CZ166699A3

CZ166699A3 - Způsob izolace rekombinantního lidského neurotrofinu, neurotrofinový prostředek a způsob čištění neurotrofinu

Info

Publication number: CZ166699A3
Application number: CZ991666A
Authority: CZ
Inventors: Louis E. Burton; Charles H. Schmelzer; Joanne T. Beck
Original assignee: Genentech, Inc.
Priority date: 1996-11-15
Filing date: 1997-11-14
Publication date: 1999-10-13
Also published as: EP0942930B1; US6423831B1; US6184360B1; ES2293662T3; KR20000053297A; PL191400B1; HU222666B1; AU729459B2; CN1237184A; DE69738074D1; US20040138431A1; CA2268747A1; JP2007302679A; HUP9903947A3; WO1998021234A3; IL129851A0; JP2009040786A; CN1268639C; JP4671372B2; CZ300296B6

Description

Předmětný vynález se týká zlepšené metody purifíkace neurotrofinů, konkrétně těch, které patří do NGF rodiny, konkrétněji pak nervového růstového faktoru (NGF) a neurotrofinu 4/5 (NT-4/5), a neurotrofinu 3 (NT-3) od variant, nečistot a kontamínantů s nimi spojených, zejména, jsou-li produkovány fermentací bakteriálních a savčích buněk.

Dosavadní stav techniky

Produkce velkého množství relativně čistých, biologicky aktivních polypeptidů a proteinů je důležitá z ekonomického hlediska pro výrobu lidských a živočišných farmaceutických formulací, enzymů a jiných speciálních chemikálii. Pro produkci mnoha proteinů se metodou výběru stávají techniky rekombinantní DNA, protože velká množství exogenních proteinů mohou být exprimována v savčích, bakteriálních a jiných hostitelských buňkách

Primární strukturu savčího NGF (myšší NGF) poprvé objasnili Angeletti a Bradshaw, Proč. Nati. Acad. Aci. USA 68:2417 (1971). Primární struktura jeho prekursoru, pre-pro-NGF, byla odvozena od nukleotídové sekvence cDNA myššiho NGF (Scott a spol. Nátuře 302.538 (1983),Ullrich a spal. Nátuře 303.821 (1983)).

Identifikován byl rovněž gen pro homologní lidský NGF (hNGF) (Ullrich, Symp. au Quandiio'., UoldSpnny Harbor 48:435 (1983). LJS Patent 5,288,622 vydaný 22. února 1994, jak je uvedeno v referencích) Jeho homologie s myším NGF je asi 90 % v případě aminokyselinového složení a 87 % u nukleotidove sekvence. Vzhledem k nedostatku přirozeně se vyskytujícího lidského NGF nebyl připraven z přírodních zdrojů v takových množstvích, která by byla dostatečná pro podrobnou biochemickou charakterizaci.

Od té doby byly identifikovány další neurotrofni faktory vztahující se k NGF Patří sem mozkový neurotrofni faktor (BDNF) (Leibrock, a spal.. Nátuře, 341:149 až 152 (1989)), neurotrofin-3 (NT-3) (Kaisho, a spal., UUHS Letí, 266:187 (1990), Maísonpierre, a spo/., Science, 247:1446 (1990), Rosenthal, a spoí, Neuron, 4:767 (1990)) a neurotrofin 4/5 (NT-4/5) (Berkmeier, a spoí, Neuron, 7:857 až 866 (1991)). GDNF, vzdáleny člen TGF-β nadrodiny a neurturin (”NTN”) jsou dva nedávno identifikované strukturálně podobné účinné faktory pro ··· «« - v « * · * · * · «**· • ···· « · · · ·«· ··· • · · * · * ·

-) a a a a a * a »« «* neurony sympatických senzorů centrálního nervového systému (Lin a spoi. Science 260:1130 až 1132 (1993); Henderson a spoi. Science 266:1062 až 1064 (1994); Buj-Bello a spoi., Neuron 15:821 až 828 (1995), Kotzbauer a spoi. Nátuře. 384 467 až 470 (1996)).

Produkce rekombinantnich proteinů zahrnuje transfekci hostitelských buněk DNA, která kóduje protein, a růst buněk za podmínek, které jsou příznivé pro expresi rekombinantního proteinu. Prokaryotní E. coli je vhodná hostitelská buňka, protože umožňuje levnou produkci rekombinantního proteinu ve vysokých výtěžcích. Existuje řada US patentů na obecnou bakteriální expresi DNA, která kóduje proteiny. Patři sem U S. Pat. No. 4,565,785 na molekulu rekombinantní DNA obsahující bakteriální gen pro extracelulární nebo periplasmatický nosičovy protein a nebakteriální gen; US Pat. No 4,673,641 na současnou produkci cizího polypeptidu s polypeptidem, který tvoří agregáty, U S. Pat. No. 4,738,921 na expresní vektor s trp promotor/operátorem a na trp LE fúzí s polypeptidem, jako je IGF-I; U S. Pat. No. 4,795,706 na začlenění expresních kontrolních sekvenci do cizího proteinu, a U S Pat. No 4,710,473 na specifické cirkulámí DNA plasmidy jako jsou ty, které kódují IGF-Í.

Geneticky modifikované bioťarmaceutické látky jsou většinou purifikované ze supematantu, který obsahuje řadu různorodých kontaminantů hostitelské buňky. V konkrétním případě NGF byl podle dostupných informací purifikován s použitím řady nuzných metod do různého stupně čistoty, s různým stupněm úsilí a uspěchu. Viz např. Longo a spoi., JBRO Handbook, vol. 12, pp 3 až 30 (1989), US Patent 5,082,774, který odhaluje CHO buněčnou produkci NGF; Bruče a Heinrich (Neurobio. Aging 10:89 až 94 (1989): Schmelzer a spoi. J. Neurochem. 59:1675 až 1683 (1992); Burton a spoi.. J. Nerochem. 59:1937 1945 (1992). Toto vše bylo prováděno původně v laboratorním měřítku

Avšak nepodařilo se docílit preparativní izolace farmaceuticky čistého rekombinantního lidského NGF bez příměsí variant a s vysokým výtěžkem

Proto je tedy třeba vyvinout účinný protokol pro selektivní separaci neurotiofinů, konkrétně NGF a neurotrofinů z NGE rodiny od jejich variant a jiných molekul a od ostatních polypeptidu $ vysokým pl. Proces purifikace neurotrofinů ve velkém měřítku by měl být aplikovatelný na výchozí materiál z různých zdrojů včetně fermentačního bujónu a lyžovaných bakteriálních nebo savčích buněk $ cílem pokrýt klinické potřeby Kromě toho, protože autoři předmětného vynálezu objevili dosud neznámé, obtížně separovatelné neurotrofinové varianty, např. NGF varianty, prezentované metody jsou konkrétně užitečné pro získání komerčně využitelného množství rekombinantnich neurotrofinů, včetně lidského NGF’ (rhNGIj, rhNT-3 a rhNT-4/5 a jejich žádoucích geneticky modifikovaných mutantů, které neobsahují žádné nežádoucí varianty. Tyto a další předměty vynálezu budou nyní zřejmé pro každého odborníka v dané oblasti.

Podstata vynalezu

V jednom provedení předmětného vynálezu je uváděn proces purifikace neurotrofinu, konkrétně toho, který patří do NGF rodiny, včetně NGF, NT-3, NT-4/5 a BDNF, ktere jsou rozpoznávány vysoce homologní rodinou receptorů (trks), výhodněji rhNGF, rNT-3, rhNT 4/5, rhBDNF nebo jejich žádoucích geneticky manipulovaných forem užitím chromatografie s hydrofóbní interakcí (HIC). Vzhledem k tomu, že autoři předmětného vynálezu objevili existenci určitých nežádoucích neurotrofinových variant, vznikajících z rekombinantní produkce neurotrofinu, jak je zde uváděno, použití HIC umožňuje separaci chemicky odlišných nebo dokonce chybně svinutých forem neurotrofinu od požadovaného, správně svinutého, neporušeného neurotrofinu. Varianty, které mohou být odstraněny, jsou takové, které se liší v hydrofobicitě od zralých, správně svinutých neurotrofmů. Jsou to částečně zpracované prekursorové sekvence, glykosylované zralé formy a formy obsahující prekursor (pochází-li z eukaryotické buněčné kultury), a chybně svinuté nebo částečně svinuté varianty (obecně z bakteriální buněčné kultury, probíhaji-li kroky, vedoucí ke svinutí in vilro). Napr HIC je konkrétně užitečná při odstranění částečně zpracovaných prekursorových sekvencí NGF, glykosylovaných druhů NGF a prekursoru (pochazi-li z eukaryotické buněčné kultury) a chybně nebo částečné svinutých variant (obecně z bakteriální buněčné kultury a in vilro probíhajících kroků, vedoucích ke svinutí) ze směsi zralého NGF. NGF má jedno N-vazebné glykosylační místo na A$n45. V případě znovu svinutého rhNT-4/5, který je exprimován bakterii, separuje HIC správně svinuté formy NT-4/5 od nesprávně svinutých forem. Výsledkem tohoto postupu jc neurotrofin, který neobsahuje téměř žádné tyto varianty. Pro purifikaci neurotrofinu jsou upřednostňovány ťenylové funkční skupiny vázané na pryskyřicovém nosiči, zatímco oklylové a butylové skupiny mohou být použity. Konkrétně upřednostňovaná provedeni zahrnují HIC pryskyřicové náplně Phenyl Toyopearl, Phenyl Sepharose Fast Flow Low Substitution, TSKPhenyl 5PW a podobné

V jiném provedení je uváděn proces purifikace neurotrofinu, konkrétně jednoho z NGF rodiny, výhodněji rhNGF, rNT-3, rhNT-4/5 nebo jejich žádoucích geneticky modifikovaných forem pomocí preparativní ionexové chromatografie na katexu Tato chromatografie separuje nábojově modifikované varianty, jako jsou oxidované a deamidované nebo isoasp formy od zralého * ·*♦» · · • · · · » · • · · t!9 9 9 9 • « · · • · · · · neurotrofinu. Konkrétně upřednostňovaná provedeni používají SP-Sepharose High Performance, Fractogel EMD SO3 nebo pryskyřice obsahující polyasparagovou kyselinu, z nichž je konkrétně upřednostňovaná PolyCAT A. Ve velkém měřítku jsou nejvíce upřednostňovány pryskyřice SPSepharose High Performance nebo Fractogel EMD SO3

V ještě dalším provedení předmětného vynálezu je použita jak HIC tak ionexová chromatografie na katexu pro přípravu kompozice žádoucího neurotrofinu např. rekombinantniho zralého NGF, výhodněji lidského NGF, který je převážně homogenní, tzn převážně neobsahuje žádné procesní a nábojové varianty, např chybně svinuté a chemické varianty, a je také převážně čistý z hlediska obsahu proteinů.

V jednom provedení předmětného vynálezu je poskytován zdokonalený postup separace neurotrofmů, konkrétně těch, které patří do NGF rodiny, výhodněji rekombinantniho lidského NGF, NT-3, NT-4/5 a jejich žádoucích geneticky modifikovaných forem, od příbuzných nežádoucích variant, např fermentačních, proteázami štěpených, glykosylovaných variant a chybně svinutých variant kapalinovou chromatografu s reverzní fází Výhodněji je NGF 120/120 nebo 118/118 homodimer Výsledkem zde popisovaného postupu je neurotrofin, který nejvýhodněji neobsahuje téměř žádné varianty

V jiném provedení je poskytován postup purifikace neurotrofinu, konkrétně těch z NGF rodiny, od příbuzných variant použitím elučnich podmínek, zahrnujících fyziologické pH

V ještě jiném provedeni je poskytován postup purifikace neurotrofinu se značně zlepšenou homogenitou

V jiném provedení poskytuje předmětný vynález postup pro separaci neurotrofinu z NGF rodiny od jejich variant a skládá se z:

a) nanesení pufru, obsahujícího neurotrofin a jeho varianty při ni 1 asi 5 až 8 na kolonu pro chromatografu s hydrofobní interakcí

b) promytí kolony

c) eluce neurotrofinu pufřeni o pH 5 až 8

d) nanesení eluentu, obsahujícího neurotrofin, na kolonu pro Íonexovou chromatografii na katexu při pH asi 5 až 8, a

e) eluce neurotrofinu z kolony pomoci pufru s gradientem soli při pH asi 5 až 8, výhodněji _PHÓ Neurotrofin je nejvýhodněji rhNGF

V jednom provedení předmětného vynálezu je poskytován krok chromatografie na sloupci silikagelu, který účinně odstraňuje proteiny hostitelské buňky z neurotrofmové frakce, která je výhodněji NGF frakci.

• · · * 4 « · * · · · · · * · · · · · 4·· • · · · • · · 4 ·

V jednom provedeni předmětného vynálezu je poskytován krok postupu, ve kterém je NGF o 120 aminokyselinách vystaven působeni proteázy na bázi trypsinu Dojde k selektivnímu odstraněni koncového RA dipeptidu z VRRA C-konce a ke vzniku 118 aminokyselinového zbytku. Je upřednostňována kolona s imobilizovaným trypsinem

Předmětný vynález se také vztahuje k neurotrofinové kompozici a formulaci, připravené pomoci postupů předmětného vynálezu, a k použiti kompozice a formulace.

Je poskytována kompozice neurotrofinu, který je převážně homogení, tzn. neobsahuje ani procesní ani nábojové varianty, např chybně svinuté varianty a chemické varianty a také je převážně čistý z hlediska obsahu proteinů V této formě jsou výhodněji poskytovány zralý lidsky NGF, zralý lidský nebo potkaní NT-3 a zralý lidský NT-4/5 V upřednostňovaném provedení obsahuje NGF 120 aminokyselin a výhodněji 118, nejvýhodněji jako homodimer, např. 118/118.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 zobrazuje chromatogram na SP-Sepharose HP. Po fermentaci 12 kl byla směs, obsahující NGF po HIC, nanesena na kolonu s pryskyřicí SP-Sepharose High Performance (rozměry kolony 1,0 x 35 cm; 27,5 ml mrtvý objem) z pryskyřice 25 omnifit S9S HP

Pufr A obsahoval 0,2 M NaCI, 20 mM sukcinál, pH 6,0 (23 ms) Pufr B obsahoval 0,7 M NaCI, 20 mM sukcinát, pH 6,0 (63 ms) Kolona byla nejdříve ekvilibrována pulfem A. Frakce po HIC o objemu 345 ml a koncentraci 0,24 mg/ml byly převedeny do roztoku 25 mM sukcinátu, pi l 6 (17 ms), z čehož 362 ml bylo naneseno a to dává 3 mg/ml pryskyřice, 82,5 mg NGF bylo naneseno Rychlost nanášení byla 40 cm/hod. NGF byl eluován gradientem 30 % až 80 % putru B (od 0,35 do 0,60 M NaCI, 37 až 57 ms), objemem odpovídajícím 22 násobku objemu kolony Rychlost eluce byla 60 em/hod. Absorbance (280 nm) a mS/cm byly vyneseny proti číslu frakce a elucnímu objemu v ml. Frakce, obsahující NGF, byly stanoveny a spojeny dohromady V tomto případě byly spojeny frakce 43 až 60 a bylo získáno 99 ml vzorku o koncentraci NGF 0,38 mg/ml, návratnost kroku byla asi 46 %.

Obrázek 2 zobrazuje analýzu frakcí po chromatografu na koloně Phenyl Sepharose Fast Flow a SP-Sepharose HP ionexovou chromatografií na katexu SP-NPR 1 IPI.C (11PIEX). Jednotlivé chromatogramy jsou označeny

Obrázek 3 zobrazuje C4 RP-HPLC analýzu vybraných frakcí (hlavní frakce, koncové a počáteční frakce hlavního píku) po chromatografií na SP-Sepharose HP. fři signály byly překryty

a označeny Jak je vidět, hlavní pík (obsahující zralý NGF) je separován od ostatních nižších píku, které obsahují varianty NGF.

Obrázek 4 zobrazuje sekvenci lidského prepro-NGF (SEQ ID NO: 1). Podle obrázku je první aminokyselina zralého NGF (pozice 1) a poslední aminokyselina 120 aminokyselinové formy NGF (pozice 120). Upřednostňovaná aminokyselinová sekvence NGF je sekvence zralé 118 aminokyselinové formy (od pozice 1 do pozice 118). Také jsou ukázány variantní formy: zralá 120 (pozice 1 až pozice 120); zralá 117 ( pozice I až 117), R120 (pozice -1 až 120), a místa pro další chybné zpracování formy, které se vyskytuje na N- a C-konci, včetně zralých variant 114 (aminokyseliny 1 až 114), 115 ( aminokyseliny 1 až 115) a 117 ( aminokyseliny 1 až 117). Hlavní chybně zpracovaná varianta, proteolyticky chybně zpracovaná, je v sekvenci NGF štěpena na Nkonci mezi aminokyselinami R(-39) a S(-38) Pravděpodobné iniciační Met jsou podtrženy. Další varianty, štěpené na N-konci, zahrnují zkrácené formy NGF s nejběžnějším štěpením mezí aminokyselinami H8 a R9 a mezi aminokyselinami R9 a G10.

Obrázek 5 zobrazuje aminokyselinové sekvence lidského NGF (SEQ ID NO:2), myššího NGF (SEQ ID NO:3), BDNF (SEQ ID NO:4), NT-3 (SEQ ID NO 5) a NT-4/5 (SEQ ID NO:6) Orámované oblasti označují homologní oblasti obsahující cystein, které jsou zahrnuty v uzlíkovém motivu cysteinu ( De Young 5(8): 1554 až 66 (1996)).

Obrázek 6 zobrazuje chromatografický záznam puriftkace preparátu rhNT-4/5 na koloně s pryskyřicovou náplni DEAE-Sepharose Fast Fiow (DEFF). Chromatogram, označený jako ”NT45DE1 1 UV\ udává průběh UV absorbance měřené při 280 nm Chromatogram, označený jako ”NT45DE1: l Condl”, znázorňuje vodivost eluovaných frakcí Frakce, obsahující neurotroťin, které byly spojeny, jsou označeny vodorovnou šipkou ’ΤοοΓ

Obrázek 7 zobrazuje záznam chromaíograíie rhNT-4/5 na koloně s pryskyřici SP-Sepharose Fast Flow. Chromatogram, označený jako ”NT45SFF1:1 UV’\ je UV absorbance při 280 nm Chromatogram, označeny jako ”N145SFIT.lCondl”, znázorňuje vodivost eluovaných frakci Frakce obsahující neurolrofin, které byly spojeny, jsou naznačeny vodorovnou šipkou ”ΡοοΓ'

Obrázek 8 zobrazuje typický chromatografický záznam preparativní C4-RP-HPLC chromatografie preparátu rhNT-4/5 za podmínek popsaných v textu Byla sledována absorbance při 280 nm. Trakce obsahující neurotrofin, které byly spojeny, jsou označeny vodorovnou šipkou ”Pool”

Obrázek 9 poskytuje záznam analytické JJPLC chromatografie vzorků NT4/5, analyzovaných v naznačených časech během procesu, kdy docházelo ke znovusvinutí Ghroinatografické podmínky jsou popsány v textu. ”NT-4/5 Std.” naznačuje záznam eluce správně svinutého, neporušeného «»· « · · · B · B *

B a B B B B · · · B B B • B B B B B fl B * B · · · · *

NT-4/5, který byl použit jako standard. Křivka označená jako ”SSFF (0,5 m)” zobrazuje analýzu preparátu NT-4/5, eluovaného před znovusvinutím z kolony S-Sepharose Fast Flow roztokem 0,5 M NaCl. Jak dochází k opětovnému svinováni NT-4/5, křivka, naznačující průběh eluce, se blíží křivce standardu.

Obrázek 10 zobrazuje chromatogram zobrazující separaci neporušeného, správně svinutého NT-4/5 od chybně svinutých variant chromátografií s hydrofobní interakcí na koloně Phenyl Toyopearl 650M. Chybně svinuté varianty, které jsou méně hydrofobní než správně svinutý NT4/5, jsou eluovány bez zadrženi na koloně, zatímco chybně svinuté varianty (pik B), které jsou hydrofobnějsí, se eluují vyššími koncentracemi organických rozpouštědel, než je třeba pro eluci správně svinutého NT-4/5 (pík A)

Obrázek 11 zobrazuje průběh eluce NT-4/5 a jeho variant z katexové kolony s pryskyřicí SPSepharose. Byla sledována absorbance při 280 nm. Pík A obsahuje karbamylované a zkrácené varianty, zatímco pík B obsahuje neporušený, správně svinutý NT-4/5. Frakce, obsahující NT-4/5, které byly spojeny, jsou označeny vodorovnou šipkou ”ΡοοΓ.

Obrázek 12 zobrazuje typický chromatografický záznam preparativní chromatografie preparátu rhNT-4/5 na pryskyřici póly CAT A za podmínek, které jsou popsány v textu

Obrázek 13 zobrazuje SDS elektroforézu v 16 % PAA gelu (komerčně připravený Trisglycinovy systém od firmy Novex, lne, San Diego, CA) za redukčních podmínek, která byla použita pro určení čistoty a homogenity vzorků po naznačených krocích purifikačního postupu, popsaného v textu. Proteiny byly detekovány roztokem Coomassie-R.250 (Andrews, Elcctrophoresis, Oxford University Press: New York, 1986). Dráha označená jako ”DE nástřik obsahuje vzorek ΡΕΪ směsi, která byla nanesena na kolonu DE-Sepharose Fast Flow; dráha označená jako ” DE FT” obsahuje vzorek, který protekl kolonou DE-Sepharose Fast Flow bez zadrženi, dráha ”S frakce” obsahuje vzorek spojených frakcí, obsahujících NT-4/5, které byly eluovány z kolony S-Sepharose Fast Flow před tím, než došlo ke znovusvinutí; dráha frakce znovusvinutého NT-4/5” obsahuje vzorek spojených frakcí po ukončení znovusvinováni, dráha ”C4 frakce” obsahuje vzorek spojených frakci po preparativní chromatografii na koloně C4 RPHPEC; a dráha PolyCAT A frakce” obsahuje vzorek ze spojených frakcí, obsahujících NT-4/5, po HPLC na koloně PolyCAT A

Obrázek 14 zobrazuje průběh UV absorbance frakcí po chromatografii směsi, obsahující bakteriálně produkovaný sulťonylovaný rhNT-3, na koloně S-Sepharose Fast Flow

Obrázek 15 zobrazuje ionexovou chromatografii směsi obsahující in viíro znovusvinuté formy rhNT-3 na katexové koloně Macroprep High S. Pryskyřice byla dodána firmou Biorad. Rozměry * · 4 ♦· * 4 v « 4

444444 4 4 4 * ft * *4 4 4 4 4 4 * * * _y 44 4 4 *4 4 44 4*

O kolony byly 9x9 cm. 700 m) vzorku spojených frakcí po SSFF chromatografii, obsahujících znovusvinuté formy (po 36 hodinách znovu sví no vání), pH 6,8, byl nanesen na kolonu Macroprep při průtoku asi 310 ml/min Podmínky jsou udány v textu.

Obrázek 16 zobrazuje chromatografii na koloně Phenyl Sepharose Fast Flow High Substitution (chromatografie s hydrofobní interakcí) preparátu znovusvínutého rhNT-3, purifikovaného ionexovou chromatografii na katexu. Tato chromatografie byla použita pro odstranění chybně svinutých variant

Obrázek 17 zobrazuje SP-Sepharose High Performance chromatografii frakci rhNT-3, spojených po HIC.

Definice

Zde použity pojem neurotrofin” označuje neurotrofm, výhodněji ten, kteiý patří do NGF rodiny, včetně NGF, NT-3, NT-4/5 a BDNF z mnoha druhů, včetně myšího, hovězího, ovčího, prasečího, koňského, ptačího a výhodněji pak lidského, v nativní sekvenci nebo geneticky modifikované formě a z jakkýchkolív zdrojů, ať již přirozených, syntetických nebo rekombinantně vyráběných. Např., ”NGF” znamená nervový růstový faktor z různých druhů, včetně myššího, hovězího, ovčího, prasečího, koňského, ptačího a výhodněji lidského, v nativní sekvenci nebo v geneticky modifikované formě a z jakéhokoliv zdroje ať již přirozeného, syntetického nebo rekombinantně vyráběného. Výhodněji je neurotrofm vyráběn rekombinantně V metodě, která je upřednostňována, je neurotrofm klonován a jeho DNA exprimována např. v savčích a bakteriálních buňkách. Zde zmíněné postupy a metody mohou být rovněž použity pro neuroírofiny GDNF a neurturin.

Pro použití v humánní medicíně jc upřednostňován zralý NGF s nativní sekvencí, výhodněji 120 aminokyselinovou sekvenci a nejvýhodněji 118 aminokyselinovou sekvencí Výhodněji jc tento NGF s nativní sekvencí produkován rekombinantně. Upřednostňovaná sekvence aminokyselin pro lidské pre-pro-NGF a zralý NGl· je poskytována v US Patentu 5,288,622, který je zde specificky uveden jako odkaz. Upřednostňovaná forma se 120 aminokyselinovou sekvencí bez dalších posttranslačních modifikací, jc homodimerová forma (tzn., 120/120). Ještě více upřednostňovaná je forma se 118 aminokyselinami, bez dalších posttranslačních modifikací, konkrétně homodimer (tzn , 118/118).

» » - »

4« 4 4 · ·

4·«··« 4 4 φ • 4 4 « 4 ·*· · ·* · 4« ·»

Pod pojmem převážně čistý” je míněn stupeň čistoty preparátu celkového neurotrofinu, např. NGF, vzhledem k celkovému obsahu proteinů, kde je alespoň 70 % neurotrofinu, výhodněji alespoň 80 % a ještě výhodněji rostoucí obsah do alespoň 90 %, 95 % nebo 99 %. Konkrétně upřednostňovaná čistota je alespoň 95 %. Pod pojmem téměř čistý” je míněno, že čistota kompozice žádoucího neurotrofinu je alespoň 90 % nebo vyšší.

Pod pojmem převážně bez obsahu neurotrofinových variant” je míněna kompozice, která obsahuje alespoň 70 % žádoucích druhů neurotrofinu vzhledem k celkovému neurotrofinu (včetně méně žádoucích typů neurotrofinu), výhodněji alespoň 80 % a ještě výhodněji procento rostoucí do alespoň 90 %, 93 %, 95 %, nebo 99 %. Pod pojmem téměř čistý” je míněna kompozice, která obsahuje minimálně 90 % nebo více žádoucího neurotrofinu. Konkrétně upřednostňovaná hladina je alespoň 95 % žádoucího neurotrofinu, např. správně svinutého, neporušeného 118/118 druhu rhNGF Další nežádoucí druhy nebo formy mohou být chybně zpracované formy nebo chemické varianty, např. nábojově změněné varianty, vznikající při fermentaci nebo během purifikačního procesu, nebo výhodněji všechny drive uvedené. Např., je-li NGF po syntéze v bakteriích svinut w vifro, druhy” nebo varianty mohou obsahovat nesprávně nebo částečně svinuté formy

Pod pojmem nesprávně svinutá” varianta neurotrofinu je míněna varianta, která se liší od neurotrofinu párováním cysteinových zbytků nebo konkrétně cysteinových zbytků, které jsou volné nebo blokované. Nesprávně svinuté varianty také mohou mít stejné cysteinové párování jako neurotrofin, ale mají rozdílnou prostorovou trojrozměrnou konformaci, která vzniká v důsledku nesprávného svinutí

Pod pojmem chemická varianta je míněna varianta, která se chemicky liší od neurotrofinu, např. tím, že má změněný náboj, je karbamylována, deamidována, oxidována, glykosylována nebo proteolyticky štěpena.

V předmětném vynálezu mají pufry používané pri chromatografiích obvykle pH v rozsahu asi 5 až 8. Pufry, které budou kontrolovat pH v tomto rozsahu, zahrnují např. citrátový, sukcinátovy, fosfátový, MBS, ADA, BIS-TRIS propanový, P1PES, ACES, imidazolovy, puti s kyselinou dietylmalonovou, MOPS, MOPSO, TES, TRIS pufry jako jsou TR1S-HC1, HEPES, HEPPS, TRICINE, glycin-amidový, BIC1NF, glycylglycinový a borátové pufry Upřednostňovaný pufr je MOPSO

Pojmy alkoholy a ” alkoholická rozpouštědla” jsou zde používány ve smyslu běžně používané terminologie pro alkoholy, výhodněji alkoholy s 1 až 10 atomy uhlíku, ještě výhodněji metanol, etanol, isopropanol, n-propanol nebo t-butanol, stejně tak jako glycerol, propylenglykol, etylenglykol, hexylenglykol, polypropylenglykol a polyetylenglykol a nejvýhodněji etanol nebo * «»*·*« isopropanol. Protože alkoholy jsou rozpouštědla, jsou-li přidány do vodných roztoků, zvýší se hydrofobicita roztoku snížením jeho polarity.

MOPSO je 3-(N-Morfolino)-2-hydroxypropansulfonová kyselina. HEPES je N-2- Hydroxyetylpiperazin-N'-2-etansulfonová kyselina Alkohol obsahuje 95 objemových dílů Speciálně Denaturovaného Alkoholu formule 3A a 5 objemových dílů isopropylalkoholu MES je 2~(N-Morfolino)etansulfonová kyselina. UF/DF znamená ultrafiltrace/diafiltrace. TMAC je chlorid tetrametyiamonný. TEAC je chlorid tetraetylamonný. NGF-120 označuje celou délku 120/120 formy nervového růstového faktoru NGF-118 označuje molekulu homodimeru zralého NGF se 118 aminokyselinami. Oxidovaný NGF označuje molekulu varianty NGF, Metsulfoxid.n, která je zde uváděna jako asi z 80 % biologicky aktivní oproti zralému nativnímu NGF Isoasp NGF označuje molekulu isomerizované varianty NGF, Asp93. Deamidovaný NGF označuje NGF, který má Asn45 přeměněn na Asp45. RNGF označuje molekulu NGF s extra argininovým zbytkem na N-konci. ClíO označuje ovariálni buňky čínského křečka.

Zde popisované pryskyřice zahrnují MACROPREP HIGH S Cation-exchange (BIO-RAD Laboratories, silná kationtová výměna, SO-, funkční skupiny; nominální velikost částic 50 m; přibližná velikost pórů 1000 A); Silikagel (nederivatizovaný); Phenyl Sepharose Fast Flow Substitution (Pharmacia, vysoce prokrižená 6 % agarosa; velikost částic 45 až 165 mikronů), SP-Sepharose HP (Pharmacia; vysoce prokrižená 6 % agarosa, velikost častíc 34 mikronů); Phenyl Toyopearl 650 M (TosoHaas; velikost částic 40 až 90 mikronů); a Fractogel EMD SO3 - 650 S (EM Separations, reprezentant firmy Merck (Německo) pro USA, velikost částic 25 až 40 m)

Způsoby provedeni předmětného vynálezu

Neurotrofiny patří do rodiny malých základních proteinů, ktere hraji podstatnou roli ve vývoji a zachování nervového systému Prvním identifikovaným a pravděpodobně nejlepc pochopeným členem této rodiny je nervový růstový faktor (NGF). Viz US. Patent No 5,169,762, vydaný 8. prosince 1992. V poslední době byly identifikovány sekvenčně podobné, ale vzdálené polypeptidy s podobnými funkcemi jako NGF. Např. mozkový neurotrofní faktor (BDNF). také označován jako neurotrofin-2 (NT2) byl klonován a sekvenován Leibrockem a spát (Nátuře, 341: 49 až 152 [1989]). Několik skupin identifikovalo neurotrofní faktor, původně zvaný neuronální faktor (NF), a nyní uváděný jako neurotrofin-3 (NT3) (Ernfor.s a spoL, Proč. NatíAcad.Sci. USA, 87. 5454 až 5458 [ 1990], Hohn a spoí, Nátuře, 344:339 [1990], Maisonpierre a spoí. Science, 247:1446

4* - · · r • · · ♦ * « · « « ·*»·· · · « «, _f « # » • · · · « • * »· · *4 »» [1990]; Rosenthal a spoí., Neuron, 4:767 [1990]; Jones a Reichardt, Proč. Natí Acad. Sci. USA, 87:8060 až 8064 [1990], Kaisho a spoí, EEBS Letí., 226:187 [1990]). Byl identifikován neurotrofin-4/5 (uváděný buď jako NT4 nebo NT5) (Hallbook a spoí, Neuron, 6:845 až 858 [1990]; Berkmeier a spolNeuron, 7.857 až 866 [1991], Ip a spoí, Proč. Natl.Acad. Sci. USA, 89:3060 až 3064 [1992]) US Patent 5,364,769, vydaný 15. listopadu 1994, odhaluje lidský NT4/5 a postupy pro jeho rekombinantni expresi a je zde začleněn jako odkaz Také jsou uvedeny chimérické a pantropické neurotrofmy, jako ty, uvedené v US Patentu 5,488,099, vydaném 30. ledna 1996, v publikaci Urfer a spoí, EMBO J. 13(24):5896 až 5909 (1994) a v WO 95/33829, publikovaném 14 prosince 1995 (začleněn zde jako odkaz), ve kterých byl neurotrofin buď modifikován tak, aby se vázal na více než jeden receptor nebo obsahoval receptorovou vazebnou aktivitu, která běžně není přítomna v nativním neurotrofinu ve významném stupni. Zvláštnímu zájmu se těší neurotrofmy označované MNTS-1 a Dl5A NT3, Zvláštnímu zájmu se také teší neurotrofiny, které mají aminokyselinovou páteř jako NGF, ale které jsou modifikovány tak, aby vázaly receptory jiné než trkA, jako jsou trkB nebo trkC Upřednostňovány jsou NGF, ve kterých byly provedeny aminokyselinové substituce s aminokyselinou z odpovídající pozice v NT-3, která je odpovědná za vazbu trk receptoru na NT-3. Tyto mutanty mají receptorovou vazebnou aktivitu stejnou jako NT-3, zatímco farmakokinetiky a chování během purifikaee si zachovávají stejné jako NGF (Urfer a spoí, Biochemislry 36(16) 4775 až 4781 (1997)) Tyto NGF mutanty mohou také postrádat trkA vazebnou aktivitu (Shih a spoí., J. Biol. Chem 269 (44) 27679 až 27686 (1994) Tyto mutanty NGF jsou konkrétně upřednostňované neurotroíiny pro použití ve zde popisovaném předmětném vynálezu

Izolace rekombinantního lidského neurotrofinu, např. rhNGF, zahrnuje separaci proteinu od řady různorodých kontaminantů hostitelské buňky. Každý krok zahrnuje speciální puířy, které umožňují dostatečnou separaci Poslední nebo předposlední krok postupu je komplikován přítomnosti několika neurotrofmových variant, které se v důsledku použiti běžných chromatogralických medii spolupuriíikuji s neurotrofmem. Je-li do purifikačního procesu zařazen krok, vedoucí ke znovusvinutí, varianty obsahuji nesprávně svinuté formy neurotrofinu. Varianty mohou rovněž obsahovat ty, které se od neurotrofinu liší chemicky, jako jsou karbamylované, deamidované, deamidované nebo proteolyticky štěpené formy. V případě NGF, je-li žádoucí forma 118/118, se tyto druhy skládají zejména z dimeriekých forem - homodimerů např. 120/120 nebo 117/117, nebo heterodimerů např. 120/118, 117/118, chemicky modifikovaných variantisoasp, rnonooxidovanýeh glykosylovanych variant, N-koncově a C-koncově zkrácených forem a jejich dimerů

Předmětný vynález umožňuje produkci neurotrofinů ve velkém měřítku, konkrétně rhNGF v množstvích dostatečných pro terapeutické použití, jako je např. léčba Alzheimerovy choroby, periferní neuropatie včetně diabetické neuropatie a neuropatie spojené s AIDS apod..

Z pohledu podobnosti sekvence a konformace NGF a jiných neurotrofinů, konkrétně těch z NGF rodiny, mohou být aplikovány metody předmětného vynálezu na přípravu neurotrofinů, které převážně neobsahují špatně zpracované, chybně nebo částečně svinuté, glykosylovane a/nebo nábojové varianty V předmětném vynálezu jsou identifikovány chromatografické pryskyřice a podmínky, které jsou příznivé pro selektivní separaci neurotrofinů od těchto a dalších hodně podobných variant. Neurotrofiny zahrnují NT-3, NT-4/5, NT-6, BDNF a vyrobené formy včetně jejich heterodimerových, chimérických a pantropíckých forem. Výhodněji jsou neurotroliny lidské nebo takové, které vykazují vysokou homologii s aminokyselinovou sekvencí lidského neurotrofinů, výhodněji více než 80 %, výhodněji více než 90 % a nejvýhodněji více než 95 % homologii se sekvencí lidského neurotrofinů. Vyrobený neurotrofin si bude zachovávat alespoň z 50 % vazebnou funkci trk receptoru jako nativní neurotrofin, kterému je podobný, výhodněji alespoň ze 75 % a ještě výhodněji alespoň z 80 %. Tyto vyrobené formy jsou takové, které udržují dostatečně vysoké pí nebo hydrofobní charakter nativního neurotrofinů, aby udržely podobný výkon v procesech, které jsou zde popisovány

Jak je popisováno níže, zde popsané procesy byly úspěšně aplikovány na rhNGF, rhNT-3 a rhNT-4/5. Např rhNT-4/5, který byl vyroben v E.coli, byl izolován v inkluzních tělískách, redukován a rozpuštěn z inkluzních tělísek Redukovaný NT-4/5 byl částečně puriíikován chromatografiemi na DE Sepharose Fast Flow a S-Sepharose East Flow Frakce po chromatograiii na S-Sepharose Fast Flow byly podrobeny procesu, během kterého došlo ke znovusvinuíi proteinu. Proces probíhal po dobu 24 hod, v pufiu obsahujícím guanidin. Chybně svinuté formy NT-4/5 byly odstraněny chromatografií ve veikem měřítku. Karbamylované a zkrácené formy NT-4/5 (špatně zpracované formy) byly odstraněny 1IPLC ionexovou chromatograiii na katexové pryskyřici PolyCat A nebo na SP-Sepharose HP, v kolonovém uspořádáni, ve velkém měřítku Pro formulaci byl publikovaný rhNT-4/5 ultrafiltrován a diafiltrován do kyselého pufru.

Jedno provedení předmětného vynálezu zahrnuje purifikaci neurotrofinů od jeho příbuzných variant, jejímž výsledkem bylo odstraněni většiny nečistot z preparátu neurotrofinů. K odstraněni nežádoucích látek docházelo většinou v posledním nebo v jednom z posledních kroků před odsolením nebo diafiltrací, které předcházely formulaci. Příbuzné varianty mohou byt nejenom ··· · » ···· *·· · · · ··· • ···· » · · · * ·»« »·· • · · · · · · «·· · ·· · ·· * varianty, vznikající při fermentaci, ale také varianty, produkované v případě, je-li neurotrofin degradován skladováním nebo během výroby.

Neurotrofiny, vhodné pro použití v provedeních předmětného vynálezu, mohou být připraveny jakkýmikoliv způsoby, ale výhodněji jsou připravovány rekombinantně. Zde diskutovaná molekula nukleové kyseliny, která kóduje neurotrofin, je dostupná z několika zdrojů, např. pomocí chemické syntézy použitím známé sekvence DNA nebo použitím standartních klonovacích technik, které jsou známé odborníkům v dané oblasti. cDNA klony, nesoucí neurotrofin, např. sekvence kódující hNGF, mohou být identifikovány použitím oligonukleotidových hybridizačních prób, specificky navržených na základě známé sekvence neurotrofinu.

Aby byla získána molekula, která má sekvenci kódující neurotrofin, je molekula vložena do klonovacího vektoru, vhodného pro expresi ve vybrané hostitelské buňce. Klonovací vektor je konstruován tak, aby poskytoval vhodné regulační funkce, požadované pro účinnou transkripci, translaci a výrobu kódující sekvence.

Je-li neurotrofin připravován rekombinantně, hostitelské buňky, vhodné pro expresi DNA se zakódovaným neurotrofinem, jsou prokaryota, kvasinky nebo vyšší eukaryotické buňky. Mezi prokaryota, vhodná pro tyto účely, patří bakterie, jako jsou archaebakterie nebo eubakterie. Upřednostňované bakterie jsou eubakterie, jako jsou gram-negativní nebo gram-pozitivní organismy, např. Enterobacteriaceae jako je Escherichia, např. E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsielía, Próteus, Salmonella, např. Salmonella typhimurium, Serratia, např, Serratia marcescans a Shigella; Bacilli jako jsou B. subtilis a B. licheniformis (např. B, lícheniformis 41P odhalený v DD 266,710, publikovaném 12. dubna 1989); Pseudomonas jako jsou P. aeruginosa; Streptomyces; Azotobacter; Rhizobia; Vitreoscilla; a Paracoccus. Vhodná hostitelská E. coli zahrnuje E. coli W3110 ( ATCC 27,325), E. coli 94 (ATCC 31,446), E. coli B, a E. coli X1776 (ATCC 31,537). Tyto příklady jsou spíše ilustrační než limitující.

Jako celek je zde začleněna PCT publikace WO 95/30686, publikovaná 16, listopadu 1995. Tato publikace je konkrétně významná pro svůj popis bakteriální syntézy NGF a jeho in vitro svinutí. Produkty tohoto procesu mohou být podrobeny purifikačním metodám předmětného vynálezu.

Mohou být také použity mutantní buňky jakkýchkoljv výše zmíněných bakterií. Samozřejmě je nezbytné vybrat vhodné bakterie s ohledem na replikabilitu replikonu v buňkách bakterie.

Poskytují-li replikon dobře známé plasmidy, jako jsou pBR322, pACYA177 nebo pKN410, mohou být jako hostitelské buňky vhodně použity např. E. coli, nebo druhy bakterií Serratia nebo

Salmonella. Kmen E. coli W3110 je upřednostňovaný hostitel nebo rodičovský hostitel, protože • · * je to běžný hostitelský kmen pro rekombinantni DNA produkt fermentací. Výhodněji, hostitelské buňky uvolňují minimální množství proteolytických enzymů Napr., kmen W3110 může být modifikován tak, aby došlo ke genetické mutaci v genech, které kódují proteiny endogenní pro hostitele, s příklady těchto hostitelů včetně E. coli W3110 kmen IA2, který má kompletní genotyp tonAA; E. coli W3110 kmen 9E4, který má kompletní genotyp tonA Δ ptr3, E. coli W3110 kmen 27C7 (ATCC 55,244), který má kompletní genotyp tonA ptr3 phoA Δ E15A (argF4ac)169 Δ deg P Δ ompT kan <r>; £ coli W3110 kmen 37D6, který má kompletní genotyp tonA ptr3 phoA ΔΕ15Δ (argF-lac)169 Δ degP Δ οτηρΤΔ rbs7 ilvG kan r; E. coli W3110 kmen 40B4, což je kmen 37D6 s degP deleční mutací, rezistentní ke kanamycinu, a E. coli kmen, který má mutantní periplasmatickou proteázu, odhalenou v U S. Pat No 4,946,783, vydaném 7 srpna 1990.

Lidský NGF byl exprimován v E. coli. Izolace a sekvenace genu, kódujícího β podjednotku hNGF a jeho exprese jako heterologního proteinu v E. coli, byly popsány v U S. Pat. No 5,288,622. Návody uvedené v tomto patentu jsou také vhodné pro poskytování zralého lidského NGF, produkovaného savčími buňkami. Použitím rekombinantních technik byl exprimován lidský β-NGF bez přítomnosti dalších savčích proteinů. Výsledkem exprese hNGF v E. coli s použitím dvou genů, které obsahují změněné amino konce, byla exprese fúzovaného proteinu, který popsal Iwai a spol.. Chcm. Eharm. Hnil 34:4724 (1986)

Vhodní expresní hostitelé pro vektory, které kódují neurotrofin, jsou kromě prokaryot i eukaryotické mikroorganismy, jako jsou plísně nebo kvasinky. Nejběžněji používané nižší eukaryotní hostitelské mikroorganismy jsou Saccharomyces cerevisiae nebo běžné pekařské kvasinky. Je však možno použít i mikroorganismy z řady ostatních tříd, druhů a kmenů, které jsou běžně dostupné, jako je Schizosaccharomyces pombe (Beach a Nurse, Nátuře, 290.140(1981), EP 139, 383 publikovaný 2 května 1985]; hostitelé třídy Kluyveromyces [US Pat No.4,943,529, Fleer a spol., Bio/Technology, 9:968 až 975 (1991)] jako jsou např. K lactis [MW98-8C. CBS683, CBS4574, 1 .ouvencourt a spol. .1 bacteriol., 737 (1983)], K. fragilis (ATCC 12,424), K bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. diOSophilamm |ATCC 36,906, Van den Berg a spol., Bio/ Technology, 8:135 (1990)], K. thermotolerans a K marxianus; yarrowia [EP 402,226], Pichia pastoris [EP 183,070, Sreekrishna a spol., J Basic Microbiol., 28: 265 až 278 (1988)], Candída, Trichodcrma reesia [EP 244,234], Neurospora crassa |Case a spol, Proč. Nati Acad Sci USA, 76: 5259 až 5263 (1979)]; Schwanniomyces jako jsou Schwanniomyces occidentalis [EP 394,538, publikovaný 31. října 1990]; a plísně, jako jsou napr. Neurospora, Penicillium, Tolypocladíum [WO 91/00357, • ······ publikovaný 10. ledna 1991] a hostitelé třídy Aspergillus, jako jsou A. nidulans [Ballance a spol·, Biochem Biophys. Res Commun., 112:284 až 289 (1983); Tiibum a spol·, Gene, 26 205 až 221 (1983); Yelton a spol·, Proč. Nati. Acad. Scí.USA, 81:1470 až 1474 (1984)] a A. niger [Kelly a Hyneš, EMBO4:475 až 479 (1985)]

Hostitelské buňky, vhodné pro expresi DNA, která kóduje neurotrofin, mohou být také odvozeny od multicelulárních organismů Takovéto hostitelské buňky mají řadu výrobních a glykosylacních aktivit. Zpravidla jakkákoliv vyšší eukaryotická buněčná kultura je vhodná, ať z kultury obratlovců nebo bezobratlích Příklady buněk bezobratlích zahrnují rostliny a buňky hmyzu. Byla identifikována řada bakulovírálních kmenů a variant a odpovídajících povolených hmyzích hostitelských buněk hostitelů, jako jsou Spodoptera frugiperda (housenka), Aedes aegypti (komár), Aedes albopictus (komár), Drosophila Melanogaster (muška) a Bombyx moři. Viz např. Luckow a spol·, Bio/ Technology, 6:47 až 55 (1988), Miller a spol., v Genetic Engineering, Setlow, J.K a spol., eds., Vol. 8 (plenární přednáška, 1986), pp.277 až 279 a Maeda a spol·, Nátuře, 315 . 592 až 594 (1985). Veřejně dostupné jsou různé kmeny vírů pro transfekci, např. L-l varianta viru Autographa califomica NPV a Bm-5k kmen viru Bombyx moři NPV a tyto viry mohou být použity konkrétně pro transfekci buněk Spodoptera frugiperda Lidský NGF byl produkován v buňkách hmyzu, uvedeno v U S. Pat. No. 5,272,063, vydaném 21. prosince 1993.

Jako hostitelé mohou být využity rostlinné buněčné kultury bavlny, kukuřice, brambory, sojového bobu, petúnie, rajského jablka a tabáku Rostlinné buňky jsou většinou transfektovánv inkubací se spolehlivými kmeny bakterie Agrobacterium tumefaciens, které byly nejdříve manipulovány tak, aby obsahovaly DNA, kódující neurotrofin Během inkubace rostlinné buněčné kultury s A tumefaciens je DNA, která kóduje neurotrofin, transferována do rostlinného buněčného hostitele tak, že je transfektován a bude za vhodných podmínek exprimovat DNA, kódující neurotrofin Dále jsou dostupné regulátorové a signální sekvence, slučitelné s rostlinnými buňkami, jako jsou nopalin syntázovy promotor a polyadenylační signální sekvence (Depicker a spol., J. Mol. Appl. Gen., 1:561 (1982)). Dále, DNA segmenty, izolované z oblasti před 780 genem T-DNA, jsou schopné aktivovat nebo zvyšovat hladiny transkripce rostlinami exprimovaných genů v rostlinné tkáni, které obsahují rekombinantní DNA (EP 321,196 publikovaný 21 Června 1989).

Příklady užitečných linii savčích hostitelských buněk jsou CV1 linie opičích ledvin, transformované pomocí SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linie lidských zárodečných ledvin [293 nebo 293 buněk subklonovaných pro růst v suspenzní kultuře, Graham a spol·, J. Gen Virol.,

9 9 · · 9 ·

» ·

36:59 (1977)], renální buňky mláděte křečka (BHK, ATCC CCL 10), ovariální buňky Čínského křečka - DHFR [CHO, Urlaub a Chasin, Proč Nati. Acad Sci USA, 77:4216 (1980)]; myšši Sertoliho buňky [TM4, Mather, Biol. Reprod, 23. 243-251 (1980)], renální buňky opice (CV1 ARCC CCL 70); renální buňky africké zelené opice (VERO-76), ATCC CRL-1587), buňky lidského cervikálního karcinomu (HELA, ATCC CCL 2), psí renální buňky (MDCK, ATCC CCL 34), buňky jater potkana buffalo (BRL 3A, ATCC CRT 1442); buňky lidského plicního laloku (W138, ATCC CCL 75); buňky lidských jater (Hep G2, HB 8065), myšši mama karcinom (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI buňky [Mather a spol., Annals N Y.Acad.Sci., 383: 44-68 (1982)]; MRC 5 buňky, FS4 buňky a linie (Hep G2). LJprednostňovaná metoda je exprese v CHO buňkách Aby bylo dosaženo exprese vylučovaného zralého NGE (včetně 118 a 120 aminokyselinové formy) použitím vhodných promotorů a vektorů (U.S. Pat. No. 5,288,622), může být použit exon lidského NGF, obsahující prepro-NGF. Kultury stabilních, stabilně transťektovaných CHO buněk, a sekrece zralých forem NGF jsou užitečné v předmětném vynálezu, jak je diskutováno v Příkladech.

Hostitelské buňky jsou transfektovány a výhodněji transformovány s výše uvedenými expresními nebo klonovacími vektory a kultivovány ve vhodných nutričních médiích, modifikovaných pro indukci promotorů, selekci transformantů nebo amplifikaci genů, kódujících požadované sekvence. Transfekcí se rozumí přijeti expresního vektoru hostitelskou buňkou, af jsou nebo nejsou jakkékoliv kódující sekvence ve skutečnosti exprimovány. Odborníkům v dané oblasti je známa řada metod transfekce např. CaPO₄ a elektroporace. Úspěšná transfekcc je obecně rozpoznána, proběhne-li uvnitř hostitelské buňky jakkákoliv indikace činnosti vektoru.

Transformace znamená začlenění DNA do organismu tak, že DNA je replikabilní, bud' jako extrachromozomální element nebo pomocí chromozomálního integrantu. V závislosti na použité hostitelské buňce jc transformace prováděna pomoci standartnich technik, vhodných pro tyto buňky. Pro prokaryota nebo jiné buňky, které obsahuji pevnou barieru buněčné steny, jsou běžně používány působeni vápníku prostřednictvím chloridu vápenatého, jak je popsáno v sekci 1 82 Sambrook a xpol., Molecular Cloning A Laboratory Manual [New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989] nebo elektroporace. Infekce s Agrobacterium tumefaciens je používána pro transformaci spolehlivých rostlinných buněk, jak popisuje Shaw a sfwl, Gene, 23:315 (1983) a WO 89/05859, publikovaný 29 června 1989. Dále mohou být rostliny transformovány působením ultrazvuku, jak je popsáno v WO 91/00358, publikovaném 10. června 1991.

Pro savčí buňky bez těchto buněčných stěn je upřednostňována metoda precipitaee fosforečnanem vápenatým podle autorů Graham a van der Eb, Virology, 52:456 až 457 (1978).

» » » • Mt« · * » · • · · * ; ·· Φ· • · · · · · ·

Obecné aspekty transformace systémů savčích hostitelských buněk popsali Axel v U S. 4,399,216, vydaném 16 srpna 1983. Transformace v kvasinkách je typicky prováděna podle metody autorů Van Soligen a spol, J. Bact, 130:946 (177) a Hsiao a spol.. Proč. Natl.Acad Sci.(USA), 76: 3829 (1979). Pro začlenění DNA do buněk však mohou být použity také další metody, jako jsou nukleární mikroinjekce, elektroporace, tuze bakteriálního protoplastu s neporušenými buňkami nebo polykationty např. polybren, polyomitin atd. Různé techniky transformace savčích buněk viz Keown a spol., Methods in Enzymology (1990) Vol 185, PP. 527 až 537 a Mansour a spol.. Nátuře, 336: 348 až 352 (1988).

Výhodněji, gen pro hNGF je vložen do vektoru tak, aby měl dostupný methioninový iniciační kodón, výhodněji jeden ze dvou methioninových iniciačních kodónů, jak identifikoval Ullrich a spol. Nátuře, 303:821 až 825 (1983)). hNGF gen (Ullrich a spol, Cold Spring llarbor Symposia on Quant Biol. XLVI1I, p. 435 (1983); US 5,288,622) má dva blízko sousední inethioniny, které jsou pravděpodobně využity jako translačni iniciační kodóny (pozice 1 se vztahuje k N-koncovému serinovému zbytku zralého NGF) Naopak cDNA pro NGF, izolovaný z myšší submaxilámi žlázy, nejprostudovanějši z nervových růstových faktorů, má methionin v pozici -187 kromě těch v pozicích -121 a -119. V upřednostňovaném provedení pro expresi v savčích buňkách je přítomna prepro-NGF sekvence

Jsou-ti pro produkci neurotroťinu použity prokaryotní buňky, jsou kultivovány ve vhodných médiích, ve kterých může být promotor indukován přirozeně nebo uměle, jak obecně popsali např. Sambrook a spol, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Uaboratory Press, New York 1989). Vedle uhlíku, dusíku a zdrojů anorganického fosfátu mohou být také dodány jakékoliv nezbytné doplňky v odpovídajících koncentracích, samostatně nebo ve směsi s jiným doplňkem nebo jako medium, jako je komplexní zdroj dusíku.

Jestliže jsou pro produkci neurotrofinu použity savčí hostitelské buňky, mohou být kultivovány v různých médiích. Komerčně dostupná média, jako jsou Haníš 110 (Sigma), Minimal Fssential Medium (|MEM], Sigma), RPMI-1640 (Sigma) a Dulbeccoks Modified Eagle’s Medium (|DMEMJ, Sigma), jsou vhodná pro kultivovaní hostitelských buněk. Dále, jakkékoliv médium popsané v Ham a Wallace, Meth Enz., 58:44(1979); Barnes a Sáto, Anal. Biochem., 102:255 (1980); U.S.Pat. Nos. 4,767,704, 4,657,866, 4,927,762, 5,122,469 nebo 4,560,655, WO 90/03430 nebo U S Pat. No Re 30,985 (všechna jsou začleněna zde jako odkaz), může být použito jako kultivační médium pro hostitelské buňky. Jakkékoliv z těchto médií může být doplněno, je-li to nezbytné, hormony a/nebo dalšími růstovými faktory (jako je insulin, transferrin nebo epidermálni růstový faktor), solemi (jako je chlorid sodný, vápník, hořčík a fosfát), pufry

1« • « · • ·Μ· • · • · * · *· · (jako HEPES), nukleosidy (jako jsou adenosin a thymidin), antibiotiky (jako je lék Gentamycin TM), stopovými prvky (definované jako anorganické sloučeniny, obvykle přítomné v mikromolámích konečných koncentracích) a glukózou nebo ekvivalentními zdroji energie V odpovídajících koncentracích, které by měly být známy odborníkům v dané oblasti, mohou být přidány jakkékoliv další nezbytné doplňky. Kultivace probíhá za stejných podmínek (teplota, pH a podobné), jaké byly předem použity pro hostitelské buňky, vybrané pro expresi a budou zjevné pro odborníky.

Principy, protokoly a praktické techniky pro maximalizaci produktivity in vitro kultivovaných savčích buněčných kultur mohou být nalezeny v Mammalian Cell Biotechnology: A Praclical Approach, M Butler, ed (IRE Press at Oxford University Press, Oxford, 1991). Výše uvedené postupy mohou být uplatněny v případech, kdy je neurotrofm produkován intracelulárně, v periplazmatickém prostoru nebo je-li přímo vylučován do média.

Kultivační tekutina je sklizena po vhodné době a jsou provedena standardní identifikační měření, např. imunometody jako je EEISA a Western blot nebo biologická měřeni jako je PCI2 buněčná diferenciace (Green, L.A, Trends Neurosci. 7:91 (1986)). Měření pro stanovení typu a rozsahu zde odhalených variant jsou známá v dané oblasti nebo jsou poskytnuty nebo citovány v Příkladech (viz např. Schmelzer a spol, J. Neurochem 59 (5):1675 až 83 (1992) a Burton a spol., J. Neurochem. 59(5): 1937 až 45 (1992), které jsou zde uvedeny jako odkaz

Kompozice neurotrofinu, připraveného z buněk, je výhodněji podrobena před použitím HIC alespoň jednomu purifikačnímu kroku. Příklady vhodných purifikacních kroků jsou zde popsaný, včetně afinitní chromatografie, dalších technik pro purifikaci proteinů, jako jsou chromatografie na silikagelu, chromatografie na heparinové Sepharose, ionexová chromatografie na katexové nebo anexove pryskyřici (jako je kolona s polyasparágovou kyselinou), chromatolbkuzace a preparativní SOS elcktorlbréza v PAA gelu. Použitý postup závisí na neurotrofinu, který má být získán a na použité počáteční kultuře.

V jednom provedení, kde je ncurotiofin přímo vylučován do média, je médium separováno od zbytků buněk odstředěním a vyčištěny ťermentační bujón nebo médium je pak použito pro purifikaci na silikagelu Při chrornatografii na silikagelu prochází většinou bujón nederivatizovanými silikagelovými Částicemi tak, že neurotrofmový polypeptid se pevně váže na silikagelové částice, promytím silikagelových částic dochází k odstranění kontaminantů; a polypeptid je eluován ze silikagelových částic pufrem, obsahujícím alkoholické nebo polární aprotické rozpouštědlo a kovy alkalických zemin, alkalický kov nebo anorganickou amonnou sůl

V upřednostňovaném provedeni předmětného vynálezu je použita ionexová chromatografie na katexu Macroprep High S jak pro separaci neurotroflnu od jeho variant tak pro sníženi celkového obsahu kontaminantů, Pryskyřice může být použita jako počáteční krok purifikace neurotroflnu z kultury savčích buněk, výhodněji pro frakcionaci sklizeného média. V jiném provedení je nejvýhodněji používána ionexová chromatografie na katexu Macroprep High S ihned po kroku, vedoucího ke znovusvinutí proteinu. Velmi vysoké průtokové vlastnosti této katexové kolony umožňují koncentraci velkých objemů rozpuštěného, znovu svinutého proteinu nebo sklizeného buněčného média s neurotrofinem před následujícími chromatografickými kroky, jako jsou HIC nebo chromatografie na SP-Sepharose, upravením podmínek tak, že se neurotrofiny váži na kolonu Katexový charater pryskyřice dále umožňuje odstranění nenavázaných proteinů a některých špatně zpracovaných a chemicky modifikovaných variant (např. změněný náboj, MET 37-oxidované varianty). Nejdůležitější je, že jsou-li přítomny chybně svinuté nebo chemicky modifikované varianty (např. špatně zpracované varianty nebo glykosylované varianty (jako z produkce kultury savčích buněk)), které se od nativního neurotroflnu liší v hydrofobicite, pryskyřice Macroprep dovoluje alespoň částečné odstraněni těchto hydrofobních variant. Aniž by to bylo limitujícím faktorem, doufá se, že páteř pryskyřicového nosiče obsahuje hydrofobní obsah, který podporuje nespecifické interakce mezi neurotrofiny a pryskyřicí, čehož bylo zde s výhodou využito. Užitečná koncentrace TMAC v clučním pufru o pH přibližně mezi 5 až 8, výhodněji 6 až 8, je od 0 do 3 M. Je-li přítomen octan sodný, který zvyšuje iontovou sílu roztoku, lze použít nižší koncentrace TMAC Chlorid je upřednostňovaná náhrada pro octanový ion.

V jednom příkladu provedení, kde je neurotrofin produkován v periplazmatickéin prostoru, jsou kultivační médium nebo lyzát odstředěny, aby byly odstraněny částečné buněčné zbytky. Je-li to nezbytné, mohou býi potom separovány membrána a frakce rozpuštěného proteinu Neurotrofin pak může byt puntíkován od frakce rozpuštěného proteinu a od membránové frakce lyzátu kultury v závislosti na lom, je-li membránově vázaný, je-li rozpustný nebo je-li přítomen ve formě agregátu Neurotrofin je potom rozpuštěn a následně znovusvinut použitím odpovídajícího pufru. Detaily pro tuto metodu izolace z periplazmy s cílem získat znovusvinutý protein jsou popsány níže

Nerozpustný, ne nativní neurotrofin je izolován z prokaryotních hostitelských buněk ve vhodném izolačním pufru jakoukoliv odpovídající technikou, např jedna technika zahrnuje vystavení buněk do pufru o vhodné iontové síle (s cilem rozpustit většinu hostitelských proteinů), ve kterem je však agregovaný neurotrofin převážně nerozpustný a rozrušení buněk tak, že jsou

uvolněna inkluzní tělíska a stávají se tak dostupnými pro opětovné získání např. odstředěním Tato technika je dobře známa a je popsána např. v U S.Pat No. 4,511,503

Stručné řečeno, buňky jsou rozpuštěny v pufru (většinou v pH 5 až 9, výhodněji okolo pH 6 až 8, použitím iontové síly asi 0,01 až 2 M, výhodněji 0,1 až 0,2 M). Pro udržení dostatečné iontové síly je užitečná jakkákoliv vhodná sůl včetně chloridu sodného. Po rozpuštěni v tomto pufru, jsou pak buňky rozrušeny lýzí pomoci běžně používaných technik, jako jsou např. mechanické metody, např Manton-Gaulin press mikrottuidizer, French press nebo sonikátor nebo pomocí chemických nebo enzymových metod.

Příklady chemických nebo enzymových metod rozrušení buněk zahrnují tvorbu sféroplastů, což vyžaduje použití lysozymu pro lýzi stěny bakteriální buňky (Neu u .ψο!, Biochem Biophys Res Comm,, 17 215 (1964)) a osmotický šok, což je působení roztoku s vysokou tonicitou na živé buňky a promytí studenou vodou o nízké tonicitě, aby došlo k uvolnění polypeptidů (Neu a spol., J Biol. Chem, 240 3685 až 3692 (1965)) Třetí metoda, popsaná v US. Pat. No. 4,680,262, je založena na kontaktu transformovaných bakteriálních buněk a dostatečného množství nižšího alkanolu se 2 až 4 uhlíkovými atomy dostatečně dlouho a při teplotě dostatečné pro usmrcení a lýzi buněk.

Poté, co jsou buňky rozrušeny, je suspenze většinou odstředěna a vytváří peletu ínkluzních tělisek V jednom provedeni tento krok probíhá ve standardní odstředivce asi při 500 až 15 000 x g, výhodněji okolo 12 000 x g, dostatečně dlouho Doba závisí na objemu a typu odstředivky, většinou je však okolo 10 minut až 0,5 hodiny Vznikající pelety převážně obsahuji všechny nerozpustné polypeptidové frakce, ale není-li proces rozrušování buněk ukončen, mohou rovněž obsahovat neporušené buňky nebo zlomené buněčné fragmenty. Ukončení rozrušování buněk může být zjištěno tím, že jsou pelety resuspendovány v malém množství stejného pufru a suspenze je sledována fázovým kontrastním mikroskopem. Přítomnost zlomených buněčných fragmentů nebo celých buněk naznačuje, že je nezbytné další rozrušovaní, aby byly odstraněny fragmenty nebo buňky a s nimi spojené nezlámané polypeptidy. Po tomto dalším rozrušení , je-li to nutné, je suspenze opět odstředěna a získané pelety resuspendovány a analyzovány. Proces je opakován tak dlouho, než vizuální sledování ukáže nepřítomnost zlomených buněčných fragmentů v poletovaném materiálu nebo až do doby, kdy další působení nevede ke zmenšení velikosti vznikajících pelet.

V příležitostném provedení je neurotrofm izolován z periplazmatického prostoru solubilizaci ve vhodném pufru Tato procedura může byt solubilizace in sítu, která zahrnuje přímé přidání reagencií do fermentační nádoby pote, co by] neurotrofm produkován rekombinantně Tímto se

» w w * ··♦* · * · * • · · · ^# • « « · ·* * lze vyhnout jednotlivým krokům sklízení, homogenizace a odstředění Zůstávající zbytky mohou být odstraněny odstředěním nebo filtrací nebo jejich kombinací

Jestliže je neurotrofin nesvinutý, stupeň nesvinuti je vhodné stanovit chromatografii ne nativního neurotrofinu, včetně RP-HPLC. Vzrůstající plocha píku pro ne nativní materiál naznačuje, jak mnoho ne nativního neurotrofinu je přítomno.

Jakmile je neurotrofin získán z rozpuštěných inkluzních tělísek nebo v pozdější fázi purifikace, je vhodně znovu svinut do aktivní konformace, což je popsáno níže

Jestliže již neurotrofin není v rozpustné formě před tím než je znovu svinut, může být solubilizován inkubací v alkalickém pufru, který obsahuje chaotropní a redukční činidlo, v množstvích nezbytných pro převážné rozpuštění neurotrofinu. Tato inkubace probíhá za takových podmínek (koncentrace neurotrofinu, doba inkubace a teplota inkubace), které umožní rozpuštěni neurotrofinu v alkalickém pufhj.

Stanoveni stupně rozpuŠtěnosti neurotrofinu v pufru je vhodné provést měřením zákalu, analyzováním neurotrofmové frakcionace mezi supernatant a peletu po odstředění na redukovaném SDS gelu, měřením proteinů (např. pomocí setu pro stanoveni proteinů od firmy Bio-Rad) nebo HPLC pH alkalického pufru pro rozpouštění je většinou alespoň 7,5, výhodněji v rozsahu asi 8 až 11. Příklady vhodných pufrů, které poskytují pH v této oblasti, jsou glycinový, CAPSO {3-|Cyclohexylamino]-2-hydroxy-l-propansulfonová kyselina), AMP (2-Amino-2-methyl-lpropanol), (APS (3-[Cyclohexylaminoj-l-propansulfonová kyselina), CHES (2-[NCyclohexylaminojethansullbnová kyselina) a TRIS HC1 (Tris[hydroxymethyl]aminomethan hydrochlorid) Upřednostňované pufry jsou glycinový a CAPSO, výhodněji v koncentracích okolo 20 mM a v rozsahu pH asi 8,5 až II, výhodněji 10 až 11.

Koncentrace neurotrofinu v pufrovaném roztoku pro solubilizaci musí být taková, že neurotrofin bude převážně rozpuštěny a částečně nebo zcela redukovaný a denaturovaný. Neurotrofin může být příležitostně zpočátku nerozpustný Přesné použité množstvi bude záležet např na koncentracích a typech dalších přísad v pufrovaném roztoku, konkrétně na typu a množství redukčního činidla, typu a množství chaotropního činidla a pH pufru. Např koncentrace neurotrofinu může být zvýšena alespoň třikrát, je-li koncentrace redukčního činidla, např. DDT, současně zvyšována tak, aby byl zachován poměr DDT:neurotrofin od asi 3:1 do 10.1 Je více žádoucí produkovat koncentrovanější roztok s rozpuštěným proteinem. Upřednostňovaná koncentrace neurotrofinu je alespoň okolo 30 mg/ml s upřednostňovanějším rozsahem 30 až 50

AA · A

A A mg/ntl Neurotrofin může být napr. rozpuštěn do koncentrace asi 30 až 50 mg/ml v 5 M močovině, 10 mM DDT a zředěn napr. pro svinutí na koncentraci 1 mg/ml.

Poté co je neurotrofin rozpuštěn, je převeden nebo zředěn do pufru, kde dochází ke svinutí. Pufr obsahuje 5 až 40 % (v/v) alkoholického nebo aprotického rozpouštědla, chaotropní činidlo a alkalicky kov, kovy alkalických zemin nebo amonnou sůl. Pufr může být jakkýkoliv pufr pro první pufrované roztoky, upřednostňované v rozsahu pH 8,5 až 11 jsou CAPSO, glycinový a CAPS, konkrétně v koncentracích okolo 20 mM a nejupřednostňovanější jsou CAPSO a glycinový pufr. Neurotrofin může být naředěn pufřem pro znovusvinutí, výhodněji alespoň 5 krát, ještě výhodněji alespoň přibližně 10 krát. Příležitostně může být neurotrofin dialyzován proti pufru, ve kterém probíhá znovusvinutí Proces, během kterého dochází ke znovusvinování proteinu, může probíhat při teplotě 2 až 45 °C, přednostněji okolo 2 až 8 °C po dobu alespoň jedné hodiny. Roztok také může obsahovat redukční činidlo a osmolyt.

Redukční činidlo v dané koncentraci jc vhodně vybrané z těch, které byly výše popsány pro krok, vedoucí k rozpuštění. Jeho koncentrace bude záviset zejména na koncentracích kovů alkalických zemin, alkalického kovu nebo amonné soli, neurotrofinu a rozpouštědla. Koncentrace redukčního činidla je výhodněji asi 0,5 až 8 mM, ještě výhodněji asi 0,5 až 5 mM a nejvýhodněji asi 0,5-2 mM. Upřednostňovaná redukční činidla jsou DDT a cystein.

Z roztoku, kde dochází ke znovusvinování, může být vyčerpán kyslík přídavkem inertního plynu, např. helia nebo argonu

Jako osmolyt může být výhodněji použita sacharóza (v koncentracích asi 0,25 až 1 M) nebo glycerol (v koncentracích asi 1 až 4 M). Koncentrace sacharosy je ještě výhodněji přibližně 1 M a koncentrace glycerolu je přibližně 4 M

Jak bylo stanoveno HPLC, R1A nebo biostanovením, počáteční koncentrace neurotrofinu v pufru pro svinování je taková, že poměr správně svinutého ku chybně svinutému získanému konformeru bude maximální Upřednostňovaná koncetrace neurotrofinu (vznikajícího v maximálním výtěžku správně svinutého konformeru) je v rozsahu přibližně OJ až 15 mg/ml, výhodněji asi 0,1 až 6 mg/ml a nejvýhodněji asi 0,2 až 5 mg/ml.

Stupeň znovusvinutí, které probíhá během této inkubace, je vhodně stanoven pomocí R1A tůru neurotrofinu nebo HPLC analýzou. Rostoucím RIA titr nebo velikost píku správně svinutého neurotrofinu přímo odpovídá rostoucímu množství správně svinutého, biologicky aktivního neurotrofinového konformeru, přítomného v pufru. Inkubace je prováděna proto, aby byl maximalizován výtěžek konformeru správné svinutého neurotrofinu a poměru správně svinutého neurotrofinového konformeru ku získanému chybně svinutému ncurotrofinovému konformeru, jak bylo stanoveno metodami RIA nebo HPLC, a zároveň proto, aby byl minimalizován výtěžek multimemího, spojeného neurotrofinu, jak bylo stanoveno vážkově Druhy mohou být příležitostně stanoveny metodami uvedenými níže a v Příkladech Upřednostňované denaturačm činidlo pro znovusvinování je guanidin.

Poté, co je neurotrofin znovu svinut, aby bylo dosaženo větší čistoty a homogenity preparátu, jsou použity jednotlivě nebo v kombinaci následující, příkladné vhodné purifikačni postupy· frakcionace ionexovou chromatografií na koloně katexu; chromatografie s hydrofobní interakcí (HIC); chromatografie na silikagelu.

Ať je krok, vedoucí ke znovusvinutí proteinu, součástí procesu nebo ne, upřednostňovaný krok pro separaci neurotrofinu od jeho variant je chromatografie s hydrofobní interakcí. Během fermentace, purifikace nebo in vitro znovusvinování proteinu mohou být některé proteiny chemicky modifikovány, chybně zpracovány nebo se nemusí svinout do své nativní trojrozměrné struktury, ale spíše do jiných struktur, které se liší s ohledem na jejich stabilitu, rozpustnost, imunogenicitu nebo bioaktivitu. Tyto varianty musí být odstraněny v průběhu purifikace, protože je třeba se vyhnout nežádoucím vedlejším efektům, jako je antigenícita nebo ztráta účinnosti. Je-li varianta nerozpustná, je možno ji snadno odstranit separačními dvoufázovými technikami (pevná/kapalná), jako je odstředění nebo filtrace Je-li však varianta rozpustná, je třeba pro její odstranění použít adsorpční techniky s vyšší rozlišovací schopností, jako je chromatografie Jsoufi neurotrotiny produkovány v prokaryotních buňkách nebo jsou-li znovusvinuty m vitro, tvoří rozpustné stabilní chybně svinuté varianty. Chybně svinutý neurotrofin má změněný profil disulfidového párováni a trojrozměrnou strukturu, vztahující se k nativnímu proteinu a postrádá přirozenou farmakologickou aktivitu. Jsou-li varianty produkovány v eukaryotických buňkách, např v savci buněčné kultuře, většinou vznikají jako chybně zpracované varianty. Tyto varianty také většinou postrádají přirozenou farmakologickou aktivitu a měly by byt odstraněny. Jako vhodná metoda separace těchto variant od nativního neurotrofinu zde byla zjištěna HIC.

HIC' zahrnuje postupnou adsorpci a desorpci proteinu, vázaného na pevnou matrici nekovalentními hydroťobními vazbami. Obecně, na HIC kolonu jsou naneseny molekuly vzorku v pufru s vysokou koncentrací soli. Sůl z pufru interaguje s molekulami vody, čímž snižuje solvataci molekul v roztoku, a tím odhaluje hydrofobní oblasti v molekulách vzorku, které jsou následně adsorbovány na HIC koloně. Čím je molekula hydrofobnějši, tím nižší koncentrace soli jsou třeba pro vazbu. Pro eluci vzorku z kolony je obvykle používán klesající gradient soli. Jak klesá iontová síla, roste odhalení hydroftlních oblastí molekuly a molekuly se eluují z kolony v závislosti na rostoucí hydrofobicitě Eluce vzorku může být také dosaženo přidáním slabého organického modifikátoru nebo detergentu do elučního pufru. HIC je shrnuta v knize Protein Purification, 2 nd Ed , Springer - Veriag, New York, pgs 176-179 (1988).

Síia vazby mezi proteinem a nosičem závisí na několika faktorech, včetně velikosti a hydrofobniho charakteru mobilizovaných funkčních skupin, polaritě a povrchovém napětí okolního rozpouštědla a na hydrofobicitě proteinu. Vazebná kapacita nosičů pro HIC má tendenci být nižší vzhledem k tomu, že mobilizovaný hydrofobní ligand musí byt dostatečně oddálen Kapacita média pro daný protein se dále liší inverzně k hladině hydrofobnich nečistot v preparátu vzorku. Aby byl oddělen žádoucí protein od variant a dalších nečistot, zatímco současně bude maximalizována kapacita, je nezbytné najít vhodnou HIC stacionární fázi i mobilní fázi pro nanesení, promytí a eluci.

Jak je zde stanoveno, nejvhodnější média pro separaci správně svinutých a chybně svinutých neurotrofinů nebo špatně zpracovaných forem od neporušených, správně zpracovaných forem, jsou ty, které mají mobilizované ťenylové funkční skupiny. Stacionární fáze s fenylovými skupinami od různých dodavatelů vykazují odlišnou schopnost rozpouštěl tyto neurotrofinové formy Nejlepší výsledky byly dosaženy na médiích Phenyl Toyopearl od TosoHaas a Phenyl Sepharose Fast Flow Low Sub (low substítution). Vhodný byl rovněž TSK Phenyl 5PW. K separaci těchto forem mohou sloužit i náplně pro HIC s jinými imobilizovanými funkčními skupinami. Příklady jsou oktylové skupiny, jako jsou na náplních Octyl Sepharose CL4B od Pharmacie a propylové skupiny jako na náplních High Propyl od firmy Baker Méně upřednostňované jsou pryskyřice s alkoxy, butylovými a isoamylovými funkčními skupinami.

V savčích buněčných kulturách je HIC užitečná pro separaci neurotrofmů od jejich variant Např. jak zde bylo stanoveno, rhNGF, exprimovaný v CHO buněčné kultuře, obsahuje nesprávně proteolyticky zpracované varianty, jako jsou ty, ve kterých je přítomna částečná prekursorová sekvence, např. prekursor NGF, hybridní prekursor NGF a sekvence zkráceného prekursoru NGF. V kultuře savčích buněk byly rovněž nalezeny glykosylovaný NGF a glykosylované formy nesprávně proteolyticky zpracovaných variant Nežádoucí glykosylované formy, které mohou být v případě NGF pozorovány jako druhy s vyšší molekulovou hmotností (+2000 kD), mohou vytvářet nechtěnou antigenní odezvu u pacientů a být příčinou nízké kvality nebo aktivity produktu, HIC účinně separovala hydrofobní varianty, v první řadě varianty rhNGF, proteolyticky špatně zpracované na N-konci, včetně glykosylovaných forem. Jak je ukázáno v Příkladech, NGF, obsahující prekursorovou sekvenci, zkrácenou sekvenci prekursoru NGF a glykosylované formy jak NGF tak i NGF, obsahujícího prekursorovou sekvenci, se eluovaly v počátečních fázích píku NGF při HIC s fenylovými funkčními skupinami Tak může být získána

4 4 • · · · 4

4 • 44 i

V 4· ·4·

4 *4 44 kompozice rhNGF převážně bez obsahu těchto druhů a konkrétně vhodná pro následný krok, jako je HPLC na katexu. HIC lze aplikovat bez ohledu na zdroj i na další neurotrofiny i NGF Např HTC je užitečná pro separaci NGF monomerů od dimenů, buď homo- nebo hetero-dimerů, v závislosti na přítomné monomerni formě, stejně tak jako pro rozlišení dimerových forem, lišících se v hydrofobicitě, a které jsou získány po in vitro znovusvinutí nebo, které jsou produkovány a vylučovány savčími buňkami Pro HIC je upřednostňovaný zdroj směsi neurotrofinu kultura savčích buněk, více upřednostňovaná je CHO buněčná kultura Jak je zde diskutováno, kultura je výhodněji podrobena alespoň jednomu předcházejícímu purifikačnímu kroku. HIC je konkrétně účinná při separaci chybně zpracovaných glykosylovaných variant (varianty) od nativního rekombinantního neurotrofinu. V případě rhNGF jsou glykosylované a prepro-NGF formy méně hydrofobní než nativní NGF, a proto jsou eluovány drive než nativní NGF. Chybně svinuté formy neurotrofinu (jsou-íi produkovány bakteriemi) jsou také hydrofobnější, a tudíž eluované drive než nativní neurotrofin

Nejupřednostňovanější HIC pryskyřice pro separaci neurotrofinových forem jsou ty, které mají imobilizované fenylové funkční skupiny. HIC náplně s fenylovými skupinami od různých dodavatelů vykazují odlišnou účinnost pro rozpouštění těchto NGF forem Z pryskyřicí s fenylovými skupinami je nejupřednostňovanější pro HIC náplň Phenyl Toyoperal od TosoHass a Phenyl Sepharose Fast Flow Low Sub (low substitution), upřednostňována je TSK Phenyl 5PW Upřednostňované HIC funkční skupiny pro HIC zahrnují alkoxy, butylové a isoamylové skupiny

Při HIC mohou být použity pro promytí a rozlišenou eluci neurotrofinových forem různé mobilní fáze. Tyto mobilní fáze mohou obsahovat několik různých chemických druhů, které v nižných směrech ovlivňují vazbu mezi neurotrofmem a stacionární fází. Správně svinutý a chybně svinutý neurotrofin, např. NT-4/5 může být rozpuštěn na koloně pro HIC klesajícími gradienty koncentrací solí nebo nespojitým poklesem např. koncentrace soli v mobilní fázi, např. síranu amonného, NaCl, aeetátu. Soli mohou ovlivňovat vazbu neurotrofinu na pryskyřici tím, že snižuji povrchové napětí mobilní fáze. Další činidla, která snižuji povrchové napětí, jsou citrát sodný, chlorid tetramethylamonný, jak je diskutováno v Příkladech Varianty mohou být také rozpouštěny na koloně během chromatografie eluováním vázaného proteinu rostoucím gradientem nebo nespojitou rostoucí změnou koncentrace relativně polárních organických rozpouštědel Příklady vhodných rozpouštědel jsou etanol, acetonitril a propanol. Síla vazby mezi neurotrofinovými formami a pryskyřicí pro HIC také závisela na pH mobilní fáze, $ upřednostňovanými neutrálními podmínkami. Na pH roztoku také závisela relativní hydrofobicita správně svinutého a chybně svinutého neurotrofinu. Separace variant od nativního neurotrofinu • v « t · • ······ α « ·« může být také dosaženo současně probíhající změnou několika vlastností mobilní fáze během gradientově nebo nespojité eluce. Např. mobilní fáze, kde se během eluce současně mění koncentrace soli a koncentrace apolámího rozpouštědla, poskytuje větší rozlišení než když je měněna pouze koncentrace soli.

Pro HIC chromatografii mohou být použity zde diskutované soli, včetně síranu amonného, citrátu, octanu a chloridu draselného. Aby bylo dosaženo vazby neurotrofinu na pryskyřici, je v závislosti na použité soli koncentrace soli většinou 0,5 až 3 M, výhodněji 0,5 až 2,5 M. Např vazebný pufr s koncentrací soli 0,8 až 1,5 M je upřednostňovaný pro NGF, zatímco vyšší koncentrace soli vedou ke srážení NGF na koloně a výsledkem je nižší návratnost. Pro NT-3 je upřednostňován vazebný pufr pH 7 s koncentraci soli 1,0 až 2,5 M, z čehož je více upřednostňovaná koncentrace 1,25 až 1,75 M NaCl a nejvíce upřednostňovaná koncentrace 1,5 M. Pro NT-4/5 je upřednostňován vazebný pufr pil 7 s koncentrací soli 1-3 M, z čehož je více upřednostňovaná koncentrace 2 až 2,75 M a nejvíce upřednostňovaná koncentrace 2,5 Μ. V případě NT-4/5, byla-li upřednostňovaná koncentrace soli pro nanesení vzorku 2,5 M, pro eluci byla upřednostňována 2 M NaC?l s přítomným organickým rozpouštědlem (např. 10 % alkohol, pil 7). Pro eluci a separaci neurotrofinu a jeho variant je výhodněji používáno snižování koncentrace soli. Aby došlo k eluci, koncentrace soli v elučním puťru je většinou nižši než v nanášecím pufru, ale může být použita i stejná koncentrace v případě, je-li kompenzovaná organickým rozpouštědlem

Použití organických rozpouštědel má také tu výhodu, jak zde bylo zjištěno, že přídavek organického rozpouštědla zlepšuje eluční profil tím, že vzniká užší profil piku. Kromě etanolu mohou být použita další zde diskutovaná organická rozpouštědla včetně propanolu, isopropanolu a nižších alkylenových glykolů, jako jsou propvleglykol, etylenglykol a hexylengiykol. Organická rozpouštědla v koncentracích 5 až 25 % (v/v), výhodněji 5 až 20 % (v/v), budou většinou eluovat správně svinutý neurotrofin. Eluce organickým rozpouštědlem může být jak gradientova tak i nespojitá. Rozsah pil je výhodněji oblast blízko neutrální až slabě zásaditá, pH 5 až 8, ještě výhodněji pH 6 až 8, pH 6,5 až 7,5 a nejvýhodněji pH 7. Všechny ostatní zde diskutované pufry včetně MOPSO, MOPS, HEPES, fosfátového, citrátového, amonného a acetátového mohou být použity tak dlouho, dokud udrží požadované pH

Určité nežádoucí varianty neurotrofinu, uvolňované během rekombinantní produkce neurotrofinu, které objevili autoři předmětného vynálezu, mohou být separovány HPLC na katexu, konkrétně v preparativním uspořádání Tato chrornatografie umožňuje separaci nábojově modifikovaných variant, jako jsou karbamylovane, oxidované, isoasp. formy, deamidované a < · · * · * určitým způsobem zkrácené formy, (např formy NGF, zkrácené na C-konci), od nativního neurotrofinu. Mohou být odstraněny např formy zkrácené na N-konci (např delecí 2 až 4 aminokyseliny z N-konce), vznikající jako nábojově upravené, které se mohou vyskytovat v průběhu bakteriální femientace jako v případě NT-4/5 a NT-3. V případě neurotrofinů, produkovaných v kultuře savčích buněk, se může zkrácení na C-konci vyskytovat ve vysoce nabitých koncových oblastech. Např , 118 aminokyselinová forma NGF může být nesprávně zpracovaná nebo štěpená na svém C-konei na 117, 114 a 115 aminokyselinovou formu. Ty mohou být separovány od nativního 118 aminokyselinového NGF pomocí HPLC na katexu. Konkrétně upřednostňované provedení používá SP-Sepharose High Performance, Fractogel HMD SO3 nebo pryskyřici s polyasparágovou kyselinou, z nichž je konkrétně upřednostňovaná PolyCAT A. Ve velkém měřítku jsou nejvíce upřednostňované SP-Sepharose High Performance nebo Fractogel EMD SO3.

Kompozice, získaná zde popsaným postupem, bude převážně čistý neurotrofm, častěji a výhodněji téměř čistý, a bude převážně bez obsahu neurotrofinových variant, výhodněji bude téměř bez obsahu neurotrofinových variant. Např. po purifikaci NGF z CHO buněčné kultury na koloně SP-Sepharose obsahují typické frakce asi 92 % 118 aminokyselinové formy, 4,6 % 120 aminokyselinové formy, 1 % deamidovaného NGF, 1 % oxidovaného NGF a 1 % isoasp NGF Běžně se množství každého druhu pohybuje od asi 85 do 93 % 118 aminokyselinové formy, od 0 do 5 % 120 aminokyselinové formy (z velké části v závislosti na přesnosti endogenní a/nebo exogenní proteolýzy, která je použita), od 0 do 5 % 117 aminokyselinové formy, od 0 do 3 % dcamidované formy, 0 až 2 % isoasp formy a 0 až 2 % oxidované formy. Čistota NGF (všech druhů) je běžně vyšší než 99,5 %.

Poté, co je neurotrofm eluován z. kolony, je vhodně formulován do kompozice s nosičem, výhodněji farmaceutické kompozice s fyziologicky přijatelným nosičem. Neurotrofinové kompozice jsou výhodněji sterilní. Neurotroťinové kompozice tohoto předmětného vynálezu také nacházejí in vilro použití, např. pro zajištění růstu a přežití neuronů v kultuře

Chemická a fyzikální stabilita rekombinantního lidského nervového růstového faktoru (NGF) ve vodných roztocích byla stanovena mezi 5 a 37 °C, v rozsahu pil 4,2 až 5,8 Chemická stabilita NGF rostla s rostoucím pH. V sukcinátovém pufru pH 5,8 fyzikální stabilita NGF v důsledku agregace proteinů klesala Na základě dat jak pro stabilitu při 5 °C tak i intenzivních degradačních studií při 37 °C, byla nalezena optimální formulace - acetátovy pufr v pH 5,5 (viz WO 97/17087, který je zde začleněn jako odkaz) HPLC na reverzní fázi byla metoda, která jako první naznačila stabilitu a která ukazuje, že konverze Asn-93 na iso-Asp je primární degradační cesta při 5 °C »*» v · « * « « · · • »·«··* * · · · « · * « · *

Kvantifikace degradace NGF pomoci ionexové chromatografie na katexu byla komplikována přesmykem monomerových variant NGF na různé směsné dimery (dimerová výměna). Působením zředěných kyselin na vzorky a kontrolní vzorky se rychle ustálila distribuce monomeru v dimerech a tím bylo možno kvantifikovat degradaci NGF bez dimerové výměny. Benzylalkohol a fenol byly oceněny pro jejich stabilitu a slučitelnost s rhNGF ve dvou kapalných formulacích pro účely vícenásobného použití. Tyto dvě formulace se skládají z roztoku proteinu o koncentraci 0,1 mg/ml, 20 mM octanu sodného pH 5,5 a 136 mM chloridu sodného s a bez 0,01 % pluronové kyseliny (F68) jako surfaktantu. Konečné koncentrace benzylalkoholu a fenolu v každé z těchto dvou formulací byly 0,9 a 0,25 %. Na základě sledování 12 měsíční stability lze říci, že rhNGF je více stabilní v přítomnosti benzylalkoholu než fenolu v těchto formulacích Benzylalkoholem chráněná formulace rhNGF je v přítomnosti surfaktantu stejně stabilní jako formulace, kam surfaktant nebyl přidán, což naznačuje, že přídavek F68 k multi-dávkovací formulaci rhNGF není pro účely stability požadován. Formulace skládající se z 0,1 mg/ml proteinu v 20 mM acetátu, 136 mM NaCl, 0,9 % benzylalkoholu pH 5,5 je proto doporučovaná pro rhNGF, které jsou používány pro vícenásobné dávkování ve Fázi III klinických studií. Tato multi dávkovači formulace rhNGF vyhověla USP a EP ochranným testům účinnosti po 6 měsících při 5 °C a je stejně stabilní jako současná kapalná formulace o koncentraci 2 mg/ml. Formulace by se však neměla vystavovat působení intenzivního světla, protože přítomný benzylalkohol je citlivý na světlo.

Obecně, kompozice může obsahovat další složky, výhodněji v množstvích ne menších než preparát stabilní, kapalný nebo lyolilizovaná forma a v množstvích vhodných pro účinnou a bezpečnou farmaceutickou aplikaci.

Neurotrofin je formulován s farmaceuticky přijatelným nosičem, tzn takovým, který není v používaných dávkách a koncentracích toxický pro příjemce a je slučitelný s ostatními přísadami formulace Např formulace výhodněji neobsahuje oxidační činidla a další sloučeniny, ktere jsou známé jako škodlivé pro polypeptidy. Tohoto kroku formulace je dosaženo odsolením nebo diallltrací za použití standardní technologie.

Obecně, formulace jsou připravovány rovnoměrným a těsným spojením neurotrofinů s kapalným nosičem nebo jemně rozdělenými pevnými nosiči nebo oběma Potom je, je-li to nezbytné, produkt tvarován do žádoucí formulace Nosič je výhodněji parcnterální nosič, ještě výhodněji roztok, který je isotonický vzhledem ke krvi příjemce. Příklady těchto nosičů zahrnují vodu, fyziologicky roztok, Ringerův roztok a roztok dextrózy. Nevodná vehikula, jako jsou fixovaný olej a etyloleát, jsou také užitečná, stejně tak jako lipozomv • « * β • ·»·4 · 4

Z 1 4 ♦♦· ·♦ • · * · » 4 4 44

Je vhodné, aby nosič obsahoval minoritní množství aditiv jako jsou sloučeniny, které zvyšuji isotonicitu a chemickou stabilitu Takové materiály jsou v používaných dávkách a koncentracích netoxické pro příjemce a zahrnují pufry, jako je fosfátový, citrátový, sukcinátový, s kyselinou octovou a dalšími organickými kyselinami a jejich solemi, antioxidanty jako je kyselina askorbová; nízkomolekulárni polypeptidy (menší než asi 10 zbytků), např polyarginin nebo tripeptidy, proteiny, jako jsou sérový albumin, gelatin, nebo imunoglobuliny; hydrofílni polymery, jako jsou pofyvinylpyrolidon, aminokyseliny, jako jsou glycin, giutamová kyselina, asparagova kyselina nebo arginin; monosacharidy, disacharidy a další uhlovodíky, včetně celulózy nebo jejích derivátů, trehalózy, glukózy, manózy nebo dextrinů, chelatační činidla jako je EDTA, alkoholické cukry, jako je manitol nebo sorbitol; protiionty, jako je sodík; a/nebo neionogenní surfaktantv, jako pofysorbáty, poloxamery nebo PEG Konečný preparát může být kapalina nebo tyofilizovana pevná látka.

Neurotrofin, který je používán pro terapeutickou aplikaci, musí být sterilní. Sterilita je snadno uskutečněna filtrací přes sterilní filtrační membrány (např membrány s velikostí pórů 0,2 mikronů). Obecně jsou terapeutické neurotrofinové kompozice dány do nádoby se sterilním přístupovým otvorem, např. sáčky nebo láhve s roztokem pro intravenózní aplikaci, se zátkou propíchnutelnou hypodermickou injekční jehlou. Výše uvedené formulace jsou rověž vhodné pro použití ui vitro

Neurotrofin je běžně skladován jako vodný roztok nebo jako lyofilizovana formulace pro další použití v jednotkách nebo multidávkovacích nádobách, např. zatavené ampule nebo lahvičky Příklad lyofilizované formulace' nádobky o objemu 10 ml jsou naplněny 5 ml sterilně přefiltrovaného 1 % (w/v) vodného roztoku neurotrofinů a vzniklá směs je lyofilizovana. Infúzm roztok je připraven rozpuštěním lyolilízovaného neurotrofinů použitím bakteriostatického zařízení Water-for-Injection.

Pacientům je podávána terapeuticky účinná dávka neurotrofinové formulace Pod pojmem terapeuticky účinná dávka je zde míněna taková dávka, která má takový efekt, pro který ,e podávaná Přesná dávka bude záviset na onemocnění, které má být léčeno, a známými technikami ji urči odborník v dané oblasti. Obecně, neurotrofinové formulace předmětného vynálezu jsou podávány v množstvích přibližně 0,01 pg/kg až 100 mg/kg na den Výhodněji v dávkách od 0,1 do 0,3 pg/kg. Dále, jak je v dané oblasti známo, může být nezbytná úprava dávek podle veku, tělesné hmotnosti, celkového zdraví, pohlaví, diety, délky podávání, lékové interakce a závažnosti onemocnění a bude zjistitelná rutinními experimenty. Většinou budou kliničtí lékaři podavat neurotrofinové formulace předmětného vynálezu až do takových dávek, které jsou dostatečné ·

4*4 • 4444 • « «4« 4 pro opravu, zachování a optimálně také opětovné ustanovení funkce neuronů. Vývoj této terapie je snadno monitorován vhodnými stanoveními

Neurotrofin může být kombinován nebo podáván spolu s dalšími neurotrofními faktory, včetně NGF, NT-4/5, NT-3 a/nebo BDNF a může být použit s ostatními vhodnými terapiemi nervových onemocnění

V případě NGF, kompozice výhodněji obsahuje farmaceuticky účinné množství nervového růstového faktoru a farmaceuticky přijatelný acetátovy pufr. Kompozice může mít pH v rozmezí od 5 do 6 Pufr je výhodněji pufr s octanem sodným Koncentrace octanu je výhodněji 0,1 až 200 mM. Kompozice má výhodněji koncentraci NGF 0,07 až 20 mg/inl. Kompozice může dále obsahovat farmaceuticky přijatelné ochranné látky, jako jsou bcnzylatkohol, fenol, m-kresol, metylparaben nebo propylparaben. Výhodněji je jako ochranná látka uváděn benzylalkohol Koncentrace benzylalkoholu je výhodněji v rozmezí od 0,1 do 2,0 %. Kompozice může obsahovat farmaceuticky přijatelné surfaktanty a výhodněji fyziologicky přijatelné koncentrace chloridu sodného. Upřednostňovanější kompozice obsahuje nervový růstový faktor v koncentraci alespoň asi 0,1 mg/ml a s koncentrací octanového iontu 10 až 50 mM. Ještě výhodněji, obsahuje kompozice růstový nervový faktor v koncentraci asi 0,1 až 2,0 mg/mí a octanový iont v koncentracích 10 až 50 mM Nejupřednostňovanější kompozice obsahuje NGF v koncentraci 0,1 mg/ml s koncentrací octanu sodného 20 mM, pH 5,5, koncentrací chloridu sodného 136 mM a koncentrací benzylalkoholu 0,9 % (v/v).

Jiné provedeni obsahuje koncentraci NGF 2,0 mg/ml, koncentraci octanu sodného 10 mM, pH 5,5 a koncentraci chloridu sodného 142 mM. Výhodněji je formulován NGF o koncentraci 0,1 mg/ml v roztoku 20 mM octanu sodného, 136 mM chloridu sodného a 0,9 % (v/v) benzylalkoholu pH 5,5. Jak je výše diskutováno, upřednostňovaná forma NGF je homodimer 118/118. NGF je purilikován při pH přibližně 6 až 8 proto, aby byla zachovana normální homodimerová forma. Avšak určité procento (proteolyticky) zkrácených forem reprezentuje takové monomerní formy, které se stávají zřetelnými a mohou být stanoveny HPLC s reverzní fází. Kyselé podmínky analytické HPLC disociují dimery Byla publikována existence odlišných dimerových forem NGF - 120/120, 120/118, 118/118 atd. - (Schmelzer a spol., J. Neurochem, 59:1675 až 1683 (1992), který je specificky začleněn jako celek, hlavně pro jeho analytiku a biostanovení, které byly použity v současných studiích a pro jeho obecně naučný charakter). V teto publikaci bylo uvedeno, že in vitro aktivity byly stejné u každé dimeiové formy. Avšak v kontrastu s tím, zde prezentované studie poprvé ukazují, že dimer 120/120 je méně aktivní, má asi 80 až 90 % aktivity než 118/118 druhy, což bylo zjištěno stanovením na bázi radioreceptoru V • 44 4 44 4 • · ·· ·· jedné formě stanovení byly izolovány membrány PC-12 buněk potkanů, které byly použity pro kompetitivní vazbu mezi standardem NGF a různými testovanými druhy RRA má jak P75 tak trkA receptory. Rovněž zde bylo zjištěno, že 117/117 druhy jsou stejně aktivní jako 118/118 druhy Zde použité stanovení, založené na PC-12, dále potvrdilo, že bylo nalezeno stanoveni na základě receptorů, které ukázalo, že forma 120/120 je asi z 60 % aktivní než 118/118 forma. Publikace Burton a spo!., J Neurochem. 59:1937 až 1945 (1992) je také specificky začleněna jako celek, zejména pro analytická stanovení a biostanovení, která byla použita v běžných studiích a pro svůj obecně naučný charakter.

Předpokládá se, že u lidských pacientů bude forma 118/118 lépe dostupná než forma 120/120. Biodostupnost je zvýšena alespoň 4 až 5 krát. Tento rozdíl je významný, překvapující a v dané oblasti neočekávaný.

Následující příklady jsou uvedeny pro ilustraci nikoliv jako omezující Jako odkazy ve specifikaci jsou zde úmyslně zahrnuta odhaleni všech citací.

Příklady provedení vynálezu

Příklad I. Purifikace homodimeru NGF 118/118

Tento přiklad ukazuje purifikaci NGF a princip každého kroku. Jako v každém z Příkladů provedení vynálezu, může odborník v dané oblasti snadno stanovit a upravit rozměry kolony a rychlost průtoku, aby byl kompenzován původní objem kultury a koncentrace proteinů

Tekutina sklizené buněčné kultury

Rekombinantni CHO buňka byla podrobena transťckci s expresním vektorem, obsahujícím DNA sekvenci, která kóduje 120 aminokyselinový lidsky NGF. Pro zajištěni sekrece a výroby NGF byla také přítomna prepro sekvence. Po kultivaci rekombinantních CHO buněk bylo médium buněčné kultury sklizeno Sklizena tekutá buněčná kultura (HCCT) obsahovala 120, 118 a 117 aminokyselinové druhy NGF Asi 40 až 70 % NGF byl většinou homodimer 118/118 a zbývající formy byly heterodimery 120/118, 120/120 a malé množství 118/117. Tyto druhy mohou byt separovány chrornatografii na koloně SP-Sepharose HP (viz výše)

Sklizená tekutina buněčné kultury byla přibližně 20 x zahuštěna na zařízení Millipore s filtry s vylučovací mezí 10 kD (použity byly buď celulózové, smíšené nebo polysulfonové filtry a bylo je možno zaměnit). Do koncentrátu bylo přidáno 0,1 objemu 1,0 M Tris, pH 8,2 Zředěný materiál byl mikrofiltiován přes filtr s velikostí pórů 0,22 μηι a převeden do zásobního tanku o teplotě • · a · · · 4 · · « • ·····» 4 4 444 444 • « a · 4 a a a a * »« a >· ·« °C na dobu 2 až 18 hodin. Konverze formy 120/120 na 118/118, ke které dochází během procesuje katalyzována endogenní proteazou

Chromátografie na silikagelu

Mikrofiltrát byl převeden do roztoku 1 M NaCl a aplikován na kolonu Silica Gel Column, ekvilibrovanou roztokem 1 M NaCl, 25 mM MOPSO, pH 7. Kolona byla promyta 1 M NaCl v 25 mM MOPSO, pH 7. Vhodný rozsah pH je asi 6 až 8, s upřednostňovaným pH 7 Kolona byla dále promyta 25 mM MOPSO, pH 7 Nízká vodivost proniývacího roztoku odstraňuje proteiny hostitelské buňky. Vázaný NGF byl eluován roztokem, obsahujícím 50 mM MOPSO, 0,5 M TMAC a 20 % bezvodý alkohol (94 až 96 % Speciálně Denaturovaný Alkohol formule 3 A (5 objemových dílů metanolu a 100 objemových dílů etanolu (200 prooí)) a 4 až 6 % isopropanolu). Další alkoholy, které mohou být použity jsou 20 % propanol, 20 % isopropanol a 20 % metanol Zde použité pojmy alkoholy” a alkoholická rozpouštědla” jsou míněny ve smyslu běžně používané terminologie pro alkoholy, výhodněji alkoholy s 1 až 10 uhlíkovými atomy, ještě výhodněji metanol, etanol, isopropanol, n-propanol nebo t-butanol a nejvýhodněji etanol nebo isopropanol. Protože alkoholy jsou rozpouštědla, jsou-li přidány do vodného roztoku, klesá polarita rozpouštědla a tím zvyšují hydrofobicitu roztoku Nejupřednostňovanější je etanol Spodní limit koncentrace alkoholu je jakkékohv procento, které eluujc, a horní limit je dán potřebou vyvarovat se denaturace proteinu. Rozpouštědlo je výhodněji 5 až 25 %, ještě výhodněji 5 až 20 %, a nejvýhodněji 5 až 15 %. TMAC je chlorid tetrametylamonný, který je přítomen pro eluci NGF TMAC může byt v rozsahu koncentrací 0,1 až 1 M. Upřednostňované jsou koncentrace v rozsahu 0,3 až 0,7 M. Množství TMAC, použité pro eluci NGF, je funkcí pH a koncentrace alkoholu Čím je pH nižší, tím menší množství alkoholu a TMAC je požadováno, pl! může být v rozsahu asi 4 až 8. V tomto příkladu je upřednostňováno pH 7, které umožňuje velmi malé úpravy spojených frakcí před tím, než jsou naneseny na kolonu. Horní limit pH je dán hodnotou pH, které je nezbytné pro nanesení vzorku na další kolonu, a spodní limit je dán jako užitečný pro úspěšnou eluci NGF

Chromatografie na koloně S-Sepharose Fast Flow

Eluent, obsahující NGF, byl spojen dohromady, zředěn puntíkovanou vodou na vodivost menší než 15,5 ms/cm a pH roztoku bylo upraveno na hodnotu 7. Materiál nebyl skladován déle než 8 hodin, protože byly stále přítomny některé proleázy Nebyla však zjištěna žádná aktivita endogenní proteázy, která přeměňuje 120 aminokyselinový NGF na 118 aminokyselinovou formu Materiál byl aplikován na kolonu S-Sepharose Fast Flow (katexová ionexová pryskyřice SSEPHAROSE TM agarose Fast Flow TM (Pharmacia)), ekvilibrovanou 25 mM MOPSO, pil 7.

« 9 · • 9 · · · * 9 9 9 ···· 9 · » · 9 999 9*9

9·· 9 9 · · · « · · «

Kolona je promyta 25 mM MOPSO, pH 7. Vhodný rozsah pH je přibližně od 6 do 8, s upřednostňovaným pH 7 Kolona byla poté promyta 0,16 M NaCl, pH 7. Vázaný NGF byl eluován 0,5 M NaCl, pH 7. Molámí koncentrace soli v roztoku, který je používán pro eluci, se může pohybovat z rozmezí 0,3 až 1,0 M, ještě 0,4 až 0,6 M Spodní limit je dán užitečností eluovat všechen NGF a horní limit je dán potřebou vyvarovat se odstraněni kontaminant a vzniku hydrofobních interakcí na koloně, které by mohly rušit eluci NGF. Mohou být použity i další sole, z nichž je upřednostňovaná alternativa KC1 Aby byly získány frakce o malém objemu, je upřednostňována eluce 0,5 M NaCl, pH 7. Ve vyšších koncentracích soli, např. více než 1 M, mohou být eluovány slabě vázané kontaminanty.

Chromatografie na koloně Phenyl Toyopearl 650 M

Frakce po SSFF chromatografii, obsahující NGF, byly spojeny dohromady, převedeny do 1 M NaCl a aplikovány na kolonu Phenyl foyopearl 650M. Kolona byla promyta 25 mM MOPSO, pH

7. Vhodný rozsah pH je přibližně od pH 5 do pH 8 Vázaný NGF byl eluován 10 CV (objem kolony) lineárního gradientu, který začíná gradientovým pufrem A (25 mM MOPSO, pH 7, 1,0 M NaCl) a končí gradientovým pufrem B (20 % alkohol v 80 % 25 mM MOPSO, pH 7). Frakce, obsahující NGF, byly analyzovány SDS elektroforézou v polyakrylamidovém gelu, aby bylo stanoveno, které frakce obsahuji druhy s prekursorem NGF. Aby byla získána kompozice NGF, převážně bez obsahu jakkýchkoliv sekvenci prekursoru NGF, byly vybrány a spojeny frakce, obsahující NGF. ze kterých je třeba odstranit špatně zpracované varianty, jako jsou ty, ve kterých je přítomna částečná prekursorová sekvence, např prekursor NGF, hybridní prekursor NGF a zkrácená sekvence prekursoru NGF. Fenylova kolona také odstraňovala malé množství glykosyíovaného NGF a sekvence prekursoru glykosylovaneho NGF. Prekursor a zkrácené sekvence prekursoru NGF spolu s glykosylovanými formami jak NGF tak prekursoru NGF se eluovaly na začátku NGF píku. Ί ato kolona snadno separovala NGF od různých druhů NGF, aby byla získána kompozice NGF převážně bez obsahu těchto druhů. V tomto kroku byly separovány použitím HIC různé hydrofobni varianty NGF. hlavně chybně zpracované varianty, včetně proteolytických a glykosylovaných variant

Pro separaci forem NGl·' byla nejvhodnější média s imobilizovanými ťenylovými skupinami Tato media od různých dodavatelů vykazují odlišnou účinnost při rozpouštěni těchto forem NGF NejlepŠich výsledků bylo dosaženo na médiu Phenyl Toyopearl od TosoHaas HIC' pryskyřice Phenyl Sepharose Fast FIow Low Sub (low substitution) a TSK Phenyl 5PW pracovaly dobře. Ostatní nosiče pro HIC s jinými funkčními skupinami byly za stejných podmínek méně vhodné a méně účinné včetně alkoxy, butylových a isoamylových skupin • « · fc · 4 • ««·«·· « · 4 • 4 · · 4 « •4· · 44 4 «·

Frakce spojené po chiomatografii na koloně Phenyl Toyopearl obsahovaly 75 % 118 aminokyselinové formy, 10 % 120 aminokyselinové formy, 7 % 117 aminokyselinové formy, 1,8 % deamidovaného NGF, 1,4 % oxidovaného NGF a 2 % isoasp NGF. 2,8 % připadají na zbývající neidentifikované druhy NGF.

Aby bylo dosaženo virální inaktivace, mohly být spojené frakce podrobeny účinku kyseliny v pH nižším než 3,95 po dobu minimálně 15 minut.

Chromatografie na SP-Sepharose HP

Frakce spojené po MIC chromatografii byly zředěny 0,5 až 1 objemem vody a zředěný vzorek byl upraven na pH 6 Vzorek byl nanesen na kolonu SP-Sepharose HP, ekvilibrovanou 0,2 M NaCl v 20 mM sukcinátu pH 6, obsahujícím 5 % alkoholu (jako v kroku na koloně silikagelu) Kolona byla promyta 0,2 M NaCl v 20 mM sukcinátu pH 6, obsahujicim 5 % alkohol (formule SDA-3A aleohol, alkohol nemusí být přítomen). Alkohol pomáhá redukovat nespecifické (většinou hydrofobní) interakce NGF s páteří pryskyřice. Vhodný rozsah koncentrace alkoholu je přibližně 0 až 10 %. pH nanášení je v rozmezí asi 5 až 8. Toto rozmezí bylo vybráno proto, aby bylo dosaženo separace variant NGF a zachována maximální stabilita NGF. Kolona byla promyta dvěma objemy kolony ekvilibračního pufru. Vázaný NGF byl eluován a separován od variant pomocí lineárního gradientu o objemu odpovídajícímu 22 násobku objemu kolony Gradient byl vytvořen smícháním 11 objemů kolony gradientového pufru A (0,25 M NaCl v 0,02 M sukcinátu pH 6, obsahující 5 % alkohol) a 11 objemů kolony gradientového pufru B (0,5 M NaCl, pH 6). Alkohol nemusí být přidán 118/118 forma NGF je většinou eluována koncentraci NaCl 0,35 až 0,40 M

Frakce, vycházející z kolony, byly analyzovány z hlediska obsahu NGF a NGF variant. Frakce byly ještě analyzovány chromatografii C4 RP-HPLC, jak popisuje Schmelzer a spol (1992), supra., a Burton a spol. (1992) , supra Aby byla získána kompozice NGF, která převážně neobsahuje modifikované varianty, např nabité druhy NGF jako jsou oxidované, deamidované a isoasp. druhy, byly vybrány a spojeny příslušné frakce HIC kolona z předcházejícího příkladu nemůže účinně odstranit další různé formy NGF, jako je oxidovaná a isoasp. forma NGF. HIC kolona účinně neodstraňuje chybně svinuté proteiny a glykosylované formy, které, protože mají tendenci být hydrofobnější, se vážou na pryskyřici slaběji než správně svinutý NGF. Proto byla tedy použita pro odstranění nábojově změněných variant neodstraněných na HIC pryskyřici, pryskyřice pro ionexovou chromatografii na katexu, např. SP-Sepharose HP.

Frakce spojené po chromatografii na SP-Sepharose většinou obsahovaly asi 92 % 118 aminokyselinové formy, 4,6 % 120 aminokyselinové formy, 1 % deamidovaného NGF, I % • * ♦ · · » » > » » ··«» t · · · « ··* «»« • · · · · « t • · · ♦ « v · · ·· oxidovaného NGF a 1 % isoasp formy NGF. Množství každého druhu se běžně pohybuje v rozmezí přibližně 85 až 93 % 118 aminokyselinové formy, od 0 do 5 % 120 aminokyselinové formy, od 0 do 5 % 117 aminokyselinové formy, od 0 do 3 % deamidované formy, 0 až 2 % isoasp formy a 0 až 2 % oxidované formy Čistota NGF (všech druhů) je běžně vyšší než 99,5 %

Formulace

Frakce spojené po chromatografii na SP-Sepharose HP byly pro formulaci připraveny ultrafiltrací/diafiltrací do formulačního pufru Výhodněji je používán kysely pufr, výhodněji acetátový pH 5, jak je diskutováno výše Kompozice 118/118 formy NGF je převážně bez obsahu NGF variant a jedná se o převážně čistý NGF. Formulovaný materiál je vhodný pro léčbu neuronálnich onemocnění, konkrétně periferní neuropatie spojené s diabetem a periferní senzorické neuropatie spojené s AIDS.

Příklad II. Purifikace homodimeru NGF 120/120 ve velkém měřítku

Tekutina sklizené buněčné kultury (TICCF)

HCCF byla získána z kultivace 12 000 litrů CHO buněčné kultury, jak je obecně popsáno v Příkladu 1. Distribuce jednotlivých druhů NGF v HCCF byla asi 40 až 65 % homodimeru 120/120 s heterodimerem 120/118 a zbývající množství byl homodimer 118/118. Aby byla minimalizována proteolytická konverze 120 na 118, bylo médium rychle zpracováno.

lonexová chromatograťie na katexu Macroprep High S

I1CCF byla nanesena na kolonu Macroprep High S, promytou 1,5 M octaneni sodným v 50 mM HEPES, pH 7. Vázáný NGF byl eluován 1,5 M NaCl, 0,25 M TMAC, 0,2 % thiodiglykolem pH 7 Chromatogralie na koloně Macroprep může probíhat při pH 5 až 8 s úpravou koncentrace octanu. Chlorid je upřednostňovaná náhrada octanového iontu NGF byl eluován gradientem TMAC TMAC je sůl, která má jak iontový tak i hydrofobní charakter, což je užitečná vlastnost, protože páteř některých pryskyřic obsahuje hydrofobní oblasti, které podporují nespecifické interakce mezi NGF a pryskyřici. Pro elučni pufr o pH asi 6 až 8, jsou užitečné koncentrace TMAC 0 až 3 M. Frakce, které obsahují NGF’, byly spojeny dohromady

Chromatogralie na šilikagclu

Spojené frakce byly přímo aplikovány na kolonu silikagelu. Silikagel představuje směsný typ chromatografické pryskyřice, která je iontová, polární a vykazuje hydrofobní interakce, které hrají roli ve vazebných charakteristikách proteinu. Kolona byla ekvilibrována roztokem 1 M NaCl v mM MOPSO pH 7. Kolona byla promyta 1 M NaCl v 25 mM MOPSO pH 7 (výhodněji pH asi až 8,5, ještě výhodněji pil 6 až 8, a nejvýhodněji pFl 7) Vázáný NGF byl eluován 25 mM

4,

• · 4 4 ·

4 44* 44« • · 4 • 4 4 4 4 sukcinátem pít 3,9, 50 mM TEAC (chlorid tetraetylamonný). TEAC je silnější eluent než TMAC pH se výhodněji pohybuje přibližně v rozmezí od pH 3,5 do 8 Je však třeba se vyvarovat delšího působení pH vyššího než 7,5, aby se předešlo nebo aby byla snížena tvorba deamidovaných druhů NGF. Obecně, čim nižší je pH pufru, tím menší koncentrace soli se směsnými vlastnostmi, např. TMAC nebo TEAC, je požadována pro elucí NGF z kolony silikagelu. Pro použití jsou vhodné pufry, které mají dobrou pufrovací kapacitu v oblasti blízko pil 4 až 5. Přítomnost soli v elučním pufru není nezbytná, takže před aplikací elučního pufru může být kolona promyta MOPSO pufrem bez soli

Chromatograťie na koloně Phenyl Sepharose Fast Flow

Frakce, obsahující NGF, byly identifikovány a spojeny dohromady Spojené frakce byly převedeny do roztoku 0,7 M octanu pH 7, 25 mM MOPSO. Upravené frakce byly naneseny na chromatografickou kolonu Phenyl Sepharose Fast Flow, ekvilibrovanou gradientovým pufrem A (0,7 M octan, 25 mM MOPSO, pH 7). Kolona byla promyta klesajícím gradientem od 90 % gradientového pufru A (0,7 M octan, 25 mM MOPSO, pH 7) do 10 % gradientového pufru 13 (25 mM MOPSO, pH 7, 20 % propylenglykol) Jako náhrada mohou být použity ostatní glykoly, jako je hexyfenglykol. Promývání je většinou prováděno asi 2 až 3 objemy kolony nebo tak dlouho, než je základní čára absorbance stabilní. Promytím se odstranily některé proteiny hostitelské buňky. Vázaný NGF byl eluovan 10 objemy kolony lineárního gradientu od směsi 90 % gradientového pufru A a 10 % gradientového pufru B do směsi 10 % gradientového pufru A a 90 % gradientového pufru B. V pufrech pro HIC mohou octan nahradit NaCl nebo síran sodný. pH je výhodněji v rozmezí od asi 5 do 8, ještě výhodněji od 5,5 do 7,5, s akceptovaným pH 0 až 8 a nejvýhodněji okolo 7. Kolona separovala jakkékoliv zbývající prekursorové sekvence, částečné sekvence prekursoru nebo glykosylované formy, přítomné jako homodimer nebo heterodimer monomeru zralého NGF, a monomer NGF, který má stále přítomnou část sekvence prekursoru. Prekursor a glykosylované formy NGF jsou přítomny ve frakcích na počátku elučního píku, takže, aby byly převážně tyto druhy vyloučeny, byly frakce obsahující NGF spojeny

Frakce spojené po HIC obsahovaly asi 72 % 120 aminokyselinového monomeru, 17 % 118 aminokyselinového monomeru, 2,8 % 117 aminokyselinového monomeru, 3,6 % R120 monomeru, 0,8 % isoasp forem, 1,3 % oxidovaných forem a 1 % deamidovaných forem, které byly separovány a detekovány na analytickém UPEC systému.

Chromatografic na kolo ně SP-S e^liai o s e HP · · • ·

Frakce, obsahující NGF, z kroku HIC, byly spojeny dohromady. Ve velkém měřítku toho bylo dosaženo tak, že efluent byl v odpovídajícím čase odváděn z kolony do zásobního tanku. pH spojených frakcí bylo upraveno na pH 6 a frakce byly aplikovány na chromatografickou kolonu SP-Sepharose HP Kolona byla promyta roztokem 20 mM sukcinátu, 0,2 M NaCl pH 6 (gradientovy pufr A). Vázaný NGF byl eluován 22 objemy kolony gradientu, začínajícího směsí 70 % gradientového pufru A a 30 % gradientového pufru B a končícího směsi 80 % gradientového pufru B (0,7 M NaCl pH 6) a 20 % gradientového pufru A. pH je výhodněji v rozmezí od pH 5 do 8, ještě výhodněji pH 5,7 až 6,5 a nejvýhodnějí pH 6. Reprezentativní chromatogram je ukázán na Obrázku 1.

Spojené frakce po chromatografii na SP-Sepharose HP běžně obsahovaly asi 95 % 120 aminokyselinové formy, 3 % R120 formy, 0,65 % isoasp formy, 0,6 % oxidované formy, 0,6 % deamidované formy. Ostatní neidentifikované formy NGF byly přítomny v množství asi 0,6 % a obsahovaly dioxidovaný NGF (Met 37 a Met 92) s deamidovaným Asn45. HP1LX analýza, která porovnává reprezentativní spojené frakce po HIC (nanesené na pryskyřici SP-Sepharosc) a spojené frakce, získané po chromatografii na SP-Sepharose je ukázána na Obrázku 2. Každá z těchto tři zkrácených hlavních forem NGF, 120, 118 a 117, může mít varianty Varianty převládající zkrácené formy (v tomto příkladu 120 formy), jako jsou oxidované a isoasp formy, mohou během purifikace rušit analýzu variant z méně převládajících forem (v tomto příkladu 118 a 117 formy) HPLC analýza frakcí z reprezentativního chromatografiekého běhu je ukázána na Obrázku 3.

SP-Sepharosa HP účinně odstraňovala varianty, přítomné ve frakcích spojených po HIC. R120 forma NGF má doplňkový argininový zbytek na N-konci; obvykle je N- koncová aminokyselinová sekvence rhNGF SSSHP, ale R120 má N-koncovou sekvenci RSSSHP Proto je forma RI20 zásaditější než zralý NGF a byla separovaná SP-SHP chromatografii. Má také nižší bioaktivitu, což pravděpodobně souvisí s faktem, že N-konec NGF je nezbytný pro vazbu recepturu (trkA) Oxidovaná forma NGF jc monooxidovaná, a má methionin v pozici 37 oxidovaný, a vzniká v kyselejší formě než ta, která se eluuje na počátku píku NGF. Isoasp. forma obsahuje modifikaci kyseliny asparágové na 93 aminokyselině. Isoasp forma jc nepatrně zásaditější, a proto sc váže nepatrně slaběji na pryskyřici SP-Sepharose HP. NGF druhy, obsahující isoAsp93, sc eluovaly v závěrečné fázi elučního píku. Deamidace probíhá na asparaginových zbytcích, většinou na asparaginu v pozici 45 NGF, obsahující deamidovany Asn, který poskytuje Asp v pozici 45, je nepatrně kyselejší a objevuje se na počátku elučního píku.

• 44

4 4 4 * 4 4

4 4 « ·

Pro separaci nabitých variant NGF druhů je méně upřednostňovaná alternativní pryskyřice k SP-Sepharose HP pryskyřice Fractogel EMD SO3 Je-li použita méně upřednostňovaná pryskyřice, jsou třeba pro eluci NGF vyšší koncentrace NaCl

Formulace

Celý materiál byl formulován pomocí UF/DF do formulačního pufru, stejně jako v předchozím Příkladu. V konečném produktu se obsah formy 120 pohyboval v rozmezí od asi 92 do 97 %, formy R120 od asi 1 do 4 %, isoasp. formy od asi 0,2 do 1,5 %, oxidované formy od asi 0,2 do 2 % a deamidované formy od asi 0,2 do 2 %. Obsah 117 a 118 aminokyselinových forem byl běžně nižší než asi 2 %. Čistota konečného produktu NGF byla běžně alespoň 99,5 % (včetně všech druhů)

Příklad III. Izolace 118/118

Aby byla získána převážně čistá kompozice NGF 118/118, která je převážně bez obsahu NGF variant, byla v jednom upřednostňovaném provedení použita metoda z Příkladu II s následujícími modifikacemi. Kolona s mobilizovaným trypsinem je použitá mezi chromatografii na koloně Macroprep High S a chromatografii na koloně silikagelu. Spojené frakce po chromatografii na koloně Macroprep jsou přímo naneseny na kolonu s mobilizovaným trypsinem, po úpravě pH na hodnoty asi 5 až 8,5, typičtěji pH 6,5 až 7,5, je-li to nezbytné Spojené frakce procházely kolonou a většina NGF byla v průběhu konvertována na 118 aminokyselinovou formu. Proteázové štěpení přeměňuje štěpením na C-konci VRRA na VR 120 aminokyselinovou formu na 118 aminokyselinovou formu. Pro dosažení limitovaného a selektivního štěpeni byly použity trypsin nebo trypsinu podobna proteáza, výhodněji trypsin, ještě výhodněji snadno dostupný prasečí trypsin nebo alternativně hovězí nebo rekombínantní trypsin. Může být použita jakkákoliv proteolylická metoda, která poskytuje převážně limitované a selektivní štěpeni, ale upřednostňovaná je kolona s mobilizovaným trypsinem, aby byla minimalizována kontaminace preparátu NGF Chromatografie byla prováděná při pH napomáhajícím proteázove aktivitě, výhodněji pH 5,5 až 8,5, ještě výhodněji 6,6 až 8,0 a nejvýhodnčji 6,5 až 7,5.

V tomto přikladu byl odstraněn glykosylovany NGF HIC, jak je zde diskutováno. Následovala chromatografie na koloně SP-Sepharose HP, jak je diskutováno v Příkladu II, ale kompozice NGF, upřednostňovaná pro klinické použití, byla získána výhodněji použitím 22 objemů kolony 0,3 M až 0,55 M gradientu soli Může být získána kompozice s obsahem více než 70 % 118 aminokyselinového monomeru, méně než 10 % 120 aminokyselinového monomeru a méně než 15 % 117 aminokyselinového monomeru, jak bylo stanoveno HPLC Většinou jsou získány kompozice s obsahem 90 % nebo více 118/118 rhNGF obvykleji 93 % nebo více 118/118 rhNGF ’ ’ » v v - _ „ _w • » · · · · * A · * ···· « A · A A A·· A·· · A · A A « «

AAAA A A A «« «· s obsahem stejným nebo menším než 70 % deamidovaných, isoasp a oxidovaných variant. To znamená, že pro dosaženi vyšší čistoty je třeba se vyvarovat selekce frakcí s významným množstvím variant jako jsou ty, které mohou být nalezeny v počátečních nebo konečných frakcích hlavního neurotrofinového piku, např. píku pro 118/118 formu rhNGF.

Příklad IV. Částečná purifikace rhNT-4/5 z bakteriálních inkluzních tělísek a jeho znovusvinutí

V tomto příkladu byl purifikován rhNT-4/5, který byl produkován během fermentace 10 nebo 60 litrů. Hostitel, ve kterém byl během fermentace produkován rekombinantní lidský NT-4/5, byl kmen E.coli, označený 27C7/pmNT5DT; přesto je NT-4/5, produkovaný ostatními kmeny a organismy, vhodný pro zde popsaný purifikační proces Expresní plasmid, použitý v tomto příkladu, obsahoval sekvenci, která kóduje zralý NT-4/5 pod kontrolou transkripčnimi a translačními sekvencemi, požadovanými pro expresi genu pro NT-4/5 v E.coli. V plasmidu, ve kterém je exprimován NT-4/5, byly poskytovány transkripční sekvence, použité pro expresi genu v E.coli, sekvencí promotoru alkalické fcsfatázy. Lambda transkripční terminátor byl situován vedle terminačního kodónu NT-4/5. Sekrece proteinu z cytoplasmy byla řízena STII signální sekvencí. Většina rhNT-4/5 byla nalezena v buněčném periplasmatickém prostoru v podobě nezlámaných tělísek. Plasmid propůjčil transformovanému hostiteli rezistenci k tetracyklinu Fermentační proces probíhal při 35 až 39 °C a pH 7,0 až 7,8. Fermentace probíhala 25 až 40 hodin, a kultura byla před sklizením vychlazena Kultura byla tepelně inaktivována při 60 °C použitím kontinuálně-průtočné aparatury nebo uvnitř tanku po dobu 5 až 15 minut Tepelně inaktivovaná kultura byla odstředěna v odstředivce AX Alpha-laval nebo podobné. Buňky E.coli byly získány v peletě.

Buňky E.coli, exprímující rekombinantní lidský NT-4/5 v inkluzních tělískách, byly lyžovány standardními postupy a byla získána pasta, obsahující NT-4/5 v inkluzních tělískách V pufru nebyly obsaženy žádné inhibitory proteáz

Při izolaci inkluzních tělisek ze zbytků buněk byla pasta E.coli s NT-5 použitím rotačního mechanicky dispergujicího zařízení např. Turrax, resuspendována v roztoku 0,02 M Tris, pH 8, mM EDTA (10 ml pufru/gram pasty). Suspenze buněk byla 3x protlačena mikrofiuidizerem při tlaku 6000 psi. Vzniklý homogenát byl odstředěn na centrifuze Sorvall R.C-3B při 5000 rpm po dobu asi 45 min. Supernatant dále nebyl používán a peleta byla 2 až. 3 min resuspendována v roztoku 20 mM Tns, pH 8, 5 mM EDTA (extrakčni pufr) použitím zařízení turrax při střední rychlosti. Homogenát byl odstředěn výše popsaným způsobem. Peleta byla resuspendována v • 4 · · • · extrakčním pufru a odstředěna výše popsaným způsobem. Vznikající peleta (pelety) (označované jako NT-4/5 inkluzní tělíska nebo nezlámaná těliska) byla skladovány při -70 °C

NT-4/5 byl izolován z inkluznich tělísek následujícím postupem. Pelety inkluzmho tělíska byly resuspendovány v roztoku 20 mM Tris, pH 8, 6 M močoviny, 25 mM DDT (10 ml pufru/gram inkluzního tělíska) v zařízení turrax pří střední rychlostí po dobu asi 10 min. Suspenze byla míchána 40 min při 2 až 8 °C a odstředěna v odstředivce Sorvall RC3B při 5000 rpm asi 45 min Do supernatantu byl přidán PEI (polyetylenímin) do koncentrace 0,1 % a roztok byl míchán při 2 až 8 °C 30 minut. PEI sráží nukleové kyseliny a ostatní kyselé nabité molekuly. Směs byla odstředěna v odstředivce Sorvall RC3B při 5000 rpm po dobu asi 45 minut. PEI supernatant byl nanesen na kolonu DEFF Sepharose Fast Flow (10 cm x 14 cm; DEFF je dietyl aminoetyl pryskyřice) ekvilibrovanu v 0,02 M Tris, 6 M močovině, 10 mM DDT, pH 8 Ekvivalent k 1 kg rozpuštěných nezlámaných tělísek byl nanesen na kolonu DEFF. Protože se redukovaný a denaturovaný NT-4/5 neváže na kolonu DEFF, vzorek, který prošel kolonou bez zadržení a obsahoval NT-4/5 a 6 M močovinu, byl spojen dohromady (Obrázek 6) a pH bylo upraveno kyselinou octovou na pH 5. Frakce s upraveným pH byly po chromatografií na koloně DEFF za podmínek, za kterých se NT-4/5 váže na pryskyřici, naneseny na kolonu S-Sepharose Fast Flow (S značí SO3 funkční skupiny na pryskyřici), ekvilibrovanou v 20 mM octanu pH 5, obsahujícím 6 M močovinu.. Po nanesení byla kolona S-Sepharose Fast Flow promyta několika objemy ekvilibračního pufru. Vázaný NT-4/5 byl eluován roztokem 0,5 M NaCI, 20 mM octanu sodného, 6 M močoviny pil 5 (Obrázek 7). Trakce spojené po chromatografii, eluované 0,5 M NaCI, byly dialyzovány přes noc proti roztoku 20 mM Tris, 0,14 M NaCI, pH 8, za podmínek, které umožňují NT-4/5 znovu se svinout, i když třeba chybně Chybně svinuté molekuly rhNT-4/5 agregovaly za tvorby precipitátu.

Aby byl získán správně svinuty NT-4/5, byl agregovaný, chybně svinutý rhNT-4/5 dále zpracováván Agregovaný, chybně svinutý rhNT-4/5 byl odstředěním shromážděn ve formě pelety Peleta byla resuspendována v roztoku 0,2 M fris, pí t 8, 4 M močoviny, 5 mM DTT a míchána při 2 až 8 ^QC po dobu asi 1 až 2 hodiny nebo tak dlouho, dokud nebyla peleta rozpuštěna Na základě hodnoty extinkčního koeficientu při 280 nm 1,8 byla konečná koncentrace proteinu upravena přibližně na 10 mg/ml. Do roztoku rozpuštěné pelety byl přidán oxidovaný glutation do konečné koncentrace 20 mM a následovalo jemné míchaní po dobu 15 až 30 minut při teplotě 2 až 8 C. Oxidovaný glutathion reaguje se sulfhydrylovymi skupinami NT-4/5 a vzniká směsný disulfid NT-4/5-S-glutathion Směsný disulfid NT-4/5-SG byl zředěn na konečnou koncentraci proteinu 0,1 až 0,5 mg/ml roztokem 100 mM Tris, 20 mM glycinu, 15 % • · · · · • · « · « >f· BBB

PEG-300, 1 M guanidin HCL, pH 8,3 Pro zahájení vlastního procesu znovusvinováni NT-4/5, byl do směsi přidán cystein v koncentraci 1 až 4 mM, následovalo provzdušňování (probubláváním) roztoku dusíkem nebo heliem po dobu 5 až 60 minut před tím, než byla nádoba uzavřena, aby byl vyloučen přístup kyslíku Znovusvinováni NT-4/5 probíhalo 18 až 24 hodin při 2 až 8 °C

Příležitostně byl rhNT-4/5 znovu svinován použitím sulfitolýzy a to následovně. Pelety inkluzního těliska (110 g) byly resuspendovány v 1,1 litru roztoku 20 mM Tris, 7 M močoviny, 10 mM glycinu, 100 mM siřičitanu sodného, 10 mM tetrathionátu sodného a solubilizovány v zařízeni turrax 10 min pri střední rychlosti. Směs (1260 ml) byla míchána při 2 až 8 °C po dobu 45 min. Byl přidán PEI do konečné koncentrace 0,1 %. Směs byla míchána dalších 30 minut při 4 °C a odstředěna 45 minut pri 5500 rpm v odstředivce RC3B Supernatant byl nanesen na kolonu DEFF (4,4 cm x 25 cm), ekvilibrovanou roztokem 20 mM Tris, 6 M močoviny, pH 8. pH vzorku, který protekl kolonou bez zadrženi, bylo upraveno kyselinou octovou na pil 5 a vzorek byl nanesen na kolonu S-Sepharose Fast Flow (4,4 cm x 25 cm), ekvilibrovanou roztokem 20 mM octanu, 6 M močoviny, pH 5. NT-4/5 byl eluován roztokem 25 mM MOPSO, 0,5 M NaCl, pH 7.

Frakce, spojené po chromatografri na koloně SSFF, obsahující 0,5 M NaCl a sulťonylovaný rhNT-4/5, byly zředěny na koncentraci proteinů asi 0,1 mg/ml a převedeny do roztoku 1M guanidin hydrochloridu, 100 mM Tris, 20 mM glycinu, 15 % PEG-300, pH 8,3 Znovusvinováni NT-4/5 bylo odstartováno přídavkem 2 až 4 mM cysteinu. Proces znovusvinováni byl téměř úplný po 24 hodinách. Aby byl odstraněn kyslík z roztoku, může být provedeno vzdušněni inertním plynem, např heliem nebo dusíkem

Příklad V. Izolace správně svinutého rhNT-4/5 od konforinačních (chybně svinutých) variant

Směs znovusvinutých rhNT-4/5 z Příkladu IV byla přes noc dialyzována proti roztoku o pH 4 až 5 proto, aby byl odstraněn guanidin a ostatní činidla Pro vyčereni roztoku byl roztok bud' odstředěn 45 minut při 5666 rpm nebo přefiltrován přes filtr s velikostí pórů 0,2 pm pil vyčeřeného supernatantu, obsahujícího 0,5 až 5 gramů proteinů, bylo upraveno přídavkem glaciální kyseliny octové na pil 3 až 5 a vzorek byl buď nanesen na kolonu C4 RP-HPLC nebo skladován zmraženy při -20 °C. V tomto příkladě byl okyselený a vyčerený roztok nanesen na kolonu C4 RP-HPLC (3 cm x 50 cm), na jejíž pryskyřici se váže svinutý rhNT-4/5. Správně svinutý NT-4/5 byl eluován použitím rozpouštědlového systému s acetonitrilovým gradientem v 0,05 % trifluoroctové kyselině (TFA): 26 až 40 % acetonotrilový gradient (během 95 min) v 0,05 % TFA při průtoku 25 ml/min Frakce byly sbírány v 1 až 1,5 minutových intervalech (Obrázek 8) Frakce byly analyzovány z hlediska správně svinutého NT-4/5 srovnáním etučnich

·· · ·· »· časů na analytické koloně C4 HPLC Vydac (0,21 x 15 cm) s elučnim časem standardu správně svinutého NT-4/5 (Obrázek 9). Standard správně svinutého neporušeného NT-4/5 je většinou eluován v 19. minutě, při průtoku 2,5 ml/min, pufrovacím systémem 0,5 % TFA/acetonitril Frakce, obsahující správně svinutý rhNT-4/5, byly spojeny a pH bylo upraveno na 5 až 7 Tento vzorek správně svinutého rhNT-4/5 také obsahoval karbamylované a na N-konci zkrácené formy NT-4/5,

Pryskyřice pro preparativní chromatogralii na reverzní fázi je výhodněji médium, mající průměr částic přibližně 10 až 40 mikronů, velikost pórů asi okolo 200 až 400 Angstromů a C4, C8 nebo Cl8 alkylové skupiny. Ještě výhodněji má pryskyřice průměr částice přibližně 15 až 40 mikronů a velikost pórů asi okolo 300 Angstromů a je to C4 silikagelové médium

Příklad VI. Alternativní izolace správně svinutého rhNT-4/5 od konformačních (chybně svinutých) variant

Směs znovu svinutých rhNT-4/5 z Přikladu IV byla zahuštěna přibližně lOx v ultrafiltračním zařízení Millipore-Pellicon s celulózovou (nebo polysulfonovou nebo ekvivalentní) membránou (20 ft²) s vylučovací mezí molekulové hmotnosti 10 kDa. Před tím, než byla zahuštěna směs přefiltrována přes membránu s velikostí pórů 0,2 mikronů, byla buď přes noc dialyzována proti 50 1 roztoku 50 mM octanu, pH 5,5, 50 mM NaCl nebo diafiltrována do roztoku 50 mM octanu, 50 mMNaCl, pH 5,5.

Přefiltrovaná, znovusvínutá směs byla převedena do roztoku 2,5 M NaCl, 20 mM MOPSO, pU 7 a nanesena na kolonu pro HIC Phenyt Toyopearl 650M (10 cm x 19 cm), předem ekvilibrovanou roztokem 2,5 M NaCl, 20 mM MOPSO, pH 7 Kolona byla dáte promyta ekvilibračním pufrem. Některé nesprávně svinuté formy molekuly rhNT-4/5 byly eluovány ve frakcích, které prošly kolonou bez zadržení, zatímco ostatní chybně svinuté formy byly eluovány vysokými koncentracemi organických rozpouštědel, jako je 20 až 40 % alkohol. Správně svinutý rhNT-4/5 byl z fenylové kolony eluován roztokem 2 M NaCl, 10 % alkoholu, pH 7 (Obrázek 10). Místo nosiče Toyopearl mohou být použity jiné pryskyřice s imobilizovanými fenylovými skupinami, jako je Phenyl Sepharose Mohou být použity výše diskutované soli, včetně síranu amonného, citrátu, octanu a chloridu draselného. V závislosti na typu použité soli je koncentrace soli většinou 1 až 3 M s koncentrací NaCl 2,5 M, upřednostňovanou pro naneseni a 2 M NaCl, upřednostňovanou pro eluci, je-li přítomno organické rozpouštědlo. Pro eluci a separaci neurotrofinu a jeho variant je výhodněji používána klesající koncentrace soli. Aby bylo dosaženo eluce, je koncentrace soli v elučnim pufru většinou nižší než v nanášecím pufru, ale je-li vykompenzována organickým rozpouštědlem, může být i stejná. Jak bylo zjištěno, použití • * organického rozpouštědla má ještě další výhodu. Přídavek organického rozpouštědla totiž zlepšuje eluční záznam tím, že poskytuje užší profil píku Kromě etanolu mohou být použita výše diskutovaná ostatní organická rozpouštědla včetně propanolu, isopropanolu a nižších alkylenovych glykolů, jako je propylenglykol, etylenglykol a hexylenglykol Správně svinutý neurotrofin budou většinou eluovat organická rozpouštědla v koncentracích 5 až 25 % (v/v), výhodněji 5 až 20 % (v/v) a ještě výhodněji 5 až 15 % Eluce organickým rozpouštědlem může být buď gradientova nebo nespojitá. Rozsah pH je výhodněji v oblasti blízko neutrální až slabě kyselé, od pH 5 do 8, ještě výhodněji pH 5,5 až 7,5 a nejvýhodněji pH 7. Dokud pufruje požadované pH, může být použit jakkýkoliv z výše diskutovaných pufrů včetně MOPSO, MOPS, HEPES, fosfátového, citrátového a acetátového.

Příklad VII. Purifikace správně svinutého rhNT-4/5 od chemických variant

Separace správně svinutého neporušeného rhNT-4/5 od jeho chemických variant včetně karbamylovaných a na N-konci zkrácených forem rhNT-4/5 bylo dosaženo vysokoúčinnou íonexovou chromatografii na katexové pryskyřici SP-Sepharose HP nebo PolyCat

Je-li pro odstranění chybně svinutých variant použita kolona C4 RP-HPLC, jsou frakce po této chromatografii spojeny dohromady a pH upraveno na pH 5 až 7. Vzorek byl nanesen na kolonu SP-Sepharose o rozměrech 7 cm x 19 cm, ekvilibrovanou roztokem 20 mM sukcinátu, pH 6, 5 % alkoholu a 0,2 M NaCl Pryskyřice s navázaným NT-4/5 byla promyta ekvilibračním pufrem. Vázaný rhNT-4/5 byl eluován a separován od karbamylovaných a na N-koncí zkrácených forem použitím 22 objemů kolony (CV) gradientu od 0,2 M NaCf do 0,4 M NaCl při pH 6 (tzn. gradient soli v ekvilibračním pufru) (Obrázek 11). Frakce, obsahující NT-4/5, byly spojeny dohromady a formulovány do 0,05 M octanu , pH 4 až 5 Neporušený rhNT-4/5 byl ve frakcích identifikován a rozlišen od variant výhodněji analytickou RP-HPLC nebo SDS elektroforézou porovnáním se standardem.

Variantní formy N I-4/5 byly příležitostně odstraněny vysokoučinnou íonexovou chromatografii na katexu, na koloně s polyasparagovou kyselinou (Póly CAT a PolyLC, Coumbia, Md.) (9,4 x 200 mm) (Obrázek 12) pH frakcí po C4 HPLC bylo upraveno na pH 5 až 6 a vzorek byl poté nanesen na kolonu Polycat. Chromatografické podmínky byly: Pufr A byl 20 mM fosfát, 5 % acetonitril, pH 6, Pufr B byl 20 mM fosfát, 5 % acetonitril, 0,8 M KC1, pH 6. rhNT-4/5 byl eluován použitím gradientu 25 až 60 % pufru B po dobu 60 min (Obrázek 12). Frakce byly sbírány v 1 minutových intervalech a analyzovány analytickou chromatografii na koloně C4, jak je popsáno výše • 4 ·· Β Β • · » · * ·*·♦ ♦ Β • Β Β •♦Β Β

»·· ΒΒΒ

Byla-li použita pro odstranění chybně svinutých variant HIC (Přiklad VI), frakce, obsahující správně svinutý NT-4/5, byly diaJyzovány přes noc proti roztoku 20 mM sukcinátu, 0,1 M NaCl, 5 % alkoholu, pH 6 nebo ukrafíltrovány/diafiltrovány do 20 mM sukcinátového pufru. Dialyzované nebo UF/DF frakce byly poté naneseny na kolonu SP-Sepharose nebo PolyCAT, jak je popsáno výše.

Formulace

Frakce, obsahující správně svinuty, neporušený NT-4/5 (z HPLC kroku na SP-Sepharose HP nebo PolyCAT), byly spojeny a zahuštěny ve 20 mM acetátovém formulačním pultu, pH 4 až 5 na koncentraci 1 až 5 mg/ml. Příležitostně byl NT-4/5 formulován použitím ultrafiltrace/diafiltrace.

Celý konečný roztok byl analyzován aminokyselinovou analýzou, N-koncovou sekvenční analýzou, hmotnostní spektrometrií, SDS elektroforézou (Obrázek 13) a biologickými stanoveními. Pro charakterizaci purifikovaného rhNT-4/5 bylo použito stanovení aktivace kinázového receptoru (KTRA), který detekuje aktivaci autofosforylace tyrosin kinázových receptorů (trkB) NT-4/5, lokalizovaných v buněčné membráně Byly použity CHO buňky, které exprimují trkB s gD tag. WO 95/14930, publikovaný 1. čeiwna 1995, popisuje KIRA stanoveni a je zde začleněn jako odkaz. rhNT-4/5 měl v tomto stanovení hodnotu EC50 12,6 ng/ml. Typická hodnota EC50 správně svinutého neporušeného NT-4/5, purifikovaného stejným způsobem jaký je zde popsaný, je 5 až 30, ještě výhodněji 10 až 20.

Čistota rhNT-4/5 s ohledem na jiné proteiny než NT-4/5 byla většinou 90 až. 99 %. Homogenita NT-4/5 s ohledem na karbainylované a na N-konci zkrácené varianty byla od 90 do 99 %. Nej typičtěji a výhodněji jsou čistota a homogenita 99 % a vyšší

Příklad Vlil. Úvodní purifikace, znovusvinutí a konečná purifikace rhNT-4/5 z bakteriálních inkluzních tělísek

Aby byla izolována inkluzni tělíska z buněčných zbytků, byla pasta (1 kg) NT-3 z A. coii resLispendována v 10 1 100 mM octanu sodného, pH 5 v rotačním mechanickém disperzním zařízeni např. turrax. Buněčná suspenze byla 3x protlačena mikrofiuidizerem při tlaku 6000 psi. Vzniklý homogenát byl odstředěn v odstředivce Sorvall RC-3B pri 5000 rpm 30 minut

NT-3 byl izolován z inkluzních tělisek následovně Pelety inkluzních tělisek byly suspendovány do roztoku 100 mM Tris, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 100 mM siričitanu sodného 7,5 M močoviny, pH 8,3 (10 ml/gram inkluzních tělísek) v zařízení turrax pri střední rychlosti po dobu asi 10 minut. Suspenze byla míchána asi 1 hodinu při 2 až 8 °C. PEI (polyetylenimin) byl přidán do přibližně 0,15 % (konečná koncentrace) a míchán při 2 až 8 °C 30 minut. Směs byla odstředěna na odstředivce Sorvall RC3B při 5000 rpm po dobu asi 30 minut Supernatant byl • « « · • · · · * · * · · · « Β ·· «· přefiltrován přes kolonu Gelman Preflow. Přefiltrovaný supernatant byl naředěn 3 objemy ekvilibračního pufru pro chromatografii na koloně S-Sepharose Fast Flow (50 mM octan sodný,

M močovina, pH 5). Naředěný přefiltrovaný supernatant (vodivost menší než 7 mS) je nanesen na kolonu S-Sepharose FF, ekvilibrovanou roztokem 50 mM octanu sodného, 5 M močoviny, pH 5. Kolona byla nejdříve promyta roztokem 50 mM octanu sodného, 5 M močoviny, pH 5, následovalo promytí roztokem 50 mM MOPS, 5 M močoviny, 10 mM glycinu, pH 7. Sulfitolyzovaný NT-3 byl eluován z kolony použitím 10 objemů kolony gradientu 0 až 0,6 M NaCl v roztoku 50 mM MOPS, 5 M močoviny, 10 mM glycinu, pH 7

Částečně purifikovaný NT-3 byl znovusvinut zředěním spojených frakcí po chromatografii na koloně S-Sepharose FF na koncentrací proteinu přibližně 0,1 mg/ml v pufru pro znovusvinovám, obsahujícím 0,1 M Tris, 2 M močovinu, 0,1 M NaCl, 15 % PEG 300, 10 mM glycin, 25 mM cíanolamin, pH 9,1 Znovusvinování bylo iniciováno přídavkem cysteinu do koncentrace přibližně 5 mM a mícháno při 2 až 8 °C podobu 2 až 5 dní. Aby byla snížena koncentrace kyslíku v roztoku, kde dochází ke znovusvinování, může být pufr, ve kterém proces znovusvinování probíhá, probubláván heliem nebo argonem.

pH preparátu po svinutí bylo upraveno na hodnotu pH 7, vzorek byl přefiltrován a nanesen na kolonu pro ionexovou chromatografii na katexu Macroprep High S, ekvilibrovanou v 50 mM HEPES, pi l 7. Po nanesení preparátu s upraveným pH na kolonu Macroprep byla kolona nejdříve promyta 50 mM MOPS, pH 7, následovaly 50 mM MOPS, OJ M TMAC, 0,3 M NaCl, pH 7. NT-3 byl eluován roztokem 50 mM MOPS, 0,25 M TMAC. 1,5 M NaCl, pH 7.

frakce spojené po chromatografii na koloně Macroprep byly dále purifikovaný na koloně Phenyl Sepharose fast flow High Substitution. Kolona byla ekvilibrována roztokem 50 mM HEPF.S, 1,5 M NaCl, pH 7 a frakce po této chromatografii byly přímo naneseny na kolonu Phenyl-Sepharose Kolona byla promyta ekvilibraČním pufrem a potom byl správně znovusvinutý NT-3 eluován použitím 15 objemů kolony gradientu od 50 mM HEPES, 1,5 M NaCl, pH 7 do 50 mM HEPES, 10 % alkoholu, pH 7. frakce byly analyzovány buď C4 HPLC nebo SDS elektroforézou a frakce, obsahující správně svinutý NT-3, byly spojeny dohromady

Frakce, spojené po chromatografii na koloně Phenyl-Sepharose, byly naředěný tak, aby vodivost byla menši než 25 mS (většinou asi 2 objemy vody) a vzorek byl nanesen na kolonu SPSepharose HP, předem ekvilibrovanou 25 mM MOPSO, pH 7. Kolona byla nejdříve promyta ekvilibraČním pufrem a NT-3 byl eluován použitím 20 objemů kolony gradientu od 0,35 M TMAC do 0,65 M TMAC v 25 mM MOPSO, pH 7. Frakce, obsahující rhNT-3 (usuzováno podle výsledků C4 HPLC), byly spojeny • »

• · · · • · · ♦ ··· ··« • · «« ··

Frakce po chromatografii na koloně na SP-Sepharose HP byly zahuštěny na koncentraci asi I mg/ml na membráně s vylučovacím limitem molekulové hmotnosti 10 000 a potom byly diafiltrovány 6 objemy roztoku 10 mM octanu, 140 mM NaC!, pH 5,0.

• · » » • · · · · *·*«»« « * ♦ · · 9 • · * « · » · ·»* 999 • 9 ·· ·

SEZNAM SEKVENCÍ (1) OBECNÉ INFORMACE (i) PŘIHLAŠOVATEL: Genetech, lne.

(ii) NÁZEV VYNÁLEZU: Purifikace neurotrofinů (iii) POČET SEKVENCÍ: 6 (iv) ADRESA PRO KORESPONDENCI (A) ADRESÁT: Genetech, lne.

(B) ULICE: 1 DNA Way (C) MĚSTO: Jižní San Francisco (D) STÁT: Kalifornie (E) ZEMĚ: USA (F) SMĚROVACÍ ČÍSLO: 94080 (v) POČÍTAČOVÉ ÚDAJE:

(A) TYP MÉDIA: disketa 3,5 palce, 1,44 Mb floppy disk (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilní (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: WinPatin (Genetech) (vi) SOUČASNÁ APLIKAČNÍ DATA:

(A) ČÍSLO APLIKACE:

(B) DATUM PODÁNÍ (C) KLASIFIKACE:

(vii) PŘEDCHOZÍ APLIKAČNÍ DATA:

(A) ČÍSLO APLIKACE: 60/030838 (B) DATUM PODÁNÍ: 15 listopad 1996 (vii) PŘEDCHOZÍ APLIKAČNÍ DATA:

(A) ČÍSLO APLIKACE: 60/047855 (B) DATUM PODÁNÍ: 29. květen 1997 (viii) ÚDAJE O PRÁVNÍM PORADCI:

(A) JMÉNO: Timothy E. Torchia, PhD, (B) ČÍSLO REGISTRACE: 36 700 (C) POŘADOVÉ/JEDNACÍ ČÍSLO: P1063R2PCT (ix) TELEKOMUNIKAČNÍ ÚDAJE:

(A) TELEFON: 650/225-8674 (B) TELEFAX: 650/952-9881 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 1 (i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY (A) DÉLKA: 241 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TOPOLOGIE: Lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 1:

Met 1

Ser

Met

Leu

Phe 5

Tyr

Thr

Leu

lle

Thr 10

Ala

Phe

Leu

lle

Gly 15

lle

Gyn

Ala

Glu

Pro

Ilis

Ser

Glu

Ser

Asn

Val

Pro

Ala

Gly

His

20

25

30

Thr

lle

Pro

Gin

Val

His

Trp

Thr

Lys

Leu

Gin

His

Ser

Leu

Asp

35

40

45

Thr

Ala

Leu

Arg

Ala

Arg

Ser

Ala

Pro

Ala

lle

Ala

50

55

60

Ala

Arg

Val

Ala

Gly

Gin

Thr

Arg

Asn

lle

Thr

Val

Asp

Pro

Arg

65

70

75

Leu

Phe

Lys

Arg

Leu

Arg

Ser

Pro

Arg

Val

Leu

Phw

Ser

80

85

90

Thr

Gin

pro

Pro

Arg

Glu

Ala

Asp

Thr

Gin

Asp

Leu

Asp

Phe

95

100

105

• v * · « • ·

Glu

Val

Gly

Ala 110

Ala

Pro

Phe

Asn

Arg 115

Thr

His

Arg

Ser

Lys 120

Arg

Ser

His

Pro

lle

Phe

His

Arg

Gly

Glu

Phe

Ser

Val

125

130

135

Cys

Asp

Ser

Val

Ser

Val

Trp

Val

Gly

Asp

Lys

Thr

Ala

Thr

140

145

150

Asp

Ile

Lys

Gly

Tys

Glu

Val

Met

Val

Leu

Gly

Glu

Val

Asn

Ile

155

160

165

Asn

Ser

Val

Phe

Lys

Gin

Tyr

Phe

Glu

Thr

Lys

Cys

Arg

170

175

180

Asp

Pro

Asn

Pro

Val

Asp

Ser

Gly

Cys

Arg

Gly

Ile

Asp

Ser

Lys

185

190

195

His

Trp

Asn

Ser

Tyr

Cys

Thr

Elis

Thr

Phe

Val

Lys

Ala

200

205

210

Leu

Thr

Met

Asp

Gly

Lys

Gin

Ala

Trp

Arg

Phe

Ile

Arg

Ile

215

220

225

Asp

Thr

Ala

Cys

Val

Cys

Val

Leu

Ser

Arg

Lys

Ala

Val

Arg

230 235 240

Ala

241 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO 2 (i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:

(A) DÉLKA: 120 aminokyselin (13) TYP: aminokyselina (C) TOPOLOGIE Lineární

(xi)	POPIS SEKVENCE:	SEQ ID NO:2
Ser Ser	Ser His Pro Ile	Phe His Arg	Gly Glu Phe Ser	Val Cys
1	5		10	15

* 4 ·♦*» «

Asp

Ser

Val

Ser

Val 20

Trp

Val

Gly

Asp

Lys 25

Thr

Ala

Thr

Asp 30

Ile

Lys

Gly

Lys

Giu

Val

Met

Val

Leu

Gly

Glu

Val

Asn

Ile

Asn

35

40

45

Asn

Ser

Val

Phe

Arg

Glu

Tyr

Phe

Glu

Thr

Lys

Cys

Arg

Asp

50

55

60

Pro

Asn

Pro

Val

Asp

Ser

Gly

Cys

Arg

Gly

Ile

Asp

Ser

Lys

His

65

70

75

Trp

Asn

Ser

Tyr

Cys

Thr

His

Thr

Phe

Val

Lys

Ala

Leu

80

85

90

Thr

Met

Asp

Gly

Lys

Gin

Ala

Trp

Arg

Phe

Ile

Arg

Ile

Asp

95

100

105

Thr

Ala

Cys

Val

Cys

Val

Leu

Ser

Arg

Lys

Ala

Val

Arg

Ala

110

115

120

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:3:

(i) SEKVENČNÍ CHARAK TERISTIKY:

(A) DÉLKA: 120 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TOPOLOGIE: Lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:3:

Ser 1

Ser

Thr

His

Pro 5

Val

Phe

His

Met

Gly 10

Glu

Phe

Ser

Val

Cys 15

Asp

Ser

Val

Ser

Val

Trp

Val

Gly

Asp

Lys

Thr

Ala

Thr

Asp

20

25

30

Ile

Lys

Gly

Eys

Glu

Val

Thr

Val

Leu

Ala

Glu

Val

Asn

Ile

Asn

35

40

45

Asn

Ser

Val

Phe

Arg

Gin

Tyr

Phe

Glu

Thr

Lys

Cys

Arg

Ala

50

55

60

51

4 ·*·

• 4

• 4 4 «

Ser

Asn

Pro

Val

Glu

Ser

Gly

Cys

Arg

Gly

Ile

Asp

Ser

Lys

His

65

70

75

Trp

Asn

Ser

Tyr

Cys

Thr

His

Thr

Phe

Val

Lys

Ala

Leu

80

85

90

Thr

Asp

Glu

Lys

Gin

Ala

Trp

Arg

Phe

Ile

Arg

Ile

Asp

95

100

105

Thr

Ala

Cys

Val

Cys

Val

Leu

Ser

Arg

Lys

Ala

Thr

Arg

Gly

110 115 120 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:4:

(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:

(A) DÉLKA: 118 aminokyselin

(B) TYP:

aminokyselina

(C) TOPC

*LOGI

E: Lin

eární

(xi)

POP

IS SE

KVLNCE: SEQ 11

DNO

:4:

His

Ser

Asp

Pro

Ala

Arg

Gly

Glu

Leu

Ser

Val

Cys

Asp

Ser

1

5

10

15

Ile

Ser

Glu

Trp

Val

Thr

Ala

Asp

Lys

Thr

Ala

Val

Asp

20

25

30

Met

Ser

Gly

Thr

Val

Thr

Val

Leu

Glu

Lys

Val

Pro

Val

Ser

35

40

45

Lys

Gly

Gin

Leu

l.ys

Gin

Tyr

Plic

Tyr

Glu

Thr

Lys

Cys

Asn

Pro

50

55

60

Met

Gly

Tyr

Thr

Lys

Glu

Gly

Cys

Arg

Gly

Ile

Asp

Lys

Arg

His

65

70

75

Trp

Asn

Ser

Gin

Cys

Arg

Thr

Gin

Ser

Tyr

Val

Arg

Ala

Leu

80

85

90

Thr

Met

Asp

Ser

Lys

Arg

Ile

Gly

Trp

Arg

Phe

Ile

Arg

Ile

95

100

105

* ·· · • « * • »··# 4 4 « *4 4

4 «4 4

4

4· * · · · • · · 4 ··· 444 • 4 ·· Se

Asp Thr Ser Cys Val Thr Leu Thr Ile Lys Arg Gly Arg 110 115 118 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:5:

(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:

(A) DÉLKA. 119 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TOPOLOGIE: Lineární (xi) POPIS SEKVENCE SEQ ID NO: 5:

Tyr 1

Ala (

Glu

His

Lys 5

Ser

His

Arg

Gly

Glu 10

Tyr

Ser

Val

Cys

Asp 15

Ser

Glu

Ser

Leu

Trp

Val

Thr

Asp

Lys

Ser

Ala

Ile

Asp

Ile

20

25

30

Arg

Gly

His

Gin

Val

Thr

Val

Leu

Gly

Glu

Ile

Lys

Thr

Gly

Asn

35

40

45

Ser

Pro

Val

Eys

Gin

Tyr

Phe

Tyr

Glu

Thr

Arg

Cys

Lys

Glu

Ala

50

55

60

Arg

Pro

Val

Lys

Asn

Gly

Cys

Arg

Gly

Ile

Asp

Lys

His

Trp

65

70

75

Asn

Ser

Gin

Cys

Lys

Thr

Ser

Gin

Thr

Tyr

Val

Arg

Ala

Leu

Thr

80

85

90

Ser

Glu

Asn

Lys

Leu

Val

Gly

Trp

Arg

Ί rp

Ile

Arg

Ile

Asp

95

100

105

Thr

Ser

Cys

Val

Ser

Ala

Leu

Ser

Arg

Lys

Ile

Gly

Arg

Thr

110

115

119

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:6 (i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY (A) DÉLKA: 130 aminokyselin ···

9

9999

J · · · * · 9 9 *·· 999 • 9 ·· 99 (B) TYP. aminokyselina (C) TOPOLOGIE: Lineární (xi) POPIS SEKVENCE SEQ ID NO:6:

Gly 1

Val

Ser

GIu

Thr 5

Ala

Pro

Ala

Ser

Arg 10

Arg

Gly

Glu

Leu

Ala 15

Val

Cys

Asp

Ala

Val

Ser

Gly

Trp

Val

Thr

Asp

Arg

Thr

Ala

20

25

30

Val

Asp

Leu

Arg

Gly

Arg

Glu

Val

Glu

Val

Leu

Gly

Glu

Val

Pro

35

40

45

Ala

Gly

Ser

Pro

Leu

Arg

Gin

Tyr

Phe

Glu

Thr

Arg

50

55

60

Cys

Lys

Ala

Asp

Asn

Ala

Glu

Gly

Pro

Gly

Ala

Gly

65

70

75

Gly

Cys

Arg

Gly

Val

Asp

Arg

His

Trp

Val

Ser

Glu

Cys

80

85

90

Lys

Ala

Lys

Gin

Ser

Tyr

Val

Arg

Ala

Leu

Thr

Ala

His

Ala

Gin

95

100

105

Gly

Arg

Val

Gly

Trp

Arg

Trp

Ile

Arg

Ile

Asp

Thr

Ala

Cys

Val

110

115

120

Cys

Thr

Leu

Ser

Arg

Thr

Gly

Arg

Ala

125

130

* 4

Claims

1. Způsob izolace neurotrofinu ze směsi, obsahující jiné proteiny, vyznačující se tím, že k separaci neurotrofinu od jiných proteinů ve směsi je použita chromatografie s hydrofobní interakcí.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím , že směs obsahuje chybně svinutou variantu, chybně proteolyticky zpracovanou variantu nebo glykosylační variantu neurotrofinu.

3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že separace zahrnuje nanesení směsi, obsahující neurotrofin a chybně svinutou variantu, chybně proteolyticky zpracovanou variantu nebo glykosylační variantu neurotrofinu, na pryskyřici pro chromatografii s hydrofobní interakcí a eluci neurotrofinu z pryskyřice za podmínek, kdy je neurotrofin separován od varianty nebo variant

4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že pryskyřice obsahuje fenylovou funkční skupinu.

5. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že směs, nanesená na pryskyřici pro chromatografii s hydrofobní interakci, má pH od 5 do 8.

6. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že směs nanesená na pryskyřici má koncentraci soli 0,5 M až 3 M.

7 Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že směs, nanesená na pryskyřici má koncentraci soli 0,5 M až 2,5 M.

8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že, směs, nanesená na piyskyřici má koncentraci soli 0,7 M octan nebo 1,0 M až 2,5 M NaCl.

9. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že eluční pufr obsahuje organické rozpouštědlo

10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že organické rozpouštědlo je 5 % až 20 % (objemově).

11. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že pH elučního pufru je 5 až 8.

12. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že eluce obsahuje klesající gradient koncentrace soli,

13. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že neurotrofin je v NGT nadrodině

14. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že neurotrofin je NGF, NT-4/5 nebo NT-3.

15 Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že neurotrofin je připraven z bakteriální kultury a je znovusvinut in vitro před použitím pryskyřice pro chromatografii s hydrofobní interakcí.

16. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že neurotrofin je izolován z kultury savčích buněk « « ·

17 Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že dále obsahuje separaci neurotrofinu od jeho chemických variant použitím vysokoúčinné ionexové chromatografie na katexové pryskyřici.

18. Způsob podle nároku 17, vyznačující se tím, že separační krok, zahrnující vysokoúčinnou ionexovou chromatografii na katexu, se skládá z nanesení směsi, obsahující neurotrofm a chemickou variantu tohoto neurotrofinu, na kolonu katexové pryskyřice pro vysokoúčinnou ionexovou chromatografii a z eluce neurotrofinu z pryskyřice za takových podmínek, za kterých se neurotrofm separuje od chemické varianty.

19. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, že pryskyřice pro ionexovou chromatografii na katexu je SP-Sepharose IIP, pryskyřice s polyasparágovou kyselinou, polysulfoethyl katex nebo Fractogel EMD SO3

20 Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, že eluát z katexové kolony, obsahující neurotrofm, je odsolen nebo podroben diafiltraci a potom je formulován s nosičem.

21. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že dále zahrnuje separaci neurotrofinu od jiných proteinů použitím silikagelové pryskyřice.

22 Způsob izolace neurotrofinu ze směsi proteinů, vyznačující se tím, že zahrnuje separací neurotrofinu od jiných proteinů použitím silikagelové pryskyřice

23. Způsob izolace neurotrofinu od chemické varianty tohoto neurotrofinu, vyznačující se tím, že zahrnuje separaci neurotrofinu od jeho chemické varianty použitím vysokoúčinné ionexové chromatografie na katexu.

24 Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, že neurotrofm a jeho varianta jsou před separací téměř čisté.

25. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, že pryskyřice je SP-Sepharose HP, pryskyřice s polyasparagovou kyselinou, Latexová pryskyřice polysulfoethyl nebo Fractogel EMD SO3.

26. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, že dále případně zahrnuje krok, ve kterém je separován neurotrofm od chybně svinuté varianty tohoto neurotrofinu, použitím preparativní kapalinové chromatografie s reverzní fázi.

27. Způsob podle nároku 26, vyznačující se tím, že pryskyřice obsahuje funkční skupinu C4.

28 Neurotroíínový prostředek, vyznačující se tím, že byl připraven podle způsobů nároků 1, 22 nebo 23.

29. Prostředek, vyznačující se tím, že nosič a neurotrofm je téměř čistý a homogenní, protože je téměř bez obsahu jeho variant.

30 Prostředek podle nároku 29, vyznačující se tím, že je sterilní

31 Způsob čistění neurotrofinu, vyznačující se tím, že zahrnuje:

··*· · « (a) nanesení směsi, obsahující neurotrofin a jeho variantu, na pryskyřici pro chromatografii s hydrofobní interakcí při pH 5 až 8, (b) promytí pryskyřice pufrem při pH 5 až 8;

(c) eluci neurotrofinu pufrem při pH 5 až 8, obsahujícím alkoholické nebo polární aprotické rozpouštědlo v koncentrací asi 5 až 25 % (v/v);

(d) nanesení eluentu, obsahujícího neurotrofin, na pryskyřici pro vysokoúčinnou ionexovou chromatografii na katexu při pH 5 až 6; a (e) eluci neurotrofinu z pryskyřice pro vysokoúčinnou ionexovou chromatografii na katexu pufrem při pH 5 až 6, obsahujícím kation v koncentraci 0,2 až 0,5 M.