NO327149B1 - Fremgangsmate for isolering av et rekombinant humant neutrofin, eller genetisk modifisert form av dette, fra en blanding som inneholder andre proteiner og en variant av dette rekombinante humane neutrofinet som kan inkludere en feilfoldet variant, en feilaktig proteolytisk prosessert variant, eller en glykosyleringsvariant av dette rekombinante humane neutrofinet, fremgangsmate for seperasjon av et neutrofin fra en kjemisk variant av dette neutrofinet. - Google Patents
Fremgangsmate for isolering av et rekombinant humant neutrofin, eller genetisk modifisert form av dette, fra en blanding som inneholder andre proteiner og en variant av dette rekombinante humane neutrofinet som kan inkludere en feilfoldet variant, en feilaktig proteolytisk prosessert variant, eller en glykosyleringsvariant av dette rekombinante humane neutrofinet, fremgangsmate for seperasjon av et neutrofin fra en kjemisk variant av dette neutrofinet. Download PDFInfo
- Publication number
- NO327149B1 NO327149B1 NO19992353A NO992353A NO327149B1 NO 327149 B1 NO327149 B1 NO 327149B1 NO 19992353 A NO19992353 A NO 19992353A NO 992353 A NO992353 A NO 992353A NO 327149 B1 NO327149 B1 NO 327149B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- neurotrophin
- variant
- resin
- ngf
- recombinant human
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 72
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 39
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 63
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 51
- 239000000126 substance Substances 0.000 title claims description 33
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 title claims description 10
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 title claims description 10
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 title description 3
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 claims abstract description 441
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 claims abstract description 240
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 83
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 74
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 74
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 claims description 71
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 68
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 45
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 40
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 32
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 claims description 26
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 26
- 239000012539 chromatography resin Substances 0.000 claims description 14
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 14
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 claims description 12
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 claims description 9
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 8
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 claims description 7
- 229920000805 Polyaspartic acid Polymers 0.000 claims description 6
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims description 6
- 108010064470 polyaspartate Proteins 0.000 claims description 6
- 239000003495 polar organic solvent Substances 0.000 claims description 5
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 claims description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 27
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 199
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 199
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 123
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 76
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 67
- 101000996663 Homo sapiens Neurotrophin-4 Proteins 0.000 description 64
- 102100033857 Neurotrophin-4 Human genes 0.000 description 62
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 62
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 52
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 48
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 35
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 34
- NUFBIAUZAMHTSP-UHFFFAOYSA-N 3-(n-morpholino)-2-hydroxypropanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CC(O)CN1CCOCC1 NUFBIAUZAMHTSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 26
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 25
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 24
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 108090000742 Neurotrophin 3 Proteins 0.000 description 22
- 102000004230 Neurotrophin 3 Human genes 0.000 description 22
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 22
- 229940032018 neurotrophin 3 Drugs 0.000 description 22
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 19
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 19
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 18
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 18
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 18
- 230000008569 process Effects 0.000 description 18
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 17
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 17
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 17
- 239000000463 material Substances 0.000 description 17
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 17
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 16
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 16
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 15
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 14
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 14
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 14
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 14
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 13
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 13
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 13
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 12
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 12
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 12
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 12
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 12
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 12
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 12
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 12
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 12
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 12
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 12
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 11
- 101001111439 Homo sapiens Beta-nerve growth factor Proteins 0.000 description 11
- 108090000099 Neurotrophin-4 Proteins 0.000 description 11
- -1 TRIS-HC1 Chemical compound 0.000 description 11
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 11
- 102000046917 human NGF Human genes 0.000 description 11
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 11
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 10
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 10
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 10
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 10
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 10
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 10
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 10
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 10
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 9
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 9
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 9
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 9
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 9
- 229940077737 brain-derived neurotrophic factor Drugs 0.000 description 9
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 9
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 9
- SVTBMSDMJJWYQN-UHFFFAOYSA-N 2-methylpentane-2,4-diol Chemical compound CC(O)CC(C)(C)O SVTBMSDMJJWYQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 8
- 102000003683 Neurotrophin-4 Human genes 0.000 description 8
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 8
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 8
- 239000012561 harvest cell culture fluid Substances 0.000 description 8
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 8
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 8
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 8
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 8
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 7
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 7
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 7
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 7
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 7
- 235000019445 benzyl alcohol Nutrition 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 7
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 7
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 7
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 7
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 7
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 7
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 7
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 6
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 6
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 6
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 6
- YMBCJWGVCUEGHA-UHFFFAOYSA-M tetraethylammonium chloride Chemical compound [Cl-].CC[N+](CC)(CC)CC YMBCJWGVCUEGHA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- INEWUCPYEUEQTN-UHFFFAOYSA-N 3-(cyclohexylamino)-2-hydroxy-1-propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CC(O)CNC1CCCCC1 INEWUCPYEUEQTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 235000006109 methionine Nutrition 0.000 description 5
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 5
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 5
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101100390711 Escherichia coli (strain K12) fhuA gene Proteins 0.000 description 4
- 101100404651 Mus musculus Ngf gene Proteins 0.000 description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 4
- DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N Tert-Butanol Chemical compound CC(C)(C)O DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 4
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 4
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 4
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 4
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 4
- 229940051250 hexylene glycol Drugs 0.000 description 4
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 4
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 4
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 4
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 4
- GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L sodium sulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=O GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 4
- DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN1CCOCC1 DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 3
- 101100222854 Bacillus subtilis (strain 168) czcO gene Proteins 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101100127166 Escherichia coli (strain K12) kefB gene Proteins 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- 101100537961 Methanosarcina mazei (strain ATCC BAA-159 / DSM 3647 / Goe1 / Go1 / JCM 11833 / OCM 88) trkA2 gene Proteins 0.000 description 3
- 101100178822 Mycobacterium tuberculosis (strain ATCC 25618 / H37Rv) htrA1 gene Proteins 0.000 description 3
- OKIZCWYLBDKLSU-UHFFFAOYSA-M N,N,N-Trimethylmethanaminium chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)C OKIZCWYLBDKLSU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101100407828 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) ptr-3 gene Proteins 0.000 description 3
- 102100021584 Neurturin Human genes 0.000 description 3
- 229920002556 Polyethylene Glycol 300 Polymers 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 101100277437 Rhizobium meliloti (strain 1021) degP1 gene Proteins 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 description 3
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 3
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 3
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 101150018266 degP gene Proteins 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 3
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 3
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000001972 isopentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N phenyl(114C)methanol Chemical compound O[14CH2]C1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 3
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 3
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 3
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 101150025395 trkA gene Proteins 0.000 description 3
- 101150113435 trkA1 gene Proteins 0.000 description 3
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 description 2
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 102000034615 Glial cell line-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 2
- 108091010837 Glial cell line-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 2
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 108020005350 Initiator Codon Proteins 0.000 description 2
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 2
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 2
- 102100027612 Kallikrein-11 Human genes 0.000 description 2
- 244000285963 Kluyveromyces fragilis Species 0.000 description 2
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 2
- MKWKNSIESPFAQN-UHFFFAOYSA-N N-cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCNC1CCCCC1 MKWKNSIESPFAQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methylglycine Chemical compound OCC(CO)(CO)[NH2+]CC([O-])=O SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010015406 Neurturin Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 101100084022 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) lapA gene Proteins 0.000 description 2
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 2
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 2
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 101710152431 Trypsin-like protease Proteins 0.000 description 2
- 238000011481 absorbance measurement Methods 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000010 aprotic solvent Substances 0.000 description 2
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 2
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005587 bubbling Effects 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 239000011928 denatured alcohol Substances 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 2
- YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N glycylglycine Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC([O-])=O YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N m-cresol Chemical compound CC1=CC=CC(O)=C1 RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 2
- 229940097998 neurotrophin 4 Drugs 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 125000002347 octyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 101150093139 ompT gene Proteins 0.000 description 2
- 230000000065 osmolyte Effects 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N oxidized gamma-L-glutamyl-L-cysteinylglycine Natural products OC(=O)C(N)CCC(=O)NC(C(=O)NCC(O)=O)CSSCC(C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CCC(N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000033808 peripheral neuropathy Diseases 0.000 description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 101150009573 phoA gene Proteins 0.000 description 2
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 2
- 229920002492 poly(sulfone) Polymers 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N propylparaben Chemical compound CCCOC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 230000030788 protein refolding Effects 0.000 description 2
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 235000010265 sodium sulphite Nutrition 0.000 description 2
- HAEPBEMBOAIUPN-UHFFFAOYSA-L sodium tetrathionate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[O-]S(=O)(=O)SSS([O-])(=O)=O HAEPBEMBOAIUPN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000008362 succinate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000013060 ultrafiltration and diafiltration Methods 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QZTKDVCDBIDYMD-UHFFFAOYSA-N 2,2'-[(2-amino-2-oxoethyl)imino]diacetic acid Chemical compound NC(=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O QZTKDVCDBIDYMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 2,2'-piperazine-1,4-diylbisethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LTMRRSWNXVJMBA-UHFFFAOYSA-N 2,2-diethylpropanedioic acid Chemical compound CCC(CC)(C(O)=O)C(O)=O LTMRRSWNXVJMBA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound NCC(O)=O.OCC(N)(CO)CO AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUPXYSSGJWIURR-UHFFFAOYSA-N 3-octoxypropane-1,2-diol Chemical compound CCCCCCCCOCC(O)CO GUPXYSSGJWIURR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 239000007991 ACES buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007988 ADA buffer Substances 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 1
- WVRUNFYJIHNFKD-WDSKDSINSA-N Arg-Ala Chemical group OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N WVRUNFYJIHNFKD-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241000351920 Aspergillus nidulans Species 0.000 description 1
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 1
- 241001203868 Autographa californica Species 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000589151 Azotobacter Species 0.000 description 1
- 239000007989 BIS-Tris Propane buffer Substances 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 1
- 241000409811 Bombyx mori nucleopolyhedrovirus Species 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 239000008000 CHES buffer Substances 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 101800004419 Cleaved form Proteins 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- PJWWRFATQTVXHA-UHFFFAOYSA-N Cyclohexylaminopropanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCNC1CCCCC1 PJWWRFATQTVXHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 241000255601 Drosophila melanogaster Species 0.000 description 1
- 206010013710 Drug interaction Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N Elaidinsaeure-aethylester Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588914 Enterobacter Species 0.000 description 1
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241001522878 Escherichia coli B Species 0.000 description 1
- 101000867232 Escherichia coli Heat-stable enterotoxin II Proteins 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 108010008488 Glycylglycine Proteins 0.000 description 1
- 244000299507 Gossypium hirsutum Species 0.000 description 1
- OWXMKDGYPWMGEB-UHFFFAOYSA-N HEPPS Chemical compound OCCN1CCN(CCCS(O)(=O)=O)CC1 OWXMKDGYPWMGEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007996 HEPPS buffer Substances 0.000 description 1
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 1
- 101100404649 Homo sapiens NGF gene Proteins 0.000 description 1
- 101000634196 Homo sapiens Neurotrophin-3 Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 241000481961 Lachancea thermotolerans Species 0.000 description 1
- 241000235651 Lachancea waltii Species 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 240000008790 Musa x paradisiaca Species 0.000 description 1
- 235000018290 Musa x paradisiaca Nutrition 0.000 description 1
- FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycine Chemical compound OCCN(CCO)CC(O)=O FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DBXNUXBLKRLWFA-UHFFFAOYSA-N N-(2-acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound NC(=O)CNCCS(O)(=O)=O DBXNUXBLKRLWFA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCS(O)(=O)=O JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000221960 Neurospora Species 0.000 description 1
- 241000221961 Neurospora crassa Species 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000007990 PIPES buffer Substances 0.000 description 1
- 241001057811 Paracoccus <mealybug> Species 0.000 description 1
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 description 1
- 206010034620 Peripheral sensory neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 240000007377 Petunia x hybrida Species 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000255969 Pieris brassicae Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 101710093543 Probable non-specific lipid-transfer protein Proteins 0.000 description 1
- 241000588769 Proteus <enterobacteria> Species 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 101000634201 Rattus norvegicus Neurotrophin-3 Proteins 0.000 description 1
- 102000004278 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000873 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 1
- 241000311088 Schwanniomyces Species 0.000 description 1
- 241001123650 Schwanniomyces occidentalis Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N Syringetin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 241000473945 Theria <moth genus> Species 0.000 description 1
- 241001149964 Tolypocladium Species 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 1
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 description 1
- 244000000188 Vaccinium ovalifolium Species 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 241000863000 Vitreoscilla Species 0.000 description 1
- 241000235013 Yarrowia Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical group [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- CBTVGIZVANVGBH-UHFFFAOYSA-N aminomethyl propanol Chemical compound CC(C)(N)CO CBTVGIZVANVGBH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 230000035578 autophosphorylation Effects 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 239000008228 bacteriostatic water for injection Substances 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007998 bicine buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011953 bioanalysis Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- HHKZCCWKTZRCCL-UHFFFAOYSA-N bis-tris propane Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCCNC(CO)(CO)CO HHKZCCWKTZRCCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000021235 carbamoylation Effects 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 1
- 230000006652 catabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 208000019065 cervical carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000011098 chromatofocusing Methods 0.000 description 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-N ethanesulfonic acid Chemical compound CCS(O)(=O)=O CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N ethyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N 0.000 description 1
- 229940093471 ethyl oleate Drugs 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- BEBCJVAWIBVWNZ-UHFFFAOYSA-N glycinamide Chemical compound NCC(N)=O BEBCJVAWIBVWNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 description 1
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 229940043257 glycylglycine Drugs 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 229940093915 gynecological organic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 101150020087 ilvG gene Proteins 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052816 inorganic phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- KGNKJLSLHCPWOB-UHFFFAOYSA-N iresin Natural products CC1(CO)C(O)CCC2(C)C3COC(=O)C3=CCC12 KGNKJLSLHCPWOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000010297 mechanical methods and process Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 239000004292 methyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 229960002216 methylparaben Drugs 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000003955 neuronal function Effects 0.000 description 1
- 201000001119 neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 230000007823 neuropathy Effects 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000346 nonvolatile oil Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 208000027232 peripheral nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 229920000724 poly(L-arginine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 108010011110 polyarginine Proteins 0.000 description 1
- 108010055896 polyornithine Proteins 0.000 description 1
- 229920002714 polyornithine Polymers 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229940068965 polysorbates Drugs 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 235000010232 propyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004405 propyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 229960003415 propylparaben Drugs 0.000 description 1
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000007830 receptor-based assay Methods 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000009711 regulatory function Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 229920006009 resin backbone Polymers 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 102220184791 rs77265655 Human genes 0.000 description 1
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 1
- 201000005572 sensory peripheral neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000000717 sertoli cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011343 solid material Substances 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 210000001913 submandibular gland Anatomy 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 230000002889 sympathetic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- YODZTKMDCQEPHD-UHFFFAOYSA-N thiodiglycol Chemical compound OCCSCCO YODZTKMDCQEPHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950006389 thiodiglycol Drugs 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 102000015533 trkA Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010064884 trkA Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000047459 trkC Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010064892 trkC Receptor Proteins 0.000 description 1
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/48—Nerve growth factor [NGF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
- Epoxy Compounds (AREA)
Description
Teknisk område
Foreliggende oppfinnelse omfatter fremgangsmåte for
isolering av et rekombinant humant neurotrofin, eller genetisk modifisert form av dette, fra en blanding som inneholder andre proteiner og en variant av dette rekombinante humane neurotrofinet som kan inkludere en feilfoldet variant, en feilaktig
proteolytisk prosessert variant, eller en glykosyleringsvariant av dette rekombinante humane neurotrofinet, fremgangsmåte for separasjon av et neurotrofin fra en kjemisk variant av dette neurotrofinet.
Oppfinnelsens bakgrunn
Fremstilling av store mengder av relativt rene, biologisk aktive polypeptider og proteiner er økonomisk viktig for fremstilling av farmasøytiske preparater for bruk i menneske og dyr, enzymer og andre spesielle kjemikalier. For fremstilling av mange proteiner er rekombinante DNA-teknikker blitt den foretrukne fremgangsmåte da store mengder eksogene proteiner kan uttrykkes i pattedyrvertsceller, bakterier og andre vertsceller.
Primærstrukturen av en pattedyr-NGF (muse-NGF) ble først oppklart av Angeletti og Bradshaw, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 58:2417 (1971). Primærstrukturen til dens forløper, pre-pro-NGF, er blitt utledet fra nukleotidsekvensen til NGF-cDNA fra mus (Scott et al., Nature 302:538 (1983); Ullrich et al., Nature 303:821 (1983)).
Det homologe, humane NGF-gen (hNGF-gen) er også identifisert (Ullrich, Symp. on Quan. Biol., Cold Spring Harbor 48:435 (1983); US patentskrift nr. 5 288 622, tildelt 22. februar 1994, som inkorporeres heri ved referanse). Homologien med muse-NGF er tilnærmet 90% og 87% på aminosyresekvensnivå, hhv. nukleotidsekvensnivå. Grunnet mangel på naturlig forekom-mende, human NGF er denne ikke blitt fremstilt fra naturlige kilder i mengder tilstrekkelige for biokjemisk karakterisering i detalj.
Ytterligere neurotrofiske faktorer beslektet med NGF, er senere blitt identifisert. Disse omfatter hjerneavledet, neurotrofisk faktor (BDNF) (Leibrock et al., Nature, 341:149-152 (1989)), neurotrofin-3 (NT-3) (Kaisho et al., FEBS Lett., 255:187 (1990); Maisonpierre et al., Science, 247:1446 (1990); Rosenthal et al., Neuron, 4:767 (1990)) og neurotrofin 4/5 (NT-4/5) (Berkmeier et al., Neuron, 7:857-866 (1991)). GDNF, et fjernt beslektet medlem av TGF-p-superfamilien, og neurturin ("NTN") er to nylig identifiserte, strukturelt beslektede, kraftig virkende overlevelsesfaktorer for sympatiske sanseneuroner og neuroner i sentralnervesystemet (Lin et al., Science 250:1130-1132 (1993); Henderson et al., Science 255:1062-1064 (1994); Buj-Bello et al., Neuron 15:821-828
(1995); Kotzbauer et al., Nature 384:467-470 (1996)).
Fremstilling av rekombinant protein omfatter transfeksjon av vertsceller med DNA som koder for proteinet og dyrkning av cellene under betingelser som fremmer ekspresjon av det rekombinante protein. Prokaryoten E. coli har vært en foretrukket vert da den kan benyttes for fremstilling av rekombinante proteiner i høyt utbytte med lave kostnader. Flere US-patentskrifter vedrørende generell bakteriell ekspresjon av DNA som koder for proteiner, foreligger, heriblant US patentskrift nr. 4 565 785 vedrørende et rekombinant DNA-molekyl som omfatter et bakterielt gen for et ekstracellulært eller periplasmisk bærerprotein og et ikke-bakterielt gen, US patentskrift nr. 4 673 641 vedrørende samproduksjon av et fremmed polypeptid med et aggregatdannende polypeptid, US patentskrift nr. 4 738 921 vedrørende en ekspresjonsvektor med en trp-promoter/operator og trp LE-fusjon med et polypeptid, f.eks. IGF-I, US patentskrift nr. 4 795 706 vedrørende ekspre-sjonskontrollsekvenser som skal inkluderes med et fremmed protein, og US patentskrift nr. 4 710 473 vedrørende spesifikke, sirkulære DNA-plasmider, f.eks. slike som koder for IGF-I.
Genetisk utformede biofarmasøytika renses typisk fra en supernatant som inneholder en rekke forskjellige vertscellekontaminanter. Nærmere bestemt er NGF blitt rapportert renset i varierende grad med varierende grad av innsats og suk-sess ved benyttelse av en rekke forskjellige fremgangsmåter. Se f.eks. Longo et al., IBRO Handbook, bind 12, s. 3-30
(1989), US patentskrift nr. 5 082 774 som beskriver CHO-cel-leproduksjon av NGF, Bruce og Heinrich (Neurobio. Aging 10:89-94 (1989); Schmelzer et al., J. Neurochem. 55:1675-1683
(1992); Burton et al., J. Neurochem. 59:1937-1945 (1992). Disse anstrengelser har hovedsakelig skjedd i laboratorie-skala.
Imidlertid er preparativ isolering av rekombinant, human NGF til farmasøytisk renhet og i høyt utbytte, i det vesentlige fritt for varianter, ikke skjedd innenfor teknikkens stand.
Følgelig foreligger det et behov innen faget for en effektiv fremgangsmåte for selektiv separasjon av neurotrofiner, særlig NGF og NGF-familien av neurotrofiner, fra disses varianter og- andre molekyler og fra andre polypeptider med høy pl. Fremgangsmåten for rensing av neurotrofiner i stor skala bør være anvendelig på utgangsmateriale fra forskjellige kilder, heriblant fermenteringsbrygg, lyserte bakterieceller eller pattedyrceller for å fylle de kliniske behov. Videre, da de foreliggende oppfinnere tidligere har oppdaget ukjente, vanskelig atskillbare neurotrofinvarianter, f.eks. NGF-varianter, er fremgangsmåtene som presenteres heri, spesielt anvendbare for tilveiebringelse av kommersielt anvendbare mengder av rekombinante neurotrofiner, heriblant NGF (rhNGF), rhNT-3 og rhNT-4/5 og ønskede, genetisk utformede mutanter av disse som i det vesentlige er fri for uønskede varianter.
Oppsummering
Foreliggende oppfinnelse omfatter fremgangsmåte for isolering av et rekombinant humant neurotrofin, eller genetisk modifisert form av dette, fra en blanding som inneholder andre proteiner og en variant av dette rekombinante humane neurotrofinet som kan inkludere en feilfoldet variant, en feilaktig proteolytisk prosessert variant, eller en glykosyleringsvariant av dette rekombinante humane neurotrofinet, kjennetegnet ved at den omfatter: separasjon av det rekombinante humane neurotrofinet fra andre proteiner og neurotrofinvariant i blandingen ved å benytte hydrofobt interaksjonskromatografiresin som omfatter en hydrofob funksjonell gruppe der blandingen har en pH på 5 til 8 og en saltkonsentrasjon på 0,5 M til 3 M, og der separasjonen omfatter påsetting av blandingen på et hydrofobt interaksjonskromatografiresin ved pH 5 til 8,
vasking av resinet med en buffer ved pH 5 til 8 og
eluering av det rekombinante humane neurotrofinet fra resinet med en elueringsbuffer ved pH 5 til 8 ved betingelser som er valgt fra minskende saltkonsentrasjon, endret overflatespenning, økende konsentrasjon av relativt polart organisk løsningsmiddel og endret pH i løsning, der det rekombinante humane neurotrofinet separeres fra varianten,
og som ytterligere omfatter separasjon av det rekombinante humane neurotrofinet fra sine kjemiske varianter ved å benytte høyytelses-kationbytterkromatografiresin,
og som omfatter at eluatet fra høyytelseskation-bytterresinet som inneholder det rekombinante humane neurotrofinet avsaltes eller behandles ved diafiltrering og deretter utformes med et bærerstoff.
Videre er omfattet fremgangsmåte for separasjon av et neurotrofin fra en kjemisk variant av dette neurotrofinet, kjennetegnet ved at den omfatter separasjon av neurotrofinet fra dets kjemiske variant ved benyttelse av hydrofobt inter-aks jonskromatografi HIC) -resin etterfulgt av høyytelses-kationbytterkromatografiresin, der fremgangsmåten omfatter: påsetting av neurotrofinet og dets kjemiske variant i en blanding som har en pH på 5 til 8 og en saltkonsentrasjon på 0,5 M til 3 M på et HIC-resin som omfatter en hydrofob funksjonell gruppe,
vasking av HIC-resinet med en buffer med en pH på 5 til 8,
eluering av neurotrofinet fra HIC-resinet med en elueringsbuffer ved pH 5 til 8 ved betingelser som er valgt fra minskende saltkonsentrasjon, endret overflatespenning, økende konsentrasjon av relativt polart organisk løsnings-middel og endret pH i løsning og
separasjon av neurotrofinet fra dets kjemiske variant ved å benytte høyytelses-kationbytterkromatografiresin,
der fremgangsmåten, om ønskelig, videre omfatter trinnet hvor neurotrofinet separeres fra en feilfoldet variant
av dette neurotrofinet ved benyttelse av et resin for preparativ reversfase-væskekromatografi.
Det beskrives en prosess for rensing av et neurotrofin, nærmere bestemt ett i NGF-familien, heriblant NGF, NT-3, NT-4/5 og BDNF, som alle gjenkjennes av en svært homolog reseptorfamilie (trk), fortrinnsvis rhNGF, rNT-3, rhNT-4/5, rhBDNF eller ønskede, genetisk utformede former av disse, ved benyttelse av hydrofob interaksjonskromatografi (HIC). I lys av foreliggende oppfinneres oppdagelse av visse uønskede neurotrofinvarianter som oppstår ved rekombinant fremstilling av et neurotrofin, som rapportert heri, kan anvendelse av HIC atskille kjemisk forskjellige eller til og med feilfoldede former av et neurotrofin fra det ønskede, korrekt foldede, intakte neurotrofin. Varianter som kan fjernes, er slike som avviker fra det modne, korrekt foldede neurotrofin i hydrofobisitet, heriblant delvis prosesserte forløpersekvenser, glykosylerte, modne og forløperholdige former (når slike foreligger fra en eukaryot cellekultur), og feilfoldede og delvis foldede varianter (generelt fra bakteriell cellekultur dersom in vitro foldingstrinn benyttes). For eksempel er HIC spesielt nyttig for fjerning av delvis prosesserte forløpersekvenser av NGF, glykosylerte former av NGF og forløper (når slike foreligger fra en eukaryot cellekultur), og feilfoldede og delvis foldede varianter
(generelt fra bakteriecellekultur og in vitro foldingstrinn)
fra blandinger av moden NGF. NGF har ett N-koblet glykosyler-ingssete ved Asn45. Når det gjelder bakterielt uttrykt, gjenfoldet rhNT-4/5, atskiller HIC korrekt foldet NT-4/5 fra ukorrekt foldede former. Som et resultat av prosessen som beskrives heri, er neurotrofinet i det vesentlige fritt for disse varianter. For neurotrofinrensing er den funksjonelle gruppe i HIC-resinet fortrinnsvis en fenylgruppe, mens oktyl-og butylgrupper kan være anvendbare. Spesielt foretrukne ut-førelser omfatter HIC-resinene "Phenyl Toyopearl", "Phenyl Sepharose Fast Flow Low Substitution", "TSK-Phenyl 5PW" eller lignende.
Det beskrives videre en prosess for rensing av et neurotrofin, nærmere bestemt ett i NGF-familien, fortrinnsvis rhNGF, rNT-3, rhNT-4/5 eller ønskede, genetisk utformede former av disse, ved benyttelse av preparativ kationbytterkromatografi, som atskiller ladningsmodifiserte varianter, f.eks. oksiderte former, isoasp-former og deamiderte former fra modent neurotrofin. Spesielt foretrukne utførelser benytter "SP-Sepharose High Performance", "Fractogel EMD S03" eller polyasparaginsyreresin, av hvilke PolyCAT A foretrekkes spesielt. Mest foretrukket i stor skala benyttes "SP-Sepharose High Performance"- eller "Fractogel EMD S03"-resiner.
Videre omtales det at det benyttes både HIC og kationbytterkromatografi for fremstilling av et preparat av et ønsket neurotrofin, f.eks. rekombinant, moden NGF, fortrinnsvis human NGF, som er i det vesentlige homolog, dvs. i det vesentlige fri for både prosesseringsvarianter og ladningsvarianter, f.eks. feilfoldede og kjemiske varianter, og som også er i det vesentlige ren vedrørende proteininnhold.
Det beskrives videre en forbedret prosess for atskillelse av neurotrofiner, nærmere bestemt de fra NGF-familien, fortrinnsvis rekombinant, human NGF, NT-3, NT-4/5 og deres ønskede, genetisk utformede former, fra beslektede, uønskede varianter, f.eks. fermenteringsvarianter, protease-kløyvede varianter, glykosyleringsvarianter, feilfoldede varianter, ved hjelp av revers fase-væskekromatografi. Mer foretrukket er NGF 120/120- eller 118/118-homodimerformen. Som et resultat av prosessen som beskrives heri, er neurotrofinet mest foretrukket i det vesentlige fritt for varianter.
Det beskrives også en prosess for rensing av neurotrofiner, spesielt de fra NGF-familien, fra beslektede varianter ved benyttelse av elueringsbetingelser som omfatter fysiologisk pH.
Også beskrevet er en prosess for rensing av et neurotrofin som fører til betydelig forbedring av dets homogenitet.
Det beskrives videre en prosess for å atskille NGF-familieneurotrofiner fra varianter av disse som omfatter: a) påsetting av en buffer som inneholder neurotrofinet og dets variant ved en pH mellom tilnærmet 5 og 8 på en
hydrofob interaksjonskromatografikolonne,
b) vask av kolonnen,
c) eluering av neurotrofinet med en buffer med pH mellom tilnærmet 5 og 8, d) påsetting av det neurotrofinholdige eluat på en kationbytterkromatografikolonne ved en pH mellom tilnærmet 5
og 8, og
e) eluering av neurotrofinet fra kolonnen med en buffer med en saltgradient ved en pH mellom tilnærmet 5 og 8,
fortrinnsvis pH 6. Neurotrofinet er mest foretrukket rhNGF.
Det beskrives videre at det tilveiebringes et kiselgelkromatografitrinn som effektivt fjerner vertscelleproteiner fra neurotrofinfraksjonen, som fortrinnsvis er en NGF-fraksjon.
Også beskrevet er et prosesstrinn hvor NGF med 120 aminosyrer utsettes for behandling med en trypsinlignende protease for selektiv fjerning av det terminale RA-dipeptid fra C-terminalt VRRA for erholdelse- av 118-typen. En kolonne med immobilisert trypsin foretrekkes.
Det beskrives også neurotrofinpreparatet og ut-forminger fremstilt ved prosessene som beskrevet her og anvendelser av preparatet og utformingen. Det tilveiebringes et neurotrofinpreparat som er i det vesentlige homogent, dvs. i det vesentlige fritt for både prosesseringsvarianter og ladningsvarianter, f.eks. feilfoldede og kjemiske varianter, og som også er i det vesentlige rent vedrørende proteininnhold. Fortrinnsvis tilveiebringes moden, human NGF, moden NT-3 fra menneske eller rotte og moden, human NT-4/5 i denne form. I en foretrukket utførelse er NGF av 120-typen, og mer foretrukket av 118-typen, mest foretrukket som en homodimer, f.eks. 118/118.
Kort beskrivelse av figurene
Figur 1 viser et "SP-Sepharose HP"-kromatogram. En NGF-holdig blanding fra en 12 kL fermentering, etter HIC-kromatografi, ble påsatt et "SP-Sepharose High Performance"-resin (kolonnedimensjoner 1,0 x 35 cm, 27,5 ml resinvolum) med 25 omnifit SPSHP-resin. Buffer A var 0,2 M NaCl, 20 mM succinat, pH 6,0 (23 ms). Buffer B var 0,7 M NaCl, 20 mM succinat, pH 6,0 (63 ms). Kolonnen ble først ekvilibrert med buffer A. HIC-porsjonen på 345 ml med 0,24 mg/ml ble justert til 25 mM succinat, pH 6,0 (17 ms), av hvilket 362 ml ble påsatt, noe som ga en belastning på 3 mg/ml resin. 82,5 mg NGF ble påsatt. Påsettingshastigheten var 40 cm pr. time. NGF ble eluert ved benyttelse av en gradient på 22 kolonnevolumer fra 30% til 80% buffer B (0,35 til 0,60 M NaCl, 37 til 57 ms). Elueringshas-tigheten var 60 cm pr. time. Absorbansenheter (280 nm) og mS/cm ble fremstilt som funksjon av fraksjonsnumre og eluer-ingsvolum i ml. Fraksjoner som inneholdt NGF, ble identifisert og slått sammen. I dette tilfelle ble fraksjonene 43 til 60 slått sammen for erholdelse av 99 ml prøve med 0,38 mg/ml NGF, noe som tilsvarer et utbytte på tilnærmet 4 6%.
Figur 2 viser en SP-NPR HPLC-kationbytter- (HPIEX) analyse av porsjonen fra "Phenyl Sepharose Fast Flow" og "SP-Sepharose HP". Begge kromatogrammer er merket. Figur 3 viser en C4 RP-HPLC-analyse av utvalgte fraksjoner (hovedporsjonen, forkantfraksjonen og etterkantfrak-sjonen av hovedtopp-porsjonen) fra "SP-Sepharose HP"-kromato-grafitrinnet. De tre signalene er lagt over hverandre og er som markert. Det kan observeres at hovedtoppen (som inneholder moden NGF) er atskilt fra flere lavere topper som inneholder variant-NGF. Figur 4 viser sekvensen av human prepro-NGF (SEKV.ID NR. 1). Angitt på figuren er den første aminosyre i moden NGF (posisjon 1) og den siste aminosyre i 120-NGF-formen (posisjon 120). En foretrukket NGF-aminosyresekvens er den til den modne 118-form (fra posisjon 1 til posisjon 118). Også vist er
variantformer: moden 120 (posisjon 1 til posisjon 120), moden 117 (posisjon 1 til 117), R120 (posisjon -1 til 120) og seter for andre typer feilprosessering som forekommer i N- og C-enden, heriblant moden 114- (aminosyrene 1 til 114), 115-(aminosyrene 1 til 115) og 117- (aminosyrene 1 til 117) varianter. En feilprosessert hovedvariant, proteolytisk feilprosessert, har N-terminal kløyving mellom aminosyrene R(-39)
og S(-38) i prosekvensen til NGF. Den sannsynlige initierings-Met er understreket. Andre N-terminale varianter omfatter avkortede NGF-former, hvor de vanligste skyldes kløyving mellom aminosyrene H8 og R9 og mellom R9 og G10.
Figur 5 viser aminosyresekvensene til neurotrofinene human NGF (SEKV.ID NR. 2), muse-NGF (SEKV.ID NR. 3), BDNF (SEKV.ID NR. 4), NT-3 (SEKV.ID NR. 5) og NT-4/5 (SEKV.ID NR. 6). De innrammede områder viser de homologe, cysteinholdige områder som inngår i cysteinknutemotivet (De Young et al., Protein Sei. 5(8):1554-66 (1996)). Figur 6 viser det kromatografiske mønster for rhNT-4/5 på en "DEAE-Sepharose Fast Flow"- (DEFF) resinkolonne. Kromatogrammet merket "NT45DE1:1_UV", er en UV-absorbansmåling ved 280 nm. Kromatogrammet merket "NT45DE1:l_Condl" er en led-ningsevnemåling av eluerende fraksjoner. De US neurotrofinholdige fraksjoner som ble slått sammen, er angitt ved den horisontale pil merket "Porsjon". Figur 7 viser det kromatografiske mønster for rhNT-4/5 på en "SP-Sepharose Fast Flow"-resinkolonne. Kromatogrammet merket "NT45SFF1:1_UV", er en UV-absorbansmåling ved 280 nm. Kromatogrammet merket "NT45SFF1:l_Condl", er en led-ningsevnemåling av de eluerende fraksjoner. De neurotrofinholdige fraksjoner som ble slått sammen, er angitt ved den horisontale pil merket "Porsjon". Figur 8 viser et typisk preparativt C4-RP-HPLC-kroma-tografimønster for rhNT-4/5 under betingelser som er beskrevet i teksten. Absorbansen ved 280 nm ble fulgt. De neurotrofinholdige fraksjoner som ble slått sammen, er markert med en horisontal pil merket "Porsjon". Figur 9 gir det analytiske HPLC-kromatografimønster for NT4/5-prøver analysert under refolding ved de angitte tidspunkter. Kolonnebetingelsene er beskrevet i teksten. "NT-4/5 Std." angir elueringsmønsteret for korrekt foldet, intakt NT-4/5 som ble benyttet som standard. Mønsteret merket "SSFF (0,5 m)", viser analysen av NT-4/5 eluert med 0,5 M NaCl fra "S-Sepharose Fast Flow"-kolonnen før gjenfolding. Etter hvert som NT-4/5 gjenfoldes, tilnærmer elueringsmønsteret seg mønsteret for standarden. Figur 10 viser et kromatogram som viser atskillelse av intakt, korrekt foldet NT-4/5 fra feilfoldede varianter på en hydrofob interaksjonskromatografikolonne, en "Phenyl Toyopearl 650M"-kolonne. Feilfoldede varianter som er mindre hydrofobe enn korrekt foldet NT-4/5, elueres i den ubundne fraksjon, mens feilfoldede varianter (topp B) som er mer hydrofobe, elueres ved en konsentrasjon av organisk løsnings-middel som er høyere enn den som kreves for eluering av korrekt foldet NT-4/5 (topp A). Figur 11 viser elueringsmønsteret for NT-4/5 og dets varianter fra et kationbytterresin, "SP-Sepharose". Absorbansen ved 280 nm ble fulgt. Topp A inneholder karbamylerte og kløyvede varianter, mens topp B inneholder intakt, korrekt foldet NT-4/5. NT-4/5-holdige fraksjoner som ble slått sammen, er angitt ved den horisontale pil merket "Porsjon". Figur 12 viser et typisk preparativt poly CAT A-resinkromatografimønster for rhNT-4/5 under betingelser som er beskrevet i teksten. Figur 13 viser en 16% SDS-PAGE- (Tris-glysinsystem, ferdigstøpt gel fra Novex, Inc., San Diego, CA) analyse under reduserende betingelser for å anslå renhet og homogenitet av prøver tatt fra de angitte trinn av rhNT4/5-rensingsprosessen beskrevet i teksten. Gelen ble farget med Coomassie-R250 for påvisning av protein (Andrews, Electrophoresis, Oxford Univer-sity Press: New York, 1986). Sporet merket "DE Load", inneholder en prøve av PEI-blandingen som ble påsatt "DE-Sepharose Fast Flow"-kolonnen, sporet merket "DE FT", inneholder en prøve av den ubundne fraksjon fra "DE-Sepharose Fast Flow"-kolonnen, sporet "S-porsjon" inneholder en prøve fra de sammenslåtte fraksjoner inneholdende NT-4/5 eluert fra "S-Sepharose Fast Flow"-resinkolonnen før gjenfolding, sporet "Gjenfoldet porsjon" inneholder en prøve av porsjonen etter at gjenfoldingen var fullstendig, sporet "C4-porsjon" inneholder en prøve av de sammenslåtte fraksjoner etter preparativ C4 RP-HPLC, og sporet "PolyCAT A-porsjon" inneholder en prøve fra de sammenslåtte NT-4/5-fraksjoner fra PolyCAT A HPLC-kolonnen. Figur 14 viser UV-absorpsjonsmønsteret for fraksjoner fra "S-Sepharose Fast Flow"-kromatografi av en blanding inneholdende bakteriefremstilt, sulfonylert rhNT-3. Figur 15 viser "Macroprep High S"-kationbytterkromatografi av en blanding inneholdende in vitro gjenfoldede former av rhNT-3. Resinet ble erholdt fra Biorad. Kolonne-dimensjonene var 9x9 cm. En SSFF-porsjon på 700 ml inneholdende gjenfoldet (etter 36 timers gjenfolding), pH 6,8, ble påsatt "Macroprep"-kolonnen med en hastighet på tilnærmet 310 ml/min. Betingelsene er gitt i teksten. Figur 16 viser "Phenyl Sepharose Fast Flow High Substitution"- (hydrofob interaksjonskromatografi) kromatografi av kationbytterrenset, gjenfoldet rhNT-3 for fjerning av feilfoldede varianter. Figur 17 viser en "SP-Sepharose High Performance"-kromatografi av HIC-rhNT-3-porsjonen.
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
Definisjoner
Som benyttet heri, viser "neurotrofin" til et neurotrofin, fortrinnsvis et neurotrofin fra NGF-familien, heriblant NGF, NT-3, NT-4/5 og BDNF, fra enhver art, inkludert mus, storfe, sau, svin, hest, fugl og, fortrinnsvis, menneske, i nativ sekvens eller i en genetisk modifisert form, og fra enhver kilde, enten naturlig, syntetisk eller rekombinant fremstilt. For eksempel viser "NGF" til nervevekstfaktor fra enhver art, heriblant mus, storfe, sau, svin, hest, fugl, og, fortrinnsvis, menneske, i nativ sekvens eller i genetisk modifisert variantform, og fra enhver kilde, enten naturlig, syntetisk eller rekombinant fremstilt. Neurotrofinet er fortrinnsvis rekombinant fremstilt. I en foretrukket fremgangsmåte klones neurotrofinet og dets DNA uttrykkes, f.eks. i pattedyrceller eller i bakterieceller. Prosessene og fremgangsmåtene som beskrives heri, kan også anvendes for neurotrofinene GDNF og neurturin.
Foretrukket for anvendelse i mennesket er nativ, human sekvens, moden NGF, mer foretrukket en sekvens på
120 aminosyrer, og enda mer foretrukket, en sekvens på
118 aminosyrer. Mer foretrukket er denne native NGF-sekvens rekombinant fremstilt. Den foretrukne aminosyresekvens for human pre-pro-NGF og human, moden NGF er tilveiebrakt i US patentskrift nr. 5 288 622, som inkorporeres spesifikt heri ved referanse. Formen på 120 aminosyrer, uten ytterligere posttranslasjonelle modifiseringer, er en foretrukket form i
homodimerformen (dvs. 120/120). Enda mer foretrukket er 118-formen uten ytterligere posttranslasjonelle modifiseringer, spesielt som en homodimer (dvs. 118/118).
Med "i det vesentlige rent" menes en renhetsgrad for totalt neurotrofin, f.eks. NGF, relativt til totalprotein-mengden hvor det er minst 70% neurotrofin, mer foretrukket minst 80%, og enda mer foretrukket økende til minst 90%, 95% eller 99%. En spesielt foretrukket renhet er minst 95%. Med "i alt vesentlig rent" menes at preparatet er minst 90% eller renere, med hensyn til det ønskede neurotrofin.
Med "i det vesentlige fritt for neurotrofinvariant" menes et preparat hvor prosenten av den ønskede neurotrofin-type relativt til den totale neurotrofinmengde (innbefattet mindre ønskelige neurotrofintyper) er minst 70% ønsket neuro-trofintype, mer foretrukket minst 80%, og enda mer foretrukket økende til minst 90%, 93%, 95% eller 99%. Med "i alt vesentlig fritt for" menes at preparatet inneholder minst 90% eller mer av det ønskede neurotrofin. Et spesielt foretrukket nivå er minst 95% av det ønskede neurotrofin, f.eks. av type korrekt foldet, intakt 118/118 rhNGF. De andre uønskede typer eller former kan være feilprosesserte former eller kjemiske varianter, f.eks. varianter med endret ladning, som følge av fermenteringen eller renseprosessen, eller fortrinnsvis alle de ovenstående, som beskrevet heri. Når f.eks. NGF foldes in vitro etter syntese i bakterier, kan "typer" eller "varianter" omfatte feilfoldede eller delvis foldede former.
Med "feilfoldet" variant menes en variant av neuro-trof invariant som avviker fra neurotrofinet ved forskjellig paring av cysteinrestene eller ved de bestemte cysteinrester som er frie eller blokkerte. Feilfoldede varianter kan også ha samme cysteinparing som neurotrofinet, men har en forskjellig tredimensjonal konformasjon som følge av feilfolding.
Med "kjemisk" variant menes en variant som avviker kjemisk fra neurotrofinet, f.eks. ved at den har endret ladning, ved karbamylering, deamidering, oksidasjon, glykosyler-ing eller proteolytisk kløyving.
Buffere for kolonnesiden ved denne oppfinnelsen har generelt en pH i området mellom tilnærmet 5 og 8. Buffere som vil kontrollere pH innenfor dette området, omfatter f.eks. sitrat, succinat, fosfat, MES, ADA, BIS-TRIS-propan, PIPES, ACES, imidazol, dietylmalonsyre, MOPS, MOPSO, TES, TRIS-buffer som TRIS-HC1, HEPES, HEPPS, TRICINE, glysinamid, BICINE, glysylglysin, og boratbuffere. En foretrukket buffer er en MOPSO-buffer.
Som benyttet heri, er "alkoholer" og "alkoholiske
løsningsmidler" ment i lys av den vanlig benyttede terminologi for alkohol, fortrinnsvis alkoholer med 1 til 10 karbonatomer, mer foretrukket metanol, etanol, isopropanol, n-propanol eller t-butanol, så vel som glyserol, propylenglykol, etylenglykol,
heksylenglykol, polypropylenglykol og polyetylenglykol, og mest foretrukket etanol eller isopropanol. Slike alkoholer er løsningsmidler som ved tilsetning til en vandig løsning øker løsningens hydrofobisitet ved å redusere dens polaritet.
MOPSO er 3-(N-morfolino)-2—hydroksypropansulfonsyre. HEPES er N-2-hydroksyetylpiperazin-N<1->2-etansulfonsyre. Reagensalkohol er 95 deler (vol/vol) (spesielt denaturert alkohol formel 3A og 5 deler (vol/vol) isopropylalkohol). MES er 2-(N-morfolino)etansulfonsyre. UF/DF står for ultrafiltrering/diafiltrering. TMAC er tetrametylammoniumklorid. TEAC er tetraetylammoniumklorid. NGF-120 står for fullengde 120/120-nervevekstfaktor. NGF-118 står for homodimert, modent NGF-molekyl med 118 aminosyrerester. Oksidert NGF står for NGF-variant-molekylet, metsulfoksid37, som rapporteres heri å besitte tilnærmet 80% av den biologiske aktivitet til den modne, native NGF. Isoasp-NGF står for NGF-isomerisert variantmolekyl, Asp93. Deamidert NGF står for NGF hvor Asn45 er overført til Asp45. RNGF står for et NGF-molekyl med en ekstra argininrest i N-enden. CHO står for "Chinese hamster" ovarieceller.
Resiner beskrevet heri, omfatter "MACROPREP HIGH S"-kationbytter (BIO-RAD Laboratories; kraftig kationbytter, funksjonell gruppe: SO3, nominell partikkelstørrelse: 50 m, nominell porestørrelse: 1 000 Å), kiselgel (ikke-derivatis-ert), "Phenyl Sepharose Fast Flow Low Substitution" (Pharmacia, 6% agarose med høy grad av kryssbinding, partikkelstør-relse: 45-165 pm) , "SP-Sepharose HP" (Pharmacia, 6% agarose med høy grad av kryssbinding, partikkelstørrelse: 34 um),
"Phenyl Toyopearl 650 M" (TosoHaas, partikkelstørrelse: 40-
90 um) , og "Fractogel EMD S03 - 650 S" (EM Separations, en partner fra de forente stater av E. Merck (Tyskland), partik-kelstørrelse: 25-40 m).
Måter for utførelse av oppfinnelsen
Neurotrofiner tilhører en familie med små, basiske proteiner som spiller en nøkkelrolle i utvikling og vedlike-hold av nervesystemet. Det først identifiserte og trolig best forståtte medlem av denne familie er nervevekstfaktor (NGF). Se US patentskrift nr. 5 169 762, tildelt 8. desember 1992. Nylig ble sekvensbeslektede, men forskjellige polypeptider med tilsvarende funksjoner som NGF, identifisert. For eksempel ble hjerneavledet, neurotrofisk faktor (BDNF), også betegnet neurotrofin-2 (NT2), klonet og sekvensert av Leibrock et al.
(Nature, 341:49-152 [1989]). Flere grupper identifiserte en neurotrofisk faktor som opprinnelig ble kalt neuronal faktor (NF) og som nå betegnes neurotrofin-3 (NT3). (Ernfors et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 87:5454-5458 [1990]; Hohn et al., Nature, 344:339 [1990]; Maisonpierre et al., Science, 247:1446
[1990]; Rosenthal et al., Neuron, 4:767 [1990]; Jones og Reichardt, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 87:8060-8064 [1990]; Kaisho et al., FEBS Lett., 266:181 [1990]). Neurotrofin-4/5 (betegnet enten NT4 eller NT5) er identifisert (Hallbook et al., Neuron, 5:845-858 [1991]; Berkmeier et al., Neuron, 7:857-866 [1991]; lp et al., Proe. Nati. Acad. Sei, USA, 89:3060-3064 [1992]). US patentskrift nr. 5 364 769 tildelt 15. november 1994, beskriver humant NT-4/5 og fremgangsmåter for rekombinant ekspresjon av dette og inkorporeres heri ved referanse. Også beskrevet er kimære og pantropiske neurotrofiner, f.eks. det rapportert i US patentskrift nr. 5 488 099, tildelt 30. januar 1996, i Urfer et al., EMBO J., 13(24):5896-909 (1994) og i WO 95/33829, publisert 14. desember 1995 (inkorporert heri ved referanse), hvor neurotrofinet er modifisert slik at det bindes til mer enn én reseptor eller inneholder en reseptorbindingsaktivitet som ikke normalt foreligger i vesentlig grad i det native neurotrofin. Av spesiell interesse er neurotrofinene betegnet MNTS-1 og D15A NT3. Også av spesiell interesse er neurotrofiner med en NGF-aminosyre-ryggrad, men modifisert slik at de bindes til andre reseptorer enn trkA, f.eks. trkB eller trkC. Foretrukne er slike hvor aminosyresubstitusjoner er utført i NGF med en aminosyre fra en tilsvarende posisjon i NT-3 som er ansvarlig for binding til trk-reseptoren for NT-3. Slike NGF-mutanter har NT-3-lignende reseptorbindingsaktivitet samtidig som de bibeholder farmakokinetikken og renseoppførselen til NGF (Urfer et al., Biochemistry, 36( 16):4775-4781 (1997)). Disse NGF-mutanter kan også mangle trkA-bindingsaktivitet (Shih et al., J. Biol. Chem., 259(44):27679-86 (1994)). Slike NGF-mutanter er spesielt foretrukne neurotrofiner for anvendelse som beskrives heri.
Isolering av et rekombinant, humant neurotrofin, f.eks. rhNGF, omfatter separasjon av proteinet fra en rekke forskjellige vertscellekontaminanter. Hvert trinn omfatter spesielle buffere som tillater den nødvendige separasjon å finne sted. Det siste eller nest siste behandlingstrinn for et neurotrofin kompliseres av at det foreligger flere neurotrofinvarianter som renses sammen med neurotrofinet ved benyttelse av konvensjonelle kromatografimedier. Dersom et gjenfoldingstrinn omfattes i gjenvinnings- og renseprosessen, omfatter variantene feilfoldede former av neurotrofinet. Varianter kan også omfatte slike som avviker kjemisk fra neurotrofinet, f.eks. karbamylerte, deamiderte, deamiderte eller proteolytisk kløyvede former. Når det gjelder NGF, består disse typer hovedsakelig av dimere former - homodimerer, f.eks. 120/120 eller 117/117 mens 118/118 er ønsket, eller heterodimerer, f.eks. 120/118, 117/118 -, kjemisk modifiserte varianter - isoaspartatvarianter, monooksiderte varianter, glykosyleringsvarianter, N-terminalt og C-terminalt avkortede former og dimerer av disse.
Oppfinnelsen muliggjør fremstilling i stor skala av neurotrofiner, særlig rhNGF, i mengder som er tilstrekkelige for terapeutiske anvendelser, f.eks. ved behandling av Alz-heimers sykdom, perifere neuropatier, heriblant diabetiske og AIDS-forbundne neuropatier og lignende.
I lys av likheten i sekvens og konformasjon mellom
NGF og andre neurotrofiner, særlig de i NGF-familien, kan fremgangsmåtene som beskrevet heri benyttes for fremstilling av disse neurotrofiner, i det vesentlige frie for feilprosesserte, feilfoldede eller delvis foldede varianter, glykosyleringsvarianter og/eller ladningsvarianter. I foreliggende oppfinnelse identifiseres kolonneresiner og -betingelser som er fordelaktige for selektiv separasjon av neurotrofiner fra disse og andre nært beslektede varianter. Neurotrofiner omfatter NT-3, NT-4/5, NT-6, BDNF og modifiserte former, heriblant heterodimere, kimære og pantropiske former av disse. Neurotrofinene er fortrinnsvis humane eller svært homologe med den humane aminosyresekvens, fortrinnsvis mer enn 80%, mer foretrukket mer enn 90%, og mest foretrukket mer enn 95% homologe med de humane sekvenser. Et modifisert neurotrofin vil bibeholde minst 50% av trk-reseptorbindingsfunksjonen til det native neurotrofin det skal etterligne, fortrinnsvis minst 75%, og mer foretrukket minst 80%. Disse modifiserte former er slike som har bevart tilstrekkelig høy pl eller det native neurotrofins hydrofobe natur, slik at det bibeholder en lignende yteevne i prosessene som beskrives heri.
Som beskrevet nedenfor, har prosessene som beskrives heri, vært benyttet med hell for rhNGF, rhNT-3 og rhNT-4/5. For eksempel ble rhNT-4/5 som var fremstilt i E. coli, isolert i inklusjonslegemer og redusert og løseliggjort fra inklusjonslegemene. Det reduserte NT-4/5 ble delvis renset ved "DE Sepharose Fast Flow"- og "S-Sepharose Fast Flow"-kromatografi. "S-Sepharose Fast Flow"-porsjonen ble gjenfoldet i en guani-dinholdig buffer i 24 timer. Feilfoldede former av NT-4/5 ble fjernet ved kromatografi som beskrevet heri i stor skala. De karbamylerte og kuttede (feilprosesserte former) av NT-4/5 ble fjernet ved høyytelses-kationbytterkromatografi med en PolyCat A-HPLC-resin eller "SP-Sepharose HP"-resin i kolonneformat i stor skala. Det rensede rhNT-4/5 ble ultrafiltrert og diafiltrert over i en sur buffer for utforming til preparatet.
Det beskrives også rensing av et neurotrofin fra dets beslektede varianter, vanligvis etter at neurotrofinet allerede er renset fra de fleste andre forurensninger, typisk i det siste trinn eller nær det siste trinn før avsalting eller diafiltrering forut for utforming til preparater. De beslektede varianter i blandingen kan omfatte ikke bare varianter blandet under fermenteringen, men også varianter fremstilt dersom neurotrofinet degraderes ved lagring eller under prosessering.
Neurotrofinene som er egnet for anvendelse med utfør-elser av oppfinnelsen, kan fremstilles ved ethvert middel, men fremstilles fortrinnsvis rekombinant. Et nukleinsyremolekyl som koder for neurotrofinene som diskuteres heri, er tilgjengelig fra flere kilder, f.eks. ved kjemisk syntese ut fra den kjente DNA-sekvens eller ved benyttelse av standard klonings-teknikker kjent innen faget. cDNA-kloner som bærer neurotrofinet, f.eks. hNGF-kodende sekvens, kan identifiseres ved bruk av oligonukleotidhybridiseringsprober, spesifikt utformet basert på den kjente neurotrofinsekvens.
Etter erholdelse av et molekyl som omfatter den neurotrofinkodende sekvens, innsettes molekylet i en klon-ingsvektor som er egnet for ekspresjon i den valgte vertscelle. Kloningsvektoren konstrueres slik at den tilveiebringer de nødvendige regulatoriske funksjoner som kreves for effektiv transkripsjon, translasjon og prosessering av den kodende sekvens .
Dersom neurotrofinet fremstilles rekombinant, er egnede vertsceller for ekspresjon av DNA som koder for neurotrofinet, prokaryote celler, gjærceller eller høyere eukaryote celler. Egnede prokaryoter for dette formål omfatter bakterier som arkebakterier og eubakterier. Foretrukne bakterier er eubakterier som gramnegative eller grampositive organismer, f.eks. Enterobacteriaceae som Escherichia, f.eks. E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, f.eks. Salmonella typhimurium, Serratia, f.eks. Serratia marcescens, og Shigella; Bacilli som B. subtilis og B. licheniformis (f.eks. B. licheniformis 41P beskrevet i DD 266 710, publisert 12. april 1989); Pseudomonas som P. aeruginosa; Streptomyces; Azotobacter; Rhizobia; Vitreoscilla; og Paracoccus. Egnede E. coli-verter omfatter E. coli W3110 (ATCC 27 325), E. coli 94 (ATCC 31 446), E. coli B og E. coli X1776 (ATCC 31 537). Disse eksempler er illustrerende snarere enn begrensende.
Inkorporert heri i sin helhet er PCT-publikasjon WO 95/30686 publisert 16. november 1995. Publikasjonen er spesielt relevant grunnet sin beskrivelse av bakteriell syntese og in vitro folding av NGF. Produktene fra denne prosess kan behandles ved rensefremgangsmåtene som beskrevet heri.
Mutantceller av enhver av de ovenfor nevnte bakterier kan også benyttes. Det er naturligvis nødvendig å utvelge de egnede bakterier ved at man tar i betraktning replikonets replikerbarhet i bakteriecellene. For eksempel kan E. coli, Serratia eller Salmonella-arter med fordel benyttes som vert dersom velkjente plasmider som pBR322, pBR325, pACYA177 eller pKN410 benyttes som kilde for replikonet. E. coli-stamme W3110 er en foretrukken vert eller utgangsvert da den er en vanlig vertsstamme for fermentering av rekombinant DNA-produkter. Vertscellen utskiller fortrinnsvis minimale mengder av proteo-lytiske enzymer. For eksempel kan stamme W3110 modifiseres slik at det oppnås en genetisk mutasjon i genene som koder for proteiner som er endogene for verten, hvor eksempler på slike verter omfatter E. coli W3110-stamme 1A2 som har den fullstendige genotype tonA A; E. coli W3110-stamme 9E4 som har den fullstendige genotype tonA A ptr3; E. coli W3110-stamme 27C7 (ATCC 55 244) som har den fullstendige genotype tonA ptr3 phoA A E15 A (argF-lac)169 A degP A ompT kan<r>; E. coli W3110-stamme 37D6 som har den fullstendige genotype tonA ptr3 phoA A E15 A (argF-lac)169 A degP A ompT A rbs7 ilvG kan r; E. coli W3110-stamme 40 B4, som er stamme 37D6 med en ikke-kanamycin-resistent degP-delesjonsmutasjon, og en E. coli-stamme med mutant periplasmatisk protease, beskrevet i US patentskrift nr. 4 946 783 tildelt 7. august 1990.
Human NGF er blitt uttrykt i E. coli. Isolering og sekvens av genet som koder for (5-subenheten av hNGF og ekspresjon som et heterologt protein i E. coli, er beskrevet i US patentskrift nr. 5 288 622. Beskrivelsene i denne er også egnet for tilveiebringelse av moden, human NGF fremstilt i pattedyrceller. Ved benyttelse av rekombinante teknikker ble human Ø-NGF uttrykt fritt for andre pattedyrproteiner. Ekspresjon av hNGF i E. coli ved benyttelse av to gener som inneholdt en endret aminoende, førte til ekspresjon av et fusjon-ert protein som ble beskrevet av Iwai et al., Chem. Pharm. Bull. 34:4724 (1986).
I tillegg til prokaryoter er eukaryote mikrober som filamentøs sopp eller gjær, egnede ekspresjonsverter for neurotrofinkodende vektorer. Saccharomyces cerevisiae, eller vanlig brødgjær, er den vanligst benyttede blant de lavere eukaryote vertsmikroorganismer. Imidlertid er en rekke andre slekter, arter og stammer lett tilgjengelige og anvendbare heri, f.eks. Schizosaccharomyces pombe [Beach og Nurse, Nature, 290:140 (1981); EP 139 383 publisert 2. mai 1985]; Kluyveromyces-verter [US patentskrift nr. 4 943 529; Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)] som f.eks. K. lactis [MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol, 737 (1983)], K. fragilis (ATCC 12 424), K. bulgaricus (ATCC 16 045), K. wickeramii (ATCC 24 178), K. Waltii (ATCC 56 500), K. drosophilarum [ATCC 36 906; Van den Berg et al., Bio/Tech-nology, 8:135 (1990)], K. thermotolerans og K. marxianus; yarrowia [EP 402 226]; Pichia pastoris [EP 183 070; Sree-krishna et al., J. Basic Microbiol., 28:265-278 (1988)]; Candida; Trichoderma reesia [EP 244 234]; Neurospora crassa [Case et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 75:5259-5263
(1979)]; Schwanniomyces, f.eks. Schwanniomyces occidentalis [EP 394 538 publisert 31. oktober 1990]; og filamentøs sopp som f.eks. Neurospora, Penicillium, Tolypocladium [WO 91/00357 publisert 10. januar 1991], og Aspergillus-verter som A. nidulans [Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 (1983); Tilburn et al., Gene, 25:205-221 (1983); Yelton et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 81:1470-1474
(1984) ] og A. niger [Kelly og Hynes, EMBO J., 4:475-479
(1985) ].
Egnede vertsceller som er passende for ekspresjon av DNA som koder for neurotrofinet, kan også være avledet fra multicellulære organismer. Slike vertsceller er i stand til kompliserte prosesserings- og glykosyleringsaktiviteter. I prinsippet er enhver kultur av høyere eukaryote celler egnet, enten cellene er fra en vertebratkultur eller en invertebrat-kultur. Eksempler på invertebratceller omfatter planteceller og insektceller. En rekke baculovirusstammer og -varianter og tilsvarende følsomme insektsvertsceller fra verter som Spodoptera frugiperda (kålorm), Åedes aegypti (moskito), Åedes al-bopictus (moskito), Drosophila melanogaster (bananflue) og Bombyx mori, er identifisert. Se f.eks. Luckow et al., Bio/- Technology, 5:47-55 (1988); Miller et al., i Genetic Engineer-ing, Setlow, J.K. et al., red., bind 8 (Plenum Publishing, 1986), s. 277-279; og Maeda et al., Nature, 515:592-594
(1985). En rekke virusstammer for transfeksjon er alminnelig tilgjengelige, f.eks. L-l-varianten av Autographa californica NPV og Bm-5-stammen av Bombyx mori NPV, og slike virus kan benyttes heri, spesielt for transfeksjon av Spodoptera frugiperda-celler. Human NGF er blitt fremstilt i insektceller som rapportert i US patentskrift nr. 5 272 063, tildelt 21. desember 1993.
Plantecellekulturer fra bomull, mais, potet, soya-bønne, petunia, tomat og tobakk kan-benyttes som verter. Planteceller transfekteres typisk ved inkubasjon med visse stammer av bakterien Agrobacterium tumefaciens, som på forhånd er manipulert slik at den inneholder DNA som koder for neurotrofinet. Under inkubasjonen av plantecellekulturen med A. tumefaciens overføres DNA som koder for neurotrofinet, til plan-tecelleverten slik at den transfekteres og, under egnede betingelser, uttrykker DNA som koder for neurotrofinet. I tillegg er regulatoriske sekvenser og signalsekvenser som er forenlige med planteceller, tilgjengelige, f.eks. nopalinsyn-tasepromoteren og polyadenyleringssignalsekvenser (Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen., 1:561 (1982)). I tillegg er DNA-seg-menter isolert fra oppstrømsområdet fra T-DNA 780-genet i stand til å aktivere eller forhøye transkripsjonsnivået av gener som uttrykkes i planter i rekombinant DNA-holdig plan-tevev (EP 321 196 publisert 21. juni 1989).
Eksempler på anvendbare pattedyrvertscellelinjer er apenyrelinjen CV1 transformert med SV4 0 (COS-7, ATCC CRL 1651); human, embryonal nyrelinje [293 eller 293-celler sub-klonet for vekst i suspensjonskultur, Graham et al., J. Gen Virol., 35:59 (1977)]; "baby hamster"-nyreceller (BHK, ATCC CCL 10); "Chinese hamster"-ovarieceller/-DHFR [CHO, Urlaub og Chasin, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 77:4216 (1980)]; muse-ser-toliceller [TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)]; apenyreceller (CV1, ATCC CCL 70); "African green monkey"-nyre-celler (VER0-76, ATCC CRL-1587); humane cervix-karsinomceller (HELA, ATCC CCL 2); hundenyreceller (MDCK, ATCC CCL 34); bøf-felrotteleverceller (BRL 3A, ATCC CRL 1442); humane lunge-celler (W138, ATCC CCL 75); humane leverceller (Hep G2, HB 8065); muse-brysttumor (MMT 060562, ATCC CCL 51); TRI-celler [Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sei., 383:44-68 (1982)]; MRC 5-celler; FS4-celler og en human hepatomlinje (Hep G2). En foretrukket fremgangsmåte er ekspresjon i CHO-celler. Eksonet i human NGF som inneholder prepro-NGF, kan benyttes for å oppnå ekspresjon av utskilt, moden NGF (innbefattet 118- og 120-former) ved benyttelse av egnede promoterer og vektorer (US patentskrift nr. 5 288 622). Kulturer av stabile CHO-celler som er stabilt transfektert og utskiller modne NGF-former, er anvendbare i oppfinnelsen som beskrevet i eksemplene heri.
Vertceller blir transfektert og fortrinnsvis transformert med de ovenfor beskrevne ekspresjonsvektorer og klon-ingsvektorer og dyrket i konvensjonelle næringsmedier, modifisert etter behov for induksjon av promoterer, seleksjon av transformanter eller amplifisering av genene som koder for de ønskede sekvenser. Transfeksjon viser til opptak av en ekspresjonsvektor i en vertscelle, uavhengig av hvorvidt kodende sekvenser uttrykkes. En rekke transfeksjonsfremgangsmåter er kjent blant gjennomsnittsfagfolk, f.eks. ved benyttelse av CaP04 eller elektroporering. Vellykket transfeksjon oppdages generelt ved at ethvert tegn på at vektoren fungerer opptrer i vertscellen.
Transformasjon betyr innføring av DNA i en organisme slik at DNA kan replikeres, enten som et ekstrakromosomalt element eller ved integrering i kromosomet. Avhengig av den benyttede vertscelle utføres transformasjonen ved benyttelse av standardteknikker som passer for slike celler. Kalsium-behandling med kalsiumklorid som beskrevet i seksjon 1.82 i Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual [New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989], eller elektroporering benyttes generelt for prokaryoter eller andre celler som har omfattende celleveggbarrierer. Infeksjon med
Agrobacterium tumefaciens benyttes for transformering av visse planteceller, som beskrevet av Shaw et al., Gene, 23:315
(1983) og WO 89/05859 publisert 29. juni 1989. I tillegg kan planter transformeres ved å benytte ultralydbehandling som beskrevet i WO 91/00358, publisert 10. januar 1991.
For pattedyrceller uten slike cellevegger foretrekkes kalsiumfosfatutfellingsfremgangsmåten til Graham og van der
Eb, Virology, 52:456-457 (1978). Generelle sider ved transformasjon av pattedyrcellevertssystemer er beskrevet av Axel i US patentskrift nr. 4 399 216, tildelt 16. august 1983. Transformasjon av gjær utføres typisk ifølge fremgangsmåten til Van Solingen et al., J. Bact., 130:946 (1977) og Hsiao et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (USA), 75:3829 (1979). Imidlertid kan andre fremgangsmåter for innføring av DNA i celler, f.eks. ved mikroinjeksjon i kjernen, elektroporering, fusjon av bakterie-protoplaster med intakte celler eller polykationer, f.eks. polybren, polyornitin etc, også benyttes. For forskjellige teknikker for transformasjon av pattedyrceller, se Keown et al., Methods in Enzymology (1990), bind 185, s. 527-537, og Mansour et al., Nature, 335:348-352 (1988).
Fortrinnsvis innsettes genet for hNGF i vektoren slik at det er tilgjengelig et metionininitieringskodon, fortrinnsvis ett av de to metionininitieringskodoner identifisert av Ullrich et al., Nature, 303:821-825 (1983)). hNGF-genet (Ullrich et al., Cold Spring Harbor Symposia on Quant. Biol. XLVIII, s. 435 (1983); US patentskrift nr. 5 288 622) har to metioniner nær hverandre som sannsynligvis benyttes som trans-lasjonsinitieringskodoner (posisjon 1 viser til den N-terminale serinrest i moden hNGF). I motsetning til dette har cDNA for NGF fra submaksillærkjertelen hos mus, den mest grundig undersøkte nervevekstfaktor, et metionin i posisjon -187 i tillegg til dem i posisjonene -121 og -119. I en foretrukket utførelse for ekspresjon i pattedyrceller foreligger prepro-NGF-sekvensen.
Dersom prokaryote celler benyttes for fremstilling av neurotrofin, dyrkes de i egnede medier hvor promoteren kan være konstitutivt indusert eller induseres kunstig som generelt beskrevet i f.eks. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York 1989). Enhver nødvendig tilsetning ved siden av karbon-kilder, nitrogenkilder og kilder for uorganisk fosfat kan også innbefattes i egnede konsentrasjoner, innført alene eller blandet med andre tilsetninger eller medier, f.eks. en kom-pleks nitrogenkilde.
Dersom pattedyrvertsceller benyttes for fremstilling av neurotrofin, kan de dyrkes i en rekke forskjellige medier. Kommersielt tilgjengelige medier som Ham's F10 (Sigma), "Minimal Essential Medium" ([MEM], Sigma), RPMI-1640 (Sigma), og Dulbeccos modifiserte Eagles medium ([DMEM], Sigma), er egnet for dyrkning av vertcellene. I tillegg kan ethvert av mediene beskrevet i Ham og Wallace, Meth. Enz., 58:44 (1979); Barnes og Sato, Anal. Biochem., 102:255 (1980); US patentskrifter nr. 4 767 704; 4 657 866; 4 927 762; 5 122 469; 4 560 655; WO 90/03430; WO 87/00195; eller US patentskrift nr. Re 30 985, hvis beskrivelser alle inkorporeres heri ved referanse, benyttes som dyrkningsmedium for vertscellene. Hvert av disse medier kan suppleres etter behov med hormoner og/eller andre vekstfaktorer (f.eks. insulin, transferrin eller epidermal vekstfaktor), salter (f.eks. natriumklorid, kalsium, magnesium og fosfat), buffere (f.eks. HEPES), nukleosider (adenosin og tymidin), antibiotika (f.eks. medikamentet "Gentamycin TM"), sporelementer (definert som uorganiske forbindelser som vanligvis foreligger i sluttkonsentrasjoner i mikromolarområdet), og glukose eller en tilsvarende energikilde. Eventuelt andre nødvendige tilsetninger kan også innbefattes i egnede konsentrasjoner som vil være kjent blant fagfolk. Dyrkningsbetingel-sene, f.eks. temperatur, pH og lignende, er slike som tidligere er benyttet med vertscellen som er valgt for ekspre-sjonen, og vil være åpenbare for gjennomsnittsfagmannen.
Generelt kan prinsipper, fremgangsmåter og praktiske teknikker for å maksimalisere produktiviteten av pattedyrcel-lekulturer in vitro finnes i Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler, red. (IRL Press ved Oxford Uni-versity Press, Oxford, 1991). Prosessen ovenfor kan benyttes enten neurotrofinet fremstilles intracellulært eller i periplasmarommet, eller skilles ut direkte i mediet.
Dyrkningsvæsken høstes typisk etter et egnet tidsrom og standard identifiseringsanalyser, f.eks. immunanalyser som ELISA og Western blot-analyse, eller biologiske analyser som PC12-celledifferensiering (Greene, L.A., Trends Neurosci. 7:91
(1986)), utføres. Analyser for å fastslå type og omfang av variantene som beskrives heri, er kjent innen faget, eller de tilveiebringes eller siteres i eksemplene (se f.eks. Schmelzer et al., J. Neurochem., 59(5):1675-83 (1992) og Burton et al., J. Neurochem. 59(5):1937-45 (1992), som inkorporeres heri ved referanse.
Neurotrofinpreparatet som fremstilles fra cellene, behandles fortrinnsvis med minst ett rensetrinn før HIC. Eksempler på egnede rensetrinn omfatter dem som beskrives heri, heriblant affinitetskromatografi, andre teknikker for protein-rensing som kiselgelkromatografi med heparin-"Sepharose", kromatografi med et anion- eller kationbytterresin (f.eks. en polyasparaginsyrekolonne), kromatofokusering og preparativ SDS-PAGE, avhengig av neurotrofinet som skal gjenvinnes og den benyttede startkultur.
I én utførelse hvor neurotrofinet utskilles direkte i mediet, skilles mediet fra cellerestene ved sentrifugering, og det klarede fermenteringsbrygg eller -medium benyttes så for rensing på kiselgel. For kiselgelkromatografi passeres brygget typisk gjennom ikke-derivatiserte kiselgelpartikler slik at neurotrofinpolypeptidet festes til kiselgelpartiklene, kiselgelpartiklene vaskes for å fjerne kontaminanter, og polypep-tidet elueres fra kiselgelpartiklene med en buffer som inneholder et alkoholisk eller polart, aprotisk løsningsmiddel og et salt av et alkalisk jordmetall eller et alkalimetall, eller et uorganisk ammoniumsalt.
I en foretrukket utførelse benyttes "Macroprep High S"-kationbytterkromatografi for å skille neurotrofin fra dets varianter, så vel som for å redusere mengden av andre kontaminanter. Dette resin kan benyttes som et tidlig trinn i rensingen av et neurotrofin fra pattedyrcellekultur, fortrinnsvis for fraksjonering av det høstede celledyrkningsmedium. I en annen utførelse benyttes "Macroprep High S"-kationbytterkromatografi fortrinnsvis umiddelbart etter et proteingjenfoldingstrinn. Den svært høye gjennomstrømning i denne kationbytterkolonne tillater enkel konsentrering av neurotrofinet i det store volum av fortynnet, gjenfoldet protein eller høstet celledyrkningsmedium før påfølgende kromatografitrinn, f.eks. HIC eller "SP-Sepharose", ved å justere betingelsene slik at neurotrofinene bindes til kolonnen. Videre tillater resinets kationbytternatur fjerning av ubundne proteiner og noen feilprosesserte varianter og kjemisk modifiserte varianter (f.eks. endret ladning, MET37-oksidert variant). Viktigst er det at dersom feilfoldede varianter eller kjemisk modifiserte varianter, (f.eks. feilprosesserte varianter, glykosyleringsvarianter (f.eks. ved fremstilling i pattedyrcellekultur)) med forskjellig hydrofobisitet fra nativt neurotrofin foreligger, tillater "Macroprep"-resinet i det minste delvis fjerning av disse hydrofobe varianter og omfattende anrikning av det native neurotrofin, som fastslått heri. Selv om dette ikke er ment å være begrensende, antas det at ryggraden i resinstøttemidlet har et hydrofobt innhold som fremmer uspesifikke interaksjoner mellom neurotrofiner og resinet, noe som det dras fordel av i foreliggende oppfinnel-ses lære. For en elueringsbuffer med pH mellom tilnærmet 5 og 8, mer foretrukket mellom 6 og 8, er en TMAC-konsentrasjon fra 0 til 3 M anvendbar. Natriumacetat, dersom dette foreligger for å øke elueringsbufferens ionestyrke, tillater bruk av lavere TMAC-konsentrasjon. Klorid er en foretrukket erstatning for acetation.
I ett eksempel av utførelsen hvor neurotrofinet produseres i periplasmarommet, sentrifugeres dyrkningsmediet eller lysatet for å fjerne partikulære cellerester. Membranfraksjonen og den løselige proteinfraksjon kan så skilles fra hverandre, om nødvendig. Neurotrofinet kan så renses fra den løselige proteinfraksjon og fra membranfraksjonen i dyrknings-lysatet, avhengig av hvorvidt neurotrofinet er membranbundet, løselig eller foreligger i en aggregert form. Deretter løses neurotrofinet og gjenfoldes deretter ved benyttelse av en egnet buffer. Detaljene for denne fremgangsmåte for isolering fra periplasmaet for fremstilling av gjenfoldet protein, beskrives nedenfor.
Uløselig, ikke-nativt neurotrofin isoleres fra de prokaryote vertsceller i en egnet isoleringsbuffer ved enhver egnet teknikk, f.eks. én som omfatter behandling av cellene med en buffer med egnet ionestyrke for løseliggjøring av de fleste vertsproteiner, men hvor aggregert neurotrofin er i det vesentlige uløselig, og knusing av cellene slik at inklusjonslegemene frigjøres og blir tilgjengelige for gjenvinning ved f.eks. sentrifugering. Denne teknikk er velkjent og beskrives f. eks. i US patentskrift nr. 4 511 503.
Kort beskrevet, suspenderes cellene i bufferen (typisk ved pH 5 til 9, fortrinnsvis tilnærmet 6 til 8, ved benyttelse av en ionestyrke på tilnærmet 0,01 til 2 M, fortrinnsvis 0,1 til 0,2 M). Ethvert egnet salt, heriblant natriumklorid, kan benyttes for å opprettholde en tilstrekkelig ionestyrkeverdi. Mens cellene er suspendert i denne buffer, justeres de med vanlig benyttede teknikker, f.eks. mekan-iske fremgangsmåter som en Manton-Gaulin-pressmikrofluidisa-tor, en "French"-presse eller en ultralysoscillator, eller ved kjemiske eller enzymatiske fremgangsmåter.
Eksempler på kjemiske eller enzymatiske fremgangsmåter for celleoppbrytning omfatter dannelse av sfæroplaster som omfatter benyttelse av lysozym for lysering av bakterie-veggen (Neu et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 17:215
(1964)), og osmotisk sjokk, som omfatter behandling av levende celler med en løsning med høy tonisitet og med en vask med kaldt vann med lav tonisitet for frigjøring av polypeptidene (Neu et al., J. Biol. Chem., 240:3685-3692 (1965)). En tredje metode beskrevet i US patentskrift nr. 4 680 262, omfatter å sette de transformerte bakterieceller i forbindelse med en effektiv mengde av en lavere alkanol med 2 til 4 karbonatomer over et tidsrom og ved en temperatur som er tilstrekkelig til at cellene drepes og lyseres.
Etter oppbryting av cellene sentrifugeres typisk suspensjonen for nedsentrifugering av inklusjonslegemene. I én utførelse utføres dette trinn ved tilnærmet 500 til 15 000 x g, fortrinnsvis tilnærmet 12 000 x g, i en standardsentrifuge i et tilstrekkelig tidsrom som avhenger av volum og sentri-fugeutforming, vanligvis tilnærmet 10 minutter til 0,5 time. Det resulterende, nedsentrifugerte materiale inneholder i det vesentlige hele den uløselige polypeptidfraksjon, men dersom celleoppbrytningsprosessen ikke er fullstendig, kan den også inneholde intakte celler eller cellefragmenter. Celleoppbryt-ningens omfang kan analyseres ved å resuspendere pelleten i et lite volum av samme bufferløsning og eksaminere suspensjonen med et fasekontrastmikroskop. Forekomst av cellefragmenter eller hele celler viser at ytterligere oppbrytning er nødven-dig for å fjerne fragmentene eller cellene og de ikke-refraktile polypeptider som er forbundet med disse. Etter slik videre oppbrytning sentrifugeres, om nødvendig, suspensjonen igjen og nedsentrifugert materiale gjenvinnes, resuspenderes og analyseres. Prosessen gjentas inntil visuell undersøkelse viser fravær av cellefragmenter i det nedsentrifugerte materiale, eller inntil videre behandling ikke reduserer mengden nedsentrifugert materiale.
I en alternativ utførelse isoleres neurotrofinet fra periplasmarommet ved solubilisering i en egnet buffer. Denne fremgangsmåte kan være in situ solubilisering som omfatter direkte tilsetning av reagenser til fermenteringskaret etter rekombinant fremstilling av neurotrofinet, hvorved man unngår ekstratrinnene som omfatter høsting, homogenisering og sentrifugering for erholdelse av neurotrofinet. Gjenværende, fast materiale kan fjernes ved sentrifugering eller filtrering, eller ved kombinasjoner av disse.
Dersom neurotrofinet skal utfoldes, kan utfoldings-graden bestemmes ved kromatografi av det ikke-native neurotrofin, f.eks. ved RP-HPLC. Økende toppareal for det ikke-native materiale viser hvor mye ikke-nativt neurotrofin som foreligger .
Når det først er erholdt fra de løseliggjorte inklusjonslegemer eller i et senere rensetrinn, gjenfoldes neurotrofinet på egnet vis til en aktiv konformasjon som beskrevet nedenfor.
Dersom neurotrofinet ikke allerede er i løselig form før det skal gjenfoldes, kan det løseliggjøres ved inkubasjon i alkalisk buffer tilsatt kaotrope midler og reduksjonsmidler i mengder som er tilstrekkelige til i vesentlig grad å løse-liggjøre neurotrofinet. Inkubasjonen finner sted under betingelser vedrørende neurotrofinkonsentrasjon, inkubasjonstid og inkubasjonstemperatur som tillater løseliggjøring av neurotrofinet i den alkaliske buffer.
Måling av graden av løseliggjøring av neurotrofinet i bufferen utføres på egnet vis ved turbiditetsmåling, ved ana-lysering av neurotrofinfordelingen etter sentrifugering i supernatant og nedsentrifugert materiale i reduserende SDS-geler, ved proteinanalyse (f.eks. proteinanalysesettet fra Bio-Rad), eller ved HPLC.
pH-området for den alkaliske buffer for solubiliser-ingen er typisk minst tilnærmet 7,5, og med et foretrukket område mellom tilnærmet 8 og 11. Eksempler på egnede buffere som vil gi en pH innenfor dette siste område, omfatter glysin, CAPSO (3-[sykloheksylamino]-2-hydroksy-l-propansulfonsyre) , AMP (2-amino-2-metyl-l-propanol), CAPS (3-[sykloheksylamino]-1-propansulfonsyre), CHES (2-[N-sykloheksylamino]etansulfon-syre) og TRIS-HC1 (tris[hydroksymetyl]aminometan-hydroklorid. Den foretrukne buffer heri er glysin eller CAPSO, fortrinnsvis i en konsentrasjon på tilnærmet 20 mM, ved en pH mellom tilnærmet 8,5 og 11, fortrinnsvis rundt 10-11.
Konsentrasjonen av neurotrofinet i den bufrede solu-biliseringsløsning må være slik at neurotrofinet i vesentlig grad vil løseliggjøres, og delvis eller fullstendig reduseres og denatureres. Alternativt kan neurotrofinet i utgangspunktet være uløselig. Den nøyaktige mengde som skal benyttes, vil blant annet avhenge av konsentrasjonen og naturen av andre bestanddeler i den bufrede løsning, særlig type og mengde av reduksjonsmiddel, type og mengde kaotropt middel og pH av bufferen. For eksempel kan konsentrasjonen av neurotrofinet økes minst tre ganger dersom konsentrasjonen av reduksjonsmiddel, f.eks. DTT, samtidig økes, slik at et forhold mellom DTT og neurotrofin på mellom tilnærmet 3:1 til 10:1 opprettholdes. Det er ønskelig å fremstille en mer konsentrert løsning av løseliggjort protein før gjenfolding ved fortynning. Således er den foretrukne neurotrofinkonsentrasjon minst tilnærmet 30 mg/ml, med et mer foretrukket område på 30-50 mg/ml. For eksempel kan neurotrofinet løseliggjøres til en konsentrasjon på tilnærmet 30-50 mg/ml i 5 M til 7 M urea, 10 mM DTT, og f.eks. fortynnes til tilnærmet 1 mg/ml for foldingen.
Etter at neurotrofinet er løseliggjort, overføres det til eller fortynnes i en gjenfoldingsbuffer som inneholder 5-40% (vol/vol) alkoholisk eller aprotisk løsningsmiddel, et kaotropt middel og et alkalimetallsalt, alkalisk jordmetall-salt eller ammoniumsalt. Bufferen kan være enhver buffer benyttet i den første bufrede løsning, med CAPSO, glysin og CAPS foretrukket ved pH 8,5-11, særlig ved en konsentrasjon på tilnærmet 20 mM, og mest foretrukket CAPSO og glysin. Neurotrofinet kan fortynnes med gjenfoldingsbufferen, fortrinnsvis minst fem ganger, mer foretrukket minst tilnærmet ti ganger. Alternativt kan neurotrofinet dialyseres mot gjenfoldingsbufferen. Gjenfoldingen kan utføres ved tilnærmet 2-45 °C, mest foretrukket tilnærmet 2-8 °C i minst tilnærmet 1 time. ,Løsnin-gen kan også, om ønskelig, inneholde et reduksjonsmiddel og en osmolytt.
Reduksjonsmidlet kan med fordel utvelges blant dem beskrevet ovenfor for løseliggjøringstrinnet i det angitte konsentrasjonsområde. Konsentrasjonen vil særlig avhenge av konsentrasjonen av alkaliske jordmetallsalter, alkaliske metallsalter eller ammoniumsalter, neurotrofin og løsningsmid-del. Fortrinnsvis er konsentrasjonen av reduksjonsmiddel tilnærmet 0,5 til 8 mM, mer foretrukket tilnærmet 0,5-5 mM, enda mer foretrukket tilnærmet 0,5-2 mM. De foretrukne reduksjonsmidler er DTT og cystein.
Oksygen i gjenfoldingsløsningen kan eventuelt fjernes ved tilsetning av en inert gass, f.eks. helium eller argon, for fortrengning av oksygenet.
Den valgfrie osmolytt er fortrinnsvis sukrose (i en konsentrasjon på tilnærmet 0,25-1 M) eller glyserol (i en konsentrasjon på tilnærmet 1-4 M). Mer foretrukket er sukrosekon-sentrasjonen tilnærmet 1 M og glyserolkonsentrasjonen tilnærmet 4 M.
Utgangskonsentrasjonen av neurotrofin i foldingsbuf-feren er slik at forholdet mellom korrekt foldet og feilfoldet konformer som gjenvinnes, er høyest mulig, bestemt ved HPLC, RIA eller bioanalyse. Den foretrukne neurotrofinkonsentrasjon
(som fører til maksimalt utbytte av korrekt foldet konformer)
ligger i området fra tilnærmet 0,1 til 15 mg/ml, mer foretrukket 0,1 til 6 mg/ml, og mest foretrukket tilnærmet 0,2 til 5 mg/ml.
Graden av gjenfolding som skjer under denne inkuber-ing, bestemmes på egnet måte ved RIA-titeren av neurotrofinet eller ved HPLC-analyse, hvor økende RIA-titer eller toppstørr-elsen for korrekt foldet neurotrofin direkte samsvarer med økende mengder av korrekt foldet, biologisk aktiv neurotrofinkonformer i bufferen. Inkubasjonen utføres for å maksimalisere utbyttet av korrekt foldet neurotrofinkonformer og forholdet mellom korrekt foldet neurotrofinkonformer og feilfoldet neurotrofinkonformer som gjenvinnes, bestemt ved RIA eller HPLC, og for å minimalisere utbyttet av multimert, assosiert neurotrofin, bestemt ved massebalanse. Alternativt kan de forskjellige typer bestemmes ved hjelp- av fremgangsmåtene som tilveiebringes nedenfor og i eksemplene. Guanidin er et foretrukket denatureringsmiddel for gjenfolding.
Etter at neurotrofinet er gjenfoldet, er de påfølg-ende fremgangsmåter som beskrives heri, hver for seg eller i kombinasjon, eksempler på egnede rensefremgangsmåter for å oppnå høyere renhet og homogenitet: fraksjonering på kation-bytterkolonner, hydrofob interaksjonskromatografi (HIC) og kiselgelkromatografi.
Enten et gjenfoldingstrinn er del av prosessen eller ikke, er et foretrukket trinn for å separere neurotrofin fra sine varianter separasjon med hydrofob interaksjonskromato-graf iresin. Under fermenteringen, rensingen eller proteingjen-foldingen in vitro kan noe protein bli kjemisk modifisert, feilprosessert eller ikke gjenfoldes til sin native, tredimen-sjonale struktur, men snarere til andre strukturer som avviker når det gjelder stabilitet, solubilitet, immunogenitet eller bioaktivitet. Disse varianter må fjernes under gjenvinningen for å unngå uønskede bivirkninger, f.eks. antigenisitet eller tap av aktivitet. Dersom varianten er uløselig, kan den lett fjernes ved fast fase/væskeseparasjonsteknikker som sentrifugering og filtrering. Dersom varianten imidlertid er løse-lig, er adsorpsjonsteknikker med høyere resolusjon, f.eks. kromatografi, påkrevet for å fjerne dem. Ved fremstilling i prokaryote celler eller ved gjenfolding in vitro danner neurotrofiner en løselig, stabil, feilfoldet variant. Feilfoldet neurotrofin har endret disulfidparingsmønster og tredimensjonal struktur sammenlignet med nativt neurotrofin, og mangler den native farmakologiske aktivitet. Ved fremstilling i eukaryot cellekultur, f.eks. pattedyrcellekultur, er variantformene typisk feilprosesserte former. Disse mangler også typisk den native, farmakologiske aktivitet og bør fjernes. HIC er heri blitt funnet egnet for å skille disse varianter fra nativt neurotrofin.
HIC omfatter sekvensiell adsorpsjon og desorpsjon av protein fra faste støttemidler, formidlet gjennom ikke-ko-valent, hydrofob binding. Generelt påsettes prøvemolekylene i en buffer med høy saltkonsentrasjon på HIC-kolonnen. Saltet i bufferen interagerer med vannmolekyler og reduserer løsnings-middelinteraksjonen til molekylene i løsningen, hvorved hydrofobe områder i prøvemolekylene eksponeres slik at disse adsor-beres til HIC-kolonnen. Jo mer hydrofobt molekylet er, jo mindre salt trengs for å fremme binding. Vanligvis benyttes en nedadgående saltgradient for å eluere prøver fra kolonnen. Etter hvert som ionestyrken reduseres, økes eksponeringen av de hydrofile områder i molekylene, og molekylene elueres fra kolonnen i en rekkefølge som tilsvarer økende hydrofobisitet. Eluering av prøven kan også oppnås ved tilsetning av milde, organiske forbindelser eller detergenter til eluerings-buf feren. En oversikt over HIC gis i Protein Purification, 2. utg., Springer-Verlag, New York, s. 176-179 (1988).
Styrken av assosiasjonen mellom et protein og støt-temidlet avhenger av flere faktorer, heriblant størrelse og hydrofob karakter av den immobiliserte, funksjonelle gruppe, det omliggende løsningsmiddels polaritet og overflatespenning og proteinets hydrofobisitet. Bindingskapasiteten til HIV-støttemidler er vanligvis lav grunnet behovet for god avstand mellom de immobiliserte, hydrofobe ligander. Videre varierer et støttemiddels kapasitet for et gitt protein inverst med nivået av hydrofobe urenheter i prøvepreparatet. For å skille et ønsket protein fra varianter og andre urenheter samtidig som kapasiteten maksimaliseres, er det nødvendig å identifi-sere et egnet fast fase-medium for HIC så vel som egnede, mobile faser for påsetting, vask og eluering.
Som bestemt heri, var de mest egnede medier for å separere korrekt foldede og feilfoldede neurotrofiner eller feilprosesserte former fra intakte, korrekt prosesserte former, slike som hadde immobiliserte fenylgrupper som funksjonelle grupper. Fenylbaserte HIC-medier fra forskjellige produsenter viste forskjellig effektivitet for atskillelse av disse neurotrofinformer. Best resultater ble oppnådd med "Phenyl Toyopearl"-medium fra TosoHaas og "Phenyl Sepharose Fast Flow Low Sub" (lav substitusjon). "TSK Phenyl 5PW" var også egnet. Andre immobiliserte, funksjonelle grupper for HIC kan separere disse former. Eksempler på dette var oktylgrup-per, f.eks. dem i "Octyl Sepharose CL4B"-medium fra Pharmacia, og propylgrupper, f.eks. dem i "High Propyl"-medium fra Baker. Mindre foretrukket er resiner med alkoksy, butyl og isoamyl som funksjonelle grupper.
HIC var anvendbart for å skille neurotrofiner fra sine varianter i pattedyrcellekultur. For eksempel inneholdt, som bestemt heri, rhNGF-uttrykkende CHO-cellekultur feil-aktige, proteolytisk prosesserte varianter, f.eks. slike hvor en delvis forløpersekvens foreligger, f.eks. forløper-NGF, hybridforløper-NGF og kuttet forløper-NGF-sekvenser. Også funnet i pattedyrcellekulturmediet var glykosylert NGF og glykosylerte former av de feilaktig proteolytisk prosesserte varianter. Uønskede, glykosylerte former, som når det gjelder NGF kan observeres som molekyltyper med høyere molekylvekt
(+2 000 kD), kan tenkes å frembringe en uønsket antigenrespons hos en pasient og bidra til lav produktkvalitet eller -aktivitet. HIC separerte effektivt hydrofobe varianter, først og fremst N-terminale, proteolytisk feilprosesserte varianter, heriblant glykosylerte former, fra rhNGF. Som vist i eksemplene, ble forløpersekvensholdig og kuttet forløpersekvens-holdig NGF og de glykosylerte former av både NGF og forløper-sekvensholdig NGF eluert i forkant av NGF-toppen ved fenyl-HIC. Således kunne et rhNGF-preparat erholdes som var i det vesentlige fritt for disse typer, og som var spesielt godt
egnet for et påfølgende trinn som høyytelses-kationbytterkromatografi. HIC kan anvendes for andre neurotrofiner så vel som for NGF, uavhengig av kilde. For eksempel er HIC anvendbart for å skille NGF-monomerer fra dimerer, enten homo- eller heterodimerer avhengig av de monomere former som foreligger, så vel som å skille mellom dimerformer som også er forskjellige når det gjelder hydrofobisitet, og som erholdes etter in vitro gjenfolding eller ved fremstilling og utskillelse fra
pattedyrceller. En foretrukket kilde for neurotrofinblandinger for anvendelse med HIC er pattedyrcellekultur, mer foretrukket CHO-cellekultur. Kulturen behandles fortrinnsvis med minst ett tidligere rensetrinn som diskutert heri. HIC er spesielt effektivt når det gjelder å skille feilprosesserte, glykosylerte varianter fra det native, rekombinante neurotrofin. Når det gjelder rhNGF, er de glykosylerte former og preproNGF-formene mindre hydrofobe enn nativ NGF, og elueres derfor før nativ NGF. Feilfoldede neurotrofinformer (ved fremstilling i bakterier) er også mer hydrofobe og elueres tidligere enn det native neurotrofin.
Det mest foretrukne HIC-resin for separasjon av neurotrofinformer var resin med immobilisert fenyl som funksjonell gruppe. Fenylbaserte HIC-medier fra forskjellige fabrikanter viste forskjellig effektivitet for å atskille disse NGF-former. Av fenyl-HIC-resinene er "Phenyl Toyopearl"-medium fra TosoHaas det mest foretrukne, og "Phenyl Sepharose Fast Flow Low Sub" (lav substitusjonsgrad) og "TSK Phenyl 5PW" foretrekkes. Foretrukne, funksjonelle grupper for HIC omfatter alkoksygruppen, butylgruppen og isoamylgruppen.
Ved benyttelse av HIC kan et stort antall betingelser vedrørende den mobile fase benyttes for vask og differensiell eluering av neurotrofinformer. Disse mobile faser kan inneholde flere forskjellige kjemiske molekyler som påvirker assosiasjonen mellom et neurotrofin og den stasjonære fase på forskjellige måter. Korrekt foldet og feilfoldet neurotrofin, f.eks. NT-4/5, kan atskilles på en HIC-kolonne ved saltgradi-enter med avtagende konsentrasjon eller trinnvis reduksjon, f.eks. av salt i den mobile fase, f.eks. ammoniumsulfat, NaCl-konsentrasjon eller acetatkonsentrasjon. Salter kan påvirke bindingen av et neurotrofin til resinet ved å modulere den mobile fases overflatespenning. Andre midler som påvirket overflatespenningen, var natriumsitrat og tetrametylammoniumklorid, som diskutert i eksemplene. Varianter kan også atskilles ved kolonnekromatografi ved å eluere bundet protein med økende gradienter eller trinnvis økning i konsentrasjonen av relativt polare, organiske løsningsmidler. Eksempler på egnede løsningsmidler omfatter etanol, acetonitril og propanol. Styrken av assosiasjonen mellom neurotrofinformer og HIC-resinet var også avhengig av pH i den mobile fase hvor nøy-trale betingelser foretrekkes. Den relative hydrofobisitet av korrekt foldet og feilfoldet neurotrofin var også avhengig av løsningens pH. Separasjon av varianter fra nativt neurotrofin kunne også oppnås ved samtidig å variere flere egenskaper i den mobile fase ved bruk av gradienteluering eller trinnvis eluering. For eksempel ga en mobil fase hvor saltkonsentrasjon og konsentrasjon av apolart løsningsmiddel ble variert samtidig under elueringen, en bedre oppløsning enn når kun salt ble variert.
For HIC kan salter som diskutert heri, heriblant ammoniumsulfat, sitrat, acetat og kaliumklorid, benyttes. Avhengig av saltet som benyttes, er saltkonsentrasjonen typisk 0,5 M til 3 M, mer foretrukket 0,5 til 2,5 M, for å oppnå binding av neurotrofinet til resinet. For eksempel foretrekkes en bindingsbuffer med mellom 0,8 og 1,5 M salt for NGF, hvor høyere saltkonsentrasjoner fører til utfelling av NGF i resinet og redusert utbytte. For NT-3 foretrekkes en bindings-buf fer med pH 7 og en saltkonsentrasjon mellom 1,0 og 2,5, hvor 1,25 til 1,75 M NaCl er mer foretrukket, og 1,5 M mest foretrukket. For NT-4/5 foretrekkes en bindingsbuffer med pH 7 og 1 til 3 M salt, mer foretrukket 2 til 2,75 M, og mest foretrukket 2,5 M NaCl. Når det gjelder NT-4/5, ble, dersom 2,5 M NaCl var foretrukket for påsetning, 2 M NaCl foretrukket for eluering i nærvær av organisk løsningsmiddel (f.eks. 10% alkohol, pH 7). Fortrinnsvis benyttes en reduksjon av saltkonsentrasjonen for eluering og separasjon av et neurotrofin fra dets varianter. For å oppnå eluering er saltkonsentrasjonen i elueringsbuffer typisk lavere enn i påsetningsbufferen, men det kan være samme konsentrasjon dersom dette kompenseres for med organisk løsningsmiddel.
I tillegg har anvendelse av organisk løsningsmiddel
en annen fordel, som vist heri, ved at tilsetning av et organisk løsningsmiddel forbedrer elueringsmønsteret ved at det gir skarpere topper. I tillegg til etanol kan andre organiske løs-ningsmidler benyttes, som diskutert heri, heriblant propanol,
isopropanol og lavere alkylenglykoler, f.eks. propylenglykol, etylenglykol og heksylenglykol. Organisk løsningsmiddel i en konsentrasjon på mellom 5 og 25% (vol/vol), mer foretrukket 5 til 20% (vol/vol), vil typisk eluere et korrekt foldet neurotrofin. Eluering med organisk løsningsmiddel kan være enten gradienteluering eller trinnvis eluering. pH-området er fortrinnsvis nær nøytralt til svakt surt, fra pH 5 til 8, mer foretrukket pH 6 til 8, pH 6,5 til 7,5, og mest foretrukket pH 7. Enhver av bufferne som diskuteres heri, heriblant MOPSO, MOPS, HEPES, fosfat, sitrat, ammonium og acetat, kan benyttes så lenge de bufrer ved den ønskede pH.
I lys av foreliggende oppfinneres oppdagelse at visse uønskede neurotrofinvarianter oppstår ved rekombinant fremstilling av et neurotrofin, som rapportert heri, tillater anvendelse av høyytelses-kationbytterkromatografi, fortrinnsvis 1 preparativ utførelse, separasjon av de ladningsmodifiserte varianter, f.eks. karbamylerte og oksiderte former, isoasp-former, deamiderte former og visse avkortede former (f.eks. C-terminalt avkortede former av NGF) fra nativt neurotrofin. For eksempel kan N-terminalt avkortede former (f.eks. delesjon av 2 til 4 N-terminale aminosyrer) som fører til ladningsendring, noe som kan opptre under bakteriefermentering av f.eks. NT-4/5 og NT-3, nå fjernes. Når det gjelder neurotrofiner fremstilt i pattedyrcellekultur, kan C-terminal avkorting forekomme i det meget ladede, terminale område. For eksempel kan 118-formen av NGF feilprosesseres eller kløyves i C-enden til 117-, 114- og 115-former. Disse kan atskilles fra nativ 118-NGF ved høy-ytelses-kationbytterkromatografi. Spesielt foretrukne utførel-ser benytter "SP-Sepharose High Performance", "Fractogel EMD S03", eller polyasparaginsyreresin, av hvilke PolyCAT A er spesielt foretrukket. I stor skala er anvendelse av "SP-Sepharose High Performance" eller "Fractogel EMD S03"-resiner mest foretrukket.
Preparater erholdt ved prosessene som beskrives heri, vil være i det vesentlige rent neurotrofin, mer vanlig og foretrukket i alt vesentlig rent, og vil være i det vesentlige fritt for neurotrofinvarianter, mer foretrukket i alt vesentlig fritt for neurotrofinvarianter. For eksempel inneholder en typisk "SP-Sepharose"-porsjon etter rensing av NGF fra CHO-cellekultur, tilnærmet 92% 118, 4,6% 120, 1% deamidert NGF, 1% oksidert NGF og 1% isoasp-NGF. Rutinemessig varierer mengden av hver type fra tilnærmet 85 til 93% for 118, 0 til 5% for 120 (i stor grad avhengig av omfanget av endogen og/eller ek-sogen proteolyse som benyttes), 0 til 5% for 117, 0 til 3% for deamiderte former, 0-2% for isoasp-former, og 0 til 2% for oksiderte former. Renheten av NGF (alle typer) er rutinemessig høyere enn 99,5%.
Etter at neurotrofinet er eluert fra kolonnen, utformes det med fordel i et preparat med et bærerstoff, fortrinnsvis et farmasøytisk preparat med et fysiologisk aksepterbart bærerstoff. Neurotrofinpreparater er fortrinnsvis sterile. Neurotrofinpreparatene ifølge oppfinnelsen kan også anvendes in vitro, f.eks. for å fremme vekst og overlevelse av neuroner i kultur.
Den kjemiske og fysiske stabilitet av rekombinant, human nervevekstfaktor (NGF) i vandig løsning ble undersøkt mellom 5 og 37 °C i pH-området fra 4,2 til 5,8. Den kjemiske stabilitet av NGF økte med økende pH. I succinatbuffer ved pH 5,8 avtok den fysiske stabilitet av NGF grunnet proteinaggre-gering. Basert både på stabilitetsresultatene ved 5 °C og studier av akselerert degradering ved 37 °C, ble det optimale preparat funnet å være acetatbuffer ved pH 5,5 (se WO 97/17087 som inkorporeres heri ved referanse). Revers fase-HPLC var den primære fremgangsmåte for analyse av stabilitet og viste at overføring av Asn-93 til iso-Asp er den primære degraderings-vei ved 5 °C. Kvantitering av NGF-degradering ved kationbytterkromatografi ble vanskeliggjort ved omordningen av NGF-monomervarianter til forskjellige blandede dimerer over tid (dimerutbytting). Behandling av prøver og kontroller med fortynnet syre førte raskt til ekvilibrering av monomerfordelin-gen i dimerer, noe som tillot kvantitering av NGF-degradering i fravær av dimerutbytting. Benzylalkohol og fenol ble evalu-ert for kompatibilitet og stabilitet med rhNGF i to flytende preparater beregnet på flere gangers bruk. Disse to preparater besto av 0,1 mg/ml protein i 20 mM natriumacetat ved pH 5,5 og 136 mM natriumklorid, med og uten 0,01% "pluronic acid" (F68) som overflateaktivt middel. Sluttkonsentrasjonene av benzylalkohol og fenol i de to preparater var hhv. 0,9 og 0,25%. Basert på stabilitetsmålinger over 12 måneder, er rhNGF mer stabil med benzylalkohol enn med fenol i disse preparater. Benzylalkoholkonservert rhNGF-preparat i nærvær av overflateaktivt middel er like stabilt som preparatet uten overflateaktivt middel tilsatt, noe som tyder på at tilsetning av F68 til flerdosepreparater av rhNGF ikke er påkrevet for å bevare stabiliteten. Derfor anbefales et preparat som består av 0,1 mg/ml protein i 20 mM acetat, 136 mM NaCl, 0,9% benzylalkohol, pH 5,5, for rhNGF som skal benyttes for flere doser i klinisk fase III-undersøkelser. Dette flerdose-rhNGF-preparat passerte USP og EP konserveringseffektivitetsanalyse etter 6 måneder ved 5 °C, og er like stabilt som det for tiden benyttede, flytende preparat ved 2 mg/ml. Det bør imidlertid unngås at preparatet utsettes for intenst lys grunnet nærvær av benzylalkohol som er lyssensitiv som konserveringsmiddel.
Generelt kan preparatene inneholde andre bestanddeler i mengder som fortrinnsvis ikke forhindrer fremstilling av stabile, flytende eller frysetørkede former, og i mengder som er egnet for effektiv, trygg, farmasøytisk tilførsel.
Neurotrofin utformes med et farmasøytisk aksepterbart bærerstoff, dvs. ett som ikke er giftig for mottakerne i de benyttede doser og konsentrasjoner, og som er forenlig med andre bestanddeler i preparatet. For eksempel omfatter preparatet fortrinnsvis ikke oksidasjonsmidler og andre forbindelser som vites å være skadelige for polypeptider. Dette utformings-trinn oppnås ved avsalting eller diafiltrering ved benyttelse
av standard teknologi.
Generelt fremstilles preparatene ved å sette neurotrofinet uniformt og intimt i forbindelse med flytende bærerstoffer eller fint fordelte, faste bærerstoffer eller begge deler. Om nødvendig, utformes så produktet til det ønskede preparat. Bærerstoffet er fortrinnsvis et parenteralt bærerstoff, mer foretrukket en løsning som er isoton med mot-takerens blod. Eksempler på slike bærerstoffer omfatter vann, saltvann, Ringers løsning og dekstroseløsning. Ikke-vandige bærerstoffer, f.eks. ikke-flyktige oljer og etyloleat, er også anvendbare heri, likeså liposomer.
Bærerstoffet inneholder med fordel mindre mengder tilsetningsstoffer, f.eks. substanser som fremmer isotonisitet og kjemisk stabilitet. Slike materialer er ikke-toksiske for mottakeren i de benyttede doser og konsentrasjoner, og omfatter buffere som fosfat, sitrat, succinat, eddiksyre og andre organiske syrer eller deres salter; antioksidanter som askor-binsyre; polypeptider med lav molekylvekt (mindre enn tilnærmet 10 aminosyrerester), f.eks. polyarginin eller tripeptider; proteiner, f.eks. serumalbumin, gelatin eller immunoglobu-liner; hydrofile polymerer som polyvinylpyrrolidon; aminosyrer som glysin, glutaminsyre, asparaginsyre eller arginin; mono-sakkarider, disakkarider og andre karbohydrater, heriblant cellulose eller cellulosederivater, trehalose, glukose, man-nose eller dekstriner; chelateringsmidler som EDTA; sukker-alkoholer som mannitol eller sorbitol; motioner som natrium; og/eller ikke-ioniske, overflateaktive midler som polysor-bater, poloksamerer eller PEG. Sluttpreparatet kan være en væske eller et frysetørket, fast stoff.
Neurotrofin som skal benyttes for terapeutisk tilfør-sel, må være sterilt. Sterilitet oppnås enkelt ved filtrering gjennom sterilfiltreringsmembraner (f.eks. 0,2 um membraner). Terapeutiske neurotrofinpreparater plasseres generelt i en beholder med steril tilgang, f.eks. en pose for intravenøs væske eller en ampulle med en kork som kan gjennomtrenges av en hypoderm injeksjonsnål. Preparatene ovenfor er også egnet for anvendelse in vitro.
Neurotrofin vil vanligvis oppbevares i enhetsdose-beholdere eller flerdosebeholdere, f.eks. forseglede ampuller, som en vandig løsning eller som et frysetørket preparat for rekonstituering. Som et eksempel på et frysetørket preparat fylles 10 ml ampuller med 5 ml sterilfUtrert 1% (vekt/vol) vandig neurotrofinløsning, og den resulterende blanding fryse-tørkes. Injeksjonsløsningen fremstilles ved å rekonstituere det frysetørkede neurotrofin ved å benytte bakteriostatisk vann for injeksjon.
En terapeutisk effektiv dose av et neurotrofinpreparat tilføres til en pasient. Med "terapeutisk effektiv dose" menes heri en dose som frembringer de virkninger som er for-målet med tilførselen. Den eksakte dose vil avhenge av for-styrrelsen som skal behandles, og vil kunne fastsettes av en fagmann ved benyttelse av kjente teknikker. Generelt tilføres neurotrofinpreparatene som beskrevet heri i doser på tilnærmet 0,01 ug/kg til tilnærmet 100 mg/kg pr. dag, fortrinnsvis fra 0,1 til 0,3 ug/kg. Som kjent innen faget, kan i tillegg justeringer hvor det tas hensyn til alder så vel som kropps-vekt, generell helsetilstand, kjønn, diett, tilførselstids-punkt, medikamentinteraksjoner og sykdommens omfang, være nødvendige, og disse vil kunne fastsettes av fagfolk ved rutinemessig eksperimentering. Typisk vil klinikeren tilføre neurotrofinpreparater ifølge oppfinnelsen inntil det oppnås en dose som reparerer, vedlikeholder og, optimalt, gjenetablerer neuronfunksjonen. Forløpet av denne behandling kan lett følges ved konvensjonelle analyser.
Neurotrofin kan, om ønskelig, kombineres med eller tilføres sammen med andre neurotrofiske faktorer, heriblant NGF, NT-4/5, NT-3 og/eller BDNF, og benyttes sammen med andre konvensjonelle behandlingsformer for nerveforstyrrelser.
Når det gjelder NGF, omfatter et preparat fortrinnsvis en farmasøytisk effektiv mengde nervevekstfaktor og en farmasøytisk aksepterbar, acetatholdig buffer. Preparatet kan ha en pH mellom 5 og 6. Bufferen er fortrinnsvis natriumacetat. Acetatkonsentrasjonen er fortrinnsvis 0,1 til 200 mM. Preparatet har fortrinnsvis en NGF-konsentrasjon mellom 0,07 og 20 mg/ml. Videre omfatter preparatet, om ønskelig, et far-masøytisk aksepterbart konserveringsmiddel, f.eks. benzylalkohol, fenol, m-kresol, metylparaben eller propylparaben. Kon-serveringsmidlet er fortrinnsvis benzylalkohol. Benzylalkohol-konsentrasjonen er fortrinnsvis mellom 0,1 og 2,0%. Preparatet kan i tillegg inneholde et farmasøytisk aksepterbart, overflateaktivt middel. Videre kan preparatet, om ønskelig, men fortrinnsvis, inneholde en fysiologisk aksepterbar konsentrasjon av natriumklorid. Et mer foretrukket preparat inneholder nervevekstfaktor i en konsentrasjon på minst tilnærmet 0,1 mg/ml og en acetationkonsentrasjon mellom 10 mM og 50 mM. Enda mer foretrukket inneholder preparatet nervevekstfaktor i en konsentrasjon på 0,1 til tilnærmet 2,0 mg/ml og acetation i en konsentrasjon mellom 10 mM og 50 mM. Det mest foretrukne preparat inneholder NGF i en konsentrasjon på 0,1 mg/ml, natriumacetat i en konsentrasjon på 20 mM, pH 5,5, en natriumkloridkonsentrasjon på 136 mM og benzylalkohol i en konsentrasjon på 0,9% (vol/vol).
En annen utførelse omfatter en NGF-konsentrasjon på 2,0 mg/ml, en natriumacetatkonsentrasjon på 10 mM, pH 5,5, og en natriumkloridkonsentrasjon på 142 mM. Det foretrekkes å utforme NGF i en konsentrasjon på 0,1 mg/ml, 20 mM natriumacetat, 136 mM natriumklorid, 0,9% (vol/vol) benzylalkohol ved en pH på 5,5. Som diskutert heri, er 118/118-homodimeren en foretrukket NGF-form. NGF renses ved tilnærmet pH 6 til 8 for å bevare den normale dimerform. Imidlertid representerer prosentinnholdet av (proteolytisk) avkortede former monomere former som kan oppdages og bestemmes ved revers fase-HPLC. De sure betingelser ved analytisk HPLC dissosierer dimerene. Forekomsten av forskjellige dimere former av NGF - 120/120, 120/118, 118/118, etc. - er publisert (Schmelzer et al., J. Neurochem. 59:1675-1683 (1992), som inkorporeres spesifikt heri i sin helhet, hovedsakelig grunnet de analytiske fremgangsmåter og bioanalysene som ble benyttet i de foreliggende undersøkelser, så vel som for den generelle lære som beskrives) . Denne publikasjon rapporterte at in vi tro-aktivi-tetene var de samme for alle dimere former. I motsetning til dette viser imidlertid de foreliggende undersøkelser heri for første gang at 120/120-dimeren er mindre aktiv enn 118/118-typen, med tilnærmet 80-90% av dennes aktivitet, ved benyttelse av en analyse basert på en radioaktivt merket reseptor. I én form av analysen isoleres membraner fra PC-12-celler fra rotte og benyttes for kompetitiv binding mellom NGF-standard og de forskjellige typene som analyseres. RRA har både P75- og trkA-reseptorer. Det ble også funnet heri at 117/117-typen er like aktiv som 118/118-typen. Videre bekreftet anvendelse heri av en PC-12-basert analyse det reseptorbaserte analysefunn som viste at 120/120-formen har tilnærmet 60% av aktiviteten til 118/118-formen. Også inkorporert spesifikt ved referanse i sin helhet er Burton et al., J. Neurochem. 59:1937-1945 (1992) hovedsakelig grunnet analytiske fremgangsmåter og bioanalyser som ble benyttet i de foreliggende undersøkelser, så vel som for dens generelle lære.
118/118-formen antas å være mer biotilgjengelig i humane pasienter enn 120/120-formen. Økningen i biotilgjenge-lighet er minst 4 til 5 ganger. Denne forskjell er signifi-kant, overraskende og uventet i lys av teknikkens stand.
De påfølgende eksempler er ment å illustrere oppfinnelsen uten på noen måte å begrense-den. Alle verker som siteres i beskrivelsen, inkorporeres heri ved referanse.
Eksempler
Eksempel I. Rensing av 118/ 118 NGF- homodimer
Dette eksempel illustrerer rensing av NGF og bakgrun-nen for hvert trinn. Som i de andre eksemplene, kan en fagmann lett bestemme og justere kolonnedimensjoner og gjennomstrøm-ningshastigheter for å kompensere for opprinnelige kultur-volumer og proteinkonsentrasjoner som velkjent innen faget.
Høstet celledyrkningsvæske
Rekombinante CHO-celler ble transfektert med en ekspresjonsvektor som inneholdt en DNA-sekvens som kodet for human NGF med 120 aminosyrer. For å fremme utskillelse og prosessering var NGF-preprosekvensen også til stede. Etter dyrkning av de rekombinante CHO-cellene ble celledyrknings-mediet høstet. Den høstede celledyrkningsvæske (HCCF) inneholdt NGF-typene 120, 118 og 117. Tilnærmet 40-70% av NGF var typisk en 118/118-homodimer, mens resten forelå som hetero-dimerene 120/118, 120/120, og en liten mengde som 118/117. Som vist heri, kan disse typer separeres med "SP-Sepharose HP"-kolonnen.
Høstet celledyrkningsvæske ble konsentrert tilnærmet 20 ganger ved benyttelse av "Millipore"-membraner med 10 Kd grenseverdi (cellulosemembraner, sammensatte membraner og polysulfonmembraner ble benyttet om hverandre). Til konsen-tratet ble det tilsatt 0,1 volum 1,0 M Tris, pH 8,2. Det fortynnede materiale ble mikrofiltrert ved benyttelse av et 0,22 pm filter og overført til en inkubasjonstank ved 37 °C i 2 til 18 timer. Overføring av 120/120-formen til 118/118-formen katalyseres av en endogen protease under inkubasjonen.
Kiselgelkromatografi
Mikrofiltratet ble justert til 1 M NaCl og påsatt en kiselgelkolonne ekvilibrert i 1 M NaCl, 25 mM MOPSO, pH 7. Kolonnen ble vasket med 1 M NaCl, 25 mM MOPSO, pH 7. Et egnet pH-område er mellom tilnærmet 6 og 8, hvor pH 7 foretrekkes. Kolonnen ble så vasket med 25 mM MOPSO, pH 7. En vask med buffer med lav konduktivitet fjerner vertscelleproteiner. Bundet NGF ble eluert med 50 mM MOPSO, 0,5 M TMAC, 20% vannfri alkohol av reagensgrad (94-96% spesielt denaturert alkohol formel 3A (5 volumer metanol og 100 volumer 200 "proof" etanol) og 4-6% isopropanol). Andre alkoholer kan benyttes, f.eks. 20% propanol, 20% isopropanol og 20% metanol. Som benyttet heri, er "alkoholer" og "alkoholiske løsningsmidler" ment ut fra den vanlig benyttede terminologi for alkohol, fortrinnsvis alkoholer med 1 til 10 karbonatomer, mer foretrukket metanol, etanol, isopropanol, n-propanol eller t-butanol, og mest foretrukket etanol eller isopropanol. Slike alkoholer er løsnings-midler som ved tilsetning til vandige løsninger, øker løsnin-gens hydrofobisitet ved å redusere dens polaritet. Etanol er mest foretrukket. Den laveste grense for alkoholkonsentra-sjonen er den prosent som fører til eluering, og den øvre grense bestemmes av behovet for å unngå proteindenaturering. Konsentrasjonen er fortrinnsvis 5% til 25%, mer foretrukket 5% til 20%, og enda mer foretrukket 5% til 15%. TMAC er tetrametylammoniumklorid som foreligger for å eluere NGF. TMAC-konsentrasjonen kan variere mellom 0,1 og 1 M, hvor området 0,3 til 0,7 M er mer foretrukket. Mengden TMAC som benyttes for eluering av NGF, er en funksjon av pH og alkoholkonsentrasjon. Jo lavere pH, jo mindre mengder alkohol og TMAC er nødvendig. pH kan ligge mellom tilnærmet pH 4 og 8. I dette eksempel var den foretrukne pH 7, som tillater minimal justering av de sammenslåtte fraksjoner før de påsettes neste kolonne. Den øvre pH-grense bestemmes av pH-verdien som er nødvendig for påsetting på neste kolonne, mens den lavere verdi begrenses av behovet for effektiv eluering av NGF.
" S- Sepharose Fast Flow"- kromatografi
Eluert NGF ble slått sammen, fortynnet til en konduktivitet lavere enn 15,5 ms/cm med renset vann, og pH justert til 7,0. Materialet ble ikke oppbevart lengre enn 8 timer, da flere proteaser fremdeles foreligger. Imidlertid ble ingen aktivitet av den endogene protease som overfører NGF med 120 aminosyrer til 118-formen, observert. Materialet ble påsatt en "S-Sepharose Fast Flow"-kromatografikolonne (et kationbytterresin "S-SEPHAROSE TM agarose Fast Flow" (Pharmacia) ) ekvilibrert med 25 mM MOPSO, pH 7. Kolonnen ble vasket med 25 mM MOPSO, pH 7. Et egnet pH-område er fra tilnærmet 6 til 8, hvor pH 7 foretrekkes. Kolonnen ble så vasket med 0,16 M NaCl, pH 7. Bundet NGF ble eluert med 0,5 M NaCl, pH 7. Molariteten av saltet som benyttes for eluering, kan variere mellom 0,3 og 1,0 M, mer foretrukket 0,4 til 0,6 M. Den lavere grense bestemmes av behovet for eluering av all NGF, mens den øvre grense bestemmes av behovet for å unngå fjerning av kontaminanter og å forårsake hydrofobe interaksjoner på kolonnen som kunne interferere med elueringen av NGF. Andre salter kan benyttes, og KC1 er et foretrukket alternativ. Eluering med 0,5 M NaCl, pH 7, foretrekkes for å erholde en porsjon med lavt volum. Ved høyere saltkonsentrasjoner, f.eks. over 1 M, kan fast bundne kontaminanter elueres.
" Phenyl Toyopearl 650M"- kromatografi
SSFF-kolonnefraksjoner som inneholdt NGF, ble slått sammen, justert til 1 M NaCl og påsatt en "Phenyl Toyopearl 650M"-kolonne. Kolonnen ble vasket med 25 mM MOPSO, pH 7. En egnet pH ligger i området mellom tilnærmet 5 og 8. Bundet NGF ble eluert med en lineær gradient på 10 kolonnevolumer som startet med gradientbuffer A (25 mM MOPSO, pH 7, 1,0 M NaCl) og endte med gradientbuffer B (20% alkohol i 80% 25 mM MOPSO, pH 7). NGF-holdige fraksjoner ble analysert ved SDS-PAGE poly-akrylamidgelelektroforese for å fastslå hvilke fraksjoner som inneholdt forløper-NGF-typen. NGF-holdige fraksjoner ble utvalgt og slått sammen for å fjerne hovedsakelig feilaktig prosesserte varianter, f.eks. slike hvor deler av forløpersek-vensen foreligger, f.eks. forløper-NGF, hybridforløper-NGF og avkortede forløper-NGF-sekvenser, for erholdelse av et NGF-preparat som er i det vesentlige fritt for alle NGF-forløper-sekvenser. Fenylkolonnen fjernet også den lille mengde glykosylert NGF og glykosylerte NGF-forløpersekvenser. NGF-for-løpersekvensen og den avkortede NGF-forløpersekvens ble eluert i forkant av NGF-toppen, sammen med de glykosylerte former av både NGF og forløper-NGF. Således separerte denne kolonne enkelt NGF fra forskjellige NGF-typer slik at et NGF-preparat som var i det vesentlige fritt for disse typer, ble erholdt. I dette trinn ble hydrofobe NGF-varianter, hovedsakelig feilprosesserte varianter, heriblant proteolytisk prosesserte og glykosylerte varianter, separert ved benyttelse av HIC.
De mest egnede medier for separering av NGF-former var slike med immobiliserte fenylgrupper som funksjonelle grupper. Fenylbaserte HIC-medier fra forskjellige leverandører viste forskjellig effektivitet for å skille disse NGF-former fra hverandre. De beste resultater ble oppnådd med "Phenyl Toyopearl"-medier fra TosoHaas. HIC-resinene "Phenyl Sepharose Fast Flow Low Sub" (lav substitusjonsgrad) og "TSK Phenyl 5PW" fungerte godt. Andre funksjonelle HIC-grupper var mindre egnet, og mindre effektive under disse betingelser, heriblant alkoksygruppen, butylgruppen og isoamylgruppen.
"Phenyl Toyopearl"-porsjonen inneholdt 75% 118, 10% 120, 7% 117, 1,8% deamidert NGF, 1,4% oksidert NGF og 2,0% isoasp NGF, mens de gjenværende 2,8% var andre ikke-identifiserte NGF-typer.
Om ønskelig, ble de sammenslåtte fraksjoner syrebe-handlet for å oppnå virusinaktivering ved en pH lavere enn 3,95 i minst 15 minutter.
" SP- Sepharose HP"- kromatografi
HIC-porsjonen ble fortynnet med 0,5 til 1 volum vann, og den fortynnede porsjon ble justert til pH 6. Porsjonen ble påsatt en "SP-Sepharose HP"-kolonne ekvilibrert med 0,2 M natriumklorid, 20 mM succinat, pH 6, tilsatt 5% reagensalkohol (som i kiselgelkolonnetrinnet). Kolonnen ble vasket med 0,2 M NaCl, 20 mM succinat, pH 6 tilsatt 5% reagensalkohol (formel SDA-3A-alkohol, innholdet av alkohol er valgfritt). Alkohol bidrar til å redusere uspesifikke (hovedsakelig hydrofobe) interaksjoner mellom NGF og resinryggraden. Et egnet alkohol-område er fra tilnærmet 0 til 10%. Påsetnings-pH-verdien er mellom tilnærmet 5 og 8, et område som er valgt for å oppnå og opprettholde maksimal stabilitet av NGF og separasjon av NGF-varianter. Kolonnen ble vasket med to kolonnevolumer ekvilibreringsbuffer. Bundet NGF ble eluert og separert fra variantene med en lineær gradient på 22•kolonnevolumer fremstilt ved å blande 11 kolonnevolumer gradientbuffer A (0,25 M NaCl, 0,02 M succinat, pH 6, tilsatt 5% alkohol) med 11 kolonnevolumer gradientbuffer B (0,5 M NaCl, pH 6). Tilsetning av alkohol er valgfritt. 118/118-NGF ble typisk eluert ved en NaCl-konsentrasjon på 0,35 M til 0,40 M.
Kolonnefraksjonene ble analysert for innhold av NGF og NGF-variant. Fraksjonene analyseres fortrinnsvis ved C4 RP-HPLC som beskrevet av Schmelzer et al. (1992), supra, og Burton et al. (1992), supra. Fraksjonene ble utvalgt og slått sammen for å oppnå et NGF-preparat som var i det vesentlige fritt for modifiserte NGF-varianter, f.eks. ladede typer som oksiderte og deamiderte NGF-typer og isoasp-NGF-typer. Den tidligere benyttede HIC-kolonne kan ikke effektivt fjerne andre variantformer av NGF, f.eks. oksidert NGF og isoasp-NGF. HIC-kolonnen fjernet effektivt feilfoldede proteiner og glykosylerte proteiner, som bindes sterkere til HIC-resinet enn korrekt foldet NGF, da de er mer hydrofobe. Følgelig ble kationbytterresinet, f.eks. "SP-Sepharose HP", benyttet for å fjerne varianter med endret ladning som ikke ble fjernet med HIC-resinet.
"SP-Sepharose"-porsjonen inneholdt typisk tilnærmet 92% 118, 4,6% 120, 1% deamidert NGF, 1% oksidert NGF og 1%
isoasp-NGF. Rutinemessig varierer mengden av hver type fra tilnærmet 85 til 93% for 118, 0 til 5% for 120, 0 til 5% for 117, 0 til 3% for deamiderte former, 0-2% for isoasp-formene, og 0 til 2% for oksiderte former. Renheten av NGF (alle typer) er rutinemessig høyere enn 99,5%.
Preparatfremstilling
"SP-Sepharose HP"-porsjonen ble forberedt for preparatfremstilling ved ultrafiltrering/diafiltrering over i en preparatbuffer. En sur buffer foretrekkes, fortrinnsvis acetat ved pH 5 som diskutert ovenfor. 118/118-NGF-preparatet er i det vesentlige fritt for NGF-varianter og er i det vesentlige rent NGF. Det fremstilte preparat er egnet for behandling av neuronale forstyrrelser, særlig perifer neuropati forbundet med diabetes og perifer, sensorisk neuropati forbundet med
AIDS.
Eksempel II. Rensing av 120/ 120- NGF- homodimer i stor skala Høstet celledyrkningsvæske
HCCF ble erholdt fra en 12 000 1 CHO-cellekultur hovedsakelig som beskrevet i eksempel I. Fordelingen av NGF-typer i HCCF var tilnærmet 40-65% 120/120-homodimer med 120/118-heterodimer, mens det gjenværende forelå som 118/118-homodimer. Mediet ble typisk viderebehandlet raskt for å minimalisere proteolytisk overføring av 120 til 118.
" Macroprep High S"- kationbytterkromatografi
HCCF ble påsatt en "Macroprep High S"-kationbytterkromatografikolonne vasket med 1,5 M natriumacetat, 50 mM HEPES, pH 7. Bundet NGF ble eluert med 1,5 M NaCl, 0,25 M TMAC, 0,2% tiodiglykol, pH 7. "Macroprep"-kolonnen kan kjøres ved pH 5 til 8 med justering av acetatkonsentrasjonen. Klorid er en foretrukket erstatning for acetationet. NGF ble eluert grunnet TMAC-gradienten. TMAC er et salt med både ionisk og hydrofob karakter, noe som er en nyttig egenskap da ryggrads-støttemidlet i visse resiner har et hydrofobt innhold som fremmer uspesifikke interaksjoner mellom NGF og resinet. For en elueringsbuffer med en pH mellom tilnærmet 6 og 8 er typisk en TMAC-konsentrasjon mellom 0 og 3 M anvendbar. NGF-holdige fraksjoner ble slått sammen.
Kiselgelkromatografi
Porsjonen ble direkte påsatt en kiselgelkromatografi-kolonne. Kiselgel er et kromatografiresin med blandede egenskaper hvor både ioniske, polare og hydrofobe interaksjoner spiller en rolle ved binding av protein. Kolonnen var ekvilibrert i 1 M NaCl, 25 mM MOPSO, pH 7. Kolonnen ble vasket med 1 M NaCl, 25 mM MOPSO, pH 7 (fortrinnsvis tilnærmet pH 5,0 til 8,5, mer foretrukket pH 6 til 8, og mest foretrukket pH 7). Bundet NGF ble eluert med 25 mM succinat, pH 3,9, 50 mM TEAC (tetraetylammoniumklorid). TEAC er et kraftigere elueringsmid-del enn TMAC. pH ligger fortrinnsvis mellom tilnærmet 3,5 og 8. Imidlertid bør en pH over 7,5 over et lengre tidsrom unngås for å hindre eller redusere dannelse av de deamiderte NGF-typer. Generelt er det slik at jo lavere pH i bufferen er, jo lavere er konsentrasjonen av saltet med blandede egenskaper, f.eks. TMAC eller TEAC, som er nødvendig for å eluere NGF fra kiselgelkolonnen. Buffere med god bufringskapasitet nær pH 4 til 5 er egnet for bruk. Nærvær av salt i elueringsbufferen er valgfritt slik at kolonnen kan vaskes med en MOPSO-buffer uten salt før påsetning av elueringsbufferen.
" Phenyl Sepharose Fast Flow"- kromatografi
De NGF-holdige fraksjoner ble identifisert og slått sammen. Porsjonen ble justert til 0,7 M acetat, pH 7, 25 mM MOPSO. Den justerte porsjon ble påsatt en "Phenyl Sepharose Fast Flow"-kromatografikolonne ekvilibrert med gradientbuffer A (0,7 M acetat, 25 mM MOPSO, pH 7). Kolonnen ble vasket med en gradient fra 90% gradientbuffer A (0,7 M acetat, 25 mM MOPSO, pH 7) til 10% gradientbuffer B (25 mM MOPSO, pH 7, 20% propylenglykol). Andre glykoler kan benyttes i stedet, f.eks. heksylenglykol. Det ble typisk vasket med tilnærmet 2 til 3 kolonnevolumer, eller inntil en stabil grunnlinje-OD oppnås. Noen vertscelleproteiner ble fjernet under vasken. Bundet NGF ble eluert med en lineær gradient på 10 kolonnevolumer fra en blanding av 90% gradientbuffer A og 10% gradientbuffer B til en blanding av 10% gradientbuffer A og 90% gradientbuffer B. NaCl eller natriumsulfat kan erstatte acetat i HIC-bufferne. pH ligger fortrinnsvis mellom tilnærmet 5 og 8, mer foretrukket tilnærmet 5,5 til 7,5, med pH 6 til 8 som aksepterbart, og mest foretrukket tilnærmet 7. Kolonnen separerte eventuelt gjenværende forløpersekvenser, partielle forløper-sekvenser eller glykosylerte former som forelå som en homodimer eller en heterodimer mellom en moden NGF-monomer og en NGF-monomer som fortsatt har deler av forløpersekvensen til stede. Forløperformen og de glykosylerte former av NGF foreligger i forkant av elueringstoppen slik at NGF-holdige fraksjoner ble slått sammen på en måte som i det vesentlige eks-kluderte disse typer.
HIC-porsjonen inneholdt tilnærmet 72% 120-monomer, 17% 118-monomer, 2,8% 117-monomer, 3,6% R120-monomer, 0,8% isoasp-former, 1,3% oksiderte former og 1% deamiderte former, analysert ved separasjon og påvisning i et analytisk HPLC-sys-tem.
" SP- Sepharose HP"- kromatografi
NGF-holdige fraksjoner fra HIC-trinnet ble slått sammen. I stor skala ble dette oppnådd ved å styre eluatet fra kolonnen til en oppsamlingstank i det egnede tidsrom. Porsjonens pH ble justert til 6, hvoretter den ble påsatt en "SP-Sepharose HP"-kromatografikolonne. Kolonnen ble vasket med 20 mM succinat, 0,2 M NaCl, pH 6 (gradientbuffer A). Bundet NGF ble eluert med en gradient på 22 kolonnevolumer som startet med en blanding av 70% gradientbuffer A og 30% gradient-buf fer B til en sluttblanding av 80% gradientbuffer B (0,7 M NaCl/pH 6) og 20% gradientbuffer A. pH ligger fortrinnsvis mellom 5 og 8, mer foretrukket pH 5,7 til 6,5, og mest foretrukket pH 6. Et representativt kromatogram er vist i figur 1.
"SP-Sepharose HP"-porsjonen inneholdt rutinemessig tilnærmet 95% 120-form, 3% R120-form, 0,65% isoasp-form, 0,6% oksidert form, 0,6% deamidert form. Andre ikke-identifiserte NGF-former utgjorde tilnærmet 0,6%, og omfattet dioksidert NGF (Met37 og Met92) med deamidert Asn45 til stede. En HPIEX-analyse som sammenligner en representativ HIC-porsjon (påsatt
"SP-Sepharose"-resinet) og porsjonen erholdt etter "SP-Sepharose"-kromatografi, er vist i figur 2. Alle de tre hovedformer av kløyvet NGF, 120, 118 og 117, kan ha varianter, men variantene, f.eks. oksiderte varianter og isoasp-varianter, av den dominerende, kløyvde form under en rensing (120 i dette eksempel) kan maskere analyse av variantene fra de mindre fremtred-ende former (118 og 117 i dette eksempel). En HPLC-analyse av fraksjoner fra en representativ kjøring er vist i figur 3.
"SP-Sepharose HP" fjernet effektivt varianter som forelå i HIC-porsjonen. R120-formen har en ekstra argininrest i N-enden av NGF; vanligvis er den N-terminale aminosyresekvens av rhNGF SSSHP, men R120 har den N-terminale sekvens RSSSHP. Således er R120-formen mer basisk enn moden NGF og ble separert ved SP-SHP. Den har også lavere bioaktivitet, trolig grunnet det faktum at N-terminalen til NGF er nødvendig for reseptorbinding (trkA). Den oksiderte NGF-form er en monoksi-dert form hvor metionin i posisjon 37 er oksidert, noe som gir en surere form som elueres i forkant av NGF-toppen. Isoasp-formen inneholder en modifikasjon av asparaginsyre i posisjon 93. Isoasp-formen er noe mer basisk og bindes således noe kraftigere til "SP-Sepharose HP"-resinet. NGF-typer som inneholder isoAsp93, ble eluert i forkant av elueringstoppen. Deamidering skjer ved asparaginrester, typisk ved asparagin i posisjon 45. NGF med deamidert Asn, som gir en Asp i posisjon 45, er noe mer sur og forefinnes i forkant av elueringstoppen.
"Fractogel EMD S03" er et mindre foretrukket, alternativt resin til "SP-Sepharose HP"-resin for å separere ladede varianter av NGF-typene. Dersom dette mindre foretrukne resin benyttes, er høyere NaCl-konsentrasjoner nødvendig for eluering av NGF.
Preparatfremstilling
Hovedmaterialet ble utformet ved UF/DF over i preparatbuffer som i det foregående eksempel. I sluttproduktet utgjorde 120-formen rutinemessig mellom tilnærmet 92 og 97%, R120 fra tilnærmet 1 til 4%, isoasp-formen fra tilnærmet 0,2 til 1,5%, den oksiderte form fra tilnærmet 0,2 til 2%, og den deamiderte form fra tilnærmet 0,2 til 2%. 117- og 118-formene utgjorde rutinemessig mindre enn tilnærmet 2%. Sluttproduktet besto rutinemessig av minst 99,5% ren NGF (innbefattet alle typer).
Eksempel III. Isolering av 118/ 118
I én foretrukket utførelse for erholdelse av et i det vesentlige rent 118/118-NGF-preparat som i det vesentlige er fritt for NGF-varianter, ble fremgangsmåten ifølge eksempel II benyttet med følgende modifikasjoner. En kolonne med immobilisert trypsin benyttes mellom "Macroprep High S"-kolonnen og kiselgelkolonnen. "Macroprep"-porsjonen påsettes direkte på kolonnen med immobilisert trypsin etter justering av pH til mellom tilnærmet 5 og 8,5, mest typisk 6,5 til 7,5, om nødven-dig. Porsjonen ble passert gjennom kolonnen, hvorved det meste av NGF som forelå, ble overført til 118-formen. Protease-kløyvingen overfører 120-formen til■118-formen ved kløyving av C-terminalen VRRA til VR. For å oppnå denne begrensede og selektive kløyving benyttes et trypsin eller en trypsinlignende protease, fortrinnsvis trypsin, mer foretrukket det lett tilgjengelige svinetrypsin, eller alternativt trypsin fra storfe eller et rekombinant trypsin. Enhver proteolytisk fremgangsmåte som gir i det vesentlige begrenset og selektiv kløyving, kan benyttes, men det foretrekkes en kolonne med immobilisert trypsin for å minimalisere kontaminering av NGF-preparatet. Kolonnen kjøres ved en pH som fremmer proteaseak-tivitet, fortrinnsvis pH 5,5 til 8,5, mer foretrukket 6,0 til 8,0, og mest foretrukket 6,5 til 7,5.
I dette eksempel ble glykosylert NGF fjernet ved HIC som diskutert heri. Etter et "SP-Sepharose HP"-trinn som diskutert heri i eksempel II, men fortrinnsvis ved benyttelse av en gradient på 22 kolonnevolumer fra 0,3 M til 0,55 M salt, ble et foretrukket NGF-preparat for klinisk anvendelse erholdt. Et preparat med mer enn 70% 118-monomer, mindre enn 10% 120-monomer og mindre enn 15% 117-monomer, bestemt ved RP-HPLC-analyser, kan erholdes. Typisk erholdes preparater med 90% eller mer 118/118-rhNGF, mer vanlig 93% eller mer 118/118-rhNGF, med 7% eller mindre av de deamiderte varianter, isoAsp-varianten og de oksiderte varianter. Ett middel for å oppnå høyere renhet er å unngå å utvelge fraksjoner med signifikante mengder av varianter, f.eks. slike som foreligger i forkant eller etterkant av hovedneurotrofintoppen, f.eks. 118/118-rhNGF-toppen.
Eksempel IV. Delvis rensing og gjenfolding av rhNT- 4/ 5 fra bakterielle inklusjonslegemer
I dette eksempel ble rhNT-4/5 renset med utgangspunkt i en fermentering på 10 eller 60 1. Verten som benyttes for fremstilling av rekombinant, human NT-4/5 i fermenteringen beskrevet i dette eksempel, var en E. coli-stamme betegnet 27C7/pmNT5DT, selv om NT-4/5 fremstilt fra andre stammer og organismer, er egnet for renseprosessen som beskrives heri. Ekspresjonsplasmidet som ble benyttet i dette eksempel, inneholdt den modne NT-4/5-kodende sekvens under kontroll av transkripsjons- og translasjonskont-rollsekvenser som er nød-vendige for ekspresjon av NT-4/5-genet i E. coli. I det NT-4/5-uttrykkende plasmid ble transkripsjonssekvensene som ble benyttet for ekspresjon av genet i E. coli, tilveiebrakt av promotersekvensen fra alkalisk fosfatase. Lambdaen til transkripsjonsterminatoren ble plassert ved siden av termin-eringskodonet til NT-4/5. Utskillelse av proteinet fra cyto-plasma ble styrt av signalsekvensen STII. Hovedmengden av rhNT-4/5 ble funnet i periplasmarommet i cellen som refraktile legemer. Plasmidet ga tetrasyklinresistens til den transformerte vert. Fermenteringsprosessen ble utført ved 35-39 °C og ved pH 7,0-7,8. Fermenteringen fikk forløpe i 25-40 timer, hvoretter kulturen ble avkjølt før høsting. Kulturen ble inak-tivert ved varmebehandling ved benyttelse av et apparat med kontinuerlig gjennomstrømning ved 60 °C eller benyttelse av varmeinaktivering i tanken, ved samme temperatur i 5-15 minutter. Den varmeinaktiverte kultur ble sentrifugert ved benyttelse av en "AX Alpha-laval"-sentrifuge eller tilsvarende. E. coli-cellene ble gjenvunnet i det nedsentrifugerte materiale.
E. coli-cellene som uttrykte rekombinant, human NT-4/5 i inklusjonslegemer, ble lysert ved standardmidler slik at det ble dannet en grøt som inneholdt NT-4/5 i inklusjonslegemer. Ingen proteaseinhibitorer ble benyttet i bufferen.
For å skille inklusjonslegemene fra cellerester ble E. coli NT-5-grøten resuspendert i 0,02 M Tris, pH 8, 5 mM EDTA (10 ml buffer/g grøt) ved benyttelse av en roterende, mekanisk dispersjonsanretning, f.eks. en Turrax. Cellesuspensjonen ble passert gjennom en mikrofluidisator tre ganger ved 41 370 kPa. Det resulterende homogenat ble sentrifugert i en "Sorvall RC-3B"-sentrifuge ved 5 000 rpm i tilnærmet 45 minutter. Supernatanten ble kastet og det nedsentrifugerte materiale resuspendert i 20 mM Tris, pH 8, 5 mM EDTA (ekstraksjons-buffer) ved benyttelse av en turrax i 2 til 3 minutter ved middels hastighet. Homogenatet ble sentrifugert som beskrevet ovenfor. Nedsentrifugert materiale ble resuspendert i ekstrak-sjonsbuffer og sentrifugert som beskrevet ovenfor. Det resulterende, nedsentrifugerte materiale (betegnet NT-4/5-inklusjonslegemer eller refraktile legemer) ble lagret ved -70 °C.
NT-4/5 ble isolert fra inklusjonslegemene som følger. De nedsentrifugerte inklusjonslegemer ble suspendert i 20 mM Tris, pH 8, 6 M urea, 25 mM DTT (10 ml buffer/g inklusjonslegemer) ved benyttelse av en turrax ved middels hastighet i 10 minutter. Suspensjonen ble omrørt i 40 minutter ved 2-8 °C og sentrifugert i en "Sorvall RC3B" ved 5 000 rpm i tilnærmet
45 minutter. PEI (polyetylenimin) ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 0,1% til supernatanten, som ble omrørt ved 2-8 °C i 30 minutter. PEI feller ut nukleinsyrer og andre molekyler med sur ladning. Blandingen ble sentrifugert i en "Sorvall RC3B" ved 5 000 rpm i tilnærmet 45 minutter. PEI-supernatanten ble påsatt en "DEFF Sepharose Fast Flow"-kolonne (10 cm x 14 cm, DEFF er et dietylaminoetylresin) ekvilibrert i 0,02 M Tris, 6 M urea, 10 mM DTT, pH 8. En mengde tilsvarende 1 kg solubiliserte, refraktile legemer ble påsatt DEFF-kolonnen. Da redusert og denaturert NT-4/5 ikke bindes til DEFF-resinet, ble den ubundne porsjon som inneholdt NT-4/5 og 6 M urea, oppsamlet (figur 6), og porsjonens pH ble redusert til 5,0 med eddiksyre. Den pH-justerte, ubundne porsjon fra DEFF ble påsatt en "S-Sepharose Fast Flow"-kolonne (S står for resinets funksjonelle S03-gruppe) ekvilibrert med 20 mM acetat, pH 5, og tilsatt 6 M urea, under hvilke betingelser NT-4/5 bindes til resinet. Etter påsetting ble S-"Sepharose
Fast Flow"-kolonnen vasket med flere kolonnevolumer ekvilibreringsbuffer. Bundet NT-4/5 ble eluert med 0,5 M NaCl, 20 mM natriumacetat, 6 M urea, pH 5 (figur 7). 0,5 M NaCl SSFF-porsjonen ble dialysert over natten mot 20 mM Tris, 0,14 M NaCl, pH 8, betingelser som tillater gjenfolding av NT-4/5, om enn ukorrekt. De feilfoldede rhNT-4/5-molekyler aggregerte slik at det ble dannet en utfelling.
Aggregert, feilfoldet rhNT-4/5 ble prosessert for erholdelse av korrekt foldet NT-4/5. Aggregert, feilfoldet rhNT-4/5 ble oppsamlet ved sentrifugering. Nedsentrifugert materiale ble resuspendert i 0,2 M Tris, pH 8, 4 M urea, 5 mM DTT og omrørt ved 2-8 °C i tilnærmet 1 til 2 timer, eller inntil utfellingen var oppløst. Den endelige proteinkonsentrasjon ble justert til tilnærmet 10 mg/ml protein, basert på ekstink-sjonskoeffisienten 1,8 ved 280 nm. Oksidert glutation ble tilsatt til løsningen til en sluttkons-entrasjon på 20 mM, fulgt av forsiktig omrøring i 15 til 30 minutter ved 2-8 °C. Oksidert glutation reagerer med sulfhydrylgruppene i NT-4/5 slik at det dannes NT-4/5-S-glutationblandet disulfid. Det NT-4/5-SG-blandede disulfid ble fortynnet til en sluttkonsentrasjon på 0,1 til 0,5 mg/ml protein i 100 mM Tris, 20 mM glysin, 15% PEG-300, 1 M guanidin-HCl, pH 8,3. For initiering av korrekt gjenfolding av NT-4/5 ble cystein tilsatt til gjenfoldingsblandingen i en konsentrasjon på 2 til 4 mM, fulgt av gjennombobling av løsningen med nitrogen eller helium i 5 til 60 minutter før beholderen ble forseglet for å ekskludere oksygen. Gjenfolding av NT-4/5 fikk forløpe i 18 til 24 timer ved 2 til 8 °C.
Alternativt ble rhNT-4/5 gjenfoldet ved sulfitolyse som følger. De nedsentrifugerte inklusjonslegemer (110 g) ble suspendert i 1,1 1 20 mM Tris, 7 M urea, 10 mM glysin, 100 mM natriumsulfitt, 10 mM natriumtetrationat, og løseliggjort ved benyttelse av en turrax i 10 minutter ved middels hastighet. Blandingen (1 260 ml) ble deretter omrørt ved 2 til 8 °C i
45 minutter. PEI ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 0,1% PEI. Blandingen ble omrørt i ytterligere 30 minutter ved 4 °C og sentrifugert i 45 minutter ved 5 500 rpm i en RC3B-sentri-fuge. Supernatanten ble påsatt en DEFF-kolonne (4,4 cm x 25 cm) ekvilibrert med 20 mM Tris, 6 M urea, pH 8. Ubundet materiale ble justert til pH 5 med eddiksyre og påsatt en "S-Sepharose Fast Flow"-kolonne (4,4 cm x 25 cm) ekvilibrert med 20 mM acetat, 6 M urea, pH 5. NT-4/5 ble eluert med 25 mM MOPSO, 0,5 M NaCl, pH 7. SSFF-0,5 M natriumklorid-porsjonen inneholdende sulfonylert rhNT-4/5, ble fortynnet til tilnærmet 0,1 mg/ml protein og justert til 1 M guanidin-hydroklorid, 100 mM Tris, 20 mM glysin, 15% PEG-300, pH 8,3. Gjenfolding av NT-4/5 ble startet ved tilsetning av 2 til 4 mM cystein. Gjenfoldings-reaksjonen var i det vesentlige fullstendig i løpet av 24 timer. Gjennombobling med en inert gass, f.eks. helium eller nitrogen, for å fordrive oksygen fra løsningen, kan, om ønskelig, utføres.
Eksempel V. Isolering av korrekt foldet rhNT- 4/ 5 fra konformasjonsvarianter ( feilfoldede varianter)
Gjenfoldingsblandingen med rhNT-4/5 fra eksempel IV ble dialysert mot en løsning med pH 4 til 5 over natten for fjerning av guanidin og andre reagenser. For klaring av løs-ningen ble den sentrifugert i 45 minutter ved 5 000 rpm eller passert gjennom et 0,2 um filter.
Den klarede supernatant som inneholdt 0,5 til 5 g protein, ble justert til pH 3 til 5 ved tilsetning av iseddik og ble enten påsatt en C4 RP-HPLC-kolonne eller lagret ned-frosset ved -20 °C inntil den var klar for rensing. I dette eksempel ble den surgjorte og klarede løsning påsatt en C4 RP-HPLC-kolonne (3 cm x 50 cm), hvor foldet rhNT-4/5 bindes. Korrekt foldet NT-4/5 ble eluert med en acetonitrilgradient i et løsningsmiddelsystem med 0,05% trifluoreddiksyre (TFA): en 26 til 40% acetonitrilgradient (over et tidsrom på 95 minutter) i 0,05% TFA ved en gjennomstrømningshastighet på 25 ml/min. Fraksjoner ble oppsamlet ved 1 til 1,5 minutters mellomrom (figur 8). Fraksjonene ble analysert for korrekt foldet NT-4/5 ved å sammenligne elueringstiden på en analytisk C4 HPLC "Vydac"- (0,21 x 15 cm) kolonne med tiden for en korrekt foldet NT-4/5-standard (figur 9). Korrekt foldet, intakt NT-4/5-standard ble typisk eluert etter 19 minutter ved en gjennom-strømningshastighet på 2,5 ml pr. minutt med et 0,5% TFA/- acetonitrilbuffersystem. Fraksjonene som inneholdt korrekt foldet rhNT-4/5, ble slått sammen og pH justert til mellom 5 og 7. Denne porsjon med korrekt foldet rhNT-4/5 inneholdt også karbamylerte og N-terminalt avkortede former av NT-4/5.
Det benyttede resin for preparativ revers fase-væskekromatografi er fortrinnsvis et medium med partikkeldiameter på tilnærmet 10-40 um, en porestørrelse på tilnærmet 200-
400 Å, og en C4-, C8- eller C18-alkylgruppe. Mer foretrukket har resinet en partikkeldiameter på tilnærmet 15-40 um og en porestørrelse på tilnærmet 300 Å og er et C4-kiselgelmedium.
Eksempel VI. Alternativ isolering av korrekt foldet rhNT- 4/ 5 fra konformasjonsvarianter ( feilfoldede varianter)
Blandingen med gjenfoldet rhNT-4/5 fra eksempel IV ble konsentrert tilnærmet 10 ganger, ved benyttelse av et "Millipore-Pellicon"-ultrafiltreringssystem med en 1,86 m<2 >cellulosemembran (eller polysulfonmembran eller tilsvarende) med en 10 kD grenseverdi. Den konsentrerte blanding ble enten dia-lysert over natten mot 50 1 50 mM acetat, pH 5,5, 50 mM NaCl eller diafiltrert til 50 mM acetat, 50 mM NaCl, pH 5,5, før filtrering gjennom en 0,2 um membran.
Den filtrerte gjenfoldingsblanding ble justert til 2,5 M NaCl, 20 mM MOPSO, pH 7, og påsatt en HIC-kolonne, "Phenyl Toyopearl 650M"-kolonne (10 cm x 19 cm) som på forhånd var ekvilibrert med 2,5 M NaCl, 20 mM MOPSO, pH 7. Kolonnen ble så vasket med ekvilibreringsbuffer. Noen feilfoldede former av rhNT-4/5-molekylet ble eluert i de ubundne fraksjoner, mens andre feilfoldede former ble eluert ved høye konsentrasjoner av organiske løsningsmidler, f.eks. 20 til 40% reagensalkohol. Korrekt foldet rhNT-4/5 ble eluert fra fenylkolonnen med 2 M natriumklorid, 10% reagensalkohol, pH 7 (figur 10). Andre fenylresiner som fenyl-"Sepharose", kan benyttes istedenfor "Toyopearl"-skjelettet. Salter diskutert heri, heriblant ammoniumsulfat, sitrat, acetat og kaliumklorid, kan benyttes. Avhengig av det benyttede salt er salt-konsentras j onen typisk 1 M til 3 M, hvor 2,5 M NaCl foretrekkes for påsetting, og 2 M NaCl foretrekkes for eluering dersom organisk løsningsmiddel er til stede. Fortrinnsvis benyttes en reduksjon av saltkonsentrasjonen for eluering og separering av et neurotrofin og dets varianter. For å oppnå eluering er saltkonsentrasjonen i elueringsbufferen typisk lavere enn i påsettingsbufferen, men det kan være samme konsentrasjon dersom dette kompenseres for med organisk løsningsmiddel. I tillegg har anvendelse av organisk løsningsmiddel en annen fordel, som vist heri, nemlig at tilsetning av et organisk løs-ningsmiddel forbedrer elueringsmønsteret ved at det gir smalere topp-profiler. I tillegg til etanol kan andre organiske løsningsmidler diskutert heri, benyttes, heriblant propanol, isopropanol og lavere alkylenglykoler, f.eks. propylenglykol, etylenglykol og heksylenglykol. Det organiske løs-ningsmiddel i en konsentrasjon mellom 5 og 25% (vol/vol), mer foretrukket 5 til 20% (vol/vol), enda mer foretrukket 5 til 15%, vil typisk eluere et korrekt foldet neurotrofin. Eluering med organisk løsningsmiddel kan utføres enten med gradient eller trinnvis. pH-området er fortrinnsvis nær nøytralt til svakt surt, mellom pH 5 og 8, mer foretrukket pH 5,5 til 7,5, og mest foretrukket pH 7. Enhver av bufferne som diskuteres heri, heriblant MOPSO, MOPS, HEPES, fosfat, sitrat, ammonium og acetat, kan benyttes så lenge de bufrer ved den ønskede pH.
Eksempel VII. Rensing av korrekt foldet rhNT- 4/ 5 fra kjemiske varianter
Separasjon av korrekt foldet, intakt rhNT-4/5 fra kjemiske varianter, heriblant karbamylerte og N-terminalt avkortede former av rhNT-4/5, ble oppnådd ved høyytelses-kationbytterkromatografi med "SP-Sepharose HP"-resin eller "PolyCat a" HPLC-resin.
Dersom C4 RP-HPLC-kolonnen ble benyttet for fjerning av feilfoldede varianter, ble C4 HPLC-porsjonen justert til pH 5 til 7 og påsatt en 7 cm x 19 cm "SP-Sepharose HP"-kolonne ekvilibrert med 20 mM succinat, pH 6, 5% reagensalkohol, 0,2 M NaCl. Resinet med bundet NT-4/5 ble vasket med ekvilibreringsbuffer. Bundet rhNT-4/5 ble eluert og separert fra de karbamylerte og N-terminalt avkortede former ved benyttelse av en gradient på 22 kolonnevolumer fra 0,2 M NaCl til 0,4 M NaCl ved pH 6 (dvs. en saltgradient i ekvilibreringsbuffer) (figur 11) . NT-4/5-holdige fraksjoner ble slått sammen og overført til 0,05 M acetat, pH 4 til 5. Intakt rhNT-4/5 ble identifisert og skilt fra variantene i fraksjonene fortrinnsvis ved analytisk RP-HPLC, eller ved SDS-PAGE som diskutert heri, sammenlignet med standard.
Alternativt ble variantformene av NT-4/5 fjernet ved høyytelses-kationbytter-HPLC på en polyasparaginsyrekolonne ("PolyCAT a", "PolyLC", Columbia, Md.) (9,4 x 200 mm) (figur 12) . C4 HPLC-porsjonen ble justert til pH 5 til 6 og påsatt "Polycat a"-kolonnen. Kromatografibetingelsene var: buffer A var 20 mM fosfat, 5% acetonitril, pH 6, buffer B var 20 mM fosfat, 5% acetonitril, 0,8 M kaliumklorid, pH 6. rhNT-4/5 ble eluert med en gradient fra 25 til 60% buffer B over 65 minutter (figur 12). Fraksjoner ble oppsamlet med 1 minutts mellomrom og analysert ved analytisk C4 HPLC som beskrevet ovenfor.
Dersom HIC ble benyttet for fjerning av feilfoldede varianter (eksempel VI ovenfor), ble porsjonen med korrekt foldet NT-4/5 dialysert over natten mot 20 mM succinat, 0,1 M NaCl, 5% reagensalkohol, pH 6 eller ultrafiltrert/diafiltrert mot 20 mM succinatbufferen. Dialysatet eller ultrafiltratet ble så påsatt en "SP-Sepharose HP"-kolonne eller "PolyCAT a"-kolonne som beskrevet ovenfor.
Preparatfremstilling
Fraksjoner som inneholdt korrekt foldet, intakt NT-4/5 (fra "SP-Sepharose HP"-trinnet eller "PolyCAT a"-HPLC-trinnet) ble slått sammen og konsentrert til 1 til 5 mg/ml i 20 mM acetat, pH 4 til 5. Alternativt ble preparatutforming av NT-4/5 utført ved ultrafiltrering/diafiltrering.
Den endelige løsning ble analysert ved aminosyreana-lyse, N-terminal sekvensanalyse, massespektrometri, SDS-PAGE (figur 13) og biologiske analyser. En kinasereseptoraktiver-ingsanalyse (KIRA) som påviser NT-4/5-aktivering av autofos-forylering av sin tyrosinkinasereseptor (trkB) i en cellemem-bran, ble benyttet for aktivisering av det rensede rhNT-4/5. CHO-celler som uttrykker trkB med en gD-merkelapp, ble benyttet. WO 95/14930, publisert 1. juni 1995, beskriver KIRA-analysen og inkorporeres heri ved referanse. rhNT-4/5 hadde en ED50 på 12,6 ng/ml i denne analyse. Typisk er EC50 for korrekt foldet, intakt NT-4/5, renset som beskrevet heri, 5 til 30, mer foretrukket 10 til 20.
Renheten av rhNT-4/5 relativt til ikke-NT-4/5-proteiner var typisk 90 til 99%. Homogeniteten av NT-4/5 med hensyn til karbamylerte og N-terminalt avkortede varianter var mellom 90 og 99%. Mest typisk, og fortrinnsvis, er renheten og homogeniteten 99% eller mer.
Eksempel VIII. Innledende rensing, gjenfolding og sluttrensing av rhNT- 3 fra bakterielle inklusjonslegemer
For isolering av inklusjonslegemer fra cellerester ble E. coli NT-3-grøten (1 kg) resuspendert i 10 1 100 mM natriumacetat, pH 5, ved benyttelse av en roterende, mekanisk dispersjonsanretning, f.eks. en turrax. Cellesuspensjonen ble passert gjennom en mikrofluidisator tre ganger ved 41 400 kPa. Det resulterende homogenat ble sentrifugert i en "Sorvall RC-3B"-sentrifuge ved 5 000 rpm i 30 minutter.
NT-3 ble isolert fra inklusjonslegemene som følger. De nedsentrifugerte inklusjonslegemer ble suspendert i 100 mM Tris, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 100 mM natriumsulfitt, 10 mM natriumtetrationat, 7,5 M urea, pH 8,3 (10 ml/g inklusjonslegemer) ved benyttelse av en turrax ved middels hastighet i tilnærmet 10 minutter. Suspensjonen ble omrørt i tilnærmet 1 time ved 2-8 °C. PEI (polyetylenimin) ble tilsatt til tilnærmet 0,15% (sluttkonsentrasjon) og omrørt ved 2-8 °C i
30 minutter. Blandingen ble sentrifugert i en "Sorvall RC3B" ved 5 000 rpm i tilnærmet 30 minutter. Supernatanten ble filtrert med en "Gelman Preflow"-patron. Den filtrerte supernatant ble fortynnet med tre volumer "S-Sepharose Fast Flow"-ekvilibreringsbuffer (50 mM natriumacetat, 5 M urea, pH 5). Den fortynnede, filtrerte supernatant (ledningsevne lavere enn 7 mS) påsettes en "S-Sepharose FF"-kolonne ekvilibrert med 50 mM natriumacetat, 5 M urea, pH 5,0. Kolonnen ble først vasket med 50 mM natriumacetat, 5 M urea, pH 5, fulgt av 50 mM MOPS, 5 M urea, 10 mM glysin, pH 7,0. Sulfitolysert NT-3 ble eluert fra kolonnen med en gradient på 10 kolonnevolumer fra 0-0,6 M NaCl i 50 mM MOPS, 5 M urea, 10 mM glysin, pH 7.
Delvis renset NT-3 ble gjenfoldet ved fortynning av "S-Sepharose FF"-porsjonen til tilnærmet 0,1 mg/ml protein i gjenfoldingsbuffer som inneholdt 0,1 M Tris, 2 M urea, 0,1 M NaCl, 15% PEG 300, 10 mM glysin, 25 mM etanolamin, pH 9,1. Gjenfoldingen ble startet ved tilsetning av cystein til tilnærmet 5 mM og omrøring i 2-5 dager ved 2-8 °C. Om ønskelig, kan gjenfoldingsbufferen gjennombobles med He eller argon for reduksjon av oksygenkonsentrasjonen i gjenfoldingsløsningen.
pH i den gjenfoldede porsjon ble justert til pH 7, og løsningen ble filtrert og påsatt en "Macroprep High S"-kationbytterkromatografikolonne ekvilibrert med 50 mM HEPES, pH 7. Etter påsetting av den pH-justerte, gjenfoldede porsjon på "Macroprep"-kolonnen, ble kolonnen først vasket med 50 mM MOPS, pH 7, fulgt av 50 mM MOPS, 0,1 M TMAC, 0,3 M NaCl, pH 7. NT-3 ble eluert med 50 mM MOPS, 0,25 M TMAC, 1,5 M NaCl, pH 7.
"Macroprep"-porsjonen ble så videre renset på en
"Phenyl Sepharose Fast Flow High Substitution"-kolonne. Fenylkolonnen ble ekvilibrert med 50 mM HEPES, 1,5 M NaCl, pH 7, og "Macroprep"-porsjonen ble direkte påsatt fenylkolonnen. Kolonnen ble vasket med ekvilibreringsbuffer, hvoretter korrekt
gjenfoldet NT-3 ble eluert med en gradient på 15 kolonnevolumer fra 50 mM HEPES, 1,5 M NaCl, pH 7 til 50 mM HEPES, 10% reagensalkohol, pH 7. Fraksjonene ble analysert, enten ved C4 HPLC eller ved SDS-PAGE, og fraksjonene som inneholdt korrekt foldet NT-3, ble slått sammen.
Fenylporsjonen ble fortynnet til mindre enn 25 mS (typisk med tilnærmet 2 volumer vann) og påsatt en "SP-Sepharose HP"-kolonne som på forhånd var ekvilibrert med 25 mM MOPSO, pH 7. Kolonnen ble først vasket med ekvilibreringsbuffer, og NT-3 ble eluert fra kolonnen med en gradient på
20 kolonnevolumer fra 0,35 M TMAC til 0,65 M TMAC i 25 mM MOPSO, pH 7. rhNT-3-holdige fraksjoner (vurdert ved C4 HPLC-analyse) ble slått sammen.
"SP-Sepharose HP"-porsjonen ble konsentrert til tilnærmet 1 mg/ml med en membran med grenseverdi 10 000 dalton og deretter diafiltrert med 6 volumer 10 mM acetat, 140 mM NaCl, pH 5,0.
Claims (7)
1. Fremgangsmåte for isolering av et rekombinant humant neurotrofin, eller genetisk modifisert form av dette, fra en blanding som inneholder andre proteiner og en variant av dette rekombinante humane neurotrofinet som kan inkludere en feilfoldet variant, en feilaktig proteolytisk prosessert variant, eller en glykosyleringsvariant av dette rekombinante humane neurotrofinet,
karakterisert ved at den omfatter: separasjon av det rekombinante humane neurotrofinet fra andre proteiner og neurotrofinvariant i blandingen ved å benytte hydrofobt interaksjonskromatografiresin som omfatter en hydrofob funksjonell gruppe der blandingen har en pH på 5 til 8 og en saltkonsentrasjon på o,5 M til 3 M, og der separasjonen omfatter påsetting av blandingen på et hydrofobt interaksjonskromatografiresin ved pH 5 til 8, vasking av resinet med en buffer ved pH 5 til 8 og eluering av det rekombinante humane neurotrofinet fra resinet med en elueringsbuffer ved pH 5 til 8 ved betingelser som er valgt fra minskende saltkonsentrasjon, endret overflatespenning, økende konsentrasjon av relativt polart organisk løsningsmiddel og endret pH i løsning, der det rekombinante humane neurotrofinet separeres fra varianten, og som ytterligere omfatter separasjon av det rekombinante humane neurotrofinet fra sine kjemiske varianter ved å benytte høyytelses-kationbytterkromatografiresin, og som omfatter at eluatet fra høyytelses-kationbytterresinet som inneholder det rekombinante humane neurotrofinet avsaltes eller behandles ved diafiltrering og deretter utformes med et bærerstoff.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at trinnet som omfatter høyytelses-kationbytterkromatografiseparasjon, omfatter påsetting av en blanding som inneholder det rekombinante humane neurotrofinet og en kjemisk variant av det rekombinante humane neurotrofinet på et høyytelses-kationbytterkromatografiresin og eluering av det rekombinante humane neurotrofinet fra resinet under betingelser hvor det rekombinante humane neurotrofinet separeres fra den kjemiske varianten, og hvori det rekombinante humane neurotrofinet har en høy pl.
3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at høyytelses-kationbytterresinet er et "SP-Sepharose HP"-resin, et polyasparaginsyreresin, et polysulfoetylkationbytterresin eller et "Fractogel EMD S03"-resin.
4. Fremgangsmåte for separasjon av et neurotrofin fra en kjemisk variant av dette neurotrofinet, karakterisert ved -at den omfatter separasjon av neurotrofinet fra dets kjemiske variant ved benyttelse av hydrofobt interaksjonskromatografi HIC) -resin etterfulgt av høyytelses-kationbytterkromatografiresin, der fremgangsmåten omfatter: påsetting av neurotrofinet og dets kjemiske variant i en blanding som har en pH på 5 til 8 og en saltkonsentrasjon på 0,5 M til 3 M på et HIC-resin som omfatter en hydrofob funksjonell gruppe, vasking av HIC-resinet med en buffer med en pH på 5 til 8, eluering av neurotrofinet fra HIC-resinet med en elueringsbuffer ved pH 5 til 8 ved betingelser som er valgt fra minskende saltkonsentrasjon, endret overflatespenning, økende konsentrasjon av relativt polart organisk løsningsmiddel og endret pH i løsning og separasjon av neurotrofinet fra dets kjemiske variant ved å benytte høyytelses-kationbytterkromatografiresin, der fremgangsmåten, om ønskelig, videre omfatter trinnet hvor neurotrofinet separeres fra en feilfoldet variant av dette neurotrofinet ved benyttelse av et resin for preparativ reversfase-væskekromatografi.
5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at neurotrofinet og dets variant i alt vesentlig er rene før separasjonen av neurotrofinet fra dets kjemiske variant ved å benytte høyytelses-kationbytterkromatografiresin..
6. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at høyytelses-kationbytterkromatografiresinet er et "SP-Sepharose HP"-resin, et polyasparaginsyreresin, et polysulfoetyl-kationbytterresin eller et "Fractogel EMD S03"-resin.
7. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at resinet for preparativ reversfase-væskekromatografi inneholder én funksjonell C4-gruppe.
165089
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US3083896P | 1996-11-15 | 1996-11-15 | |
US4785597P | 1997-05-29 | 1997-05-29 | |
PCT/US1997/021068 WO1998021234A2 (en) | 1996-11-15 | 1997-11-14 | Purification of neurotrophins |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO992353D0 NO992353D0 (no) | 1999-05-14 |
NO992353L NO992353L (no) | 1999-07-09 |
NO327149B1 true NO327149B1 (no) | 2009-05-04 |
Family
ID=26706516
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO19992353A NO327149B1 (no) | 1996-11-15 | 1999-05-14 | Fremgangsmate for isolering av et rekombinant humant neutrofin, eller genetisk modifisert form av dette, fra en blanding som inneholder andre proteiner og en variant av dette rekombinante humane neutrofinet som kan inkludere en feilfoldet variant, en feilaktig proteolytisk prosessert variant, eller en glykosyleringsvariant av dette rekombinante humane neutrofinet, fremgangsmate for seperasjon av et neutrofin fra en kjemisk variant av dette neutrofinet. |
Country Status (21)
Country | Link |
---|---|
US (5) | US6005081A (no) |
EP (1) | EP0942930B1 (no) |
JP (3) | JP4671372B2 (no) |
KR (1) | KR100554332B1 (no) |
CN (1) | CN1268639C (no) |
AT (1) | ATE371670T1 (no) |
AU (1) | AU729459B2 (no) |
BR (1) | BR9713055A (no) |
CA (1) | CA2268747A1 (no) |
CZ (1) | CZ300296B6 (no) |
DE (1) | DE69738074T2 (no) |
EA (1) | EA002349B1 (no) |
ES (1) | ES2293662T3 (no) |
HU (1) | HU222666B1 (no) |
ID (1) | ID26697A (no) |
IL (2) | IL129851A0 (no) |
NO (1) | NO327149B1 (no) |
NZ (1) | NZ335207A (no) |
PL (1) | PL191400B1 (no) |
TR (1) | TR199901734T2 (no) |
WO (1) | WO1998021234A2 (no) |
Families Citing this family (57)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CZ300296B6 (cs) * | 1996-11-15 | 2009-04-15 | Genentech, Inc. | Zpusob izolace rekombinantního lidského neurotrofinu, neurotrofinový prostredek a zpusob cištení neurotrofinu |
EP1032830A1 (en) * | 1997-11-20 | 2000-09-06 | ESA, Inc. | Electrochemical analysis system |
US6489447B1 (en) | 1998-05-06 | 2002-12-03 | Genentech, Inc. | Protein purification |
DK1681298T3 (da) | 2000-03-27 | 2010-06-14 | Genetics Inst Llc | Fremgangsmåder til oprensning af særdeles anioniske proteiner |
NZ530025A (en) * | 2001-06-05 | 2005-06-24 | Inst Genetics Llc | Methods for purifying highly anionic proteins |
EP1456233A4 (en) * | 2001-06-15 | 2006-06-21 | Queensland Bioproc Technology | ORMEAU HEMOCYANINE AND METHOD FOR PURIFICATION THEREOF |
CA2490409A1 (en) | 2002-06-28 | 2004-01-08 | Centocor, Inc. | Mammalian ch1 deleted mimetibodies, compositions, methods and uses |
US7998705B2 (en) * | 2002-08-06 | 2011-08-16 | FUJIFILM Diosynth Biotechnologies U.S.A., Inc | Increased dynamic binding capacity in ion exchange chromatography by addition of polyethylene glycol |
AU2003902066A0 (en) * | 2003-05-01 | 2003-05-15 | Norika Holdings | Extraction process for a pharmaceutical product |
EP1538201A1 (en) * | 2003-12-02 | 2005-06-08 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Method for the recombinant production and purification of protein kinases |
CA2487673C (en) * | 2003-12-02 | 2010-11-02 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Improved method for the recombinant production and purification of protein kinases |
EP1720564A1 (en) * | 2004-02-20 | 2006-11-15 | Rinat Neuroscience Corp. | Methods of treating obesity or diabetes using nt-4/5 |
PL1745078T3 (pl) * | 2004-04-23 | 2009-12-31 | Conjuchem Biotechnologies Inc | Sposób oczyszczania koniugatów albumin |
US20090060861A1 (en) * | 2005-05-25 | 2009-03-05 | Novo Nordisk A/S | Stabilized Polypeptide Formulations |
JP5235661B2 (ja) | 2005-05-25 | 2013-07-10 | ノボ・ノルデイスク・エー/エス | 安定化ポリペプチド製剤 |
SG155183A1 (en) | 2005-08-26 | 2009-09-30 | Ares Trading Sa | Process for the preparation of glycosylated interferon beta |
AU2006323925B2 (en) | 2005-12-09 | 2012-08-02 | Ares Trading S.A. | Method for purifying FSH or a FSH mutant |
CN100419422C (zh) * | 2005-12-12 | 2008-09-17 | 北京三诺佳邑生物技术有限责任公司 | 测定神经生长因子含量的方法 |
PL1969007T4 (pl) | 2005-12-20 | 2014-04-30 | Bristol Myers Squibb Co | Kompozycje i sposoby wytwarzania kompozycji |
AR058568A1 (es) | 2005-12-20 | 2008-02-13 | Bristol Myers Squibb Co | Metodos para producir una composicion con moleculas ctla4-ig a partir de un medio de cultivo |
RU2008131939A (ru) | 2006-02-02 | 2010-02-10 | Ринат Ньюросайенс Корп. (Us) | Способы лечения нежелательной потери веса или нарушений приема пищи агонистами trkb |
CA2637707A1 (en) * | 2006-02-02 | 2007-08-09 | Rinat Neuroscience Corporation | Methods for treating obesity by administering a trkb antagonist |
US10741034B2 (en) | 2006-05-19 | 2020-08-11 | Apdn (B.V.I.) Inc. | Security system and method of marking an inventory item and/or person in the vicinity |
US9790538B2 (en) * | 2013-03-07 | 2017-10-17 | Apdn (B.V.I.) Inc. | Alkaline activation for immobilization of DNA taggants |
AU2007337809A1 (en) * | 2006-12-20 | 2008-07-03 | Rinat Neuroscience Corporation | TrkB agonists for treating autoimmune disorders |
LT3597659T (lt) | 2007-07-09 | 2023-05-10 | Genentech, Inc. | Disulfidinės jungties redukcijos prevencijos būdas gaminant polipeptidą rekombinantiniu būdu |
PL2840090T3 (pl) | 2007-10-30 | 2018-07-31 | Genentech, Inc. | Oczyszczanie przeciwciał za pomocą chromatografii kationowymiennej |
US8447409B2 (en) * | 2008-10-15 | 2013-05-21 | Cochlear Limited | Electroneural interface for a medical implant |
WO2010075535A1 (en) * | 2008-12-23 | 2010-07-01 | Regents Of The University Of Minnesota | Neurotrophins and uses thereof |
JP5695384B2 (ja) | 2009-10-05 | 2015-04-01 | 花王株式会社 | 毛髪形状感受性遺伝子 |
JP5699429B2 (ja) * | 2009-12-18 | 2015-04-08 | 東ソー株式会社 | Fcレセプターの精製方法 |
SG10201407983VA (en) | 2009-12-18 | 2015-01-29 | Csl Ltd | Method of purifying polypeptides |
WO2011162317A1 (ja) * | 2010-06-25 | 2011-12-29 | 日本臓器製薬株式会社 | 被検物質の判定又は評価方法 |
CN102898514B (zh) * | 2011-07-28 | 2015-04-29 | 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 | 重组人神经生长因子缺失突变体及其制备方法和用途 |
EP2594295A1 (en) | 2011-11-16 | 2013-05-22 | Servicio Andaluz De Salud | Nerve implants based on a compacted biomaterial containing cells |
US9297032B2 (en) | 2012-10-10 | 2016-03-29 | Apdn (B.V.I.) Inc. | Use of perturbants to facilitate incorporation and recovery of taggants from polymerized coatings |
US9266370B2 (en) | 2012-10-10 | 2016-02-23 | Apdn (B.V.I) Inc. | DNA marking of previously undistinguished items for traceability |
US9963740B2 (en) | 2013-03-07 | 2018-05-08 | APDN (B.V.I.), Inc. | Method and device for marking articles |
CA2926436A1 (en) | 2013-10-07 | 2015-04-16 | Judith Murrah | Multimode image and spectral reader |
CN103880943A (zh) * | 2014-01-20 | 2014-06-25 | 厦门北大之路生物工程有限公司 | 一种rhNGF成熟肽的制备方法 |
CA2940655C (en) | 2014-03-18 | 2020-07-07 | Apdn (B.V.I.) Inc. | Encrypted optical markers for security applications |
US10745825B2 (en) | 2014-03-18 | 2020-08-18 | Apdn (B.V.I.) Inc. | Encrypted optical markers for security applications |
CN104195160A (zh) * | 2014-08-08 | 2014-12-10 | 厦门北大之路生物工程有限公司 | 一种以Pro-BDNF的形式制备人脑源性神经营养因子的方法 |
US10760182B2 (en) | 2014-12-16 | 2020-09-01 | Apdn (B.V.I.) Inc. | Method and device for marking fibrous materials |
CN106279397A (zh) * | 2015-06-09 | 2017-01-04 | 舒泰神(北京)生物制药股份有限公司 | 一种神经生长因子的提取方法 |
US10519605B2 (en) | 2016-04-11 | 2019-12-31 | APDN (B.V.I.), Inc. | Method of marking cellulosic products |
CN106478801A (zh) * | 2016-10-10 | 2017-03-08 | 未名生物医药有限公司 | 一种从哺乳动物细胞培养物中分离重组人神经生长因子的方法 |
US10995371B2 (en) | 2016-10-13 | 2021-05-04 | Apdn (B.V.I.) Inc. | Composition and method of DNA marking elastomeric material |
WO2018156352A1 (en) | 2017-02-21 | 2018-08-30 | Apdn (B.V.I) Inc. | Nucleic acid coated submicron particles for authentication |
GB201705955D0 (en) * | 2017-04-13 | 2017-05-31 | Cell Guidance Systems Ltd | Delivery method |
CN107973848B (zh) * | 2017-12-28 | 2020-10-16 | 未名生物医药有限公司 | 一种从混合物中分离天然序列神经生长因子的方法 |
CN108239146A (zh) * | 2018-03-26 | 2018-07-03 | 江苏中新医药有限公司 | 一种高纯度rhNGF的制备方法 |
CN108467428A (zh) * | 2018-03-26 | 2018-08-31 | 江苏中新医药有限公司 | 一种清除rhNGF中N端截短及异常变异体的方法 |
CN108467429A (zh) * | 2018-03-26 | 2018-08-31 | 江苏中新医药有限公司 | 疏水层析动态清除重组人神经生长因子前体的方法 |
US20210079053A1 (en) * | 2018-04-27 | 2021-03-18 | Chiesi Farmaceutici Spa | Production of nerve growth factor (ngf) and of muteins thereof |
CN114252519B (zh) * | 2020-09-23 | 2023-11-24 | 舒泰神(北京)生物制药股份有限公司 | 一种测定神经生长因子纯度的方法 |
CN114380901A (zh) * | 2021-12-31 | 2022-04-22 | 华东理工大学 | 蛋白纳米粒子的制备方法、所得蛋白纳米粒子及其应用 |
Family Cites Families (37)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4407744A (en) * | 1977-11-23 | 1983-10-04 | Young David M | Process for obtaining nerve growth factor |
US4565785A (en) * | 1978-06-08 | 1986-01-21 | The President And Fellows Of Harvard College | Recombinant DNA molecule |
US4673641A (en) * | 1982-12-16 | 1987-06-16 | Molecular Genetics Research And Development Limited Partnership | Co-aggregate purification of proteins |
DK161152C (da) * | 1983-03-03 | 1991-11-11 | Genentech Inc | Polypeptid med egenskaber som human beta-nervevaekstfaktor og fremgangsmaade til fremstilling deraf, dna-isolat omfattende en sekvens som koder for polypeptidet, replicerbar udtrykkelsesvektor for dna-sekvensen, rekombinant vaertscelle transformeret med vektoren, farmaceutisk praeparat indeholdende polypeptidet og fremg. der omfatter anvendelsen af polypeptidet til fremst. af et farmaceutisk praeparat |
US5169762A (en) * | 1983-03-03 | 1992-12-08 | Genentech, Inc. | Human nerve growth factor by recombinant technology |
US4710473A (en) * | 1983-08-10 | 1987-12-01 | Amgen, Inc. | DNA plasmids |
US4738921A (en) * | 1984-09-27 | 1988-04-19 | Eli Lilly And Company | Derivative of the tryptophan operon for expression of fused gene products |
US4795706A (en) * | 1985-01-31 | 1989-01-03 | Eli Lilly And Company | Novel expression control sequences |
IT1219874B (it) * | 1988-03-18 | 1990-05-24 | Fidia Farmaceutici | Utilizzazione del fattore di crescita nervoso umano e sue composizioni farmaceutiche |
US5082774A (en) * | 1988-08-30 | 1992-01-21 | The General Hospital Corporation | Recombinant human nerve growth factor |
US5272063A (en) * | 1988-11-22 | 1993-12-21 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Process of making human nerve growth factor |
CA2005600A1 (en) * | 1988-12-20 | 1990-06-20 | Cal-Henrik Heldin | Endothelial cell growth factor |
DE69017793T2 (de) * | 1989-08-21 | 1995-08-24 | Takeda Chemical Industries Ltd | Produktion von menschlichen Nervenwachstumsfaktoren. |
JPH04128300A (ja) * | 1989-08-21 | 1992-04-28 | Takeda Chem Ind Ltd | ヒト神経成長因子蛋白質およびその製造法 |
US5180820A (en) * | 1989-08-30 | 1993-01-19 | Barde Yves Alain | Brain-derived neurotrophic factor |
US5229500A (en) * | 1989-08-30 | 1993-07-20 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Brain derived neurotrophic factor |
US5606031A (en) * | 1990-04-06 | 1997-02-25 | Lile; Jack | Production and purification of biologically active recombinant neurotrophic protein in bacteria |
US5235043A (en) * | 1990-04-06 | 1993-08-10 | Synergen, Inc. | Production of biologically active, recombinant members of the ngf/bdnf family of neurotrophic proteins |
US5169764A (en) * | 1990-08-08 | 1992-12-08 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Multitrophic and multifunctional chimeric neurotrophic factors, and nucleic acids and plasmids encoding the chimeras |
DE69121208T2 (de) * | 1990-09-25 | 1997-01-23 | Genentech Inc | Neuer neurotropischer faktor |
US5702906A (en) * | 1990-09-25 | 1997-12-30 | Genentech, Inc. | Antibodies to neurotrophic factor-4 (NT-4) |
US5364769A (en) * | 1990-09-25 | 1994-11-15 | Genentech, Inc. | Nucleic acid encoding neurotrophic factor four (NT-4), vectors, host cells and methods of production |
ATE154389T1 (de) * | 1991-02-18 | 1997-06-15 | Takeda Chemical Industries Ltd | Verfahren zur herstellung von menschlichem ngf-2 |
PT100580A (pt) * | 1991-06-12 | 1993-09-30 | Regeneron Pharma | Producao e recuperacao de neurotrofinas recombinantes |
US5389529A (en) * | 1991-06-12 | 1995-02-14 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Modified lamβ signal sequence and processes for producing recombinant neurotrophins |
DE4133707A1 (de) * | 1991-10-11 | 1993-04-15 | Behringwerke Ag | Verfahren zur reinigung von streptolysin o, intaktes streptolysin o erhaeltlich nach diesem verfahren und seine verwendung |
JPH05211887A (ja) * | 1992-01-31 | 1993-08-24 | Hitachi Ltd | 神経成長因子の生産方法 |
US5349055A (en) * | 1992-03-06 | 1994-09-20 | Persson Hakan B | Nerve growth factor having altered receptor binding specificities |
US5488099A (en) * | 1992-03-06 | 1996-01-30 | Persson, Deceased; Hakan B. | Multifunctional chimeric neurotrophic factors |
US5451660A (en) * | 1993-12-13 | 1995-09-19 | Genentech, Inc. | Method for purifying polypeptides |
US5728803A (en) * | 1994-06-03 | 1998-03-17 | Genentech, Inc. | Pantropic neurotrophic factors |
US5759775A (en) * | 1994-10-27 | 1998-06-02 | Genetech, Inc. | Methods for detecting nucleic acids encoding AL--1 neurotrophic factor |
US5733875A (en) * | 1994-11-15 | 1998-03-31 | Amgen Inc. | Methods of using GDNF as a neuroprotective agent |
US5650496A (en) * | 1995-04-14 | 1997-07-22 | Cephalon, Inc. | IGF-I purification process |
IL118201A (en) * | 1995-05-11 | 2004-12-15 | Roche Diagnostics Gmbh | Preparation comprising a protein with human erythropoietin activity which is free of serum and non-recombinant mammalian protein and process for the preparation thereof |
US5739307A (en) * | 1995-08-28 | 1998-04-14 | Washington University | Polynucleotide encoding neurturin neurotrophic factor |
CZ300296B6 (cs) * | 1996-11-15 | 2009-04-15 | Genentech, Inc. | Zpusob izolace rekombinantního lidského neurotrofinu, neurotrofinový prostredek a zpusob cištení neurotrofinu |
-
1997
- 1997-11-14 CZ CZ0166699A patent/CZ300296B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-11-14 ID IDW990339D patent/ID26697A/id unknown
- 1997-11-14 PL PL333460A patent/PL191400B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1997-11-14 EP EP97948362A patent/EP0942930B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-11-14 ES ES97948362T patent/ES2293662T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-11-14 AT AT97948362T patent/ATE371670T1/de active
- 1997-11-14 EA EA199900436A patent/EA002349B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1997-11-14 CN CNB971996822A patent/CN1268639C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1997-11-14 AU AU54448/98A patent/AU729459B2/en not_active Ceased
- 1997-11-14 HU HU9903947A patent/HU222666B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1997-11-14 IL IL12985197A patent/IL129851A0/xx active IP Right Grant
- 1997-11-14 BR BR9713055-9A patent/BR9713055A/pt not_active Application Discontinuation
- 1997-11-14 TR TR1999/01734T patent/TR199901734T2/xx unknown
- 1997-11-14 DE DE69738074T patent/DE69738074T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-11-14 JP JP52291398A patent/JP4671372B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1997-11-14 US US08/970,865 patent/US6005081A/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-11-14 WO PCT/US1997/021068 patent/WO1998021234A2/en active IP Right Grant
- 1997-11-14 CA CA002268747A patent/CA2268747A1/en not_active Abandoned
- 1997-11-14 NZ NZ335207A patent/NZ335207A/xx not_active IP Right Cessation
- 1997-11-14 KR KR1019997004281A patent/KR100554332B1/ko not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-05-09 IL IL129851A patent/IL129851A/en not_active IP Right Cessation
- 1999-05-14 NO NO19992353A patent/NO327149B1/no not_active IP Right Cessation
- 1999-07-29 US US09/363,573 patent/US6184360B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-09-29 US US09/675,503 patent/US6423831B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2002
- 2002-02-08 US US10/072,681 patent/US6812330B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2004
- 2004-02-18 US US10/782,261 patent/US6953844B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2007
- 2007-06-26 JP JP2007168104A patent/JP4881234B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2008
- 2008-08-13 JP JP2008208434A patent/JP2009040786A/ja not_active Withdrawn
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US6423831B1 (en) | Isolation of neurotrophins from a mixture containing other proteins and neurotrophin variants using hydrophobic interaction chromatography | |
JP2007302679A6 (ja) | ニューロトロフィンの精製 | |
WO1998021234A9 (en) | Purification of neurotrophins | |
KR101520105B1 (ko) | 재조합 단백질의 리폴딩 | |
US8969042B2 (en) | Refolding transforming growth factor beta family proteins | |
Shirai et al. | Cloning and expression in Escherichia coli of the gene for human tumour necrosis factor | |
KR101837802B1 (ko) | 신규 prongf 돌연변이체 및 베타-ngf의 제조에서의 이의 용도 | |
US5446024A (en) | Purification of insulin-like growth factor | |
JP4239131B2 (ja) | 分子の精製 | |
NO864321L (no) | Rensemetode for proteiner. | |
MXPA99004339A (en) | Purification of neurotrophins | |
JP2005514914A (ja) | ポリペプチド精製法 | |
KR100988706B1 (ko) | 재조합 에리트로포이에틴의 신규한 정제방법 | |
US20100168386A1 (en) | Fusion protein carrying neurotrophin across the blood-brain barrier, encoding gene and uses thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |