽包含与ActRIIB的部分具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、97%、98%、99%或100%同一性的序列，基本上由其组成，或由其组成，所述ActRIIB的部分开始于对应于SEQ ID NO: 1的氨基酸20-29、20-24、21-24、22-25或21-29中任一个的残基且结束于SEQ ID NO: 1的109-134、119-134、119-133、129-134或129-133的位置。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体包含至少一种ActRIIB多肽，所述ActRIIB多肽包含与SEQ ID NO: 1的氨基酸29-109具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94% 95%、97%、98%、99%或100%同一性的序列，基本上由其组成或由其组成。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体包含至少一种ActRIIB多肽，所述ActRIIB多肽包含与SEQ ID NO: 1的氨基酸25-131具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94% 95%、97%、98%、99%或100%同一性的序列，基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，本公开内容的ALK4:ActRIIB异多聚体复合体包含至少一种ActRIIB多肽，其中对应于SEQ ID NO: 1的L79的位置不是酸性氨基酸(即，不是天然存在的D或E氨基酸残基或人工酸性氨基酸残基)。本公开内容的ALK4:ActRIIB异多聚体包括例如异二聚体、异三聚体、异四聚体和进一步更高级的寡聚体结构。参见，例如，图21-23。在某些优选实施方案中，本公开内容的异多聚体复合体是ALK4:ActRIIB异二聚体。

在一些实施方案中，本公开内容预期为了诸如增强治疗功效或稳定性(例如，贮存期限和对体内蛋白水解降解的抗性)的目的，通过修饰ActRII多肽和/或ALK4多肽的结构来制备功能变体。变体可通过氨基酸取代、缺失、添加或其组合产生。例如，合理的是预期用异亮氨酸或缬氨酸独立置换亮氨酸为、用谷氨酸独立置换天冬氨酸、用丝氨酸独立置换苏氨酸或用结构相关的氨基酸类似置换氨基酸(例如，保守突变)对所得分子的生物学活性将不具有较大影响。保守置换是在其侧链上相关的氨基酸家族内发生的那些。本公开内容的多肽的氨基酸序列中的变化是否导致功能同源物可通过评估变体多肽在细胞中以类似于野生型多肽的方式产生反应，或结合一种或多种TGF-β配体，包括例如BMP2、BMP2/7、BMP3、BMP4、BMP4/7、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP8b、BMP9、BMP10、GDF3、GDF5、GDF6/BMP13、GDF7、GDF8、GDF9b/BMP15、GDF11/BMP11、GDF15/MIC1、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC、nodal、神经胶质细胞衍生的神经营养因子(GDNF)、neurturin、artemin、persephin、MIS和Lefty的能力容易地确定。

在某些实施方案中，本公开内容预期ActRII和/或ALK4多肽的特定突变以便改变多肽的糖基化。这种突变可经选择，以便引入或消除一个或多个糖基化位点，如O-连接或N-连接的糖基化位点。天冬酰胺-连接的糖基化识别位点通常包含三肽序列，天冬酰胺-X-苏氨酸或天冬酰胺-X-丝氨酸(其中“X”是任何氨基酸)，其被合适的细胞糖基化酶特异性识别。还可通过添加一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基至多肽的序列或通过对多肽的序列取代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基进行改变(对于O-连接的糖基化位点)。糖基化识别位点的第一或第三氨基酸位置的一个或两个处的多种氨基酸取代或缺失(和/或第二位置处的氨基酸缺失)导致在修饰的三肽序列处非-糖基化。增加多肽上的碳水化合物部分的数目的另一种方式是通过糖苷化学或酶促偶联至多肽。取决于使用的偶联模式，糖可附着至(a) 精氨酸和组氨酸；(b) 游离的羧基；(c) 游离的巯基，如半胱氨酸的那些；(d) 游离的羟基，如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的那些；(e) 芳族残基，如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的那些；或(f) 谷氨酰胺的酰胺基。除去多肽上存在的一个或多个碳水化合物部分可经化学和/或酶促实现。化学去糖基化可包括例如，将多肽暴露于化合物三氟甲磺酸或等效的化合物。这种处理导致除了连接糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)之外的大部分或所有的糖切割，同时使氨基酸序列保持完整。多肽上碳水化合物部分的酶促切割可通过使用多种内切和外切糖苷酶实现，如Thotakura等人[Meth. Enzymol. (1987) 138:350]所述的。在合适的情况下，多肽的序列可依赖于使用的表达系统的类型进行调整，这是因为哺乳动物、酵母、昆虫和植物细胞都可引入可受所述肽的氨基酸序列影响的不同糖基化模式。通常，用于在人中使用的本公开内容的多肽可在提供正确糖基化的哺乳动物细胞系中表达，如HEK293或CHO细胞系，尽管其他哺乳动物表达细胞系预期也是有用的。

本公开内容进一步预期了产生ActRII和/或ALK4多肽的突变体、特别是组合突变体组，以及截短突变体的方法。组合突变体的库对于鉴定功能活性的(例如，GDF/BMP配体结合)ActRII序列尤其有用。筛选这种组合文库的目的可以是产生例如，具有改变的性质的多肽变体，如改变的药物代谢动力学或改变的配体结合。多种筛选测定在下文提供且这种测定可用于评价变体。例如，可筛选ActRII和/或ALK4变体和包含其的异多聚体结合一种或多种GDF/BMP配体(例如，BMP2、BMP2/7、BMP3、BMP4、BMP4/7、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP8b、BMP9、BMP10、GDF3、GDF5、GDF6/BMP13、GDF7、GDF8、GDF9b/BMP15、GDF11/BMP11、GDF15/MIC1、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白AB、激活蛋白AC、nodal、神经胶质细胞衍生的神经营养因子(GDNF)、neurturin、artemin、persephin、MIS和Lefty)以阻止GDF/BMP配体与ActRII和/或ALK4多肽以及其异多聚体的结合和/或干扰由GDF/BMP配体引起的信号传导的能力。

ActRII多肽、ALK4多肽和ALK4:ActRIIB异二聚体的活性也可在基于细胞的测定或体内测定中测试。例如，评估了ActRII多肽、ALK4多肽或ALK4:ActRIIB异二聚体对与PH发病机理有关的基因的表达的影响。在需要的情况下，这可在一种或多种重组配体蛋白(例如，BMP2、BMP2/7、BMP3、BMP4、BMP4/7、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP8b、BMP9、BMP10、GDF3、GDF5、GDF6/BMP13、GDF7、GDF8、GDF9b/BMP15、GDF11/BMP11、GDF15/MIC1、TGF-β1、TGF-β2、TGFβ3、激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC、nodal、神经胶质细胞衍生的神经营养因子(GDNF)、neurturin、artemin、persephin、MIS和Lefty)存在的情况下进行，且细胞可经转染，以便产生ActRII多肽、ALK4多肽或ALK4:ActRIIB异二聚体和任选地，GDF/BMP配体。同样地，ActRII多肽、ALK4多肽或ALK4:ActRIIB异二聚体可施用于小鼠或其他动物，并且可使用本领域公认的方法评估对PH发病机理的影响。类似地，ActRII多肽、ALK4多肽或ALK4:ActRIIB异二聚体或其变体的活性可在血细胞前体细胞中测试对这些细胞的生长的任何影响，例如，通过如本文所述的测定和本领域众所周知的那些。SMAD-响应报道基因可在这种细胞系中用于监控对下游信号传导的影响。

可产生组合衍生的变体，相对于参考ActRII多肽、ALK4多肽或ALK4:ActRIIB异二聚体，其具有增加的选择性或通常增加的效力。这种变体，当从重组DNA构建体表达时，可用于基因治疗规程中。同样地，诱变可产生变体，其具有显著不同于相应的未修饰的ActRII多肽、ALK4多肽或ALK4:ActRIIB异二聚体的细胞内半衰期。例如，可以使改变的蛋白变得对蛋白水解降解或导致未修饰多肽的破坏或以其他方式失活的其他细胞过程更稳定或较不稳定。这种变体和编码它们的基因可通过调节多肽的半衰期用于改变多肽复合体水平。例如，短的半衰期可产生更短暂的生物学作用，并且当诱导型表达系统的一部分时，可允许更紧密控制细胞内的重组多肽复合体水平。在Fc融合蛋白中，可在接头(如果有的话)和/或Fc部分中进行突变以改变ActRII多肽、ALK4多肽或ALK4:ActRIIB异二聚体的半衰期。

组合文库可通过编码多肽文库的简并基因文库产生，所述多肽各自至少包括潜在的ActRII多肽、ALK4多肽或ALK4:ActRIIB异二聚体序列的一部分。例如，合成的寡核苷酸的混合物可经酶促连接至基因序列，从而使得潜在的ActRII和/或ALK4编码核苷酸序列的简并组可作为个别多肽表达，或者另一方面，作为较大的融合蛋白组表达(例如，对于噬菌体展示)。

存在许多可自简并寡核苷酸序列产生潜在的同源物的文库的方式。简并基因序列的化学合成可在自动DNA合成仪中进行，且合成的基因然后可连接至合适的载体用于表达。简并寡核苷酸的合成是本领域众所周知的[Narang，SA (1983) Tetrahedron 39:3；Itakura等人(1981) Recombinant DNA，Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules，ed. AG Walton，Amsterdam: Elsevier pp273-289；Itakura等人(1984) Annu. Rev.Biochem. 53:323；Itakura等人(1984) Science 198:1056；和Ike等人(1983) NucleicAcid Res. 11:477]。这种技术已经用于其他蛋白的定向进化[Scott等人，(1990) Science249:386-390；Roberts等人(1992) PNAS USA 89:2429-2433；Devlin等人(1990) Science249: 404-406；Cwirla等人，(1990) PNAS USA 87: 6378-6382;以及美国专利号: 5,223,409、5,198,346和5,096,815]。

另一方面，其他形式的诱变可用于产生组合文库。例如，本公开内容的ActRII多肽、ALK4多肽和ALK4:ActRIIB异二聚体可通过使用例如丙氨酸分区诱变进行筛选[Ruf等人(1994) Biochemistry 33:1565-1572；Wang等人(1994) J. Biol. Chem. 269:3095-3099；Balint等人(1993) Gene 137:109-118；Grodberg等人(1993) Eur. J. Biochem. 218:597-601；Nagashima等人(1993) J. Biol. Chem. 268:2888-2892；Lowman等人(1991)Biochemistry 30:10832-10838;和Cunningham等人(1989) Science 244:1081-1085]，通过接头分区诱变[Gustin等人(1993) Virology 193:653-660;和Brown等人(1992) Mol.Cell Biol. 12:2644-2652；McKnight等人(1982) Science 232:316]，通过饱和诱变[Meyers等人，(1986) Science 232:613]；通过PCR诱变[Leung等人(1989) Method CellMol Biol 1:11-19]；或通过随机诱变，包括化学诱变[Miller等人(1992) A Short Coursein Bacterial Genetics，CSHL Press，Cold Spring Harbor，NY;和Greener等人(1994)Strategies in Mol Biol 7:32-34]，从文库产生和分离。接头分区诱变，特别是在组合的背景下，是一种用于鉴定截短(生物活性)形式的ActRII多肽、ALK4多肽或ALK4:ActRIIB异二聚体的有吸引力的方法。

本领域已知用于筛选通过点突变和截短制备的组合文库的基因产物的广泛范围的技术，且在这方面，用于筛选cDNA文库的具有特定性质的基因产物的广泛范围的技术。这种技术通常可适用于通过ActRII多肽的组合诱变产生的基因文库的快速筛选。用于筛选大基因文库的最广泛使用的技术一般包括克隆基因文库至可复制的表达载体，用所得载体文库转化合适的细胞，且在其中期望活性的检测促进相对容易地分离编码其产物被检测的基因的载体的条件下表达组合基因。优选的测定包括配体(例如，BMP2、BMP2/7、BMP3、BMP4、BMP4/7、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP8b、BMP9、BMP10、GDF3、GDF5、GDF6/BMP13、GDF7、GDF8、GDF9b/BMP15、GDF11/BMP11、GDF15/MIC1、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC、nodal、神经胶质细胞衍生的神经营养因子(GDNF)、neurturin、artemin、persephin、MIS和Lefty)结合测定和/或配体-介导的细胞信号传导测定。

如本领域技术人员将认识到的，本文所述的大多数所述突变、变体或修饰可以在核酸水平上进行，或者在一些情况下，通过翻译后修饰或化学合成进行。这种技术是本领域中众所周知的，并且其中一些在本文中描述。部分地，本公开内容鉴定了ActRII多肽、ALK4多肽或ALK4:ActRIIB异二聚体的功能活性部分(片段)和变体，其可用作在本文所述发明的范围内生成和使用其他变体ActRII多肽的指导。

在某些实施方案中，本公开内容的ActRII多肽、ALK4多肽和ALK4:ActRIIB异二聚体的功能活性片段可以通过筛选从编码ActRII和/或ALK4多肽的核酸的相应片段重组产生的多肽来获得。此外，可以使用本领域已知的技术如常规的Merrifield固相f-Moc或t-Boc化学化学合成片段。可以产生(重组或通过化学合成)片段并进行测试以鉴定可以起ActRII和/或ALK4受体和/或一种或多种配体(例如，BMP2、BMP2/7、BMP3、BMP4、BMP4/7、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP8b、BMP9、BMP10、GDF3、GDF5、GDF6/BMP13、GDF7、GDF8、GDF9b/BMP15、GDF11/BMP11、GDF15/MIC1、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC、nodal、神经胶质细胞衍生的神经营养因子(GDNF)、neurturin、artemin、persephin、MIS和Lefty )的拮抗剂(抑制剂)作用的那些肽基片段。

在某些实施方案中，除了在ActRII多肽、ALK4多肽或ALK4:ActRIIB异二聚体中天然存在的任何修饰之外，本公开内容的ActRII多肽、ALK4多肽和/或ALK4:ActRIIB异二聚体可进一步包含翻译后修饰。这种修饰包括但不限于，乙酰化、羧基化、糖基化、磷酸化、脂质化（lipidation）和酰化。作为结果，ActRII多肽、ALK4多肽或ALK4:ActRIIB异二聚体可含有非-氨基酸元件，诸如聚乙二醇、脂质、多糖或单糖和磷酸酯。这种非-氨基酸元件对配体捕获物多肽的功能性的影响可如本文对于其他ActRII、ALK4和ALK4:ActRIIB变体所述进行测试。当本公开内容的多肽在细胞中通过切割新生形式的多肽产生时，翻译后加工也可能对于蛋白的正确折叠和/或功能是重要的。不同的细胞(例如，CHO、HeLa、MDCK、293、WI38、NIH-3T3或HEK293)具有用于这种翻译后活性的特定细胞机器和特征性机制，且可经选择以确保ActRII多肽的正确修饰和加工。

在某些方面，本公开内容的ActRII和ALK4多肽包括具有ActRII或ALK4多肽的至少一部分(结构域)和一个或多个异源部分(结构域)的融合蛋白。这种融合结构域的众所周知的实例包括但不限于多组氨酸、Glu-Glu、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、硫氧还蛋白、A蛋白、G蛋白、免疫球蛋白重链恒定区(Fc)、麦芽糖结合蛋白(MBP)或人血清清蛋白。可以选择融合结构域以便赋予期望的性质。例如，一些融合结构域对于通过亲和层析分离融合蛋白特别有用。为了亲和纯化起见，使用亲和层析的相关基质，如谷胱甘肽-、淀粉酶-和镍-或钴-缀合的树脂。许多这种基质可以以“试剂盒”形式获得，如Pharmacia GST纯化系统和与(HIS₆)融合配偶体一起有用的QIAexpress^TM系统(Qiagen)。作为另一实例，融合结构域可经选择，以便促进ActRII或ALK4多肽的检测。这种检测结构域的实例包括各种荧光蛋白(例如，GFP)以及“附加表位”，其通常是针对其的特异性抗体可利用的短的肽序列。针对其的特异性单克隆抗体可容易利用的众所周知的附加表位包括FLAG、流感病毒血细胞凝集素(HA)和c-myc标记物。在一些情况下，融合结构域具有蛋白酶切割位点，如对于因子Xa或凝血酶，其允许相关的蛋白酶部分地消化融合蛋白，且由此从其中释放重组蛋白。释放的蛋白然后可通过随后的层析分离与融合结构域分离。可以选择的其他类型的融合结构域包括多聚化(例如，二聚化、四聚化)结构域和功能结构域(其赋予额外的生物学功能)，包括例如来自免疫球蛋白的恒定结构域(例如，Fc结构域)。

在某些方面，本公开内容的ActRII和ALK4多肽含有一种或多种能够“稳定化”多肽的修饰。“稳定化”意指增加体外半衰期、血清半衰期的任何物质，无论这是由于药剂的破坏减少、肾脏清除率降低还是其他药物代谢动力学作用。例如，这种修饰增加多肽的贮存期限，增加多肽的循环半衰期和/或减少多肽的蛋白水解降解。这种稳定修饰包括但不限于，融合蛋白(包括例如，包含ActRII多肽(或ALK4多肽)结构域和稳定剂结构域的融合蛋白)，糖基化位点的修饰(包括例如，添加糖基化位点至本公开内容的多肽)和碳水化合物部分的修饰(包括例如，从本公开内容的多肽除去碳水化合物部分)。如本文所用的，术语“稳定剂结构域”不仅是指在融合蛋白的情况下的融合结构域(例如，免疫球蛋白Fc结构域)，而且还包括非蛋白修饰，如碳水化合物部分或非蛋白部分，如聚乙二醇。在某些优选实施方案中，ActRII多肽(或ALK4多肽)与稳定化多肽的异源结构域(“稳定剂”结构域)、优选增加多肽体内稳定性的异源结构域融合。已知具有免疫球蛋白的恒定结构域(例如，Fc结构域)的融合物赋予广泛范围的蛋白期望的药物代谢动力学性质。同样地，与人血清清蛋白的融合可以赋予期望的性质。

可用于人IgG1的Fc部分(G1Fc)的天然氨基酸序列的实例在下文显示(SEQ ID NO:14)。虚下划线表示铰链区，且实下划线表示具有天然存在的变体的位置。部分地，本公开内容提供了包含与SEQ ID NO: 14具有70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽。根据SEQ ID NO: 14(参见Uniprot P01857)中使用的编号系统，G1Fc中天然存在的变体包括E134D和M136L。

任选地，IgG1 Fc结构域在残基如Asp-265、赖氨酸322和Asn-434处具有一个或多个突变。在某些情况下，相对于野生型Fc结构域，具有这些突变中的一个或多个(例如，Asp-265突变)的突变体IgG1 Fc结构域具有减少的结合Fcγ受体的能力。在其他情况下，相对于野生型IgG1 Fc结构域，具有这些突变中的一个或多个(例如，Asn-434突变)的突变体Fc结构域具有增加的结合MHC I类相关Fc-受体(FcRN)的能力。

可用于人IgG2的Fc部分(G2Fc)的天然氨基酸序列的实例在下文显示(SEQ ID NO:15)。虚下划线表示铰链区且双下划线表示其中在序列(根据UniProt P01859)中存在数据库冲突的位置。部分地，本公开内容提供了包含与SEQ ID NO: 15具有70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽。

可用于人IgG3的Fc部分(G3Fc)的氨基酸序列的两个实例在下文显示。G3Fc中的铰链区可最多达其他Fc链中的4倍长，且含有三个相同的15-残基区段，前面是类似的17-残基区段。在下文显示的第一G3Fc序列(SEQ ID NO: 16)含有由单一15-残基区段组成的短的铰链区，而第二G3Fc序列(SEQ ID NO: 17)含有全长铰链区。在每种情况下，虚下划线表示铰链区，且实下划线表示根据UniProt P01859具有天然存在的变体的位置。部分地，本公开内容提供了包含与SEQ ID NO: 16和17具有70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽。

当转变为SEQ ID NO: 16中使用的编号系统时，G3Fc (例如，参见UniprotP01860)中的天然存在的变体包括E68Q、P76L、E79Q、Y81F、D97N、N100D、T124A、S169N、S169del、F221Y，且本公开内容提供了包含G3Fc结构域的融合蛋白，所述结构域含有这些变异中的一种或多种。此外，人免疫球蛋白IgG3基因(IGHG3)显示特征在于不同的铰链长度的结构多态性[参见Uniprot P01859]。具体地，变体WIS缺乏大部分V区和所有的CH1区。除了铰链区中正常存在的位置11的链间二硫键之外，其在位置7处具有额外的链间二硫键。变体ZUC缺乏大部分V区、所有的CH1区和部分的铰链。变体OMM可以代表等位基因形式或另一种γ链亚类。本公开内容提供了包含G3Fc结构域的额外融合蛋白，所述结构域含有这些变体中的一种或多种。

可用于人IgG4的Fc部分(G4Fc)的天然氨基酸序列的实例在下文显示(SEQ ID NO:18)。虚下划线表示铰链区。部分地，本公开内容提供了包含与SEQ ID NO: 18具有70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽。

相对于G1Fc序列(SEQ ID NO: 14)，本文呈现了Fc结构域的多种人工改造的突变，且G2Fc、G3Fc和G4Fc中的类似突变可衍生自在图4中它们与G1Fc的比对。由于不等的铰链长度，基于同种型比对(图4)的类似的Fc位置在SEQ ID NO: 14、15、16、17和18中具有不同的氨基酸编号。还可理解，在由铰链、C_H2和C_H3区组成的免疫球蛋白序列(例如，SEQ ID NO:14、15、16、17和18)中给定的氨基酸位置将通过与当编号包含如Uniprot数据库中那样整个IgG1重链恒定结构域(由C_H1、铰链、C_H2和C_H3区组成)时的相同位置不同的编号来鉴定。例如，在人G1Fc序列(SEQ ID NO: 14)、人IgG1重链恒定结构域(Uniprot P01857)和人IgG1重链中选择的C_H3位置之间的对应如下。

在某些方面，本文公开的多肽可以形成蛋白复合体，其包含与至少一种ActRIIB多肽共价或非共价缔合的至少一种ALK4多肽。优选地，本文公开的多肽形成异二聚的复合体，尽管还包括更高级的异多聚的复合体(异多聚体)，如，但不限于，异三聚体、异四聚体和进一步的寡聚体结构(参见，例如，图21-23)。在一些实施方案中，ALK4和/或ActRIIB多肽包含至少一个多聚化结构域。如本文所公开的，术语“多聚化结构域”是指促进至少第一多肽和至少第二多肽之间的共价或非共价相互作用的氨基酸或氨基酸序列。本文公开的多肽可共价或非共价连接至多聚化结构域。优选地，多聚化结构域促进在第一多肽(例如，ALK4多肽)和第二多肽(例如，ActRIIB多肽)之间的相互作用以促进异多聚体形成(例如，异二聚体形成)，且任选地妨碍或以其他方式不利于同多聚体形成(例如，同二聚体形成)，从而增加期望的异多聚体的得率(参见，例如，图22)。

本领域已知的许多方法可用于产生ALK4:ActRIIB异多聚体。例如，非天然存在的二硫键可通过用游离的含硫醇残基(诸如半胱氨酸)置换第一多肽(例如，ALK4多肽)上的天然存在的氨基酸来构建，从而使得游离的硫醇与第二多肽(例如，ActRIIB多肽)上的另一游离的含硫醇残基相互作用，从而使得在第一和第二多肽之间形成二硫键。促进异多聚体形成的相互作用的另外的实例包括但不限于，离子相互作用，如描述于Kjaergaard等人，WO2007147901；静电指导（steering）作用，如描述于Kannan等人，U.S.8,592,562；卷曲螺旋相互作用，如描述于Christensen等人，U.S.20120302737；亮氨酸拉链，如描述于Pack &Plueckthun,(1992) Biochemistry 31: 1579-1584;和螺旋-转角-螺旋基序，如描述于Pack等人，(1993) Bio/Technology 11: 1271-1277。各种区段的连接可通过例如共价结合，如通过化学交联、肽接头、二硫键等，或亲和相互作用，如通过亲和素-生物素或亮氨酸拉链技术获得。

在某些方面，多聚化结构域可包含相互作用对的一个组分。在一些实施方案中，本文公开的多肽可形成蛋白复合体，其包含与第二多肽共价或非共价缔合的第一多肽，其中第一多肽包含ALK4多肽的氨基酸序列和相互作用对的第一成员的氨基酸序列；且第二多肽包含ActRIIB多肽的氨基酸序列和相互作用对的第二成员的氨基酸序列。相互作用对可以是相互作用以形成复合体、特别是异二聚的复合体的任何两个多肽序列，尽管实施的实施方案也可采用可以形成同二聚的复合体的相互作用对。相互作用对的一个成员可融合至如本文所述的ALK4或ActRIIB多肽，包括例如，包含与SEQ ID NO: 2、3、5、6、101和103的任一个的序列具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽序列。相互作用对可经选择以赋予改进的性质/活性，如增加的血清半衰期，或充当衔接子，另一部分附着至所述衔接子上以提供改进的性质/活性。例如，聚乙二醇部分可附着至相互作用对的一个或两个组分以提供改进的性质/活性，诸如改进的血清半衰期。

相互作用对的第一和第二成员可以是不对称的对，从而意味着该对的成员优先与彼此缔合，而非自缔合。因此，不对称的相互作用对的第一和第二成员可以缔合以形成异二聚的复合体(参见，例如，图22)。另一方面，相互作用对可以是未指导的，从而意味着该对的成员可以在没有显著的优先选择的情况下与彼此缔合或自缔合，且因而可以具有相同或不同的氨基酸序列。因此，未指导的相互作用对的第一和第二成员可以缔合以形成同二聚体复合体或异二聚体复合体。任选地，相互作用对(例如，不对称对或未指导的相互作用对)的第一成员与相互作用对的第二成员共价缔合。任选地，相互作用对(例如，不对称对或未指导的相互作用对)的第一成员与相互作用对的第二成员非共价缔合。

作为具体实例，本公开内容提供了融合蛋白，其包含与包含免疫球蛋白的恒定结构域(如衍生自人IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4的CH1、CH2或CH3结构域)的多肽融合的ALK4或ActRIIB，所述多肽已被修饰以促进异多聚体形成。从单一细胞系大规模生产不对称的基于免疫球蛋白的蛋白产生的问题被称为“链缔合问题”。如在产生双特异性抗体中所突出面临的，链缔合问题涉及从当不同的重链和/或轻链在单一细胞系中产生时固有导致的从多个组合中有效产生期望的多链蛋白的挑战[Klein等人(2012) mAbs 4:653-663]。当两条不同的重链和两条不同的轻链在相同的细胞中产生时，该问题是最尖锐的，在该情况下存在总共16种可能的链组合(尽管这些中的一些是相同的)，而一般仅期望一种。然而，相同的原理解释了并入仅两种不同的(不对称的)重链的所期望的多链融合蛋白的降低的得率。

在单一细胞系中增加含Fc融合多肽链的期望配对以以可接受的得率产生优选的不对称的融合蛋白的各种方法是本领域已知的[Klein等人(2012) mAbs 4:653-663;和Spiess等人(2015) Molecular Immunology 67(2A): 95-106]。获得期望的含Fc链的配对的方法包括但不限于，基于电荷的配对(静电指导)、“杵-臼(knobs-into-holes)”空间配对、SEEDbody配对和基于亮氨酸拉链的配对[Ridgway等人(1996) Protein Eng 9:617-621；Merchant等人(1998) Nat Biotech 16:677-681；Davis等人(2010) Protein Eng DesSel 23:195-202；Gunasekaran等人(2010)；285:19637-19646；Wranik等人(2012) J BiolChem 287:43331-43339；US5932448；WO 1993/011162；WO 2009/089004和WO 2011/034605]。如本文所述的，这些方法可用于产生ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异多聚体复合体。参见，例如，图23。

先前已经公开了ALK4:ActRIIB异多聚体和制备这种异多聚体的方法。参见，例如，WO 2016/164497，其全部教导引入本文作为参考。

应理解，融合蛋白(例如，免疫球蛋白Fc融合蛋白)的不同元件可以以与期望功能性一致的任何方式排列。例如，ActRII多肽(或ALK4多肽)结构域可位于异源结构域的C-末端，或者另一方面，异源结构域可位于ActRII多肽(或ALK4多肽)结构域的C-末端。ActRII多肽(或ALK4多肽)结构域和异源结构域在融合蛋白中不需要相邻，且另外的结构域或氨基酸序列可包括在任一结构域的C-或N-末端或在结构域之间。

例如，ActRII (或ALK4)受体融合蛋白可包含如式A-B-C中所示的氨基酸序列。B部分对应于ActRII (或ALK4)多肽结构域。A和C部分可独立地是零、一个或超过一个氨基酸，且A和C部分两者当存在时对B都是异源的。A和/或C部分可通过接头序列附着至B部分。接头可以富含甘氨酸(例如，2-10、2-5、2-4、2-3个甘氨酸残基)或甘氨酸和脯氨酸残基，且可例如含有苏氨酸/丝氨酸和甘氨酸的单一序列，或苏氨酸/丝氨酸和/或甘氨酸的重复序列，例如，GGG (SEQ ID NO: 19)、GGGG (SEQ ID NO: 20)、TGGGG(SEQ ID NO: 21)、SGGGG(SEQ IDNO: 22)、TGGG(SEQ ID NO: 23)、SGGG(SEQ ID NO: 24)或GGGGS (SEQ ID NO: 25)单现基因或重复序列。在某些实施方案中，ActRII (或ALK4)融合蛋白包含如式A-B-C中所示的氨基酸序列，其中A是前导(信号)序列，B由ActRII (或ALK4)多肽结构域组成，且C是增强体内稳定性、体内半衰期、摄取/施用、组织定位或分布、蛋白复合体形成和/或纯化的一种或多种的多肽部分。在某些实施方案中，ActRII (或ALK4)融合蛋白包含如式A-B-C中所示的氨基酸序列，其中A是TPA前导序列，B由ActRII (或ALK4)受体多肽结构域组成，且C是免疫球蛋白Fc结构域。优选的融合蛋白包含SEQ ID NO: 32、36、39、40、42、45、46、48、69、74、77、78、108、110、111、113、114、115、116、117、118、120、122和124中任一个所示的氨基酸序列。

在优选的实施方案中，待根据本文所述的方法使用的ActRII多肽、ALK4多肽和ALK4:ActRIIB异多聚体是分离的多肽。如本文所用的，分离的蛋白或多肽是已经与其天然环境的组分分开的蛋白或多肽。在一些实施方案中，本公开内容的多肽被纯化至大于95%、96%、97%、98%或99%纯度，如通过例如，电泳(例如，SDS-PAGE、等电点聚焦(IEF)、毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)所测定的。用于评估纯度的方法是本领域众所周知的[参见，例如，Flatman等人，(2007) J. Chromatogr. B 848:79-87]。在一些实施方案中，待根据本文描述的方法使用的ActRII多肽、ALK4多肽和ALK4:ActRIIB异多聚体是重组多肽。

本公开内容的ActRII多肽、ALK4多肽和ALK4:ActRIIB异多聚体可通过多种本领域已知的技术产生。例如，本公开内容的多肽可使用标准蛋白化学技术合成，如描述于Bodansky，M. Principles of Peptide Synthesis，Springer Verlag，Berlin (1993)和Grant G. A. (ed.)，Synthetic Peptides: A User's Guide，W. H. Freeman andCompany，New York (1992)的那些。此外，自动肽合成仪可市售获得(例如，AdvancedChemTech Model 396；Milligen/Biosearch 9600)。另一方面，本公开内容的多肽，包括其片段或变体，可使用各种表达系统[例如，大肠杆菌（E. coli）、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞、杆状病毒]重组产生，如本领域众所周知的。在进一步的实施方案中，本公开内容的修饰或未修饰的多肽可通过使用例如，蛋白酶，例如，胰蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶或成对碱性氨基酸转换酶(PACE)，消化重组产生的全长ActRII多肽产生。计算机分析(使用市售可得的软件，例如，MacVector，Omega，PCGene，Molecular Simulation，Inc.)可用于鉴定蛋白酶剪切位点。另一方面，可以使用化学切割(例如，溴化氰、羟胺等)从重组生成的全长ActRII或ALK4多肽产生这种多肽。

3. 编码ActRII和ALK4多肽及其变体的核酸

在某些实施方案中，本公开内容提供了编码ActRII和/或ALK4受体(包括其片段、功能变体和融合蛋白)的分离和/或重组的核酸。例如，SEQ ID NO: 7编码天然存在的人ActRIIB前体多肽(上文所述的R64变体)，而SEQ ID NO: 8编码ActRIIB(上文所述的R64变体)的加工的细胞外结构域。主题核酸可以是单链的或双链的。这种核酸可以是DNA或RNA分子。这些核酸可用于例如，制备如本文描述的基于ActRII的配体捕获物多肽的方法中。

如本文所用的，分离的核酸是指已经与其天然环境的组分分开的核酸分子。分离的核酸包括在正常包含核酸分子的细胞中包含的核酸分子，但所述核酸分子存在于染色体外或不同于其天然的染色体位置的染色体位置。

在某些实施方案中，编码本公开内容的ActRII或ALK4多肽的核酸被理解为包括作为SEQ ID NO: 7、8、12、13、37、43、49、70、71、72、73、75、76、80、81、82、83、84、102、103、106、107、109、112、119、121、123和135的任一个的变体的核酸。变体核苷酸序列包括差异一个或多个核苷酸取代、添加或缺失的序列，包括等位基因变体，且因此，将包括与SEQ ID NO: 7、8、12、13、37、43、49、70、71、72、73、75、76、80、81、82、83、84、102、103、106、107、109、112、119、121、123和135中任一个指定的核苷酸序列不同的编码序列。

在某些实施方案中，本公开内容的ActRII或ALK4多肽由分离和/或重组核酸序列编码，所述核酸序列与SEQ ID NO: 7、8、12、13、37、43、49、70、71、72、73、75、76、80、81、82、83、84、102、103、106、107、109、112、119、121、123和135中任一个具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94% 95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性。本领域普通技术人员将理解和与SEQ ID NO: 7、8、12、13、37、43、49、70、71、72、73、75、76、80、81、82、83、84、102、103、106、107、109、112、119、121、123和135互补的序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94% 95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核酸序列及其变体也在本公开内容的范围内。在进一步实施方案中，本公开内容的核酸序列可以是分离的、重组的，和/或与异源的核苷酸序列融合或在DNA文库中。

在其他实施方案中，本公开内容的核酸还包括在高度严格条件下与SEQ ID NO:7、8、12、13、37、43、49、70、71、72、73、75、76、80、81、82、83、84、102、103、106、107、109、112、119、121、123和135中指定的核苷酸序列，SEQ ID NO: 7、8、12、13、37、43、49、70、71、72、73、75、76、80、81、82、83、84、102、103、106、107、109、112、119、121、123和135的互补序列或其片段杂交的核苷酸序列。如上文所讨论的，本领域普通技术人员将容易理解，可以改变促进DNA杂交的适当严格条件。本领域普通技术人员将容易理解，可以改变促进DNA杂交的适当严格条件。例如，可在6.0 x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中在约45 ℃进行杂交，随后为在50 ℃的2.0 x SSC洗涤。例如，在洗涤步骤中的盐浓度可选自在50 ℃约2.0 x SSC的低严格性至在50 ℃约0.2 x SSC的高严格性。此外，在洗涤步骤中的温度可从在室温约22 ℃的低严格条件增加至在约65 ℃的高严格条件。温度和盐两者可以改变，或温度或盐浓度可以保持恒定，而改变另一个变量。在一个实施方案中，本公开内容提供了核酸，其在室温6 x SSC的低严格条件下杂交，随后为在室温的2 x SSC洗涤。

由于遗传密码的简并性而不同于如SEQ ID NO: 7、8、12、13、37、43、49、70、71、72、73、75、76、80、81、82、83、84、102、103、106、107、109、112、119、121、123和135中所示的核酸的分离的核酸也在本公开内容的范围内。例如，许多氨基酸由超过一个三联体指定。规定相同的氨基酸的密码子，或同义密码子(例如，CAU和CAC是组氨酸的同义密码子)可导致“沉默”突变，其不影响蛋白的氨基酸序列。然而，预期的确导致主题蛋白的氨基酸序列变化的DNA序列多态性将存在于哺乳动物细胞中。本领域技术人员将理解，由于天然等位基因变异，编码特定蛋白的核酸的一个或多个核苷酸(至多约3-5%的核苷酸)的这些变异可存在于给定物种的个体中。任何和所有这种核苷酸变异和所产生的氨基酸多态性在本公开内容的范围内。

在某些实施方案中，本公开内容的重组核酸可以与在表达构建体中的一种或多种调节性核苷酸序列可操作地连接。调节性核苷酸序列通常将适合于用于表达的宿主细胞。许多类型的合适表达载体和合适的调节性序列是本领域已知的并且可用于多种宿主细胞中。一般，一种或多种调节性核苷酸序列可包括但不限于，启动子序列、前导或信号序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列、和增强子或激活物序列。本公开内容预期如本领域已知的组成型或诱导型启动子。启动子可以是天然存在的启动子，或组合超过一个启动子的元件的杂合启动子。表达构建体可存在于细胞中的附加体(如质粒)上，或表达构建体可插入染色体中。在一些实施方案中，表达载体含有选择标记基因以允许选择转化的宿主细胞。选择标记基因是本领域众所周知的并且可以随使用的宿主细胞而改变。

在某些方面，在表达载体中提供本文公开的主题核酸，所述表达载体包含编码ActRII和/或ALK4多肽且可操作连接至至少一种调节性序列的核苷酸序列。调节性序列是本领域公认的且经选择以指导ActRII和/或ALK4多肽的表达。因此，术语调节性序列包括启动子、增强子和其他表达控制元件。示例性调节性序列描述于Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology，Academic Press，San Diego，CA (1990)。例如，当与其可操作连接时控制DNA序列表达的各种各样表达控制序列的任一种可用于这些载体中以表达编码ActRII和/或ALK4多肽的DNA序列。这种有用的表达控制序列包括例如，SV40的早期和晚期启动子、tet启动子、腺病毒或巨细胞病毒立即早期启动子、RSV启动子、lac系统、trp系统、TAC或TRC系统、其表达受T7 RNA聚合酶指导的T7启动子、噬菌体λ的主要操纵基因和启动子区、fd外壳蛋白的控制区、3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶的启动子、酸性磷酸酶(例如，Pho5)的启动子、酵母 α-交配因子的启动子、杆状病毒系统的多面体启动子和已知控制原核或真核细胞或它们的病毒的基因表达的其他序列，和其各种组合。应理解，表达载体的设计可取决于诸如待转化的宿主细胞的选择和/或期望表达的蛋白类型的因素。此外，还应考虑载体的拷贝数、控制该拷贝数的能力和由载体编码的任何其他蛋白(诸如抗生素标记)的表达。

本公开内容的重组核酸可通过将克隆的基因或其部分连接到适合于在原核细胞、真核细胞(酵母、禽类、昆虫或哺乳动物)或两者中表达的载体中来产生。用于产生重组ActRII和/或ALK4多肽的表达载体包括质粒和其他载体。例如，合适的载体包括以下类型的质粒：pBR322-衍生的质粒、pEMBL-衍生的质粒、pEX-衍生的质粒、pBTac-衍生的质粒和pUC-衍生的质粒，其用于在原核细胞如大肠杆菌中表达。

一些哺乳动物表达载体含有促进载体在细菌中繁殖的原核序列和在真核细胞中表达的一个或多个真核转录单位两者。pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2-dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko-neo和pHyg衍生的载体是适合于转染真核细胞的哺乳动物表达载体的实例。这些载体的一些用来自细菌质粒如pBR322的序列修饰，以促进在原核和真核细胞两者中的复制和抗药性选择。另一方面，病毒如牛乳头瘤病毒(BPV-1)或EB病毒(pHEBo、pREP-衍生的和p205)的衍生物可用于蛋白在真核细胞中的瞬时表达。其他病毒(包括逆转录病毒)表达系统的实例可见于下文的基因疗法递送系统的描述中。用于制备质粒和转化宿主生物的各种方法是本领域众所周知的。对于原核和真核细胞两者的其他合适的表达系统，以及通用的重组程序，例如Molecular Cloning ALaboratory Manual，第3版，Sambrook、Fritsch和Maniatis编辑，(Cold Spring HarborLaboratory Press，2001)。在一些实例中，可能期望通过使用杆状病毒表达系统来表达重组多肽。这种杆状病毒表达系统的实例包括pVL-衍生的载体(如pVL1392、pVL1393和pVL941)、pAcUW-衍生的载体(如pAcUW1)和pBlueBac-衍生的载体(如含有β-gal的pBlueBacIII)。

在优选实施方案中，载体将经设计以用于在CHO细胞中产生主题ActRII和/或ALK4多肽，如Pcmv-Script载体(Stratagene，La Jolla，Calif.)、pcDNA4载体(Invitrogen，Carlsbad，Calif.)和pCI-neo载体(Promega，Madison，Wisc.)。如将显而易见的，主题基因构建体可用于导致主题ActRII多肽在培养物中繁殖的细胞中表达，例如，以产生蛋白，包括融合蛋白或变体蛋白，用于纯化。

本公开内容还涉及用重组基因转染的宿主细胞，所述重组基因包括一种或多种主题ActRII和/或ALK4多肽的编码序列。宿主细胞可以是任何原核或真核细胞。例如，本公开内容的ActRII和/或ALK4多肽可在细菌细胞如大肠杆菌、昆虫细胞(例如，使用杆状病毒表达系统)、酵母或哺乳动物细胞[例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系]中表达。其他合适的宿主细胞是本领域技术人员已知的。

因此，本公开内容进一步涉及产生主题ActRII和/或ALK4多肽的方法。例如，用编码ActRII和/或ALK4多肽的表达载体转染的宿主细胞可在合适的条件下培养，以允许发生ActRII和/或ALK4多肽的表达。多肽可经分泌并从细胞和包含多肽的培养基的混合物分离。另一方面，ActRII和/或ALK4多肽可保留在细胞质中或膜级分中，并且收获细胞，裂解并分离蛋白。细胞培养物包括宿主细胞、培养基和其他副产物。用于细胞培养的合适培养基是本领域众所周知的。主题多肽可使用本领域已知用于纯化蛋白的技术从细胞培养基、宿主细胞或两者分离，所述技术包括离子交换层析、凝胶过滤层析、超滤、电泳、用对ActRII和/或ALK4多肽的特定表位特异性的抗体的免疫亲和纯化、和用结合融合至ActRII多肽的结构域的试剂的亲和纯化(例如，A蛋白柱可用于纯化ActRII-Fc和/或ALK4-Fc融合蛋白)。在一些实施方案中，ActRII和/或ALK4多肽是含有促进其纯化的结构域的融合蛋白。

在一些实施方案中，纯化通过一系列柱层析步骤实现，包括例如，以任何顺序的以下的三种或更多种：A蛋白层析、Q琼脂糖凝胶层析、苯基琼脂糖凝胶层析、尺寸排阻层析和阳离子交换层析。纯化可以用病毒过滤和缓冲液更换完成。ActRII和/或ALK4蛋白可纯化至>90%、>95%、>96%、>98%或>99%的纯度，如通过尺寸排阻层析所测定的，和>90%、>95%、>96%、>98%或>99%的纯度，如通过SDS PAGE所测定的。纯度的靶水平应该是足以在哺乳动物系统、特别是非-人灵长类动物、啮齿类动物(小鼠)和人中实现期望的结果的纯度。

在另一个实施方案中，编码在重组ActRII和/或ALK4多肽的期望部分的N-末端的纯化前导序列如聚-(His)/肠激酶切割位点序列的融合基因可允许通过亲和层析使用Ni²⁺金属树脂纯化表达的融合蛋白。然后纯化前导序列可随后通过用肠激酶处理来除去，以提供纯化的ActRII和/或ALK4多肽。参见，例如，Hochuli等人(1987) J. Chromatography 411:177;和Janknecht等人(1991) PNAS USA 88:8972。

用于制备融合基因的技术是众所周知的。基本上，编码不同多肽序列的各种DNA片段的连接根据常规技术进行，采用平端或交错端末端用于连接，限制性酶消化以提供合适的末端，在合适的情况下补平粘端，碱性磷酸酶处理以避免不期望的连接，和酶促连接。在另一个实施方案中，融合基因可通过常规技术(包括自动DNA合成仪)合成。另一方面，基因片段的PCR扩增可使用锚定引物进行，其在两个相邻的基因片段之间产生互补的突出端，其可随后被退火以产生嵌合基因序列。参见，例如，Current Protocols in MolecularBiology，Ausubel等人编辑，John Wiley & Sons: 1992。

4.抗体拮抗剂

在某些方面，待根据本文公开的方法和用途使用的GDF/BMP拮抗剂是抗体(GDF/BMP拮抗剂抗体)或抗体的组合。GDF/BMP拮抗剂抗体或抗体的组合可以结合例如一种或多种ActRII配体(例如，激活蛋白、GDF8、GDF11、BMP6、BMP15、BMP10和/或GDF3)、ActRII受体(ActRIIA和/或ActRIIB)、I型受体(ALK4、ALK5和/或ALK7)和/或共同受体。如本文所述的，可以单独或与一种或多种支持疗法或活性剂组合使用GDF/BMP拮抗剂抗体，以治疗、预防或降低肺高血压(PH)的进展率和/或严重程度，特别是治疗、预防或降低一种或多种PH相关并发症的进展率和/或严重程度。

在某些方面，GDF/BMP拮抗剂抗体或抗体的组合是至少抑制激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白AE和/或激活蛋白BE)的抗体。因此，在一些实施方案中，GDF/BMP拮抗剂抗体或抗体的组合结合至少激活蛋白。如本文所用的，激活蛋白抗体(或抗-激活蛋白抗体)通常是指以足够的亲和力结合激活蛋白、从而使得所述抗体可用作靶向激活蛋白的诊断剂和/或治疗剂的抗体。在某些实施方案中，激活蛋白抗体与不相关的非-激活蛋白蛋白的结合程度小于所述抗体与激活蛋白的结合的约10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或小于约1%，如例如通过放射免疫测定(RIA)、Biacore或其他蛋白相互作用或结合亲和力测定所测量的。在某些实施方案中，激活蛋白抗体结合在来自不同物种的激活蛋白中保守的激活蛋白的表位。在某些优选实施方案中，抗-激活蛋白抗体结合人激活蛋白。在一些实施方案中，激活蛋白抗体可以抑制激活蛋白结合I型和/或II型受体(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5和/或ALK7)，且因此抑制激活蛋白-介导的信号传导(例如，Smad信号传导)。在一些实施方案中，激活蛋白抗体可以抑制激活蛋白结合ActRII共同受体，且因此抑制激活蛋白介导的信号传导(例如，Smad信号传导)。应当注意，激活蛋白A与激活蛋白B具有相似序列同源性，且因此结合激活蛋白A的抗体在一些情况下也可以结合和/或抑制激活蛋白B，其也适用于抗-激活蛋白B抗体。在一些实施方案中，本公开内容涉及多特异性抗体(例如，双特异性抗体)及其用途，所述抗体结合激活蛋白且进一步结合例如一种或多种额外GDF/BMP配体[例如，GDF11、GDF8、GDF3、BMP15、BMP10和BMP6]、一种或多种I型受体和/或II型受体(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5和/或ALK7)和/或一种或多种共同受体。在一些实施方案中，结合激活蛋白的多特异性抗体不结合或基本上不结合BMP9(例如，以大于1 x 10^-7 M的K_D结合BMP9或具有相对适度的结合，例如，约1 x 10^-8 M或约1 x 10^-9 M)。在一些实施方案中，结合激活蛋白的多特异性抗体不结合或基本上不结合激活蛋白A(例如，以大于1 x 10^-7 M的K_D结合激活蛋白A或具有相对适度的结合，例如，约1 x 10^-8 M或约1 x 10^-9 M)。在一些实施方案中，本公开内容涉及抗体的组合及其用途，其中抗体的组合包含激活蛋白抗体和一种或多种额外的结合例如一种或多种额外GDF/BMP超家族配体[例如，GDF8、GDF11、GDF3、BMP6和BMP15]、一种或多种I型受体和/或II型受体(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5和/或ALK7)和/或一种或多种共同受体的抗体。在一些实施方案中，包含激活蛋白抗体的抗体的组合不包含BMP9抗体。在一些实施方案中，包含激活蛋白抗体的抗体的组合不包含激活蛋白A抗体。

在某些方面，GDF/BMP拮抗剂抗体或抗体的组合是至少抑制激活蛋白B的抗体。因此，在一些实施方案中，GDF/BMP拮抗剂抗体或抗体的组合结合至少激活蛋白B。如本文所用的，激活蛋白B抗体(或抗-激活蛋白B抗体)通常是指以足够的亲和力结合激活蛋白B、从而使得所述抗体可用作靶向激活蛋白B的诊断剂和/或治疗剂的抗体。在某些实施方案中，激活蛋白B抗体与不相关的非-激活蛋白B蛋白的结合程度小于所述抗体与激活蛋白的结合的约10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或小于约1%，如例如通过放射免疫测定(RIA)、Biacore或其他蛋白相互作用或结合亲和力测定所测量的。在某些实施方案中，激活蛋白B抗体结合在来自不同物种的激活蛋白B中保守的激活蛋白B的表位。在某些优选实施方案中，抗-激活蛋白B抗体结合人激活蛋白B。在一些实施方案中，激活蛋白B抗体可以抑制激活蛋白B结合I型和/或II型受体(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5和/或ALK7)，且因此抑制激活蛋白B-介导的信号传导(例如，Smad信号传导)。在一些实施方案中，激活蛋白B抗体可以抑制激活蛋白B结合共同受体，且因此抑制激活蛋白B介导的信号传导(例如，Smad信号传导)。应当注意，激活蛋白B与激活蛋白A具有相似序列同源性，且因此结合激活蛋白B的抗体在一些情况下也可以结合和/或抑制激活蛋白A。在一些实施方案中，本公开内容涉及多特异性抗体(例如，双特异性抗体)及其用途，所述抗体结合激活蛋白B且进一步结合例如一种或多种额外GDF/BMP配体[例如，GDF11、GDF8、GDF3、BMP15、BMP10和BMP6]、一种或多种I型受体和/或II型受体(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5和/或ALK7)和/或一种或多种共同受体。在一些实施方案中，结合激活蛋白B的多特异性抗体不结合或基本上不结合BMP9(例如，以大于1 x10^-7 M的K_D结合BMP9或具有相对适度的结合，例如，约1 x 10^-8 M或约1 x 10^-9 M)。在一些实施方案中，结合激活蛋白B的多特异性抗体不结合或基本上不结合激活蛋白A(例如，以大于1 x 10^-7 M的K_D结合激活蛋白A或具有相对适度的结合，例如，约1 x 10^-8 M或约1 x 10^-9M)。在一些实施方案中，本公开内容涉及抗体的组合及其用途，其中抗体的组合包含激活蛋白B抗体和一种或多种额外的结合例如一种或多种额外GDF/BMP配体[例如，GDF8、GDF11、GDF3、BMP6、BMP10和BMP15]、一种或多种I型受体和/或II型受体(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5和/或ALK7)和/或一种或多种共同受体的抗体。在一些实施方案中，包含激活蛋白B抗体的抗体的组合不包含BMP9抗体。在一些实施方案中，包含激活蛋白B抗体的抗体的组合不包含激活蛋白A抗体。

在某些方面，GDF/BMP拮抗剂抗体或抗体的组合是至少抑制GDF8的抗体。因此，在一些实施方案中，GDF/BMP拮抗剂抗体或抗体的组合结合至少GDF8。如本文所用的，GDF8抗体(或抗-GDF8抗体)通常是指以足够的亲和力结合GDF8、从而使得所述抗体可用作靶向GDF8的诊断剂和/或治疗剂的抗体。在某些实施方案中，GDF8抗体与不相关的非-GDF8蛋白的结合程度小于所述抗体与GDF8的结合的约10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或小于约1%，如例如通过放射免疫测定(RIA)、Biacore或其他蛋白相互作用或结合亲和力测定所测量的。在某些实施方案中，GDF8抗体结合在来自不同物种的GDF8中保守的GDF8的表位。在某些优选实施方案中，抗-GDF8抗体结合人GDF8。在一些实施方案中，GDF8抗体可以抑制GDF8结合I型和/或II型受体(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5和/或ALK7)，且因此抑制GDF8-介导的信号传导(例如，Smad信号传导)。在一些实施方案中，GDF8抗体可以抑制GDF8结合共同受体，且因此抑制GDF8介导的信号传导(例如，Smad信号传导)。应当注意，GDF8与GDF11具有高度序列同源性，且因此结合GDF8的抗体在一些情况下也可以结合和/或抑制GDF11。在一些实施方案中，本公开内容涉及多特异性抗体(例如，双特异性抗体)及其用途，所述抗体结合GDF8且进一步结合例如一种或多种额外GDF/BMP配体[例如，激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白AE、激活蛋白BE)、GDF11、GDF3、BMP15、BMP10和BMP6]、一种或多种I型受体和/或II型受体(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5和/或ALK7)和/或一种或多种共同受体。在一些实施方案中，结合GDF8的多特异性抗体不结合或基本上不结合BMP9(例如，以大于1 x 10^-7 M的K_D结合BMP9或具有相对适度的结合，例如，约1 x 10^-8 M或约1 x 10^-9 M)。在一些实施方案中，结合GDF8的多特异性抗体不结合或基本上不结合激活蛋白A(例如，以大于1 x 10^-7 M的K_D结合激活蛋白A或具有相对适度的结合，例如，约1 x 10^-8 M或约1 x 10^-9 M)。在一些实施方案中，本公开内容涉及抗体的组合及其用途，其中抗体的组合包含GDF8抗体和一种或多种额外的结合例如一种或多种额外GDF/BMP配体[例如，激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白AE、激活蛋白BE)、GDF11、GDF3、BMP6、BMP10和BMP15]、一种或多种I型受体和/或II型受体(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5和/或ALK7)和/或一种或多种共同受体的抗体。在一些实施方案中，包含GDF8抗体的抗体的组合不包含BMP9抗体。在一些实施方案中，包含GDF8抗体的抗体的组合不包含激活蛋白A抗体。

在某些方面，GDF/BMP拮抗剂抗体或抗体的组合是至少抑制GDF11的抗体。因此，在一些实施方案中，GDF/BMP拮抗剂抗体或抗体的组合结合至少GDF11。如本文所用的，GDF11抗体(或抗-GDF11抗体)通常是指以足够的亲和力结合GDF11、从而使得所述抗体可用作靶向GDF11的诊断剂和/或治疗剂的抗体。在某些实施方案中，GDF11抗体与不相关的非-GDF11蛋白的结合程度小于所述抗体与GDF11的结合的约10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或小于约1%，如例如通过放射免疫测定(RIA)、Biacore或其他蛋白相互作用或结合亲和力测定所测量的。在某些实施方案中，GDF11抗体结合在来自不同物种的GDF11中保守的GDF11的表位。在某些优选实施方案中，抗-GDF11抗体结合人GDF11。在一些实施方案中，GDF11抗体可以抑制GDF11结合I型和/或II型受体(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5和/或ALK7)，且因此抑制GDF11-介导的信号传导(例如，Smad信号传导)。在一些实施方案中，GDF11抗体可以抑制GDF11结合共同受体，且因此抑制GDF11介导的信号传导(例如，Smad信号传导)。应当注意，GDF11与GDF8具有高度序列同源性，且因此结合GDF11的抗体在一些情况下还可以结合和/或抑制GDF8。在一些实施方案中，本公开内容涉及多特异性抗体(例如，双特异性抗体)及其用途，所述抗体结合GDF11且进一步结合例如一种或多种额外GDF/BMP配体[例如，激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白AE、激活蛋白BE)、GDF8、GDF3、BMP15、BMP10和BMP6]、一种或多种I型受体和/或II型受体(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5和/或ALK7)和/或一种或多种共同受体。在一些实施方案中，结合GDF11的多特异性抗体不结合或基本上不结合BMP9(例如，以大于1 x 10^-7 M的K_D结合BMP9或具有相对适度的结合，例如，约1 x 10^-8 M或约1 x 10^-9 M)。在一些实施方案中，结合GDF11的多特异性抗体不结合或基本上不结合激活蛋白A(例如，以大于1 x 10^-7 M的K_D结合激活蛋白A或具有相对适度的结合，例如，约1 x 10^-8 M或约1 x10^-9 M)。在一些实施方案中，本公开内容涉及抗体的组合及其用途，其中抗体的组合包含GDF11抗体和一种或多种额外的结合例如一种或多种额外GDF/BMP配体[例如，激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白AE、激活蛋白BE)、GDF8、GDF3、BMP6、BMP10和BMP15]、一种或多种I型受体和/或II型受体(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5和/或ALK7)和/或一种或多种共同受体的抗体。在一些实施方案中，包含GDF11抗体的抗体的组合不包含BMP9抗体。在一些实施方案中，包含GDF11抗体的抗体的组合不包含激活蛋白A抗体。

在某些方面，GDF/BMP拮抗剂抗体或抗体的组合是至少抑制BMP6的抗体。因此，在一些实施方案中，GDF/BMP拮抗剂抗体或抗体的组合结合至少BMP6。如本文所用的，BMP6抗体(或抗-BMP6抗体)通常是指可以以足够的亲和力结合BMP6、从而使得所述抗体可用作靶向BMP6的诊断剂和/或治疗剂的抗体。在某些实施方案中，BMP6抗体与不相关的非-BMP6蛋白的结合程度小于所述抗体与BMP6的结合的约10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或小于约1%，如例如通过放射免疫测定(RIA)、Biacore或其他蛋白相互作用或结合亲和力测定所测量的。在某些实施方案中，BMP6抗体结合在来自不同物种的BMP6中保守的BMP6的表位。在某些优选实施方案中，抗-BMP6抗体结合人BMP6。在一些实施方案中，BMP6抗体可以抑制BMP6结合I型和/或II型受体(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5和/或ALK7)，且因此抑制BMP6-介导的信号传导(例如，Smad信号传导)。在一些实施方案中，BMP6抗体可以抑制BMP6结合共同受体，且因此抑制BMP6介导的信号传导(例如，Smad信号传导)。在一些实施方案中，本公开内容涉及多特异性抗体(例如，双特异性抗体)及其用途，所述抗体结合BMP6且进一步结合例如一种或多种额外GDF/BMP配体[例如，激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白AE、激活蛋白BE)、GDF8、GDF3、BMP15、BMP10和GDF11]、一种或多种I型受体和/或II型受体(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5和/或ALK7)和/或一种或多种共同受体。在一些实施方案中，结合BMP6的多特异性抗体不结合或基本上不结合BMP9(例如，以大于1 x 10^-7 M的K_D结合BMP9或具有相对适度的结合，例如，约1 x 10^-8 M或约1 x 10^-9 M)。在一些实施方案中，结合BMP6的多特异性抗体不结合或基本上不结合激活蛋白A(例如，以大于1 x 10^-7 M的K_D结合激活蛋白A或具有相对适度的结合，例如，约1 x 10^-8 M或约1 x 10^-9 M)。在一些实施方案中，本公开内容涉及抗体的组合及其用途，其中抗体的组合包含BMP6抗体和一种或多种额外的结合例如一种或多种额外GDF/BMP配体[例如，激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白AE、激活蛋白BE)、GDF8、GDF11、GDF3、BMP10和BMP15]、一种或多种I型受体和/或II型受体(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5和/或ALK7)和/或一种或多种共同受体的抗体。在一些实施方案中，包含BMP6抗体的抗体的组合不包含BMP9抗体。在一些实施方案中，包含BMP6抗体的抗体的组合不包含激活蛋白A抗体。

在某些方面，GDF/BMP拮抗剂抗体或抗体的组合是至少抑制GDF3的抗体。因此，在一些实施方案中，GDF/BMP拮抗剂抗体或抗体的组合结合至少GDF3。如本文所用的，GDF3抗体(或抗-GDF3抗体)通常是指可以以足够的亲和力结合GDF3、从而使得所述抗体可用作靶向GDF3的诊断剂和/或治疗剂的抗体。在某些实施方案中，GDF3抗体与不相关的非-GDF3蛋白的结合程度小于所述抗体与GDF3的结合的约10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或小于约1%，如例如通过放射免疫测定(RIA)、Biacore或其他蛋白相互作用或结合亲和力测定所测量的。在某些实施方案中，GDF3抗体结合在来自不同物种的GDF3中保守的GDF3的表位。在某些优选实施方案中，抗-GDF3抗体结合人GDF3。在一些实施方案中，GDF3抗体可以抑制GDF3结合I型和/或II型受体(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5和/或ALK7)，且因此抑制GDF3-介导的信号传导(例如，Smad信号传导)。在一些实施方案中，GDF3抗体可以抑制GDF3结合共同受体，且因此抑制GDF3介导的信号传导(例如，Smad信号传导)。在一些实施方案中，本公开内容涉及多特异性抗体(例如，双特异性抗体)及其用途，所述抗体结合GDF3且进一步结合例如一种或多种额外GDF/BMP配体[例如，激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白AE、激活蛋白BE)、GDF8、BMP6、BMP15、BMP10和GDF11]、一种或多种I型受体和/或II型受体(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5和/或ALK7)和/或一种或多种共同受体。在一些实施方案中，结合GDF3的多特异性抗体不结合或基本上不结合BMP9(例如，以大于1 x 10^-7 M的K_D结合BMP9或具有相对适度的结合，例如，约1 x 10^-8 M或约1 x 10^-9 M)。在一些实施方案中，结合GDF3的多特异性抗体不结合或基本上不结合激活蛋白A(例如，以大于1 x 10^-7 M的K_D结合激活蛋白A或具有相对适度的结合，例如，约1 x 10^-8 M或约1 x 10^-9 M)。在一些实施方案中，本公开内容涉及抗体的组合及其用途，其中抗体的组合包含GDF3抗体和一种或多种额外的结合例如一种或多种额外GDF/BMP配体[例如，激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白AE、激活蛋白BE)、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10和BMP15]、一种或多种I型受体和/或II型受体(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5和/或ALK7)和/或一种或多种共同受体的抗体。在一些实施方案中，包含GDF3抗体的抗体的组合不包含BMP9抗体。在一些实施方案中，包含GDF3抗体的抗体的组合不包含激活蛋白A抗体。

在某些方面，GDF/BMP拮抗剂抗体或抗体的组合是至少抑制BMP15的抗体。因此，在一些实施方案中，GDF/BMP拮抗剂抗体或抗体的组合结合至少BMP15。如本文所用的，BMP15抗体(或抗-BMP15抗体)通常是指可以以足够的亲和力结合BMP15、从而使得所述抗体可用作靶向BMP15的诊断剂和/或治疗剂的抗体。在某些实施方案中，BMP15抗体与不相关的非-BMP15蛋白的结合程度小于所述抗体与BMP15的结合的约10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或小于约1%，如例如通过放射免疫测定(RIA)、Biacore或其他蛋白相互作用或结合亲和力测定所测量的。在某些实施方案中，BMP15抗体结合在来自不同物种的BMP15中保守的BMP15的表位。在某些优选实施方案中，抗-BMP15抗体结合人BMP15。在一些实施方案中，BMP15抗体可以抑制BMP15结合I型和/或II型受体(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5和/或ALK7)，且因此抑制BMP15-介导的信号传导(例如，Smad信号传导)。在一些实施方案中，BMP15抗体可以抑制BMP15结合共同受体，且因此抑制BMP15介导的信号传导(例如，Smad信号传导)。在一些实施方案中，本公开内容涉及多特异性抗体(例如，双特异性抗体)及其用途，所述抗体结合BMP15且进一步结合例如一种或多种额外GDF/BMP配体[例如，激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白AE和激活蛋白BE)、GDF8、GDF11、GDF3、BMP10和BMP6]、一种或多种I型受体和/或II型受体(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5和/或ALK7)和/或一种或多种共同受体。在一些实施方案中，结合BMP15的多特异性抗体不结合或基本上不结合BMP9(例如，以大于1 x 10^-7 M的K_D结合BMP9或具有相对适度的结合，例如，约1 x 10^-8 M或约1 x 10^-9 M)。在一些实施方案中，结合BMP15的多特异性抗体不结合或基本上不结合激活蛋白A(例如，以大于1 x 10^-7 M的K_D结合激活蛋白A或具有相对适度的结合，例如，约1 x 10^-8 M或约1 x 10^-9 M)。在一些实施方案中，本公开内容涉及抗体的组合及其用途，其中抗体的组合包含BMP15抗体和一种或多种额外的结合例如一种或多种额外GDF/BMP配体[例如，激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白AE和激活蛋白BE)、GDF8、GDF3、BMP6、BMP10和GDF11]、一种或多种I型受体和/或II型受体(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5和/或ALK7)和/或一种或多种共同受体的抗体。在一些实施方案中，包含BMP15抗体的抗体的组合不包含BMP9抗体。在一些实施方案中，包含BMP15抗体的抗体的组合不包含激活蛋白A抗体。

在某些方面，GDF/BMP拮抗剂抗体或抗体的组合是至少抑制BMP10的抗体。因此，在一些实施方案中，GDF/BMP拮抗剂抗体或抗体的组合结合至少BMP10。如本文所用的，BMP10抗体(或抗-BMP10抗体)通常是指可以以足够的亲和力结合BMP10、从而使得所述抗体可用作靶向BMP10的诊断剂和/或治疗剂的抗体。在某些实施方案中，BMP10抗体与不相关的非-BMP10蛋白的结合程度小于所述抗体与BMP10的结合的约10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或小于约1%，如例如通过放射免疫测定(RIA)、Biacore或其他蛋白相互作用或结合亲和力测定所测量的。在某些实施方案中，BMP10抗体结合在来自不同物种的BMP10中保守的BMP10的表位。在某些优选实施方案中，抗-BMP10抗体结合人BMP10。在一些实施方案中，BMP10抗体可以抑制BMP10结合I型和/或II型受体(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5和/或ALK7)，且因此抑制BMP10-介导的信号传导(例如，Smad信号传导)。在一些实施方案中，BMP10抗体可以抑制BMP10结合共同受体，且因此抑制BMP10介导的信号传导(例如，Smad信号传导)。在一些实施方案中，本公开内容涉及多特异性抗体(例如，双特异性抗体)及其用途，所述抗体结合BMP10且进一步结合例如一种或多种额外GDF/BMP配体[例如，激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白AE和激活蛋白BE)、GDF8、GDF11、GDF3和BMP6]、一种或多种I型受体和/或II型受体(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5和/或ALK7)和/或一种或多种共同受体。在一些实施方案中，结合BMP10的多特异性抗体不结合或基本上不结合BMP9(例如，以大于1 x 10^-7 M的K_D结合BMP9或具有相对适度的结合，例如，约1 x 10^-8 M或约1 x 10^-9 M)。在一些实施方案中，结合BMP10的多特异性抗体不结合或基本上不结合激活蛋白A(例如，以大于1 x 10^-7 M的K_D结合激活蛋白A或具有相对适度的结合，例如，约1 x 10^-8 M或约1 x 10^-9 M)。在一些实施方案中，本公开内容涉及抗体的组合及其用途，其中抗体的组合包含BMP10抗体和一种或多种额外的结合例如一种或多种额外GDF/BMP配体[例如，激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白AE和激活蛋白BE)、GDF8、GDF3、BMP6、BMP10和GDF11]、一种或多种I型受体和/或II型受体(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5和/或ALK7)和/或一种或多种共同受体的抗体。在一些实施方案中，包含BMP10抗体的抗体的组合不包含BMP9抗体。在一些实施方案中，包含BMP10抗体的抗体的组合不包含激活蛋白A抗体。

在某些方面，GDF/BMP拮抗剂抗体或抗体的组合是至少抑制ActRIIB的抗体。因此，在一些实施方案中，GDF/BMP拮抗剂抗体或抗体的组合结合至少ActRIIB。如本文所用的，ActRIIB抗体(抗-ActRIIB抗体)通常是指以足够的亲和力结合ActRIIB、从而使得所述抗体可用作靶向ActRIIB的诊断剂和/或治疗剂的抗体。在某些实施方案中，抗-ActRIIB抗体与不相关的非-ActRIIB蛋白的结合程度小于所述抗体与ActRIIB的结合的约10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或小于约1%，如例如通过放射免疫测定(RIA)、Biacore或其他蛋白-蛋白相互作用或结合亲和力测定所测量的。在某些实施方案中，抗-ActRIIB抗体结合在来自不同物种的ActRIIB中保守的ActRIIB的表位。在某些优选实施方案中，抗-ActRIIB抗体结合人ActRIIB。在一些实施方案中，抗-ActRIIB抗体可以抑制一种或多种GDF/BMP配体[例如，GDF8、激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白AE和激活蛋白BE) GDF11、BMP6、GDF3、BMP10和BMP15]结合ActRIIB。在一些实施方案中，抗-ActRIIB抗体是多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，其结合ActRIIB和一种或多种GDF/BMP配体[例如，GDF11、GDF8、激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC) GDF3、BMP6和BMP10]、I型受体(例如，ALK4、ALK5和/或ALK7)、共同受体和/或额外II型受体(例如，ActRIIA)。在一些实施方案中，本公开内容涉及抗体的组合及其用途，其中抗体的组合包含抗-ActRIIB抗体和一种或多种额外的结合例如一种或多种GDF/BMP配体[例如，GDF11、GDF8、激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白AE和激活蛋白BE) BMP6、GDF3和BMP10]、共同受体、I型受体(例如，ALK4、ALK5和/或ALK7)和/或额外II型受体(例如，ActRIIA)的抗体。应当注意，ActRIIB与ActRIIA具有序列相似性，且因此结合ActRIIB的抗体在一些情况下也可以结合和/或抑制ActRIIA。

在某些方面，GDF/BMP拮抗剂抗体或抗体的组合是至少抑制ActRIIA的抗体。因此，在一些实施方案中，GDF/BMP拮抗剂抗体或抗体的组合结合至少ActRIIA。如本文所用的，ActRIIA抗体(抗-ActRIIA抗体)通常是指以足够的亲和力结合ActRIIA、从而使得所述抗体可用作靶向ActRIIA的诊断剂和/或治疗剂的抗体。在某些实施方案中，抗-ActRIIA抗体与不相关的非-ActRIIA蛋白的结合程度小于所述抗体与ActRIIA的结合的约10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或小于约1%，如例如通过放射免疫测定(RIA)、Biacore或其他蛋白-蛋白相互作用或结合亲和力测定所测量的。在某些实施方案中，抗-ActRIIA抗体结合在来自不同物种的ActRIIA中保守的ActRIIA的表位。在某些优选实施方案中，抗-ActRIIA抗体结合人ActRIIA。在一些实施方案中，抗-ActRIIA抗体可以抑制一种或多种GDF/BMP配体[例如，GDF8、激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白AE和激活蛋白BE) GDF11、BMP6、GDF3、BMP10和BMP15]结合ActRIIA。在一些实施方案中，抗-ActRIIA抗体是多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，其结合ActRIIA和一种或多种GDF/BMP配体[例如，GDF11、GDF8、激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC) GDF3、BMP6和BMP10]、I型受体(例如，ALK4、ALK5和/或ALK7)、共同受体和/或额外II型受体(例如，ActRIIB)。在一些实施方案中，本公开内容涉及抗体的组合及其用途，其中抗体的组合包含抗-ActRIIA抗体和一种或多种额外的结合例如一种或多种GDF/BMP配体[例如，GDF11、GDF8、激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白AE和激活蛋白BE) BMP6和BMP10]、共同受体、I型受体(例如，ALK4、ALK5和/或ALK7)和/或额外II型受体(例如，ActRIIB)的抗体。应当注意，ActRIIA与ActRIIB具有序列相似性，且因此结合ActRIIA的抗体在一些情况下也可以结合和/或抑制ActRIIB。

在某些方面，GDF/BMP拮抗剂抗体或抗体的组合是至少抑制ALK4的抗体。因此，在一些实施方案中，GDF/BMP拮抗剂抗体或抗体的组合结合至少ALK4。如本文所用的，ALK4抗体(抗-ALK4抗体)通常是指以足够的亲和力结合ALK4、从而使得所述抗体可用作靶向ALK4的诊断剂和/或治疗剂的抗体。在某些实施方案中，抗-ALK4抗体与不相关的非-ALK4蛋白的结合程度小于所述抗体与ALK4的结合的约10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或小于约1%，如例如通过放射免疫测定(RIA)、Biacore或其他蛋白-蛋白相互作用或结合亲和力测定所测量的。在某些实施方案中，抗-ALK4抗体结合在来自不同物种的ALK4中保守的ALK4的表位。在某些优选实施方案中，抗-ALK4抗体结合人ALK4。在一些实施方案中，抗-ALK4抗体可以抑制一种或多种GDF/BMP配体[例如，GDF8、激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白AE和激活蛋白BE) GDF11、BMP6、GDF3、BMP10和BMP15]结合ALK4。在一些实施方案中，抗-ALK4抗体是多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，其结合ALK4和一种或多种GDF/BMP配体[例如，GDF11、GDF8、激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC) GDF3、BMP6和BMP10]、II型受体(例如，ActRIIA和/或ActRIIB)、共同受体和/或额外I型受体(例如，ALK5和/或ALK7)。在一些实施方案中，本公开内容涉及抗体的组合及其用途，其中抗体的组合包含抗-ALK4抗体和一种或多种额外的结合例如一种或多种GDF/BMP配体[例如，GDF11、GDF8、激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白AE和激活蛋白BE) BMP6和BMP10]、共同受体、II型受体(例如，ActRIIA和/或ActRIIB)和/或额外I型受体(例如，ALK5和/或ALK7)的抗体。

在某些方面，GDF/BMP拮抗剂抗体或抗体的组合是至少抑制ALK5的抗体。因此，在一些实施方案中，GDF/BMP拮抗剂抗体或抗体的组合结合至少ALK5。如本文所用的，ALK5抗体(抗-ALK5抗体)通常是指以足够的亲和力结合ALK5、从而使得所述抗体可用作靶向ALK5的诊断剂和/或治疗剂的抗体。在某些实施方案中，抗-ALK5抗体与不相关的非-ALK5蛋白的结合程度小于所述抗体与ALK5的结合的约10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或小于约1%，如例如通过放射免疫测定(RIA)、Biacore或其他蛋白-蛋白相互作用或结合亲和力测定所测量的。在某些实施方案中，抗-ALK5抗体结合在来自不同物种的ALK5中保守的ALK5的表位。在某些优选实施方案中，抗-ALK5抗体结合人ALK5。在一些实施方案中，抗-ALK5抗体可以抑制一种或多种GDF/BMP配体[例如，GDF8、激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白AE和激活蛋白BE) GDF11、BMP6、GDF3、BMP10和BMP15]结合ALK5。在一些实施方案中，抗-ALK5抗体是多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，其结合ALK5和一种或多种GDF/BMP配体[例如，GDF11、GDF8、激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC) GDF3、BMP6和BMP10]、II型受体(例如，ActRIIA和/或ActRIIB)、共同受体和/或额外I型受体(例如，ALK4和/或ALK7)。在一些实施方案中，本公开内容涉及抗体的组合及其用途，其中抗体的组合包含抗-ALK5抗体和一种或多种额外的结合例如一种或多种GDF/BMP配体[例如，GDF11、GDF8、激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白AE和激活蛋白BE) BMP6和BMP10]、共同受体、II型受体(例如，ActRIIA和/或ActRIIB)和/或额外I型受体(例如，ALK4和/或ALK7)的抗体。

在某些方面，GDF/BMP拮抗剂抗体或抗体的组合是至少抑制ALK7的抗体。因此，在一些实施方案中，GDF/BMP拮抗剂抗体或抗体的组合结合至少ALK7。如本文所用的，ALK7抗体(抗-ALK7抗体)通常是指以足够的亲和力结合ALK7、从而使得所述抗体可用作靶向ALK7的诊断剂和/或治疗剂的抗体。在某些实施方案中，抗-ALK7抗体与不相关的非-ALK7蛋白的结合程度小于所述抗体与ALK7的结合的约10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或小于约1%，如例如通过放射免疫测定(RIA)、Biacore或其他蛋白-蛋白相互作用或结合亲和力测定所测量的。在某些实施方案中，抗-ALK7抗体结合在来自不同物种的ALK7中保守的ALK7的表位。在某些优选实施方案中，抗-ALK7抗体结合人ALK7。在一些实施方案中，抗-ALK7抗体可以抑制一种或多种GDF/BMP配体[例如，GDF8、激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白AE和激活蛋白BE) GDF11、BMP6、GDF3、BMP10和BMP15]结合ALK7。在一些实施方案中，抗-ALK7抗体是多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，其结合ALK7和一种或多种GDF/BMP配体[例如，GDF11、GDF8、激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC) GDF3、BMP6和BMP10]、II型受体(例如，ActRIIA和/或ActRIIB)、共同受体和/或额外I型受体(例如，ALK4和/或ALK5)。在一些实施方案中，本公开内容涉及抗体的组合及其用途，其中抗体的组合包含抗-ALK7抗体和一种或多种额外的结合例如一种或多种GDF/BMP配体[例如，GDF11、GDF8、激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白AE和激活蛋白BE) BMP6和BMP10]、共同受体、II型受体(例如，ActRIIA和/或ActRIIB)和/或额外I型受体(例如，ALK4和/或ALK5)的抗体。

术语抗体在本文以最广含义使用，且包含各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示期望的抗原-结合活性。抗体片段是指除了完整抗体以外的分子，其包含结合完整抗体所结合的抗原的完整抗体的一部分。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')₂；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体[参见，例如，Hudson等人(2003) Nat. Med. 9:129-134；Plückthun，The Pharmacology of MonoclonalAntibodies，vol. 113，Rosenburg和Moore编辑，(Springer-Verlag，New York)，pp. 269-315 (1994)；WO 93/16185; 和美国专利号5,571,894; 5,587,458; 和5,869,046]。双抗体是具有两个抗原结合部位的抗体片段，其可以是二价的或双特异性的[参见，例如，EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人(2003) Nat. Med. 9:129-134 (2003);和Hollinger等人(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448]。三链抗体和四链抗体（tetrabodies）也描述于Hudson等人(2003) Nat. Med. 9:129-134中。单-结构域抗体是包含抗体的所有或一部分重链可变结构域或所有或一部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单-结构域抗体是人单-结构域抗体[参见，例如，美国专利号6,248,516]。本文公开的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。在某些实施方案中，本公开内容的抗体包含与其附着且能够被检测的标记(例如，所述标记可以是放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子)。在某些优选实施方案中，本公开内容的抗体是分离的抗体。在某些优选实施方案中，本公开内容的抗体是重组抗体。

本文的抗体可以是任何类别的。抗体的类别是指由其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在5种主要类别的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，且这些类别中的几种可进一步分为亚类(同种型)，例如，IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁和IgA₂。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域被称为α、δ、ε、γ和μ。

通常，用于本文公开的方法中的抗体特异性结合其靶抗原，优选地具有高结合亲和力。亲和力可表示为K_D值，且反映固有结合亲和力(例如，具有最小化的亲合力（avidity）作用)。一般，结合亲和力在体外测量，无论是在无细胞的设置还是细胞缔合的设置下。本领域已知的许多测定的任一种，包括本文公开的那些，可用于获得结合亲和力测量结果，包括例如，Biacore、放射性标记的抗原-结合测定(RIA)和ELISA。在一些实施方案中，本公开内容的抗体以至少1x 10^-7或更强、1x10^-8或更强、1x10^-9或更强、1x10^-10或更强、1x10^-11或更强、1x10^-12或更强、1x10^-13或更强或1x10^-14或更强的K_D结合它们的靶抗原(例如，ActRIIB、ActRIIA、ALK4、ALK5、ALK7、激活蛋白、GDF11、GDF8、GDF3、BMP15、BMP10和/或BMP6)。

在某些实施方案中，K_D通过以目标抗体的Fab形式和其靶抗原进行的RIA测量，如由以下测定所述的。Fab对抗原的溶液结合亲和力通过在滴定系列的未标记抗原存在的情况下用最小浓度的放射性标记的抗原(例如， ¹²⁵I-标记的)平衡Fab，然后用抗-Fab抗体-包被的板捕获结合的抗原来测量[参见，例如，Chen等人(1999) J. Mol. Biol. 293:865-881]。为了确立该测定的条件，多孔板(例如，来自Thermo Scientific的MICROTITER^®)用捕获性抗-Fab抗体(例如，来自Cappel Labs)包被(例如，过夜)且随后用牛血清清蛋白封闭，优选地在室温(约23℃)。在非-吸附板中，放射性标记的抗原与系列稀释的目标Fab混合[例如，与抗-VEGF抗体Fab-12的评估一致，Presta等人，(1997) Cancer Res. 57:4593-4599]。然后将目标Fab温育，优选地温育过夜，但温育可持续更长时间段(例如，约65小时)以确保达到平衡。其后，将混合物转移至捕获板用于温育，优选地在室温温育约1小时。然后除去溶液，并将板洗涤几次，优选地用聚山梨醇酯20和PBS混合物。当板已经干燥时，加入闪烁体(例如，来自Packard的MICROSCINT^®)，并将板在γ计数器(例如，来自Packard的TOPCOUNT^®)上计数。

根据另一个实施方案，K_D使用表面等离振子共振测定，使用例如BIACORE^®2000或BIACORE^®3000 (BIAcore，Inc.，Piscataway，N.J.)用约10响应单位（responsive unit）(RU)的固定化抗原CM5芯片测量。简言之，羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIACORE，Inc.)用N-乙基-N'-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)根据供应商的说明书活化。例如，抗原可用10 mM乙酸钠pH 4.8稀释至5 µg/ml (约0.2 µM)，然后以5 µl/分钟的流速注射以实现近似10响应单位(RU)的偶联蛋白。在注射抗原后，注射1 M乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，以近似25 µl/min的流速注射在含0.05%聚山梨醇酯20 (TWEEN-20^®)表面活性剂的PBS (PBST)中的2倍系列稀释的Fab (0.78nM至500 nM)。缔合速率(k_on)和解离速率(k_off)使用例如，简单的一比一Langmuir结合模型(BIACORE^® Evaluation软件版本3.2)，通过同时拟合缔合和解离传感图计算。平衡解离常数(K_D)计算为比率k_off / k_on [参见，例如，Chen等人，(1999) J. Mol. Biol. 293:865-881]。如果通过上述表面等离振子共振测定，结合速率超过例如，10⁶ M^-1 s^-1，则结合速率可通过使用测量在渐增浓度的抗原存在的情况下PBS中20 nM抗-抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度的增加或减少(例如，激发=295 nm；发射=340 nm，16 nm带通)的荧光猝灭技术测定，如在分光计，诸如停流装备的分光光度计(Aviv Instruments)或带有搅拌杯的8000-系列SLM-AMINCO^®分光光度计(ThermoSpectronic)中所测量的。

抗体片段可以通过各种技术制备，所述技术包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及由重组宿主细胞(例如，大肠杆菌或噬菌体)产生，如本文所述的。人ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7、激活蛋白(激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C和激活蛋白E)、GDF11、GDF8、BMP15、GDF3、BMP10和BMP6的核酸和氨基酸序列是本领域已知的。此外，许多用于生成抗体的方法是本领域众所周知的，其中一些在本文中描述。因此，根据本公开内容使用的抗体拮抗剂可由技术人员基于本领域的知识和本文提供的教导常规制备。

在某些实施方案中，本文提供的抗体是嵌合抗体。嵌合抗体是指其中重链和/或轻链的一部分源自特定的来源或物种，而重链和/或轻链的剩余部分源自不同的来源或物种的抗体。某些嵌合抗体描述于例如，美国专利号4,816,567; 和Morrison等人，(1984)Proc. Natl. Acad. Sci. USA，81:6851-6855。在一些实施方案中，嵌合抗体包含非-人可变区(例如，源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非-人灵长类动物如猴的可变区)和人恒定区。在一些实施方案中，嵌合抗体是“类别转换的”抗体，其中类别或亚类已从亲本抗体改变。通常，嵌合抗体包括其抗原-结合片段。

在某些实施方案中，本文提供的嵌合抗体是人源化抗体。人源化抗体是指包含来自非-人高变区(HVR)的氨基酸残基和来自人构架区(FR)的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个且一般两个可变结构域，其中所有或基本上所有的HVR (例如，CDR)对应于非-人抗体的那些，且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的那些。人源化抗体任选地可至少包含源自人抗体的抗体恒定区的一部分。抗体的“人源化形式”，例如，非-人抗体，是指已经历人源化的抗体。人源化抗体和制备它们的方法综述于例如，Almagro和Fransson (2008) Front. Biosci. 13:1619-1633且进一步描述于例如，Riechmann等人，(1988) Nature 332:323-329；Queen等人(1989) Proc. Nat'lAcad. Sci. USA 86:10029-10033；美国专利号5,821,337；7,527,791；6,982,321；和7,087,409；Kashmiri等人，(2005) Methods 36:25-34 [描述SDR (a-CDR)嫁接]；Padlan，Mol. Immunol. (1991) 28:489-498 (描述了“表面重建（resurfacing）”)；Dall'Acqua等人(2005) Methods 36:43-60 (描述“FR改组”)；Osbourn等人(2005) Methods 36:61-68;和Klimka等人Br. J. Cancer (2000) 83:252-260 (描述FR改组的“指导的选择”方法)。可用于人源化的人构架区包括但不限于：使用“最佳拟合（best-fit）”方法选择的构架区[参见，例如，Sims等人(1993) J. Immunol. 151:2296 ]；源自轻链或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列的构架区[参见，例如，Carter等人(1992) Proc. Natl. Acad. Sci.USA，89:4285;和Presta等人(1993) J. Immunol.，151:2623]；人成熟(体细胞成熟)构架区或人种系构架区[参见，例如，Almagro和Fransson (2008) Front. Biosci. 13:1619-1633]；和源自筛选FR文库的构架区[参见，例如，Baca等人，(1997) J. Biol. Chem. 272:10678-10684;和Rosok等人，(1996) J. Biol. Chem. 271:22611-22618]。

在某些实施方案中，本文提供的抗体是人抗体。人抗体可使用本领域已知的各种技术产生。人抗体总体描述于van Dijk和van de Winkel (2008) Curr. Opin.Pharmacol. 5: 368-74 (2001)以及Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459。例如，人抗体可通过施用免疫原(例如，GDF11多肽、激活蛋白B多肽、ActRIIA多肽或ActRIIB多肽)至转基因动物来制备，所述转基因动物已经修饰以响应于抗原攻击产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。这种动物一般含有所有或一部分的人免疫球蛋白基因座，其置换内源免疫球蛋白基因座或其在染色体外存在或随机整合至动物的染色体中。在这种转基因动物中，内源免疫球蛋白基因座通常已被灭活。对于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见，例如，Lonberg (2005) Nat. Biotech. 23:1117-1125；美国专利号6,075,181和6,150,584 (描述XENOMOUSE™技术)；美国专利号5,770,429 (描述HuMab^®技术)；美国专利号7,041,870 (描述K-M MOUSE^®技术)；和美国专利申请公开号2007/0061900 (描述VelociMouse^®技术)。来自由这种动物产生的完整抗体的人可变区可被进一步修饰，例如，通过与不同的人恒定区组合。

本文提供的人抗体还可通过基于杂交瘤的方法制备。已描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人种间骨髓瘤（heteromyeloma）细胞系[参见，例如，Kozbor J.Immunol.，(1984) 133: 3001；Brodeur等人(1987) Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications，pp. 51-63，Marcel Dekker，Inc.，New York;和Boerner等人(1991) J. Immunol.，147: 86]。通过人B-细胞杂交瘤技术产生的人抗体还描述于Li等人，(2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA，103:3557-3562。额外的方法包括描述于例如，美国专利号7,189,826 (描述从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和倪，现代免疫学(2006) 26(4):265-268 (2006) (描述人-人杂交瘤)中的那些。人杂交瘤技术(Trioma技术)还描述于Vollmers和Brandlein (2005) Histol. Histopathol.，20(3):927-937(2005)和Vollmers和Brandlein (2005) Methods Find Exp. Clin. Pharmacol.，27(3):185-91。本文提供的人抗体还可通过分离选自人-衍生的噬菌体展示文库的Fv克隆可变-结构域序列产生。这种可变-结构域序列然后可与期望的人恒定结构域组合。用于从抗体文库选择人抗体的技术是本领域已知的且在本文描述。

例如，本公开内容的抗体可通过筛选组合文库的具有期望的一种或多种活性的抗体来分离。产生噬菌体展示文库和筛选这种文库的具有期望的结合特征的抗体的多种方法是本领域已知的。这种方法综述于例如，Hoogenboom等人(2001)的Methods in MolecularBiology 178:1-37，O'Brien等人编辑，Human Press，Totowa，N.J.，且进一步描述于例如，McCafferty等人(1991) Nature 348:552-554；Clackson等人，(1991) Nature 352: 624-628；Marks等人(1992) J. Mol. Biol. 222:581-597；Marks和Bradbury (2003)的Methodsin Molecular Biology 248:161-175，Lo编辑，Human Press，Totowa，N.J.；Sidhu等人(2004) J. Mol. Biol. 338(2):299-310；Lee等人(2004) J. Mol. Biol. 340(5):1073-1093；Fellouse (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472;和Lee等人(2004) J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132。

在某些噬菌体展示方法中，VH和VL基因的所有组成成分（repertoires）分别通过聚合酶链反应(PCR)克隆并在噬菌体文库中随机重组，其然后可针对抗原-结合噬菌体进行筛选，如描述于Winter等人(1994) Ann. Rev. Immunol.，12: 433-455中的。噬菌体一般作为单链Fv (scFv)片段或作为Fab片段展示抗体片段。来自免疫的来源的文库在不需要构建杂交瘤的情况下提供针对免疫原(例如，ActRIIA、ActRIIB、激活蛋白、GDF11、GDF8、BMP15、GDF3或BMP6)的高-亲和力抗体。另一方面，首次用于实验的（naive）所有组成成分可被克隆(例如，从人)以在没有任何免疫的情况下提供针对广泛范围的非-自身且以及自身抗原的单一来源的抗体，如描述于Griffiths等人(1993) EMBO J，12: 725-734中的。最后，首次用于实验的文库还可通过如下合成制备：从干细胞克隆未重排V-基因区段并使用包含随机序列的PCR引物，以编码高度可变的CDR3区和实现体外重排，如描述于Hoogenboom和Winter(1992) J. Mol. Biol.，227: 381-388中的。描述人抗体噬菌体文库的专利出版物包括例如：美国专利号5,750,373和美国专利公开号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。

在某些实施方案中，本文提供的抗体是多特异性抗体，例如，双特异性抗体。多特异性抗体(一般单克隆抗体)具有对一种或多种(例如，两种、三种、四种、五种、六种或更多种)抗原上的至少两个不同的表位(例如，两个、三个、四个、五个或六个或更多个)的结合特异性。

用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于重组共表达具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链/正链对[参见，例如，Milstein和Cuello (1983) Nature 305: 537; 国际专利公开号WO 93/08829; 和Traunecker等人 (1991) EMBO J. 10: 3655, 和美国专利号5,731,168 (“杵-臼(knob-in-hole)”人工改造)]。多特异性抗体也可以通过如下制备：人工改造静电指导作用用于制备抗体Fc-异二聚的分子(参见，例如，WO 2009/089004A1)；交联两种或多种抗体或片段[参见，例如，美国专利号4,676,980; 和Brennan等人 (1985)Science, 229: 81]；使用亮氨酸拉链以产生双特异性抗体[参见，例如，Kostelny等人(1992) J. Immunol., 148(5):1547-1553]；使用“双抗体”技术用于制备双特异性抗体片段[参见，例如，Hollinger等人 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448]；使用单链Fv(sFv)二聚体[参见，例如，Gruber等人 (1994) J. Immunol., 152:5368]；和制备三特异性抗体(参见，例如，Tutt等人 (1991) J. Immunol. 147: 60。可以将多特异性抗体制备为全长抗体或抗体片段。本文还包括具有三个或更多个功能性抗原结合部位的人工改造的抗体，包括“章鱼抗体（Octopus antibody）”[参见，例如，US 2006/0025576A1]。

在某些实施方案中，本文公开的抗体是单克隆抗体。单克隆抗体是指获得自一群基本上均质的抗体的抗体，即，构成该群体的个别抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了可能的变体抗体，例如，含有天然存在的突变或在产生单克隆抗体制剂期间产生，这种变体通常以较少量存在。与一般包括针对不同表位的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每个单克隆抗体针对抗原上的单一表位。因此，修饰语“单克隆”表示抗体获得自抗体的基本均质群体的性质且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，待根据本发明的方法使用的单克隆抗体可通过多种技术制备，所述技术包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有所有或部分的人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，这种方法和制备单克隆抗体的其他示例性方法在本文中描述。

例如，通过使用源自激活蛋白的免疫原，抗-蛋白/抗-肽抗血清或单克隆抗体可通过标准规程制备[参见，例如，Antibodies: A Laboratory Manual，Harlow和Lane编辑(1988) Cold Spring Harbor Press: 1988]。哺乳动物如小鼠、仓鼠或兔可用激活蛋白多肽的免疫原性形式、能够引发抗体应答的抗原片段或融合蛋白免疫。赋予蛋白或肽免疫原性的技术包括与载体缀合或本领域众所周知的其他技术。激活蛋白多肽的免疫原性部分可在佐剂存在的情况下施用。免疫进展可通过检测血浆或血清中的抗体效价来监控。标准ELISA或其他免疫测定可与作为抗原的免疫原一起用于评估抗体产生的水平和/或结合亲和力的水平。

用激活蛋白的抗原制剂免疫动物后，可获得抗血清，并且如果期望，可从血清分离多克隆抗体。为了产生单克隆抗体，产生抗体的细胞(淋巴细胞)可从免疫的动物收获，且通过标准体细胞融合程序与无限增殖化细胞如骨髓瘤细胞融合，以得到杂交瘤细胞。这种技术是本领域众所周知的且包括例如，杂交瘤技术[参见，例如，Kohler和Milstein (1975)Nature，256: 495-497]、人B细胞杂交瘤技术[参见，例如，Kozbar等人(1983) ImmunologyToday，4:72]和产生人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术[Cole等人(1985) MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy，Alan R. Liss，Inc. pp. 77-96]。杂交瘤细胞可针对与激活蛋白多肽特异性反应的抗体的产生进行免疫化学筛选，且从包含这种杂交瘤细胞的培养物分离单克隆抗体。

在某些实施方案中，一个或多个氨基酸修饰可引入本文提供的抗体的Fc区，由此产生Fc区变体。Fc区变体可包含在一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如，取代、缺失和/或添加)的人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)。

例如，本公开内容预期具有一些但并非所有效应子功能的抗体变体，对于其中抗体的体内半衰期是重要的、但某些效应子功能[例如，依赖补体的细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)]是不必要的或有害的应用，这使得它成为期望的候选物。可进行体外和/或体内细胞毒性测定以证实CDC和/或ADCC活性的减少/耗尽。例如，可进行Fc受体(FcR)结合测定以确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。介导ADCC的原代细胞，NK细胞，仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达概述于例如，Ravetch和Kinet (1991) Annu. Rev.Immunol. 9:457-492。评估目标分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例描述于美国专利号5,500,362；Hellstrom, I.等人(1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7059-7063]; Hellstrom, I等人 (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:1499-1502; 美国专利号5,821,337; Bruggemann, M. 等人 (1987)J. Exp. Med. 166:1351-1361。另一方面，可采用非-放射性测定方法(例如，ACTI™，用于流式细胞术的非-放射性细胞毒性测定；CellTechnology，Inc. Mountain View，Calif.;和CytoTox 96^®非-放射性细胞毒性测定，Promega，Madison，Wis.)。用于这种测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。另一方面，或另外，目标分子的ADCC活性可体内评估，例如，在动物模型中，如公开于Clynes等人(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:652-656中的。也可进行C1q结合测定以证实抗体不能结合C1q且因此缺乏CDC活性[参见，例如，WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA]。为了评估补体活化，可进行CDC测定[参见，例如，Gazzano-Santoro等人(1996) J. Immunol. Methods 202:163；Cragg，M. S.等人(2003) Blood 101:1045-1052;和Cragg，M. S和M. J. Glennie (2004) Blood 103:2738-2743]。FcRn结合和体内清除率/半衰期测定也可使用本领域已知的方法进行[参见，例如，Petkova，S. B.等人(2006) Intl. Immunol. 18(12):1759-1769]。具有减少的效应子功能的本公开内容的抗体包括具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329的一个或多个的取代的那些(美国专利号6,737,056)。这种Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327的两个或更多个处具有取代的Fc突变体，包括残基265和297取代为丙氨酸的所谓的“DANA” Fc突变体(美国专利号7,332,581)。

在某些实施方案中，可能期望产生半胱氨酸人工改造的抗体，例如，“thioMAb”，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在具体实施方案中，取代的残基出现在抗体的可及位点。通过用半胱氨酸取代那些残基，反应性硫醇基团由此位于抗体的可及位点，且可用于使抗体与其他部分如药物部分或接头-药物部分缀合，以产生免疫缀合物（immunoconjugate），如本文进一步描述的。在某些实施方案中，以下残基中的任何一种或多种可被半胱氨酸取代：轻链的V205 (Kabat编号)；重链的A118 (EU编号)；和重链Fc区的S400 (EU编号)。半胱氨酸人工改造的抗体可如例如美国专利号7,521,541中所述产生。

此外，用于筛选抗体以鉴定期望的抗体的技术可影响获得的抗体的性质。例如，如果抗体用于在溶液中结合抗原，可能期望测试溶液结合。用于测试抗体和抗原之间的相互作用以鉴定特别期望的抗体的多种不同的技术是可用的。这种技术包括ELISA、表面等离振子共振结合测定(例如，Biacore结合测定，Biacore AB，Uppsala，Sweden)、夹心测定(例如，IGEN International，Inc.，Gaithersburg，Maryland的顺磁珠系统)、蛋白质印迹、免疫沉淀测定和免疫组织化学。

在某些实施方案中，预期本文提供的抗体和/或结合多肽的氨基酸序列变体。例如，可能期望改进抗体和/或结合多肽的结合亲和力和/或其他生物学性质。抗体和/或结合多肽的氨基酸序列变体可通过将合适的修饰引入编码抗体和/或结合多肽的核苷酸序列或通过肽合成来制备。这种修饰包括例如，抗体和/或结合多肽的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或取代。可进行缺失、插入和取代的任何组合以获得最终的构建体，只要最终的构建体具有期望的特征，例如，靶结合(例如，和激活蛋白诸如激活蛋白E和/或激活蛋白C结合)。

可在HVR中进行改变(例如，取代)，例如以改进抗体亲和力。这种改变可在HVR“热点”，即由在体细胞成熟过程中经历高频率的突变的密码子编码的残基[参见，例如，Chowdhury (2008) Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)]和/或SDRs (a-CDRs)中进行，其中测试所得变体VH或VL的结合亲和力。本领域已描述通过构建二级文库和从其中重新选择的亲和力成熟[参见，例如，Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178:1-37，O'Brien等编辑，Human Press，Totowa，N.J.，(2001)]。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法的任一种将多样性引入经选择用于成熟的可变基因中(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸指导的诱变)。然后产生二级文库。然后筛选该文库以鉴定具有期望亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法包括HVR指导的方法，其中几个HVR残基(例如，一次4-6残基)被随机化。与抗原结合有关的HVR残基可被特别鉴定，例如，使用丙氨酸分区诱变或建模。具体而言，经常靶向CDR-H3和CDR-L3。

在某些实施方案中，取代、插入或缺失可在一个或多个HVR内发生，只要这种改变基本上不减少抗体结合抗原的能力。例如，基本上不减少结合亲和力的保守改变(例如，如本文提供的保守取代)可在HVR中进行。这种改变可在HVR“热点”或SDR之外。在上述提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR是未改变的，或含有仅仅一个、两个或三个氨基酸取代。

用于鉴定抗体和/或结合多肽的可针对诱变靶向的残基或区域的有用方法被称为“丙氨酸分区诱变”，如Cunningham和Wells (1989) Science，244:1081-1085所述的。在该方法中，残基或一组靶残基(例如，带电荷的残基，如Arg、Asp、His、Lys和Glu)被鉴定和被中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或多丙氨酸（polyalanine）)置换，以确定抗体-抗原的相互作用是否受到影响。进一步的取代可在显示对最初取代的功能敏感性的氨基酸位置引入。另一方面，或另外，测定抗原-抗体复合体的晶体结构以鉴定抗体和抗原之间的接触点。这种接触残基和邻近残基可作为取代的候选物被靶向或消除。变体可经筛选以确定它们是否含有期望的性质。

氨基酸序列插入包括长度范围从1个残基一直到包含一百或更多个残基的多肽的氨基-和/或羧基-末端融合物，以及单个或多个氨基酸残基的序列内（intrasequence）插入。末端插入的实例包括具有N-末端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括抗体的N-或C-末端融合至酶(例如，对于ADEPT)或增加抗体的血清半衰期的多肽。

在某些实施方案中，本文提供的抗体和/或结合多肽可进一步修饰以含有本领域已知的且容易获得的另外的非蛋白部分。适合于衍生抗体和/或结合多肽的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧基甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧杂环戊烷、聚-1,3,6-三氧杂环已烷、乙烯/马来酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇（propropylene glycol）均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇和其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性可具有制造中的益处。聚合物可具有任何分子量且可以是分支的或未分支的。附着至抗体和/或结合多肽的聚合物的数目可改变，且如果附着超过一个聚合物，则它们可以是相同的或不同的分子。通常，用于衍生的聚合物的数目和/或类型可基于以下考虑来确定，包括但不限于待改进的抗体和/或结合多肽的特定性质或功能，无论抗体衍生物和/或结合多肽衍生物是否将在限定的条件下用于疗法中。

5.小分子拮抗剂

在其他方面，待根据本文描述的方法和用途使用的GDF/BMP拮抗剂是小分子(GDF/BMP小分子拮抗剂)，或小分子拮抗剂的组合。GDF/BMP小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合可以抑制例如一种或多种GDF/BMP配体(例如，激活蛋白、GDF11、GDF8、GDF3、BMP6、BMP10和/或BMP15)、I型受体(例如，ALK4、ALK5和/或ALK7)、II型受体(例如，ActRIIB和/或ActRIIA)、共同受体和/或一种或多种信号传导因子(例如，Smad蛋白，如Smads 2和3)。在一些实施方案中，GDF/BMP小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合抑制由一种或多种GDF/BMP配体介导的信号传导，例如，如在基于细胞的测定、如本文所述的那些中所测定的。如本文所述的，可以单独或与一种或多种支持疗法或活性剂组合使用GDF/BMP小分子拮抗剂，以治疗、预防或降低肺高血压(PH)的进展率和/或严重程度，特别是治疗、预防或降低一种或多种PH相关并发症的进展率和/或严重程度。

在一些实施方案中，GDF/BMP小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合至少抑制GDF11，任选地进一步抑制GDF8、激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白AE和/或激活蛋白BE)、GDF3、BMP6、BMP10、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7和一种或多种Smad蛋白(例如，Smads 2和3)中的一种或多种。在一些实施方案中，GDF/BMP小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合至少抑制GDF8，任选地进一步抑制GDF11、激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白AE和/或激活蛋白BE)、GDF3、BMP6、BMP10、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7和一种或多种Smad蛋白(例如，Smads 2和3)中的一种或多种。在一些实施方案中，GDF/BMP小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合至少抑制激活蛋白(激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白AE和/或激活蛋白BE)，任选地进一步抑制GDF8、GDF11、GDF3、BMP6、BMP10、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7和一种或多种Smad蛋白(例如，Smads 2和3)中的一种或多种。在一些实施方案中，GDF/BMP小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合至少抑制激活蛋白B，任选地进一步抑制GDF8、GDF11、GDF3、BMP6、BMP10、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7和一种或多种Smad蛋白(例如，Smads 2和3)中的一种或多种。在一些实施方案中，GDF/BMP小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合至少抑制BMP6，任选地进一步抑制GDF8、激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白AE和/或激活蛋白BE)、GDF3、GDF11、BMP10、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7和一种或多种Smad蛋白(例如，Smads 2和3)中的一种或多种。在一些实施方案中，GDF/BMP小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合至少抑制BMP15，任选地进一步抑制GDF8、激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白AE和/或激活蛋白BE)、GDF3、BMP6、GDF11、BMP10、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7和一种或多种Smad蛋白(例如，Smads 2和3)中的一种或多种。在一些实施方案中，GDF/BMP小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合至少抑制GDF3，任选地进一步抑制GDF8、激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白AE和/或激活蛋白BE)、BMP15、BMP6、GDF11、BMP10、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7和一种或多种Smad蛋白(例如，Smads 2和3)中的一种或多种。在一些实施方案中，GDF/BMP小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合至少抑制BMP10，任选地进一步抑制GDF8、激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白AE和/或激活蛋白BE)、BMP15、BMP6、GDF11、GDF3、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7和一种或多种Smad蛋白(例如，Smads 2和3)中的一种或多种。在一些实施方案中，GDF/BMP小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合至少抑制ActRIIA，任选地进一步抑制GDF8、激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白AE和/或激活蛋白BE)、BMP15、BMP6、GDF11、GDF3、BMP10、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7和一种或多种Smad蛋白(例如，Smads 2和3)中的一种或多种。在一些实施方案中，GDF/BMP小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合至少抑制ActRIIB，任选地进一步抑制GDF8、激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白AE和/或激活蛋白BE)、BMP15、BMP6、GDF11、GDF3、ActRIIA、BMP10、ALK4、ALK5、ALK7和一种或多种Smad蛋白(例如，Smads 2和3)中的一种或多种。在一些实施方案中，GDF/BMP小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合至少抑制ALK4，任选地进一步抑制GDF8、激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白AE和/或激活蛋白BE)、BMP15、BMP6、GDF11、GDF3、ActRIIA、ActRIIB、BMP10、ALK5、ALK7和一种或多种Smad蛋白(例如，Smads 2和3)中的一种或多种。在一些实施方案中，GDF/BMP小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合至少抑制ALK5，任选地进一步抑制GDF8、激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白AE和/或激活蛋白BE)、BMP15、BMP6、GDF11、GDF3、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、BMP10、ALK7和一种或多种Smad蛋白(例如，Smads 2和3)中的一种或多种。在一些实施方案中，GDF/BMP小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合至少抑制ALK7，任选地进一步抑制GDF8、激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白AE和/或激活蛋白BE)、BMP15、BMP6、GDF11、GDF3、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、BMP10和一种或多种Smad蛋白(例如，Smads 2和3)中的一种或多种。在一些实施方案中，如本文所公开的GDF/BMP小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合不抑制或基本上不抑制BMP9。在一些实施方案中，如本文所公开的GDF/BMP小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合不抑制或基本上不抑制激活蛋白A。

GDF/BMP小分子拮抗剂可以是直接或间接抑制剂。例如，间接小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合可以抑制至少一种或多种GDF/BMP配体[例如，激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白B、激活蛋白BC、激活蛋白AE或激活蛋白BE)、GDF11、BMP15、BMP6、GDF3、BMP10和/或GDF8]、I型受体(例如，ALK4、ALK5和/或ALK7)、II型受体(例如，ActRIIA和/或ActRIIB)、共同受体和/或一种或多种下游信号传导组分(例如，Smads)的表达(例如，转录、翻译、细胞分泌或其组合)。另一方面，直接小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合可以直接结合和抑制例如一种或多种一种或多种GDF/BMP配体[例如，激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白B、激活蛋白BC、激活蛋白AE或激活蛋白BE)、GDF11、BMP15、BMP6、GDF3、BMP10和/或GDF8]、I型受体(例如，ALK4、ALK5和/或ALK7)、II型受体(例如，ActRIIA和/或ActRIIB)、共同受体和/或一种或多种下游信号传导组分(例如，Smads)。一种或多种间接和一种或多种直接GDF/BMP小分子拮抗剂的组合可以根据本文公开的方法使用。

本公开内容的结合小分子拮抗剂可使用已知的方法鉴定和化学合成(参见，例如，PCT公开号WO 00/00823和WO 00/39585)。通常，本公开内容的小分子拮抗剂通常大小小于约2000道尔顿，另一方面大小小于约1500、750、500、250或200道尔顿，其中这种有机小分子能够结合、优选地特异性结合如本文所述的多肽。这些小分子拮抗剂可使用众所周知的技术在没有过度实验的情况下鉴定。在这方面，注意用于针对能够结合多肽靶的分子筛选有机小分子文库的技术是本领域众所周知的(参见，例如，国际专利公开号WO00/00823和WO00/39585)。

本公开内容的结合有机小分子可以是例如，醛、酮、肟、腙、缩氨基脲、卡巴肼、伯胺、仲胺、叔胺、N-取代的肼、酰肼、醇、醚、硫醇、硫醚、二硫化物、羧酸、酯、酰胺、脲、氨基甲酸酯、碳酸酯、缩酮、酮缩硫醇、缩醛、硫缩醛、芳基卤、芳基磺酸酯、烷基卤、烷基磺酸酯、芳族化合物、杂环化合物、苯胺、链烯、炔、二醇、氨基醇、唑烷、唑啉、噻唑烷、噻唑啉、烯胺、磺酰胺、环氧化物、氮丙啶、异氰酸酯、磺酰氯、重氮化合物和酰基氯。

6.多核苷酸拮抗剂

在其他方面，待根据本文公开的方法和用途使用的GDF/BMP拮抗剂是多核苷酸(GDF/BMP多核苷酸拮抗剂)或多核苷酸的组合。GDF/BMP多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂的组合可以抑制例如一种或多种GDF/BMP配体(例如，激活蛋白、GDF11、GDF8、GDF3、BMP6、BMP10和/或BMP15)、I型受体(例如，ALK4、ALK5和/或ALK7)、II型受体(例如，ActRIIA和/或ActRIIB)、共同受体和/或下游信号传导组分(例如，Smads)。在一些实施方案中，GDF/BMP多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂的组合抑制由一种或多种GDF/BMP配体介导的信号传导，例如，如在基于细胞的测定、如本文所述的那些中所测定的。如本文所述的，可以单独或与一种或多种支持疗法或活性剂组合使用GDF/BMP多核苷酸拮抗剂，以治疗、预防或降低肺高血压(PH)的进展率和/或严重程度，特别是治疗、预防或降低一种或多种PH相关并发症的进展率和/或严重程度。

在一些实施方案中，GDF/BMP多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂的组合至少抑制GDF11，任选地进一步抑制GDF8、激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白AE和/或激活蛋白BE)、GDF3、BMP6、BMP15、BMP10、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7和一种或多种Smad蛋白(例如，Smads 2和3)中的一种或多种。在一些实施方案中，GDF/BMP多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂的组合至少抑制GDF8，任选地进一步抑制GDF11、激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白AE和/或激活蛋白BE)、GDF3、BMP6、BMP15、BMP10、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7和一种或多种Smad蛋白(例如，Smads 2和3)中的一种或多种。在一些实施方案中，GDF/BMP多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂的组合至少抑制激活蛋白(激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白AE和/或激活蛋白BE)，任选地进一步抑制GDF8、GDF11、GDF3、BMP6、BMP15、BMP10、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7和一种或多种Smad蛋白(例如，Smads 2和3)中的一种或多种。在一些实施方案中，GDF/BMP多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂的组合至少抑制激活蛋白B，任选地进一步抑制GDF8、GDF11、GDF3、BMP6、BMP15、BMP10、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7和一种或多种Smad蛋白(例如，Smads 2和3)中的一种或多种。在一些实施方案中，GDF/BMP多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂的组合至少抑制BMP6，任选地进一步抑制GDF8、激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白AE和/或激活蛋白BE)、GDF3、GDF11、BMP15、BMP10、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7和一种或多种Smad蛋白(例如，Smads 2和3)中的一种或多种。在一些实施方案中，GDF/BMP多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂的组合至少抑制BMP15，任选地进一步抑制GDF8、激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白AE和/或激活蛋白BE)、GDF3、BMP6、GDF11、BMP10、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7和一种或多种Smad蛋白(例如，Smads 2和3)中的一种或多种。在一些实施方案中，GDF/BMP多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂的组合至少抑制GDF3，任选地进一步抑制GDF8、激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白AE和/或激活蛋白BE)、BMP15、BMP6、GDF11、BMP10、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7和一种或多种Smad蛋白(例如，Smads 2和3)中的一种或多种。在一些实施方案中，GDF/BMP多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂的组合至少抑制BMP10，任选地进一步抑制GDF8、激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白AE和/或激活蛋白BE)、BMP15、BMP6、GDF11、GDF3、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7和一种或多种Smad蛋白(例如，Smads 2和3)中的一种或多种。在一些实施方案中，GDF/BMP多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂的组合至少抑制ActRIIA，任选地进一步抑制GDF8、激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白AE和/或激活蛋白BE)、BMP15、BMP6、GDF11、GDF3、BMP10、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7和一种或多种Smad蛋白(例如，Smads 2和3)中的一种或多种。在一些实施方案中，GDF/BMP多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂的组合至少抑制ActRIIB，任选地进一步抑制GDF8、激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白AE和/或激活蛋白BE)、BMP15、BMP6、GDF11、GDF3、ActRIIA、BMP10、ALK4、ALK5、ALK7和一种或多种Smad蛋白(例如，Smads 2和3)中的一种或多种。在一些实施方案中，GDF/BMP多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂的组合至少抑制ALK4，任选地进一步抑制GDF8、激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白AE和/或激活蛋白BE)、BMP15、BMP6、GDF11、GDF3、ActRIIA、ActRIIB、BMP10、ALK5、ALK7和一种或多种Smad蛋白(例如，Smads 2和3)中的一种或多种。在一些实施方案中，GDF/BMP多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂的组合至少抑制ALK5，任选地进一步抑制GDF8、激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白AE和/或激活蛋白BE)、BMP15、BMP6、GDF11、GDF3、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、BMP10、ALK7和一种或多种Smad蛋白(例如，Smads 2和3)中的一种或多种。在一些实施方案中，GDF/BMP多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂的组合至少抑制ALK7，任选地进一步抑制GDF8、激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、激活蛋白AB、激活蛋白AC、激活蛋白BC、激活蛋白AE和/或激活蛋白BE)、BMP15、BMP6、GDF11、GDF3、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、BMP10和一种或多种Smad蛋白(例如，Smads 2和3)中的一种或多种。在一些实施方案中，如本文所公开的GDF/BMP多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂的组合不抑制或基本上不抑制BMP9。在一些实施方案中，如本文所公开的GDF/BMP多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂的组合不抑制或基本上不抑制激活蛋白A。

在一些实施方案中，本公开内容的多核苷酸拮抗剂可以是反义核酸、RNAi分子[例如，小干扰RNA (siRNA)、小-发夹RNA (shRNA)、微RNA (miRNA)]、适体和/或核酶。人GDF11、GDF8、激活蛋白(激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C和激活蛋白E)、BMP6、GDF3、ActRIIA、ActRIIB、BMP10、ALK4、ALK5、ALK7、BMP15和Smad蛋白的核酸和氨基酸序列是本领域已知的。此外，生成多核苷酸拮抗剂的许多不同方法是本领域众所周知的。因此，根据本公开内容使用的多核苷酸拮抗剂可由技术人员基于本领域的知识和本文提供的教导常规制备。

反义技术可用于通过反义DNA或RNA或通过三股螺旋形成来控制基因表达。反义技术讨论于例如，Okano (1991) J. Neurochem. 56:560；Oligodeoxynucleotides asAntisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, Fla. (1988)。三股螺旋形成讨论于例如，Cooney等人(1988) Science 241:456;和Dervan等人，(1991)Science 251:1300。该方法基于多核苷酸与互补DNA或RNA的结合。在一些实施方案中，反义核酸包含单链的RNA或DNA序列，其与本文公开的基因的RNA转录物的至少一部分互补。然而，绝对互补性尽管是优选的，但不是必需的。

本文提及的“与RNA的至少一部分互补的”序列是指具有足够的互补性以能够与RNA杂交，从而形成稳定的双链体的序列；在本文公开的基因的双链反义核酸的情况下，可因此测试双链体DNA的单链，或可测定三链体形成。杂交能力取决于互补性的程度和反义核酸的长度两者。通常，杂交核酸越长，其可含有且仍形成稳定的双链体(或根据具体情况，三链体)的与RNA的碱基错配越多。本领域技术人员可通过使用确定杂交的复合体的解链温度的标准程序来确定可允许的错配程度。

与信息的5'端、例如直至和包括AUG起始密码子的5'-非翻译序列互补的多核苷酸应在抑制翻译中最有效地起作用。然而，与mRNA的3'-非翻译序列互补的序列已显示也有效抑制mRNA的翻译[参见，例如，Wagner，R.，(1994) Nature 372:333-335]。因此，与本公开内容的基因的5'-或3'-非翻译、非编码区互补的寡核苷酸可用于反义方法中以抑制内源mRNA的翻译。与mRNA的5'-非翻译区互补的多核苷酸应包括AUG起始密码子的互补序列（complement）。与mRNA编码区互补的反义多核苷酸是较不有效的翻译抑制剂，但可以根据本公开内容的方法使用。无论是设计为与本公开内容的mRNA的5'-、3'-还是编码区杂交，反义核酸长度都应为至少6个核苷酸且优选为长度范围从6一直到约50个核苷酸的寡核苷酸。在具体方面，寡核苷酸为至少10个核苷酸、至少17个核苷酸、至少25个核苷酸或至少50个核苷酸。

在一个实施方案中，本公开内容的反义核酸通过从外源序列转录在细胞内产生。例如，载体或其部分经转录，从而产生本公开内容的基因的反义核酸(RNA)。这种载体将含有编码期望的反义核酸的序列。这种载体可保持附加型或成为染色体整合的，只要其可被转录以产生期望的反义RNA。这种载体可通过本领域标准的重组DNA技术方法构建。载体可以是用于在脊椎动物细胞中复制和表达的质粒、病毒或本领域已知的其他载体。编码本公开内容的期望的基因或其片段的序列的表达可通过本领域已知的在脊椎动物、优选地人细胞中起作用的任何启动子进行。这种启动子可以是诱导型或组成型的。这种启动子包括但不限于SV40早期启动子区[参见，例如，Benoist和Chambon (1981) Nature 290:304-310]、在劳斯肉瘤病毒的3'长-末端重复序列中含有的启动子[参见，例如，Yamamoto等人(1980)Cell 22:787-797]、疱疹胸苷启动子[参见，例如，Wagner等人(1981) Proc. Natl. Acad.Sci. U.S.A. 78:1441-1445]和金属硫蛋白基因的调节性序列[参见，例如，Brinster,等人(1982) Nature 296:39-42]。

在一些实施方案中，多核苷酸拮抗剂是干扰RNA（RNAi）分子，其靶向以下中的一种或多种的表达：GDF11、GDF8、激活蛋白(激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C和激活蛋白E)、BMP6、GDF3、ActRIIA、ActRIIB、BMP10、ALK4、ALK5、ALK7、BMP15和Smad蛋白。RNAi是指干扰靶向的mRNA的表达的RNA的表达。具体而言，RNAi通过与特定的mRNA通过siRNA(小干扰RNA)相互作用来沉默靶向的基因。ds RNA复合体然后被靶向用于由细胞降解。siRNA分子是长度10-50个核苷酸的双链的RNA双链体，其干扰足够互补(例如，与该基因具有至少80%同一性)的靶基因的表达。在一些实施方案中，siRNA分子包含与靶基因的核苷酸序列具有至少85、90、95、96、97、98、99或100%同一性的核苷酸序列。

额外的RNAi分子包括短发夹RNA (shRNA)；以及短干扰发夹和微RNA (miRNA)。shRNA分子含有通过环连接的来自靶基因的有义和反义序列。shRNA从细胞核转运至细胞质并且其与mRNA一起降解。对于RNAi，Pol III或U6启动子可用于表达RNA。Paddison等人[Genes & Dev. (2002) 16:948-958，2002]已经使用折叠成发夹的小的RNA分子作为实现RNAi的工具。因此，这种短发夹RNA (shRNA)分子也有利地用于本文所述的方法中。功能性shRNA的茎和环的长度不同；在不影响沉默活性的情况下，茎长度可范围从约25一直到约30nt的任何地方，且环大小可范围从4一直到约25 nt。尽管不希望受任何特定理论束缚，但认为这些shRNA类似于DICER RNA酶的双链RNA (dsRNA)产物，并且在任何情况下都具有相同的抑制特定基因表达的能力。shRNA可从慢病毒载体表达。miRNA是长度约10-70个核苷酸的单链RNA，其最初转录为特征在于“茎-环”结构的前-miRNA，其在通过RISC进一步加工后，随后被加工成成熟miRNA。

介导RNAi的分子，包括但不限于siRNA，可通过化学合成(Hohjoh，FEBS Lett 521:195-199，2002)、dsRNA的水解(Yang等人，Proc Natl Acad Sci USA 99:9942-9947，2002)，通过用T7 RNA聚合酶体外转录(Donzeet等人，Nucleic Acids Res 30:e46，2002；Yu等人，Proc Natl Acad Sci USA 99:6047-6052，2002)和通过使用核酸酶如大肠杆菌RNA酶III的双链RNA水解(Yang等人，Proc Natl Acad Sci USA 99:9942-9947，2002)体外产生。

根据另一个方面，本公开内容提供了多核苷酸拮抗剂，其包括但不限于诱饵DNA、双链DNA、单链DNA、复合DNA、被囊的（encapsulated）DNA、病毒DNA、质粒DNA、裸RNA、被囊的RNA、病毒RNA、双链RNA、能够产生RNA干扰的分子或其组合。

在一些实施方案中，本公开内容的多核苷酸拮抗剂是适体。适体是核酸分子，包括双链DNA和单链RNA分子，其结合和形成特异性结合靶分子的三级结构。适体的产生和治疗用途是本领域充分确立的(参见，例如，美国专利号5,475,096)。关于适体的额外信息可见于美国专利申请公开号20060148748。核酸适体使用本领域已知的方法选择，例如通过指数富集配体系统进化（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment）(SELEX)方法。SELEX是具有与靶分子高度特异性结合的核酸分子的体外进化的方法，如描述于例如，美国专利号5,475,096；5,580,737；5,567,588；5,707,796；5,763,177；6,011,577和6,699,843中的。鉴定适体的另一种筛选方法描述于美国专利号5,270,163。SELEX方法基于核酸形成多种二维和三维结构的能力，以及核苷酸单体内充当与实际上任何化合物（无论是单体还是聚合的，包括其他核酸分子和多肽）的配体（形成特异性结合对）的可用化学多功能性。任何大小或组成的分子都可充当靶。SELEX方法涉及从候选寡核苷酸的混合物的选择，和使用相同的通用选择方案逐步重复结合、分开和扩增，以实现期望的结合亲和力和选择性。从可包含随机化序列的区段的核酸的混合物开始，SELEX方法包括以下步骤：使混合物与靶在有利于结合的条件下接触；使未结合的核酸与已经特异性结合至靶分子的那些核酸分开；解离核酸-靶复合体；扩增从核酸-靶复合体解离的核酸以得到配体富集的核酸混合物。结合、分开、解离和扩增的步骤重复如所需要的那么多循环，以得到以高亲和力和特异性结合靶分子的核酸配体。

一般，将这种结合分子单独施用于动物[参见，例如，O'Connor (1991) J.Neurochem. 56:560]，但这种结合分子也可从宿主细胞摄取的多核苷酸体内表达，和体内表达[参见，例如，Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of GeneExpression, CRC Press, Boca Raton, Fla. (1988)]。

7. 促滤泡素抑制素和FLRG拮抗剂

在其他方面，GDF/BMP拮抗剂是促滤泡素抑制素或FLRG多肽。如本文所用的，促滤泡素抑制素和/或FLRG多肽可用于治疗、预防或降低肺高血压(PH)的进展率和/或严重程度，特别是治疗、预防或降低一种或多种PH相关并发症的进展率和/或严重程度。

术语“促滤泡素抑制素多肽”包括包含促滤泡素抑制素的任何天然存在的多肽以及其保留有用活性的任何变体(包括突变体、片段、融合物和肽模拟物形式)的多肽，且进一步包括促滤泡素抑制素的任何功能单体或多聚体。在某些优选实施方案中，本公开内容的促滤泡素抑制素多肽结合和/或抑制激活蛋白活性、特别是激活蛋白A。促滤泡素抑制素多肽的保留激活蛋白结合性质的变体可以基于根据先前的涉及促滤泡素抑制素和激活蛋白相互作用的研究鉴定。例如，WO2008/030367公开了特定的促滤泡素抑制素结构域(“FSD”)，其显示对于激活蛋白结合是重要的。如在下文SEQ ID NO: 28-30中所示的，促滤泡素抑制素N-末端结构域(“FSND” SEQ ID NO: 28)、FSD2 (SEQ ID NO: 30)和较少程度上FSD1(SEQ ID NO: 29)代表促滤泡素抑制素内对于激活蛋白结合是重要的示例性结构域。此外，用于制备和测试多肽文库的方法在上文的ActRII多肽的上下文中进行描述，且这种方法还涉及制备和测试促滤泡素抑制素的变体。促滤泡素抑制素多肽包括衍生自任何已知促滤泡素抑制素的序列的多肽，其具有与促滤泡素抑制素多肽的序列具有至少约80%同一性和任选地至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大同一性的序列。促滤泡素抑制素多肽的实例包括成熟的促滤泡素抑制素多肽或人促滤泡素抑制素前体多肽(SEQ ID NO: 26)的较短的同种型或其他变体，如描述于例如WO2005/025601中的。

人促滤泡素抑制素前体多肽同种型FST344如下：

(SEQ ID NO: 26; NCBI参考号NP_037541.1)

信号肽加下划线；上文加下划线的还有最后27个残基，其代表区分该促滤泡素抑制素同种型与下文所示的较短的促滤泡素抑制素同种型FST317的C-末端延伸。

人促滤泡素抑制素前体多肽同种型FST317如下：

(SEQ ID NO: 27; NCBI参考号NP_006341.1)

信号肽加下划线。

促滤泡素抑制素N-末端结构域(FSND)序列如下：

FSD1和FSD2序列如下：

在其他方面，用于根据本文公开的方法使用的试剂是促滤泡素抑制素-样相关基因(FLRG)，也称为促滤泡素抑制素-相关蛋白3 (FSTL3)。术语“FLRG多肽”包括包含FLRG的任何天然存在的多肽以及其保留有用活性的任何变体(包括突变体、片段、融合物和肽模拟物形式)的多肽。在某些优选实施方案中，本公开内容的FLRG多肽结合和/或抑制激活蛋白活性、特别是激活蛋白A。FLRG多肽的保留激活蛋白结合性质的变体可以使用测定FLRG和激活蛋白相互作用的常规方法鉴定(参见，例如，US 6,537,966)。此外，用于制备和测试多肽文库的方法在上文的ActRII多肽的上下文中进行描述，且这种方法还涉及制备和测试FLRG的变体。FLRG多肽包括衍生自任何已知FLRG的序列的多肽，其具有与FLRG多肽的序列具有至少约80%同一性和任选地至少85%、90%、95%、97%、99%或更大同一性的序列。

人FLRG前体(促滤泡素抑制素-相关蛋白3前体)多肽如下：

(SEQ ID NO: 31; NCBI参考号NP_005851.1)

信号肽加下划线。

在某些实施方案中，促滤泡素抑制素多肽和FLRG多肽的功能变体或修饰形式包括具有至少一部分的促滤泡素抑制素多肽或FLRG多肽和一个或多个融合结构域如例如促进多肽的分离、检测、稳定化或多聚化的结构域的融合蛋白。合适的融合结构域在上文参考ActRII多肽详细论述。在特定实施方案中，本公开内容的拮抗剂是包含融合至Fc结构域的促滤泡素抑制素多肽的激活蛋白-结合部分的融合蛋白。在另一个实施方案中，本公开内容的拮抗剂是包含融合至Fc结构域的FLRG多肽的激活蛋白-结合部分的融合蛋白。

8.筛选测定

在某些方面，本公开内容涉及主题GDF/BMP拮抗剂(例如，ActRII多肽及其变体)用于鉴定可用于治疗、预防或降低肺高血压(PH)的进展率和/或严重程度，特别是治疗、预防或降低一种或多种PH相关并发症的进展率和/或严重程度的化合物(试剂)的用途。

存在许多筛选用于通过靶向一种或多种GDF/BMP配体的信号传导(例如，Smad信号传导)治疗PH的治疗剂的方法。在某些实施方案中，可进行化合物的高通量筛选以鉴定在选择的细胞系上干扰GDF/BMP配体-介导的作用的试剂。在某些实施方案中，进行该测定以筛选和鉴定特异性抑制或减少GDF/BMP配体(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白AB、激活蛋白C、GDF3、BMP6、GDF8、GDF15、GDF11或BMP10)与其结合配偶体(如II型受体(例如，ActRIIA和/或ActRIIB))的结合的化合物。另一方面，该测定可用于鉴定增强GDF/BMP配体与其结合配偶体(如II型受体)的结合的化合物。在进一步实施方案中，化合物可通过其与II型受体相互作用的能力来鉴定。

多种测定形式将是足够的，并且根据本公开内容，本文未明确描述的那些将仍然被本领域普通技术人员所理解。如本文所述的，本发明的测试化合物(试剂)可通过任何组合化学方法产生。另一方面，主题化合物可以是体内或体外合成的天然存在的生物分子。待测试其充当组织生长的调制剂的能力的化合物(试剂)可例如，由细菌、酵母、植物或其他生物产生(例如，天然产物)，化学产生(例如，小分子，包括肽模拟物)或重组产生。本发明预期的测试化合物包括非肽基有机分子、肽、多肽、肽模拟物、糖、激素和核酸分子。在某些实施方案中，测试试剂是具有小于约2,000道尔顿的分子量的小的有机分子。

本公开内容的测试化合物可作为单一的离散实体提供，或在较大复杂性的文库(如通过组合化学制备的)中提供。这些文库可包含，例如，醇、烷基卤、胺、酰胺、酯、醛、醚和其他类型的有机化合物。测试化合物至测试系统的呈递可以为分离的形式或作为化合物的混合物，尤其是在最初筛选步骤中。任选地，化合物可任选地用其他化合物衍生，且具有促进化合物的分离的衍生基团。衍生基团的非限制性实例包括生物素、荧光素、洋地黄毒苷、绿色荧光蛋白、同位素、多组氨酸、磁珠、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、光可活化的交联剂或其任何组合。

在测试化合物和天然提取物的文库的许多药物-筛选程序中，期望高通量测定以使在给定的时间段内调查的化合物的数目最大化。在无细胞系统中进行的测定，如可用纯化或半纯化的蛋白衍生的，作为“初级”筛选经常是优选的，这是因为它们可经产生以允许由测试化合物介导的分子靶的改变的快速发展和相对容易检测。此外，测试化合物的细胞毒性或生物利用率的影响在体外系统中通常可忽略，该测定而是主要聚焦于药物对分子靶的影响，如可以在GDF/BMP配体(例如，激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白AB、激活蛋白C、GDF8、GDF15、GDF11、GDF3、BMP6或BMP10)与其结合配偶体(如II型受体(例如，ActRIIA和/或ActRIIB))之间的结合亲和力的改变所显现的。

仅仅为了举例说明，在本公开内容的示例性筛选测定中，如对于测定的目的合适的，将目标化合物与分离和纯化的通常能够结合ActRIIB配体的ActRIIB多肽接触。然后向化合物和ActRIIB多肽的混合物中加入含有ActRIIB配体(例如，GDF11)的组合物。ActRIIB/ActRIIB-配体复合体的检测和定量提供了用于测定化合物抑制(或加强)ActRIIB多肽和其结合蛋白之间的复合体形成的功效的手段。化合物的功效可通过从使用各种浓度的测试化合物获得的数据产生剂量-反应曲线来评估。此外，也可进行对照测定以提供基线用于比较。例如，在对照测定中，分离和纯化的ActRIIB配体被加入包含ActRIIB多肽的组合物和在没有测试化合物的情况下定量ActRIIB/ActRIIB配体复合体的形成。将理解的是，通常，其中可混合反应物的顺序可改变，且可同时混合。此外，代替纯化的蛋白，细胞提取物和裂解物可用于提供合适的无细胞测定系统。

GDF/BMP配体及其结合蛋白之间的复合体形成可通过多种技术检测。例如，复合体形成的调节可使用例如，可检测标记的蛋白如放射性标记的(例如，³²P、³⁵S、¹⁴C或³H)、荧光标记的(例如，FITC)或酶促标记的ActRIIB多肽和/或其结合蛋白，通过免疫测定或通过层析检测来定量。

在某些实施方案中，本公开内容预期荧光偏振测定和荧光共振能量转移(FRET)测定在直接或间接测量GDF/BMP配体及其结合蛋白之间相互作用的程度中的用途。此外，其他检测模式，如基于光波导(参见，例如，PCT公开WO 96/26432和美国专利号5,677,196)、表面等离振子共振(SPR)、表面电荷传感器和表面力传感器的那些，与本公开内容的许多实施方案相容。

此外，本公开内容预期相互作用捕获物测定，也称为“双杂交测定”用于鉴定破坏或加强GDF/BMP配体及其结合配偶体之间相互作用的试剂的用途。参见，例如，美国专利号5,283,317；Zervos等人(1993) Cell 72:223-232；Madura等人(1993) J Biol Chem 268:12046-12054；Bartel等人(1993) Biotechniques 14:920-924;和Iwabuchi等人(1993)Oncogene 8:1693-1696)。在具体实施方案中，本公开内容预期反向双杂交系统鉴定解离GDF/BMP配体及其结合配偶体之间相互作用的化合物(例如，小分子或肽)的用途[参见，例如，Vidal和Legrain，(1999) Nucleic Acids Res 27:919-29；Vidal和Legrain，(1999)Trends Biotechnol 17:374-81;和美国专利号5,525,490；5,955,280;和5,965,368]。

在某些实施方案中，主题化合物通过其与GDF/BMP配体相互作用的能力来鉴定。在化合物和GDF/BMP配体之间的相互作用可以是共价或非共价的。例如，这种相互作用可在蛋白水平上使用体外生物化学方法，包括光交联、放射性标记的配体结合和亲和层析鉴定[参见，例如，Jakoby WB等人(1974) Methods in Enzymology 46:1]。在某些情况下，化合物可在基于机制的测定(如检测结合GDF/BMP配体的化合物的测定)中筛选。这可包括固相或液相结合事件。另一方面，编码GDF/BMP配体的基因可与报道系统(例如，β-半乳糖苷酶、萤光素酶或绿色荧光蛋白)转染至细胞中，且针对文库优选地通过高通量筛选或以文库的个别成员进行筛选。可使用其他基于机制的结合测定；例如，检测自由能变化的结合测定。结合测定可用固定至孔、珠或芯片的，或通过固定的抗体捕获的，或通过毛细管电泳分离的靶进行。结合的化合物可通常使用比色终点（colorimetric endpoints）或荧光或表面等离振子共振检测。

9. 治疗用途

部分地，本公开内容涉及治疗肺高血压(例如，肺动脉高压)的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的GDF/BMP拮抗剂(例如，激活蛋白、GDF8、GDF11、GDF3、BMP6、BMP15、BMP10、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7和一种或多种Smad蛋白中的一种或多种的拮抗剂)。在一些实施方案中，本公开内容预期治疗肺高血压的一种或多种并发症(例如，肺动脉中的平滑肌和/或内皮细胞增殖、肺动脉中的血管发生、呼吸困难、胸痛、肺血管重建、右心室肥大和肺纤维化)的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的GDF/BMP拮抗剂。在一些实施方案中，本公开内容预期预防肺高血压的一种或多种并发症的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的GDF/BMP拮抗剂。在一些实施方案中，本公开内容预期降低肺高血压的进展率的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的GDF/BMP拮抗剂。在一些实施方案中，本公开内容预期降低肺高血压的一种或多种并发症的进展率的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的GDF/BMP拮抗剂。在一些实施方案中，本公开内容预期降低肺高血压的严重程度的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的GDF/BMP拮抗剂。在一些实施方案中，本公开内容预期降低肺高血压的一种或多种并发症的严重程度的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的GDF/BMP拮抗剂。任选地，本文公开的用于治疗、预防或降低肺高血压的进展率和/或严重程度、特别是治疗、预防或降低肺高血压的一种或多种并发症的进展率和/或严重程度的方法可进一步包括向患者施用一种或多种用于治疗肺高血压的支持疗法或额外活性剂。例如，还可以向所述患者施用一种或多种选自以下的支持疗法或活性剂：前列环素及其衍生物(例如，依前列醇、曲前列环素和伊洛前列素)；前列环素受体激动剂(例如，赛乐西帕)；内皮素受体拮抗剂(例如，西他生坦、安立生坦、马西替坦和波生坦)；钙通道阻滞剂(例如，阿洛地平、地尔硫和硝苯地平；抗凝剂(例如，华法林)；利尿剂；氧气疗法；心房间隔切开术；肺动脉血栓动脉内膜切除术；磷酸二酯酶5型抑制剂(例如，西地那非和他达拉非)；可溶性鸟苷酸环化酶的活化剂(例如，cinaciguat和利奥西呱)；ASK-1抑制剂(例如，CIIA；SCH79797；GS-4997；MSC2032964A；3H-萘并[1,2,3-de]喹啉-2,7-二酮，NQDI-1；2-硫代-噻唑烷，5-溴-3-(4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基)-1,3-二氢-吲哚-2-酮)；NF-κB拮抗剂(例如，dh404、CDDO-环氧化物；2.2-二氟丙酰胺；C28咪唑(CDDO-Im)；2-氰基-3,12-二氧代齐墩果-1,9-二烯-28-酸(CDDO)；3-乙酰基齐墩果酸；3-三氟乙酰基齐墩果酸；28-甲基-3-乙酰基齐墩果烷；28-甲基-3-三氟乙酰基齐墩果烷；28-甲氧基齐墩果酸；SZC014；SCZ015；SZC017；齐墩果酸的加入聚乙二醇的衍生物；3-O-(β-D-吡喃葡糖基)齐墩果酸；3-O-[β-D-吡喃葡糖基-(1-->3)-β-D-吡喃葡糖基]齐墩果酸；3-O- [β-D-吡喃葡糖基-(1-->2)-β-D-吡喃葡糖基]齐墩果酸；3-O- [β-D-吡喃葡糖基-(1-->3)-β-D-吡喃葡糖基]齐墩果酸28-O-β-D-吡喃葡糖基酯；3-O-[β-D-吡喃葡糖基-(1-->2)-β-D-吡喃葡糖基]齐墩果酸28-O-β-D-吡喃葡糖基酯；3-O-[a-L-吡喃鼠李糖基-(1-->3)-β-D-吡喃葡糖醛酸基]齐墩果酸；3-O-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1-->3)-β-D-吡喃葡糖醛酸基]齐墩果酸28-O-β-D-吡喃葡糖基酯；28-O-β-D-吡喃葡糖基-齐墩果酸；3-O-β-D-吡喃葡糖基(1→3)-β-D-吡喃葡糖苷酸(CS1)；齐墩果酸3-O-β-D-吡喃葡糖基(1→3)-β-D-吡喃葡糖苷酸(CS2)；3,11-二氧代齐墩果-12-烯-28-酸甲酯(DIOXOL)；ZCVI₄-2；3-脱羟基-1,2,5-二唑并[3',4':2,3]齐墩果酸苄酯)；肺和/或心脏移植。在一些实施方案中，还可以向所述患者施用BMP9多肽。在一些实施方案中，所述BMP9多肽是成熟BMP9多肽。在一些实施方案中，所述BMP9多肽包含BMP9前域多肽。在一些实施方案中，所述BMF9多肽在药物制剂中施用，所述药物制剂任选地可包含BMP9前域多肽。在包含BMP9前域多肽的这种BMP9药物制剂中，所述BMP9多肽可以与BMP9前域多肽非共价缔合。在一些实施方案中，BMP9药物制剂基本上不含或不含BMP9前域多肽。BMP9多肽(成熟和多肽原（pro-polypeptides）)、BMP9前域多肽、包含其的药物组合物以及生成这种多肽和药物组合物的方法描述于例如WO2013/152213(其整体引入本文作为参考)中。如本文所用的，“预防”病症或状况的治疗剂是指这样的化合物，其在统计样本中，相对于未治疗的对照样本减少治疗的样本中的病症或状况的发生，或相对于未治疗的对照样本延迟病症或状况的一种或多种症状的开始或降低其严重程度。

在一些实施方案中，本公开内容涉及治疗间质性肺病(例如，特发性肺纤维化)的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的本文公开的任何GDF/BMP拮抗剂(例如，激活蛋白、GDF8、GDF11、GDF3、BMP6、BMP15、BMP10、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7和一种或多种Smad蛋白中的一种或多种的拮抗剂)。在一些实施方案中，所述间质性肺病是肺纤维化。在一些实施方案中，所述间质性肺病由以下中的任一种引起：矽肺、石棉沉着症、慢性铍病（berylliosis）、过敏性肺炎、药物使用(例如，抗生素、化学治疗药物、抗心律不齐药、抑制素)、全身性硬皮病、多肌炎、皮肌炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、感染(例如，非典型性肺炎、肺囊虫性肺炎、结核、沙眼衣原体和/或呼吸道合胞病毒)、淋巴管性癌病、吸烟或发育病症。在一些实施方案中，所述间质性肺病是特发性的(例如，肉样瘤病、特发性肺纤维化、Hamman-Rich综合征和/或抗合成酶综合征（antisynthetase syndrome）)。在具体实施方案中，所述间质性肺病是特发性肺纤维化。在一些实施方案中，特发性肺纤维化的治疗与额外治疗剂组合施用。在一些实施方案中，所述额外治疗剂选自：吡非尼酮、N-乙酰半胱氨酸、泼尼松、硫唑嘌呤、尼达尼布（nintedanib）、其衍生物及其组合。

如本文所用的术语“治疗”包括一旦已经确立，则改善或消除状况。在任一情况下，预防或治疗可在由内科医生或其他卫生保健提供者提供的诊断和施用治疗剂的预期结果中辨别。

通常，本公开内容中描述的疾病或状况的治疗或预防通过施用有效量的GDF/BMP拮抗剂来实现。试剂的有效量是指在必需的剂量和时间段有效实现期望的治疗或预防结果的量。本公开内容的试剂的治疗有效量可根据因素如个体的疾病状态、年龄、性别和体重和试剂在个体中引出期望的反应的能力而改变。预防有效量是指在必需的剂量和时间段有效实现期望的预防结果的量。

术语“主体”、“个体”或“患者”在整个说明书中是可互换的，并且通常是指哺乳动物。哺乳动物包括，但不限于，家畜(例如，牛、羊、猫、狗和马)，灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)，兔和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。

肺高血压(PH)以前已经被分类为原发性(特发性)或继发性的。最近，世界卫生组织(WHO)将肺高血压分为五组：第1组：肺动脉高压(PAH)；第2组：具有左心脏病的肺高血压；第3组：具有肺病和/或缺氧的肺高血压；第4组：由于慢性血栓形成性和/或栓塞性疾病导致的肺高血压；和第5组：混杂状况(例如，肉样瘤病、组织细胞增多病X、淋巴管瘤病（lymphangiomatosis）和肺血管压迫)。参见，例如，Rubin (2004) Chest 126:7-10。

在某些方面，本公开内容涉及治疗、预防或降低肺高血压的进展率和/或严重程度(例如，治疗、预防或降低肺高血压的一种或多种并发症的进展率和/或严重程度)的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的GDF/BMP拮抗剂(例如，激活蛋白、GDF8、GDF11、GDF3、BMP6、BMP15、BMP10、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7和一种或多种Smad蛋白中的一种或多种的拮抗剂)。在一些实施方案中，所述方法涉及具有肺动脉高压的肺高血压患者。在一些实施方案中，所述方法涉及患有具有左心脏病的肺高血压的肺高血压患者。在一些实施方案中，所述方法涉及具有肺病和/或缺氧的肺高血压患者。在一些实施方案中，所述方法涉及具有慢性血栓形成性和/或栓塞性疾病的肺高血压患者。在一些实施方案中，所述方法涉及具有肉样瘤病、组织细胞增多病X或淋巴管瘤病和肺血管压迫的肺高血压患者。

肺动脉高压是肺血管系统的严重、进行性和危及生命的疾病，其特征在于深度血管收缩和肺动脉壁中平滑肌细胞的异常增殖。肺中的血管的严重收缩导致非常高的肺动脉压。这些高压使得心脏难以将血液泵送通过肺以进行加氧。具有PAH的患者遭受极度气促，这是因为心脏努力针对这些高压进行泵送。具有PAH的患者一般发展肺血管阻力(PVR)的显著增加和肺动脉压(PAP)的持续升高，其最终导致右心室衰竭和死亡。被诊断具有PAH的患者预后不良并且生活质量同样受损，如果不治疗，从诊断时起平均预期寿命为2至5年。

多种因素对肺高血压的发病机理产生影响，包括肺细胞的增殖，其可对血管重建产生影响(即，增生)。例如，肺血管重建主要通过具有肺高血压的患者的动脉内皮细胞和平滑肌细胞的增殖发生。据信各种细胞因子的超表达促进肺高血压。进一步地，已经发现肺高血压可能由肺动脉平滑细胞和肺内皮细胞的过度增殖引起。更进一步地，晚期PAH的特征可以在于远端肺小动脉的肌组织化、同心内膜增厚和通过增殖内皮细胞阻塞血管腔。Pietra等人, J. Am. Coll. Cardiol., 43:255-325 (2004)。

在某些方面，本公开内容涉及治疗、预防或降低肺高血压的进展率和/或严重程度(例如，治疗、预防或降低肺高血压的一种或多种并发症的进展率和/或严重程度)的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的GDF/BMP拮抗剂(例如，激活蛋白、GDF8、GDF11、GDF3、BMP6、BMP15、BMP10、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7和一种或多种Smad蛋白中的一种或多种的拮抗剂)，其中所述患者具有至少25 mm Hg(例如，25、30、35、40、45或50 mm Hg)的静息肺动脉压(PAP)。在一些实施方案中，所述方法涉及具有至少25 mm Hg的静息PAP的患者。在一些实施方案中，所述方法涉及具有至少30 mm Hg的静息PAP的患者。在一些实施方案中，所述方法涉及具有至少35 mm Hg的静息PAP的患者。在一些实施方案中，所述方法涉及具有至少40 mm Hg的静息PAP的患者。在一些实施方案中，所述方法涉及具有至少45 mm Hg的静息PAP的患者。在一些实施方案中，所述方法涉及具有至少50 mm Hg的静息PAP的患者。

在一些实施方案中，本公开内容涉及将PH患者中的一种或多种血流动力学参数调整至更正常水平(例如，与相似年龄和性别的健康人相比正常)的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的GDF/BMP拮抗剂(例如，激活蛋白、GDF8、GDF11、GDF3、BMP6、BMP15、BMP10、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7和一种或多种Smad蛋白中的一种或多种的拮抗剂)。在一些实施方案中，所述方法涉及降低PAP。在一些实施方案中，所述方法涉及将患者的PAP降低至少3 mmHg。在某些实施方案中，所述方法涉及将患者的PAP降低至少5 mmHg。在某些实施方案中，所述方法涉及将患者的PAP降低至少7 mmHg。在某些实施方案中，所述方法涉及将患者的PAP降低至少10 mmHg。在某些实施方案中，所述方法涉及将患者的PAP降低至少12mmHg。在某些实施方案中，所述方法涉及将患者的PAP降低至少15 mmHg。在某些实施方案中，所述方法涉及将患者的PAP降低至少20 mmHg。在某些实施方案中，所述方法涉及将患者的PAP降低至少25 mmHg。在一些实施方案中，所述方法涉及降低肺血管阻力(PVR)。在一些实施方案中，所述方法涉及增加肺毛细血管楔压(PCWP)。在一些实施方案中，所述方法涉及增加左心室舒张期末压(LVEDP)。

在某些方面，本公开内容涉及治疗、预防或降低肺高血压的一种或多种并发症的进展率和/或严重程度的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的GDF/BMP拮抗剂(例如，激活蛋白、GDF8、GDF11、GDF3、BMP6、BMP15、BMP10、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7和一种或多种Smad蛋白中的一种或多种的拮抗剂)。在一些实施方案中，所述方法涉及治疗、预防或降低肺高血压患者的肺动脉中的细胞增殖的进展率和/或严重程度。在一些实施方案中，所述方法涉及治疗、预防或降低肺高血压患者的肺动脉中的平滑肌和/或内皮细胞增殖的进展率和/或严重程度。在一些实施方案中，所述方法涉及治疗、预防或降低肺高血压患者的肺动脉中的血管发生的进展率和/或严重程度。在一些实施方案中，所述方法涉及增加具有肺高血压的患者的体力活动（physical activity）。在一些实施方案中，所述方法涉及治疗、预防或降低肺高血压患者中的呼吸困难的进展率和/或严重程度。在一些实施方案中，所述方法涉及治疗、预防或降低肺高血压患者中的胸痛的进展率和/或严重程度。在一些实施方案中，所述方法涉及治疗、预防或降低肺高血压患者中的疲劳的进展率和/或严重程度。在一些实施方案中，所述方法涉及治疗、预防或降低肺高血压患者中的肺纤维化的进展率和/或严重程度。在一些实施方案中，所述方法涉及治疗、预防或降低肺高血压患者中的纤维化的进展率和/或严重程度。在一些实施方案中，所述方法涉及治疗、预防或降低肺高血压患者中的肺血管重建的进展率和/或严重程度。在一些实施方案中，所述方法涉及治疗、预防或降低肺高血压患者中的右心室肥大的进展率和/或严重程度。

在某些方面，本公开内容涉及增加具有肺高血压的患者中的运动能力的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的GDF/BMP拮抗剂(例如，激活蛋白、GDF8、GDF11、GDF3、BMP6、BMP15、BMP10、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7和一种或多种Smad蛋白中的一种或多种的拮抗剂)。可以使用任何合适的运动能力的量度。例如，6-分钟步行测试(6MWT)中的运动能力，其测量主体在6分钟内可以步行多远，即6-分钟步行距离(6MWD)，经常用于评估肺高血压严重程度和疾病进展。Borg呼吸困难指数(BDI)是用于评估感觉出的呼吸困难(呼吸不适)的数值刻度（numerical scale）。其测量呼吸困难的程度，例如，在完成6MWT之后，其中0的BDI表明无气促，且10的BDI表明最大气促。在一些实施方案中，所述方法涉及在具有肺高血压的患者中将6MWD增加至少10米。在一些实施方案中，所述方法涉及在具有肺高血压的患者中将6MWD增加至少20米。在一些实施方案中，所述方法涉及在具有肺高血压的患者中将6MWD增加至少30米。在一些实施方案中，所述方法涉及在具有肺高血压的患者中将6MWD增加至少40米。在一些实施方案中，所述方法涉及在具有肺高血压的患者中将6MWD增加至少50米。在一些实施方案中，所述方法涉及在具有肺高血压的患者中将6MWD增加至少60米。在一些实施方案中，所述方法涉及在具有肺高血压的患者中将6MWD增加至少70米。在一些实施方案中，所述方法涉及在具有肺高血压的患者中将6MWD增加至少80米。在一些实施方案中，所述方法涉及在具有肺高血压的患者中将6MWD增加至少90米。在一些实施方案中，所述方法涉及在具有肺高血压的患者中将6MWD增加至少100米。在一些实施方案中，所述方法涉及在具有肺高血压的患者中将BDI降低至少0.5个指数点。在一些实施方案中，所述方法涉及在具有肺高血压的患者中将BDI降低至少1个指数点。在一些实施方案中，所述方法涉及在具有肺高血压的患者中将BDI降低至少1.5个指数点。在一些实施方案中，所述方法涉及在具有肺高血压的患者中将BDI降低至少2个指数点。在一些实施方案中，所述方法涉及在具有肺高血压的患者中将BDI降低至少2.5个指数点。在一些实施方案中，所述方法涉及在具有肺高血压的患者中将BDI降低至少3个指数点。在一些实施方案中，所述方法涉及在具有肺高血压的患者中将BDI降低至少3.5个指数点。在一些实施方案中，所述方法涉及在具有肺高血压的患者中将BDI降低至少4个指数点。在一些实施方案中，所述方法涉及在具有肺高血压的患者中将BDI降低至少4.5个指数点。在一些实施方案中，所述方法涉及在具有肺高血压的患者中将BDI降低至少5个指数点。在一些实施方案中，所述方法涉及在具有肺高血压的患者中将BDI降低至少5.5个指数点。在一些实施方案中，所述方法涉及在具有肺高血压的患者中将BDI降低至少6个指数点。在一些实施方案中，所述方法涉及在具有肺高血压的患者中将BDI降低至少6.5个指数点。在一些实施方案中，所述方法涉及在具有肺高血压的患者中将BDI降低至少7个指数点。在一些实施方案中，所述方法涉及在具有肺高血压的患者中将BDI降低至少7.5个指数点。在一些实施方案中，所述方法涉及在具有肺高血压的患者中将BDI降低至少8个指数点。在一些实施方案中，所述方法涉及在具有肺高血压的患者中将BDI降低至少8.5个指数点。在一些实施方案中，所述方法涉及在具有肺高血压的患者中将BDI降低至少9个指数点。在一些实施方案中，所述方法涉及在具有肺高血压的患者中将BDI降低至少9.5个指数点。在一些实施方案中，所述方法涉及在具有肺高血压的患者中将BDI降低至少3个指数点。在一些实施方案中，所述方法涉及在具有肺高血压的患者中将BDI降低10个指数点。

基线处的肺高血压可以是轻度、中度或重度的，如例如通过世界卫生组织(WHO)功能类别(其为具有肺高血压的患者中的疾病严重程度的量度)所测量的。WHO功能分类是纽约心脏协会（New York Heart Association）(NYHA)系统的改编本，并且常规用于定性评估活动耐性，例如在监控疾病进展和对治疗的反应中(Rubin (2004) Chest 126:7-10)。在WHO系统中认可四种功能类别：I类：不导致体力活动的限制的肺高血压；普通的体力活动不引起过度的呼吸困难或疲劳、胸痛或接近晕厥；II类：导致体力活动的轻微限制的肺高血压；患者在休息时舒服；普通的体力活动引起过度的呼吸困难或疲劳、胸痛或接近晕厥；III类：导致体力活动的显著限制的肺高血压；患者在休息时舒服；低于普通活动引起过度的呼吸困难或疲劳、胸痛或接近晕厥；IV类：导致不能在无症状的情况下进行任何体力活动的肺高血压；患者显现出右心衰竭征；甚至在休息时也可存在呼吸困难和/或疲劳；任何体力活动都增加不适。

在某些方面，本公开内容涉及治疗、预防或降低肺高血压的进展率和/或严重程度(例如，治疗、预防或降低肺高血压的一种或多种并发症的进展率和/或严重程度)的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的GDF/BMP拮抗剂(例如，激活蛋白、GDF8、GDF11、GDF3、BMP6、BMP15、BMP10、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7和一种或多种Smad蛋白中的一种或多种的拮抗剂)，其中所述患者具有如WHO所认可的I类、II类、III类或IV类肺高血压。在一些实施方案中，所述方法涉及具有如WHO所认可的I类肺高血压的患者。在一些实施方案中，所述方法涉及具有如WHO所认可的II类肺高血压的患者。在一些实施方案中，所述方法涉及预防或延迟患者从I类肺高血压进展至II类肺高血压(如WHO所认可的)。在一些实施方案中，所述方法涉及促进或增加患者从II类肺高血压倒退至I类肺高血压(如WHO所认可的)。在一些实施方案中，所述方法涉及具有如WHO所认可的III类肺高血压的患者。在一些实施方案中，所述方法涉及预防或延迟患者从II类肺高血压进展至III类肺高血压(如WHO所认可的)。在一些实施方案中，所述方法涉及促进或增加患者从III类肺高血压倒退至II类肺高血压(如WHO所认可的)。在一些实施方案中，所述方法涉及促进或增加患者从III类肺高血压倒退至I类肺高血压(如WHO所认可的)。在一些实施方案中，所述方法涉及具有如WHO所认可的IV类肺高血压的患者。在一些实施方案中，所述方法涉及预防或延迟患者从III类肺高血压进展至IV类肺高血压(如WHO所认可的)。在一些实施方案中，所述方法涉及促进或增加患者从IV类肺高血压倒退至III类肺高血压(如WHO所认可的)。在一些实施方案中，所述方法涉及促进或增加患者从IV类肺高血压倒退至II类肺高血压(如WHO所认可的)。在一些实施方案中，所述方法涉及促进或增加患者从IV类肺高血压倒退至I类肺高血压(如WHO所认可的)。

对于肺高血压没有已知的治愈；目前的治疗方法聚焦于延长患者寿命和增强患者生活质量。目前治疗肺高血压的方法包括施用：血管扩张剂如前列环素、依前列醇和西地那非；内皮素受体拮抗剂诸如波生坦；钙通道阻滞剂如阿洛地平、地尔硫和硝苯地平；抗凝剂如华法林；和利尿剂。也已使用氧气疗法、心房间隔切开术、肺动脉血栓动脉内膜切除术以及肺和/或心脏移植来进行肺高血压的治疗。然而，这些方法中的每一种都有一个或多个缺点，其可能包括缺乏有效性、严重的副作用、低患者依从性和高成本。在某些方面，所述方法涉及治疗、预防或降低肺高血压的进展率和/或严重程度(例如，治疗、预防或降低肺高血压的一种或多种并发症的进展率和/或严重程度)，其包括向有需要的患者施用有效量的GDF/BMP拮抗剂(例如，激活蛋白、GDF8、GDF11、GDF3、BMP6、BMP15、BMP10、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7和一种或多种Smad蛋白中的一种或多种的拮抗剂)与一种或多种用于治疗肺高血压的额外活性剂和/或支持疗法(例如，血管扩张剂如前列环素、依前列醇和西地那非；内皮素受体拮抗剂诸如波生坦；钙通道阻滞剂如阿洛地平、地尔硫和硝苯地平；抗凝剂如华法林；利尿剂；氧气疗法；心房间隔切开术；肺动脉血栓动脉内膜切除术；以及肺和/或心脏移植)；BMP9多肽；BMP10多肽；甲基巴多索隆或其衍生物；齐墩果酸或其衍生物的组合(例如，同时或不同时施用，但通常以这种方式施用，以便实现重叠药理学/生理学效应)。

在某些实施方案中，本公开内容提供了用于通过测量患者中的一种或多种血液学参数来管理已经用一种或多种一种或多种本公开内容的GDF/BMP拮抗剂(例如，配体捕获物，如ActRIIA多肽、ActRIIB多肽和GDF捕获物多肽)治疗或者是用其治疗的候选者的患者的方法。血液学参数可用于评价作为待用本公开内容的拮抗剂治疗的候选者的患者的适当给药，监控治疗期间的血液学参数，评价在用一种或多种本公开内容的拮抗剂治疗期间是否调整剂量，和/或评价一种或多种本公开内容的拮抗剂的适当维持剂量。如果血液学参数中的一种或多种在正常水平之外，则可以减少、延迟或终止一种或多种GDF/BMP拮抗剂的给药。

可以根据本文提供的方法测量的血液学参数包括，例如，使用本领域公认的方法，红细胞水平、血压、铁储备（iron store）和在体液中发现的与增加的红细胞水平相关的其他试剂。这种参数可以使用来自患者的血液样品来测定。红细胞水平、血红蛋白水平和/或血细胞比容水平的增加可以引起血压的增加。

在一个实施方案中，如果一种或多种血液学参数在作为用一种或多种GDF/BMP拮抗剂治疗的候选者的患者的正常范围之外或在正常高侧（high side）上，则可以延迟一种或多种本公开内容的拮抗剂的施用的开始，一直到血液学参数自然或经由治疗干预恢复至正常或可接受的水平。例如，如果候选患者是高血压的或高血压前（pre-hypertensive）的，则可以用降血压剂治疗患者以降低患者的血压。可以使用适合于个体患者的状况的任何降血压剂，包括例如利尿剂、肾上腺素能抑制剂(包括α受体阻滞剂和β受体阻滞剂)、血管扩张剂、钙通道阻滞剂、血管紧张肽转化酶(ACE)抑制剂或血管紧张肽II受体阻滞剂。另一方面，可以使用膳食和运动方案来治疗血压。类似地，如果候选患者具有低于正常或在正常的低侧（low side）上的铁储备，则患者可以用适当的膳食和/或铁补充剂的方案治疗，一直到患者的铁储备已恢复至正常或可接受的水平。对于具有高于正常红细胞水平和/或血红蛋白水平的患者，则可以延迟施用一种或多种本公开内容的拮抗剂，一直到所述水平已恢复至正常或可接受的水平。

在某些实施方案中，如果一种或多种血液学参数在作为用一种或多种GDF/BMP拮抗剂治疗的候选者的患者的正常范围之外或正常高侧上，则可以不延迟施用的开始。然而，一种或多种本公开内容的拮抗剂的剂量或给药频率可以定在将降低施用一种或多种本公开内容的拮抗剂时出现的血液学参数的不可接受的增加的风险的量。另一方面，可以为患者开发治疗方案，其将一种或多种GDF/BMP拮抗剂与处理不期望的血液学参数水平的治疗剂组合。例如，如果患者具有升高的血压，则可以设计治疗方案，其涉及施用一种或多种GDF/BMP拮抗剂和降血压剂。对于具有低于期望的铁储备的患者，可以开发治疗方案，其涉及一种或多种本公开内容的GDF/BMP拮抗剂和铁补充给药法。

在一个实施方案中，可以为作为待用一种或多种本公开内容的GDF/BMP拮抗剂治疗的候选者的患者确立一种或多种血液学参数的基线参数，并且基于所述基线值为该患者确立适当的给药方案。另一方面，基于患者的病史确立的基线参数可用于为患者告知适当的拮抗剂给药方案。例如，如果健康患者具有高于定义的正常范围的确立的基线血压读数，则在用一种或多种本公开内容的拮抗剂治疗之前可能没有必要使患者的血压进入对于一般人群被认为是正常的范围中。在用一种或多种本公开内容的GDF/BMP拮抗剂治疗之前患者的一种或多种血液学参数的基线值也可以用作用于监控用一种或多种本公开内容的拮抗剂治疗期间血液学参数的任何变化的相关比较值。

在某些实施方案中，在正在用一种或多种GDF/BMP拮抗剂治疗的患者中测量一种或多种血液学参数。血液学参数可用于在治疗期间监控患者，并允许调节或终止用一种或多种本公开内容的拮抗剂给药或额外用另一种治疗剂给药。例如，如果施用一种或多种GDF/BMP拮抗剂导致血压、红细胞水平或血红蛋白水平的增加或铁储备的减少，则可以在量或频率方面减少一种或多种本公开内容的拮抗剂的剂量，以减少一种或多种本公开内容的拮抗剂对一种或多种血液学参数的作用。如果施用一种或多种GDF/BMP拮抗剂导致一种或多种血液学参数的对患者不利的变化，则一种或多种本公开内容的拮抗剂的给药可以暂时终止(一直到血液学参数恢复至可接受的水平)或永久终止。类似地，如果在减少一种或多种本公开内容的拮抗剂的施用剂量或频率后，未使一种或多种血液学参数在可接受的范围内，则可以终止给药。作为减少或终止用一种或多种本公开内容的拮抗剂给药的替代方案或另外地，患者可以用额外的治疗剂给药，所述治疗剂处理血液学参数中的不希望的水平，如，例如，降血压剂或铁补充剂。例如，如果用一种或多种GDF/BMP拮抗剂治疗的患者具有升高的血压，则用一种或多种本公开内容的拮抗剂给药可以在相同水平继续并且将血压降低剂添加至治疗方案中，将用一种或多种本公开内容的拮抗剂的给药(例如，量和/或频率)可以被减少并将血压降低剂添加至治疗方案中，或者可以终止用一种或多种本公开内容的拮抗剂的给药并且可以用降血压剂治疗患者。

10. 药物组合物

本文所述的治疗剂(例如，GDF/BMP拮抗剂)可以配制于药物组合物中。用于根据本公开内容使用的药物组合物可以使用一种或多种生理学上可接受的载体或赋形剂以常规方式配制。按照大多数管理要求，这种制剂将通常基本上无致热原。

在某些实施方案中，本公开内容的治疗方法包括全身性施用组合物或局部施用组合物作为植入物或设备。当施用时，用于本公开内容中的治疗组合物呈基本上无致热原或无致热原、生理学上可接受的形式。除了GDF/BMP拮抗剂以外的治疗上有用的试剂(其也可任选地包括在如上所述的组合物中)可在本文公开的方法中与主题化合物同时或序贯施用。

一般，本文公开的蛋白治疗剂将肠胃外、且特别是静脉内或皮下施用。适合于肠胃外施用的药物组合物可包含一种或多种GDF/BMP拮抗剂与一种或多种药学上可接受的无菌等渗水溶液或非水溶液、分散体、悬浮液或乳剂、或可恰好在使用前重构成无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末的组合，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使制剂与预期受体的血液等渗的溶质或悬浮剂或增稠剂。可用于本公开内容的药物组合物中的合适的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(诸如，甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油(如，橄榄油)和可注射有机酯(如，油酸乙酯)。正确的流动性可例如，通过使用包被材料(如，卵磷脂)，在分散体的情况下通过维持需要的粒度，且通过使用表面活性剂来维持。

如果期望，所述组合物和制剂可以在包或分配器设备中呈现，所述包或分配器设备可以含有一种或多种含有活性成分的单位剂型（unit dosage form）。所述包可以例如包括金属或塑料箔，诸如泡罩包（blister pack）。所述包或分配器设备可以附带有关于施用的说明书。

此外，所述组合物可以以递送至靶组织部位的形式被包入胶囊内或注射。在某些实施方案中，本发明的组合物可包括能够递送一种或多种治疗化合物(例如，GDF/BMP拮抗剂)至靶组织部位，从而为发育中的组织提供结构，且最佳地能够再吸收至体内的基质。例如，基质可提供GDF/BMP拮抗剂的缓慢释放。这种基质可由目前用于其他植入的医学应用的材料形成。

基质材料的选择基于生物适合性、生物降解力、机械性质、美容外观和界面性质。主题组合物的特定应用将定义合适的制剂。用于组合物的潜在基质可以是生物可降解的和化学成分确知的硫酸钙、磷酸三钙、羟基磷灰石、聚乳酸和聚酐。其他潜在的材料是生物可降解的和生物学上充分确定的，诸如骨或皮肤胶原。其他基质包含纯的蛋白或细胞外基质组分。其他潜在的基质是非-生物可降解的和化学成分确知的，诸如烧结的羟基磷灰石、生物玻璃（bioglass）、铝酸盐或其他陶瓷。基质可包含任何上述类型的材料(诸如聚乳酸和羟基磷灰石或胶原和磷酸三钙)的组合。生物陶瓷可在组成(例如，钙-铝酸盐-磷酸盐)和加工方面改变以改变孔径、粒度、颗粒形状和生物降解力。

在某些实施方案中，本发明的方法可经口施用，例如，以胶囊、扁囊剂（cachet）、丸剂、片剂、锭剂(使用调味基底（flavored basis），通常为蔗糖和阿拉伯胶（acacia）或西黄蓍胶)、粉剂、颗粒、或作为水性或非水性液体中的溶液或悬浮液、或作为水包油或油包水液体乳剂、或作为酏剂或糖浆、或作为软锭剂(使用惰性基质，如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶)和/或作为口腔洗剂等的形式，各自含有预定量的作为活性成分的药剂。药剂还可作为巨丸剂、药糖剂或糊剂施用。

在用于经口施用的固体剂型(胶囊、片剂、丸剂、糖锭剂、粉剂、颗粒等)中，一种或多种本发明的治疗化合物可与一种或多种药学上可接受的载体混合，所述载体如柠檬酸钠或磷酸二钙，和/或以下中的任一种：(1)充填剂或膨胀剂，如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和/或硅酸；(2)结合剂，如，例如，羧基甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；(3)湿润剂，如，甘油；(4)崩解剂，如，琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；(5)溶解阻滞剂，如，石蜡；(6)吸收加速剂，如，季铵化合物；(7)润湿剂，如，鲸蜡醇和甘油单硬脂酸酯；(8)吸收剂，如，高岭土和膨润土；(9)润滑剂，如，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠及其混合物；和(10)着色剂。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，药物组合物还可包含缓冲剂。类似类型的固体组合物也可作为填充物用于软和硬填充明胶胶囊中，其使用赋形剂如乳糖(lactose)或乳糖(milksugar)以及高分子量聚乙二醇等。

用于经口施用的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、微乳、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除了活性成分以外，液体剂型可含有本领域常用的惰性稀释剂，如，水或其他溶剂、增溶剂和/或乳化剂，如，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(具体而言，棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油（germ oil）、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃基甲醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯和其混合物。除了惰性稀释剂以外，经口组合物还可包括佐剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂、着色剂、芳香剂和防腐剂。

悬浮液，除了活性化合物以外，可含有悬浮剂，如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨糖醇和脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝（aluminum metahydroxide）、膨润土、琼脂和西黄蓍胶及其混合物。

本发明的组合物还可以含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。微生物的作用的预防可通过包括各种抗菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等)来确保。可期望向组合物中包括等渗剂如糖、氯化钠等。此外，可通过包括延迟吸收的试剂如单硬脂酸铝和明胶导致可注射药物形式的延长吸收。

应理解，剂量方案将由主治医师考虑各种因素来确定，所述因素改变本公开内容的主题化合物(例如，GDF/BMP拮抗剂)的作用。各种因素包括但不限于患者的年龄、性别和膳食，疾病严重程度，施用的时间和其他临床因素。任选地，剂量可以随着重构中使用的基质类型和组合物中化合物的类型而变化。向最终组合物中添加其他已知的生长因子也可以影响剂量。可以通过定期评估骨生长和/或修复来监控进展，例如，X-射线(包括DEXA)、组织形态度量测定和四环素标记。

在某些实施方案中，本发明还提供了用于体内产生GDF/BMP拮抗剂的基因疗法。这种疗法将通过将GDF/BMP拮抗剂多核苷酸序列引入具有上文列出的病症的细胞或组织来实现其治疗效果。GDF/BMP拮抗剂多核苷酸序列的递送可使用重组表达载体如嵌合病毒或胶态分散系统来实现。GDF/BMP拮抗剂多核苷酸序列的治疗递送优选使用靶向的脂质体。

如本文教导的可用于基因疗法的各种病毒载体包括腺病毒、疱疹病毒、牛痘或优选RNA病毒(如，逆转录病毒)。优选地，逆转录病毒载体是鼠或禽逆转录病毒的衍生物。其中可插入单一外源基因的逆转录病毒载体的实例包括但不限于：莫洛尼鼠类白血病病毒(MoMuLV)、Harvey鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠类乳腺肿瘤病毒(MuMTV)和劳斯肉瘤病毒(RSV)。许多额外的逆转录病毒载体可并入多种基因。所有这些载体都可转移或并入用于选择标记的基因，从而使得可鉴定和产生转导的细胞。通过附着例如，糖、糖脂或蛋白，可使得逆转录病毒载体为靶特异性的。优选的靶向通过使用抗体实现。本领域技术人员将认识到，特定的多核苷酸序列可插入逆转录病毒基因组或附着至病毒包膜以允许含有GDF/BMP拮抗剂的逆转录病毒载体的靶特异性递送。在优选实施方案中，所述载体被靶向至骨或软骨。

另一方面，组织培养细胞可通过常规磷酸钙转染，用编码逆转录病毒结构基因gag、pol和env的质粒直接转染。然后这些细胞用含有目标基因的载体质粒转染。所得细胞将逆转录病毒载体释放至培养基中。

用于GDF/BMP拮抗剂多核苷酸的另一种靶向的递送系统是胶态分散系统。胶态分散系统包括大分子复合体、纳米胶囊（nanocapsules）、小球体、珠和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、微团、混合微团和脂质体。本发明的优选的胶态系统是脂质体。脂质体是人工膜小泡，其可体外和体内用作递送载体。RNA、DNA和完整的病毒体可被囊化在水性内部中且以生物活性形式递送至细胞(参见，例如，Fraley等人, Trends Biochem. Sci., 6:77,1981)。使用脂质体载体的用于有效基因转移的方法是本领域已知的，参见，例如，Mannino,等人, Biotechniques, 6:682, 1988。脂质体的组合物通常是磷脂的组合，通常与类固醇、特别是胆固醇组合。也可以使用其他磷脂或其他脂质。脂质体的物理特征取决于pH、离子强度和二价阳离子的存在。

脂质体生产中有用的磷脂的实例包括磷脂酰化合物，如，磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘脂、脑苷脂和神经节苷脂。举例说明性磷脂包括卵磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱和二硬脂酰磷脂酰胆碱。脂质体的靶向还可能基于例如，器官-特异性、细胞-特异性和细胞器-特异性，并且是本领域已知的。

本公开内容提供了制剂，其可以被改变以包括调节pH的酸和碱；和将pH保持在狭窄范围内的缓冲剂。

实施例

本发明已总体上进行了描述，其参考以下实施例将更容易理解，所述实施例仅为举例说明本发明的某些实施方案起见包括在内，且不意图限制本发明。

实施例1：ActRIIa-Fc融合蛋白

构建了可溶性ActRIIA融合蛋白，其具有与人或小鼠Fc结构域融合的人ActRIIa的细胞外结构域，其之间具有最小接头。所述构建体分别被称为ActRIIA-hFc和ActRIIA-mFc。

ActRIIA-hFc如下显示为从CHO细胞系纯化(SEQ ID NO:32)：

ActRIIA-hFc和ActRIIA-mFc蛋白在CHO细胞系中表达。考虑了三种不同的前导序列：

(i)蜜蜂蜂毒肽(HBML)：MKFLVNVALVFMVVYISYIYA (SEQ ID NO:33)

(ii)组织纤溶酶原激活物(TPA)：MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP (SEQ ID NO:34)

(iii)天然：MGAAAKLAFAVFLISCSSGA (SEQ ID NO:35)。

选择的形式采用TPA前导序列且具有以下未加工的氨基酸序列：

该多肽由以下核酸序列编码：

ActRIIA-hFc和ActRIIA-mFc两者均显著适合于重组表达。如图5中所示，将蛋白纯化为蛋白的单一、清晰的峰。N-末端测序揭示–ILGRSETQE (SEQ ID NO:38)的单一序列。纯化可以通过一系列柱层析步骤实现，包括例如，以任何顺序的以下的三种或更多种：A蛋白层析、Q琼脂糖凝胶层析、苯基琼脂糖凝胶层析、尺寸排阻层析和阳离子交换层析。纯化可以用病毒过滤和缓冲液更换完成。ActRIIA-hFc蛋白被纯化至如通过尺寸排阻层析所测定的>98％的纯度和如通过SDS PAGE所测定的>95％的纯度。

ActRIIA-hFc和ActRIIA-mFc显示对配体的高亲和力。使用标准胺偶联程序将GDF11或激活蛋白A固定在Biacore™ CM5芯片上。将ActRIIA-hFc和ActRIIA-mFc蛋白加载至系统上并测量结合。ActRIIA-hFc以5 x 10^-12的解离常数(K_D)与激活蛋白结合，且以9.96x 10^-9的K_D与GDF11结合。参见图6。使用类似的结合测定，ActRIIA-hFc被确定为对于其它TGF-β超家族配体(包括，例如激活蛋白B、GDF8、BMP6和BMP10)具有高至中等的亲和力。ActRIIA-mFc表现相似。

ActRIIA-hFc在药物代谢动力学研究中非常稳定。向大鼠用1 mg/kg、3 mg/kg或10mg/kg的ActRIIA-hFc蛋白给药，且在24、48、72、144和168小时测量蛋白的血浆水平。在分开的研究中，大鼠以1 mg/kg、10 mg/kg或30 mg/kg给药。在大鼠中，ActRIIA-hFc具有11-14天血清半衰期，且药物的循环水平在两周后相当高(对于1 mg/kg、10 mg/kg或30 mg/kg的最初施用，分别为11 μg/ml、110 μg/ml或304 μg/ml) 。在食蟹猴中，血浆半衰期显著大于14天，且对于1 mg/kg、10 mg/kg或30 mg/kg的最初施用，药物的循环水平分别为25μg/ml、304μg/ml或1440μg/ml。

实施例2：ActRIIA-hFc蛋白的表征

使用SEQ ID NO:34的组织纤溶酶原前导序列，在稳定转染的CHO-DUKX B11细胞中从pAID4载体(SV40 ori/增强子，CMV启动子)表达ActRIIA-hFc融合蛋白。如上文实施例1中所述纯化的蛋白具有SEQ ID NO:32的序列。Fc部分是人IgG1 Fc序列，如SEQ ID NO:32中所示。蛋白分析揭示ActRIIA-hFc融合蛋白形成为具有二硫键的同二聚体。

CHO细胞表达的材料对激活蛋白B配体的亲和力高于对人293细胞中表达的ActRIIa-hFc融合蛋白所报道的亲和力[参见，del Re等人 (2004) J Biol Chem. 279(51):53126-53135]。另外，TPA前导序列的使用提供了比其它前导序列更大的产量，并且与用天然前导序列表达的ActRIIA-Fc不同，提供了高纯度的N-末端序列。使用天然前导序列产生两种主要种类的ActRIIA-Fc，各自具有不同的N-末端序列。

实施例3：备择ActRIIA-Fc蛋白

可以根据本文所述的方法使用的多种ActRIIA变体描述于作为WO2006/012627 公开的国际专利申请(参见例如，第55-58页)中，其整体引入本文作为参考。备择的构建体可以具有C-末端尾部(ActRIIA的细胞外结构域的最后15个氨基酸)的缺失。这种构建体的序列如下呈现(Fc部分加下划线)(SEQ ID NO:39)：

实施例4：ActRIIB-Fc融合蛋白的生成

申请人构建了可溶性ActRIIB融合蛋白，其具有与人或小鼠Fc结构域融合的人ActRIIB的细胞外结构域，其之间具有最小接头。所述构建体分别被称为ActRIIB-hFc和ActRIIB-mFc。

ActRIIB-hFc如下显示为从CHO细胞系纯化(SEQ ID NO:40)：

ActRIIB-hFc和ActRIIB-mFc蛋白在CHO细胞系中表达。考虑了三种不同的前导序列：(i)蜜蜂蜂毒肽(HBML)，ii)组织纤溶酶原激活物(TPA)，和(iii)天然：MGAAAKLAFAVFLISCSSGA (SEQ ID NO:41)。

选择的形式采用TPA前导序列且具有以下未加工的氨基酸序列(SEQ ID NO:42)：

该多肽由以下核酸序列(SEQ ID NO:43)编码：

CHO细胞产生的材料的N-末端测序揭示–GRGEAE (SEQ ID NO:44)的主要序列。值得注意的是，文献中报道的其它构建体以–SGR…序列开始。

纯化可以通过一系列柱层析步骤实现，包括例如，以任何顺序的以下的三种或更多种：A蛋白层析、Q琼脂糖凝胶层析、苯基琼脂糖凝胶层析、尺寸排阻层析和阳离子交换层析。纯化可以用病毒过滤和缓冲液更换完成。

ActRIIB-Fc融合蛋白也在HEK293细胞和COS细胞中表达。尽管来自所有细胞系和合理培养条件的材料都提供了在体内具有肌肉锻炼（muscle-building）活性的蛋白，但观察到效力的可变性，其可能与细胞系选择和/或培养条件相关。

申请人在ActRIIB的细胞外结构域中生成了一系列突变，并将这些突变蛋白产生为细胞外ActRIIB和Fc结构域之间的可溶性融合蛋白。背景ActRIIB-Fc融合物（fusion）具有SEQ ID NO:40的序列。

将各种突变(包括N-和C-末端截短)引入背景ActRIIB-Fc蛋白中。基于本文呈现的数据，预期这些构建体如果用TPA前导序列表达，将缺乏N-末端丝氨酸。通过PCR诱变在ActRIIB细胞外结构域中生成突变。在PCR后，将片段通过Qiagen柱纯化，用Sfol和Agel消化并凝胶纯化。将这些片段连接至表达载体pAID4(参见WO2006/012627)中，从而使得在连接时其产生与人IgG1的融合嵌合体。转化入大肠杆菌DH5α中时，挑取菌落并分离DNA。对于鼠构建体(mFc)，用鼠IgG2a取代人IgG1。验证所有突变体的序列。通过瞬时转染在HEK293T细胞中产生所有突变体。总之，在500ml旋转器中，将HEK293T细胞在250ml体积的Freestyle(Invitrogen)培养基中以6x10⁵个细胞/ml设置并生长过夜。第二天，将这些细胞用DNA:PEI(1:1)复合体以0.5μg/ml最终DNA浓度处理。4小时后，添加250ml培养基，并使细胞生长7天。通过离心（spinning down）细胞来收获条件培养基并浓缩。

将突变体使用多种技术(包括例如A蛋白柱)纯化，并用低pH (3.0)甘氨酸缓冲液洗脱。中和后，将这些针对PBS透析。

还通过类似方法在CHO细胞中产生突变体。在引入本文作为参考的WO 2008/097541和WO 2006/012627中描述的结合测定和/或生物测定中测试突变体。在一些情况下，用条件培养基而不是纯化的蛋白进行测定。ActRIIB的额外变异描述于美国专利号7,842,663中。

申请人生成了ActRIIB(25-131)-hFc融合蛋白，其包含具有N-末端和C-末端截短(天然蛋白SEQ ID NO:1的残基25-131)的人ActRIIB细胞外结构域，其在N-末端与取代天然ActRIIB前导序列的TPA前导序列融合且在C-末端经由最小接头(三个甘氨酸残基)与人Fc结构域融合(图7)。编码该融合蛋白的核苷酸序列显示于图8。申请人修饰了密码子并发现了编码ActRIIB(25-131)-hFc蛋白的变体核酸，其提供了最初转化体的表达水平的显著改善(图9)。

成熟蛋白具有如下氨基酸序列(通过N-末端测序证实的N-末端)(SEQ ID NO:45)：

表达的分子使用一系列柱层析步骤纯化，包括例如，以任何顺序的以下的三种或更多种：A蛋白层析、Q琼脂糖凝胶层析、苯基琼脂糖凝胶层析、尺寸排阻层析和阳离子交换层析。纯化可以用病毒过滤和缓冲液更换完成。

用Biacore™仪器在体外评价几种配体对ActRIIB(25-131)-hFc及其全长对应物ActRIIB(20-134)-hFc的亲和力，且结果总结于下表中。由于复合体的非常快速的缔合和解离，Kd值通过稳态亲和拟合获得，这防止了k_on和k_off的准确测定。ActRIIB(25-131)-hFc以高亲和力结合例如激活蛋白A、激活蛋白B和GDF11。

ActRIIB-hFc形式的配体亲和力：

实施例5：GDF捕获物的生成

如下构建GDF捕获物。具有修饰的ActRIIB的细胞外结构域(具有L79D取代的SEQ IDNO:1的氨基酸20-134)的多肽(其相对于GDF11和/或肌肉生长抑制素具有大大降低的激活蛋白A结合(由于SEQ ID NO:1中位置79的亮氨酸至天冬氨酸取代)，与人或小鼠Fc结构域融合，其之间具有最小接头。所述构建体分别被称为ActRIIB(L79D 20-134)-hFc和ActRIIB(L79D 20-134)-mFc。在位置79具有谷氨酸而不是天冬氨酸的备择形式表现类似(L79E)。还生成在下面的就SEQ ID NO:64而言的位置226处具有丙氨酸而不是缬氨酸的备择形式，并且其在所有测试的方面表现相同。在位置79(相对于SEQ ID NO:1)的天冬氨酸在下面用双下划线表示。相对于SEQ ID NO:64的位置226处的缬氨酸在下面也通过双下划线表示。

GDF捕获物ActRIIB(L79D 20-134)-hFc如下显示为从CHO细胞系纯化(SEQ ID NO:46)。

GDF捕获物的ActRIIB衍生的部分具有下文所示的氨基酸序列(SEQ ID NO:47)，并且该部分可以用作单体或作为单体、二聚体或高级（greater-order）复合体的非Fc融合蛋白。

GDF捕获物蛋白在CHO细胞系中表达。考虑了三种不同的前导序列：

(i)蜜蜂蜂毒肽(HBML)，(ii)组织纤溶酶原激活物(TPA)，和(iii)天然。

该多肽由以下核酸序列(SEQ ID NO:49)编码：

纯化可以通过一系列柱层析步骤实现，包括例如，以任何顺序的以下的三种或更多种：A蛋白层析、Q琼脂糖凝胶层析、苯基琼脂糖凝胶层析、尺寸排阻层析和阳离子交换层析。纯化可以用病毒过滤和缓冲液更换完成。在纯化方案的实例中，将细胞培养基在A蛋白柱上经过，在150 mM Tris/NaCl (pH 8.0)中洗涤，然后在50 mM Tris/NaCl (pH 8.0)中洗涤，并用0.1M甘氨酸, pH 3.0洗脱。将低pH洗脱物在室温保持30分钟作为病毒清除步骤。然后将洗脱物中和并在Q-琼脂糖凝胶离子交换柱上经过，并在50 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCl中洗涤，并在具有150 mM-300 mM的NaCl浓度的50 mM Tris pH 8.0中洗脱。然后将洗脱物更换到50 mM Tris pH 8.0，1.1 M硫酸铵中并在苯基琼脂糖凝胶柱上经过，洗涤，并在具有150-300 mM的硫酸铵的50 mM Tris pH 8.0中洗脱。将洗脱物透析并过滤以供使用。

额外的GDF捕获物(经修饰以降低激活蛋白A结合相对于肌肉生长抑制素或GDF11结合的比率的ActRIIB-Fc融合蛋白)描述于引入本文作为参考的WO 2008/097541和WO2006/012627中。

实施例6：GDF-11-和激活蛋白介导的信号传导的生物测定

使用A-204报道基因测定来评价ActRIIB-Fc蛋白和GDF捕获物对通过GDF-11和激活蛋白A的信号传导的影响。细胞系：人横纹肌肉瘤(衍生自肌肉)。报道载体：pGL3(CAGA)12 (描述于Dennler等人, 1998, EMBO 17: 3091-3100)。CAGA12基序存在于TGF-βTGFβ响应基因(例如，PAI-1基因)中，所以该载体通常用于通过SMAD2和3信号传导的因子。

第1天：将A-204细胞分至48孔板中。

第2天：用10 ug pGL3(CAGA)12或pGL3(CAGA)12(10 ug) + pRLCMV (1 µg)和Fugene转染A-204细胞。

第3天：添加因子(稀释至培养基+ 0.1％ BSA中)。在添加至细胞之前，抑制剂需要与因子预温育1小时。6小时后，将细胞用PBS冲洗并裂解。

这随后为萤光素酶测定。在不存在任何抑制剂的情况下，激活蛋白A显示报道基因表达的10-倍刺激和ED50 ~ 2 ng/ml。GDF-11：16倍刺激，ED50：~ 1.5 ng/ml。

ActRIIB(20-134)是该测定中例如激活蛋白A、GDF-8和GDF-11活性的有效抑制剂。如下所述，还在该测定中测试ActRIIB变体。

实施例7：ActRIIB-Fc变体，基于细胞的活性

如上所述在基于细胞的测定中测试ActRIIB-Fc蛋白和GDF捕获物的活性。结果总结于下表中。在不同的C-末端截短构建体中测试一些变体。如上文所讨论的，5或15个氨基酸的截短引起活性降低。GDF捕获物(L79D和L79E变体)显示激活蛋白A抑制的基本丧失，同时保留GDF-11的几乎野生型抑制。

可溶性ActRIIB-Fc与GDF 11和激活蛋白A的结合：

+ 差的活性(大致1x10^-6 K_I)

++ 中等活性(大致1x10^-7 K_I)

+++ 良好(野生型)活性(大致1x10^-8 K_I)

++++ 大于野生型活性。

A24N变体在基于细胞的测定(上述)中具有活性，并且其与野生型分子相当。A24N变体和上述测试的其它变体中的任一种，可以与GDF捕获物分子如L79D或L79E变体组合。

实施例8：GDF-11和激活蛋白A结合。

在Biacore^TM测定中测试某些ActRIIB-Fc蛋白和GDF捕获物与配体的结合。

使用抗-hFc抗体将ActRIIB-Fc变体或野生型蛋白捕获至系统上。注射配体并使其流过捕获的受体蛋白。结果总结于下表中。

配体结合特异性IIB变体。

这些在无细胞测定中获得的数据证实了基于细胞的测定数据，从而证明A24N变体保留与ActRIIB(20-134)-hFc分子类似的配体结合活性，且L79D或L79E分子保留肌肉生长抑制素和GDF11结合，但显示显著降低的与激活蛋白A的结合(不可定量)。

已经生成和测试了其它变体，如WO2006/012627(其整体引入本文作为参考)中所报道的。参见例如第59-60页，其使用与设备偶联的配体并使受体流过偶联的配体。值得注意的是，相对于野生型K74分子，K74Y、K74F、K74I(并且推测起来K74处的其它疏水取代，如K74L)和D80I引起激活蛋白A (ActA)与GDF11结合的比率降低。下面重现了关于这些变体的数据表：

可溶性ActRIIB-Fc变体与GDF11和激活蛋白A的结合(Biacore™测定)

* 没有观察的结合

-- < 1/5 WT结合

- ~ 1/2 WT结合

+ WT

++ < 2x增加的结合

+++ ~5x增加的结合

++++ ~10x增加的结合

+++++ ~ 40x增加的结合。

实施例9：具有截短的ActRIIB细胞外结构域的GDF捕获物的生成

通过TPA前导序列N-末端融合至含有亮氨酸至天冬氨酸取代(在SEQ ID NO:1中的残基79处)的ActRIIB细胞外结构域(SEQ ID NO:1中的残基20-134)和人Fc结构域利用最小接头(三个甘氨酸残基)的C-末端融合来生成被称为ActRIIB(L79D 20-134)-hFc的GDF捕获物(图10；SEQ ID NO:74)。对应于该融合蛋白的核苷酸序列显示于图11(SEQ ID NO:75，有义链；和SEQ ID NO:76，反义链)。

通过TPA前导序列N-末端融合至含有亮氨酸至天冬氨酸取代(在SEQ ID NO:1中的残基79处)的截短的细胞外结构域(SEQ ID NO:1中的残基25-131)和人Fc结构域利用最小接头(三个甘氨酸残基)的C-末端融合来生成被称为ActRIIB(L79D 25-131)-hFc的具有截短的ActRIIB细胞外结构域的GDF捕获物(图12，SEQ ID NO:77)。ActRIIB(L79D 25-131)-hFc的细胞纯化形式的序列呈现于图13中 (SEQ ID NO:78)。编码该融合蛋白的一种核苷酸序列(SEQ ID NO:80)连同其互补序列(SEQ ID NO:81)显示于图15中，而编码完全相同的融合蛋白的一种备择核苷酸序列(SEQ ID NO:82)及其互补序列(SEQ ID NO:83)显示于图16中。

实施例10：通过具有双截短的ActRIIB细胞外结构域的GDF捕获物的选择性配体结合

用Biacore™仪器在体外评价GDF捕获物和其它ActRIIB-hFc蛋白对几种配体的亲和力。结果总结于下表中。由于复合体的非常快速的缔合和解离，Kd值通过稳态亲和拟合获得，这防止了k_on和k_off的准确测定。

ActRIIB-hFc变体的配体选择性：

具有截短的细胞外结构域的GDF捕获物，ActRIIB(L79D 25-131)-hFc，等于或超过较长变体ActRIIB(L79D 20-134)-hFc所展示的配体选择性，与缺乏L79D取代的ActRIIB-hFc对应物相比，具有激活蛋白A结合的显著丧失，激活蛋白B结合的部分丧失，以及GDF11结合的几乎完全保留。请注意，单独的截短(没有L79D取代)不改变此处展示的配体中的选择性[比较ActRIIB(L79 25-131)-hFc与ActRIIB(L79 20-134)-hFc]。ActRIIB(L79D 25-131)-hFc还保留了与Smad 2/3信号传导配体GDF8和Smad 1/5/8配体BMP6和BMP10的强至中等程度结合。

实施例11：衍生自ActRIIB5的GDF捕获物

其他人已经报道了ActRIIB的一种替代的可溶形式(称为ActRIIB5)，其中包括ActRIIB跨膜结构域的外显子4已经被不同的C-末端序列置换(参见例如，WO 2007/053775)。

没有其前导序列的天然人ActRIIB5的序列如下：

亮氨酸至天冬氨酸取代或其它酸性取代可以如所述在天然位置79(加下划线的)处进行以构建变体ActRIIB5(L79D)，其具有以下序列：

该变体可以用TGGG接头(单下划线)连接至人Fc(双下划线)以生成具有以下序列的人ActRIIB5(L79D)-hFc融合蛋白：

该构建体可以在CHO细胞中表达。

实施例12：ALK4:ActRIIB异二聚体的生成

构建了ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异聚复合体，其包含人ActRIIB和人ALK4的细胞外结构域，其各自分别用位于细胞外结构域和Fc结构域之间的接头融合至Fc结构域。各个构建体分别被称为ActRIIB-Fc融合多肽和ALK4-Fc融合多肽，且下面提供各自的序列。

与ActRIIB-Fc或ALK4-Fc同二聚的复合体相反，促进形成ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异聚复合体的方法是在Fc结构域的氨基酸序列中引入改变，以指导不对称的异聚复合体的形成。本公开内容中描述了使用Fc结构域制备不对称的相互作用对的许多不同的方法。

在一种方法中，分别在SEQ ID NO:108和110以及SEQ ID NO:111和113的ActRIIB-Fc和ALK4-Fc多肽序列中举例说明的，一个Fc结构域被改变以在相互作用界面处引入阳离子氨基酸，而另一个Fc结构域被改变以在相互作用界面处引入阴离子氨基酸。ActRIIB-Fc融合多肽和ALK4-Fc融合多肽各自采用组织纤溶酶原激活物(TPA)前导序列。

ActRIIB-Fc多肽序列(SEQ ID NO:108)显示如下：

前导(信号)序列和接头加下划线。为了促进形成ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体而不是任一种可能的同二聚的复合体，两个氨基酸取代(用赖氨酸置换酸性氨基酸)可以被引入ActRIIB融合蛋白的Fc结构域，如上文通过双下划线所示的。SEQ ID NO:108的氨基酸序列可以任选地以从C-末端除去赖氨酸(K)来提供。

该ActRIIB-Fc融合蛋白由以下核酸序列(SEQ ID NO:109)编码：

成熟的ActRIIB-Fc融合多肽(SEQ ID NO:110)如下，且可以任选地以从C-末端除去赖氨酸(K)来提供。

ALK4-Fc融合多肽的互补形式(SEQ ID NO:111)如下：

前导序列和接头加下划线。为了指导与上述SEQ ID NO:108和110的ActRIIB-Fc融合多肽的异二聚体形成，两个氨基酸取代(用天冬氨酸置换赖氨酸)可被引入ALK4-Fc融合多肽的Fc结构域，如上文通过双下划线所示的。SEQ ID NO:111的氨基酸序列可以任选地以在C-末端添加赖氨酸(K)来提供。

该ALK4-Fc融合蛋白由以下核酸(SEQ ID NO:112)编码：

成熟的ALK4-Fc融合蛋白序列(SEQ ID NO:113)如下，且可以任选地以在C-末端添加赖氨酸(K)来提供。

分别为SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:113的ActRIIB-Fc和ALK4-Fc蛋白可以从CHO细胞系共表达和纯化，以产生包含ALK4-Fc:ActRIIB-Fc的异聚复合体。

在使用不对称的Fc融合蛋白促进异多聚体复合体形成的另一种方法中，Fc结构域被改变以引入互补疏水作用和额外的分子间二硫键，如在分别SEQ ID NO:114和115以及SEQ ID NO:116和117的ActRIIB-Fc和ALK4-Fc多肽序列中所举例说明的。ActRIIB-Fc融合多肽和ALK4-Fc融合多肽各自采用组织纤溶酶原激活物(TPA)前导序列。

ActRIIB-Fc多肽序列(SEQ ID NO:114)显示如下：

前导(信号)序列和接头加下划线。为了促进形成ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体而不是任一种可能的同二聚的复合体，两个氨基酸取代(用半胱氨酸置换丝氨酸和用色氨酸置换苏氨酸)可以被引入融合蛋白的Fc结构域，如上文通过双下划线所示的。SEQ ID NO:114的氨基酸序列可以任选地以从C-末端除去赖氨酸(K)来提供。

成熟的ActRIIB-Fc融合多肽如下：

ALK4-Fc融合多肽的互补形式(SEQ ID NO:116)如下，且可以任选地以从C-末端除去赖氨酸(K)来提供。

前导序列和接头加下划线。为了指导与上述SEQ ID NO:114和115的ActRIIB-Fc融合多肽的异二聚体形成，四个氨基酸取代可被引入ALK4融合多肽的Fc结构域，如上文通过双下划线所示的。SEQ ID NO:116的氨基酸序列可以任选地以从C-末端除去赖氨酸(K)来提供。

成熟的ALK4-Fc融合蛋白序列如下，且可以任选地以从C-末端除去赖氨酸(K)来提供。

分别为SEQ ID NO:115和SEQ ID NO:117的ActRIIB-Fc和ALK4-Fc蛋白可以从CHO细胞系共表达和纯化，以产生包含ALK4-Fc:ActRIIB-Fc的异聚复合体。

各种ALK4-Fc:ActRIIB-Fc复合体的纯化可以通过一系列柱层析步骤实现，包括例如，以任何顺序的以下的三种或更多种：A蛋白层析、Q琼脂糖凝胶层析、苯基琼脂糖凝胶层析、尺寸排阻层析和阳离子交换层析。纯化可以用病毒过滤和缓冲液更换完成。

在使用不对称的Fc融合蛋白促进异多聚体复合体形成的另一种方法中，Fc结构域被改变以引入互补疏水作用、额外的分子间二硫键和两个Fc结构域之间的静电差以用于促进基于净分子电荷的纯化，如在分别SEQ ID NO:118-121和122-125的ActRIIB-Fc和ALK4-Fc多肽序列中所举例说明的。ActRIIB-Fc融合多肽和ALK4-Fc融合多肽各自采用组织纤溶酶原激活物(TPA)前导序列。

ActRIIB-Fc多肽序列(SEQ ID NO:118)显示如下：

前导序列和接头加下划线。为了促进形成ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体而不是任一种可能的同二聚的复合体，两个氨基酸取代(用半胱氨酸置换丝氨酸和用色氨酸置换苏氨酸)可以被引入融合蛋白的Fc结构域，如上文通过双下划线所示的。为了促进ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体的纯化，两个氨基酸取代(用酸性氨基酸置换赖氨酸)也可以被引入融合蛋白的Fc结构域，如上文通过双下划线所示的。SEQ ID NO:118的氨基酸序列可以任选地以在C-末端添加赖氨酸来提供。

该ActRIIB-Fc融合蛋白由以下核酸(SEQ ID NO:119)编码：

成熟的ActRIIB-Fc融合多肽如下(SEQ ID NO:120)，且可以任选地以向C-末端添加赖氨酸来提供。

该ActRIIB-Fc融合多肽由以下核酸(SEQ ID NO:121)编码：

ALK4-Fc融合多肽的互补形式(SEQ ID NO:122)如下，且可以任选地以从C-末端除去赖氨酸来提供。

前导序列和接头加下划线。为了指导与上述SEQ ID NO:118和120的ActRIIB-Fc融合多肽的异二聚体形成，四个氨基酸取代(用半胱氨酸置换酪氨酸，用丝氨酸置换苏氨酸，用丙氨酸置换亮氨酸，和用缬氨酸置换酪氨酸)可被引入ALK4融合多肽的Fc结构域，如上文通过双下划线所示的。为了促进ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体的纯化，两个氨基酸取代(用精氨酸置换天冬酰胺，和用精氨酸置换天冬氨酸)也可以被引入ALK4-Fc融合蛋白的Fc结构域，如上文通过双下划线所示的。SEQ ID NO:122的氨基酸序列可以任选地以从C-末端除去赖氨酸来提供。

该ALK4-Fc融合多肽由以下核酸(SEQ ID NO:123)编码：

成熟的ALK4-Fc融合多肽序列如下(SEQ ID NO:124)，且可以任选地以从C-末端除去赖氨酸来提供。

该ALK4-Fc融合多肽由以下核酸(SEQ ID NO:125)编码：

分别为SEQ ID NO:120和SEQ ID NO:124的ActRIIB-Fc和ALK4-Fc蛋白可以从CHO细胞系共表达和纯化，以产生包含ALK4-Fc:ActRIIB-Fc的异聚复合体。

各种ALK4-Fc:ActRIIB-Fc复合体的纯化可以通过一系列柱层析步骤实现，包括例如，以任何顺序的以下的三种或更多种：A蛋白层析、Q琼脂糖凝胶层析、苯基琼脂糖凝胶层析、尺寸排阻层析、阳离子交换层析、基于表位的亲和层析(例如，用针对ALK4或ActRIIB上的表位的抗体或功能等效配体)和多元层析(例如，用含有静电和疏水配体两者的树脂)。纯化可以用病毒过滤和缓冲液更换完成。

实施例13. 与ActRIIB-Fc同二聚体和ALK4-Fc同二聚体相比，ALK4-Fc:ActRIIB- Fc异二聚体的配体结合概况

基于Biacore^TM的结合测定用于比较上述ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚的复合体与ActRIIB-Fc和ALK4-Fc同二聚体复合体的配体结合选择性。使用抗-Fc抗体将ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体、ActRIIB-Fc同二聚体和ALK4-Fc同二聚体独立地捕获至系统上。注射配体且允许其流过捕获的受体蛋白。结果总结于下表中，其中最指示有效的配体捕获物的配体解离速率(k_d)通过灰色阴影表示。

这些比较结合数据证明ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体相对于ActRIIB-Fc或ALK4-Fc同二聚体具有改变的结合概况/选择性。ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体与任一同二聚体相比展示与激活蛋白B增强的结合，保留如用ActRIIB-Fc同二聚体所观察到的与激活蛋白A、GDF8和GDF11的强结合，且表现出与BMP9、BMP10和GDF3显著减少的结合。具体而言，BMP9展示低或无可观察到的对ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体的亲和力，而该配体强烈结合ActRIIB-Fc同二聚体。与ActRIIB-Fc同二聚体一样，异二聚体保留与BMP6的中等水平结合。参见图19。

此外，使用A-204报道基因测定来评价ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体和ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc同二聚体对通过激活蛋白A、激活蛋白B、GDF11、GDF8、BMP10和BMP9的信号传导的影响。细胞系：人横纹肌肉瘤(衍生自肌肉)。报道载体：pGL3(CAGA)12 (如Dennler等人, 1998, EMBO 17: 3091-3100中所述)。CAGA12基序存在于TGFβ响应基因(PAI-1基因)中，所以该载体通常用于通过Smad2和3信号传导的因子。以下概述示例性A-204报道基因测定。

第1天：将A-204细胞分至48孔板中。

第2天：用10 ug pGL3(CAGA)12或pGL3(CAGA)12(10 ug)+pRLCMV (1 ug)和Fugene转染A-204细胞。

第3天：添加因子(稀释至培养基+ 0.1% BSA中)。在添加至细胞之前，抑制剂需要与因子预温育约1小时。约6小时后，将细胞用PBS冲洗且然后裂解。

遵循上述步骤，进行萤光素酶测定。

在该测定中，ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体和ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc同二聚体两者均被确定为激活蛋白A、激活蛋白B、GDF11和GDF8的有效抑制剂。具体而言，如在图19中所举例说明的比较同二聚体/异二聚体IC₅₀数据中可见的，ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体与ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc同二聚体类似地抑制激活蛋白A、激活蛋白B、GDF8和GDF11信号传导途径。然而，与ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc同二聚体相比，BMP9和BMP10信号传导途径的ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体抑制显著降低。该数据与上面讨论的结合数据一致，其中观察到ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体和ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc同二聚体两者都展示与激活蛋白A、激活蛋白B、GDF8和GDF11的强结合，但与ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc同二聚体相比，BMP10和BMP9对ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体具有显著降低的亲和力。

合起来，这些数据因此证明，与ActRIIB-Fc同二聚体相比，ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体是激活蛋白A、激活蛋白B、GDF8和GDF11的更有选择性的拮抗剂。因此，在其中这种选择性拮抗作用有利的某些应用中，ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体将比ActRIIB-Fc同二聚体更有用。实例包括治疗应用，其中期望保留激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白AC、GDF8和GDF11中的一种或多种的拮抗作用，但使BMP9、BMP10、GDF3和BMP6中的一种或多种的拮抗作用最小化。

实施例14： ActRII多肽和ALK4:ActRIIB异二聚体对单野百合碱大鼠模型中的肺高血压的作用

在肺动脉高压(PAH)的大鼠模型中检查ActRIIA-mFc融合蛋白(如实施例1中所述的ActRIIA-mFc同二聚体)、ALK4-Fc-ActRIIB-Fc异二聚体(如实施例12和13中所述的)和西地那非(经批准用于治疗PAH的磷酸二酯酶-5抑制剂)的作用。在该模型中，Sprague Dawley大鼠在开始疗法前24小时接受单野百合碱(MCT)的皮下注射以诱导PAH。

将大鼠分成不同的治疗组(每组10只小鼠)： 1)用MCT(在研究的第1天作为单剂i.p.施用的60 mg/kg)和Tris缓冲盐水(作为1 ml/kg i.p.，每三天)治疗(载体治疗组)，2)用ActRIIA-mFc多肽(每3天i.p.施用的10 mg/kg)和MCT(在研究的第1天作为单剂i.p.施用的60 mg/kg)治疗，3)用ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体(每3天i.p.施用的10 mg/kg)和MCT(在研究的第1天作为单剂i.p.施用的60 mg/kg)治疗，4)用西地那非(每天两次口服施用的30 mg/kg)和MCT (在研究的第1天作为单剂i.p.施用的60 mg/kg)治疗，和5)对照大鼠(每三天作为1 ml/kg i.p.施用的Tris缓冲盐水)。治疗大鼠28天。在第1天第一剂前记录体重，且然后在整个研究期间每周记录体重。

在第28天，通过腹膜内注射氯胺酮/塞拉嗪(80/10mg/kg)来麻醉大鼠。在颈部做切口，并分离颈静脉且前部结扎。将充液压力导管引入右颈静脉以测量肺动脉压(PAP)。在腹股沟区做另一切口，并分离股动脉且前部结扎。将Millar压力导管引入股动脉以测量收缩期动脉压、舒张压和心率。使用Notocord HEM (Croissy sur Seine, Frnace) v3.5数据捕获系统监控平均动脉压和右PAP达约5-10分钟，直到获得稳定的测量结果为止。在测量期间，将大鼠在加热垫上维持在约37℃，并在整个程序期间用直肠温度探头监控体温。在程序结束时，对大鼠实施安死术，并取出心脏和肺。将整个心脏称重。接下来，移除心房并将具有中隔的左心室(LV + S)与右心室(RV)分开。将心室分开称重。通过计算RV/LV + S部分地评估肥大。还将肺称重。

与对照动物相比，观察到单野百合碱治疗的大鼠(载体治疗组)具有减轻的体重、升高的PAP、右心肥大和增加的肺重量，从而表明PAH的确立。西地那非治疗的大鼠与单野百合碱治疗的大鼠相比没有任何体重改善。然而，与单野百合碱治疗的大鼠相比，西地那非治疗的确使升高的PAP降低30%，使右心肥大降低18.5%，并使肺重量降低10%。令人惊讶地，与西地那非相比，发现ALK4-Fc:ActRIIB-Fc和ActRIIA-mFc两者在该模型中治疗PAH中具有显著更大的效果。例如，ALK4-Fc:ActRIIB-Fc治疗导致体重改善(+5.1%)，升高的PAP降低44.6%，右心肥大降低39.6%，和肺重量降低19.0%。尽管ActRIIA-mFc治疗没有显示体重的改善，但其在治疗PAH的其他并发症中具有显著效果。例如，ActRIIA-Fc治疗导致升高的PAP降低68%，右心肥大降低47.1%，和肺重量降低18.4%。

基于组织病理学评分，在血管肌型化上观察到类似趋势。在将组织样品染色以检测αSMA/弹性蛋白之后，每只动物100个大小在10μm和50μm之间的肺小动脉被归类为非肌组织化的、部分肌组织化的或完全肌组织化的。来自载体治疗的大鼠的肺小动脉被确定为62.3%完全肌组织化的，36.4%部分肌组织化的，和1.4%非肌组织化的。西地那非治疗对降低血管肌型化仅具有适度作用(例如，肺小动脉为57.9%完全肌组织化的，41.6%部分肌组织化的，和0.9%非肌组织化的)。比较起来，与西地那非治疗的动物相比，ActRIIA-mFc治疗导致血管肌型化的显著降低(例如，与载体治疗的动物相比，肺小动脉为25.8%完全肌组织化的，66.9%部分肌组织化的，和7.3%非肌组织化的)。肺小动脉的平滑肌肥大的组织病理学评分也记录如下：0(正常)、1(最小)、2(轻度)、3(中等)或4(显著)。载体治疗的大鼠具有中等至显著的平均平滑肌肥大(3.8分)。再次，观察到西地那非治疗对肥大具有适度影响，其平均评分为3(中等)。而与载体和西地那非治疗的动物两者相比，观察到ActRIIA-mFc治疗的动物具有平滑肌肥大的显著减少(平均评分为1.6)。总的说来，ActRIIA-mFc治疗显著降低该PAH模型中的血管肌型化和肥大。

合起来，这些数据证明ActRIIA-mFc和ALK4-Fc:ActRIIB-Fc两者在改善该单野百合碱诱导的模型中的PAH的各种并发症中是有效的。具体而言，ActRIIA-mFc和ALK4-Fc:ActRIIB-Fc两者在降低动脉压、右心肥大和血管肌组织化中具有比对于西地那非(其是一种经批准用于治疗PAH的药物)观察到的更大的效果。此外，数据表明其他GDF/BMP拮抗剂，特别是具有与ActRIIA-mFc和ALK4-Fc:ActRIIB-Fc相似活性的拮抗剂，可用于治疗PAH，特别是可用于预防或减轻PAH的各种并发症的严重程度。

实施例15： ActRII多肽和ALK4:ActRIIB异二聚体对Sugen缺氧大鼠模型中的肺高血压的作用

在PAH的Sugen缺氧模型中进一步检查ActRIIA-mFc融合蛋白(如实施例1中所述的ActRIIA-mFc同二聚体)和西地那非(经批准用于治疗PAH的磷酸二酯酶-5抑制剂)的作用。在该模型中，大鼠在开始疗法前24小时接受semaxanib的每日剂量并置于低氧环境(约13%氧)中以诱导PAH。

将大鼠分成不同的治疗组(每组10只小鼠)： 1)用semaxanib(每天作为单剂s.c.施用的200 mg/kg)/缺氧和Tris缓冲盐水(作为1 ml/kg i.p.施用的，每三天)治疗(载体治疗组)，2)用ActRIIA-mFc多肽(每3天i.p.施用的10 mg/kg)和semaxanib(每天作为单剂s.c.施用的200 mg/kg)/缺氧治疗，3)用西地那非(每天两次口服施用的30 mg/kg)和semaxanib(每天作为单剂s.c.施用的200 mg/kg)/缺氧治疗，和4)对照大鼠(每三天作为1ml/kg i.p.施用的Tris缓冲盐水)。治疗大鼠28天。在第1天第一剂前记录体重，且然后在整个研究期间每周记录体重。

与对照动物相比，观察到semaxanib/缺氧治疗的大鼠(载体治疗组)具有减轻的体重、升高的PAP、右心肥大和增加的肺重量，从而表明PAH的确立。与载体治疗的动物相比，西地那非治疗使平均肺动脉压降低22.4%和使右心肥大降低10%。再次，与西地那非相比，发现ActRIIA-mFc治疗在该模型中治疗PAH中具有显著更大的效果。例如，与载体治疗的动物相比，ActRIIA-mFc治疗导致平均肺动脉压降低51.3%和右心肥大降低53.5%。

基于组织病理学评分，在血管肌型化上观察到类似趋势。在将组织样品染色以检测αSMA/弹性蛋白之后，每只动物100个大小在10μm和50μm之间的肺小动脉被归类为非肌组织化的、部分肌组织化的或完全肌组织化的。来自载体治疗的大鼠的肺小动脉被确定为72.5%完全肌组织化的，27.4%部分肌组织化的，和0.1%非肌组织化的。与载体治疗的动物相比，西地那非治疗对降低血管肌型化仅具有适度作用(例如，肺小动脉为67.4%完全肌组织化的，31.6%部分肌组织化的，和1.0%非肌组织化的)。比较起来，与西地那非治疗的动物相比，ActRIIA-mFc治疗导致血管肌型化的显著降低(例如，与载体治疗的动物相比，肺小动脉为29.3%完全肌组织化的，69.3%部分肌组织化的，和1.4%非肌组织化的)。肺小动脉的平滑肌肥大的组织病理学评分也记录如下：0(正常)、1(最小)、2(轻度)、3(中等)或4(显著)。载体治疗的大鼠具有中等至显著的平均平滑肌肥大(3.6分)。再次，观察到西地那非治疗对肥大具有适度影响，其平均评分为3(中等)。而与西地那非治疗的动物相比，观察到ActRIIA-mFc治疗的动物具有平滑肌肥大的显著减少(平均评分为1.4)。总的说来，ActRIIA-mFc治疗显著降低该PAH模型中的血管肌型化和肥大。

合起来，这些数据证明ActRIIA-mFc在改善该Sugen缺氧模型中的PAH的各种并发症中是有效的。具体而言，ActRIIA-mFc在降低动脉压、右心肥大和血管肌组织化中具有比对于西地那非(其是一种经批准用于治疗PAH的药物)观察到的更大的效果。此外，数据表明其他GDF/BMP拮抗剂，特别是具有与ActRIIA-mFc相似活性的拮抗剂，可用于治疗PAH，特别是可用于预防或减轻PAH的各种并发症的严重程度。

通过引用并入

本文提及的所有出版物和专利均特此以其整体引入本文作为参考，就像每个个别出版物或专利具体而个别被指明引入作为参考一样。

尽管已经论述了主题的具体实施方案，但上述说明书是举例说明性的而非限制性的。在仔细研究本说明书和随附权利要求书时，许多变化形式对本领域技术人员将变得显而易见。应参考权利要求连同其等同内容的整个范围和说明书连同这种变化形式来确定本发明的整个范围。

Claims

1.治疗肺动脉高压的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的多肽，所述多肽包含与如下氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列，所述如下氨基酸序列开始于SEQ IDNO: 9的氨基酸21、22、23、24、25、26、27、28、29或30中任一个且结束于SEQ ID NO: 9的氨基酸110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134或135中任一个。

2.治疗肺高血压的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的GDF/BMP拮抗剂，其中所述GDF/BMP拮抗剂抑制激活蛋白、GDF8、GDF11、GDF3、BMP6、BMP15、BMP10、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5和ALK7中的一种或多种。

3.治疗、预防或降低肺高血压的一种或多种并发症的进展率和/或严重程度的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的GDF/BMP拮抗剂，其中所述GDF/BMP拮抗剂抑制激活蛋白、GDF8、GDF11、GDF3、BMP6、BMP15、BMP10、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5和ALK7中的一种或多种。

4.权利要求3的方法，其中所述肺高血压的一种或多种并发症选自：肺动脉中的平滑肌和/或内皮细胞增殖、肺动脉中的血管发生、呼吸困难、胸痛、肺血管重建、右心室肥大和肺纤维化。

5.权利要求2-4中任一项的方法，其中所述肺高血压是肺动脉高压。

6.治疗、预防或降低间质性肺病的一种或多种并发症的进展率和/或严重程度的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的GDF/BMP拮抗剂，其中所述GDF/BMP拮抗剂抑制激活蛋白、GDF8、GDF11、GDF3、BMP6、BMP15、BMP10、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5和ALK7中的一种或多种。

7.权利要求6的方法，其中所述间质性肺病是特发性肺纤维化。

8.权利要求2-7中任一项的方法，其中所述GDF/BMP拮抗剂抑制激活蛋白。

9.权利要求8的方法，其中所述GDF/BMP拮抗剂抑制激活蛋白A。

10.权利要求8或9的方法，其中所述GDF/BMP拮抗剂抑制激活蛋白B。

11.权利要求2-10中任一项的方法，其中所述GDF/BMP拮抗剂抑制GDF8。

12.权利要求2-11中任一项的方法，其中所述GDF/BMP拮抗剂抑制GDF11。

13.权利要求2-12中任一项的方法，其中所述GDF/BMP拮抗剂抑制GDF3。

14.权利要求2-13中任一项的方法，其中所述GDF/BMP拮抗剂抑制BMP6。

15.权利要求2-14中任一项的方法，其中所述GDF/BMP拮抗剂抑制BMP15。

16.权利要求2-15中任一项的方法，其中所述GDF/BMP拮抗剂抑制BMP10。

17.权利要求2-16中任一项的方法，其中所述GDF/BMP拮抗剂抑制ActRIIA。

18.权利要求2-17中任一项的方法，其中所述GDF/BMP拮抗剂抑制ActRIIB。

19.权利要求2-18中任一项的方法，其中所述GDF/BMP拮抗剂抑制ALK4。

20.权利要求2-19中任一项的方法，其中所述GDF/BMP拮抗剂抑制ALK5。

21.权利要求2-20中任一项的方法，其中所述GDF/BMP拮抗剂抑制ALK7。

22.权利要求2-21中任一项的方法，其中所述GDF/BMP拮抗剂是抗体或抗体的组合。

23.权利要求22的方法，其中所述抗体或抗体的组合结合至少GDF8。

24.权利要求22或23的方法，其中所述抗体或抗体的组合结合至少GDF11。

25.权利要求22-24中任一项的方法，其中所述抗体或抗体的组合结合至少激活蛋白。

26.权利要求25的方法，其中所述抗体或抗体的组合结合至少激活蛋白A。

27.权利要求25或26的方法，其中所述抗体或抗体的组合结合至少激活蛋白B。

28.权利要求22-27中任一项的方法，其中所述抗体或抗体的组合结合至少GDF3。

29.权利要求22-28中任一项的方法，其中所述抗体或抗体的组合结合至少BMP6。

30.权利要求22-29中任一项的方法，其中所述抗体或抗体的组合结合至少BMP15。

31.权利要求22-30中任一项的方法，其中所述抗体或抗体的组合结合至少BMP10。

32.权利要求22-31中任一项的方法，其中所述抗体或抗体的组合结合至少ActRIIA。

33.权利要求22-32中任一项的方法，其中所述抗体或抗体的组合结合至少ActRIIB。

34.权利要求22-33中任一项的方法，其中所述抗体或抗体的组合结合至少ALK4。

35.权利要求22-34中任一项的方法，其中所述抗体或抗体的组合结合至少ALK5。

36.权利要求22-35中任一项的方法，其中所述抗体或抗体的组合结合至少ALK7。

37.权利要求22-36中任一项的方法，其中所述抗体是多特异性抗体。

38.权利要求37的方法，其中所述抗体是双特异性抗体。

39.权利要求2-21中任一项的方法，其中所述GDF/BMP拮抗剂是小分子或小分子的组合。

40.权利要求39的方法，其中所述小分子或小分子的组合抑制至少GDF8。

41.权利要求39或40的方法，其中所述小分子或小分子的组合抑制至少GDF11。

42.权利要求39-41中任一项的方法，其中所述小分子或小分子的组合抑制至少激活蛋白。

43.权利要求42的方法，其中所述小分子或小分子的组合抑制至少激活蛋白A。

44.权利要求42或43的方法，其中所述小分子或小分子的组合抑制至少激活蛋白B。

45.权利要求39-44中任一项的方法，其中所述小分子或小分子的组合抑制至少GDF3。

46.权利要求39-45中任一项的方法，其中所述小分子或小分子的组合抑制至少BMP6。

47.权利要求39-46中任一项的方法，其中所述小分子或小分子的组合抑制至少BMP15。

48.权利要求39-47中任一项的方法，其中所述小分子或小分子的组合抑制至少BMP10。

49.权利要求39-48中任一项的方法，其中所述小分子或小分子的组合抑制至少ActRIIA。

50.权利要求39-49中任一项的方法，其中所述小分子或小分子的组合抑制至少ActRIIB。

51.权利要求39-50中任一项的方法，其中所述小分子或小分子的组合抑制至少ALK4。

52.权利要求39-51中任一项的方法，其中所述小分子或小分子的组合抑制至少ALK5。

53.权利要求39-52中任一项的方法，其中所述小分子或小分子的组合抑制至少ALK7。

54.权利要求2-21中任一项的方法，其中所述GDF/BMP拮抗剂是多核苷酸或多核苷酸的组合。

55.权利要求54的方法，其中所述多核苷酸或多核苷酸的组合抑制至少GDF8。

56.权利要求54或55的方法，其中所述多核苷酸或多核苷酸的组合抑制至少GDF11。

57.权利要求54-56中任一项的方法，其中所述多核苷酸或多核苷酸的组合抑制至少激活蛋白。

58.权利要求57的方法，其中所述多核苷酸或多核苷酸的组合抑制至少激活蛋白A。

59.权利要求57或58的方法，其中所述多核苷酸或多核苷酸的组合抑制至少激活蛋白B。

60.权利要求54-59中任一项的方法，其中所述多核苷酸或多核苷酸的组合抑制至少GDF3。

61.权利要求54-60中任一项的方法，其中所述多核苷酸或多核苷酸的组合抑制至少BMP6。

62.权利要求54-61中任一项的方法，其中所述多核苷酸或多核苷酸的组合抑制至少BMP10。

63.权利要求54-62中任一项的方法，其中所述多核苷酸或多核苷酸的组合抑制至少BMP15。

64.权利要求54-63中任一项的方法，其中所述多核苷酸或多核苷酸的组合抑制至少ActRIIA。

65.权利要求54-64中任一项的方法，其中所述多核苷酸或多核苷酸的组合抑制至少ActRIIB。

66.权利要求54-65中任一项的方法，其中所述多核苷酸或多核苷酸的组合抑制至少ALK4。

67.权利要求54-66中任一项的方法，其中所述多核苷酸或多核苷酸的组合抑制至少ALK5。

68.权利要求54-67中任一项的方法，其中所述多核苷酸或多核苷酸的组合抑制至少ALK7。

69.权利要求1-68中任一项的方法，其包括向所述患者进一步施用用于治疗肺高血压的额外活性剂和/或支持疗法。

70.权利要求69的方法，其中所述用于治疗肺高血压的额外活性剂和/或支持疗法选自：前列环素及其衍生物(例如，依前列醇、曲前列环素和伊洛前列素)；前列环素受体激动剂(例如，赛乐西帕)；内皮素受体拮抗剂(例如，西他生坦、安立生坦、马西替坦和波生坦)；钙通道阻滞剂(例如，阿洛地平、地尔硫和硝苯地平；抗凝剂(例如，华法林)；利尿剂；氧气疗法；心房间隔切开术；肺动脉血栓动脉内膜切除术；磷酸二酯酶5型抑制剂(例如，西地那非和他达拉非)；可溶性鸟苷酸环化酶的活化剂(例如，cinaciguat和利奥西呱)；ASK-1抑制剂(例如，CIIA；SCH79797；GS-4997；MSC2032964A；3H-萘并[1,2,3-de]喹啉-2,7-二酮，NQDI-1；2-硫代-噻唑烷，5-溴-3-(4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基)-1,3-二氢-吲哚-2-酮)；NF-κB拮抗剂(例如，dh404、CDDO-环氧化物；2.2-二氟丙酰胺；C28咪唑(CDDO-Im)；2-氰基-3,12-二氧代齐墩果-1,9-二烯-28-酸(CDDO)；3-乙酰基齐墩果酸；3-三氟乙酰基齐墩果酸；28-甲基-3-乙酰基齐墩果烷；28-甲基-3-三氟乙酰基齐墩果烷；28-甲氧基齐墩果酸；SZC014；SCZ015；SZC017；齐墩果酸的加入聚乙二醇的衍生物；3-O-(β-D-吡喃葡糖基)齐墩果酸；3-O-[β-D-吡喃葡糖基-(1-->3)-β-D-吡喃葡糖基]齐墩果酸；3-O- [β-D-吡喃葡糖基-(1-->2)-β-D-吡喃葡糖基]齐墩果酸；3-O- [β-D-吡喃葡糖基-(1-->3)-β-D-吡喃葡糖基]齐墩果酸28-O-β-D-吡喃葡糖基酯；3-O-[β-D-吡喃葡糖基-(1-->2)-β-D-吡喃葡糖基]齐墩果酸28-O-β-D-吡喃葡糖基酯；3-O-[a-L-吡喃鼠李糖基-(1-->3)-β-D-吡喃葡糖醛酸基]齐墩果酸；3-O-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1-->3)-β-D-吡喃葡糖醛酸基]齐墩果酸28-O-β-D-吡喃葡糖基酯；28-O-β-D-吡喃葡糖基-齐墩果酸；3-O-β-D-吡喃葡糖基(1→3)-β-D-吡喃葡糖苷酸(CS1)；齐墩果酸3-O-β-D-吡喃葡糖基(1→3)-β-D-吡喃葡糖苷酸(CS2)；3,11-二氧代齐墩果-12-烯-28-酸甲酯(DIOXOL)；ZCVI₄-2；3-脱羟基-1,2,5-二唑并[3',4':2,3]齐墩果酸苄酯)；肺和/或心脏移植。

71.权利要求2-70中任一项的方法，其中所述方法包括向所述患者施用BMP9多肽。

72.权利要求71的方法，其中所述BMP9多肽是成熟BMP9多肽。

73.权利要求71的方法，其中所述BMP9多肽包含BMP9前域多肽。

74.权利要求71-73中任一项的方法，其中所述BMP9多肽在药物制剂中施用。

75.权利要求74的方法，其中所述药物制剂进一步包含BMP9前域多肽。

76.权利要求75的方法，其中所述BMP9多肽与所述BMP9前域多肽非共价缔合。

77.权利要求74的方法，其中所述药物制剂基本上不含或不含BMP9前域多肽。

78.权利要求1-77中任一项的方法，其中所述患者具有至少25 mm Hg(例如，25、30、35、40、45或50 mm Hg)的静息肺动脉压(PAP)。

79.权利要求1-78中任一项的方法，其中所述方法降低所述患者中的PAP。

80.权利要求79的方法，其中所述方法将所述患者中的PAP降低至少3 mmHg(例如，至少3、5、7、10、12、15、20或25 mm Hg)。

81.权利要求1-80中任一项的方法，其中所述方法降低所述患者中的肺血管阻力。

82.权利要求1-81中任一项的方法，其中所述方法增加肺毛细血管楔压。

83.权利要求1-82中任一项的方法，其中所述方法增加左心室舒张期末压。

84.权利要求1-83中任一项的方法，其中所述方法增加所述患者的运动能力。

85.权利要求84的方法，其中所述方法增加所述患者的6-分钟步行距离。

86.权利要求85的方法，其中所述方法将患者的6-分钟步行距离增加至少10米(例如，至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多米)。

87.权利要求1-86中任一项的方法，其中所述方法降低所述患者的Borg呼吸困难指数(BDI)。

88.权利要求87的方法，其中所述方法将患者的BDI降低至少0.5个指数点(例如，至少0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10个指数点)。

89.权利要求1-88中任一项的方法，其中所述患者具有如世界卫生组织所认可的功能I类、II类、III类或IV类肺高血压。

90.权利要求89的方法，其中所述方法预防或延迟肺高血压功能类别进展(例如，预防或延迟从功能I类进展至II类，从II类进展至III类，或从III类进展至IV类肺高血压(如世界卫生组织所认可的))。

91.权利要求89的方法，其中所述方法促进或增加肺高血压功能类别倒退(例如，促进或增加从IV类倒退至III类，从III类倒退至II类，或从II类倒退至I类肺高血压(如世界卫生组织所认可的))。

92.权利要求2-91中任一项的方法，其中所述GDF/BMP拮抗剂是包含ALK4多肽和ActRIIB多肽的异多聚体。

93.权利要求92的方法，其中所述ALK4多肽包含选自以下的多肽：

a.包含与如下氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列的多肽，所述如下氨基酸序列开始于SEQ ID NO: 100的氨基酸24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34中任一个且结束于SEQ ID NO: 100的氨基酸101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125或126中任一个；

b. 包含与SEQ ID NO: 100的氨基酸34-101具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列的多肽；

c. 包含与SEQ ID NO: 100的氨基酸24-126具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列的多肽；

d. 包含与SEQ ID NO: 101的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列的多肽；和

e. 包含与SEQ ID NO: 105的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列的多肽。

94.权利要求92或93的方法，其中所述ActRIIB多肽包含选自以下的多肽：

a.包含与如下氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列的多肽，所述如下氨基酸序列开始于SEQ ID NO: 1的氨基酸20、21、22、23、24、25、26、27、28或29中任一个且结束于SEQ ID NO: 1的氨基酸109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134中任一个；

b. 包含与SEQ ID NO: 1的氨基酸29-109具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列的多肽；

c. 包含与SEQ ID NO: 1的氨基酸25-131具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列的多肽；

d. 包含与SEQ ID NO: 2的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列的多肽；

e. 包含与SEQ ID NO: 3的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列的多肽；

f. 包含与SEQ ID NO: 5的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列的多肽；和

g. 包含与SEQ ID NO: 6的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列的多肽。

95.权利要求92-94中任一项的方法，其中所述ActRIIB多肽在对应于SEQ ID NO:1的L79的位置处不包含酸性氨基酸。

96.权利要求92-95中任一项的方法，其中所述ALK4多肽是融合蛋白，其进一步包含异源结构域，所述异源结构域包含相互作用对的第一或第二成员。

97.权利要求92-96中任一项的方法，其中所述ActRIIB多肽是融合蛋白，其进一步包含异源结构域，所述异源结构域包含相互作用对的第一或第二成员。

98.权利要求96或97的方法，其中所述异源结构域是Fc免疫球蛋白结构域。

99.权利要求92-98中任一项的方法，其中所述ALK4多肽和/或ActRIIB多肽包含一个或多个促进异多聚体形成的氨基酸修饰。

100.权利要求96-99中任一项的方法，其中所述ALK4和/或ActRIIB融合蛋白进一步包含位于所述ALK4和/或ActRIIB结构域和异源结构域之间的接头结构域。

101.权利要求100的方法，其中所述接头结构域选自：TGGG (SEQ ID NO:23)、TGGGG(SEQ ID NO:21)、SGGGG (SEQ ID NO:22)、GGGGS (SEQ ID NO:25)、GGG (SEQ ID NO:19)、GGGG (SEQ ID NO:20)和SGGG (SEQ ID NO:24)。

102.权利要求92-96中任一项的方法，其中所述ALK4融合蛋白包含选自以下的多肽：

a. 包含与SEQ ID NO: 111的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列的多肽；

b.包含与SEQ ID NO: 113的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列的多肽；

c.包含与SEQ ID NO: 116的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列的多肽；

d. 包含与SEQ ID NO: 117的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列的多肽；

e. 包含与SEQ ID NO: 122的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列的多肽；和

f. 包含与SEQ ID NO: 124的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列的多肽。

103.权利要求92-102中任一项的方法，其中所述ActRIIB融合蛋白包含选自以下的多肽：

a.包含与SEQ ID NO: 108的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列的多肽；

b.包含与SEQ ID NO: 110的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列的多肽；

c.包含与SEQ ID NO: 114的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列的多肽；

d. 包含与SEQ ID NO: 115的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列的多肽；

e. 包含与SEQ ID NO: 118的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列的多肽；和

f. 包含与SEQ ID NO: 120的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列的多肽。

104.权利要求92-103中任一项的方法，其中所述ALK4和/或ActRIIB多肽或融合蛋白包含一个或多个选自以下的氨基酸修饰：糖基化氨基酸、加入聚乙二醇的氨基酸、法呢基化氨基酸、乙酰化氨基酸、生物素化氨基酸和与脂质部分缀合的氨基酸。

105.权利要求104的方法，其中所述ALK4和/或ActRIIB多肽或融合蛋白是糖基化的并且具有哺乳动物糖基化模式。

106.权利要求105的方法，其中所述ALK4和/或ActRIIB多肽或融合蛋白具有可获得自中国仓鼠卵巢细胞系的糖基化模式。

107.权利要求92-106中任一项的方法，其中异多聚体结合一种或多种选自以下的配体：激活蛋白A、激活蛋白B、GDF11、GDF8和BMP6。

108.权利要求107的方法，其中所述异多聚体结合激活蛋白A。

109.权利要求92-108中任一项的方法，其中所述异多聚体抑制一种或多种选自以下的TGFβ超家族配体：激活蛋白A、激活蛋白B、GDF11、GDF8和BMP6。

110.权利要求109的方法，其中所述异多聚体抑制激活蛋白A。

111.权利要求92-110中任一项的方法，其中所述异多聚体不结合或基本上不结合一种或多种选自以下的配体：BMP10、BMP9和GDF3。

112.权利要求92-110中任一项的方法，其中所述异多聚体以与相应的ActRIIB同多聚体相比较低的亲和力结合BMP10、BMP9或GDF3中的一种或多种。

113.权利要求92-112中任一项的方法，其中所述异多聚体在药物制剂中。

114.权利要求113的方法，其中所述药物制剂包含小于约10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或小于约1% ALK4同多聚体。

115.权利要求113或114的方法，其中所述药物制剂包含小于约10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或小于约1% ActRIIB同多聚体。

116.权利要求92-115中任一项的方法，其中所述异多聚体是ALK4:ActRIIB异二聚体。

117.权利要求2-91中任一项的方法，其中所述GDF/BMP拮抗剂是ActRIIA多肽。

118.权利要求117的方法，其中所述ActRIIA多肽包含与如下氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列，所述如下氨基酸序列开始于SEQ ID NO: 9的氨基酸21、22、23、24、25、26、27、28、29或30中任一个且结束于SEQ ID NO: 9的氨基酸110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134或135中任一个。

119.权利要求1或118的方法，其中所述多肽选自：

a. 包含与对应于SEQ ID NO: 9的残基30-110的氨基酸的序列具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列的多肽；

b. 包含与氨基酸序列SEQ ID NO: 10具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列的多肽；和

c. 包含与SEQ ID NO: 11的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列的多肽。

120.权利要求119的方法，其中所述多肽是进一步包含免疫球蛋白的Fc结构域的融合蛋白。

121.权利要求120的方法，其中所述免疫球蛋白的Fc结构域是IgG1免疫球蛋白的Fc结构域。

122.权利要求120或121的方法，其中所述Fc融合蛋白进一步包含位于ActRIIA多肽结构域和免疫球蛋白的Fc结构域之间的接头结构域。

123.权利要求122的方法，其中所述接头结构域选自：TGGG (SEQ ID NO:23)、TGGGG(SEQ ID NO:21)、SGGGG (SEQ ID NO:22)、GGGGS (SEQ ID NO:25)、GGG (SEQ ID NO:19)、GGGG (SEQ ID NO:20)和SGGG (SEQ ID NO:24)。

124.权利要求1、118和119中任一项的方法，其中所述多肽包含与SEQ ID NO: 32的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。

125.权利要求1-91和117-124中任一项的方法，其中所述多肽是同二聚体蛋白复合体的一部分。

126.权利要求1-91和117-125中任一项的方法，其中所述多肽是糖基化的。

127.权利要求1-91和117-125中任一项的方法，其中所述多肽具有可通过在中国仓鼠卵巢细胞中表达获得的糖基化模式。

128.权利要求1-127中任一项的方法，其中所述方法降低患者中的肺动脉压。

129.权利要求128的方法，其中所述方法将所述患者中的肺动脉压降低至少10%(例如，10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或至少80%)。

130.权利要求1-129中任一项的方法，其中所述方法降低患者中的心室肥大。

131.权利要求130的方法，其中所述方法将所述患者中的心室肥大降低至少10%(例如，10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或至少80%)。

132.权利要求1-131中任一项的方法，其中所述方法降低患者中的平滑肌肥大。

133.权利要求132的方法，其中所述方法将所述患者中的平滑肌肥大降低至少10%(例如，10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或至少80%)。

134.权利要求1-133中任一项的方法，其中所述方法降低患者中的肺小动脉肌型化。

135.权利要求134的方法，其中所述方法将所述患者中的肺小动脉肌型化降低至少10%(例如，10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或至少80%)。

136.权利要求1-135中任一项的方法，其中所述方法降低所述患者中的肺血管阻力。

137.权利要求136的方法，其中所述方法将所述患者中的肺血管阻力降低至少10%(例如，10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或至少80%)。

138.权利要求1-137中任一项的方法，其中所述患者具有肺动脉高压并且具有根据世界卫生组织的肺高血压功能分类系统的功能II类或III类肺高血压。

139.权利要求1-138中任一项的方法，其中所述患者具有肺动脉高压，所述肺动脉高压被分类为选自以下的一种或多种亚型：特发性或遗传性肺动脉高压、药物和/或毒素诱导的肺高血压、与结缔组织疾病相关的肺高血压和与分流修复后至少1年的先天性全身至肺分流相关的肺高血压。

140.权利要求1-139中任一项的方法，其中所述患者已经用一种或多种血管扩张剂治疗。

141.权利要求1-140中任一项的方法，其中所述患者已经用一种或多种选自以下的药剂治疗：磷酸二酯酶5型抑制剂、可溶性鸟苷酸环化酶刺激剂、前列环素受体激动剂和内皮素受体拮抗剂。

142.权利要求141的方法，其中所述一种或多种药剂选自：波生坦、西地那非、贝拉普罗、马西替坦、赛乐西帕、依前列醇、曲前列环素、伊洛前列素、安立生坦和他达拉非。

143.权利要求1-142中任一项的方法，其中所述方法进一步包括施用一种或多种血管扩张剂。

144.权利要求1-143中任一项的方法，其中所述方法进一步包括施用一种或多种选自以下的药剂：磷酸二酯酶5型抑制剂、可溶性鸟苷酸环化酶刺激剂、前列环素受体激动剂和内皮素受体拮抗剂。

145.权利要求143的方法，其中所述一种或多种药剂选自：波生坦、西地那非、贝拉普罗、马西替坦、赛乐西帕、依前列醇、曲前列环素、伊洛前列素、安立生坦和他达拉非。

146.权利要求1-145中任一项的方法，其中所述患者具有150至400米的6-分钟步行距离。

147.权利要求1-146中任一项的方法，其中所述方法将患者的6-分钟步行距离增加至少10米(例如，至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300或多于400米)。

148.权利要求1-147中任一项的方法，其中所述患者具有>8且<15 g/dl的血红蛋白水平。

149.权利要求1-148中任一项的方法，其中所述方法延迟肺动脉高压的临床恶化。

150.权利要求149的方法，其中所述方法根据世界卫生组织的肺高血压的功能分类系统延迟肺高血压的临床恶化。

151.权利要求1-150中任一项的方法，其中所述方法降低与肺动脉高压相关的一种或多种并发症的住院的风险。

152.权利要求1-91和117-151中任一项的方法，其中所述ActRIIA多肽结合一种或多种选自以下的配体：激活蛋白A、激活蛋白B和GDF11。

153.权利要求152的方法，其中所述ActRIIA多肽进一步结合一种或多种选自以下的配体：BMP10、GDF8和BMP6。