DE69738074T2

DE69738074T2 - Reinigung von neurotrophinen

Info

Publication number: DE69738074T2
Application number: DE69738074T
Authority: DE
Inventors: Louis E. San Mateo BURTON; Charles H. Burlingame SCHMELZER; Joanne T. Westlake Village BECK
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1996-11-15
Filing date: 1997-11-14
Publication date: 2008-05-21
Anticipated expiration: 2017-11-15
Also published as: TR199901734T2; JP2001503779A; IL129851A0; CA2268747A1; CZ300296B6; HUP9903947A2; KR100554332B1; US20040138431A1; EP0942930A2; NO327149B1; EA199900436A1; WO1998021234A3; ID26697A; EP0942930B1; JP4881234B2; JP2007302679A; JP4671372B2; HUP9903947A3; PL191400B1; EA002349B1

Description

Technisches Gebiet
Diese Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Reinigung von Neurotrophinen, insbesondere jener der NGF-Familie, besonders von Nervenwachstumsfaktor (NGF) sowie von Neurotrophin-4/5 (NT-4/5) und Neurotrophin-3 (NT-3), von Varianten, Unreinheiten und Verunreinigungen, die damit assoziiert sind, besonders im Falle einer Produktion durch bakterielle oder Säugetierzellfermentation.
Hintergrund
Die Produktion großer Mengen von vergleichsweise reinen, biologisch aktiven Polypeptiden und Proteinen ist wirtschaftlich gesehen für die Herstellung menschlicher und tierischer pharmazeutischer Formulierungen, Enzyme und anderer spezieller Chemikalien von Bedeutung. Für die Produktion vieler Proteine sind DNA-Rekombinationsverfahren zum Verfahren der Wahl geworden, da große Mengen exogener Proteine in Säugetier-Wirtszellen, Bakterien und anderen Wirtszellen exprimiert werden können.
Die Primärstruktur eines Säugetier-NGF (Maus-NGF) wurde erstmals von Angeletti und Bradshaw, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 68, 2417 (1971), aufgeklärt. Die Primärstruktur seines Vorläufers, Prä-Pro-NGF, wurde von der Nucleotidsequenz der Maus-NGF-cDNA abgeleitet (Scott et al., Nature 302, 538 (1983); Ullrich et al., Nature 303, 821 (1983)).
Das homologe menschliche NGF-Gen (hNGF) wurde ebenfalls identifiziert (Ullrich, Symp. on Quan. Biol. 48, 435, Cold Spring Harbor (1983); US-Patent Nr. 5288.622 , ausgegeben am 22. Februar 1994, hierin durch Verweis aufgenommen). Seine Homologie zum Maus-NGF liegt bei etwa 90 % und 87 % auf Aminosäure- bzw. Nucleotidsequenz-Niveau. Aufgrund der Seltenheit von natürlich vorkommendem, menschlichem NGF wurde es aus natürlichen Quellen nicht in Mengen hergestellt, die für eine biochemische Beschreibung im Detail ausreichen.
Zusätzliche neurotrophe Faktoren, die mit NGF verwandt sind, wurden seitdem identifiziert. Diese umfassen den hirnabstammenden neurotrophen Faktor (BDNF) (Leibrocket al., Nature 341, 149–152 (1989)); Neurotrophin-3 (NT-3) (Kaisho et al., FEBS Lett. 266, 187 (1990); Maisonpierre et al., Science 247, 1446 (1990); Rosenthal et al., Neuron 4, 767 (1990)), sowie Neurotrophin-4/5 (NT-4/5) (Berkmeier et al., Neuron 7, 857–866 (1991)). GDNF, ein entferntes Mitglied der TGF-β-Überfamilie, sowie Neurturin („NTN") sind zwei vor kurzem identifizierte, strukturell verwandte, potentielle Überlebensfaktoren für sympathische sensorische und Zentralnervensystem-Neuronen (Lin et al., Science 260, 1130–1132 (1993); Henderson et al., Science 266, 1062–1064 (1994); Buj-Bello et al., Neuron 15, 821–828 (1995); Kotzbauer et al., Nature 384, 467–470 (1996)).
Die Produktion von rekombinantem Protein umfasst das Transfizieren von Wirtszellen mit DNA, die für das Protein kodiert, sowie das Züchten der Zellen bei Bedingungen, welche die Expression des rekombinanten Proteins fördern. Der Prokaryot E. coli ist und war ein bevorzugter Wirt, da mit ihm rekombinante Proteine in großer Ausbeute und mit geringen Kosten produziert werden können. Es existieren zahlreiche US-Patente bezüglich der allgemeinen bakteriellen Expression von für Proteine kodierender DNA, unter anderem US-Patent Nr. 4.565.785 bezüglich eines rekombinanten DNA-Moleküls, umfassend ein bakterielles Gen für ein extrazelluläres oder periplasmatisches Trägerprotein und nicht-bakterielles Gen; US-Patent Nr. 4.673.641 bezüglich der Co-Produktion eines fremden Polypeptids mit einem aggregatbildenden Polypeptid; US-Patent Nr. 4.738.921 bezüglich eines Expressionsvektors mit einem trp-Promotor/Operator und einer trp-LE-Fusion mit einem Polypeptid, wie z.B. IGF-I; US-Patent Nr. 4.795.706 bezüglich der Expression von Kontrollsequenzen, um ein fremdes Protein einzuschließen; sowie US-Patent Nr. 4.710.473 bezüglich spezifischer ringförmiger DNA-Plasmide, wie z.B. jene, die für IGF-I kodieren.
Gentechnisch veränderte Biopharmazeutika werden typischerweise aus einem Überstand gereinigt, der eine Reihe verschiedener Wirtszellen-Verunreinigungen enthält. Besonders über NGF gibt es Berichte über eine Reinigung in einem variierenden Ausmaß mit variierendem Anstrengungs- und Erfolgsausmaß unter Verwendung ei ner Reihe verschiedener Verfahren. Siehe z.B. Longo et al., IBRO Handbook, Band 12, 3–30 (1989); US-Patent Nr. 5.082.774 , das eine CHO-Zellproduktion von NGF offenbart; Bruce und Heinrich, Neurobio. Aging 10, 89–94 (1989); Schmelzer et al., J. Neurochem. 59, 1675–1683 (1992); Burton et al., J. Neurochem. 59, 1937–1945 (1992).
Kolbeck et al., Eur. J. Biochem. 225, 995–1003 (1994), berichten, dass bei der Reinigung von rekombinantem BDNF und NT-3 mittels Umkehrphasenchromatographie diese Neurotrophine als zwei deutlich ausgeprägte Peaks eluieren. Belew und Ebendal, Exp. Cell. Res. 167 (1986), berichten über eine partielle Reinigung eines NGF-artigen Faktors aus Hühnerembryoextrakt mittels Kationenaustauschchromatographie, gefolgt von einer Hydrophobchromatographie auf Octylsulfid-Agarose. Diese Bemühungen fanden hauptsächlich in Labormaßstab statt.
Eine präparative Isolation von rekombinantem, menschlichem NGF, die zu pharmazeutischer Reinheit und einer hohen Ausbeute führt, die im Wesentlichen frei von Varianten ist, ist nach dem Stand der Technik jedoch nicht erfasst worden.
Dementsprechend gibt es nach dem Stand der Technik eine Notwendigkeit einer wirksamen Arbeitsvorschrift zur selektiven Trennung von Neurotrophinen, insbesondere NGF und die NGF-Familie von Neurotrophinen, von ihren Varianten und anderen Molekülen sowie von anderen Polypeptiden mit einem hohen pI-Wert. Das Verfahren der Reinigung von Neurotrophinen in großem Ausmaß sollte auf ein Ausgangsmaterial variierender Quellen, unter anderem Fermentationsbrühe, lysierte bakterielle oder Säugetier-Zellen, anwendbar sein, um den klinischen Bedürfnissen gerecht zu werden. Weiters sind die hierin vorgestellten Verfahren besonders nützlich zur Bereitstellung von kommerziell nützlichen Mengen rekombinanter Neurotrophine, unter anderem von menschlichem NGF (rhNGF), rhNT-3 und rhNT-4/5, sowie gewünschten, gentechnisch veränderten Mutanten davon, die im Wesentlichen frei von ungewünschten Varianten sind, da die Erfinder der vorliegenden Erfindung zuvor unbekannte, schwierig zu trennende Neurotrophin-Varianten, z.B. NGF- Varianten, entdeckt haben. Diese und andere Ziele der Erfindung sind für den Fachmann nun ersichtlich.
ZUSAMMENFASSUNG
In einer Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Reinigung eines Neurotrophins, besonders eines der NGF-Familie, umfassend NGF, NT-3, NT-4/5 und BDNF, wobei diese die Erkennung durch eine hochgradig homologe Rezeptorfamilie (trks) gemeinsam haben, vorzugsweise rhNGF, rNT-3, rhNT-4/5, rhBDNF, oder gewünschter, gentechnisch veränderter Formen davon, durch die Verwendung einer Hydrophobchromatographie (HIC) bereitgestellt. Angesichts der Entdeckung gewisser unerwünschter Neurotrophin-Varianten, die, wie hierin berichtet, aus der rekombinanten Produktion eines Neurotrophins stammen, durch die Erfinder der vorliegenden Erfindung kann die Verwendung einer HIC chemisch unterschiedliche oder sogar fehlgefaltete Formen eines Neurotrophins vom gewünschten, korrekt gefalteten, intakten Neurotrophin trennen. Varianten, die entfernt werden können, sind jene, die sich vom reifen, korrekt gefalteten Neurotrophin bezüglich der Hydrophobie unterscheiden, unter anderem partiell verarbeitete Vorläufersequenzen, glykosylierte reife und vorläuferenthaltende Formen (falls aus eukaryotischer Zellkultur vorhanden) sowie fehlgefaltete und partiell gefaltete Varianten (allgemein aus bakterieller Zellkultur, wenn In-vitro-Faltungsschritte verwendet werden). Die HIC ist z.B. besonders nützlich, um partiell verarbeitete Vorläufer-Sequenzen von NGF, glykosylierte Spezies von NGF und Vorläufer (falls aus eukaryotischer Zellkultur vorhanden) sowie fehlgefaltete und teilweise gefaltete Varianten (allgemein aus bakterieller Zellkultur und In-vitro-Faltungsschritten) aus Gemischen von reifem NGF zu entfernen. NGF besitzt eine N-gebundene Glykosylierungsstelle bei Asn45. Im Fall von bakterienexprimiertem, umgefaltetem rhNT-4/5 trennt die HIC korrekt gefaltetes NT-4/5 von inkorrekt gefalteten Formen. Als ein Resultat des hierin beschriebenen Verfahrens ist das Neurotrophin im Wesentlichen frei von diesen Varianten. Zur Neurotrophin-Reinigung ist die funktionelle HIC-Harzgruppe vorzugsweise eine Phenylgruppe, während Octyl- und Butyl-Gruppen ebenfalls von Nutzen sein können. Besonders bevorzugte Ausführungsformen umfassen die HIC-Harze Phenyl-Toyopearl, „Phenyl-Sepharose- Fast-Flow-Low-Substitution", TSK-Phenyl-5PW oder dergleichen. Das Verfahren umfasst das Laden des Gemisches auf ein Hydrophobchromatographieharz und das Eluieren des rekombinanten menschlichen Neurotrophins aus dem Harz mit einem Elutionspuffer, der ein organisches Lösungsmittel in einer Konzentration zwischen 5 % bis 25 Vol.-% enthält.
Ein weiteres Verfahren zur Reinigung eines hierin offenbarten Neurotrophins, besonders eines der NGF-Familie, vorzugsweise rhNGF, rNT-3, rhNT-4/5 oder erwünschte, gentechnisch veränderte Formen davon, ist die präparative Kationenaustauschchromatographie, die ladungsveränderte Varianten, wie z.B. oxidierte, Isoasp- und desamidierte Formen des reifen Neurotrophins, trennt. Besonders bevorzugte Ausführungsformen verwenden SP-Sepharose-Hochleistungs-, Fractogel-EMD-SO3- oder Polyasparaginsäure-Harz, von denen PolyCAT-A besonders bevorzugt wird. Insbesondere werden auf breiter Ebene SP-Sepharose-Hochleistungs- oder Fractogel-EMD-SO3-Harze verwendet.
Die Erfindung kann sowohl die HIC als auch die Kationenaustauschchromatographie verwenden, um eine Zusammensetzung eines gewünschten Neurotrophins herzustellen, z.B. rekombinantes, reifes NGF, vorzugsweise menschliches NGF, das im Wesentlichen homogen ist, d.h. im Wesentlichen frei von sowohl Verfahrens- als auch Ladungsvarianten, z.B. fehlgefaltete und chemische Varianten, und ebenso hinsichtlich des Proteingehalts im Wesentlichen rein ist.
Ein weiteres Verfahren zur Trennung von hierin offenbarten Neurotrophinen, besonders jener der NGF-Familie, vorzugsweise rekombinantes menschliches NGF, NT-3, NT-4/5 und ihre erwünschten, gentechnisch veränderten Formen, von verwandten, unerwünschten Varianten, z.B. Fermentations-, proteasegespaltenen Varianten, Glykosylierungs-Varianten und fehlgefalteten Varianten, erfolgt durch eine Umkehrphasenflüssigkeitschromatographie. Noch bevorzugter weist der NGF die 120/120- oder 118/118-Homodimer-Form auf. Als ein Resultat des hierin beschriebenen Verfahrens ist das Neurotrophin insbesondere im Wesentlichen frei von Varianten.
Das Verfahren zur Reinigung von Neurotrophinen, insbesondere jenen der NGF-Familie, von verwandten Varianten kann Elutionsbedingungen umfassen, die einen physiologischen pH involvieren.
Das Verfahren zur Reinigung eines Neurotrophins kann zu einer beträchtlichen Verbesserung seiner Homogenität führen.
Das Verfahren zur Trennung von NGF-Familien-Neurotrophinen von Varianten dieser kann Folgendes umfassen:

a) das Laden eines Puffers, enthaltend das Neurotrophin und seine Variante, bei einem pH von etwa 5 bis 8 auf eine Hydrophobchromatographiesäule;
b) das Waschen der Säule;
c) das Eluieren des Neurotrophins mit einem Puffer bei einem pH von etwa 5 bis 8, enthaltend ein organisches Lösungsmittel in einer Konzentration von zwischen 5 % bis 25 Vol.-%;
d) das Laden des neurotrophinhältigen Eluenten auf eine Kationenaustauschchromatographiesäule bei einem pH von etwa 5 bis 8; und
e) das Eluieren des Neurotrophins aus der Säule mit einem Puffer bei einem Salzgradienten mit einem pH von etwa 5 bis 8, vorzugsweise einem pH von 6. Besonders bevorzugt ist, wenn das Neurotrophin rhNGF ist.

In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Reinigung eines rekombinanten menschlichen Neurotrophins bereit, umfassend:

a) das Laden eines Gemisches, umfassend das rekombinante menschliche Neurotrophin und seine Variante, auf ein Hydrophobchromatographieharz bei einem pH von 5 bis 8;
b) das Waschen des Harzes mit einem Puffer mit einem pH von 5 bis 8;
c) das Eluieren des rekombinanten menschlichen Neurotrophins mit einem Puffer mit einem pH von 5 bis 8, enthaltend ein alkoholisches oder polares aprotisches Lösungsmittel in einer Konzentration von 5 bis 25 Vol.-%;
d) das Laden des Eluenten, der das rekombinante menschliche Neurotrophin enthält, auf ein Hochleistungs-Kationenaustauschchromatographieharz bei einem pH von 5 bis 6; und
e) das Eluieren des rekombinanten menschlichen Neurotrophins aus dem Hochleistungs-Kationenaustauschchromatographieharz mit einem Puffer mit einem pH von 5 bis 6, enthaltend ein Kation in einer Konzentration von 0,2 bis 0,5 M.

Hierin wird ebenfalls ein Silicagel-Chromatographieschritt beschrieben, der wirksam Wirtszellenproteine aus der Neurotrophinfraktion entfernt, die vorzugsweise eine NGF-Fraktion ist.
Hierin wird ebenfalls ein Verfahrensschritt beschrieben, in dem 120-Aminosäuren-NGF einer trypsinartigen Proteasebehandlung unterzogen wird, um das terminale RA-Dipeptid vom VRRA-C-Terminus selektiv zu entfernen, um die 118-Spezies zu ergeben. Es wird eine immobilisierte Trypsin-Säule bevorzugt.
Die vorliegende Anmeldung beschreibt ebenfalls die durch die Verfahren der Erfindung hergestellte Neurotrophin-Zusammensetzung und -Formulierung sowie Verwendungen der Zusammensetzung und Formulierung. Es wird eine Neurotrophin-Zusammensetzung bereitgestellt, die im Wesentlichen homogen ist, d.h. im Wesentlichen frei von sowohl Verfahrens- als auch Ladungsvarianten, z.B. fehlgefalteten und chemischen Varianten, und ebenfalls hinsichtlich des Proteingehalts im Wesentlichen rein ist. In dieser Form werden vorzugsweise reifer menschlicher NGF, reifes menschliches oder Ratten-NT-3 und reifes menschliches NT-4/5 bereitgestellt. In ei ner bevorzugten Ausführungsform ist der NGF die 120-Spezies und noch bevorzugter die 118-Form, insbesondere als ein Homodimer, z.B. 118/118.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 zeigt ein SP-Sepharose-HP-Chromatogramm. Ein NGF-hältiges Gemisch einer 12-kL-Fermentation wurde nach einer HIC-Chromatographie auf ein SP-Sepharose-Hochleistungsharz (Säulendimension 1,0 × 35 cm; ein 27,5-ml-Bettvolumen) eines 25-Omnifit-SPSHP-Harzes geladen. Puffer A bestand aus 0,2 M NaCl, 20 mM Succinat, pH 6,0 (23 ms). Puffer B bestand aus 0,7 M NaCl, 20 mM Succinat, pH 6,0 (63 ms). Die Säule wurde zuerst in Puffer A äquilibriert. Der HIC-Pool von 345 ml bei 0,24 mg/ml wurde auf 25 mM Succinat, pH 6,0 (17 ms) angepasst, von denen 362 ml geladen wurde, was eine Harzbeladung von 3 mg/ml ergab; es wurden 82,5 mg NGF geladen. Die Ladungsgeschwindigkeit lag bei 40 cm pro Stunde. NGF wurde unter Verwendung eines 22-Säulenvolumen-Gradienten von 30 % bis 80 % Puffer B eluiert (0,35 bis 0,60 M NaCl; 37 bis 57 ms). Die Elutionsgeschwindigkeit lag bei 60 cm pro Stunde. Extinktionseinheiten (280 nm) und mS/cm wurden gegen Fraktionsnummern und dem Elutionsvolumen in ml geplottet. Fraktionen, die NGF enthielten, wurden bestimmt und gepoolt. In diesem Fall wurden Fraktionen 43 bis 60 gepoolt, um 99 ml Probe bei 0,38 mg/ml NGF zu erhalten, was etwa eine Ausbeute von 46 % ergibt.
2 zeigt eine SP-NPR-HPLC-Kationenaustausch- (HPIEX-) Analyse des Phenyl-Sepharose-Fast-Flow-Pools und des SP-Sepharose-HP-Pools. Das Chromatogramm für einen jeden ist dabei markiert.
3 zeigt eine C4-RP-HPLC-Analyse ausgewählter Fraktionen (Haupt-Pool, linke Kante und rechte Kante des Haupt-Peak-Pools) aus dem SP-Sepharose-HP-Chromatographieschritt. Die drei Signale sind überlagert und sind wie markiert. Wie zu sehen ist, ist der Haupt-Peak (enthaltend reifen NGF) von mehreren kleineren Peaks getrennt, die NGF-Varianten enthalten.
4 zeigt die Sequenz von menschlichem Prä-Pro-NGF (Seq.-ID Nr. 1). In der Fig. ist die erste Aminosäure des reifen NGF (Position 1) und die letzte Aminosäure der 120-NGF-Form (Position 120) dargestellt. Eine bevorzugte NGF-Aminosäuresequenz ist jene der reifen 118-Form (von Position 1 bis Position 118). Es werden auch Varianten-Formen dargestellt: reife 120- (Position 1 bis 120); reife 117- (Position 1 bis 117); R120- (Position –1 bis 120); sowie Stellen für andere Fehlverarbeitungen, die an den N- und den C-terminalen Enden auftreten, unter anderem reife 114- (Aminosäuren 1 bis 114), 115- (Aminosäuren 1 bis 115) und 117-Varianten (Aminosäuren 1 bis 117). Eine bedeutende fehlverarbeitete Variante, die proteolytisch fehlverarbeitet ist, besitzt eine N-terminale Spaltung zwischen den Aminosäuren R(-39) und S(-38) in der Pro-Sequenz von NGF. Die wahrscheinliche Initiations-Met ist unterstrichen. Andere N-terminale Varianten umfassen trunkierte Formen von NGF, wobei die am häufigsten auftretenden eine Spaltung besitzen, die zwischen den Aminosäuren H8 und R9 und zwischen R9 und G10 auftritt.
5 zeigt die Aminosäuresequenzen der Neurotrophine menschlicher NGF (Seq.-ID Nr. 2), Maus-NGF (Seq.-ID Nr. 3), BDNF (Seq.-ID Nr. 4), NT-3 (Seq.-ID Nr. 5) und NT-4/5 (Seq.-ID Nr. 6). Die eingerahmten Regionen zeigen die homologen cysteinhältigen Regionen, die in das Cystein-Knotenmotiv involviert sind (De Young et al., Protein Sci. 5 (8), 1554–66 (1996)).
6 zeigt das Chromatographiemuster von rhNT-4/5 auf einer DEAE-Sepharose-Fast-Flow- (DEFF-) Harzsäule. Das „NT45DE1:1_UV" benannte Chromatogramm stellt eine UV-Extinktionsmessung bei 280 nm dar. Das „NT45DE1:1_Cond1" benannte Chromatogramm stellt eine Leitfähigkeitsmessung von eluierenden Fraktionen dar. Die neurotrophinhältigen Fraktionen, die gepoolt wurden, sind durch den horizontalen Pfeil mit der Beschriftung „Pool" dargestellt.
7 zeigt ein Chromatographiemuster von rhNT-4/5 auf einer SP-Sepharose-Fast-Flow-Harzsäule. Das „NT45SFF1:1_UV" benannte Chromatogramm stellt eine UV-Extinktionsmessung bei 280 nm dar. Das „NT45SFF1:1_Cond1" benannte Chromatogramm stellt eine Leitfähigkeitsmessung von eluierenden Fraktionen dar. Die neu rotrophinhältigen Fraktionen, die gepoolt wurden, sind durch den horizontalen Pfeil mit der Beschriftung „Pool" dargestellt.
8 zeigt ein typisches präparatives C4-RP-HPLC-Chromatographiemuster von rhNT-4/5 unter den im Text beschriebenen Bedingungen. Die Extinktion bei 280 nm wurde beobachtet. Die neurotrophinhältigen Fraktionen, die gepoolt wurden, sind durch einen horizontalen Pfeil mit der Beschriftung „Pool" dargestellt.
9 stellt das analytische HPLC-Chromatographiemuster von NT4/5-Proben dar, die während der Umfaltung zu den angegebenen Zeiten beobachtet wurden. Die Säulenbedingungen sind im Text beschrieben. „NT-4/5-Std." gibt das Elutionsmuster eines korrekt gefalteten, intakten NT-4/5 an, das als Standard verwendet wird. Das mit „SSFF (0,5 m)" markierte Muster zeigt die Analyse von NT4/5, das mit 0,5 M NaCl aus der S-Sepharose-Fast-Flow-Säule vor der Umfaltung eluiert wird. Während der Umfaltung von NT-4/5 nähert sich das Elutionsmuster jenem des Standards an.
10 zeigt ein Chromatogramm, das die Trennung von intaktem, korrekt gefaltetem NT-4/5 von fehlgefalteten Varianten auf einer Hydrophobchromatographiesäule, einer Phenyl-Toyopearl-650-M-Säule, darstellt. Fehlgefaltete Varianten, die weniger hydrophob sind als korrekt gefaltetes NT-4/5, eluieren im Durchfluss, während fehlgefaltete Varianten (Peak B), die stärker hydrophob sind, bei einer Konzentration eines organischen Lösungsmittels eluieren, die höher ist als jene, die benötigt wird, um korrekt gefaltetes NT-4/5 zu eluieren (Peak A).
11 zeigt das Elutionsmuster von NT-4/5 und Varianten aus einem Kationenaustauschharz, SP-Sepharose. Die Extinktion bei 280 nm wurde beobachtet. Peak A enthält carbamylierte und beschnittene Varianten, während Peak B intaktes, korrekt gefaltetes NT-4/5 enthält. NT-4/5-hältige Fraktionen, die gepoolt wurden, sind durch den horizontalen Pfeil mit der Beschriftung „Pool" dargestellt.
12 zeigt ein typisches präparatives Poly-CAT-A-Harz-Chromatographiemuster von rhNT-4/5 unter den im Text beschriebenen Bedingungen.
13 zeigt eine 16-%-SDS-PAGE-Analyse (Tris-Glycin-System, vorgegossen, von Novex Inc., San Diego, CA) unter reduzierenden Bedingungen, um die Reinheit und die Homogenität von Proben zu untersuchen, die aus den angegebenen Schritten des im Text beschriebenen rhNT-4/5-Reinigungsverfahrens entnommen wurden. Das Gel wurde mit Coomassie-R250 gefärbt, um das Protein zu detektieren (Andrews, Electrophoresis, Oxford University Press, New York (1986)). Die Bahn mit der Beschriftung „DE-Beladung" enthält eine Probe des PEI-Gemisches, das auf die DE-Sepharose-Fast-Flow-Säule geladen wurde; die Bahn mit der Beschriftung „DE-FT" enthält eine Probe des Durchflusses der DE-Sepharose-Fast-Flow-Säule; die Bahn „S-Pool" enthält eine Probe der gepoolten Fraktionen, die NT-4/5 enthalten, das vor der Umfaltung aus der S-Sepharose-Fast-Flow-Harz-Säule eluiert wurde; die Bahn „Umfaltungs-Pool" enthält eine Probe des Pools nach beendeter Umfaltung; die Bahn „CD4-Pool" enthält eine Probe der gepoolten Fraktionen nach präparativer C4-RP-HPLC; und die Bahn „Poly-CAT-A-Pool" enthält eine Probe der gepoolten NT-4/5-Fraktionen aus der Poly-CAT-A-HPLC-Säule.
14 zeigt das UV-Extinktionsmuster von Fraktionen der S-Sepharose-Fast-Flow-Chromatographie eines Gemisches, das bakteriell produziertes, sulfonyliertes rhNT-3 enthält.
15 zeigt eine Macroprep-High-S-Kationenaustauschchromatographie eines Gemisches, das in vitro umgefaltete Formen von rhNT-3 enthält. Das Harz wurde von Biorad zugekauft. Die Säulendimensionen waren 9 × 9 cm. Ein 700-ml-SSFF-Pool, der umgefaltete Formen enthielt (nach einer Umfaltung von 36 Stunden), pH 6,8, wurde bei einem Fluss von etwa 310 ml/min auf die Macroprep-Säule geladen. Die Bedingungen sind im Text angeführt.
16 zeigt eine Phenyl-Sepharose-Fast-Flow-High-Substitution-Chromatographie (Hydrophobchromatographie) von kationenaustauschgereinigtem, umgefaltetem rhNT-3 zur Entfernung fehlgefalteter Varianten.
17 zeigt eine SP-Sepharose-Hochleistungschromatographie des HIC-rhNT-3-Pools.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Definitionen
Wie hierin verwendet, bezieht sich „Neurotrophin" auf ein Neurotrophin, vorzugsweise ein Neurotrophin der NGF-Familie, unter anderem NGF, NT-3, NT-4/5 und BDNF, einer beliebigen Spezies, unter anderem murinen Ursprungs, bovinen Ursprungs, von Schafen, Schweinen, Pferden und Vögeln abstammend und vorzugsweise menschlich, und zwar in nativer Sequenz oder in einer gentechnisch veränderten Form sowie aus einer beliebigen Quelle, egal ob natürlich, synthetisch oder rekombinant hergestellt. „NGF" bezieht sich z.B. auf den Nervenwachstumsfaktor einer beliebigen Spezies, unter anderem murinen Ursprungs, bovinen Ursprungs, von Schafen, Schweinen, Pferden und Vögeln abstammend und vorzugsweise menschlich, in nativer Sequenz oder in einer gentechnisch veränderten Variantenform sowie aus einer beliebigen Quelle, egal ob natürlich, synthetisch oder rekombinant hergestellt. Das Neurotrophin wird vorzugsweise rekombinant hergestellt. In einem bevorzugten Verfahren wird das Neurotrophin kloniert und seine DNA exprimiert, z.B. in Säugetierzellen, in bakteriellen Zellen. Die Vorgänge und Verfahren, die hierin gelehrt werden, können auch auf die Neurotrophine GDNF und Neurturin angewandt werden.
Für die menschliche Anwendung wird ein menschlicher, reifer Nativsequenz-NGF bevorzugt, noch bevorzugter eine 120-Aminosäure-Sequenz und sogar noch bevorzugter eine 118-Aminosäure-Sequenz. Noch bevorzugter wird dieser Nativsequenz-NGF rekombinant hergestellt. Die bevorzugte Aminosäuresequenz für menschlichen Prä-Pro-NGF und menschlichen reifen NGF werden durch das US-Patent Nr. 5.288.622 bereitgestellt, das hierin spezifisch durch Verweis aufgenommen wurde. Die 120-Aminosäure-Form ist, ohne zusätzliche posttranslationale Modifikationen, eine bevorzugte Form in der Homodimer-Form (d.h. 120/120). Noch stärker bevor zugt wird die 118-Form ohne zusätzliche posttranslationale Modifikationen, besonders als ein Homodimer (d.h. 118/118).
Mit „im Wesentlichen rein" ist ein Ausmaß an Reinheit an Gesamtneurotrophin, z.B. NGF, gegenüber Gesamtprotein gemeint, bei dem es zumindest 70 % Neurotrophin, noch bevorzugter zumindest 80 % und noch bevorzugter eine Erhöhung auf zumindest 90 %, 95 % oder 99 %, gibt. Eine besonders bevorzugte Reinheit liegt bei zumindest 95 %. Mit „im Wesentlichen rein" ist gemeint, dass die Zusammensetzung eine Reinheit von zumindest 90 % oder mehr bezüglich des gewünschten Neurotrophins besitzt.
Mit „im Wesentlichen frei von Neurotrophin-Varianten" ist eine Zusammensetzung gemeint, bei der der Prozentsatz der gewünschten Neurotrophin-Spezies gegenüber Gesamt-Neurotrophin (umfassend weniger erwünschte Neurotrophin-Spezies) bei zumindest 70 % an gewünschten Neurotrophin-Spezies, noch bevorzugter bei zumindest 80 % liegt und noch weiter bevorzugt auf zumindest 90 %, 93 %, 95 % oder 99 % ansteigt. Mit „im Wesentlichen frei" ist gemeint, dass die Zusammensetzung zumindest 90 % oder mehr an gewünschtem Neurotrophin enthält. Eine besonders bevorzugte Menge liegt bei zumindest 95 % gewünschtem Neurotrophin, z.B. korrekt gefalteten, intakten 118/118-rhNGF-Spezies. Die anderen unerwünschten Spezies oder Formen können fehlverarbeitete Formen oder chemische Varianten sein, z.B. Varianten mit veränderter Ladung, die aus dem Fermentations- oder Reinigungsvorgang resultieren, oder vorzugsweise alle der vorangehenden, wie hierin offenbart. Wird NGF z.B. in vitro nach der Synthese in Bakterien gefaltet, so können „Spezies" oder „Varianten" fehlgefaltete oder partiell gefaltete Formen umfassen.
Mit einer „fehlgefalteten" Variante ist eine Variante des Neurotrophins gemeint, die sich vom Neurotrophin durch die Paarung ihrer Cysteinreste oder durch die spezifischen Cysteinreste, die frei oder blockiert sind, unterscheidet. Fehlgefaltete Varianten können auch dieselbe Cysteinpaarung wie das Neurotrophin aufweisen, jedoch eine unterschiedliche dreidimensionale Konformation besitzen, die aus der Fehlfaltung resultiert.
Mit einer „chemischen" Variante ist eine Variante gemeint, die sich chemisch vom Neurotrophin unterscheidet, z.B. durch eine veränderte Ladung, durch Carbamylierung, Desamidierung, Oxidation, Glykosylierung oder proteolytische Spaltung.
Puffer für den Säulenaspekt dieser Erfindung besitzen allgemein einen pH im Bereich von etwa 5 bis 8. Puffer, die den pH innerhalb dieses Bereichs steuern, umfassen z.B. Citrat-, Succinat-, Phosphat-, MES-, ADA-, BIS-TRIS-Propan-, PIPES-, ACES-, Imidazol-, Diethylmalonsäure-, MOPS-, MOPSO-, TES-, TRIS-Puffer, wie z.B. TRIS-HCl-, HEPES-, HEPPS-, TRICINE, Glycinamid-, BICINE-, Glycylglycin- und Boratpuffer. Ein bevorzugter Puffer ist ein MOPSO-Puffer.
Wie hierin verwendet, werden die Begriffe „Alkohole" und „alkoholische Lösungsmittel" im Sinne der normalerweise für Alkohol verwendeten Terminologie, vorzugsweise Alkohole mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, noch bevorzugter Methanol, Ethanol, Isopropanol, n-Propanol oder t-Butanol, sowie Glycerin, Propylenglykol, Ethylenglykol, Hexylenglykol, Polypropylenglykol und Polyethylenglykol, sowie insbesondere Ethanol oder Isopropanol, verwendet. Solche Alkohole sind Lösungsmittel, die bei Addition zu wässriger Lösung die Hydrophobie der Lösung erhöhen, indem sie die Lösungspolarität verringern.
MOPSO ist 3-(N-Morpholino-)-2-hydroxypropansulfonsäure. HEPES ist N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure. Reagensalkohol beträgt 95 Volumenteile (Speziell denaturierte Alkoholformel 3A und 5 Volumenteile Isopropylalkohol). MES ist 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure. UF/DF bedeutet Ultrafiltration/Diafiltration. TMAC ist Tetramethylammoniumchlorid. TEAC ist Tetraethylammoniumchlorid. NGF-120 beschreibt die volle Länge des 120/120-Nervenwachstumsfaktors. NGF-118 bedeutet ein homodimeres reifes NGF-Molekül mit 118 Resten. Oxidierter NGF bedeutet eine NGF-Molekülvariante, Metsulfoxid₃₇, von der hierin berichtet wird, dass sie etwa 80 % der biologischen Aktivität von reifem, nativem NGF besitzt. Isoasp-NGF bedeutet eine isomerisierte NGF-Molekülvariante, Asp93. Desamidierter NGF bedeutet NGF, bei dem Asn45 in Asp45 umgewandelt ist. RNGF bedeutet ein NGF-Molekül mit einem zusätzlichen Argininrest an seinem N-Terminus. CHO bedeutet Chinahamster-Eierstockzellen.
Hierin beschriebene Harze umfassen MACROPREP-HIGH-S-Kationenaustausch(BIO-RAD Laborstories; starker Kationenaustausch; funktionale SO₃-Gruppe; nominale Teilchengröße von 50 m; nominale Porengröße von 1000 A); Silicagel (underivatisiert); Phenyl-Sepharose-Fast-Flow-Low-Substitution- (Pharmacia; hochgradig vernetzte 6 % Agarose; Teilchengröße von 45–165 μm); SP-Sepharose-HP- (Pharmacia; hochgradig vernetzte 6 % Agarose; Teilchengröße von 34 μm); Phenyl-Toyopearl-650-M- (TosoHaas; Teilchengröße von 40–90 μm); sowie Fractogel-EMD-SO₃-650-S-Harz (EM Separations, eine US-Schwestergesellschaft von E. Merck (Deutschland); Teilchengröße von 25–40 m).
Modi zur Durchführung der Erfindung
Neurotrophine gehören einer Familie kleiner, basischer Proteine an, die eine entscheidende Rolle in der Entwicklung und dem Erhalt des Nervensystems spielen. Das als erstes identifizierte und wahrscheinlich am besten erforschte Mitglied dieser Familie ist der Nervenwachstumsfaktor (NGF). Siehe US-Patent Nr. 5.169.762 , ausgegeben am 8. Dezember 1992. Vor kurzem wurden der Sequenz nach verwandte, jedoch unterschiedliche Polypeptide mit ähnlichen Funktionen wie NGF identifiziert. Es wurde z.B. der hirnabstammende neurotrophe Faktor (BDNF), auch als Neurotrophin-2 (NT2) bekannt, von Leibrock et al., Nature 341, 49–152 (1989), kloniert und sequenziert. Mehrere Gruppen identifizierten einen neurotrophen Faktor, der ursprünglich Neuronenfaktor (NF) genannt wurde und nun als Neurotrophin-3 (NT3) bezeichnet wird (Ernfors et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 5454–5458 (1990); Höhn et al., Nature 344, 339 (1990); Maisonpierre et al., Science 247, 1446 (1990); Rosenthal et al., Neuron 4, 767 (1990); Jones und Reichardt, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8060–8064 (1990); Kaisho et al., FEBS Lett. 266, 187 (1990)). Neurotrophin-4/5 (als entweder NT4 oder NT5 bezeichnet) wurde identifiziert (Hallbook et al., Neuron 6, 845–858 (1991); Berkmeier et al., Neuron 7, 857–866 (1991); Ip et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 89, 3060–3064 (1992)). Das am 15. November 1994 ausgegebene US-Patent Nr. 5.364.769 offenbart menschliches NT-4/5 sowie Verfahren für dessen rekombinante Expression und ist hierin durch Verweis aufgenommen. Es wird auch von chimären und pantropischen Neurotrophinen berichtet, wie z.B. von dem im US-Patent Nr. 5.488.099 , ausgegeben am 30. Jänner 1996, in Urfer et al., EMBO J. 13 (24), 5896–909 (1994), und in WO 95/33829 , veröffentlicht am 14. Dezember 1995 (hierin mittels Verweis aufgenommen), beschriebenen, in denen das Neurotrophin modifiziert wurde, um mehr als einen Rezeptor zu binden, oder in denen es eine Rezeptorbindungsaktivität enthält, die normalerweise im nativen Neurotrophin nicht in einem signifikanten Ausmaß vorhanden ist. Von besonderem Interesse sind Neurotrophine, die MNTS-1 und D15A-NT3 genannt werden. Ebenfalls von besonderem Interesse sind Neurotrophine mit einer NGF-Aminosäuren-Hauptkette, die jedoch modifiziert wurden, um andere Rezeptoren als trkA, wie z.B. trkB oder trkC, zu binden. Es werden jene bevorzugt, bei denen Aminosäuresubstitutionen in NGF mit einer Aminosäure aus einer korrespondierenden Position in NT-3 vorgenommen wurden, die für die Bindung des trk-Rezeptors für NT-3 verantwortlich ist. Solche NGF-Mutanten besitzen eine NT-3-artige Rezeptorbindungsaktivität, während sie das NGF-Pharmakokinetik- und Reinigungsverhalten beibehalten (Urfer et al., Biochemistry 36 (16), 4775–4781 (1997)). Diesen NGF-Mutanten kann auch die trkA-Bindungsaktivität fehlen (Shih et al., J. Biol. Chem. 269 (44), 27679–86 (1994)). Solche NGF-Mutanten sind für die Verwendung in der hierin beschriebenen Erfindung besonders bevorzugte Neurotrophine.
Die Isolation eines rekombinanten menschlichen Neurotrophins, z.B. rhNGF, umfasst die Trennung des Proteins von einer Reihe verschiedener Wirtszellen-Verunreinigungen. Jeder Schritt umfasst spezielle Puffer, die eine ausreichende Trennung ermöglichen. Der letzte oder vorletzte Verarbeitungsschritt für ein Neurotrophin wird durch die Gegenwart mehrerer Neurotrophin-Varianten verkompliziert, die unter Verwendung herkömmlicher chromatographischer Medien eine Co-Reinigung durchführen. Wird ein Umfaltungsschritt in den Gewinnungs- und Reinigungsprozess inkludiert, so umfassen die Varianten fehlgefaltete Formen des Neurotrophins. Varianten können auch jene inkludieren, die sich chemisch vom Neurotrophin unterscheiden, wie z.B. carbamylierte, desamidierte oder proteolytisch gespaltene Formen. Im Fall von NGF bestehen diese Spezies hauptsächlich aus dimeren Formen – Homodimeren, z.B. 120/120 oder 117/117, wenn 118/118 gewünscht wird, oder Heterodimeren, z.B. 120/118, 117/118 –, chemisch modifizierten Varianten – Isoaspartat-, monooxidierte, Glykosylierungsvarianten, N-terminal und C-terminal trunkierten Formen, sowie Dimeren davon.
Die Erfindung ermöglicht die großflächig angelegte Produktion von Neurotrophinen, insbesondere von rhNGF, in Mengen, die für therapeutische Verwendungszwecke, wie z.B. die Behandlung der Alzheimer-Krankheit, von peripheren Neuropathien, unter anderem diabetischen und AIDS-bezogenen Neuropathien und dergleichen, ausreichen.
Angesichts der Ähnlichkeit der Sequenz und der Konformation zwischen NGF und anderen Neurotrophinen, vorzugsweise jenen der NGF-Familie, können die Verfahren der vorliegenden Erfindung angewandt werden, um diese Neurotrophine im Wesentlichen frei von fehlverarbeiteten, fehlgefalteten oder partiell gefalteten Glykosylierungs- und/oder Ladungsvarianten herzustellen. In der vorliegenden Erfindung werden Säulenharze und -bedingungen identifiziert, die sich auf die selektive Trennung von Neurotrophinen von diesen und anderen eng verwandten Varianten positiv auswirken. Neurotrophine umfassen NT-3, NT-4/5, NT-6, BDNF sowie gentechnisch veränderte Formen, unter anderem heterodimere, chimäre oder pantropische Formen davon. Die Neurotrophine sind vorzugsweise menschlich oder zu der menschlichen Aminosäuresequenz hochgradig homolog, vorzugsweise sind sie zu mehr als 80 %, noch bevorzugter mehr als 90 % und insbesondere mehr als 95 %, homolog zu den menschlichen Sequenzen. Ein gentechnisch verändertes Neurotrophin behält zumindest 50 % der trk-Rezeptorbindungsfunktion des nativen Neurotrophins bei, das es imitiert, vorzugsweise zumindest 75 % und insbesondere zumindest 80 %. Diese gentechnisch veränderten Formen sind jene, die einen ausreichend hohen pI-Wert oder hydrophoben Charakter des nativen Neurotrophins beibehalten, um in den hierin beschriebenen Verfahren eine ähnliche Leistung beizubehalten.
Wie unten stehend beschrieben, wurden die hierin beschriebenen Verfahren erfolgreich auf rhNGF, rhNT-3 und rhNT-4/5 angewandt. rhNT-4/5, das in E. coli hergestellt wurde, wurde z.B. in Einschlusskörpern isoliert und aus den Einschlusskörpern reduziert und löslich gemacht. Das reduzierte NT-4/5 wurde mittels DE-Sepharose-Fast-Flow- und S-Sepharose-Flast-Flow-Chromatographie partiell gereinigt. Der S-Sepharose-Flast-Flow-Pool wurde in einem Guanidin enthaltenden Puffer 24 Stunden lang umgefaltet. Fehlgefaltete Formen von NT-4/5 wurden, wie hierin offenbart, in großem Ausmaß mittels Chromatographie entfernt. Die carbamylierten und beschnittenen (fehlverarbeiteten) Formen von NT-4/5 wurden mittels Hochleistungs-Kationenaustauschchromatographie durch ein PolyCat-A-HPLC-Harz oder ein SP-Sepharose-HP-Harz in großem Ausmaß in Säulenformat entfernt. Das gereinigte rhNT-4/5 wurde zur Formulierung in einen sauren Puffer ultrafiltriert und diafiltriert.
Eine Ausführungsform der Erfindung umfasst die Reinigung eines Neurotrophins von seinen verwandten Varianten, normalerweise, nachdem das Neurotrophin bereits von den meisten anderen Unreinheiten gereinigt wurde, typischerweise im finalen oder kurz vor dem finalen Schritt vor der Entsalzung oder Diafiltration vor der Formulierung. Die verwandten Varianten im Gemisch können nicht nur Varianten umfassen, die von einer Fermentation übergeblieben sind, sondern auch Varianten, die produziert werden, wenn das Neurotrophin bei der Lagerung oder während der Verarbeitung abgebaut wird.
Die zur Verwendung in den Ausführungsformen der Erfindung geeigneten Neurotrophine können durch beliebige Verfahren hergestellt werden, werden jedoch vorzugsweise rekombinant hergestellt. Ein Nucleinsäuremolekül, das für die hierin beschriebenen Neurotrophine kodiert, ist aus mehreren Quellen erhältlich, z.B. durch chemische Synthese unter Verwendung der bekannten DNA-Sequenz oder unter Verwendung von Standard-Klonierungsverfahren, die dem Fachmann bekannt sind. cDNA-Klone, die das Neurotrophin in sich tragen, z.B. die für hNGF kodierende Sequenz, können durch die Verwendung von Oligonucleotid-Hybridisierungssonden identifiziert werden, die basierend auf der bekannten Sequenz des Neurotrophins spezifisch kreiert wurden.
Nach dem Erhalt eines Moleküls mit der kodierenden Neurotrophin-Sequenz wird das Molekül in einen Klonierungsvektor insertiert, der für die Expression in der ausgewählten Wirtszelle geeignet ist. Der Klonierungsvektor ist so konstruiert, dass die geeigneten Regulationsfunktionen, die für die wirksame Transkription, Translation und Verarbeitung der kodierenden Sequenz erforderlich sind, bereitgestellt werden.
Falls das Neurotrophin rekombinant hergestellt wird, sind geeignete Wirtszellen zur Expression der DNA, die für das Neurotrophin kodiert, Prokaryotenzellen, Hefezellen oder Zellen höherer Eukaryoten. Zu diesem Zweck geeignete Prokaryoten umfassen Bakterien, wie z.B. Archaebakterien und Eubakterien. Bevorzugte Bakterien umfassen Eubakterien, z.B. gramnegative oder grampositive Organismen, z.B. Enterobacteriaceae, wie z.B. Escherichia, z.B. E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, z.B. Salmonella typhimurium, Serratia, z.B. Serratia marcescans, sowie Shigella; Bacilli, wie z.B. B. subtilis und B. licheniformis (z.B. B. licheniformis 41P, offenbart in DD 266.710 , veröffentlicht am 12. April 1989)); Pseudomonas, wie z.B. P. aeruginosa; Streptomyces; Azotobacter; Rhizobia; Vitreoscilla; sowie Paracoccus. Geeignete E.-coli-Wirte umfassen E. coli W3110 (ATCC 27.325), E. coli 94 (ATCC 31.446), E. coli B und E. coli X1776 (ATCC 31.537). Diese Beispiele dienen der Veranschaulichung und nicht als Einschränkung.
Die PCT-Veröffentlichung WO 95/30686 , veröffentlicht am 16. November 1995, ist hierin in ihrer Gesamtheit aufgenommen. Die Anmeldung ist besonders aufgrund ihrer Beschreibung der bakteriellen Synthese und In-vitro-Faltung von NGF von Bedeutung. Die Produkte aus diesem Verfahren können den Reinigungsverfahren der vorliegenden Erfindung unterzogen werden.
Es können auch Mutantenzellen eines beliebigen der oben genannten Bakterien verwendet werden. Es ist natürlich notwendig, die geeigneten Bakterien unter Miteinbeziehung der Replizierbarkeit des Replikons in den Zellen eines Bakteriums zu selektieren. Es können z.B. E.-coli-, Serratia- oder Salmonella-Spezies geeigneterweise als Wirt verwendet werden, wenn wohlbekannte Plasmide, wie z.B. pBR322, pBR325, pACYA177 oder pKN410, zur Bereitstellung des Replikons verwendet wer den. Der E.-coli-Stamm W3110 ist ein bevorzugter Wirt oder Stammwirt, da er ein häufig anzutreffender Wirtstamm für Produktfermentationen rekombinanter DNA ist. Die Wirtszelle sekretiert vorzugsweise minimale Mengen proteolytischer Enzyme. Stamm W3110 kann z.B. modifiziert werden, um eine genetische Mutation in den Genen durchzuführen, die für Proteine kodieren, die dem Wirt gegenüber endogen sind, wobei Beispiele solcher Wirte den E.-coli-W3110-Stamm 1A2 umfassen, der den vollständigen Genotyp tonAΔ besitzt; den E.-coli-W3110-Stamm 9E4, der den vollständigen Genotyp tonAΔ ptr3 besitzt; den E.-coli-W3110-Stamm 27C7 (ATCC 55.244), der den vollständigen Genotyp tonA ptr3 phoA Δ E15 Δ (argF-lac) 169 Δ degP Δ ompT kan<r> besitzt; den E.-coli-W3110-Stamm 37D6, der den vollständigen Genotyp tonA ptr3 phoA Δ E15 Δ (argF-lac) 169 Δ degP Δ ompT Δ rbs7 ilvG kan-r besitzt; den E.-coli-W3110-Stamm 4084, wobei es sich um Stamm 37D6 mit einer nicht kanamycinresistenten degP-Deletionsmutation handelt; sowie einen E.-coli-Stamm mit einer periplasmatischen Mutantenprotease, die im US-Patent Nr. 4.946.783 , ausgegeben am 7. August 1990, offenbart wird.
Menschlicher NGF wurde in E. coli exprimiert. Die Isolation und Sequenz des Gens, das für die β-Untereinheit von hNGF kodiert, sowie seine Expression als ein heterologes Protein in E. coli wurde im US-Patent Nr. 5.288.622 beschrieben. Die hierin enthaltenen Lehren sind auch geeignet, um von Säugetierzellen produzierten, reifen, menschlichen NGF bereitzustellen. Unter Verwendung von Rekombinationsverfahren wurde menschlicher β-NGF frei von anderen Säugetierproteinen exprimiert. Die Expression des hNGF in E. coli unter Verwendung von zwei Genen, die veränderte Amins-Termini enthielten, führte zu der Expression eines fusionierten Proteins, das von Iwai et al., Chem. Pharm. Bull. 34, 4724 (1986), beschrieben wurde.
Zusätzlich zu Prokaryoten sind eukaryotische Mikroben, wie z.B. Fadenpilze oder Hefe, geeignete Expressionswirte für Vektoren, die für Neurotrophin kodieren. Saccharomyces cerevisiae oder gemeine Bäckerhefe ist der am häufigsten verwendete Wirtsmikroorganismus unter den niederen Eukaryoten. Es ist jedoch eine Reihe anderer Genera, Spezies und Stämme leicht erhältlich und hierin von Nutzen, wie z.B.
Schizosaccharomyes pombe [Beach und Nurse, Nature 290, 140 (1981); EP 139.383 , veröffentlicht am 2. Mai 1985]; Kluyveromyces-Wirte [ US-Patent Nr. 4.943.529 ; Fleer et al., Bio/Technology 9, 968-975 (1991)], wie z.B. K. lactis [MW988C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol. 737 (1983)]; K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum [ATCC 36.906; Van den Berg et al., Bio/Technology 8, 135 (1990)], K. thermotolerans sowie K. marxianus; Yarrowia [ EP 402.226 ]; Pichia pastoris [ EP 183.070 ; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol. 28, 265-278 (1988)]; Candida; Trichoderma reesia [ EP 244.234 ]; Neurospora crassa [Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 5259–5263 (1979)]; Schwanniomyces, wie z.B. Schwanniomyces occidentalis [ EP 394.538 , veröffentlicht am 31. Oktober 1990]; sowie Fadenpilze, wie z.B. Neurospora, Penicillium, Tolypocladium [ WO 91/00357 , veröffentlicht am 10. Jänner 1991], sowie Aspergillus-Wirte, wie z.B. A. nidulans [Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 284–289 (1983); Tilburn et al., Gene 26, 205–221 (1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1470–1474 (1984)] sowie A. niger [Kelly und Hynes, EMBO J. 4, 475–479 (1985)].
Geeignete Wirtszellen, die für die Expression der DNA, die für das Neurotrophin kodiert, passend sind, können auch von multizellulären Organismen abstammen. Solche Wirtszellen sind zu komplexen Verarbeitungs- und Glykosylierungsaktivitäten in der Lage. Im Prinzip ist jede höhere eukaryotische Zellkultur geeignet, egal ob von einer Wirbeltier-Kultur oder einer Wirbellosen-Kultur. Beispiele von Wirbellosen-Zellen umfassen Pflanzen- und Insekten-Zellen. Es wurden zahlreiche Baculovirus-Stämme und -Varianten sowie korrespondierende permissive Insektenwirtszellen von Wirten, wie z.B. Spodoptera frugiperda (Raupe), Aedes aegypti (Stechmücke), Aedes albopictus (Stechmücke), Drosophila melanogaster (Fruchtfliege) und Bombyx mori, identifiziert. Siehe z.B. Luckow et al., Bio/Technology 6, 47–55 (1988); Miller et al., in: Genetic Engineering, Band 8, 277–279, J.K. Setlow et al. (Hrsg.), Plenum Publishing (1986); sowie Maeda et al., Nature 315, 592–594 (1985). Es ist eine Reihe viraler Stämme zur Transfektion öffentlich erhältlich, z.B. die L-1-Variante von Autographa-californica-NPV und der Bm-5-Stamm von Bombyx-mori-NPV, und solche Viren können hierin verwendet werden, besonders für Transfektion von Spodoptera frugiperda-Zellen. Menschlicher NGF wurde in Insektenzellen produziert, wie im US-Patent Nr. 5.272.063 , ausgegeben am 21. Dezember 1993, berichtet wurde.
Es können Pflanzenzellenkulturen von Baumwolle, Kukuruz (Mais), Erdäpfeln (Kartoffeln), Sojabohnen, Petunien, Paradeisern (Tomaten) und Tabak als Wirte verwendet werden. Typischerweise werden Pflanzenzellen mittels Inkubation mit gewissen Stämmen des Bakteriums Agrobacterium tumefaciens transfiziert, die zuvor manipuliert wurden, um die DNA zu enthalten, die für das Neurotrophin kodiert. Während der Inkubation der Pflanzenzellenkultur mit A. tumefaciens wird die DNA, die für das Neurotrophin kodiert, zum Pflanzenzellenwirt transferiert, sodass er transfiziert ist und unter geeigneten Bedingungen die DNA, die für das Neurotrophin kodiert, exprimiert. Zusätzlich dazu sind Regulations- und Signalsequenzen, die mit Pflanzenzellen kompatibel sind, erhältlich, wie z.B. der Nopalin-Synthase-Promotor und Polyadenylierungssignalsequenzen (Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen. 1, 561 (1982)). Zusätzlich dazu sind DNA-Segmente, die aus der stromauf gelegenen Region des T-DNA-780-Gens isoliert werden, in der Lage, Transkriptionsmengen von pflanzenexprimierbaren Genen in Pflanzengewebe, das rekombinante DNA enthält, zu aktivieren oder zu erhöhen ( EP 321.196 , veröffentlicht am 21. Juni 1989).
Beispiele nützlicher Säugetier-Wirtszelllinien umfassen die Affen-Nieren-CV1-Linie, durch SV40 transformiert (COS-7, ATCC CRL 1651); die menschliche Embryo-Nierenlinie [293 oder 293-Zellen, die zum Züchten in Suspensionskultur subkloniert werden, Graham et al., J. Gen. Virol. 36, 59 (1977)]; Babyhamster-Nierenzellen (BHK, ATCC CCL 10); Chinahamster-Eierstockzellen/-DHFR [CHO, Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980)]; Maus-Sertoli-Zellen [TM4, Mather., Biol. Reprod. 23, 243–251 (1980)]; Affen-Nierenzellen (CV1, ATCC CCL 70); Nierenzellen der Afrikanischen Grünen Meerkatze (VERO-76, ATCC CRL 1587); menschliche Zervixkarzinomzellen (HELA, ATCC CCL 2); Hunde-Nierenzellen (MDCK, ATCC CCL 34); Büffelratten-Leberzellen (BRL 3A, ATCC CRL 1442); menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); menschliche Leberzellen (Hep G2, HB 8065); Maus-Mammatumor (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI-Zellen [Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383, 46–68 (1982)]; MRC-5-Zellen; FS4-Zellen, sowie eine menschliche Hepatom-Linie (Hep G2). Ein bevorzugtes Verfahren ist die Expression in CHO-Zellen. Das Exon von menschlichem NGF, enthaltend den Prä-Pro-NGF, kann unter Verwendung geeigneter Promotoren und Vektoren verwendet werden, um die Expression von sekretiertem, reifem NGF (unter anderem 118- und 120-Formen) zu erreichen ( US-Patent Nr. 5.288.622 ). Kulturen stabiler CHO-Zellen, die stabil transfiziert sind und reife Formen von NGF sekretieren, sind in der Erfindung von Nutzen, wie in den Beispielen hierin beschrieben.
Wirtszellen werden mit den oben beschriebenen Expressions- oder Klonierungsvektoren transfiziert und vorzugsweise transformiert und in herkömmlichem Nährmedium gezüchtet, das, je nach Eignung, zur Induktion von Promotoren, zur Selektion von Transformanten oder zur Amplifikation der Gene, die für die gewünschten Sequenzen kodieren, modifiziert ist. Die Transfektion bezieht sich auf die Aufnahme eines Expressionsvektors durch eine Wirtszelle, egal ob tatsächlich etwaige kodierende Sequenzen exprimiert werden. Es sind dem Fachmann zahlreiche Verfahren zur Transfektion bekannt, z.B. CaPO4 und Elektroporation. Die erfolgreiche Transfektion wird allgemein erkannt, wenn ein beliebiges Anzeichen für die Operation dieses Vektors innerhalb der Wirtszelle auftritt.
Transformation bedeutet das Einführen von DNA in einen Organismus, so dass die DNA replizierbar ist, und zwar entweder als ein extrachromosomales Element oder durch einen chromosomalen Integranten. Je nach Abhängigkeit von der verwendeten Wirtszelle erfolgt die Transformation unter Verwendung von Standardverfahren, die für solche Zellen geeignet sind. Die Calciumbehandlung, die Calciumchlorid verwendet, wie in Abschnitt 1.82 von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory Press, New York (1989), beschrieben, oder die Elektroporation wird allgemein für Prokaryoten oder andere Zellen verwendet, die beträchtliche Zellwandbarrieren enthalten. Eine Infektion mit Agrobacterium tumefaciens wird zur Transformation gewisser Pflanzenzellen verwendet, wie von Shaw et al., Gene 23, 315 (1983), und WO 89/05859 , veröffentlicht am 29. Juni 1989, beschrieben wird. Zusätzlich dazu können Pflanzen unter Verwendung von Ultraschall behandlung transformiert werden, wie in WO 91/00358 , veröffentlicht am 10. Jänner 1991, beschrieben ist.
Bei Säugetierzellen ohne solche Zellwände wird das Calciumphosphat-Präzipitationsverfahren von Graham und van der Eb, Virology 52, 456–457 (1978), bevorzugt. Allgemeine Aspekte von Säugetierzellen-Wirtssystemtransformationen wurden von Axel im US-Patent Nr. 4.399.216 , ausgegeben am 16. August 1983, beschrieben. Transformationen zu Hefe werden typischerweise entsprechend dem Verfahren von Van Solingen et al., J. Bact. 130, 946 (1977), und Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 3829 (1979), durchgeführt. Es können jedoch auch andere Verfahren zum Einführen von DNA in Zellen verwendet werden, wie z.B. mittels Kern-Mikroinjektion, Elektroporation, bakterieller Protoplastenfusion mit intakten Zellen oder Polykationen, z.B. Polybren, Polyornithin etc. Bezüglich verschiedener Verfahren zur Transformation von Säugetierzellen siehe Keown et al., Methods in Enzymology, Band 185, 527–537 (1990), sowie Mansour et al., Nature 336, 348–352 (1988).
Vorzugsweise wird das Gen für hNGF in den Vektor insertiert, um ein Methionin-Startcodon erhältlich zu haben, vorzugsweise eines der zwei Methionin-Startcodons, wie von Ullrich et al., Nature 303, 821–825 (1983), identifiziert. Das hNGF-Gen (Ullrich et al., Cold Spring Harbor Symposia on Quant. Biol. XLVIII, 435 (1983); US-Patent Nr. 5.288.622 ) besitzt zwei fast nebeneinander liegende Methionine, die wahrscheinlich als Translationsinitiationscodons verwendet werden (Position 1 bezieht sich auf den N-terminalen Serin-Rest des reifen hNGF). Im Gegensatz dazu besitzt die Maus-Submaxillardrüsen-cDNA für NGF, den am genauesten untersuchten der Nervenwachstumsfaktoren, ein Methionin an Positon –187 zusätzlich zu jenen an Positionen –121 und –119. In einer bevorzugten Ausführungsform zur Expression in Säugetierzellen ist die Prä-Pro-NGF-Sequenz vorhanden.
Falls prokaryotische Zellen zur Produktion von Neurotrophin verwendet werden, so werden sie in geeignetem Medium gezüchtet, in dem der Promotor konstitutiv oder künstlich induziert werden kann, wie allgemein z.B. in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory Press, New York (1989), beschrieben. Etwaige notwendige Zusätze, abgesehen von Kohlenstoff-, Stickstoff- und anorganischen Phosphatquellen, können auch in geeigneten Konzentrationen allein oder als Gemisch mit einem anderen ergänzenden Stoff oder Medium, wie z.B. einer komplexen Stickstoffquelle, inkludiert werden.
Falls Säugetierwirtszellen zur Produktion von Neurotrophin verwendet werden, so können sie in einer Reihe von Medien gezüchtet werden. Im Handel erhältliche Medien, wie z.B. Ham-F10 (Sigma), Minimales Essentielles Medium ([MEM], Sigma), RPMI-1640 (Sigma) und Dulbeccos Modifiziertes Eagle-Medium ([DMEM], Sigma), sind zum Züchten der Wirtszellen geeignet. Zusätzlich dazu kann ein beliebiges der in Ham und Wallace, Meth. Enz. 58, 44 (1979); Barnes und Sato, Anal. Biochem. 102, 255 (1980); US-Patent Nr. 4.767.704 ; 4.657.866 ; 4.927.762 ; 5.122.469 oder 4.560.655 ; WO 90/03430 ; WO 87/00195 oder US-Patent Nr. Re. 30.985 , deren Offenbarungen allesamt hierin durch Verweis aufgenommen sind, beschriebenen Medien als Kulturmedium für die Wirtszellen verwendet werden. Jedes dieser Medien kann, je nach Notwendigkeit, mit Homonen und/oder anderen Wachstumsfaktoren (wie z.B. Insulin, Transferrin oder epidermalem Wachstumsfaktor), Salzen (wie z.B. Natriumchlorid, Calcium, Magnesium und Phosphat), Puffern (wie z.B. HEPES), Nucleosiden (wie z.B. Adenosin und Thymidin), Antibiotika (wie z.B. dem Gentamycin^TM-Arzneimittel), Spurenelementen (als anorganische Verbindungen definiert, die normalerweise in Endkonzentrationen im mikromolaren Bereich vorhanden sind) sowie Glucose oder einer äquivalenten Energiequelle ergänzt sein. Etwaige andere notwendige Zusätze können ebenfalls in geeigneten Konzentrationen, die dem Fachmann bekannt wären, inkludiert sein. Die Kulturbedingungen, wie z.B. Temperatur, pH und dergleichen, sind jene, die zuvor für die zur Expression ausgewählte Wirtszelle verwendet wurden und sind dem Fachmann bekannt.
Allgemein sind Prinzipien, Arbeitsvorschriften und praktische Verfahren zur Maximierung der Produktivität von In-vitro-Säugetierzellkulturen in Mammalian Cell Biotechnologe: A Practical Approach, M. Butler (Hrsg.), IRL Press, Oxford University Press, Oxford (1991), zu finden. Das oben genannte Verfahren kann verwendet werden, egal, ob das Neurotrophin intrazellulär produziert wird, im periplasmatischen Raum produziert wird oder direkt in das Medium sekretiert wird.
Typischerweise wird Kulturflüssigkeit nach einer geeigneten Zeitspanne geerntet, und es werden Standard-Identifikationstests, z.B. Immuntests, wie etwa ELISA- und Western-Blot-Analysen, oder biologische Tests, wie z.B. die PC12-Zellen-Differenzierung (L.A. Greene, Trends Neurosci. 7, 91 (1986)), durchgeführt. Tests zur Bestimmung der Art und des Ausmaßes der hierin offenbarten Varianten sind nach dem Stand der Technik bekannt oder sie werden in den Beispielen bereitgestellt oder zitiert (siehe z.B. Schmelzer et al., J. Neurochem. 59 (5), 1675–83 (1992), sowie Burton et al., J. Neurochem. 59 (5), 1937–45 (1992)), die hierin durch Verweis aufgenommen sind.
Die aus den Zellen hergestellte Neurotrophin-Zusammensetzung wird vor der HIC vorzugsweise zumindest einem Reinigungsschritt unterzogen. Beispiele geeigneter Reinigungsschritte umfassen jene, die hierin beschrieben werden, unter anderem die Affinitätschromatographie, andere Verfahren zur Proteinreinigung, wie z.B. die Chromatographie auf Silica, die Chromatographie auf Heparin-Sepharose, die Chromatographie auf einem Anionen- oder Kationenaustauschharz (wie z.B. einer Polyasparaginsäure-Säule), die Chromatofokussierung sowie die präparative SDS-PAGE, in Abhängigkeit vom zu gewinnenden Neurotrophin und der verwendeten Ausgangskultur.
In einer Ausführungsform, in der das Neurotrophin direkt in das Medium sekretiert wird, wird das Medium von zellulären Trümmern mittels Zentrifugierung getrennt, und die/das geklärte Fermentationsbrühe oder -medium wird anschließend zur Reinigung auf Silicagel verwendet. Für die Silicachromatographie wird die Brühe typischerweise durch nicht derivatisierte Silicateilchen geleitet, so dass das Neurotrophin-Polypeptid an den Silicateilchen haftet; die Silicateilchen werden gewaschen, um Verunreinigungen zu entfernen, und das Polypeptid wird aus den Silicateilchen mit einem Puffer eluiert, der ein alkoholisches oder polares aprotisches Lösungsmittel und ein Erdalkali-, ein Alkalimetall- oder ein anorganisches Ammoniumsalz umfasst.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine Macroprep-High-S-Kationenaustauschchromatographie verwendet, um Neurotrophin von seinen Varianten zu trennen, sowie um in großen Mengen auftretende Verunreinigungen zu verringern. Dieses Harz kann als eine frühe Stufe in der Reinigung eines Neurotrophins aus Säugetierzellkultur verwendet werden, vorzugsweise zur Fraktionierung des geernteten Zellkulturmediums. In einer anderen Ausführungsform wird die Macroprep-High-S-Kationenaustauschchromatographie am meisten bevorzugt sofort nach einem Protein-Umfaltungsschritt verwendet. Das sehr hohe Fließverhalten dieser Kationenaustauschsäule ermöglicht eine leichte Konzentration der großen Menge an verdünntem, umgefaltetem Protein oder geerntetem Zellkulturmedium-Neurotrophin vor darauf folgenden Chromatographieschritten, wie z.B. HIC oder SP-Sepharose, und zwar durch das Anpassen von Bedingungen, so dass die Neurotrophine die Säule binden. Weiters ermöglicht die Kationenaustausch-Natur des Harzes die Entfernung nicht gebundener großer Proteine sowie mancher fehlverarbeiteter Varianten und chemisch modifizierter Varianten (z.B. veränderte Ladung, MET37-oxidierte Variante). Am wichtigsten ist jedoch, dass bei Vorhandensein von fehlgefalteten oder chemisch modifizierten Varianten (z.B. fehlverarbeiteten Varianten, einer Glykosylierungsvariante (wie aus der Säugetierzellkulturproduktion)), die sich bezüglich der Hydrophobie von nativem Neurotrophin unterscheiden, das Macroprep-Harz zumindest eine partielle Entfernung dieser hydrophoben Varianten ermöglicht, wobei es, wie hierin definiert, zu einer wesentlichen Anreicherung des nativen Neurotrophins kommt. Es wird davon ausgegangen, und dies ist nicht als Einschränkung zu verstehen, dass die Hauptkette des Harzträgers einen hydrophoben Gehalt aufweist, der unspezifische Wechselwirkungen zwischen Neurotrophinen und dem Harz fördert, wobei dies, wie hierin gelehrt wird, als Vorteil genutzt wurde. Typischerweise ist für einen Elutionspuffer mit einem pH von etwa 5 bis 8, noch bevorzugter 6 bis 8, eine TMAC-Konzentration von 0 bis 3 M von Nutzen. Natriumacetat ermöglicht, bei Vorhandensein zur Erhöhung der Ionenstärke des Elutionspuffers, die Verwendung einer geringeren TMAC-Konzentration. Chlorid ist ein bevorzugtes Substitut für das Acetat-Ion.
In einem Beispiel der Ausführungsform, in dem das Neurotrophin im periplasmatischen Raum produziert wird, wird das Kulturmedium oder -lysat zentrifugiert, um partikelförmige Zelltrümmer zu entfernen. Anschließend können die Fraktionen der Membran und des löslichen Proteins getrennt werden, falls notwendig. Das Neurotrophin kann anschließend aus der Fraktion des löslichen Proteins und aus der Membranfraktion des Kulturlysats gereinigt werden, und zwar in Abhängigkeit davon, ob das Neurotrophin membrangebunden ist, löslich ist oder in einer aggregierten Form vorhanden ist. Danach wird das Neurotrophin solubilisiert und anschließend unter Verwendung eines geeigneten Puffers umgefaltet. Die Details für dieses Verfahren der Isolation aus dem Periplasma zur Produktion von umgefaltetem Protein sind unten stehend beschrieben.
Nicht lösliches, nicht natives Neurotrophin wird aus den prokaryotischen Wirtszellen in einem geeigneten Isolationspuffer durch ein beliebiges geeignetes Verfahren isoliert, z.B. eines, welches das Aussetzen der Zellen gegenüber einem Puffer mit geeigneter Ionenstärke umfasst, um die meisten Wirtsproteine zu solubilisieren, in dem jedoch aggregiertes Neurotrophin im Wesentlichen nicht löslich ist, sowie das Zerstören der Zellen, um die Einschlusskörper freizusetzen und zur Gewinnung, z.B. durch Zentrifugierung, verfügbar zu machen. Dieses Verfahren ist wohlbekannt und wird z.B. im US-Patent Nr. 4.511.503 beschrieben.
Kurz gesagt, werden die Zellen im Puffer suspendiert (typischerweise bei einem pH von 5 bis 9, vorzugsweise etwa 6 bis 8, unter Verwendung einer Ionenstärke von etwa 0,01 bis 2 M, vorzugsweise von 0,1 bis 0,2 M). Ein beliebiges geeignetes Salz, unter anderem Natriumchlorid, ist von Nutzen, um einen ausreichenden Ionenstärke-Wert zu erhalten. Die Zellen werden anschließend, während sie in diesem Puffer suspendiert sind, mittels Lyse unter Verwendung von Verfahren zerstört, die häufig angewandt werden, z.B. mechanischen Verfahren, z.B. einem Manton-Gaulin-Press-Microfluidizer, einer French-Press oder einem Schalloszillator, oder mittels chemischer oder enzymatischer Verfahren.
Beispiele chemischer oder enzymatischer Verfahren der Zellzerstörung umfassen das Verfahren des Spheroplasting, das die Verwendung von Lysozym zur Lyse der Bakterienwand umfasst (Neu et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 17, 215 (1964)), sowie den osmotischen Schock, der die Behandlung lebensfähiger Zellen mit einer Lösung hoher Tonizität und mit einem Kaltwasser-Waschschritt mit geringer Tonizität umfasst, um die Polypeptide freizusetzen (Neu et al., J. Biol. Chem. 240, 3685–3692 (1965)). Ein drittes Verfahren, beschrieben im US-Patent Nr. 4.680.262 , umfasst das Kontaktieren der transformierten bakteriellen Zellen mit einer wirksamen Menge eines niederen Alkanols mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen für eine Zeitspanne und bei einer Temperatur, die ausreichen, um die Zellen abzutöten und zu lysieren.
Nachdem die Zellen zerstört worden sind, wird die Suspension typischerweise zentrifugiert, um die Einschlusskörper zu pelletieren. In einer Ausführungsform wird dieser Schritt bei etwa 500 bis 15.000 × g, vorzugsweise etwa 12.000 × g, in einer Standardzentrifuge für eine ausreichend lange Zeitspanne durchgeführt, die vom Volumen und dem Design der Zentrifuge abhängt, normalerweise etwa von 10 Minuten bis 0,5 Stunden. Das resultierende Pellet enthält im Wesentlichen die gesamte der nicht löslichen Polypeptid-Fraktion, ist der Zellzerstörungsvorgang jedoch nicht vollendet, so kann es jedoch auch intakte Zellen oder zerbrochene Zellfragmente enthalten. Der Grad der Vollendung der Zellzerstörung kann durch das Resuspendieren des Pellets in einer kleinen Menge derselben Pufferlösung und das Untersuchen der Suspension mit einem Phasenkontrastmikroskop getestet werden. Die Gegenwart zerbrochener Zellfragmente oder ganzer Zellen zeigt, dass eine zusätzliche Zerstörung notwendig ist, um die Fragmente oder Zellen sowie die assoziierten, nichtrefraktilen Polypeptide zu entfernen. Nach solch einer weiteren Zerstörung, falls erforderlich, wird die Suspension erneut zentrifugiert und das Pellet gewonnen, resuspendiert und analysiert. Das Verfahren wird wiederholt, bis eine Sichtüberprüfung das Fehlen zerbrochener Zellfragmente im pelletierten Material zeigt oder bis es mit einer weiteren Behandlung nicht gelingt, die Größe des resultierenden Pellets zu reduzieren.
In einer alternativen Ausführungsform wird das Neurotrophin aus dem periplasmatischen Raum mittels Solubilisierung in einem geeigneten Puffer isoliert. Dieses Verfahren kann eine In-situ-Solubilisierung sein, die eine direkte Hinzufügung von Reagenzien zum Fermentationsgefäß umfasst, nachdem das Neurotrophin rekombinant produziert wurde, wobei zusätzliche Schritte des Erntens, der Homogenisierung und der Zentrifugierung vermieden werden, um das Neurotrophin zu erhalten. Die verbleibenden partikulären Stoffe können mittels Zentrifugierung oder Filtration, oder Kombinationen davon, entfernt werden.
Falls das Neurotrophin aufgefaltet wird, so wird das Ausmaß der Auffaltung in geeignetem Ausmaß mittels Chromatographie des nicht nativen Neurotrophins, unter anderem RP-HPLC, bestimmt. Eine zunehmende Peak-Fläche des nicht nativen Materials zeigt, wie viel nicht natives Neurotrophin vorhanden ist.
Einmal aus den solubilisierten Einschlusskörpern oder in einem späteren Reinigungsstadium erhalten, wird das Neurotrophin, wie unten stehend beschrieben, auf geeignete Art und Weise in eine aktive Konformation umgefaltet.
Falls das Neurotrophin noch nicht bereits in löslicher Form vorliegt, bevor es umgefaltet werden soll, so kann es durch Inkubation in alkalischem Puffer, enthaltend ein chaotropes Mittel und ein Reduktionsmittel in Mengen, die erforderlich sind, um das Neurotrophin im Wesentlichen löslich zu machen, löslich gemacht werden. Diese Inkubation erfolgt unter Bedingungen der Neurotrophinkonzentration, der Inkubationszeit und der Inkubationstemperatur, die das Auftreten der Solubilisierung des Neurotrophins im alkalischen Puffer ermöglichen.
Die Messung des Ausmaßes der Solubilisierung des Neurotrophins im Puffer wird geeigneterweise mittels Trübheitsbestimmung, durch Analyse von Neurotrophin-Fraktionierung zwischen dem Überstand und dem Pellet nach der Zentrifugierung auf reduzierten SDS-Gelen, durch Proteintest (z.B. dem Bio-Rad-Protein-Test-Set) oder durch HPLC durchgeführt.
Der Bereich des pH des alkalischen Puffers zur Solubilisierung beträgt typischerweise zumindest etwa 7,5, wobei der bevorzugte Bereich bei von etwa 8 bis 11 liegt. Beispiele geeigneter Puffer, die einen pH innerhalb dieses letzteren Bereichs bereitstellen, umfassen Glycin, CAPSO (3-[Cyclohexylamino]-2-hydroxy-1-propansulfonsäure), AMP (2-Amino-2-methyl-1-propanol), CAPS (3-[Cyclohexylamino]-1-propansulfonsäure), CHES (2-[N-Cyclohexylamino]ethansulfonsäure) sowie IRIS-HCl (Tris[hydroxymethyl]aminomethanhydrochlorid). Der bevorzugte Puffer hierin ist Glycin oder CAPSO, vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 20 mM, bei einem pH von etwa 8,5 bis 11, vorzugsweise 10–11.
Die Neurotrophin-Konzentration in der gepufferten Lösung zur Solubilisierung muss eine solche sein, dass das Neurotrophin im Wesentlichen solubilisiert und partiell oder vollständig reduziert und denaturiert wird. Alternativ dazu kann das Neurotrophin anfänglich unlöslich sein. Die genaue Menge, die zu verwenden ist, hängt z.B. von den Konzentrationen und Typen anderer Bestandteile der gepufferten Lösung ab, insbesondere vom Typ und der Menge des Reduktionsmittels, vom Typ und der Menge des chaotropen Mittels sowie vom pH des Puffers. Die Neurotrophin-Konzentration kann z.B. zumindest dreifach erhöht werden, wenn die Konzentration des Reduktionsmittels, z.B. DTT, gleichzeitig erhöht wird, um ein Verhältnis von DTT: Neurotrophin von etwa 3:1 oder 10:1 beizubehalten. Es ist wünschenswert, eine konzentriertere, löslich gemachte Proteinlösung vor der Verdünnungsumfaltung herzustellen. Daher beträgt die bevorzugte Neurotrophin-Konzentration zumindest etwa 30 mg/ml, wobei ein stärker bevorzugter Bereich bei 30–50 mg/ml liegt. Neurotrophin kann z.B. bis zu einer Konzentration von etwa 30–50 mg/ml in 5 M bis 7 M Harnstoff, 10 mM DTT solubilisiert werden und zum Falten z.B. auf etwa 1 mg/ml verdünnt werden.
Nachdem das Neurotrophin solubilisiert worden ist, wird es in einem Umfaltungspuffer platziert oder in diesen verdünnt, wobei dieser 5–40 Vol.-% alkoholisches oder aprotisches Lösungsmittel, ein chaotropes Mittel und ein Alkalimetall-, Erdalkali- oder Ammoniumsalz enthält. Der Puffer kann ein beliebiger Puffer für die erste gepufferte Lösung sein, wobei CAPSO, Glycin und CAPS mit einem pH von 8,5–11, vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 20 mM, und insbesondere CAPSO und Glycin bevorzugt werden. Das Neurotrophin kann mit dem Umfaltungspuffer verdünnt werden, vorzugsweise zumindest fünffach, noch bevorzugter zumindest etwa zehnfach. Alternativ dazu kann das Neurotrophin gegen den Umfaltungspuffer dialysiert werden. Die Umfaltung kann bei etwa 2 °C–45 °C, insbesondere bei etwa 2 °C–8 °C, für zumindest etwa eine Stunde durchgeführt werden. Die Lösung enthält gegebenenfalls auch ein Reduktionsmittel und einen Osmolyten.
Das Reduktionsmittel wird geeigneterweise aus jenen, die oben stehend für den Solubilisierungsschritt beschrieben werden, im angegebenen Konzentrationsbereich ausgewählt. Seine Konzentration hängt besonders von den Konzentrationen von Erdalkali-, Alkalimetall- oder Ammoniumsalz, Neurotrophin und Lösungsmittel ab. Die Konzentration an reduzierendem Mittel liegt vorzugsweise bei etwa 0,5 bis 8 mM, noch bevorzugter bei etwa 0,5–5 mM, insbesondere bei etwa 0,5–2 mM. Die bevorzugten Reduktionsmittel sind DTT und Cystein.
Sauerstoff in der Umfaltungslösung kann gegebenenfalls durch Hinzufügung eines Inertgases, z.B. Helium oder Argon, verarmt sein, um den Sauerstoff zu verdrängen.
Der optionale Osmolyt ist vorzugsweise Saccharose (in einer Konzentration von etwa 0,25–1 M) oder Glycerin (in einer Konzentration von etwa 1–4 M). Noch bevorzugter liegt die Saccharosekonzentration bei etwa 1 M und die Glycerinkonzentration bei etwa 4 M.
Die anfängliche Konzentration an Neurotrophin im Faltungspuffer ist eine solche, dass das Verhältnis an korrekt gefaltetem zu fehlgefaltetem gewonnenem Konformer maximiert wird, wie durch HPLC, RIA oder einen Bioassay bestimmt wird. Die bevorzugte Neurotrophin-Konzentration (die zu einer maximalen Ausbeute an korrekt gefaltetem Konformer führt) befindet sich im Bereich von etwa 0,1 bis 15 mg/ml, noch bevorzugter von etwa 0,1 bis 6 mg/ml und insbesondere von etwa 0,2 bis 5 mg/ml.
Das Ausmaß der Umfaltung, die nach dieser Inkubation auftritt, wird geeigneterweise durch den RIA-Titer des Neurotrophins oder durch HPLC-Analyse mit ansteigendem RIA-Titer oder korrekt gefalteter Neurotrophin-Peak-Größe bestimmt, die direkt mit ansteigenden Mengen an korrekt gefaltetem, biologisch aktivem und im Puffer vorhandenem Neurotrophin-Konformer korreliert. Die Inkubation wird durchgeführt, um die Ausbeute an korrekt gefaltetem Neurotrophin-Konformer und das Verhältnis von korrekt gefaltetem Neurotrophin-Konformer zu fehlgefaltetem gewonnenem Neurotrophin-Konformer zu maximieren, wie durch RIA oder HPLC bestimmt, und um die Ausbeute an multimerem, assoziiertem Neurotrophin, wie mittels Stoffbilanz bestimmt, zu minimieren. Alternativ dazu kann die Spezies durch die unten stehenden und in den Beispielen beschriebenen Verfahren bestimmt werden. Guanidin ist ein bevorzugtes denaturierendes Mittel zur Umfaltung.
Nach der Umfaltung des Neurotrophins sind die folgenden Verfahren, wie sie hierin gelehrt werden, entweder einzeln oder in Kombination als Beispiel geeigneter Reinigungsverfahren zum Erhalt größerer Reinheit und Homogenität anzusehen: Fraktionierung auf Kationenaustauschsäulen; Hydrophobchromatographie (HIC); sowie Chromatographie auf Silica.
Unabhängig davon, ob ein Umfaltungsschritt Teil des Verfahrens ist oder nicht, umfassen Verfahren, wie hierin beansprucht, einen Schritt zur Trennung eines Neurotrophins von seinen Varianten mittels Trennung auf Hydrophobchromatographieharz. Während der Fermentation, der Reinigung oder der In-vitro-Protein-Umfaltung können manche Proteine chemisch modifiziert werden, fehlverarbeitet werden, oder es kann sein, dass sie sich nicht zu ihrer nativen dreidimensionalen Struktur umfalten, sondern vielmehr zu anderen Strukturen, die sich hinsichtlich ihrer Stabilität, Löslichkeit, Immunogenität oder Bioaktivität unterscheiden. Diese Varianten müssen während der Gewinnung entfernt werden, um unerwünschte Nebenwirkungen, wie z.B. Antigenität oder einen Verlust der Leistungsfähigkeit, zu vermeiden. Ist die Variante nicht löslich, so kann sie leicht mittels Fest/Flüssig-Trennungsverfahren, wie z.B. Zentrifugierung und Filtration, entfernt werden. Ist die Variante jedoch löslich, so sind Adsorptionsverfahren mit höherer Auflösung, wie z.B. eine Chromatographie, erforderlich, um sie zu entfernen. Bei Produktion in prokaryotischen Zellen oder Umfaltung in vitro bilden Neurotrophine eine lösliche, stabile, fehlgefaltete Variante. Fehl gefaltetes Neurotrophin besitzt ein(e) veränderte(s) Disulfidpaarungsmuster und dreidimensionale Struktur im Vergleich zu nativem Neurotrophin, und es fehlt ihm an nativer pharmakologischer Aktivität. Bei Produktion in eukaryotischer Zellkultur, z.B. einer Säugetierzellkultur, handelt es sich bei den Formvarianten typischerweise um fehlverarbeitete Formen. Diesen fehlt ebenfalls typischerweise native pharmakologische Aktivität und sollten entfernt werden. Die HIC wurde hierin als zur Trennung dieser Varianten von nativem Neurotrophin geeignet angesehen.
Die HIC umfasst die sequentielle Adsorption und Desorption von Protein aus Festmatrizen, vermittelt durch nichtkovalente hydrophobe Bindung. Allgemein werden Probemoleküle in einem Puffer mit hohem Salzgehalt auf die HIC-Säule geladen. Das Salz im Puffer wechselwirkt mit Wassermolekülen, um die Solvation der Moleküle in Lösung zu reduzieren, wodurch hydrophobe Regionen in den Probemolekülen freigelegt werden, die daraufhin von der HIC-Säule adsorbiert werden. Je stärker das Molekül hydrophob ist, desto weniger Salz wird zur Förderung der Bindung benötigt. Normalerweise wird ein geringer werdender Salzgradient verwendet, um Proben aus der Säule zu eluieren. Wird die Ionenstärke geringer, nimmt das Maß der Aussetzung der hydrophilen Regionen der Moleküle zu, und Moleküle eluieren in der Reihenfolge zunehmender Hydrophobie aus der Säule. Die Proben-Eluierung wurde auch durch die Hinzufügung milder organischer Modifikatoren oder Detergenzien zum Elutionspuffer erreicht. Über die HIC wird in Protein Purification, 2. Auflage, 176–179, Springer-Verlag, New York (1988), berichtet.
Die Stärke der Assoziierung zwischen einem Protein und einer Matrize hängt von mehreren Faktoren ab, unter anderem der Größe und dem hydrophoben Charakter der immobilisierten funktionalen Gruppe, der Polarität und der Oberflächenspannung des umgebenden Lösungsmittels und der Hydrophobie des Proteins. Die Bindungskapazität von HIC-Matrizen tendiert aufgrund der Notwendigkeit eines großen Abstands der immobilisierten hydrophoben Liganden dazu, gering zu sein. Weiters variiert die Kapazität eines Mediums für ein bestimmtes Protein in entgegengesetzter Richtung zu der Menge hydrophober Unreinheiten im Probenpräparat. Um ein gewünschtes Protein von Varianten und anderen Verunreinigungen zu lösen bei gleich zeitiger Kapazitätsmaximierung, ist es notwendig, ein geeignetes HIC-Festphasen-Medium sowie geeignete mobile Phasen für die Ladung, das Waschen und die Elution zu finden.
Wie hierin bestimmt, waren die am besten geeigneten Medien zum Trennen korrekt gefalteter und fehlgefalteter Neurotrophine oder fehlverarbeiteter Formen intakter, korrekt verarbeiteter Formen jene mit immobilisierten funktionalen Phenylgruppen. Phenylbasierte HIC-Medien von verschiedenen Lieferanten zeigten eine unterschiedliche Wirksamkeit bezüglich des Auflösens dieser Neurotrophin-Formen. Die besten Resultate wurden mit Phenyl-Toyopearl-Medium von TosoHaas und Phenyl-Sepharose-Fast-Flow-Low-Sub (geringe Substitution) erreicht. TSK-Phenyl-5PW war ebenfalls geeignet. Andere HIC-immobilisierte funktionale Gruppen können eine Trennung dieser Formen bewirken. Beispiele waren Octylgruppen, wie z.B. jene auf Octyl-Sepharose-CL4B-Medien von Pharmacia, sowie Propylgruppen, wie z.B. jene auf High-Propyl-Medien von Baker. Weniger bevorzugt werden die Harze mit funktionalen Alkoxy-, Butyl- und Isoamyl-Gruppen.
Die HIC war für die Trennung von Neurotrophinen von ihren Varianten in Säugetierzellkultur von Nutzen. Wie hierin bestimmt wurde, enthielt z.B. rhNGF-exprimierende CHO-Zellkultur proteolytisch inkorrekt verarbeitete Varianten, wie z.B. jene, bei denen eine partielle Vorläufersequenz vorhanden ist, z.B. Vorläufer-NGF-, Hybrid-Vorläufer-NGF- sowie beschnittene Vorläufer-NGF-Sequenzen. Auch glykosylierter NGF und glykosylierte Formen der proteolytisch inkorrekt verarbeiteten Varianten waren im Säugetierzellkulturmedium zu finden. Unerwünschte glykosylierte Formen, die im Fall von NGF als eine Spezies mit einem höheren Molekulargewicht (+ 2000 kD) angesehen werden können, konnten eine unerwünschte antigene Antwort bei einem Patienten erzeugen und zu schlechter Produktqualität oder -aktivität beitragen. Die HIC trennte wirksam hydrophobe Varianten, hauptsächlich proteolytisch fehlverarbeitete N-terminale Varianten, unter anderem glykosylierte Formen, von rhNGF. Wie in den Beispielen dargestellt, eluierte der vorläufersequenzhältige und beschnittene Vorläufersequenz-NGF sowie die glykosylierten Formen von sowohl dem NGF als auch dem vorläufersequenzhältigen NGF in der linken Kante des NGF-Peaks während der Phenyl-HIC. Daher konnte eine rhNGF-Zusammensetzung erhalten werden, die im Wesentlichen frei von diesen Spezies war und die sich für einen darauf folgenden Schritt, wie z.B. einer Hochleistungs-Kationenaustauschchromatographie, besonders eignete. Die HIC ist auf andere Neurotrophine, sowie auf NGF, unabhängig von der Quelle, anwendbar. Die HIC ist z.B. nützlich, um NGF-Monomere von Dimeren, entweder Homo- oder Heterodimeren, zu trennen, je nach Abhängigkeit von den vorhandenen Monomerformen, sowie zur Unterscheidung von Dimerformen, die sich auch bezüglich der Hydrophobie unterscheiden, die nach der Invitro-Umfaltung oder bei Produktion und Sekretion von Säugetierzellen erhalten werden. Eine bevorzugte Quelle von Neurotrophin-Gemischen zur Verwendung für die HIC ist eine Säugetierzellkultur, noch bevorzugter eine CHO-Zellkultur. Die Kultur wird vorzugsweise zumindest einem vorangehenden Reinigungsschritt unterzogen, wie hierin beschrieben wird. Die HIC ist besonders für die Trennung fehlverarbeiteter, glykosylierter Variante(n) vom nativen rekombinanten Neurotrophin wirksam. Im Fall von rhNGF sind die glykosylierten und Prä-Pro-NGF-Formen weniger hydrophob als nativer NGF, wodurch sie vor dem nativen NGF eluieren. Fehlgefaltete Neurotrophin-Formen sind (bei bakterieller Herstellung) auch stärker hydrophob, wodurch sie früher eluieren als das native Neurotrophin.
Die am stärksten bevorzugten HIC-Harze zur Trennung von Neurotrophin-Formen waren jene mit immobilisierten funktionalen Phenylgruppen. Phenylbasierte HIC-Medien von verschiedenen Lieferanten zeigten eine unterschiedliche Wirksamkeit zum Auflösen dieser NGF-Formen. Von den Phenyl-HIC-Harzen wird Phenyl-Toyopearl-Medium von TosoHaas am stärksten bevorzugt, und Phenyl-Sepharose-Fast-Flow-Low-Sub (geringe Substitution) und TSK-Phenyl-5PW werden bevorzugt. Bevorzugte funktionale HIC-Gruppen umfassen die Alkoxy-, Butyl- und Isoamyl-Gruppierungen.
Unter Verwendung einer HIC kann eine Reihe von Bedingungen mobiler Phasen verwendet werden, um Neurotrophin-Formen zu waschen und differenziert zu eluieren. Diese mobilen Phasen können mehrere verschiedene chemische Spezies enthalten, welche die Assoziierung zwischen einem Neurotrophin und der stationären Phase auf verschiedene Arten beeinflussen. Korrekt gefaltetes und fehlgefaltetes Neurotrophin, z.B. NT-4/5, kann auf einer HIC-Säule mittels geringer werdender Salzgradienten oder schrittweiser Verringerung, z.B. von Mobilphasensalz, z.B. Ammoniumsulfat, NaCl-Konzentration, Acetatkonzentration, aufgelöst werden. Salze können die Bindung eines Neurotrophins an das Harz durch Modulation der Oberflächenspannung der mobilen Phase beeinflussen. Andere Mittel, welche die Oberflächenspannung beeinflussten, waren Natriumcitrat und Tetramethylammoniumchlorid, wie in den Beispielen beschrieben. Varianten können auch während der Säulenchromatographie durch Eluieren von gebundenem Protein mit zunehmenden Gradienten oder schrittweiser Erhöhung der Konzentration relativ polarer organischer Lösungsmittel aufgelöst werden. Beispiele geeigneter Lösungsmittel umfassen Ethanol, Acetonitril und Propanol. Die Stärke der Assoziierung zwischen Neurotrophin-Formen und HIC-Harz hing auch vom pH der mobilen Phase ab, wobei neutrale Bedingungen bevorzugt wurden. Die relative Hydrophobie des korrekt gefalteten und fehlgefalteten Neurotrophin hing auch vom pH der Lösung ab. Die Trennung von Varianten von nativem Neurotrophin konnte auch durch das gleichzeitige Variieren mehrerer Eigenschaften der mobilen Phase während der Gradienten- oder der schrittweisen Eluierung erreicht werden. Eine mobile Phase, bei der es z.B. gleichzeitig eine variierende Salzkonzentration und eine variierende Konzentration des apolaren Lösungsmittels während der Eluierung gab, ergab eine bessere Auflösung als im Fall einer Variation des Salzes alleine.
Bei der HIC können die hierin beschriebenen Salze, unter anderem Ammoniumsulfat, Citrat, Acetat und Kaliumchlorid verwendet werden. In Abhängigkeit vom verwendeten Salz liegt die Salzkonzentration bei typischerweise 0,5 M bis 3 M, noch bevorzugter bei 0,5 bis 2,5 M, um eine Bindung von Neurotrophin an das Harz zu erreichen. Ein Bindungspuffer von 0,8 bis 1,5 M Salz wird z.B. für NGF bevorzugt, wobei höhere Salzkonzentrationen zu einer Präzipitation von NGF auf das Harz führen, was in einer geringeren Ausbeute resultiert. Bei NT-3 wird ein Bindungspuffer mit einem pH von 7 mit einer Salzkonzentration von 1,0 bis 2,5 bevorzugt, wobei 1,25 bis 1,75 M NaCl noch stärker bevorzugt werden und 1,5 M am meisten bevorzugten werden. Bei NT-4/5 wird ein Bindungspuffer mit einem pH von 7 mit 1 bis 3 M Salz bevorzugt, wobei 2 bis 2,75 M noch stärker bevorzugt werden und 2,5 M NaCl am meisten bevorzugten werden. Im Fall von NT-4/5 wurden, als 2,5 M NaCl zur Ladung bevorzugt wurden, 2 M NaCl zur Eluierung mit vorhandenem organischem Lösungsmittel bevorzugt (z.B. 10 % Alkohol, pH 7). Es wird vorzugsweise eine Verringerung der Salzkonzentration verwendet, um ein Neurotrophin und seine Varianten zu eluieren und zu trennen. Um die Eluierung zu erreichen, ist die Salzkonzentration im Elutionspuffer typischerweise niedriger als im Ladungspuffer, er kann jedoch dieselbe Konzentration aufweisen, wenn sie mit organischem Lösungsmittel kompensiert wird.
Zusätzlich dazu besitzt die Verwendung von organischem Lösungsmittel einen weiteren Vorteil, wie hierin herausgefunden wurde, nämlich jenen, dass die Hinzufügung eines organischen Lösungsmittels das Elutionsmuster verbessert, was zu schmäleren Peak-Profilen führt. Zusätzlich zu Ethanol können andere, hierin beschriebene, organische Lösungsmittel verwendet werden, unter anderem Propanol, Isopropanol und Niederalkylenglykole, wie z.B. Propylenglykol, Ethylenglykol und Hexylenglykol. Das organische Lösungsmittel bei 5 bis 25 Vol.-%, noch bevorzugter 5 bis 20 Vol.-%, eluiert typischerweise ein korrekt gefaltetes Neurotrophin. Die Elution mit organischem Lösungsmittel kann entweder gradienten- oder schrittweise erfolgen. Der pH-Bereich liegt vorzugsweise in der Nähe des neutralen Bereichs bis hin zu leicht sauer, bei einem pH von 5 bis 8, noch bevorzugter bei einem pH von 6 bis 8, einem pH von 6,5 bis 7,5 und insbesondere einem pH von 7. Es kann jeder der hierin beschriebenen Puffer, unter anderem MOPSO, MOPS, HEPES, Phosphat, Citrat, Ammonium, Acetat, verwendet werden, solange dieser beim gewünschten pH einen Puffer darstellt.
Angesichts der Entdeckung gewisser unerwünschter Neurotrophin-Varianten, die aus der rekombinanten Produktion eines Neurotrophins entstehen, durch die Erfinder der vorliegenden Erfindung ermöglicht die Verwendung einer Hochleistungs-Kationenaustauschchromatographie, wie hierin beschrieben, vorzugsweise in präparativem Modus, eine Trennung der ladungsmodifizierten Varianten, wie z.B. carbamylierter, oxidierter, Isoasp-, desamidierter und gewisser beschnittener Formen (z.B. C-terminale trunkierte Formen von NGF), von nativem Neurotrophin. N-terminale beschnit tene Formen (z.B. 2 bis 4 N-terminale Aminosäure-Deletionen), die zu einer Ladungsveränderung führen, die während der bakteriellen Fermentierung auftreten kann, wie im Fall von NT-4/5 und NT-3, können z.B. nun entfernt werden. Im Fall von Neurotrophinen, die in Säugetierzellkultur produziert werden, kann eine C-terminale Trunkierung in der hochgradig geladenen terminalen Region auftreten. Es können z.B. 118-Formen von NGF fehlverarbeitet oder an seinem C-Terminus zu 117-, 114- und 115-Formen gespalten werden. Diese können von nativem 118-NGF mittels Hochleistungs-Kationenaustauschchromatographie getrennt werden. Besonders bevorzugte Ausführungsformen verwenden SP-Sepharose-High-Performance-, Fractogel-EMD-SO3- oder Polyasparaginsäure-Harz, von denen PolyCAT-A besonders bevorzugt wird. Noch bevorzugter werden in großem Maßstab SP-Sepharose-High-Performance- oder Fractogel-EMD-SO3-Harze verwendet.
Zusammensetzungen, die durch die hierin beschriebenen Verfahren erhalten werden, umfassen in hohem Maße reines Neurotrophin, häufiger und bevorzugterweise im Wesentlichen rein, und sind in hohem Maße frei von Neurotrophin-Varianten, noch bevorzugter im Wesentlichen frei von Neurotrophin-Varianten. Ein typischer SP-Sepharose-Pool nach der Reinigung von NGF aus CHO-Zellkultur enthält z.B. etwa 92 % 118-, 4,6 % 120-, 1 % desamidierten NGF, 1 % oxidierten NGF und 1 % Isoasp-NGF. Routinemäßig befindet sich die Menge jeder Spezies in einem Bereich von etwa 85 bis 93 % bei 118-, 0 bis 5 % bei 120- (großteils vom Ausmaß endogener und/oder exogener Proteolyse abhängig, die verwendet wird), 0 bis 5 % bei 117-, 0 bis 3 % bei desamidierten Formen, 0–2 % bei Isoasp-Formen und 0 bis 2 % bei oxidierten Formen. Die Reinheit von NGF (alle Spezies) ist routinemäßig größer als 99,5 %.
Nachdem das Neurotrophin aus der Säule eluiert ist, wird es auf geeignete Art und Weise mit einem Träger zu einer Zusammensetzung formuliert, vorzugsweise einer pharmazeutischen Zusammensetzung mit einem physiologisch annehmbaren Träger. Neurotrophin-Zusammensetzungen sind vorzugsweise steril. Die Neurotrophin-Zusammensetzungen der Erfindung finden auch in vitro Anwendung, z.B. zur Förderung des Wachstums und des Überlebens von Neuronen in Kultur.
Die chemische und physikalische Stabilität von rekombinantem menschlichem Nervenwachstumsfaktor (NGF) in wässriger Lösung wurde zwischen 5 und 37 °C im pH-Bereich von 4,2 bis 5,8 untersucht. Die chemische NGF-Stabilität nahm mit zunehmendem pH zu. In Succinat-Puffer bei einem pH von 5,8 verringerte sich die physikalische NGF-Stabilität aufgrund der Protein-Aggregierung. Sowohl basierend auf den Stabilitätsdaten bei 5 °C als auch auf beschleunigten Degradationsstudien bei 37 °C wurde als optimale Formulierung Acetatpuffer mit einem pH von 5,5 identifiziert (siehe WO 97/17087 , hierin durch Verweis aufgenommen). Eine Umkehrphasen-HPLC war das Hauptverfahren zur Angabe der Stabilität, das eine Umwandlung von Asn-93 zu Iso-Asp als Haupt-Degradationsweg bei 5 °C zeigte. Die Quantifizierung der NGF-Degradation mittels Kationenaustauschchromatographie wurde durch die Neuanordnung der NGF-Monomervarianten in verschiedene gemischte Dimere über eine gewisse Zeitspanne kompliziert (Dimeraustausch). Die Behandlung von Proben und Kontrollen mit verdünnter Säure führte zu einer schnellen Äquilibrierung der Monomerverteilung in den Dimeren, was eine Quantifizierung der NGF-Degradation bei fehlendem Dimeraustausch ermöglichte. Benzylalkohol und Phenol wurden auf ihre Kompatibilität und Stabilität mit rhNGF in zwei flüssigen Formulierungen für multifunktionale Verwendungszwecke evaluiert. Diese zwei Formulierungen bestehen aus 0,1 mg/ml Protein in 20 mM Natriumacetat bei einem pH von 5,5 und 136 mM Natriumchlorid mit und ohne 0,01 % Pluronsäure (F68) als Tensid. Die Endkonzentrationen von Benzylalkohol und Phenol in jeder dieser zwei Formulierungen lagen bei 0,9 bzw. 0,25 %. Laut der 12-Monats-Stabilitätsdaten ist rhNGF in diesen Formulierungen mit Benzylalkohol stabiler als mit Phenol. Die mit Benzylalkohol konservierte rhNGF-Formulierung mit vorhandenem Tensid ist genauso stabil wie die Formulierung, zu der kein Tensid zugegeben wird, was zeigt, dass die Zugabe von F68 zur rhNGF-Multidosis-Formulierung zum Zwecke der Stabilität nicht erforderlich ist. Daher wird eine Formulierung, die aus 0,1 mg/ml Protein in 20 mM Acetat, 136 mM NaCl, 0,9 % Benzylalkohol, pH 5,5, besteht, für rhNGF empfohlen, der zur mehrfachen Dosierung in klinischen Phase-III-Versuchen verwendet wird. Diese rhNGF-Multidosis-Formulierung bestand den USP- und EP-Konservierungswirksamkeitstest nach 6 Monaten bei 5 °C und ist genauso stabil wie die jetzige flüssige Formulierung bei 2 mg/ml. Die Formulierung sollte jedoch aufgrund des Vorhandenseins von Benzylalkohol als lichtempfindliches Konservierungsmittel keiner intensiven Lichtbestrahlung ausgesetzt werden.
Allgemein können die Zusammensetzungen andere Komponenten in Mengen enthalten, die vorzugsweise bei der Herstellung stabiler, flüssiger oder lyophilisierbarer Formen nicht hinderlich sind, sowie in Mengen, die sich für eine wirksame, sichere pharmazeutische Verabreichung eignen.
Neurotrophin wird mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger formuliert, d.h. einem Träger, der für Rezipienten in den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch ist und mit anderen Bestandteilen der Formulierung kompatibel ist. Die Formulierung umfasst z.B. vorzugsweise keine Oxidationsmittel und andere Verbindungen, von denen bekannt ist, dass sie für Polypeptide schädlich sind. Dieser Formulierungsschritt wird durch Entsalzen oder Diafiltration unter Verwendung von Standardverfahren erreicht.
Allgemein werden die Formulierungen durch das einheitliche und enge Kontaktieren des Neurotrophins mit flüssigen Trägern oder fein zerteilten festen Trägern oder beidem hergestellt. Anschließend wird das Produkt, falls notwendig, in die Form der gewünschten Formulierung gebracht. Der Träger ist vorzugsweise ein parenteraler Träger, noch bevorzugter eine Lösung, die mit dem Blut des Rezipienten isotonisch ist. Beispiele solcher Trägervehikel umfassen Wasser, Salzlösung, Ringer-Lösung. und Dextrose-Lösung. Nicht wässrige Vehikel, wie z.B. fette Öle und Ethyloleat, sind hierin ebenfalls von Nutzen sowie auch Liposomen.
Der Träger enthält passenderweise geringe Mengen von Zusatzstoffen, wie z.B. Substanzen, die die Isotonie und die chemische Stabilität verbessern. Solche Materialien sind für Rezipienten in den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch und umfassen Puffer, wie z.B. Phosphat, Citrat, Succinat, Essigsäure und andere organische Säuren oder ihre Salze; Antioxidantien, wie z.B. Ascorbinsäure; Polypeptide mit niedrigem Molekulargewicht (weniger als etwa zehn Reste), z.B.
Polyarginin oder Tripeptide; Proteine, wie z.B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere, wie z.B. Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren, wie z.B. Glycin, Glutaminsäure, Asparaginsäure oder Arginin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate, unter anderem Zellulose oder seine Derivate, Trehalose, Glucose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner, wie z.B. EDTA; Zuckeralkohole, wie z.B. Mannit oder Sorbit; Gegenionen, wie z.B. Natrium; und/oder nichtionische Tenside, wie z.B. Polysorbate, Poloxamere oder PEG. Das Endpräparat kann eine Flüssigkeit oder ein lyophilisierter Feststoff sein.
Neurotrophin, das zur therapeutischen Verabreichung verwendet wird, muss steril sein. Sterilität wird durch Filtrierung durch sterile Filtrierungsmembranen (z.B. 0,2-μm-Membranen) leicht erreicht. Therapeutische Neurotrophin-Zusammensetzungen werden allgemein in einem Behälter mit einer sterilen Zugangsöffnung platziert, z.B. einem Beutel für intravenöse Lösung oder einer Phiole mit einem Stöpsel, der von einer subkutanen Injektionsnadel durchstochen werden kann. Die oben genannten Formulierungen sind auch für In-vitro-Verwendungen geeignet.
Neurotrophin wird normalerweise in Einzeldosierungs- oder Mehrfachdosierungs-Behältern gelagert, z.B. versiegelten Ampullen oder Phiolen, als wässrige Lösung oder als lyophilisierte Formulierung zur Wiederherstellung. Als ein Beispiel einer lyophilisierten Formulierung werden 10-ml-Phiolen mit 5 ml sterilfiltrierter wässriger 1-%-(Gew./Vol.)-Neurotrophin-Lösung befüllt, und das daraus resultierende Gemisch wird lyophilisiert. Die Infusionslösung wird durch Wiederherstellung des lyophilisierten Neurotrophins unter Verwendung von bakteriostatischem Injektionswasser hergestellt.
Eine therapeutisch wirksame Menge einer Neurotrophin-Formulierung wird einem Patienten verabreicht. Mit „therapeutisch wirksamer Menge" ist hierin eine Dosis gemeint, die jene Wirkungen erzeugt, aufgrund derer sie verabreicht wird. Die genaue Dosis hängt von der zu behandelnden Erkrankung ab und ist von einem Fachmann unter Verwendung der bekannten Verfahren festsetzbar. Allgemein werden die Neu rotrophin-Formulierungen der vorliegenden Erfindung mit etwa 0,01 μg/kg bis etwa 100 mg/kg pro Tag verabreicht. Vorzugsweise von 0,1 bis 0,3 μg/kg. Zusätzlich dazu können, wie nach dem Stand der Technik bekannt ist, Anpassungen aufgrund des Alters und des Körpergewichts, des allgemeinen Gesundheitszustands, des Geschlechts, der Ernährung, der Verabrechungszeit, aufgrund von Wechselwirkungen mit Arzneimitteln und des Schweregrads der Erkrankung erforderlich sein und sind anhand von Routineversuchen vom Fachmann festzusetzen. Typischerweise verabreicht der Kliniker Neurotrophin-Formulierungen der Erfindung solange, bis eine Dosierung erreicht wird, welche die Neuronenfunktion wiederherstellt, erhält und im Optimalfall neu aufbaut. Der Fortschritt dieser Therapie ist anhand von herkömmlichen Tests leicht zu beobachten.
Neurotrophin wird gegebenenfalls mit anderen neurotrophen Faktoren kombiniert oder zusammen mit diesen verabreicht, unter anderem mit NGF, NT-4/5, NT-3 und/oder BDNF, und wird zusammen mit anderen herkömmlichen Therapien bei Nervenerkrankungen verwendet.
Im Fall von NGF umfasst eine Zusammensetzung vorzugsweise eine pharmazeutisch wirksame Menge an Nervenwachstumsfaktor und einen pharmazeutisch annehmbaren, acetathältigen Puffer. Die Zusammensetzung kann einen pH von 5 bis 6 aufweisen. Bei dem Puffer handelt es sich vorzugsweise um Natriumacetat. Die Acetatkonzentration liegt vorzugsweise bei 0,1 bis 200 mM. Die Zusammensetzung besitzt vorzugsweise eine NGF-Konzentration von 0,07 bis 20 mg/ml. Die Zusammensetzung enthält gegebenenfalls weiters ein pharmazeutisch annehmbares Konservierungsmittel, wie z.B. Benzylalkohol, Phenol, m-Cresol, Methylparaben oder Propylparaben. Das Konservierungsmittel ist vorzugsweise Benzylalkohol. Die Benzylalkoholkonzentration liegt vorzugsweise bei 0,1 bis 2,0 %. Die Zusammensetzung kann gegebenenfalls ein pharmazeutisch annehmbares Tensid enthalten. Weiters kann die Zusammensetzung gegebenenfalls, jedoch bevorzugterweise, eine physiologisch annehmbare Konzentration an Natriumchlorid enthalten. Eine stärker bevorzugte Zusammensetzung enthält Nervenwachstumsfaktor in einer Konzentration von zumin dest etwa 0,1 mg/ml und eine Acetat-Zonenkonzentration von 10 mM bis 50 mM. Noch stärker bevorzugt wird es, wenn die Zusammensetzung Nervenwachstumsfaktor in einer Konzentration von 0,1 bis etwa 2,0 mg/ml sowie Acetationen in einer Konzentration von 10 mM bis 50 mM enthält. Eine am meisten bevorzugte Zusammensetzung enthält NGF in einer Konzentration von 0,1 mg/ml, eine Natriumacetatkonzentration von 20 mM, pH 5,5, eine Natriumchloridkonzentration von 136 mM sowie Benzylalkohol mit 0,9 Vol.-%.
Eine weitere Ausführungsform enthält eine NGF-Konzentration von 2,0 mg/ml, eine Natriumacetatkonzentration von 10 mM, pH 5,5, und eine Natriumchloridkonzentration von 142 mM. Eine Formulierung von NGF mit 0,1 mg/ml, 20 mM Natriumacetat, 136 mM Natriumchlorid, 0,9 Vol.-% Benzylalkohol mit einem pH von 5,5 wird bevorzugt. Wie hierin beschrieben, ist das 118/118-Homodimer eine bevorzugte Form von NGF. NGF wird mit einem pH von etwa 6 bis 8 gereinigt, um die normale Dimerform zu erhalten. Der Prozentsatz an (proteolytisch) beschnittenen Formen stellt jedoch monomere Formen dar, die sichtbar werden und mittels Umkehrphasen-HPLC bestimmt werden können. Die Säurebedingungen der analytischen HPLC dissoziieren die Dimere. Über die Existenz verschiedener dimerer Formen von NGF – 120/120, 120/118, 118/118 etc. – gibt es bereits Publikationen (Schmelzer et al., J. Neurochem. 59, 1657–1683 (1992), hierin in seiner Gesamtheit spezifisch durch Verweis aufgenommen, hauptsächlich aufgrund seiner analytischen und Bio-Tests, die in den aktuellen Studien verwendet wurden, sowie aufgrund seiner allgemeinen Lehren). Diese Publikation berichtete darüber, dass die In-vitro-Aktivitäten bei jeder dimeren Form dieselben waren. Im Gegensatz dazu zeigen die vorliegenden Studien hierin unter Verwendung eines Tests auf Radiorezeptorbasis zum ersten Mal, dass das 120/120-Dimer weniger aktiv als, etwa 80–90 % so aktiv wie, die 118/118-Spezies ist. In einer Form des Tests werden Ratten-PC-12-Zellmembranen isoliert und zur kompetitiven Bindung zwischen NGF-Standard- und den verschiedenen Test-Spezies verwendet. Der RRA besitzt sowohl P75- als auch trkA-Rezeptoren. Hierin wurde ebenfalls herausgefunden, dass die 117/117-Spezies genauso aktiv ist wie die 118/118-Spezies. Weiters bestätigte die hierin enthaltene Verwendung eines PC-12-basierten Tests das Resultat des Tests auf Rezeptorbasis und zeigte, dass die 120/120-Form zu etwa 60 % so aktiv ist wie die 118/118-Form. Burton et al., Neurochem. 59, 1937–1945 (1992), ist hauptsächlich aufgrund seiner analytischen und Bio-Tests, die in den aktuellen Studien verwendet wurden, sowie aufgrund seiner allgemeinen Lehren ebenfalls hierin in seiner Gesamtheit spezifisch durch Verweis aufgenommen.
Von der 118/118-Form wird angenommen, dass sie bei menschlichen Patienten eine größere Bioverfügbarkeit aufweist als die 120/120-Form. Dieser Unterschied ist angesichts des Stands der Technik signifikant, überraschend und unerwartet.
Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung und sind nicht als Einschränkung zu sehen. Die Offenbarungen aller Zitate in der Beschreibung sind hierin ausdrücklich durch Verweis aufgenommen.
BEISPIELE
Beispiel I. Reinigung von 118/118-NGF-Homodimer
Dieses Beispiel veranschaulicht die Reinigung von NGF und die Erklärung für jeden Schritt. Wie in jedem der Beispiele kann ein Fachmann Säulendimensionen und Durchflussgeschwindigkeiten leicht bestimmen und anpassen, um für anfängliche Kulturvolumenmengen und Proteinkonzentrationen zu kompensieren, wie nach dem Stand der Technik wohlbekannt ist.
Geerntete Zellkulturflüssigkeit
Eine rekombinante CHO-Zelle wurde mit einem Expressionsvektor transfiziert, der die für menschliches NGF mit einer Länge von 120 Aminosäuren kodierende DNA-Sequenz enthielt. Um die Sekretion und die Verarbeitung zu fördern, war die NGF-Prä-Pro-Sequenz ebenfalls vorhanden. Nach dem Züchten der rekombinanten CHO-Zellen wurde das Zellkulturmedium geerntet. Die Geerntete Zellkulturflüssigkeit (HCCF) enthielt die NGF-Spezies 120, 118 und 117. Etwa 40–70 % des NGF waren typischerweise ein 118/118-Homodimer, die verbleibenden waren Heterodimere 120/118, 120/120 sowie eine kleine Menge an 118/117. Wie hierin gelehrt wird, können diese Spezies mittels SP-Sepharose-HP-Säule getrennt werden.
Geerntete Zellkulturflüssigkeit wurde unter Verwendung von Millipore-10-Kd-Cutoff-Membranen (es wurden entweder Zellulose, Verbundstoff oder Polysulfon austauschbar verwendet) etwa 20fach konzentriert. Zu dem Konzentrat wurden 0,1 Volumeneinheiten 1,0 M Tris, pH 8,2, hinzugefügt. Das verdünnte Material wurde unter Verwendung eines 0,22-μm-Filters mikrofiltriert und bei 37 °C für eine Zeitspanne von 2 bis 18 Stunden in einen Aufbewahrungsbehälter transferiert. Die Umwandlung von der 120/120-Form zu der 118/118-Form wird während der Aufbewahrung durch eine endogene Protease katalysiert.
Silicagel-Chromatographie
Das Mikrofiltrat wurde auf 1 M NaCl angepasst und auf eine Silicagel-Säule aufgebracht, die in 1 M NaCl, 25 mM MOPSO, pH 7, äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit 1 M NaCl, 25 mM MOPSO, pH 7, gewaschen. Ein geeigneter pH-Bereich liegt etwa bei einem pH von 6 bis 8, wobei ein pH von 7 bevorzugt wird. Die Säule wurde anschließend mit 25 mM MOPSO, pH 7, gewaschen. Ein Waschschritt mit geringer Leitfähigkeit entfernt Wirtszellenproteine. Gebundener NGF wurde mit 50 mM MOPSO, 0,5 M TMAC, 20 % wasserfreiem Alkohol (94–96 % Speziell Denaturierte Alkohol-Formel 3A (5 Volumeneinheiten Methanol und 100 Volumeneinheiten 200-Proof-Ethanol) und 4–6 % Isopropanol) eluiert. Andere Alkohole können verwendet werden, wie z.B. 20 % Propanol, 20 % Isopropanol und 20 % Methanol. Wie hierin verwendet, werden die Begriffe „Alkohole" und „alkoholische Lösungsmittel" im Sinne der normalerweise für Alkohol verwendeten Terminologie verwendet, vorzugsweise handelt es sich um Alkohole mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, noch bevorzugter um Methanol, Ethanol, Isopropanol, n-Propanol oder t-Butanol und noch bevorzugter Ethanol oder Isopropanol. Solche Alkohole sind Lösungsmittel, die bei Addition zu wässriger Lösung die Hydrophobie der Lösung durch Verringern der Lösungspolarität steigern. Ethanol wird am stärksten bevorzugt. Der untere Alkoholgrenzwert ist jener beliebige Prozentsatz, der eluiert wrd, und der obere Grenzwert wird durch die Notwendigkeit, eine Proteindenaturierung zu vermeiden, festgesetzt. Das Lösungsmittel liegt vorzugsweise bei 5 % bis 25 %, noch bevorzugter bei 5 % bis 20 %, noch bevorzugter bei 5 % bis 15 %. TMAC ist Tetramethylammoniumchlorid, das vorhanden ist, um NGF zu eluieren. TMAC kann sich in einem Bereich von 0,1 bis 1 M befinden. Dabei wird der Bereich von 0,3 bis 0,7 M stärker bevorzugt. Die Menge von TMAC, die verwendet wird, um NGF zu eluieren, ist eine Funktion von pH und Alkholkonzentration. Je niedriger der pH ist, desto geringere Mengen an Alkohol und TMAC werden benötigt. Der pH kann zwischen einem pH von 4 bis 8 liegen. In diesem Beispiel wird ein pH von 7 bevorzugt, der eine minimale Anpassung der gepoolten Fraktionen vor dem Laden auf die nächste Säule ermöglicht. Der obere pH-Grenzwert wird durch den pH bestimmt, der notwendig ist, um die nächste Säule zu beladen, während der untere Grenzwert durch jenen bestimmt wird, der nützlich ist, um NGF wirksam zu eluieren.
S-Sepharose-Fast-Flow-Chromatographie
Der NGF-hältige Eluent wurde gepoolt, mit gereinigtem Wasser auf eine Leitfähigkeit von weniger als 15,5 ms/cm verdünnt, und der pH wurde auf 7,0 angepasst. Das Material wurde nicht länger als 8 Stunden gehalten, da immer noch mehrere Proteasen vorhanden waren; es wurde jedoch keine Aktivität der endogenen Protease beobachtet, die 120-Aminosäure-NGF in die 118-Form umwandelt. Das Material wurde auf eine S-Sepharose-Fast-Flow-Chromatographie-Säule aufgebracht (ein Kationenaustauschharz S-SEPHAROSE^TM-Agarose-Fast-Flow^TM (Pharmacia)), in 25 mM MOPSO, pH 7, äquilibriert. Die Säule wird mit 25 mM MOPSO, pH 7, gewaschen. Ein geeigneter pH-Bereich liegt bei von etwa einem pH von 6 bis 8, wobei ein pH von 7 bevorzugt wird. Anschließend wurde die Säule mit 0,16 M NaCl, pH 7, gewaschen. Der gebundene NGF wurde mit 0,5 M NaCl, pH 7, eluiert. Die Elutionssalzmolarität kann sich in einem Bereich von 0,3 bis 1,0 M befinden, noch bevorzugter von 0,4 bis 0,6 M. Der untere Grenzwert wird durch den Nutzen in der Elution des gesamten NGF festgesetzt, und der obere Grenzwert wird durch die Notwendigkeit festgelegt, zu verhindern, Verunreinigungen zu entfernen und hydrophobe Wechselwirkungen auf der Säule hervorzurufen, die die Elution von NGF stören könnten. Andere Salze können verwendet werden, wobei KCl eine bevorzugte Alternative ist. Die Elution mit 0,5 M NaCl, pH 7, wird bevorzugt, um einen Pool mit einem geringen Volumen zu erhalten. Bei höheren Salzkonzentrationen, z.B. über 1 M, können eng gebundene Verunreinigungen eluieren.
Phenol-Toyopearl-650M-Chromatographie
SSFF-Säulenfraktionen, die NGF enthielten, wurden gepoolt, auf 1 M NaCl angepasst und auf eine Phenyl-Toyopearl-650M-Säule aufgebracht. Die Säule wurde mit 25 mM MOPSO, pH 7, gewaschen. Ein geeigneter pH liegt im Bereich von etwa einem pH von 5 bis 8. Der gebundene NGF wurde mit einem linearen 10-CV- (Säulenvolumeneinheit-) Gradienten eluiert, der mit Gradientenpuffer A (25 mM MOPSO, pH 7, 1,0 M NaCl) begann und mit Gradientenpuffer B (20 % Alkohol in 80 % 25 mM MOPSO, pH 7) endete. Fraktionen, die NGF enthielten, wurden mittels SDS-PAGE-Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert, um zu bestimmen, welche Fraktionen die Vorläufer-NGF-Spezies in sich trugen. Fraktionen, die NGF in sich trugen, wurden selektiert und gepoolt, um primär inkorrekt verarbeitete Varianten zu entfernen, wie z.B. jene, in denen eine partielle Vorläufersequenz vorhanden ist, z.B. Vorläufer-NGF-, Hybrid-Vorläufer-NGF- sowie beschnittene Vorläufer-NGF-Sequenzen, um eine NGF-Zusammensetzung zu erhalten, die im Wesentlichen frei von beliebigen NGF-Vorläufersequenzen ist. Die Phenylsäule entfernte auch die geringe Menge an gkykosylierten NGF- und glykosylierten NGF-Vorläufersequenzen. Die Vorläufer- und die beschnittenen Vorläufer-NGF-Sequenzen zusammen mit den glykosylierten Formen von sowohl NGF als auch Vorläufer-NGF eluierten in der linken Kante des NGF-Peaks. Daher trennte diese Säule NGF leicht von verschiedenen NGF-Spezies, um eine NGF-Zusammensetzung zu erhalten, die im Wesentlichen frei von diesen Spezies ist. In diesem Schritt wurden variierende hydrophobe NGF-Varianten, hauptsächlich fehlverarbeitete Varianten, unter anderem proteolytische und glykosylierte Varianten, unter Verwendung einer HIC getrennt.
Die am besten geeigneten Medien zum Trennen von NGF-Formen waren jene mit immobilisierten funktionalen Phenylgruppen. Phenylbasierte HIC-Medien von verschiedenen Lieferanten zeigten eine unterschiedliche Wirksamkeit zum Auflösen dieser NGF-Formen. Die besten Resultate wurden mit Phenyl-Toyopearl-Medien von TosoHaas erhalten. Auch mit den HIC-Harzen Phenyl-Sepharose-Fast-Flow-Low-Sub (geringe Substitution) und TSK-Phenyl-5PW wurden gute Resultate erzielt. Andere funktionale HIC-Gruppen waren weniger geeignet und weniger wirksam unter diesen Bedingungen, unter anderem die Alkoxy-, Butyl- und Isoamyl-Gruppierungen.
Der Phenyl-Toyopearl-Pool enthielt 75 % 118-, 10 % 120-, 7% 117-, 1,8 % desamidierten NGF, 1,4 % oxidierten NGF und 2,0 % Isoasp-NGF, wobei die verbleibenden 2,8 % andere unidentifizierte NGF-Spezies waren.
Gegebenenfalls wurden die gepoolten Fraktionen für ein Minimum von 15 Minuten säurebehandelt, um eine virale Deaktivierung bei einem pH von weniger als 3,95 zu erhalten.
SP-Sepharose-HP-Chromatographie
Der HIC-Pool wurde mit 0,5 bis 1 Volumeneinheiten Wasser verdünnt, und der verdünnte Pool wurde auf einen pH von 6 angepasst. Der Pool wurde auf eine SP-Sepharose-HP-Säule geladen, die mit 0,2 M Natriumchlorid, 20 mM Succinat, pH 6, enthaltend 5 % Reagensalkohol (wie im Silicagel-Säulenschritt), äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit 0,2 M NaCl, 20 mM Succinat, pH 6, enthaltend 5 % Reagensalkohol (Formel SDA-3A-Alkohol; der Alkohol ist gegebenenfalls vorhanden), gewaschen. Alkohol hilft, nicht spezifische (meist hydrophobe) Wechselwirkungen von NGF mit der Harz-Hauptkette zu reduzieren. Ein geeigneter Alkoholbereich liegt bei etwa 0 bis 10 %. Der Ladungs-pH liegt bei einem pH von etwa 5 bis 8, der ausgewählt wird, um maximale Stabilität von NGF sowie die Trennung von NGF-Varianten zu erreichen und beizubehalten. Die Säule wurde mit zwei Säulenvolumeneinheiten Äquilibrierungspuffer gewaschen. Gebundener NGF wurde eluiert und von Varianten durch einen linearen 22-Säulenvolumeneinheiten-Gradienten durch das Mischen von 11 Säulenvolumeneinheiten von Gradientpuffer A (0,25 M NaCl, 0,02 M Succinat, pH 6, enthaltend 5 % Alkohol) und 11 Säulenvolumeneinheiten von Gradientpuffer B (0,5 M NaCl, pH 6) getrennt. Der Alkohol ist optional. Der 118/118-NGF wird typischerweise bei 0,35 M bis 0,40 M NaCl-Konzentration eluiert.
Die Säulenfraktionen wurden auf den Gehalt von NGF und NGF-Varianten analysiert. Fraktionen wurden vorzugsweise mittels C4-RP-HPLC analysiert, wie von Schmelzer et al. (1992), s.o., und Burton et al. (1992), s.o., beschrieben. Fraktionen wurden ausgewählt und gepoolt, um eine Zusammensetzung von NGF zu erhalten, die im Wesentlichen frei von modifizierten NGF-Varianten war, z.B. geladene Spezies, wie z.B. oxidierte, desamidierte und Isoasp-NGF-Spezies. Die vorangehende HIC-Säule kann andere Formenvarianten von NGF, wie z.B. oxidierten und Isoasp-NGF, nicht wirksam entfernen. Die HIC-Säule entfernt fehlgefaltete und glykosylierte Proteine wirksam, die enger an das HIC-Harz binden als korrekt gefalteter NGF, da sie tendenziell hydrophober sind. Dementsprechend wurde das Kationenaustauschharz, z.B. SP-Sepharose-HP, verwendet, um veränderte Ladungsvarianten zu entfernen, die nicht durch das HIC-Harz entfernt wurden.
Der SP-Sepharose-Pool enthielt typischerweise etwa 92 % 118-, 4,6 % 120-, 1 % desamidierten NGF, 1 % oxidierten NGF und 1 % Isoasp-NGF. Routinemäßig reicht die Menge jeder Spezies von etwa 85 bis 93 % für 118-, 0 bis 5 % für 120-, 0 bis 5 % für 117-, 0 bis 3 % für desamidierte Formen, 0 bis 2 % für Isoasp-Formen und 0 bis 2 % für oxidierte Formen. Die Reinheit von NGF (alle Spezies) lag routinemäßig bei mehr als 99,5 %.
Formulierung
Der SP-Sepharose-HP-Pool wurde durch Ultrafiltration/Diafiltration zur Formulierung in einen Formulierungspuffer hergestellt. Es wird vorzugsweise ein saurer Puffer verwendet, vorzugsweise Acetat mit einem pH von 5, wie oben stehend beschrieben. Die 118/118-NGF-Zusammensetzung ist im Wesentlichen frei von NGF-Varianten und ist im Wesentlichen reiner NGF. Das formulierte Material ist zur Behandlung neuronaler Erkrankungen geeignet, besonders von peripherer Neuropathie, die mit Diabetes assoziiert ist, sowie von peripherer sensorischer Neuropathie, die mit AIDS assoziiert ist.
Beispiel II. Reinigung von 120/120-NGF-Homodimer in großem Ausmaß
Geerntete Zellkulturflüssigkeit
HCCF wurde, wie in Beispiel I beschrieben, aus einer 12.000-Liter-CHO-Zellkultur erhalten. Die NGF-Speziesverteilung in der HCCF lag bei etwa 40–65 % 120/120-Homodimer mit 120/118-Heterodimer, wobei die verbleibenden 118/118-Homodimere waren. Das Medium wurde typischerweise schnell verarbeitet, um die proteolytische Umwandlung von 120 in 118 zu minimieren.
Macroprep-High-S-Kationenaustauschchromatographie
Die HCCF wurde auf eine Macroprep-High-S-Kationenaustauschchromatographiesäule geladen, mit 1,5 M Natriumacetat, 50 mM HEPES, pH 7, gewaschen. Gebundener NGF wurde mit 1,5 M NaCl, 0,25 M TMAC, 0,2 % Thiodiglykol, pH 7, eluiert. Die Macroprep-Säule kann bei einem pH von 5 bis 8 mit einer Anpassung der Acetatkonzentration laufen gelassen werden. Chlorid ist ein bevorzugtes Substitut für Acetationen. Der NGF eluierte aufgrund des TMAC-Gradienten. TMAC ist ein Salz mit sowohl ionischem als auch hydrophobem Charakter, was eine nützliche Eigenschaft ist, da das Gerüst mancher Harze einen hydrophoben Inhalt besitzt, der unspezifische Wechselwirkungen zwischen NGF und dem Harz fördert. Typischerweise ist für einen Elutionspuffer mit einem pH von etwa 6 bis 8 eine TMAC-Konzentration von 0–3 M nützlich. Fraktionen, die NGF enthielten, wurden gepoolt.
Silicagel-Chromatographie
Der Pool wurde direkt auf eine Silicagel-Chromatographiesäule aufgebracht. Silica stellt ein Mischmodus-Chromatographieharz mit ionischen, Polaritäts- und hydropho ben Wechselwirkungen bereit, die bezüglich der Proteinbindungseigenschaften eine Rolle spielen. Die Säule wurde in 1 M NaCl, 25 mM MOPSO, pH 7, äquilibriert. Die Säule wurde mit 1 M NaCl, 25 mM MOPSO, pH 7, (vorzugsweise etwa pH 5,0 bis 8,5, noch bevorzugter pH 6 bis 8, und insbesondere pH 7) gewaschen. Gebundener NGF wurde mit 25 mM Succinat, pH 3,9, 50 mM TEAC (Tetraethylammoniumchlorid) eluiert. TEAC ist ein stärkerer Eluent als TMAC. Der pH liegt vorzugsweise in einem Bereich von 3,5 bis 8. Ein pH über 7,5 über ausgedehnte Zeitspannen sollte jedoch vermieden werden, um die Bildung der desamidierten NGF-Spezies zu verhindern oder zu reduzieren. Allgemein kann gesagt werden, dass je niedriger der pH des Puffers ist, desto niedriger ist die Konzentration des Salzes mit gemischten Eigenschaften, z.B. TMAC oder TEAC, das erforderlich ist, um NGF aus der Silicasäule zu eluieren. Puffer mit einer guten Pufferkapazität mit einem pH im Bereich von 4 bis 5 sind zur Verwendung geeignet. Die Gegenwart von Salz im Elutionspuffer ist optional, so dass die Säule vor dem Auftragen des Elutionspuffers mit einem MOPSO-Puffer ohne Salz gewaschen werden kann.
Phenyl-Sepharose-Fast-Flow-Chromatographie
Die NGF-hältigen Fraktionen wurden identifiziert und gepoolt. Der Pool wurde auf 0,7 M Acetat, pH 7, 25 mM MOPSO, angepasst. Der angepasste Pool wurde auf eine Phenyl-Sepharose-Fast-Flow-Chromatographiesäule geladen, die mit Gradientenpuffer A (0,7 M Acetat, 25 mM MOPSO, pH 7) äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit einem Gradienten von 90 % Gradientenpuffer A (0,7 M Acetat, 25 mM MOPSO, pH 7) zu 10 % Gradientenpuffer B (25 mM MOPSO, pH 7, 20 % Propylenglykol) gewaschen. Andere Glykole können substituiert werden, wie z.B. Hexylenglykol. Typischerweise lag der Waschschritt bei etwa 2 bis 3 CV oder bis eine stabile Grundlinien-OD erreicht wurde. Der Waschschritt entfernte manche Wirtszellenproteine. Gebundener NGF wurde mit einem linearen 10-CV-Gradienten aus einem Gemisch von 90 % Gradientenpuffer A und 10 % Gradientenpuffer B zu einem Gemisch aus 10 % Gradientenpuffer A und 90 % Gradientenpuffer B eluiert. NaCl- oder Natriumsulfat kann in den HIC-Puffern als Substitut für Acetat verwendet werden. Der pH liegt vorzugsweise bei einem pH von 5 bis 8, noch bevorzugter von 5,5 bis 7,5, wobei ein pH von 6 bis 8 annehmbar ist, und besonders bevorzugt liegt er bei etwa 7. Die Säule trennte etwaige verbleibende Vorläufersequenzen, partielle Vorläufersequenzen oder glykosylierte Formen, die als ein Homodimer oder als ein Heterodimer eines reifen NGF-Monomers und eines NGF-Monomers vorhanden waren, in dem noch ein Teil der Vorläufersequenz vorhanden war. Die Vorläufer- und glykosylierten Formen von NGF sind in der linken Kante des Elutions-Peaks vorhanden, so dass NGF-hältige Faktoren gepoolt wurden, um diese Spezies im Wesentlichen auszuschließen.
Der HIC-Pool enthielt etwa 72 % 120-Monomer, 17 % 118-Monomer, 2,8 % 117-Monomer, 3,6 % R120-Monomer, 0,8 % Isoasp-Formen, 1,3 % oxidierte Formen und 1 % desamidierte Formen, wie auf einem analytischen HPLC-System getrennt detektiert wurde.
SP-Sepharose-HP-Chromatographie
NGF-hältige Fraktionen aus dem HIC-Schritt wurden gepoolt. Auf breiter Ebene wurde dies durch das Leiten des ablaufenden Säulenmediums zum richtigen Zeitpunkt in einen Pool-Behälter (Aufbewahrungsbehälter) erreicht. Der pH des Pools wurde auf einen pH von 6 angepasst und auf eine SP-Sepharose-HP-Chromatographie-Säule aufgebracht. Die Säule wurde mit 20 mM Succinat, 0,2 M NaCl, pH 6 (Gradientenpuffer A), gewaschen. Der gebundene NGF wurde mit einem 22-CV-Gradienten eluiert, beginnend mit einem Gemisch aus 70 % Gradientenpuffer A und 30 % Gradientenpuffer B auf ein Endgemisch von 80 % Gradientenpuffer B (0,7 M NaCl/pH 6) und 20 Gradientenpuffer A. Der pH liegt vorzugsweise bei einem pH von 5 bis 8, noch bevorzugter bei einem pH von 5,7 bis 6,5 und insbesondere bei einem pH von 6. Ein repräsentatives Chromatogramm wird in 1 dargestellt.
Der SP-Sepharose-HP-Pool enthielt routinemäßig etwa 95 % 120-Form, 3 % R120-Form, 0,65 % Isoasp-Form, 0,6 % oxidierte Form, 0,6 % desamidierte Form. Andere unidentifizierte NGF-Formen lagen bei etwa 0,6 % und umfassten di-oxidierten NGF (Met 37 und Met 92) mit einem vorhandenen desamidierten Asn45. Eine HPIEX- Analyse, die einen repräsentativen HIC-Pool (auf das SP-Sepharose-Harz geladen), und den Pool, der nach der SP-Sepharose-Chromatographie erhalten wurde, vergleicht, ist in 2 dargestellt. Jede der drei beschnittenen Haupt-Formen von NGF, 120, 118 und 117, kann Varianten aufweisen, die Varianten, wie z.B. oxidierte und Isoasp-Formen, der vorwiegend beschnittenen Form (120 in diesem Beispiel) können jedoch während einer Reinigung eine Analyse der Varianten aus den weniger prädominanten Formen (in diesem Beispiel 118 und 177) maskieren. Eine HPLC-Analyse von Fraktionen aus einem repräsentativen Druchgang ist in 3 dargestellt.
Die SP-Sepharose-HP entfernte wirksam Varianten, die im HIC-Pool vorhanden waren. Die R120-Form besitzt einen zusätzlichen Arginin-Rest am N-Terminus von NGF; normalerweise ist die N-terminale Aminosäuresequenz von rhNGF SSSHP, R120 besitzt jedoch RSSSHP als N-terminale Sequenz. Daher ist die R120-Form stärker basisch als reifer NGF und wurde mittels SP-SHP getrennt. Sie besitzt auch eine geringere Bioaktivität, wahrscheinlich in Zusammenhang mit der Tatsache, dass der NGF-N-Terminus für die Rezeptor-(trkA-)Bindung erforderlich ist. Die oxidierte NGF-Form ist eine mono-oxidierte Form, bei der das Methionin an Position 37 oxidiert ist, was eine stärker sauere Form ergibt, die an der linken Kante des NGF-Peaks eluiert. Die Isoasp-Form enthält eine Modifikation der Asparaginsäure an Aminosäure 93. Die Isoasp-Form ist etwas stärker basisch und bindet daher etwas enger an das SP-Sepharose-HP-Harz. NGF-Spezies, die isoAsp93 enthielten, eluierten in der rechten Kante des Elutions-Peaks. Die Desamidierung tritt an Asparagin-Resten auf, typischerweise an Asparagin bei Position 45. NGF, der desamidiertes Asn enthält, das ein Asp an Position 45 ergibt, ist etwas stärker sauer und tritt an der linken Kante des Elutions-Peaks auf.
Fractogel-EMD-SO3 ist ein weniger bevorzugtes, alternatives Harz zum SP-Sepharose-HP-Harz zum Trennen geladener Varianten der NGF-Spezies. Bei der Verwendung dieses weniger bevorzugten Harzes werden höhere Konzentrationen an NaCl benötigt, um NGF zu eluieren.
Formulierung
Das Rohmaterial wurde mittels UF/DF zu einem Formulierungspuffer formuliert, wie im vorangehenden Beispiel beschrieben. Im finalen Rohprodukt lag die 120-Form routinemäßig im Bereich von 92 bis 97 %, die R120-Form von etwa 1 bis 4 %, die Isoasp-Form von etwa 0,2 bis 1,5 %, die oxidierte Form von etwa 0,2 bis 2 % und die desamidierte Form von etwa 0,2 bis 2 % vor. Die 117- und 118-Formen waren routinemäßig weniger als etwa 2 %. Das finale Rohprodukt war routinemäßig zumindest 99,5 % reiner NGF (umfassend alle Spezies).
Beispiel III. Isolation von 118/118
In einer bevorzugten Ausführungsform wurde das Verfahren aus Beispiel II mit den folgenden Modifikationen angewandt, um eine im Wesentlichen reine 118/118-NGF-Zusammensetzung zu erhalten, die im Wesentlichen frei von NGF-Varianten ist. Eine immobilisierte Trypsin-Säule wird zwischen der Macroprep-High-S-Säule und der Silica-Säule verwendet. Der Macroprep-Pool wird direkt auf die immobilisierte Trypsin-Säule geladen, nachdem der pH, falls notwendig, auf zwischen etwa 5 bis 8,5, typischerweise 6,5 bis 7,5, angepasst wurde. Der Pool wurde durch die Säule geleitet, wobei während dieser Zeit das meiste des NGF in die 118-Form umgewandelt wurde. Der Protease-Verdau wandelt die 120-Form mittels Spaltung des C-terminalen VRRA in VR in die 118-Form um. Um die eingeschränkte und selektive Spaltung zu erreichen, wird eine Trypsin- oder trypsinartige Protease verwendet, vorzugsweise Trypsin, noch bevorzugter das leicht erhältliche Schweine-Trypsin, oder alternativ dazu Rinder-Trypsin oder ein rekombinantes Trypsin. Ein beliebiges proteolytisches Verfahren, das im Wesentlichen eingeschränkte und selektive Spaltung bereitstellt, kann verwendet werden, es wird jedoch eine Säule mit immobilisiertem Trypsin bevorzugt, um die Verunreinigung des NGF-Präparats zu minimieren. Die Säule wird bei einem pH laufen gelassen, der für die Protease-Aktivität förderlich ist, vorzugsweise ein pH von 5,5 bis 8,5, noch bevorzugter 6,0 bis 8,0 und insbesondere 6,5 bis 7,5.
In diesem Beispiel wurde glykosylierter NGF, wie hierin beschrieben, mittels HIC entfernt. Nach einem SP-Sepharose-HP-Schritt, wie hierin in Beispiel II beschrieben, jedoch vorzugsweise unter Verwendung einer 22-Säulenvolumeneinheit von 0,3 M bis 0,55 M Salzgradient, wurde eine bevorzugte Zusammensetzung von NGF zur klinischen Verwendung erhalten. Eine Zusammensetzung von mehr als 70 % 118-Monomer, weniger als 10 % 120-Monomer und weniger als 15 % 117-Monomer, wie mittels RP-HPLC-Tests bestimmt, kann erhalten werden. Typischerweise werden Zusammensetzungen erhalten, die größer als oder gleich 90 % 118/118-rhNGF sind, noch häufiger größer als oder gleich 93 % 118/118-rhNGF mit weniger als oder gleich etwa 7 % desamidiertem isoAsp und oxidierten Varianten. Ein Mittel zum Erreichen einer höheren Reinheit ist das Vermeiden des Selektierens von Fraktionen mit signifikanten Variantenmengen, wie sie z.B. in den linken oder rechten Kanten des Haupt-Neurotrophin-Peaks, z.B. 118/118-rhNGF-Peak, zu finden sind.
Beispiel IV. Partielle Reinigung und Umfaltung von rhNT-4/5 aus bakteriellen Einschlusskörpern
In diesem Beispiel wurde rhNT-4/5 beginnend mit einer 10- oder 60-Liter-Fermentierung gereinigt. Der Wirt, der verwendet wurde, um rekombinantes menschliches rhNT-4/5 in der Fermentation, wie in diesem Beispiel beschrieben, zu produzieren, war ein E.-coli-Stamm, der 27C7/pmNT5DT genannt wurde; obwohl rhNT-4/5, das von anderen Stämmen und Organismen produziert wurde, für das hierin beschriebene Reinigungsverfahren geeignet ist. Das in diesem Beispiel verwendete Expressionsplasmid enthielt die reife, für NT-4/5 kodierende Sequenz unter Transkriptions- und Translations-Kontrollsequenzen, die für die Expression des NT-4/5-Gens in E. coli erforderlich waren. In dem NT-415-exprimierenden Plasmid wurden die für die Expression des Gens in E. coli verwendeten Transkriptionssequenzen durch die alkalische-Phosphatase-Promotorsequenz bereitgestellt. Der λ-Transkriptionsterminator befand sich neben dem NT-4/5-Terminationscodon. Die Sekretion des Proteins aus dem Zytoplasma wurde durch die STII-Signalsequenz gesteuert. Die Mehrheit an rhNT-4/5 war im periplasmatischen Zellraum als refraktile Körper zu finden. Das Plasmid verlieh dem transformierten Wirt Tetrazyklinresistenz. Der Fermentations- Prozess wurde bei 35 °–39 °C und einem pH von 7,0 bis 7,8 durchgeführt. Die Fermentation wurde für 25–40 Stunden fortgeführt, wobei die Kultur zu dieser Zeit vor der Ernte gekühlt wurde. Die Kultur wurde mittels 5- bis 15-minütiger Hitzebehandlung unter Verwendung einer Durchflussvorrichtung bei 60 °C oder unter Anwendung einer Hitzedeaktivierung im Tank bei dieser Temperatur deaktiviert. Die hitzedeaktivierte Kultur wurde unter Verwendung einer AX-Alpha-Laval-Zentrifuge oder einem Äquivalent dieser zentrifugiert. Die E.-coli-Zellen wurden im Pellet gewonnen.
Die E.-coli-Zellen, die rekombinantes menschliches NT-4/5 in Einschlusskörpern exprimierten, wurden mittels Standardverfahren lysiert, um eine Paste herzustellen, die NT-4/5 in Einschlusskörpern enthielt. Im Puffer waren keine Protease-Inhibitoren inkludiert.
Um die Einschlusskörper aus den Zelltrümmern zu isolieren, wurde die E.-coli-NT-5-Paste in 0,02 M Tris, pH 8, 5 mM EDTA (10 ml Puffer/Gramm Paste) unter Verwendung einer mechanischen Rotationsdispersionsvorrichtung, z.B. einem Turrax, resuspendiert. Die Zellsuspension wurde drei Mal bei 6000 psi durch einen Mikroverflüssiger geleitet. Das resultierende Homogenat wurde in einer Sorvall-RC-3B-Zentrifuge bei 5000 U/min für eine Zeitspanne von etwa 45 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, und das Pellet wurde in 20 M Tris, pH 8, 5 mM EDTA (Extraktionspuffer) unter Verwendung eines Turrax für eine Zeitspanne von 2 bis 3 Minuten bei mittlerer Geschwindigkeit resuspendiert. Das Homogenat wurde, wie oben stehend beschrieben, zentrifugiert. Das Pellet wurde in Extraktionspuffer resuspendiert und, wie oben stehend beschrieben, zentrifugiert. Das/Die resultierende(n) Pellet(s) (als NT-4/5-Einschlusskörper oder refraktile Körper bezeichnet) wurde(n) bei –70 °C gelagert.
NT-4/5 wurde folgendermaßen aus den Einschlusskörpern isoliert. Die Einschlusskörper-Pellets wurden in 20 mM Tris, pH 8, 6 M Harnstoff, 25 mM DTT (10 ml Puffer/Gramm Einschlusskörper) unter Verwendung eines Turrax bei mittlerer Geschwindigkeit für eine Zeitspanne von etwa 10 Minuten suspendiert. Die Suspension wurde 40 Minuten lang bei 2–8 °C gerührt und in einer Sorvall-RC3B-Zentrifuge bei 5000 U/min für eine Zeitspanne von etwa 45 Minuten zentrifugiert. PEI (Polyethylenimin) wurde auf 0,1 % im Überstand hinzufügt, der für eine Zeitspanne von 30 Minuten bei 2–8 °C gerührt wurde. Das PEI präzipitiert Nucleinsäure und andere sauregeladene Moleküle. Das Gemisch wurde in einer Sorvall-RC3B-Zentrifuge bei 5000 U/min für eine Zeitspanne von etwa 45 Minuten zentrifugiert. Der PEI-Überstand wurde auf eine DEFF-Sepharose-Fast-Flow-Säule geladen (10 cm × 14 cm; DEFF ist ein Diethylaminoethyl-Harz), die in 0,02 M Tris, 6 M Harnstoff, 10 mM DTT, pH 8, äquilibriert worden war. Eine äquivalente Menge von 1 kg löslich gemachten, refraktilen Körpern wurde auf die DEFF-Säule geladen. Da reduziertes und denaturiertes NT-4/5 nicht an das DEFF-Harz bindet, wurde der Durchflusspool, der NT-4/5 und 6 M Harnstoff enthielt, gesammelt (6), und der pH des Pools wurde mit Essigsäure auf 5,0 gesenkt. Der pH-angepasste DEFF-Durchflusspool wurde auf eine S-Sepharose-Fast-Flow-Säule geladen (S bezieht sich auf die funktionale SO3-Gruppe auf dem Harz), die in 20 mM Acetat, pH 5, enthaltend 6 M Harnstoff, äquilibriert worden war, wobei NT-4/5 unter diesen Bedingungen an das Harz bindet. Nach dem Beladen wurde die S-Sepharose-Fast-Flow-Säule mit mehreren Säulenvolumeneinheiten Äquilibrierungspuffer gewaschen. Das gebundene NT-4/5 wurde mit 0,5 M NaCl, 20 mM Natriumacetat, 6 M Harnstoff, pH 5, eluiert (7). Der 0,5-M-NaCl-SSFF-Pool wurde über Nacht gegen 20 mM Tris, 0,14 M NaCl, pH 8, dialysiert, Bedingungen, die es NT-4/5 ermöglichen, sich umzufalten, wenn auch auf inkorrekte Art und Weise. Die fehlgefalteten rhNT-4/5-Moleküle aggregierten, um ein Präzipitat zu bilden.
Das aggregierte, fehlgefaltete rhNT-4/5 wurde verarbeitet, um korrekt gefaltetes NT-4/5 zu erhalten. Das aggregierte, fehlgefaltete rhNT-4/5 wurde mittels Zentrifugierung als ein Pellet gesammelt. Das Pellet wurde in 0,2 M Tris, pH 8, 4 M Harnstoff, 5 mM DTT resuspendiert und bei 2–8 °C für etwa 1 bis 2 Stunden oder bis das Pellet aufgelöst war gerührt. Die finale Proteinkonzentration wurde auf etwa 10 mg/ml Protein angepasst, basierend auf dem Extinktionskoeffizienten 1,8 bei 280 nm. Oxidiertes Glutathion wurde zu der löslich gemachten Pelletlösung bis zu einer Endkonzentrati on von 20 mM hinzugefügt, gefolgt von leichtem Rühren bei 2–8 °C für eine Zeitspanne von 15 bis 30 Minuten. Das oxidierte Glutathion reagiert mit den NT-4/5-Sulfhydrylgruppen, um gemischtes NT-4/5-S-Glutathion-Disulfid zu ergeben. Das gemischte NT-4/5-SG-Disulfid wurde in 100 mM Tris, 20 mM Glycin, 15 % PEG-300, 1 M Guanidin-HCl, pH 8,3, auf eine Endkonzentration von 0,1 bis 0,5 mg/ml Protein verdünnt. Um eine korrekte Umfaltung von NT-4/5 zu initiieren, wurde Cystein zum Umfaltungsgemisch in einer Konzentration von 2 bis 4 mM hinzugefügt, gefolgt von einer Belüftung (mittels Hindurchperlen) der Lösung mit Stickstoff oder Helium für eine Zeitspanne von 5 bis 60 Minuten, bevor der Behälter versiegelt wurde, um Sauerstoff auszuschließen. Die Umfaltung von NT-4/5 wurde für 18 bis 24 Stunden bei 2–8 °C fortgeführt.
Alternativ dazu wurde der rhNT-4/5 unter Verwendung der Sulfitolyse folgendermaßen umgefaltet. Die Einschlusskörperpellets (110 g) wurden in 1,1 l 20 mM Tris, 7 M Harnstoff, 10 mM Glycin, 100 mM Natriumsulfit, 10 mM Natriumtetrathiosulfat suspendiert und unter Verwendung eines Turrax bei mittlerer Geschwindigkeit 10 Minuten lang löslich gemacht. Das Gemisch (1260 ml) wurde anschließend 45 Minuten lang bei 2–8 °C gerührt. PEI wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,1 % PEI hinzugefügt. Das Gemisch wurde für weitere 30 Minuten lang bei 4 °C gerührt und 45 Minuten lang bei 5500 U/min in einer RC3B-Zentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde auf eine DEFF-Säule (4,4 cm × 25 cm) geladen, die in 20 mM Tris, 6 M Harnstoff, pH 8, äquilibriert worden war. Der DEFF-Durchfluss wurde mit Essigsäure auf einen pH von 5 angepasst und auf eine S-Sepharose-Fast-Flow-Säule geladen (4,4 cm × 25 cm), die mit 20 mM Acetat, 6 M Harnstoff, pH 5, äquilibriert worden war. Das NT-4/5 wurde mit 25 mM MOPSO, 0,5 M NaCl, pH 7, eluiert.
Der SSFF-0,5-M-Natriumchlorid-Pool, der sulfonyliertes rhNT-4/5 enthielt, wurde auf etwa 0,1 mg/ml Protein verdünnt und auf 1 M Guanidin-Hydrochlorid, 100 mM Tris, 20 mM Glycin, 15 % PEG-300, pH 8,3, angepasst. Die Umfaltung von NT-4/5 wurde durch die Addition von 2 bis 4 mM Cystein initiiert. Die Umfaltungsreaktion war im Wesentlichen innerhalb von 24 Stunden beendet. Eine Belüftung mit einem inerten Gas, z.B. Helium oder Stickstoff, um Sauerstoff aus der Lösung zu ersetzen, kann gegebenenfalls durchgeführt werden.
Bezugsbeispiel V: Isolation von korrekt gefaltetem rhNT-4/5 aus (fehlgefalteten) Konformationsvarianten
Das Umfaltungsgemisch an rhNT-4/5 aus Beispiel IV wurde gegen eine Lösung mit einem pH von 4 bis 5 über Nacht dialysiert, um Guanidin und andere Reagenzien zu entfernen. Um die Lösung zu klären, wurde die Lösung entweder 45 Minuten lang bei 5000 U/min zentrifugiert oder durch einen 0,2-μm-Filter passiert.
Der geklärte Überstand, enthaltend 0,5 bis 5 Gramm Protein, wurde durch die Hinzufügung von Eisessig auf einen pH von 3 bis 5 angepasst und entweder auf eine C4-RP-HPLC-Säule geladen oder bei –20 °C in gefrorenem Zustand gelagert, bis er zur Reinigung bereit war. In diesem Beispiel wurde die angesäuerte und geklärte Lösung auf eine C4-RP-HPLC-Säule (3 cm × 50 cm) geladen, an deren Harz das gefaltete rhNT-4/5 band. Das korrekt gebundene NT-4/5 wurde unter Verwendung eines Acetonitrilgradienten in einem 0,05-Trifluoressigsäure- (TFA-) Lösungsmittelsystem eluiert: ein 26 auf 40 % Acetonitril-Gradient (über eine Zeitspanne von 95 Minuten) in 0,05 % TFA bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 25 ml/min. Fraktionen wurden in Intervallen von 1 bis 1,5 Minuten gesammelt (8). Fraktionen wurden auf korrekt gefaltetes NT-4/5 durch Vergleichen der Elutionszeit auf einer analytischen C4-HPLC-Vydac-Säule (0,21 × 15 cm) mit jener eines korrekt gefalteten NT-4/5-Standards analysiert (9). Dem Standard entsprechend korrekt gefaltetes und intaktes NT-4/5 eluierte typischerweise nach 19 Minuten bei einer Flussgeschwindigkeit von 2,5 ml pro Minute mit einem 0,5-%-TFA/Acetonitril-Puffersystem. Die Fraktionen, die korrekt gefaltetes rhNT-4/5 enthielten, wurden gepoolt, und ihr pH wurde auf einen pH von 5 bis 7 angepasst. Dieser Pool an korrekt gefaltetem rhNT-4/5 enthielt auch carbamylierte und N-terminal beschnittene Formen von NT-4/5.
Das präparative Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographieharz ist vorzugsweise ein Medium mit einem Teilchendurchmesser von etwa 10–40 μm, einer Porengröße von etwa 200–400 Angström und einer C4-, C8- oder einer C18-Alkylgruppe. Noch bevorzugter besitzt das Harz einen Teilchendurchmesser von etwa 15–40 μm und eine Porengröße von etwa 300 Angström und handelt sich dabei um ein C4-Silica-Medium.
Beispiel VI. Eine alternative Isolation von korrekt gefaltetem rhNT-4/5 aus (fehlgefalteten) Konformationsvarianten
Das umgefaltete rhNT-4/5-Gemisch aus Beispiel IV wurde unter Verwendung eines Millipore-Pellicon-Ultrafiltrationssystems mit 20 Quadratfuß Zellulose-Membran (oder Polysulfon-Membran oder einem Äquivalent) mit einem Molekulargewicht-Cut-off von 10 kD etwa 10fach konzentriert. Das konzentrierte Gemisch wurde entweder über Nacht gegen 50 l von 50 mM Acetat, pH 5,5, 50 mM NaCl dialysiert oder vor der Filtration durch eine 0,2-μm-Membran in 50 mM Acetat, 50 mM NaCl, pH 5,5, diafiltriert.
Das filtrierte Umfaltungsgemisch wurde auf 2,5 M NaCl, 20 mM MOPSO, pH 7, angepasst und auf eine HIC-Säule, eine Phenyl-Toyopearl-650M-Säule (10 cm × 19 cm) geladen, die zuvor in 2,5 M NaCl, 20 mM MOPSO, pH 7, äquilibriert worden war. Anschließend wurde die Säule mit Äquilibrierungspuffer gewaschen. Manche fehlgefaltete Formen des rhNT-4/5-Moleküls eluierten in den Durchflussfraktionen, während andere fehlgefaltete Formen bei hohen Konzentrationen organischer Lösungsmittel, wie z.B. 20 bis 40 % Reagensalkohol, eluiert wurden. Das korrekt gefaltete rhNT-4/5 wurde unter Verwendung von 2 M Natriumchlorid, 10 % Reagensalkohol, pH 7, aus der Phenylsäule eluiert (10). Andere Phenylharze, wie z.B. Phenyl-Sepharose, können anstelle des Toyopearl-Rückgrats verwendet werden. Hierin beschriebene Salze, wie z.B. Ammoniumsulfat, Citrat, Acetat und Kaliumchlorid, können verwendet werden. In Abhängigkeit vom verwendeten Salz liegt die Salzkonzentration typischerweise bei 1 M bis 3 M, wobei 2,5 M NaCl zum Laden und 2 M NaCl zur Elution bei Vorhandensein von organischem Lösungsmittel bevorzugt sind. Vorzugsweise wird eine Verringerung der Salzkonzentration verwendet, um ein Neurotrophin und seine Varianten zu eluieren und zu trennen. Um eine Elution zu erreichen, ist die Salzkonzentration im Elutionspuffer typischerweise geringer als im Ladungspuffer, es kann sich jedoch um die gleiche Konzentration handeln, wenn mit organischem Lösungsmittel kompensiert wird. Zusätzlich dazu besitzt die Verwendung von organischem Lösungsmittel einen weiteren Vorteil, wie hierin herausgefunden wurde, nämlich, dass die Hinzufügung eines organischen Lösungsmittels das Elutionsmuster verbessert, was zu schmäleren Peak-Profilen führt. Zusätzlich zu Ethanol, können andere, hierin beschriebene organische Lösungsmittel verwendet werden, unter anderem Propanol, Isopropanol und Niederalkylenglykole, wie z.B. Propylenglykol, Ethylenglykol und Hexylenglykol. Das organische Lösungsmittel bei 5 bis 25 Vol.-%, noch bevorzugter 5 bis 20 Vol.-%, noch bevorzugter 5 bis 15 Vol.-%, eluiert typischerweise ein korrekt gefaltetes Neurotrophin. Die Elution mit organischem Lösungsmittel kann entweder gradienten- oder schrittweise erfolgen. Der pH-Bereich liegt vorzugsweise von beinahe neutral bis hin zu leicht sauer, von einem pH von 5 bis 8, noch bevorzugter von einem pH von 5,5 bis 7,5 und noch bevorzugter bei einem pH von 7. Jeder der hierin beschriebenen Puffer, unter anderem MOPSO, MOPS, HEPES, Phosphat, Citrat, Ammonium, Acetat, kann verwendet werden, solange er beim gewünschten pH einen Puffer bildet.
Beispiel VII. Reinigung von korrekt gefaltetem rhNT-4/5 von chemischen Varianten
Die Trennung von korrekt gefaltetem, intaktem rhNT-4/5 von seinen chemischen Varianten, unter anderem carbamylierten und N-terminal beschnittenen Formen von rhNT-415, wurde mittels Hochleistungs-Kationenaustauschchromatographie unter Verwendung von SP-Sepharose-Harz oder PolyCat-a-HPLC-Harz erreicht.
Wurde die C4-RP-HPLC-Säule verwendet, um fehlgefaltete Varianten zu entfernen, so wurde der C4-HPLC-Pool auf einen pH von 5 bis 7 angepasst und auf eine SP-Sepharose-HP-Säule (7 cm × 19 cm) geladen, die in 20 mM Succinat, pH 6, 5 % Reagensalkohol, 0,2 M NaCl äquilibriert worden war. Das Harz mit gebundenem NT-4/5 wurde mit Äquilibrierungspuffer gewaschen. Das gebundene rhNT-4/5 wurde eluiert und von den carbamylierten und N-terminal beschnittenen Formen unter Verwendung eines 22-Säulenvolumeneinheiten- (CV-) Gradienten aus 0,2 M NaCl bis 0,4 M NaCl mit einem pH von 6 getrennt (d.h. Salzgradient in Äquilibrierungspuffer) (11). Fraktionen, die NT-4/5 enthielten, wurden gepoolt und in 0,05 M Acetat, pH 4 bis 5, formuliert. Intaktes rhNT-4/5 wurde identifiziert und von den Varianten in den Fraktionen im Vergleich vorzugsweise mittels analytischer RP-HPLC oder, wie hierin beschrieben, mittels SDS-PAGE, unterschieden, verglichen gegen einen Standard.
Alternativ dazu wurden die Variantenformen von NT-4/5 mittels Hochleistungs-Kationenaustausch-HPLC auf einer Polyasparaginsäure-Säule (PolyCAT a, PolyLC, Columbia, Md.) (9,4 × 200 mm) entfernt (12). Der C4-HPLC-Pool wurde auf einen pH von 5 bis 6 angepasst und anschließend auf die Polycat-a-Säule geladen. Die Chromatographiebedingungen waren: Puffer A bestand aus 20 mM Phosphat, 5 Acetonitril, pH 6; Puffer B bestand aus 20 mM Phosphat, 5 % Acetonitril, 0,8 M KCl, pH 6. Das rhNT-4/5 wurde unter Verwendung eines Gradienten von 25 bis 60 Puffer B während einer Zeitspanne von 65 Minuten eluiert (12). Im Abstand von 1 Minute wurden Fraktionen entnommen und, wie oben stehend beschrieben, mittels analytischer C4-HPLC analysiert.
Wurde HIC verwendet, um fehlgefaltete Varianten zu entfernen (Beispiel VI, oben), so wurde der korrekt gefaltete NT-4/5-Pool über Nacht in 20 mM Succinat, 0,1 M NaCl, 5 % Reagensalkohol, pH 6, dialysiert oder in den 20-mM-Succinatpuffer ultrafiltriert/diafiltriert. Der dialysierte oder UF/DF-Pool wurde anschließend, wie oben stehend beschrieben, auf eine SP-Sepharose-HP- oder PolyCAT-a-Säule geladen.
Formulierung
Fraktionen, die korrekt gefaltetes, intaktes NT-4/5 enthielten (aus dem SP-Sepharose-HP- oder PolyCAT-a-HPLC-Schritt), wurden gepoolt und in 20 mM Acetat, pH 4 bis 5, Formulierungspuffer auf 1 bis 5 mg/ml konzentriert. Alternativ dazu wurde das NT-4/5 unter Verwendung von Ultrafiltration/Diafiltration formuliert.
Die finale Rohlösung wurde mittels Aminosäure-Analyse, N-terminaler Sequenzanalyse, Massenspektrometrie, SDS-PAGE (13) und biologischen Tests analysiert; ein Kinase-Rezeptor-Aktivierungs- (KIRA-) Test, der die NT-4/5-Aktivierung der Autophosphorylierung seines Tyrosinkinase-Rezeptors (trkB) detektiert, der sich in einer Zellmembran befindet, wurde verwendet, um das gereinigte rhNT-4/5 zu beschreiben. CHO-Zellen, die trkB exprimieren, mit einer gD-Markierung wurden verwendet. WO 95/14930 , veröffentlicht am 1. Juni 1995, beschreibt den KIRA-Test und ist hierin durch Verweis aufgenommen. Das rhNT-4/5 besaß in diesem Test eine EC50 von 12,6 ng/ml. Typischerweise liegt die EC50 von korrekt gefaltetem, intaktem NT-4/5, gereinigt, wie hierin beschrieben, bei 5 bis 30, vorzugsweise bei 10 bis 20.
Die Reinheit von rhNT-4/5 im Hinblick auf Nicht-NT-4/5-Proteine lag typischerweise bei 90 bis 99 %. Die Homogenität von NT-4/5 im Hinblick auf carbamylierte und N-terminal beschnittene Varianten lag bei 90 bis 99 %. Besonders typisch und bevorzugt wurde es, wenn die Reinheit und die Homogenität bei 99 % oder mehr lag.
Bezugs-Beispiel VIII. Anfängliche Reinigung, Umfaltung und finale Reinigung von rhNT-3 aus bakteriellen Einschlusskörpern
Zur Isolation der Einschlusskörper aus Zelltrümmern wurde die E.-coli-NT-3-Paste (1 kg) unter Verwendung einer mechanischen Rotationsdispersionsvorrichtung, z.B. eines Turrax, in 10 l 100 mM Natriumacetat, pH 5, resuspendiert. Die Zellsuspension wurde drei Mal bei 6000 psi durch einen Mikroverflüssiger geleitet. Das resultierende Homogenat wurde in einer Sorvall-RC-3B-Zentrifuge bei 5000 U/min 30 Minuten lang zentrifugiert.
NT-3 wurde folgendermaßen aus den Einschlusskörpern isoliert. Die Einschlusskörper-Pellets wurden in 100 mM Tris, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 100 mM Natriumsulfit, 10 mM Natriumtetrathiosulfat, 7,5 M Harnstoff, pH 8,3, (10 ml/Gramm Einschlusskörper) unter Verwendung eines Turrax bei mittlerer Geschwindigkeit für eine Zeitspanne von etwa 10 Minuten suspendiert. Die Suspension wurde etwa eine Stunde lang bei 2–8 °C gerührt. PEI (Polyethylenimin) wurde zu etwa 0,15 % (Endkonzentra tion) hinzugefügt und 30 Minuten lang bei 2–8 °C gerührt. Das Gemisch wurde in einer Sorvall-RC3B-Zentrifuge bei 5000 U/min für etwa 30 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde mit einer Gelman-Preflow-Kartusche filtriert. Der filtrierte Überstand wurde mit 3 Volumeneinheiten eines S-Sepharose-Fast-Flow-Äquilibrierungspuffers verdünnt (50 mM Natriumacetat, 5 M Harnstoff, pH 5). Der verdünnte, filtrierte Überstand (Leitfähigkeit weniger als 7 mS) wurde auf eine S-Sepharose-FF-Säule geladen, die mit 50 mM Natriumacetat, 5 M Harnstoff, pH 5,0, äquilibriert worden war. Die Säule wurde zuerst mit 50 mM Natriumacetat, 5 M Harnstoff, pH 5, gewaschen, gefolgt von 50 mM MOPS, 5 M Harnstoff, 10 mM Glycin, pH 7,0. Sulfitolysiertes NT-3 wurde unter Verwendung eines 10-Säulenvolumen-Gradienten von 0–0,6 M NaCl in 50 mM MOPS, 5 M Harnstoff, 10 mM Glycin, pH 7, aus der Säule eluiert.
Partiell gereinigtes NT-3 wurde durch Verdünnung des S-Sepharose-FF-Pools auf etwa 0,1 mg/ml Protein in Umfaltungspuffer, enthaltend 0,1 M Tris, 2 M Harnstoff, 0,1 M NaCl, 15 % PEG 300, 10 mM Glycin, 25 mM Ethanolamin, pH 9,1, umgefaltet. Die Umfaltung wurde durch die Addition von Cystein auf etwa 5 mM und durch Rühren für eine Zeitspanne von 2–5 Tagen bei 2–8 °C initiiert. Gegebenenfalls kann der Umfaltungspuffer mit He oder Argon besprengt werden, um die Sauerstoffkonzentration in der Umfaltungslösung zu reduzieren.
Der pH des umgefalteten Pools wurde auf einen pH von 7 angepasst, filtriert und auf eine Macroprep-High-S-Kationenaustauschchromatographiesäule geladen, die in 50 mM HEPES, pH 7, äquilibriert worden war. Nach dem Laden des pH-angepassten Umfaltungspools auf die Macroprep-Säule wurde die Säule zuerst mit 50 mM MOPS, pH 7, gewaschen, gefolgt von 50 mM MOPS, 0,1 M TMAC, 0,3 M NaCl, pH 7. NT-3 wurde mit 50 mM MOPS, 0,25 M TMAC, 1,5 M NaCl, pH 7, eluiert.
Der Macroprep-Pool wurde anschließend weiter auf einer Phenyl-Sepharose-Fast-Flow-High-Substitution-Säule gereinigt. Die Phenyl-Säule wurde in 50 mM HEPES, 1,5 M NaCl, pH 7, äquilibriert, und der Macroprep-Pool wurde direkt auf die Phenyl-Säule geladen. Die Säule wurde mit Äquilibrierungspuffer gewaschen, und anschlie ßend wurde das korrekt gefaltete NT-3 unter Verwendung eines 15-Säulenvolumen-Gradienten eluiert, der von 50 mM HEPES, 1,5 M NaCl, pH 7, bis 50 mM HEPES, 10 % Reagensalkohol, pH 7, umfasste. Fraktionen wurden entweder durch C4-HPLC oder durch SDS-PAGE analysiert, und die Fraktionen, die korrekt gefaltetes NT-3 enthielten, wurden gepoolt.
Der Phenyl-Pool wurde auf weniger als 25 mS verdünnt (typischerweise etwa 2 Volumeneinheiten mit Wasser) und auf eine SP-Sepharose-HP-Säule geladen, die zuvor in 25 mM MOPSO, pH 7, äquilibriert worden war. Die Säule wurde zuerst mit Äquilibrierungspuffer gewaschen, und NT-3 wurde aus der Säule unter Verwendung eines 20-Säulenvolumen-Gradienten eluiert, der von 0,35 M TMAC bis 0,65 M TMAC in 25 mM MOPSO, pH 7, reichte. rhNT3-hältige Fraktionen (wie mittels C4-HPLC-Test beurteilt wurde) wurden gepoolt.
Der SP-Sepharose-HP-Pool wurde auf einer Membran mit einem Molekulargewicht von 10.000 auf etwa 1 mg/ml konzentriert und anschließend mit 6 Volumeneinheiten 10 mM Acetat, 140 mM NaCl, pH 5,0, diafiltriert.

Claims

Verfahren zur Isolation eines rekombinanten menschlichen Neurotrophins, oder einer gentechnisch veränderten Form davon, aus einem Gemisch, enthaltend andere Proteine und eine Variante dieses rekombinanten menschlichen Neurotrophins, das eine fehlgefaltete Variante, eine proteolytisch inkorrekt bearbeitete Variante oder eine Glykosylierungsvariante dieses rekombinanten menschlichen Neurotrophins inkludieren kann, umfassend die Trennung des rekombinanten menschlichen Neurotrophins von den anderen Proteinen und der rekombinanten menschlichen Neurotrophin-Variante in dem Gemisch durch Verwendung eines Hydrophobchromatographie-Harzes, worin das Trennen das Laden des Gemisches auf ein Hydrophobchromatographie-Harz und das Eluieren des rekombinanten menschlichen Neurotrophins aus dem Harz mit einem Elutionspuffer, der ein organisches Lösungsmittel in einer Konzentration von zwischen 5 Vol.-% bis 25 Vol.-% enthält, unter Bedingungen umfasst, bei denen sich das rekombinante menschliche Neurotrophin von der Variante trennt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Harz eine funktionelle Phenylgruppe umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das auf das Hydrophobchromatographie-Harz geladene Gemisch einen pH von 5 bis 8 aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das auf das Harz geladene Gemisch eine Salzkonzentration von 0,5 M bis 3 M aufweist.
Verfahren nach Anspruch 4, worin das auf das Harz geladene Gemisch eine Salzkonzentration von 0,5 M bis 2,5 M aufweist.
Verfahren nach Anspruch 5, worin das auf das Harz geladene Gemisch eine Salzkonzentration von 0,7 M Acetat oder 1,0 M bis 2,5 M NaCl aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das organische Lösungsmittel von 5 Vol.-% bis zu 20 Vol.-% beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der Elutionspuffer-pH ein pH von 5 bis 8 ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Eluieren einen geringer werdenden Salzgradienten umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das rekombinante menschliche Neurotrophin zu der NGF-Überfamilie gehört.
Verfahren nach Anspruch 10, worin das rekombinante menschliche Neurotrophin NGF, NT-4/5 oder NT-3 ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das rekombinante menschliche Neurotrophin aus einer bakteriellen Kultur hergestellt wird und vor der Verwendung des Hydrophobchromatographie-Harzes in vitro rückgefaltet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das rekombinante menschliche Neurotrophin aus einer Säugetierzellkultur isoliert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, weiters umfassend das Trennen des rekombinanten menschlichen Neurotrophins von seinen chemischen Varianten unter Verwendung des Hochleistungs-Kationenaustauschchromatographieharzes.
Verfahren nach Anspruch 14, worin der Schritt des Trennens mit der Hochleistungs-Kationenaustauschchromatographie das Laden eines Gemisches, welches das rekombinante menschliche Neurotrophin und eine chemische Variante dieses rekombinanten menschlichen Neurotrophins umfasst, auf ein Hochleistungs-Kationenaustauschchromatographieharz sowie das Eluieren des rekombinanten menschlichen Neurotrophins aus dem Harz unter Bedingungen umfasst, bei denen sich das rekom binante menschliche Neurotrophin von der chemischen Variante trennt, und worin das rekombinante menschliche Neurotrophin einen hohen pI-Wert aufweist.
Verfahren nach Anspruch 15, worin das Hochleistungs-Kationenaustauschharz ein SP-Sepharose-HP-, ein Polyasparaginsäure-, ein Polysulfoethyl-Kationenaustausch- oder ein Fractogel-EMD-SO3-Harz ist.
Verfahren nach Anspruch 15, worin das das rekombinante menschliche Neurotrophin enthaltende Eluat aus dem Hochleistungs-Kationenaustauschharz entsalzt oder einer Diafiltration unterzogen wird und anschließend mit einem Träger formuliert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, weiters umfassend das Trennen des rekombinanten menschlichen Neurotrophins von anderen Proteinen unter Verwendung eines Silicagel-Harzes.
Verfahren zur Reinigung eines rekombinanten menschlichen Neurotrophins, umfassend: (a) das Laden eines Gemisches, umfassend das rekombinante menschliche Neurotrophin und seine Variante, auf ein Hydrophobchromatographie-Harz bei einem pH von 5 bis 8; (b) das Waschen des Harzes mit einem Puffer mit einem pH von 5 bis 8; (c) das Eluieren des rekombinanten menschlichen Neurotrophins mit einem Puffer mit einem pH von 5 bis 8, enthaltend ein alkoholisches oder polares aprotisches Lösungsmittel in einer Konzentration von 5 bis 25 Vol.-%; (d) das Laden des Eluats, das das rekombinante menschliche Neurotrophin enthält, auf ein Hochleistungs-Kationenaustauschchromatographieharz bei einem pH von 5 bis 6; und (e) das Eluieren des rekombinanten menschlichen Neurotrophins aus dem Hochleistungs-Kationenaustauschchromatographieharz mit einem Puffer mit einem pH von 5 bis 6, enthaltend ein Kation in einer Konzentration von 0,2 bis 0,5 M.