DE60038737T2

DE60038737T2 - Modifiziertes cytokin für seine stabilizierung

Info

Publication number: DE60038737T2
Application number: DE60038737T
Authority: DE
Inventors: Helena Domingues; Hartmut Oschkinat; Luis Serrano; Joerg Peters
Original assignee: Europaisches Laboratorium fuer Molekularbiologie EMBL; Bayer AG
Current assignee: Europaisches Laboratorium fuer Molekularbiologie EMBL; Bayer Pharma AG
Priority date: 1999-05-26
Filing date: 2000-05-23
Publication date: 2009-07-02
Anticipated expiration: 2020-05-24
Also published as: WO2000073460A3; EP1183360B1; ES2304957T3; AU4943200A; EP1183360A2; US7112660B1; JP2003501035A; CA2372566A1; GB9912350D0; DE60038737D1; WO2000073460A2

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Stabilisierung von Cytokinen, sowie Cytokine, die durch solche Verfahren hergestellt werden. Insbesondere schließen die erfindungsgemäßen Verfahren Schritte mit ein, bei welchen Zwischenprodukte, die während der Faltung des Cytokins gebildet werden, im Verhältnis zum Cytokin in dessen natürlichen gefalteten Zustand destabilisiert werden. Dies führt zu einem Anstieg der Ausbeute des in vitro produzierten Cytokins.
Cytokine sind kleine Proteine von zwischen ca. 8 bis 80 kDa, und spielen sowohl bei der positiven als auch bei der negativen Regulation von Immunantworten eine zentrale Rolle, ebenso wie bei der Integrierung dieser Reaktionen mit anderen physiologischen Kompartementen, wie bspw. das endokrine und das hämatopoetische System.
Bisher wurden gut über einhundert unterschiedliche menschliche Cytokine identifiziert, die ein breites Spektrum an unterschiedlichen Funktionen besitzen. Diese Moleküle agieren durch die Bindung an spezifische Rezeptoren an der Zellmembran, wodurch eine Signalkaskade initiiert wird, die zur Induktion, Verstärkung oder zur Inhibierung einer Reihe von Cytokin-regulierten Genen führt. Es gibt verschiedene unterschiedliche Arten an Cytokinen, einschließlich den Interleukinen, Interferonen, Kolonie-stimulierenden Faktoren, Tumor-Nekrosefaktoren, Wachstumsfaktoren und Chemokinen. Diese Cytokine arbeiten zusammen in einem komplexen Netzwerk, in welchem die Produktion eines Cytokins im Allgemeinen die Produktion oder die Antwort auf mehrere andere Cytokine beeinflusst.
Klinisch betrachtet spielen Cytokine eine wichtige Rolle in mehreren Bereichen der Medizin, einschließlich ihrer Verwendung als entzündungshemmende Stoffe, sowie als Stoffe zur Behandlung einer Anzahl von Krebsarten, einschließlich des Nicht-Hodgkins-Lymphom, das multiple Myelom, Haut- und Eierstockkrebs. Ferner werden Cytokine bei der Behandlung von HIV, der Multiplen Sklerose, Asthma und allergische Erkrankungen eingesetzt.
Die Aktivität der Cytokine kann durch Blockieren der Wechselwirkung des spezifischen Cytokins mit seinem Rezeptorsystem inhibiert werden, wodurch die intrazellulären Signale unterdrückt werden, die für die biologischen Effekte des Cytokins verantwortlich sind. Die Strategien, die gegenwärtig verfügbar sind, um Wechselwirkungen zwischen Cytokinen und Rezeptoren zu blockieren, schließen im Allgemeinen die Verwendung von monoklonalen Antikörpern gegen das Cytokin oder gegen den Rezeptor mit ein. Darüber hinaus können lösliche Rezeptoren sowie Cytokin-Rezeptor-Antagonisten eingesetzt werden (siehe Finkelman et al. 1993; Rose John Heinrich, 1994). Rezeptor-Antagonisten sind Mutanten des Wildtyp-Cytokins, die mit hoher Affinität an Cytokin-Rezeptoren binden können, die jedoch nicht dazu in der Lage sind, eine Signaltransduktion zu induzieren, weshalb sie auch keine biologische Antwortreaktion auslösen. Im Falle von IL-4 wurde in der Literatur von zwei effizienten Antagonisten berichtet, die an den IL-4-Rezeptor alpha mit einem K_d-Wert binden, der dem des Wildtyp-Proteins ähnlich ist, die jedoch eine zweite Rezeptorkomponente nicht rekrutieren können.
Nichtsdestotrotz bleibt das therapeutische Potenzial löslicher Rezeptoren und monoklonaler Antikörper eher begrenzt, gerade aufgrund der hierfür benötigten hohen Dosen, sowie aufgrund der möglichen Immunogenizität dieser Proteine (Finkelman et al. 1993: Maliszewski et al. 1994).
Aus diesen Gründen wurde der möglichen Verwendung von Cytokin-abgeleiteten Antagonisten als therapeutische Moleküle eine große Aufmerksamkeit gewidmet. Diese neue Generation an Biopharm aka soll eine niedrigere Toxizität im Vergleich zu anderen Substanzen besitzen (Buckel, 1996).
Daneben gibt es noch mehrere praktische Gründe, warum ein Interesse an der Optimierung der Produktion von Cytokinen (Cytokin-Antagonisten) in Bakterien, wie bspw. E. coli, besteht. Obgleich mehrere eukaryotische Expressionssysteme, einschließlich das der Insekten, der Pilze, Hefe, sowie Säugetier-Zelllininen in jüngerer Zeit entwickelt wurden, macht die relative Einfachheit der Bakterien diese Organismen in den meisten Fällen zu vorteilhaften Wirten. So besitzt bspw. Escherichia coli eine schnelle Wachstumsrate (typische Verdoppelungszeit von 20 Minuten), ist ferner einfach zu handhaben, sowie hinsichtlich der Proteinexpression und hinsichtlich Mutanten einfach zu screenen, und wächst darüber hinaus in einem relativ billigen Medium. Als Konsequenz dieser Vorteile werden die meisten Protein-Arzneimittel, die gegenwärtig auf dem Markt verfügbar sind, durch eine Fermentation in großem Maßstab von E. coli produziert, das das Gen von Interesse trägt (Steven et al. 1998). Obgleich diese Kultursysteme mit hoher Zelldichte für E. coli ziemlich gut etabliert sind, ist über deren Effizienz und Lebensfähigkeit mit anderen Wirtsorganismen wenig bekannt.
So schließen Nachteile, die mit der Verwendung von E. coli und anderen prokaryotischen Expressionssystemen im Zusammenhang stehen, allgemein die Tendenz dieses Organismus mit ein, heterologes Protein in so genannten "Inclusion Bodies" (Ein – schlusskörperchen) zu bilden, ferner das Fehlen Port-translationaler Modifikationen, eine ineffiziente Translation humaner mRNA durch die bakteriellen Ribozyme, eine charakteristische Codon-Verwendung, sowie die Unfähigkeit, Sulfidbrücken im Cytoplasma zu bilden. Diese Tatsachen beeinflussen die Faltung und die Stabilität des exprimierten Proteins, und können zu einer Aggregation führen.
Faktoren, die die Bildung von Inclusion Bodies in E. coli beeinflussen, schließen die Temperatur beim Zellwachstum, die Co-Expression mit Chaperonen, die Verwendung von Fusionsproteinen, die Sekretion des Proteins ins Periplasma, die Verwendung unterschiedlicher Expressionsstämme sowie die Expression des Proteins mit dessen Pro-Sequenz mit ein. Modifizierungen dieser Verfahren sind jedoch, wenn überhaupt, für die Lösung dieses Problems nur teilweise effektiv.
Es wird bemerkt, dass die Bildung von Inclusion Bodies keineswegs ein seltenes Phänomen ist, das auf E. coli beschränkt ist. Es wurde vielmehr auch bei eukaryotischen Expressionssystemen beobachtet, wie bspw. für Saccharomyces cerevisiae, und sogar bei Säugetierzellen, sowohl bei inhärenten als auch bei heterologen Proteinen (Bowden und Georgiou, 1990).
Ein obligatorischer Schritt bei der Gewinnung eines Proteins aus Inclusion Bodies beinhaltet die Verwendung denaturierender, chaotroper Agenzien, wie bspw. Harnstoff oder GudnHCl (Guanidiniumchlorid)-Detergenzien oder extreme pH-Werte, um die Aggregate aufzulösen. Renaturierungsprotokolle sind jedoch leider selten einfach, und die Reinigung eines Proteins aus Inclusion Bodies in einer brauchbaren Menge stellt im Allgemeinen eine bedeutende Herausforderung dar. Oftmals fällt das Protein von Interesse während der Rückfaltung aus, oder kann aufgrund des Vorliegens des denaturierenden Agens irreversiblen chemischen Modifikationen unterzogen werden.
Bei der Auswahl einer Strategie für die kommerzielle Produktion eines Proteins muss bedacht werden, dass die Bedingungen, die für Wachstumstests in kleinem Maßstab ausgearbeitet wurden, auch effektiv sein müssen, wenn der Prozess mit Fermentationen im großen Maßstab durchgeführt wird. So garantiert bspw. die Tatsache, dass die Co-Überexpression eines gegebenen Zielproteins mit Chaperonen dessen Löslichkeit in einer 1-Liter-Schüttelflasche erhöht, nicht, dass das gleiche auch während einer 1000-Liter-Fermentation beobachtet wird. Es ist daher wünschenswert, einfache Lösungen für das komplexe Problem der Inclusion Bodies zu finden.
Im Falle von Proteinen mit Disulfid-Brücken, wie bspw. Cytokinen, wurde gezeigt, dass die Umwandlung von reduzierten in oxidierte Proteine über eine Reihe von Zwischenprodukten verläuft, die durch nicht-native intramolekulare Disulfid-Brücken charakterisiert sind (Creighton, 1997; De Felippis et al., 1993; Youngman et al., 1995). Für die Katalyse der Bildung und der Wiederherstellung von Disulfid-Brücken in ihre native Ausbildung sind verschiedene Agenzien verfügbar, obgleich die optimalen Bedingungen für eine vollständige, korrekte, oxidative Rückfaltung selten gefunden werden können. Daher wird während der in vitro-Faltung der meisten Disulfid-enthaltenen Proteine, wie bspw. Cytokine, eine Reihe an Isoformen gewonnen. Einige dieser Isoformen fällen aus und die native Isoform, die oftmals nur einen kleinen Anteil ausmacht, muss mittels HPLC von den anderen Isoformen getrennt werden. Obwohl das in Inclusion Bodies akkumulierte Protein oftmals für die Gewinnung der erwünschten Menge des reinen Proteins ausreichend scheint, ist der während der Aufbereitung der Inclusion Bodies und der Rückfaltung des Proteins auftretende Verlust so groß, dass nur eine unbedeutende Menge des aktiven Proteins wiedergewonnen werden kann.
Das therapeutische Potenzial von Cytokin-abgeleiteten Antagonisten wird daher aufgrund der Tatsache, dass diese Proteine nur schwierig in großen Mengen und auf kostspielige Art und Weise produziert werden können, verringert. Dies ist darauf zurückzuführen, dass sie zur Bildung von Inclusion Bodies tendieren, wenn sie in E. coli überexprimiert werden und dass sie in vitro in nur sehr geringen Ausbeuten zurückgefaltet werden können.
Daher ist es von äußerster Wichtigkeit, Strategien auszuarbeiten, mit welchen eine effizientere Produktion von Cytokin-Antagonisten erreicht werden kann, sowie alternative Wege aufzufinden, um die Interaktion zwischen Cytokinen und deren Rezeptoren zu blockieren. Idealerweise wäre es wünschenswert, "small molecules" (kleine Moleküle) zu entwerfen, die mit den Cytokinen um die Bindung an deren Rezeptor konkurrieren können.
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es daher, mutierte Cytokine zu entwerfen, die entweder als lösliche Proteine in Bakterien oder als Proteine produziert werden, die effektiv in vitro gefaltet werden können. Eine solche Strategie würde die industrielle Produktion von Cytokin-Antagonisten günstiger und weniger aufwändig machen.
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Stabilisierung eines Cytokins bereitgestellt, das die folgenden Schritte aufweist:

a) Mutieren der Aminosäuresequenz des Cytokins derart, dass Lösungsmittelexponierte hydrophobe Reste durch Aminosäuresubstitution entfernt werden; und
b) Mutieren der Aminosäuresequenz des Cytokins derart, dass Helixstabilisierende Reste eingebaut werden;

Mit dem Verfahren gemäß der Erfindung konnte gezeigt werden, dass eine Stabilisierung der Cytokine ermöglicht wurde, so dass sie mit geringen Kosten und mit großem Volumen rekombinant produziert werden können. Dieses Verfahren ebnet den Weg für eine günstige Produktion dieser Moleküle, wodurch der Einsatz dieser Moleküle bei breit gefächerten Therapien in einer Vielzahl wichtiger Krankheiten ermöglicht wird.
Erfindungsgemäß kann jedes Cytokin stabilisiert werden, einschließlich Interleukine, Interferone, Kolonie-stimulierende Faktoren, Tumor-Nekrose-Faktoren, Wachstumsfaktoren und Chemokine.
Bevorzugte Cytokine für die Stabilisierung gemäß der vorliegenden Erfindung sind "Vier-Helix-Bündel"-Cytokine, die zur hämatopoetischen oder zur Klasse-1-Cytokin-Superfamilie gehören. Die dreidimensionale Struktur dieser Proteine besteht aus einem Bündel mit Vier-Helices mit einer "hoch-hoch-runter-runter"-Topologie, einschließlich dreier Disulfid-Brücken.
Basierend auf der Länge der Polypeptidkette und auf strukturellen Merkmalen können in dieser Superfamilie zwei Unterfamilien identifiziert werden. Darüber hinaus werden die Interferone häufig dahingehend beurteilt, dass sie innerhalb der "Vier-Helix-Bündel"-Cytokine eine dritte Unterfamilie bilden.
Mitglieder dieser Superfamilie schließen das humane Wachstumshormon (HGH) mit ein, ferner den Granulocyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF), den Granulocyten-Kolonie-stimulierenden Faktor (G-CSF), den Leukämieinhibitorischen Faktor (LIF), Erythropoetin (EPO), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-13, den ciliären neurotrophischen Faktor (CNTF), Oncostatin (OSM) und die Interferone, und andere. Einige dieser bekannten Mitglieder dieser drei Subfamilien, die Strukturen ähnlich zu IL-4 besitzen, sind in der nachstehenden Tabelle 1 aufgeführt.
Ein herausragendes Merkmal der hämatopoetischen Cytokin-Superfamilie liegt darin, dass die Familienmitglieder trotz ihrer üblichen Form nur eine geringe oder überhaupt keine Sequenzhomologie aufweisen. Jedoch legt die Tatsache, dass diese Proteine sämtlich extrazelluläre Signal-Moleküle sind, dass sie ferner die gleiche einmalige Vier-Helix-Bündel-Topologie und eine ähnliche Gen-Organisation aufweisen, nahe, dass sie alle durch einen Prozess der divergenten Evulution verwandt sind.

Cytokine mit einem Vier-Helix-Bündel binden an eine Klasse von Rezeptoren, die als Hämatopoetin-Rezeptor-Superfamilie oder Typ-1-Cytokin-Rezeptor-Superfamilie bekannt sind. Diese Rezeptoren weisen eine extrazelluläre Cytokin-bindende Domäne auf, die innerhalb der Familie stark homolog ist, eine einzelne Transmembrandomäne sowie eine intrazelluläre Domäne auf, der die intrinsische Tyrosinkinaseaktivität fehlt. Die extrazelluläre Domäne besitzt vier konservierte Cysteine und ein charakteristisches Tryptophan-Serin-X-Tryptophan-Serin-Motiv (die so genannte Tryptophan-Box), von der angenommen wird, dass sie für eine effiziente Rezeptorfaltung wichtig ist (siehe die Übersicht von Bazan, 1990 und Gullberg et al. 1995). Tabelle 1: Rezeptorbindung innerhalb der hämatopoetischen Familie

Tabelle 1 Klasse 1 Hämatopoetische Cytokin-Superfamilie
Unterklasse	Beispiele mit bekannten Strukturen	Vermutliche Mitglieder
kurze Kette lange Kette	IL-2, IL-4, IL-5^a GM-CSF, M-CSF GH, LIF, G-CSF, IL-6	IL-3, IL-7, IL-9, IL-13, IL-15 OSM, 1L-11, TPO IL-12, CNTF, PRL, EPO
Interferon	IFN-β und IFN-γ
CNTF: ciliärer neurotrophischer Faktor; EPO: Erythropoetin; OSM: Oncostatin; TPO: Thrombopoetin; LIF: Leukämie-inhibitorischer Faktor; PRL: Prolactin; IFN: Interferon. Das Protein ist ein nicht-covalentes Dimer; das Protein ist ein Disulfidverbundenes Dimer; diese Tabelle ist eine modifizierte und aktualisierte Version der Tabelle aus (Mott et al., 1995)

Das am gründlichsten untersuchte Cytokin-Rezeptorsystem ist dasjenige des humanen Wachstumshormons. Mit der Bestimmung der dreidimensionalen Struktur dieses Proteins, das an zwei Ketten des gleichen Rezeptors gebunden ist (de Vos et al., 1992), wurden die Grundsteine für das Verständnis der Prinzipien gelegt, die bei der molekularen Erkennung und in der Signaltransduktion durch Cytokine mit einem Vier-Helix-Bündel und deren Rezeptoren beteiligt sind. Aus den in der Literatur verfügbaren Daten über andere Cytokin-Rezeptorsysteme liegt es nahe, dass die Ligandeninduzierte Rezeptor-Homo- oder -Hetero-Oligomerisation eine allgemeine Strategie ist, die bei Mitgliedern der hämopatoetischen Cytokinfamilie verwendet wird.
Um die vorliegende Erfindung vollständig zu verstehen, ist es wichtig, einige der Prinzipien zu verstehen, die mit der Proteinfaltung im Zusammenhang stehen. Die gegenwärtig vorherrschende Theorie auf diesem Gebiet gibt vor, dass bei der Faltung der meisten der natürlich vorkommenden Proteine Faltungs-Zwischenprodukte existieren. Einige dieser Zwischenprodukte definieren den produktiven Faltungs-Weg zum nativen Protein, wohingegen andere Zwischenprodukte Arten abseits des Wegs repräsentieren, die Aggregate bilden können, wodurch das Protein irreversibel in eine nicht-native Konfiguration gezwungen wird (siehe Baldwin, 1996). Einige dieser Faltungs-Zwischenprodukte sind stabil und enthalten viele Sekundärstrukturen, die ähnlich zu denen des nativen Proteins sind, auch wenn ihnen die tertiären Wechselwirkungen fehlen, die für die native Form charakteristisch sind. Der native Zustand zeigt sich erst nach einer "Feineinstellung" der spezifischen Wechselwirkung dieser Zwischenprodukte. Unter diesem Gesichtspunkt wurde das Auftreten der Aggregation als Funktion der Löslichkeits- und Stabilitäts-Eigenschaften der Faltungs-Zwischenprodukte gesehen, und zwar bezüglich der Umgebung, in welcher die Faltungsreaktion stattfindet.
Arbeiten, im Rahmen derer Mutationen eingeführt wurden, mit welchen eine Reduzierung von Faltungs-Defekten bewirkt werden, verbunden mit Temperatursensitiven Substitutionen, haben gezeigt, dass es möglich ist, Faltungs-Prozesse zu optimieren, ohne die Aktivität und Stabilität des reifen Proteins zu verändern. Eine detaillierte Diskussion der Literaturstellen, die für das Problem der Protein-Faltung relevant sind, kann in der Doktorarbeit von Helena Domingues gefunden werden (1999 "Rational design strategies to improve cytokine foldability and minimisation of a functional motif: the IL-4 case" Universität von Utrecht. ISBN 90-393-2081-0).
Aus diesem Basiswissen der Literatur auf diesem Gebiet folgt, dass eine Aggregation von sowohl in vitro als auch in vivo hauptsächlich aus der Akkumulierung von sich faltenden Zwischenprodukten herrührt, die eine hohe Tendenz zur Assoziierung besitzen (Fink, A. L., 1998), und die nicht-native Wechselwirkungen etablieren, durch welche Proteine in inaktive Konformationen gelenkt werden (Booth et al., 1997). Die Faltung eines Proteins in eine einmalige 3D-Struktur ist in 1 gezeigt. Faltungs- Zwischenprodukte können deswegen akkumulieren, da es zwischen ihnen und dem Übergangszustand eine hohe Energieschranke gibt, und/oder weil die Energieschranke zwischen dem gefalteten Zustand und dem Übergangszustand niedrig ist. Im ersteren Fall, der in dieser Figur gezeigt ist, ist die Faltung langsam und die Konzentration der Faltungs-Zwischenprodukte ist hoch. Im zweiten Fall entfaltet sich der gefaltete Zustand häufig unter physiologischen Bedingungen, weshalb infolgedessen eine bedeutende Konzentration an Faltungszwischenprodukten vorliegen kann. Daher könnte die relative Destabilisierung von Faltungs-Zwischenprodukten und/oder die Stabilisierung des gefalteten Zustands, bezüglich des Faltungs-Übergangszustandes, eine effizientere Proteinfaltung unterstützen (Munoz et al., 1994a).
Die Erfindung betrifft auch Verfahren, die die Einführung von Aminosäuresubstitutionen beinhalten, die jedes entstehende Zwischenprodukt im Faltungsprozess für Cytokine selektiv destabilisieren. Die auf diese Weise erhaltenen Mutanten bleiben während der Expression entweder löslich und/oder falten sich in vitro effizienter. Gleichzeitig besitzen diese Mutanten eine ähnliche Aktivität wie das Wildtyp-Protein.
Ein erster Aspekt des erfindungsgemäßen Verfahrens beinhaltet die Mutation der Aminosäuresequenz des Cytokins derart, dass Lösungsmittel-exponierte hydrophobe Reste entfernt werden. Solche Aminosäuresubstitutionen beinhalten die Substitution hydrophober Reste (wie bspw. Valin, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Tryptophan, Methionin, Prolin) für polarere Reste (wie bspw. Lysin, Arginin, Histidin, Aspartat, Asparagin, Glutamat, Glutamin, Serin, Threonin, Tyrosin).
Dieser Aspekt des Verfahrens basiert auf der Beobachtung, dass Faltungs-Zwischenprodukte oftmals durch das Vorliegen einer bedeutenden Menge an Sekundärstrukturen und schlecht definierten Tertiärstrukturen charakterisiert sind, die durch hydrophobe Wechselwirkungen stabilisiert werden. Daher erscheint es plausibel, dass hydrophobe Reste, die im gefalteten Zustand (als Ergebnis der tertiären Faltung) exponiert sind, in einem gefalteten Zwischenprodukt versteckt sein werden. Die Mutation solcher Reste in polarere Aminosäuren bewirkt die Destabilisierung des Zwischenproduktes im Verhältnis zum gefalteten Zustand zum so genannten inversen hydrophoben Effekt. Eine schematische Darstellung des inversen hydrophoben Effekts ist in 2 gezeigt. Das Austauschen hydrophober Reste durch hydrophilere Reste sollte sowohl das denaturierte Ensemble als auch das Zwischenprodukt in Bezug auf den nativen Zustand destabilisieren. Dies wird die Faltungsrate erhöhen und kinetische Aggregationsprozesse reduzieren, die aus der Akkumulation der Zwischenprodukte herrühren.
Zur Identifizierung Lösungsmittel-exponierter Reste sind verschiedene Verfahren verfügbar, einschließlich der Verwendung von üblichen Computerprogrammen für molekulare Grafiken, wie bspw. RasMol (verfügbar unter http://www.umass.edu/microbio/rasmol/getras.htm), QUANTA^TM (Molecular Simulations Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121) und Sybyl^TM (Tripos Inc., 1699 South Hanley Rd., St. Louis, Missouri, 63114, USA). Darüber hinaus ist es nicht essenziell, dass die dreidimensionale Struktur eines Proteins bekannt ist. Immer mehr hochentwickelte Computerprogramme und Bioinformatikplattformen werden verfügbar, die, ausgehend von lediglich der Aminosäurensequenz, die Vorhersage einer Proteinstruktur mit hoher Genauigkeit ermöglichen. Die Position von Lösungsmittelexponierten Resten für ein Cytokin mit unbekannter Struktur kann auch aus einem homologen, orthologen oder nahe verwandten Cytokin, für welches die Struktur verfügbar ist, abgeleitet werden, und zwar durch Einsatz von Verfahren, bei denen die Homologie nachgeahmt wird oder von Aufspürverfahren (siehe Jones, D. T., 1997). Bei der Auswahl der Reste für die Mutation in diesem Verfahrensschritt sollten die Lösungsmittel-exponierten hydrophoben Reste idealerweise derart ausgewählt sein, dass sie im Cytokin von Interesse sowie anderen homologen oder naheverwandten Cytokinen nicht konserviert sind.
So sind bspw. im Falle von IL-4, Tryptophan 23 und Leucin 91 Lösungsmittelexponierte Reste in der humanen Sequenz: in den meisten der anderen Mitglieder der IL-4-Familie wird ein Serin-Rest (hydrophil) an dieser Position gefunden. Dementsprechend stellt entweder eines oder vorzugsweise beide dieser Reste eine gute Wahl für die Mutation dar. In diesem Fall ist Serin eine zu empfehlende Wahl für den zu ersetzenden Rest, da dieser Rest nicht nur hydrophil ist, sondern da auch seine Gegenwart an dieser Position in nahe verwandten IL-4-Proteinen, die hieraus gewonnene Erkenntnis stützt, dass sein Vorliegen an dieser Stelle für die Aktivität wahrscheinlich nicht schädlich ist, und sogar vorteilhaft sein kann.
Der zweite Aspekt der Erfindung beinhaltet die Mutation der Aminosäuresequenz des Cytokins derart, dass eine oder mehrere Sekundärstrukturelemente im Cytokin stabilisiert werden. In einem bevorzugteren Aspekt dieser Ausführungsform gemäß der Erfindung, werden Helix-stabilisierende Reste in die Sequenz des Proteins eingeführt. Dieses Element des Verfahrens basiert auf der Beobachtung, dass Sekundärstrukturelemente durch eine Reihe an lokalen Interaktionen zwischen benachbarten Resten stabilisiert wird. Mit dem Ausdruck Sekundärstrukturelemente sind α-Helices und β-Faltblätter, Schleifen und β-Loops, und vorzugsweise α-Helices bezeichnet.
Bevorzugte α-Helix-unterstützende Aminosäurenreste schließen Alanin, Asparagin, Cystein, Glutamin, Glutamat, Leucin, Methionin, Phenylalanin, Tryptophan oder Tyrosin mit ein. Helix-aufbrechende Reste, die die Struktur unterbrechen, wie bspw. Prolin und Glycin, sollten vermieden werden.
Verschiedene Techniken sind verfügbar, die das gezielte Design von Proteinen ermöglichen, die stabilisierte sekundäre strukturelle Elemente enthalten. Die Prinzipien, die der Bildung und Stabilität von β-Faltblatt-Strukturen zugrunde liegen, werden erst so langsam offensichtlich. Im Falle der α-Helices sind diese Prinzipien jedoch ganz gut bekannt (siehe Chakrabartty und Baldwin 1995). Dieses Wissen entstand aus Untersuchungen mit synthetischen Modell-Peptiden, und auch aus der Analyse der thermodynamischen und kinetischen Eigenschaften von mutierten Proteinen, die Aminosäuresubstitution in deren α-Helices tragen.
Einen wichtigen Beitrag erzielten Versuche, de novo Proteine mit einem oder mehreren Segmenten der Helix-Struktur zu bilden, die so genannten Helix-Bündel (siehe Kohn und Hodges 1998). Den entworfenen Proteinen fehlte jedoch in den meisten Fällen die spezifischen tertiären Interaktionen, die für gefaltete Proteine charakteristisch sind, jedoch sind die Helix-Segmente gewöhnlich gut definiert.
Die Information, die aus diesen unterschiedlichen Arten an Untersuchungen zusammengetragen werden konnte, wurde dazu verwendet, Algorithmen zu entwickeln und zu optimieren, mit welchen der Helix-Gehalt von Peptiden in wässrigen Lösungen vorhergesagt werden kann. Ein mit AGADIR bezeichneter Algorithmus ist eines dieser Verfahren (Munoz et al., 1994b, c, d; Munoz et al., 1997; Lacroix et al., 1998), und hat sich als brauchbares Werkzeug beim Design von Peptiden mit einem hohen Gehalt an Helix-Strukturen erwiesen.
Bei diesem Element des Verfahrens, also wenn Reste identifiziert werden, die mutiert werden können, um die Helix-Bildung der Aminosäuresequenz zu erhöhen, sollten idealerweise Interaktionen mit weiter Reichweite zwischen den Resten nicht davon betroffen sein. Die Zielreste sollten Lösungsmittel-exponiert sein, lediglich ortsspezifische Kontakte innerhalb der α-Helix eingehen, und sollten nicht in weitreichenden Interaktionen mit dem Rest des Moleküls beteiligt sein.
Der Effekt verbesserter ortsspezifischer Interaktionen auf die Faltungskinetiken und auf die Stabilität eines bestimmten Proteins wird von den thermodynamischen und strukturellen Eigenschaften eventueller Zwischenprodukte im Faltungsprozess abhängen, ebenso wie von den thermodynamischen und strukturellen Eigenschaften der Produkte des nativen und denaturierten Zustandes. Wenn ein Element der Sekundärstruktur im Übergangszustand gefaltet wird, jedoch nicht in ein Faltungs-Zwischenprodukt, sollte dessen Stabilisierung durch die Einführung von bevorzugten nativ-ähnlichen Interaktionen größer sein als die Energiebarriere des Faltungs-Übergangszustandes, so dass die Faltungsreaktion beschleunigt wird (siehe 3). Auch können günstige elektrostatische Paare eingeführt werden.
Bei der Auswahl der geeigneten Helix, um in einem Cytokin eine Mutation einzuführen, müssen mehrere Kriterien bedacht werden. Zunächst ist es vorteilhaft, eine Helix auszuwählen, die unter nahen verwandten Mitgliedern der Cytokinfamilie nicht konserviert ist. Zweitens sollten die Reste derart ausgewählt werden, dass sie nicht bei der Bindung an einen Rezeptor beteiligt sind, wie bspw. im Falle von IL-4-Resten am N-Terminus der Helix C des Cytokins. Drittens kann es vorteilhaft sein, eine Helix auszuwählen, die in der Struktur flexibel ist. Dies ist jedoch nicht notwendigerweise immer der Fall, und oftmals ist es nicht bekannt, ob eine bestimmte Helix flexibel ist oder nicht. Wenn es bekannt ist, dass eine bestimmte Helix, oder Teile davon, sehr flexibel sind, dann ist diese Stelle, insbesondere wenn der flexible Teil nicht einer funktionellen Stelle entspricht, offensichtlich ein gutes Ziel für die Stabilisierung durch Mutagenese. Dies kann durch magnetische Kernresonanz-15N-Relaxationsstudien und Wasserstoff-Austauschstudien bezüglich des betroffenen Cytokins vorhergesagt werden.
In Bereichen des Proteins, die einen niedrigen Durchschnittsgehalt an Helices haben, können Mutationen eingeführt werden, die den Durchschnittsgehalt an Helices in diesem Bereich erhöhen. Diese Mutationen schließen Reste mit ein, die bessere Helix-Bilder sind als die Reste, die sie ersetzen (siehe Chakrabartty, 1995; Muñoz und Serrano, 1994e). Mutationen können auch eingeführt werden, um die Bildung von günstigen elektrostatischen Paaren zu ermöglichen.
Wenn eine Helix-bildende Aminosäuresubstitution für den Einbau in ein Cytokin entworfen wird, um dessen Stabilität zu verbessern, sollte berücksichtigt werden, dass dann, wenn die α-Helix – zusätzlich zu deren Anwesenheit in dem natürlichgefalteten Protein – auch in dem Zwischenprodukt vorliegt, das das Faltungsproblem verursacht, auch dessen Stabilisierung sowohl den gefalteten als auch den Zwischenprodukts-Zustand im gleichen Ausmaße beeinflussen wird, weshalb bei der Rückfaltung kein bedeutender Effekt gefunden werden wird, zumindest bei niedrigen Denaturierungsmittel-Konzentrationen. Bei moderaten oder hohen Konzentrationen an Denaturierungsmitteln wird das Zwischenprodukt im Verhältnis zum nativen Zustand destabilisiert und die Faltung wird schneller vorangehen.
Wenn in dem Zwischenprodukt keine α-Helix vorliegt, jedoch eine im Übergangszustand, sollte dessen Stabilisierung zu einer niedrigeren Energiebarriere zwischen dem Zwischenprodukt und dem Übergangszustand führen, und konsequenterweise zu einem Anstieg der Faltungsrate. Daher wird unter moderaten Konzentrationen an Denaturierungsmitteln, ähnlich denjenigen, die bei Protein-Rückfaltungsstudien verwendet werden, die Stabilisierung von α-Helices immer die Faltungsreaktion beschleunigen, was zu einem produktiveren Faltungsprozess führt.
Die Helix-C wird von den Erfindern als eine bevorzugte Helix für die Stabilisierung eines Cytokins gemäß der Erfindung betrachtet. Eine Stabilisierung durch diese Helix wird vermutlich dadurch erreicht, dass eine Protein-Aggregation verhindert wird, die durch ein Faltungs-Zwischenprodukt vermittelt wird, vermutlich aufgrund der Beschleunigung der Faltungsreaktion und aufgrund einer gleichzeitigen Absenkung in der Konzentration eines mutmaßlichen Faltungs-Zwischenprodukts.
Im spezifischen Beispiel von IL-4 ist die Helix-C innerhalb der Mitglieder der IL-4-Familie nicht besonders konserviert. Darüber hinaus ist es bekannt, dass die ersten Reste am N-Terminus bei der Bindung an den Rezeptor nicht beteiligt sind (Wang et al., 1997), und magnetische Kernresonanz-¹⁵N-Relaxationsstudien und Wasserstoffaustauschstudien bezüglich IL-4 haben gezeigt, dass diese Region der Helix-C sehr flexibel ist (Redfield et al., 1992; Redfield et al., 1994a; Redfield et al., 1994b). Diese Beobachtungen werden zusätzlich dadurch unterstützt, dass der Algorithmus AGADIR 1s-2 für diese Helix einen niedrigen Durchschnittsgehalt an Helices (4%) vorhersagt.
Beispiele für Helix-stabilisierende Mutationen für IL-4 sind die Mutation von Threonin 69 zu Serin; von Glutamin 71 zu Alanin; von Glutamin 72 zu Glutamat; von Phenylalanin 73 zu Alanin; von Histidin 74 zu Asparagin. Daher kann an den Positionen 69 bis 74 in der vollständigen IL-4-Aminosäuresequenz die Sequenz SAAEAN eingeführt werden, um die Sequenz TAQQFH zu ersetzen.
Im Falle einer Mutation der Helix-C von IL-4 kann gleichzeitig mit der Einführung von Aminosäureresten, die bessere Helix-Bilder sind, das N-Capping-Box-Motiv, das im Wildtyp-Protein vorhanden ist (T-X-X-Q) durch ein besseres Gegenstück (S-X-X-E) ersetzt werden, während gleichzeitig die Bildung einer Helix gefördert wird. In diesem Ausführungsbeispiel der Erfindung kann die Sequenz der Wildtyp-IL-4-Helix ATAQQFHRHKQLIRFLKRLDRNLWGLAG durch die Sequenz ASAAEANRHKQLIRFLKRLDRNLWGLAG ersetzt werden, die fettgedruckten Reste sind die mutierten Reste.
Der funktionelle IL-4-Rezeptor erwies sich als Heterodimer, der eine Komponente mit hoher Affinität umfasst, nämlich IL-4Ralpha, und eine Untereinheit mit niedriger Affinität, die entweder die mit IL-2 gemeinsame Gammakette ((Russel et al., 1993) oder IL-13Ralpha (Matthews et al., 1995) ist, je nach Zielzelle. Die von Matthews et al., 1995, dargelegten Daten legen nahe, dass IL-4 an einen bestimmten Rezeptor binden kann, der als Typ II IL-4-Rezeptor bezeichnet wird, und der aus der IL-4Rα-Kette und dem mit niedriger Affinität bindenden Rezeptor IL-13 (IL-13Rα) zusammengesetzt ist. Diese Ergebnisse erklären, warum IL-2 und IL-13 biologische Antworten hervorrufen können, die ähnlich zu IL-4 aus bestimmten Zelltypen sind. Im spezifischen Fall von IL-4 erachten es die Erfinder daher als vorteilhaft, das Cytokin derart zu mutieren, dass dessen Bindung an IL-4Rα ermöglicht wird, aber gleichzeitig die Bindung des Cytokins an IL-13Rα und/oder die γ_c-Kette verhindert wird. Die Möglichkeit, die zwei Cytokine gleichzeitig zu inhibieren, kann ein effizientes Mittel sein, die Symptome, die mit allergischen Krankheiten in Zusammenhang stehen, zu hemmen; aus diesem Grund sind diese IL-4-Antagonisten von hohem therapeutischem Interesse.
Es kann auch vorteilhaft sein, andere als diejenigen Mutationen, die der Stabilisierung der Faltung des natürlichen Proteins dienen, gleichzeitig mit der gemäß der Erfindung durchgeführten Mutagenese einzuführen. So sind bspw. zwei effiziente Antagonisten von IL-4 in der Literatur bereits offenbart. Dies sind IL-4Y124D (Y) (Kruse et al., 1992) und IL-4R121DY124D (RY) (Kruse et al., 1993; Tony et al., 1994).
Diese IL-4-Mutanten binden IL-4Rα mit einem K_d-Wert, der ähnlich zu demjenigen des Wildtyp-Proteins ist, wobei die Mutanten jedoch nicht eine zweite Rezeptorkomponente rekrutieren können (Duschl et al., 1995). Dies führt zur Bildung eines unproduktiven Komplexes mit IL-4Rα, der keine detektierbare biologische Aktivität aufweist. IL-4-Antagonisten sind nachgewiesenermaßen Inhibitoren von IL-13 (Grunewald et al., 1998; Tony et al., 1994), da das Rezeptorsystem dieses Cytokins IL-4Rα für die Signaltransduktion benötigt (Smerz-Bertling et al., 1995; Tony et al., 1994). Daher betrifft die Erfindung in einem Aspekt die Substitution eines Aspartat-Rests an Position 121 und/oder 124 in der vollständigen Länge der IL-4-Aminosäurensequenz.
Die hierin dargestellten Ergebnisse unterstützen die Einschätzung, dass alpha-Helix-Sequenzen in Proteinen für eine maximale Proteinstabilität nicht notwendigerweise optimiert sind. Dies stellt keine Probleme dar, wenn Proteine synthetisiert werden und wenn sie in ihrer natürlichen Umgebung agieren, wo sie sich zur Erfüllung ihrer biologischen Rolle entwickelt haben. Jedoch ist die Situation eine andere, wenn synthetisierte Proteine in einer heterologen Umgebung manipuliert werden, die die Stabilität des nativen Proteins und anderer Spezies im Faltungsprozess bedingen kann. In diesem Fall können Verbesserungen in der Stabilität von alpha-Helices sowohl die Stabilität des nativen Zustands als auch die Geschwindigkeit der Faltungsreaktion erhöhen.
Darüber hinaus konnte von bestimmten Algorithmen, wie bspw. AGADIR, gezeigt werden, dass sie ausgezeichnete Werkzeuge für das rationale Design von Helix-Sequenzen darstellen, die eine erhöhte Stabilität besitzen.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung weist das Verfahren einen weiteren Schritt c) auf, bei welchem die Pro-Sequenz des Cytokins an dessen N-Terminus mit eingeschlossen wird. Es ist bekannt, dass viele Proteine, einschließlich einer Vielzahl von Proteasen, Wachstumsfaktoren, Polypeptid-Hormonen, Neuropeptide und Plasmaproteine, in vivo in Form von Prä-Pro-Proteinen synthetisiert werden. Die Prä- Sequenz markiert das Protein für einen Transport in das endoplasmatische Reticulum (ER) und für eine extrazelluläre Sekretion. Die Pro-Sequenz ist gewöhnlich am N-Terminus angeheftet, und zwar hinter der Prä-Sequenz, jedoch kann sie auch am C-Terminus oder als Kombination beider Alternativen gefunden werden. Untersuchungen mit unterschiedlichen Proteasen legten nahe, dass die Pro-Sequenz bei der Proteinfaltung eine Rolle spielt (Übersichtsartikel siehe Shinde et al., 1993; Eder & Fersht, 1995).
Die am intensivsten untersuchten Fälle von Faltungen, die durch Pro-Sequenzen vermittelt werden, sind diejenigen des Subtilisins (Eder et al., 1993), und der α-lytischen Protease (Baker et al., 1992). In Abwesenheit des Pro-Peptids falten sich diese Proteine in ein stabiles, teilweise gefaltetes Zwischenprodukt mit Eigenschaften des so genannten "molten-globule" ("geschmolzene-Kügelchen")-Zustands, jedoch fehlt ihnen eine enzymatische Aktivität. Die Hinzufügung der Pro-Sequenz senkt die Aktivierungsenergiebarriere der Faltungsreaktion entweder durch Stabilisierung des Übergangszustandes für die Faltung oder durch die Stabilisierung des nicht-nativen Übergangsproduktes, was zur Bildung der nativen Konformation führt (siehe 4).
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung weist das Verfahren einen weiteren Schritt d) auf, bei welchem das Cytokin in der Wirtszelle in Verbindung mit einer Foldase und/oder mit einem Chaperonprotein exprimiert wird.
Aus den letzten Jahren wurde klar, dass die Proteinfaltung in den Zellen durch zwei unterschiedliche Klassen an Helferproteinen vermittelt wird, die als Foldasen und Chaperone bekannt sind. Foldasen katalysieren Schritte, wie bspw. die Bildung und Isomerisierung von Disulfidbrücken, sowie die Isomerisierung von Peptidbindungen vorstehender Prolinreste. In einigen Untersuchungen konnte durch eine Coexpression von Foldasen gezeigt werden, dass die Faltung von Proteinen, die in das Periplasma von E. coli sekretiert wurden, unterstützt wird (siehe Übersichtsartikel Georgiou & Valax 1996; Hockney, 1994).
Die am intensivsten charakterisierten Chaperon-Familien sind die Hsp70-Familie, die DnaK und seine Helferproteine DnaJ und GrpE mit einschließt, sowie die Hsp60-Familie. Letztere wird auch als Chaperonin-Familie bezeichnet und umfasst das bakterielle GroEL/GroES-System, sowie mehrere Analoga, die in Mitochondrien und Chloroplasten gefunden werden (siehe Übersichtsartikel Hartl et al., 1994; Martin & Hartl, 1994). Das GroEL/GroES-System wurde sowohl strukturell (Braig et al., 1994; Mande et al., 1996) als auch funktionstechnisch (Corrales & Fersht, 1996) intensiv untersucht. GroEL besteht aus zwei übereinander angeordneten heptameren Ringen, die einen doppelten Donut mit einem hierauf befindlichen Deckel bilden (GroES). Experimentelle Ergebnisse weisen auf ein Modell für die Proteinfaltung im Cytoplasma von E. coli hin, bei welchem Hsp70 und Hsp60 nacheinander beteiligt sind (Langer et al., 1992). Die Mitglieder der Hsp70-Familie binden Proteine cotranslational, also während sie synthetisiert werden, und führen sie durch die ersten Faltungsschritte, bis ein "molten-globule"-ähnlicher Zustand erreicht ist. Exponierte hydrophobe Stellen an der Oberfläche dieser Zwischenprodukte werden dann durch das GroEL/GroES-System erkannt, welches diese in einem Faltungs-kompetenten Zustand hält. Die Faltung der Polypeptidkette findet innerhalb der hohlen Struktur von GroEL statt, und das Protein wird nach ATP-Hydrolyse freigesetzt. Sollte ein Zyklus für eine vollständige Faltung nicht ausreichend sein, wird die Prozedur so lange wiederholt, bis ein korrekt gefalteter Zustand erreicht ist (Heyrovska et al., 1998).
Um eine Chaperon-unterstützte Proteinexpression durchzuführen, sollten Bakterien mit zwei unterschiedlichen Plasmiden transformiert werden, von welchen eines das Gen enthält, das für das Protein von Interesse codiert, und das andere Plasmid das Gen, das für das Chaperon codiert. Die Plasmide sollten unterschiedliche Replikationsursprünge haben, so dass sie in der gleichen bakteriellen Zelle stabil erhalten werden können. Darüber hinaus sollten sie unterschiedliche antibiotische Resistenzmarker tragen, um eine Selektion hinsichtlich des gleichzeitigen Vorliegens beider Plasmide zu ermöglichen. Die Promotoren sind gewöhnlicherweise die gleichen für die beiden Plasmide, so dass die Expression des Target-Proteins und des Chaperonins gleichzeitig induziert werden kann. In einigen Fällen kann es nützlich sein, unterschiedliche Promotoren zu benützen, so dass das Chaperonin früher induziert wer den kann. Die Expression des Target-Proteins wird anschließend zu einem späteren Zeitpunkt induziert, wenn die Mengen an Chaperonin bereits hoch genug sind, um eine effiziente Faltung zu vermitteln (Cole, 1996).
In der Literatur gibt es einige gut dokumentierte Fälle, bei welchen die Coexpression von GroEL/GroES oder des DnaK/J-Operons nachgewiesenermaßen die Menge an löslichem Protein erhöhte. Dihydrofolat-Reduktase (DHFR) ist eines der Proteine, die als Inclusion Bodies in Abwesenheit von GroEL/S produziert werden. Wenn dieses Chaperonin-System mit dem Protein coexprimiert wird, erhöht sich die Menge an Protein, das in der löslichen Fraktion vorliegt, dramatisch, was die Reinigung von 3–5 mg an aktivem Enzym pro Liter bakterieller Kultur ermöglicht (Dale et al., 1994). Ein ähnlicher Effekt wurde für die Coexpression von GroEL/S oder DnaK mit mehreren Tyrosinkinasen beobachtet (Amrein et al., 1995). Die Coproduktion von DnaK verbesserte nachgewiesenermaßen die Löslichkeit von hG-CSF (Pérez-Pérez et al., 1995) und hGH (Slum et al., 1992), zwei Cytokine der IL-4-Familie.
Vorzugsweise ist das in Schritt d) verwendete Chaperonin das GroEL/ES-System oder Thioredoxin. Gleichwohl gibt es keine allgemeine Vorschrift, welches Chaperon ausgewählt werden sollte, um die in vivo-Faltungseigenschaften eines bestimmten Proteins zu verbessern. Das Chaperon, das an ein zur Aggregation neigendes Zwischenprodukt binden kann, wird das Passendste darstellen, jedoch kann diese Antwort nur durch Durchführung von Experimenten gefunden werden. Darüber hinaus ist für einige Proteine die Expression eines Chaperons nicht hinreichend, um lösliches Protein zu erhalten, und ein Ansatz zur Kombinierung mehrerer der oben diskutierten Faktoren kann noch geeigneter sein. Für die katalytische Untereinheit der Rinder-Pyruvat-Dehydrogenase-Phosphatase wurde gezeigt, dass es notwendig ist, die Wachstumstemperatur auf 30°C abzusenken, um aktives lösliches Protein zu erhalten (Lawson et al., 1993). Ein anderer Faktor, der in Erwägung gezogen werden sollte, ist, dass die Coexpression mit Chaperonen die Expressionsmengen des Target-Proteins senken kann. Dieser Effekt entsteht vermutlich aus einem Wettbewerb zwischen dem Chaperon und dem Protein für Komponenten, die für die Proteinsynthese benötigt werden, wie bspw. Ribosome, Aminosäuren oder t-RNAs (Dale et al., 1994). Darüber hinaus können hohe Mengen an Chaperon-Expression für E. coli schädlich sein (Slum et al., 1992); ferner ist über das Verhalten von Chaperonüberexprimierenden Zellen in Fermentern, die für die Produktion von Biopharmazeutika in großem Maßstab eingesetzt werden, wenig bekannt ist (Georgiou & Valax, 1996).
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird menschliches IL-4 bereitgestellt, das an Position 23, Position 91 oder an sowohl Position 23 als auch 91 in der vollständigen Sequenzlänge durch eine Aminosäuresubstitution von Lösungsmittelexponierten hydrophoben Resten mutiert ist, und bei welchem Helix-stabilisierte Reste eingeführt werden, so dass während der Faltung des Cytokins ein während der Faltung des Cytokins gebildetes Zwischenprodukt relativ zum Cytokin in seinem gefalteten Zustand destabilisiert wird. Ein gemäß der Erfindung stabilisiertes Cytokin ist ein "Vier-Helix-Bündel"-Cytokin, wie bspw. diejenigen, die zur hämatopoetischen oder Klasse I-Cytokin-Superfamilie gehören, einschließlich HGH, GM-CSF, G-CFC, LIF, EPO, IL-2, IL-4, IL-5 und IL-6. Aufgrund des gestiegenen kommerziellen Wertes für Arzneimittel für Säugetiere sind Cytokine, die von Säugetieren, insbesondere von Menschen, abgeleitet sind, bevorzugte Ziele für die Stabilisierung gemäß der vorliegenden Erfindung.
Mit dem Ausdruck "funktionell-äquivalent" ist gemeint, dass die mutierten Cytokin-Proteine ein oder mehrere der biologischen Funktionen, die das Wildtyp-Cytokin besitzt, beibehalten. Im Falle von IL-4 schließen solche Funktionen die Wachstumskontrolle und die Differenzierung von Immunzellen mit ein, ferner die Verteidigung gegen Helminthen-Macroparasiten, die Abstoßung von bestimmten Tumoren und die spezifische Induktion von IgE-Antikörpern. Biologische Funktionen anderer Cytokine werden den Fachleuten klar sein. Der Ausdruck "Varianten" schließt bspw. Mutanten mit ein, die Aminosäuresubstitutionen, Insertionen oder Deletionen im Vergleich zur Sequenz des Wildtyp-Cytokins enthalten, ebenso wie natürliche biologische Varianten (bspw. allelische Varianten oder geografische Variationen innerhalb der Spezies, aus welcher das Cytokinmolekül abgeleitet ist). Varianten mit einer verbesserten Funktion gegenüber der der Wildtyp-Sequenz können durch eine systematische oder gerichtete Mutation spezifischer Reste in der Proteinsequenz gebildet werden. Dieser Ausdruck bezieht sich auch auf Moleküle, die mit dem Wildtyp-Cytokin strukturell ähnlich sind, oder die eine ähnliche oder identische tertiäre Struktur aufweisen.
Derivate der Moleküle, Varianten und funktionelle Äquivalente, wie oben beschrieben, sind auch hierin beschrieben. Solche Derivate können eines oder mehrere zusätzliche Peptide oder Polypeptide mit einschließen, die an den Amino- oder Carboxy-Terminus des modifizierten Cytokins fusioniert sind. Der Zweck des zusätzlichen Peptids oder Polypeptids kann in der Unterstützung der Detektion, Expression, Separation oder Reinigung des Proteins liegen, oder es kann dem Protein zusätzliche gewünschte Eigenschaften verleihen. Beispiele von möglichen Fusionspartnern schließen beta-Galactosidase, Glutathion-S-Transferase, Luciferase, ein Polyhistidin-Tag, ein T7-Polymerase-Fragment, ein Sekretionssignalpeptid oder ein anderes Cytokin oder Cytokin-Rezeptor mit ein. Solche Derivate können durch genetisches oder chemisches Fusionieren der Peptide hergestellt werden.
Die mutierten Cytokine, die gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden, zeigen vorzugsweise einen mindestens zweifachen, vorzugsweise fünffachen oder höheren, oder noch bevorzugter einen zehnfachen oder höheren Anstieg in der Rückfaltungsausbeute.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Cytokin IL-4 oder ein Derivat davon. IL-4 ist ein sehr wichtiges, immunregulatorisches Cytokin, das das Wachstum und die Differenzierung verschiedener Arten von Immunzellen kontrolliert, und das bei der Verteidigung gegenüber helminthischen Macroparasiten beteiligt ist, sowie bei der Abstoßung von bestimmten Tumoren. Die vielleicht herausragendste klinische Rolle von IL-4 ist die spezifische Induktion von IgE-Antikörpern, die für die Entwicklung von Symptomen verantwortlich sind, die typischerweise mit allergischen Reaktionen verbunden sind. Heutzutage ist es offensichtlich, dass IL-4 eine herausragende Rolle bei der allergischen Immunantwort spielt, da dieses Protein bestimmt, ob B-Zellen IgE oder andere Arten an Antikörpern entstehen lassen.
Konsequenterweise werden Arzneimittel, die die Aktivität von IL-4 beeinflussen können, die IgE-Mengen reduzieren, und werden allergische Reaktionen gegenüber einer pharmazeutischen Kontrolle zugänglich machen. Eine Voraussetzung für das Design solcher Arzneimittel ist das detaillierte Wissen über die Prinzipien, die die Bindung von IL-4 an sein Rezeptorsystem steuern. Menschliches IL-4, das an Position 23, an Position 91 oder an beiden Positionen, 23 und 91, in der vollständigen Länge der Sequenz mutiert ist, und funktionell äquivalente Fragmente oder Varianten davon bilden einen besonders bevorzugten Aspekt der Erfindung. Vorteilhafterweise kann eine Mutation, die an dieser Position eingeführt ist, ein Serin-Rest sein. Alternativ oder zusätzlich kann das IL-4-Protein eine oder mehrere der folgenden Mutationen aufweisen:: Threonin 69 zu Serin; Glutamin 71 zu Alanin; Glutamin 72 zu Glutamat; Phenylalanin 73 zu Alanin; Histidin 74 zu Asparagin. Die Sequenz SAAEAN kann daher an den Positionen 69 bis 74 in der vollständigen Länge der IL-4-Aminosäuresequenz eingeführt werden, wodurch die Sequenz TAQQFH ersetzt wird.
Gemäß einem noch weiteren Aspekt der Erfindung wird menschliches IL-4 bereitgestellt, das an Position 23, Position 91 oder an beiden Positionen, 23 und 91, mutiert ist, einschließlich einer Mutation an Position 68–95 der vollständigen Länge der Aminosäuresequenz, nämlich die Sequenz ASAAEANRHKQLIRFLKRLDRNLWGLAG, und funktionell äquivalente Fragmente oder Varianten davon.
Die IL-4-Proteine und Derivate davon, die durch das Verfahren gemäß der Erfindung hergestellt werden, können für die Reinigung von IL-4Ralpha verwendet werden. Dementsprechend beschreibt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von IL-4Ralpha-Proteinen, wobei das Verfahren die Beladung einer Affinitätssäule, an welche mutiertes IL-4-Protein gebunden ist, mit einer Zusammensetzung, die IL-4Ralpha enthält, das Waschen der Säule und das Eluieren von IL-4Ralpha von der Säule umfasst. Das mutierte IL-4-Protein ist vorzugsweise an Position 23, an Position 91 oder an beiden Positionen, 23 und 91, in der vollständigen Länge der Sequenz mutiert, und am bevorzugtesten an einer oder beiden dieser Positionen zu Serin mutiert. Alternativ oder zusätzlich kann das IL-4-Protein eine oder mehrere der folgenden Mutationen aufweisen: Threonin 69 zu Serin; Glutamin 71 zu Alanin; Glutamin 72 zu Glutamat; Phenylalanin 73 zu Alanin; Histidin 74 zu Asparagin.
Gegenwärtig wird IL-4Ralpha mittels Affinitäts-Chromatografie auf extrem teuren Reinigungssäulen aufgereinigt, die mit IL-4WT beladen sind. Die stabilisierten mutierten IL-4-Proteine, die durch die oben beschriebenen Verfahren hergestellt werden, sind in der Produktion in großen Mengen deutlich kostengünstiger und ermöglichen daher die Herstellung von Reinigungssäulen mit niedrigeren Kosten, wodurch die Kosten zur Präparation von IL-4Ralpha-Proteinen zur therapeutischen Verwendung verringert werden.
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch die Verwendung von einem Cytokin, das gemäß einem der wie oben beschriebenen erfindungsgemäßen Aspekte mutiert wurde, um Antikörper gegen das Cytokin herzustellen. Insbesondere kann ein wie oben beschriebenes mutiertes IL-4-Protein für diesen Aspekt der Erfindung eingesetzt werden. Antikörper, die durch dieses Verfahren generiert werden, haben wichtige Verwendungen als diagnostische und therapeutische Werkzeuge.
Gemäß einem noch weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Peptid bereitgestellt, das ein Fragment eines wie oben beschriebenen mutierten Cytokins aufweist.
Solche Peptide können von Wildtyp-Cytokinen abgeleitet sein, oder sie können synthetisch oder unter Einsatz von Gentechnikverfahren hergestellt werden. Insbesondere werden synthetische Moleküle als vorteilhaft betrachtet, die zur Nachahmung der Tertiärstruktur oder aktiven Stelle eines Cytokins entworfen werden. Obgleich Peptide keine idealen therapeutischen Arzneimittel sind, ermöglicht die Tatsache, dass sie einfach durch chemische Syntheseverfahren erhalten werden können, den Einbau unnatürlicher Aminosäuren, modifizierter Peptidbindungen oder chemischer Gruppen, die die intrinsische Stabilität von Peptiden und deren Widerstandsfähigkeit gegenüber einem proteolytischen Abbau erhöhen können. Darüber hinaus können die aktiven Peptide als Leitverbindungen eingesetzt werden, die durch kombinatorisches Screenen weiter optimiert werden und durch kleine organische Randbearbeitungen verbessert werden können, mit welchen die Biostabilität und Bioverfügbarkeit ermöglicht wird, die für therapeutische Arzneimittel notwendig ist (siehe Emmos et al., 1997).
Eine wichtige Frage liegt darin, wie das bestmögliche, in Frage kommende Peptid gefunden werden kann, das den erwünschten biologischen Effekt auf die effiziente Weise vermitteln kann. Molekulare dynamische (MD) Simulationen sind ein Verfahren, das das gezielte Design unterstützen kann, indem hinsichtlich der Faltbarkeit die vielversprechendsten Kandidaten ausgewählt werden (siehe Cregut et al., 1999). Daher ist es oftmals zu empfehlen, rationale Strategien mit irrationalen Ansichten zu kombinieren, in welchen die besten Peptidliganden durch Screenen von Verbindungs-Bibliotheken mit unterschiedlichen funktionellen Eigenschaften ausgewählt werden. Die Phagen-Display-Technologie war hierbei in der Bildung und dem Screenen von sehr großen Peptid-Bibliotheken hilfreich (Cwirla et al., 1990; Smith et al., 1985). Dieses Verfahren wurde erfolgreich dazu eingesetzt, Peptid-Mimetika von Erythropoetin (EPO) zu isolieren (Wrighton et al., 1996). Eines dieser Peptide kann den EPO-Rezeptor mit einem offensichtliche K_d von 0,2 μM binden und die dreidimensionale Struktur dieses Peptids, im Komplex mit dem EPO-Rezeptor ist ebenfalls bestimmt worden (Livnah et al., 1996). Das kleine Peptid (20 Reste) dimerisiert, indem ein 4-strängiges antiparalleles β-Faltblatt gebildet wird, das zwei EPO-Rezeptormoleküle binden kann, und es zeigte sich, dass es die Zellproliferation in vivo und Erythropoese in Mäusen stimulieren kann (Wrighton et al., 1996).
Der Hauptnachteil der Screening-Verfahren ist die lange Zeit, die notwendig ist, die Bibliotheken hinsichtlich einer Bindung an das Ziel zu durchsuchen. Außerdem ist es notwendig, den besten Treffer zu charakterisieren, und eine weitere, zeitaufwändige Selektionsrunde zu starten. Daher ist es wichtig, rationale Strategien zu überlegen, bei welchen strukturelle und Mutagenese-Daten eingebaut werden. Molekulare Mimetika, die auf diese Weise entworfen werden, stellen vermutlich verlässliche Ausgangspunkte mit Affinitäten dar, die mit denjenigen, die in der ersten Runde kombinatorischer Screening-Untersuchungen gefunden werden, vergleichbar sind (typischerweise im hohen μM-Bereich). Ein Ansatz, bei dem Phagen-Display und rationales Design kombiniert wurden, wurde bereits dazu eingesetzt, die Stabilität und Affinität von zwei-Helix-Derivaten der drei-Helix-Z-Domäne des Proteins A zu verbessern. Dieses, 59 Reste umfassendes Drei-Helix-Bündel bindet den Fc-Teil von Immunglobulin G (IgG) mit einem K_d-Wert von 10 nM. Die Bindedomäne wurde als ein 33 Reste umfassendes Peptid identifiziert, das dazu in der Lage ist, IgG mit praktisch der gleichen Effizienz wie das Wildtyp-Protein zu binden (Braisted et al., 1996).
Die Erfindung beschreibt auch ein Nucleinsäuremolekül, das für ein mutiertes Cytokin oder ein Peptid gemäß einem der oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Aspekte codiert. Die Erfindung beschreibt auch Verfahren zur Herstellung von wie oben beschriebenen Cytokinen und Peptiden, welche die Einführung einer Nucleinsäure, die für das Cytokin oder Peptid codiert, in eine Wirtszelle, wie bspw. ein E. coli-Bakterium, umfassen.
Gemäß einem noch weitern Aspekt der Erfindung wird ein mutiertes Cytokin oder Peptid gemäß einem der oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Aspekte bereitgestellt, zur Verwendung als ein pharmazeutisches Mittel. Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung solcher Cytokine oder Peptide in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prävention einer Krankheit in einem Säugetier, vorzugsweise einem Menschen. Vorteilhafterweise kann die Krankheit ein Allergie-bezogener Zustand sein. Mit der Erfindung wird auch ein Verfahren zur Prävention oder Behandlung einer Allergie bereitgestellt, das die Verabreichung eines wie oben beschriebenen, mutierten Cytokins oder Peptids an einem Patienten umfasst.
Gemäß einem noch weiteren Aspekt der Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, die ein mutiertes Cytokin oder Peptid gemäß irgendeinem der oben beschriebenen Aspekte der Erfindung umfasst, ggf. als ein pharmazeutisch-akzeptierbares Salz, in Kombination mit einem pharmazeutisch-akzeptierbaren Träger. Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung einer solchen pharmazeutischen Zusammensetzung bereit, bei welchem ein solches Cytokin oder Peptid in Verbindung mit einem pharmazeutisch-akzeptierbaren Träger gebracht wird.
Gemäß einem noch weiteren Aspekt der Erfindung wird ein diagnostisches Kit bereitgestellt, das ein mutiertes Cytokin oder Peptid gemäß irgendeinem der oben beschriebenen Aspekte der Erfindung enthält.
Die Erfindung stellt auch ein transgenes, nicht-menschliches Säugetier bereit, das ein Transgen trägt, das für ein mutiertes Cytokin oder Peptid gemäß irgendeinem der oben beschriebenen Aspekte der Erfindung codiert. Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines solchen transgenen Tiers bereit, das den Schritt der Einführung eines Nucleinsäuremoleküls, das für das mutierte Cytokin oder Peptid codiert, in einen Embryo eines nicht-menschlichen Tiers, vorzugsweise eine Maus aufweist.
Verschiedene Aspekte und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden nachstehend beispielhaft und detaillierter beschrieben, wobei insbesondere auf Verfahren zur Stabilisierung von Il-4 Bezug genommen wird. Es versteht sich, dass Modifizierungen im Detail vorgenommen werden können, ohne den Rahmen der Erfindung zu verlassen.
Kurze Beschreibung der Figuren
1: Schematische Darstellung der Faltung eines Proteins in eine einmalige dreidimensionale Struktur (gefalteter Zustand – F) aus einer linearen Aminosäuresequenz (ungefalteter Zustand – U). Dies stellt einen komplexen Prozess dar, der gewöhnlicherweise die Bildung von stabilen Faltungs-Zwischenprodukten (I) notwendig macht, die durch eine Energiebarriere (⧧) vom ungefalteten und gefalteten Zustand getrennt sind. Diese Zwischenprodukte können während der Faltungsreaktion in hohen Konzentrationen akkumulieren, was zu einer Protein-Aggregation führt. Die Akkumu lation von Zwischenprodukten kann auf eine hohe Energiebarriere zwischen dem Zwischenprodukt und dem Übergangszustand für die Faltung (⧧*) oder auf eine niedrigere Energiebarriere zwischen dem gefalteten Zustand und dem Übergangszustand zurückzuführen sein. Daher kann die selektive Destabilisierung von Faltungs-Zwischenprodukten (I') und/oder die Stabilisierung des gefalteten Zustands (F') dazu beitragen, die Proteine effizienter zu falten.
2: Schematische Darstellung des inversen hydrophoben Effekts. U und Um stellen die ungefaltete Konformations-Spezies des Wildtyp-Proteins und der Mutante dar. I und F, I_m und F_m stellen jeweils den Übergangs- und den gefalteten Zustand im Wildtyp und der Mutante dar. K_u und K_f sind die Konstanten der Nichtfaltungs- und der Faltungsrate, und ⧧ symbolisiert den Übergangszustand. Der Austausch hydrophober Reste durch mehrere hydrophile Reste sollte prinzipiell sowohl die denaturierten Spezies als auch das Zwischenprodukt hinsichtlich des nativen Zustands destabilisieren. Dadurch wird die Faltungsrate erhöht und kinetische Aggregationsprozesse, die aus der Akkumulation von Zwischenprodukten herrühren, reduziert.
3: Beschleunigung der Faltungsreaktion durch Optimierung lokaler Interaktionen. U stellt die ungefaltete Konformations-Spezies dar, I und F, I_m und F_m stellen jeweils den Übergangs- und gefalteten Zustand des Wildtyp-Proteins und der Mutante dar. K_7u und K_f sind die Konstanten der Nichtfaltungs- und Faltungsrate, und ⧧ symbolisiert den Übergangszustand.
4: Mögliche Wege, über welche intramolekulare Chaperone die Proteinfaltung vermitteln. Wenn das Protein in Abwesenheit seiner Pro-Sequenz faltet, nimmt es eine "molten-globule"-Zustandskonformation an, die eine Sekundärstruktur besitzt, die ähnlich dem nativen Protein ist, der jedoch die tertiären Wechselwirkungen fehlen, die für eine biologische Aktivität notwendig sind. Der "molten-globule"-Zustand ist stabil und kann die Energiebarriere, die ihn von dem gefalteten Zustand trennt, nicht überwinden. Das Hinzufügen des Propeptids senkt die Energiebarriere zwischen "molten-globule"-Zustand und dem Übergangszustand, wodurch die Faltung in den nativen Zustand weitergeführt werden kann.
5: UV-CD-Spektren des Wildtyp-Proteins (•) und des mutierten Peptids (⧫) der Helix-C von IL-4 in 25 mM Na₂HPO₄, pH 6,5 bei 5°C. Die Mittels AGADIR1s-2 vorhergesagten Werte für den Helix-Gehalt dieser Peptide und die experimentell bestimmten Werte sind eingefügt.
6: Vergleich der 2D NOESY-Spektren des Wildtyp-Peptids (IL-4Ch_wt) und des mutierten Peptids (Il-4BCh). Die Spektren wurden mit einer Mischzeit von 140 ms gewonnen. Die Dicke des Balkens unterhalb der Sequenz der Peptide stellt die Organisation der Helix in Il-4BCh dar, basierend auf den NOE-Daten.
7: Unterschied zwischen den Werten der chemischen Verschiebung des Hα-Protons des mutierten Peptids und den "random-coil"-Werten (Merutka et al., 1995). Negative Werte weisen auf die Bildung einer helicalen Struktur hin. Reste, deren Hα nicht eindeutig bestimmt werden konnte, sind durch ein Sternchen (*) markiert.
8: Zelluläre Fraktionen, abgeleitet aus E. coli AD494, die Il-4WT sowie die mutierten Proteine exprimieren. Spur 1: unlösliche Fraktion von IL-4L23SW91S, Spur 2: lösliche Fraktion aus IL-4L23SW91S, Spur 3: lösliche Fraktion aus IL-4L23S, Spur 4: lösliche Fraktion von IL-4W91S, Spur 5: lösliche Fraktion von IL-4BC-Helix, Spur 6: lösliche Fraktion des Wildtyp-Proteins. Nur eine kleine Fraktion des Wildtyp-Proteins (weniger als 10%) ist im Zellüberstand zu finden, im Gegensatz zu 50%–60% der mutierten Proteine, wie durch eine densitometrische Analyse des SDS-Gels bestimmt wurde.
9: HPLC des Wildtyps-IL-4-Proteins (Abbildung A) und des mutierten IL-4BC-Helix-Proteins (Abbildung B).
10: Monodimensionale NMR-Spektren von IL-4WT, IL-4W91S und IL-4BC-Helix. Die gute Dispersion der NMR-Signale zeigt, dass die Proteine gefaltet sind.
11: a Temperaturdenaturierungsprofil von IL-4WT (•) und den entworfenen Mutanten IL-4W91S (⧫) und IL-4BC-Helix (o), gefolgt durch CD. Der Denaturierungsprozess ist sowohl bei dem IL-4WT-Protein als auch bei den zwei mutierten Proteinen reversibel. b Chemische Denaturierungsprofile von Il-4WT (+) und den zwei Varianten IL-4W91S (o) und IL-4BC-Helix (•), gefolgt von CD. Die experimentellen Daten sind mit den gestreuten Symbolen dargestellt, und die durchgezogenen Linien zeigen die beste Anpassung an die experimentellen Daten unter Annahme eines Zwei-Zustands-Übergangsmodells, gemäß Gleichung 6. Die thermodynamischen Parameter, die aus dieser Anpassung gewonnen wurden, sind, zusammen mit den Temperaturdenaturierungsdaten, in Tabelle 4 wiedergegeben.
Beispiel 1: Rational entworfene Mutagenese zur Prävention der Aggregation von hIL-4
Interleukin-4 bildet nach Überexpression in E. coli Inclusion Bodies, und die Rückfaltung des Proteins in vitro ist sehr uneffizient, was lediglich zu einer sehr kleinen Menge an aktivem Protein führt. Sowohl die Aggregation in vitro als auch die Aggregation in vivo resultiert vermutlich aus der Akkumulation von Faltungs-Zwischenprodukten, die eine hohe Tendenz zur Assoziierung besitzen (Filimonov et al., 1993), und die nicht-native Wechselwirkungen erbringen, die das Protein in inaktive Konformationen steuern (Booth et al., 1997).
Wir haben zwei unterschiedliche Strategien entwickelt, um jedes mutmaßliche Zwischenprodukt im Faltungsprozess von IL-4 selektiv zu destabilisieren.
1.1 Verfahren

Klonierung: Das IL-4-Gen wurde mittels PCR aus einem zuvor beschriebenen Plasmid erhalten, R¹⁵prC 109/IL-4 (Kruse et al., 1991). An den 5'- und 3'-Enden wurden jeweils eine NcoI- und eine BamHI-Schnittstelle eingeführt, und zwar unter Verwendung der folgenden Oligonucleotide: Oligo5': CTA GAG ACT GCC ATG GAT CAC AAG TGC GAT; Oligo3': A CGC GGA TCC TTA TCA GCT CGA ACA. Das Gen, das jeweils für das Wildtyp-IL-4-Protein und für die mutierten Proteine codiert, wurde in PBAT4 (Peränen et al., 1996) zwischen den NcoI- und BamHI-Klonierungsstellen eingeführt. Aufgrund der Einführung einer NcoI-Stelle am 5'-Ende werden das Wildtyp-IL-4-Protein und die mutierten IL-4-Proteine mit einer zusätzlichen Aminosäure (Asp) am N-Terminus exprimiert.
Ortsspezifische Mutagenese: Die Mutanten IL-4W91S und IL-4WC-Helix wurden mittels PCR (Ho et al., 1989) unter Verwendung von Oligo5' und Oligo3' als flankierende Sequenzen und den folgenden Mutagenese-Primern (5' bis 3') erhalten: IL-4L23Sa: CAG AGC AGA AGA CTA GTT GCA CCG AGT TGA CCG; IL-4L23Sb: CGG TCA ACT CGG TGC AAC TAG TCT TCT GCT CTG; IL-4W91Sa: AGG AAC CTC AGT GGC CTG GCG GGC TTG; IL-4-W91Sb: CAA GCC CGC CAG GCC ACT GAG GTT CCT; IL-4BC-Helix-a: CTG GGT GCG AGT GCA GCA GAA GCA AAC AGG CAC AAG C; IL-4BC-Helix-b: G CTT GTG CCT GTT TGC TTC TGC TGC ACT CGC ACC CAG. Die doppelte Mutante IL-4L23SW91S wurde unter Verwendung von IL-4L23S als Template für die PCR-Reaktion und den oben aufgeführten IL-4W91S-Primern generiert.
Peptidsynthese: Die Peptide wurden auf einem Polyoxyethylen-Polystyrol-Harz auf einem Apparat mit kontinuierlichem Fluss synthetisiert. Die Proteinkettenanordnung wurde unter Verwendung der Fmoc-Chemie durchgeführt (Carpino et al., 1972) und eine in situ-Aktivierung der Aminosäuren-bildenden Blöcke mittels PyBOP (Coste et al., 1990). Die Peptide wurden mittels "reversed Phase" (umgekehrte Phasen)-HPLC gereinigt und mittels Laser-Desorptions-Massenspektrometrie (MALDI) charakterisiert.

1.2 Austausch exponierter hydrophober Reste im gefalteten Zustand durch polare Reste
Faltungs-Zwischenprodukte sind oftmals durch das Vorliegen beträchtlicher Mengen an Sekundärstrukturen und schlecht definierten Tertiärstrukturen charakterisiert, und werden durch hydrophobe Wechselwirkung stabilisiert. Daher ist es klar, dass hydrophobe Reste, die im gefalteten Zustand als Ergebnis der tertiären Faltung in einem Faltungs-Zwischenprodukt versteckt sind, im Faltungs-Zwischenprodukt versteckt sind. Eine Mutation dieser Reste in eine polare Aminosäure sollte das Zwischenprodukt in Bezug auf den gefalteten Zustand destabilisieren, und zwar durch den so genannten inverten hydrophoben Effekt (Pakula & Sauer, 1990).
Zwei nicht-konservierte Lösungsmittel-exponierte Aminosäurereste wurden in IL-4 identifiziert: Trp 91 und Leu L23. Bei den meisten anderen Mitgliedern der IL-4-Familie wird an den entsprechenden Positionen ein Serin gefunden, weshalb diese Aminosäure dazu ausgewählt wurde, W91 und L23 in dem menschlichen Protein zu ersetzen. Die auf diese Weise gewonnenen zwei Punktmutationen werden als IL-4W91S und IL-4L23S bezeichnet, sowie eine Mutante, die beide Mutationen trägt, IL-4L23SW91S.
1.3 Stabilisierung sekundärer Strukturelemente
Sekundäre Strukturelemente werden durch eine Reihe an lokalen Wechselwirkungen zwischen benachbarten Resten stabilisiert.
1.3.1 Stabilisierung von α-Helices unter Verwendung von AGADIR
AGADIR basiert auf empirischen Daten, die aus Konformations-Untersuchungen monomerer Peptide in Lösung gewonnen wurden. Der Algorithmus verwendet diese Information, um die freie Energie eines bestimmten Helix-Segments (ΔG_helix) zu berechnen, und zwar basierend auf der Helix-Coil-Übergangstheorie. Diese freie Energie reflektiert den Beitrag unterschiedlicher Wechselwirkungen innerhalb der Helix und entspricht dem Unterschied in der freien Energie zwischen dem Random-Coil und den Helix-Zuständen. In der neuesten Version des Algorithmus (AGADIRIs2, Lacroix et al., 1998) wird die freie Energie eines Helix-Segments gemäß der folgenden Gleichung beschrieben: ΔGHelix = ΔGint + ΔGHbind + ΔGSD + ΔGnichtH + ΔGDipol + ΔGausgewählt in welcher ΔG_int die intrinsische Tendenz einer bestimmten Aminosäure ist, in der Helix-Konformation vorzuliegen (Muñoz et al., 1994e), und stellt den Verlust der Konformations-Entropie dar, der nach Fixierung einer Aminosäure in helicalen dihedralen Winkeln auftritt. ΔGH_bind ist der Enthalpie-Beitrag der i, i + 4 Hauptketten-Hauptketten-Wasserstoff-Bindungen; ΔG_SD stellt die Beiträge der Seitenketten-Seitenketten nicht-geladenen Wechselwirkungen an den Positionen i, i + 3 und i, i + 4 in dem Helix-Segment dar. Bei Aminosäureresten mit ionisierbaren Seitenketten wird die pH-Wert-Abhängigkeit dieser Art an Interaktionen berücksichtigt. ΔG_Dipol reflektiert die Wechselwirkung geladener Gruppen, innerhalb oder außerhalb des Helix-Segments, mit dem Helix-Macrodipol. Eine andere Art an Wechselwirkung, die unabhängig von dem Vorliegen geladener Gruppen ist, hat mit dem Anstieg in der Stabilität von α-Helices zu tun, die während der Erhöhung der Ionenstärke beobachtet wird (Scholtz et al., 1991). Da α-Helices einen viel größeren Dipolmoment besitzen als die Random-Coil, stabilisiert einer Erhöhung der Ionenstärke vorzugsweise die α-Helix, wobei das Gleichgewicht in Richtung dieser Konformation verschoben wird. Dieser Effekt wird auch durch AGADIRIs-2 berücksichtigt, indem die Differenz in der freien Faltungsenergie einer bestimmten α-Helix in Lösung mit einer bestimmten Ionenstärke und in purem Wasser berücksichtigt wird. ΔG_ausgewählt schließt sämtliche elektrostatische Wechselwirkung zwischen zwei geladenen Resten innerhalb und außerhalb (N-Kappe und Reste, die der N-Kappe vorhergehen, und C-Kappe und Reste, die der C-Kappe folgen) des helicalen Segments mit ein, mit dem Helix-Macrodipol und Resten innerhalb der Helix. Die elektrostatischen Wechselwirkungen werden unter Berücksichtigung des Effekts des Ladungs-Screenings nach einem Anstieg der Ionenstärke berechnet, und die durchschnittliche Distanz zwischen zwei in Wechselwirkung stehenden, geladenen Gruppen wurde aus einer statistischen Analyse der Datenbank abgeleitet. Die Ladungen der einzelnen Aminosäuren in der Random-Coil und der Helix-Konformation werden durch Berechnung ihrer pKa bestimmt, und zwar unter Berücksichtigung der pH-Wert-Abhängigkeit. AGADIRIs-2 berücksichtigt auch den Effekt von N- und C-Terminal-blockierenden Gruppen. Die Reste, die der Acetylgruppe am N-Terminus folgen, oder der Amidgruppe am C-Terminus vorhergehen, können helicale Winkel mit den Acetyl- und den Amidgruppen annehmen, indem sie die Rolle des Kappungsrests annehmen.
1.3.2 Stabilisierung der Helix C von IL-4
Die α-Helix C von IL-4 wurde aus mehreren Gründen als Zielprotein ausgewählt. Diese Helix ist innerhalb der Mitglieder der IL-4-Familie nicht besonders konserviert; es ist bekannt, dass die ersten Reste am N-Terminus nicht bei der Bindung an den Rezeptor beteiligt sind (Wang et al., 1997); und die magnetische Kernresonanz ¹⁵N-Relaxations- und Wasserstoffaustauschuntersuchungen an IL-4 haben gezeigt, dass diese Region der Helix C sehr flexibel ist (Redfield et al., 1992; Redfield et al., 1994a; Redfield et al., 1994b). Tatsächlich wird mit AGADIRIs-2 ein geringer Durchschnitts-Helix-Gehalt (4%) für diese Helix vorhergesagt.
Unter Verwendung von AGADIRIs-2 haben wir drei unterschiedliche Typen an Mutationen generiert, die den durchschnittlichen Helix-Gehalt bis zu 20% erhöhen, und die Stabilität der α-Helix um etwa 1,8 Kcal/mol steigern. Im Detail haben wir das N-Kappen-Box-Motiv, das im Wildtyp-Protein (T-X-X-Q) vorliegt, durch ein besseres Gegenstück (S-X-X-E) ersetzt. Bessere Helix-Bildner (Chakrabartty et al., 1995; Muñoz et al., 1994e) wurden in die Sequenz der Helix: Q71 und F73 eingeführt, zu Alanin mutiert, und H74 wurde durch ein Asparagin substituiert. Der Grund, warum Asparagin gegenüber Alanin bevorzugt wurde, um H74 zu ersetzen, liegt darin, dass die Einführung eines weiteren Alanins an dieser Position zu einem hydrophoben Cluster am N-Terminus führen würde, der fünf Alaninreste umfasst, die die Löslichkeit des Proteins reduzieren und eine Aggregation hervorrufen könnten. Schließlich haben wir zwei günstige, elektrostatische Paare eingeführt (E-X-X-R und E-X-X-X-H).
Am C-Terminus der Helix wurden keine Mutationen vorgenommen, da dieser einen Teil des funktionellen IL-4-Epitops enthält (Wang et al., 1997). Darüber hinaus liegt in der Wildtyp-Sequenz ein Schellman-Motiv (Schellman et al., 1980) zwischen einem Leucinrest an Position 93 und dem Arginin an Position 88 vor. Dieses Motiv sollte die Bildung zweier Hauptketten/Hauptketten-Wasserstoffbrückenbindungen zwischen diesen beiden Resten bewirken, und man nimmt an, dass es ungefähr 1 Kcal/mol zur Helix-Stabilität beiträgt (Viguera et al., 1995). Die Mutante, die die stabilisierte Helix C trägt, wird hierin als IL-4BC-Helix bezeichnet.
Der zirkuläre Dichroismus zeigt einen klaren Anstieg im Helix-Gehalt des mutierten Peptids. Die Werte, die durch AGADIRIs-2 für den Helix-Gehalt des Wildtyps und für das mutierte Peptid vorhergesagt wurden, stehen in ausgezeichneter Übereinstimmung mit denjenigen, die aus den elliptischen Werten bei 222 nm bestimmt wurden (siehe 5).
Magnetische Kernresonanz-Untersuchungen des Wildtyps (IL-4Ch_wt) und der mutierten Peptide (IL-4BCh) wurden durchgeführt (siehe 6). Bezüglich IL-4Ch_wt konnte keines der NOE gefunden werden, die auf die Bildung einer helicalen Struktur hindeuten, wohingegen wir im Falle von IL-4BCh in der Lage waren, NOEs im breiten Bereich dαβ (i, i + 3) (Wütrich et al., 1996) durch die gesamte Sequenz des Peptids hindurch eindeutig zuzuordnen. Die NOE-Daten zeigen die Bildung eines Kappen-Box-Motivs am N-Terminus von IL-4BCh, und zwar zwischen S2 und E5, ebenso wie eine gut definierte, helicale Region, die die Reste S2-F15 überspannt. Die Region zwischen den Resten F15-D20 ist weniger gut definiert, und am C-Terminus werden zwei NOEs mit weitem Bereich beobachtet, die R21 mit W24 und W24 mit A27 verbinden.
Die Konformations-Verschiebungen des Hα-Protons (7) stellen einen weiteren Beweis für die Bildung der α-Helix im Mutierten Peptid bereit. Die Reste I13, L16, R18 und L19 konnten aufgrund der Überlappung mit anderen Resonanzen in den Spektren nicht eindeutig zugeordnet werden. L23 zeigt eine große Abweichung in der chemischen Verschiebung des Alpha-Protons zu einem höheren Feld hin, und zwar aufgrund der Nähe des Tryptophan-Rests.
Beispiel 2: In vivo-Faltung der IL-4-Varianten
Die bezeichneten Mutanten und das Wildtyp-Protein wurden in drei unterschiedlichen E. coli-Stämmen überexprimiert, und zwar in einer Reihe unterschiedlicher Bedingungen.
Es wurden nur DE3-Stämme eingesetzt, um eine Expression mit T7-basierten Expressionsplasmiden zu ermöglichen. Diese Stämme enthalte eine chromosomale Kopie des T7-RNA-Polymerase-Gens unter einer lacUV5-Kontrolle. Die Hinzufügung von IPTG zu dem Wachstumsmedium induziert die Transkription der T7-RNA-Polymerase, die dann die Transkription der Zielgene unter Kontrolle des T7-Promoters im Expressionsplasmid vermitteln kann (Furlong et al., 1992).
Sowohl das Wildtyp-Protein als auch die Mutanten wurden mit hohen Mengen in den unterschiedlichen Stämmen exprimiert, und machten bis zu 60% des gesamten zellulären Proteins aus. IL-4WT bildete unverändert Inclusion Bodies in sämtlichen drei Stämmen, und zwar unter allen getesteten Bedingungen. Wenn die Mutanten (IL-4L23S, IL-4W91S, IL-4L23SW91S und IL-4BC-Helix) in AD494, einem Thioredo xin-Reduktase-defizienten Stamm (trxB^–), überexprimiert wurden, wurden ungefähr 50% des hergestellten Proteins im Überstand gefunden (8).
Da bei AD494 eine der Haupt-Reduzierungswege fehlt, sollte prinzipiell die Bildung von Disulfid-Bindungen im E. coli-Cytoplasma möglich sein (Derman et al., 1993). Tatsächlich wurde dieser Stamm auch bereits dazu eingesetzt, die Löslichkeit mehrerer Proteine zu verbessern, die Inclusion Bodies bilden, wenn sie in üblicheren Expressionsstämmen, bspw. BL21, produziert werden. Die Expression der IL-4-Mutanten in BL21 führte ebenfalls zu einer Protein-Aggregation. Darüber hinaus war die Löslichkeit der Proteine nach Co-Expression mit dem GroEL/ES-Chaperonin-System oder Thioredoxin nicht erhöht, obgleich die Expressions-Level bedeutend reduziert waren.
Die Expression der Proteine in irgendeinem diese Stämme bei niedrigeren Temperaturen (15°C bis 30°C) hatte nachgewiesenermaßen keinen Effekt auf die Menge des löslichen Produkts, noch hatte die Konzentration des zur Initiierung der Expression verwendeten Inducers eine Auswirkung.

Die oben beschriebenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 2 wiedergegeben. Tabelle 2: Zusammenfassung der zur Reduzierung zur Bildung von IL-4-Inclusion Bodies (IB) verwendeten Strategien. Die optische Dichte der Zellen bei 600 nm wird durch IOD angegeben, und die Expression mit oder ohne die Pro-Sequenz ist jeweils durch +pro/–pro gekennzeichnet.

Protein	Stämme (DE3) & Vektoren						Expressionsbedingungen
	BL21				W3110& PBAT4	AD494 & PBAT4
	PBAT4	PT-trx	PT-groE/S
	–pro	PT-trx	PT-groE/S	+pro
IL4WT	IB	IB ↓ Exp.	IB ↓ Exp.	IB ↓ Exp.	IB	IB	15–37°C 0,10–1 mM IPTG IOD = 0,4–0,9
IL4L23S	18	IB ↓ Exp.	IB ↓ Exp.	IB ↓ Exp.	IB	50% löslich	37°C 0,16 mM IPTG IOD = 0,7–1,0
IL4W91S	IB	IB ↓ Exp.	IB ↓ IB Exp.	IB ↓ Exp.	IB	50% löslich	37°C 0,16 mM IPTG IOD = 0,7–1,0
IL4L23SW91S	IB	IB ↓ Exp.	IB ↓ Exp.	IB ↓ Exp.	IB	50% löslich	37°C 0,16 mM IPTG IOD = 0,7–1,0
IL4BC-Helix	IB	IB ↓ Exp.	IB ↓ Exp.	IB ↓ Exp.	IB	60% löslich	37°C 0.16 mM IPTG IOD = 0,7–1,0

Beispiel 3: Charakterisierung der löslichen IL-4-Mutanten
3.1 Verfahren
Löslichkeitstests. Escherichia coli AD494 (DE3), BL21 (DE3) und W3110 (DE3) wurden mit den Plasmiden, die für den IL-4WT und die mutierten Proteine codieren, transformiert. In jedem der Fälle wurden Ein-Liter-Flaschen mit LB-Medium mit einer einzelnen Kolonie beimpft und auf einem Rüttler bei Temperaturen im Bereich von 15 bis 37°C inkubiert, und zwar in Gegenwart von 100 mg/l Ampicillin. Die Protein-Expression wurde bei OD₆₀₀ von 0,4–1,0 bei unterschiedlichen Temperaturen unter Einsatz von IPTG-Konzentrationen im Bereich von 0,1 bis 1 mM induziert. Im Falle von BL 21 (DE3) und W3110 (DE3) wurde die Kultur 3 Stunden nach der Induktion inkubiert, und die Zellen durch Zentrifugieren geerntet. Im Falle von AD494 (DE3) wurde die Protein-Expression über Nacht induziert. In sämtlichen Fällen wurden die geernteten Zellen in 25 mM Tris-HCl, pH 8,0 resuspendiert. Die Zellen wurden durch Inkubieren der Zellen mit 1 mM MgCl₂, 20 μg/ml Lysozym und 10 μg/ml DNAse aufgebrochen, und anschließend durch eine "French Press" vollständig aufgebrochen. Die lösliche Fraktion wurde von den Zellbruchstücken durch Ultrazentrifugation bei 40000 rpm für eine Stunde getrennt. Proben aus der löslichen und der unlöslichen Fraktion wurden gesammelt und mittels SDS-PAGE auf einem 12%igen Polyacrylamidgel analysiert. Eine Quantifizierung des löslichen und des unlöslichen Produkts wurde durch densitometrische Analysen auf dem Gel vorgenommen.
Co-Expression mit GroEL/S und Thioredoxin. Um die Proteine mit den GroEL/ES-Chaperoninen und Thioredoxin überzuexprimieren, wurden kompetente BL21-Zellen, die PT-groE oder PT-Trx tragen, mit den Plasmiden transformiert, die jeweils für die Mutanten und für den IL-4-Wildtyp codierten. Die Bakterien wurden von einer einzelnen Kolonie gepickt und in 1-Liter-Schüttelflaschen mit LB angeimpft, bei Temperaturen im Bereich von 30–37°C, in Gegenwart von 100 mg/l Ampicillin und 50 mg/l Chloramphenicol. Die Expression der IL-4-Varianten und der Chaperone wurde gleichzeitig durch Hinzufügen von IPTG zum Wachstumsmedium mit einer Endkonzentration von 0,16 mM induziert, bis eine OD₆₀₀ nm von 0,7 erreicht war.
Expression von löslichem Protein in AD494: Escherichia coil AD494 (DE3) wurde mit den Plasmiden transformiert, die für den IL-4WT und für die mutierten Proteine codieren. 1-Liter-Flaschen mit LB-Medium wurden mit einer einzelnen Kolonie beimpft und auf einem Schüttler bei 37°C inkubiert. Nachdem eine OD₆₀₀ von 0,7 bis 0,8 erreicht war, wurde IPTG hinzugefügt, was zu einer Endkonzentration von 0,16 mM führte. Die Kultur wurde über Nacht inkubiert und die Zellen wurden mittels Zentrifugation geerntet.
Reinigung von löslichem Protein: Die geernteten Zellen wurden in 25 mM NaH₂PO₄, bei einem pH-Wert von 6,5, resuspendiert und eine Stunde lang auf Eis mit 1 mM MgCl₂, 20 μg/ml Lysozym und 10 μg/ml DNAse inkubiert, und anschließend durch Einsatz einer French-Press weiter zerkleinert. Die lösliche Fraktion wurde von den Zelltrümmern durch Ultrazentrifugation bei 40000 rpm getrennt. Proben aus den löslichen und unlöslichen Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE auf einem 12%igen Polyacrylamidgel analysiert. Die Quantifizierung des löslichen und des unlöslichen Produktes wurde durch densitometrische Analysen des Gels vorgenommen.
Die Proteinreinigung wurde auf einem FPLC-System von Pharmacia durchgeführt. Der Zellüberstand wurde zunächst über eine Sepharose-S-Säule (Pharmacia) gegeben, die mit 25 mM NaH₂PO₄ Ph 6,5 voräquilibriert war. Die Elution des Proteins wurde mittels eines linearen Salzgradienten von 0 bis 0,5 M NaCl durchgeführt. Die vier IL-4-Varianten eluierten bei 120 mM NaCl. Die gesammelten Fraktionen wurden dann einer Molekularsieb-Chromatografie unterzogen und die Proteine bis zu einer 90%igen Homogenität gereinigt. Die Ausbeute des Reinigungsprozesses war 1 mg von jeweils IL-4L23S, IL-4W91S, IL-4L23SW91S pro Liter Zellkultur, und ca. 2 mg IL-4BC-Helix.
Proteinexpression als Inclusion Bodies in AD494
Diese wurde wie oben für die Produktion von löslichem Protein beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Proteinexpression bei einer OD₆₀₀ von 0,5 induziert wurde.
Fermentation im 10-Liter- und im 100-Liter-Maßstab: Um größere Mengen an Protein herzustellen, wurden Fermentationen in einen 10-Liter-Bioreaktor durchgeführt. Für diese Fermentationen wurden die Plasmide in E. coli W3110 (De3) transformiert. Die Zellen wurden mittels Batch-Fermentation bei 37°C in einem komplexen Medium (30 g/l Sojapepton, 20 g/l Hefeextrakt, 20 g/l Glycerol, 5 g/l KH₂PO₄, 1 g/l MgSO₄, 100 mg/l Ampicillin) bis zu einer OD₆₀₀ von 3,0 angezüchtet. In diesem Stadium wurde die Expression des rekombinanten Proteins durch Hinzufügen von 0,4 mM IPTG induziert. Nach einer Induktionsphase von 4 Stunden wurden die Zellen mittels Zentrifugation geerntet.
Proteinreinigung aus Inclusion Bodies: Die geernteten Zellen wurden in 25 mM Tris-HCL, pH 8,0 resuspendiert. Der Zellaufbruch wurde enzymatisch durch Hinzufügen von Lysozym (1 mg pro g Zell-Trockengewicht) und Inkubation bei Raumtemperatur für 30 Minuten durchgeführt. Die freigesetzten Inclusion Bodies wurden durch Zentrifugieren bei 8000 g (30 Minuten) geerntet. Die Pellets wurden vier Mal durch Resuspendieren in 0,1 M Tris-HCL/1 mM EDTA/0,1% Zwittergent 3-14-Puffer, pH 8, und jeweiligem Zentrifugieren (8000 g, 15 Minuten) gewaschen. Die gewaschenen Inclusion Bodies wurden in 8 M GdnHCl/0,1 M Tris-HCL, pH 9, gelöst. Die SH-Gruppen wurden durch Hinzufügen von überschüssigen Sulfid- und Tetrathionat, wie von Kella et al., 1988 und Kella et al., 1985 beschrieben, zu S-SO₃ modifiziert.
Die Rückfaltung wurde mit einer Proteinkonzentration von 200 bis 300 mg/l mittels Cross-Flow-Ultrafiltration gegen fünf Volumen an 50 mM Na₂HPO₄, pH 7, 1 mM EDTA, 0,4 mM L-Cystein, 0,6 mM Arginin über 5 Stunden durchgeführt (ein Volumenaustausch/Stunde). Eine Analyse während dieses Prozesses wurde durch RP-HPLC auf einem Vydac-C4-Harz durchgeführt, indem ein linearer Gradient an Trifluoressigsäure-Acetonitril angewandt wurde. Die Rückfaltungs-Ausbeuten wurden durch einen Abgleich des Prozent-Verhältnisses des Spitzenbereichs der korrekt gefalteten Isoform zu dem Gesamtspitzenbereich (Gesamtprotein) erhalten.
Zirkularer Dichroismus: Die Fern-UV-CD-Spektren wurden auf einem Jasco-710-Instrument aufgezeichnet, und zwar in einer Küvette mit einem 2-mm-Durchgang. Messungen wurden alle 0,1 nm durchgeführt, mit einer Antwortzeit von 2 Sekunden und einer Bandweite von 1 nm, und zwar mit einer Scangeschwindigkeit von 50 nm/min. Die im Text gezeigten Spektren repräsentieren einen Durchschnitt über 20 Scans. Die Proteinkonzentration, die aus einer Absorption bei 280 nm berechnet wurde (Pace et al., 1995), betrug 10 μM. Die Versuche wurden in 25 mM Na₂HPO₄, pH 6,5 bei 5°C durchgeführt.
Thermale Denaturierung: Die thermale Denaturierung wurde durch Beobachten der Signalveränderung bei 222 nm über einen Temperaturbereich von 6–90°C in einer Küvette mit einem 2-mm-Durchgang gemessen. Die Messungen wurden in 0,5-Inkrementschritten durchgeführt, mit einer Antwortzeit von 2 s und einer Bandweite von 1 nm, bei einem Temperaturverlauf von 50°C/Stunde. Die aus der Absorption bei 280 nm berechnete Proteinkonzentration betrug 10 μM (Pace et al., 1995) und die Messungen wurden in 25 NaH₂PO₄ mM, pH 6,5 durchgeführt. Die Kurven wurden in ein Zwei-Zustands-Modell angepasst, und zwar unter Verwendung der mittleren Temperatur (T_m), der Enthalpie-Veränderung an der mittleren Temperatur (ΔH_m) und der überschüssigen Hitze-Kapazitäts-Veränderung (ΔC_p) als Anpassungsparameter. Dies erfolgte gemäß der nachstehenden Gleichung: Funf = FN + FU·exp {(ΔH(Tm)(1Tm – 1/t) + ΔCp(In(T/Tm) – T – Tm))/R}/(1 + exp {(ΔH(Tm)(1/Tm – 17T + ΔCp(In(T/Tm) – T – Tm)/T))/R}) Gleichung 1in welcher F_unf die Fraktion des ungefalteten Proteins als eine Funktion der Temperatur (T) darstellt, und F_N und F_U jeweils die Fraktion des vollständig nativen und des vollständig ungefalteten Proteins darstellen, die durch die lineare Anpassung der Basislinien gewonnen wurden, die der Übergangsregion vorgehen und dieser folgen.
Chemische Stabilität: Versuche zur chemischen Denaturierung und Renaturierung wurden bei 25°C in 50 mM Na₂HPO₄, pH 6,5 durchgeführt. Die eingesetzte Proteinkonzentration betrug 7 μM bezüglich IL-4-Wildtyp und bezüglich IL-4-W91S, sowie 5 μM bezüglich IL-4BC-Helix. Um das denaturierte Protein und das Protein zu mischen, wurde das automatische Titrationssystem von Jasco eingesetzt. Die GdnHCl-Konzentration wurde durch Messen des refraktiven Index der Lösung berechnet, wie von Pace et al. (1990) beschrieben. Die Entfaltung und Rückfaltung des Proteins wurden durch Beobachtung der Veränderung im CD-Signal bei 222 nm beobachtet. Die Elliptizitäts-Ausleseergebnisse wurden auf die entfaltete Fraktion normalisiert, und zwar unter Verwendung der Standardgleichung: Funf = (θ – θN)/(θD – θN) Gleichung 2in welcher θ der Elliptizitäts-Wert bei einer bestimmten Konzentration des denaturierenden Mittels ist, und θ_N und θ_D für die Elliptizitäten des vollständig nativen Proteins und des vollständig entfalteten Proteins bei jeder Konzentration des Denaturierungsmittels stehen, und wurden aus der linearen Regression der Prä- und Post-Entfaltungsbasislinien berechnet. Unter Annahme eines Zwei-Zustand-Modells kann die Gleichgewichtskonstante für die Denaturierung für jede Denaturierungsmittel-Konzentration mit der nachstehenden Gleichung berechnet werden: KD = (FN – F)/(F – FU) Gleichung 3in welcher F_N und F_U jeweils die Fraktion des vollständig nativen und des vollständig entfalteten Proteins darstellen, welche durch die lineare Anpassung der Basislinien gewonnen werden, die der Übergangsregion zuvorgehen und dieser nachfolgen. Es wurde experimentell herausgefunden, dass die freie Energie der Entfaltung in Gegenwart von GdnHCl mit der Konzentration des Denaturierungsmittels linear in Beziehung steht (Pace, 1986):
Der Wert von m und
also die offensichtliche freie Energie der Entfaltung in Abwesenheit eines Denaturierungsmittels, kann mit der folgenden Gleichung berechnet werden ΔGD = –RTInKD Gleichung 5
Die Proportionalitäts-Konstante m reflektiert die Kooperativität des Übergangs und steht vermutlich mit der Differenz in der hydrophoben Oberfläche, die dem Lösungsmittel gegenüber exponiert ist, aus dem nativen und den denaturierten Zuständen in Zusammenhang. Wenn diese Abhängigkeiten berücksichtigt werden, kann die Veränderung in der Elliptizität als Funktion der Konzentration des Denaturierungsmittels auf die folgende Gleichung angepasst werden:
in welcher die Abhängigkeit der intrinsischen Elliptizität von der Denaturierungsmittel-Konzentration sowohl in nativen als auch den denaturierten Zuständen, jeweils durch a[GdnHCl] und b[GdnHCl] berücksichtigt wird (lineare Annäherung Santoro & Bolen, 1988).
NMR-Spektroskopie: NMR-Proben von IL-4 und den mutierten Proteinen wurden durch Auflösung des lyophilisierten Proteins in 45 mM deuteriertem Natriumacetat (NaOAcd₄), pH 5,3, 10% D₂O, 0,1 mM TSP, 0,2% NaN₃ hergestellt, zur Herstellung einer Proteinkonzentration von 500 μM. Die Spektren wurden bei 303 K unter Verwendung von standardisierten Pulssequenzen und Phasen-Zyklisierung aufgezeichnet.
Rezeptor-Bindungsassay: Die Bindungsaffinitäten wurden durch Oberflächen-Plasmonresonanz unter Verwendung eines BIAcore 2000 (Pharmacia Biosensor) gemessen. Eine rekombinante extrazelluläre Domäne der Rezeptor-α-Kette ([C182A,Q206C]IL-4-BP) wurde an einem Biosensor CM5 mit einer Dichte von 1500 bis 2000 pg/mm² immobilisiert, wie von Shen et al. (1996) beschrieben. Die Bindung wurde bei 25°C mittels Perfusion mit HBS-Puffer (10 mM Hepes, pH 7,4/150 mM NaCl/3,4 mM EDTA/0,005%Tensid P20) plus 0,5 M NaCl mit einer Flussrate von 50 μl/min analysiert.
3.2 Ergebnisse
Das in der löslichen zellulären Fraktion vorliegende Produkt wurde durch Anionenaustausch-Chromatografie gereinigt, wobei hier aus dem hohen PI von IL-4 (9,2) Nutzen gezogen wurde, gefolgt von einem Gelfiltrationsschritt. Ca. 1 mg IL-4L23S, IL-4W91S und an der doppelten Mutante IL-4L23SW91S wurde aus 1 Liter Zellkultur gewonnen.
Für die C-Helix-Mutante, also IL-4BC-Helix war die Ausbeute mit 1,6 mg gereinigtem Protein pro Liter Kultur etwas höher. IL-4L23S, und zu einem geringeren Ausmaß IL-4L23SW91S, wurden während der Reinigung extensiv abgebaut, und bei deren Konzentration auf 1 mg/ml ausgefällt. IL-4W91S und IL-4BC-Helix zeigten jedoch ein besseres Verhalten und fällten nicht aus, wenn sie auf 1 mg/ml herunterkonzentriert wurden.
Um zu untersuchen, ob diese zwei Proteine gefaltet waren, wurden Fern-UV-CD-Spektren bezüglich der gereinigten Proben aufgezeichnet und mit dem Spektrum des Wildtyp-Proteins verglichen (Daten nicht gezeigt). Die CD-Spektren von sowohl IL-4W91S und IL-4BC-Helix zeigen die Form, die für ein Protein mit einem hohen α-Helix-Gehalt erwartet wird, unterscheiden sich aber von dem Spektrum von IL-4WT, insbesondere im Wellenlängenbereich zwischen 210 bis 225 nm. Beide Mutanten zeigten ein gut definiertes Minimum bei 208 nm, ähnlich dem Wildtyp-Protein, jedoch war im Falle von IL-4BC-Helix das Signal bei 222 nm weniger negativ als erwartet. Dieser Effekt entsteht vermutlich nicht aus einem stärkeren Beitrag des Random-Coil-Signals, da dieses Protein einen mit der Temperatur zusammenwirkenden Entfaltungsübergang mit einer Tm von 54°C besitzt. Das beobachtete Absinken in der Elliptizität bei 222 nm reflektiert vermutlich den Beitrag einiger Teile des Proteins, die weniger strukturiert sein könnten.
Einen durch zusammenwirkende Temperatur induzierter Übergang wurde auch für IL-4W91S beobachtet (Daten nicht gezeigt), was das Vorliegen tertiärer Wechselwirkungen in beiden Mutanten nahelegte. In diesem Fall sind die Elliptizitätswerte zwischen 208 und 220 nm negativer als im Wildtyp-Protein, und das Minimum bei 222 nm verschob sich auf 218 nm. Diese Unterschiede sind aufgrund der Entfernung des Tryptophan-Rests schwierig zu interpretieren. Aromatische Reste tragen zum Fern-UV-CD-Signal bei, jedoch hängt dieser Beitrag von der Umgebung ab, in welcher der Rest sitzt, und ist schwierig vorherzusagen.
Der Temperatur-induzierte Übergang war jedoch für beide Mutanten nicht vollständig reversibel, wobei nach Abkühlen der Proben von 90°C auf 5°C lediglich 50% des Signals wiedergewonnen werden konnten und ein Teil der Proben in der Küvette während des Experiments ausfiel. Darüber hinaus waren die Proben instabil und fällten nach einem Einfrier- und Auftau-Vorgang aus. Durch Massenspektrometrie und SDS-PAGE-Analyse wurden mehrere Spezies mit niedrigem Molekulargewicht identifiziert, was auf einen Abbau in beiden Proben hindeutete. Weder IL-4W91S noch IL-4BC-Helix konnten IL-4Rα binden, wie in einem Plasmon-Resonanzversuch bestimmt wurde.
3.2.1 In vitro-Charakterisierung von IL-4W91S und IL-4BC-Helix
Die Tatsache, dass die IL-4-Mutanten, die in E. coli löslich produziert wurden, nicht an den IL-4-Rezeptor binden konnten, legt nahe, dass diese Proteine nicht richtig gefaltet waren. Dennoch wurde überlegt, dass es interessant wäre, das in vitro- Rückfaltungsverhalten dieser Mutanten zu beobachten. Die Idee war, dass, obgleich das in dem Überstand vorliegende Protein nicht aktiv war, die Fraktion in den Inclusion Bodies in vitro dennoch effizienter rückfalten konnte als das Wildtyp-Protein.
IL-4WT und die zwei Mutanten IL-4W91S und IL-4BC-Helix wurden in AD494 überexprimiert. Diesmal wurden anstelle der Löslichkeit die Expressions-Bedingungen hinsichtlich einer Maximierung der Proteinproduktion optimiert. Wenn die Zellen mit einer optischen Dichte von 0,4 bis 0,5 mit 0,16 mM IPTG induziert wurden, konnten höhere Expressionsmengen gewonnen werden. Eine Proteinreinigung aus den Inclusion Bodies und die in vitro-Rückfaltung wurden gemäß den zuvor beschriebenen Verfahren durchgeführt (Kato et al., 1985; Weigel et al., 1989).
3.2.2 Rückfaltungsausbeute und Aktivitätassays
Die Bindungskonstanten von IL-4W91S und IL-4BC-Helix, die aus der unlöslichen zellulären Fraktion renaturiert wurden, an den IL-4Rα-Rezeptor wurden gemessen (siehe Tabelle 3). Tabelle 3: In vitro-Rückfaltungsausbeute und K_d des IL-4-Wildtyps und den angegebenen Mutanten

Protein Rückfaltungsausbeute (%) K_d (nM)

IL-4-Wildtyp 13 1,52

IL-4W91S 15 2,95

EL-4BC-Helix 23 1,64
Die Rückfaltungsausbeute von IL-4WT und den mutierten Proteinen sind in Tabelle 3 gezeigt. Diese Werte stellen die Menge an korrekt rückgefaltetem Protein dar und sind ein Durchschnitt bezüglich der Daten, die in vier unabhängigen Experimenten gewonnen wurden. In zwei dieser Experimente wurden die Proteine in Ein-Liter- Schüttelflaschen überexprimiert, wie im Verfahrensteil beschrieben. In zwei anderen Experimenten wurden IL-4WT und die zwei mutierten Proteine aus Zellen isoliert, die nach einer Fermentation mit niedriger Zelldichte im Zehn-Liter- und Hundert-Liter-Maßstab gewonnen wurden (siehe Verfahrensteil). In den vier Experimenten faltete IL-4BC-Helix mit einer ca. zweifachen Ausbeute im Vergleich zu derjenigen von IL-4WT, während der K_d für IL-4Rα identisch mit demjenigen des Wildtyp-Proteins bleibt. Erste Daten bezüglich einer oxidativen Rückfaltung von IL-4 legen nahe, dass der beobachtete Anstieg in der Rückfaltungsausbeute von IL-4-BC-Helix ein Ergebnis der Destabilisierung der nicht-nativen Isoform ist, die während der Rückfaltung des Wildtyp-Proteins akkumuliert (siehe 9). Andererseits verbesserte der Austausch von W91 durch Serin nicht die Rückfaltung des Proteins. Darüber hinaus führt diese Mutation zu einem zweifachen Absinken in der Bindungsaffinität an IL-4Rα, was in einer guten Übereinstimmung mit früheren Untersuchungen steht, was eine kleine Rolle von W91 bei der Rezeptorbindung nahelegt (Wang et al., 1997).
3.2.3 Thermodynamische und strukturelle Charakterisierung der Proteine
Die gereinigten Proben von IL-4W91S und IL-4BC-Helix zeigen NMR-Spektren, die ähnlich mit denjenigen des Wildtyps sind (10).
Um den Effekt der erwünschten Mutationen auf die Stabilität des Proteins zu untersuchen, wurden thermische Gleichgewichtsuntersuchungen (11a) und chemische Denaturierungsuntersuchungen (11b) durchgeführt. IL-4 ist ein zu stabiles Protein, um es mit einer Temperatur im Bereich von 0 bis 100°C denaturieren zu können. Um daher einen vollständigen Entfaltungs-Übergang zu beobachten, wurden thermische Denaturierungsversuche in Gegenwart von 2 M GdnHCl durchgeführt. Unter diesen Bedingungen kann ein vollständiger Übergang beobachtet werden. Interessanterweise konnte für das Wildtyp-Protein bei Temperaturen unterhalb von 20°C eine kalte Denaturierung beobachtet werden. Bei höheren GdnHCl-Konzentrationen sind die Proteine bei hohen Temperaturen vollständig denaturiert, jedoch sind sie bei niedrigen Temperaturen nicht vollständig gefaltet. Konsequenter weise ist es nicht möglich, präzise thermodynamische Daten aus den generierten Kurven zu gewinnen, obgleich die Temperatur, Tm, bei welcher die Hälfte des Proteins denaturiert ist, mit geeigneter Präzision bestimmt werden kann (Tabelle 4). Tabelle 4: Veränderung in der freien Energie bezüglich der Entfaltung durch GdnHCl und mittlere Übergangstemperatur Tm des IL-4-Wildtyp-Proteins und der stabilisierten Mutanten
Die Stabilität der zwei Mutanten in deren oxidierten Form wurde mit der des Wildtyp-Proteins bestimmt und verglichen. Eine freie Entfaltungsenergie von 4,3 kcal/mol wurde für IL-4WT bestimmt. Dieser Wert ist 1,6 Kcal/mol niedriger als derjenige, der in früher publizierten Untersuchungen ermittelt wurde (Windsor et al., 1991). Die Anpassung der Daten in der späteren Arbeit ist jedoch nicht präzise und Fehlerwerte werden nicht zur Verfügung gestellt. Eine genauere Untersuchung der dort dargelegten Daten legt eine freie Energie der Entfaltung für IL-4WT von ungefähr 4,5 Kcal/mol dar, was in Übereinstimmung mit unseren Ergebnissen ist.
Eine Entfernung von Lösungsmittel-exponierten hydrophoben Resten sollte das Zielprotein durch den "inversen hydrophoben Effekt" (Pakula & Sauer, 1990) stabilisieren. In dem vorliegenden Fall stabilisiert die Substitution von W91 durch Serin das Wildtyp-Protein um 1,4 Kcal/mol und induziert eine Verschiebung des Tm-Werts um 8°C. Die beobachtete Stabilisierung wird durch einen Anstieg in der Geschwindigkeit des Entfaltungsprozesses hervorgerufen, was wiederum in einen Anstieg in dem m-Wert resultiert. Dieser Anstieg in der Geschwindigkeit könnte auf die Destabilisierung eines Faltungs-Zwischenproduktes, des denaturierten Zustandes oder beides zurückzuführen sein (siehe die vergleichende Übersicht von Shortle D 1996). Ein ähnlicher Effekt (Anstieg in ΔG von 1,4 kcal/mol und ein Anstieg im m-Wert von 1,6 auf 1,9) wurde für das chemotaktische Protein, CheY gefunden, als ein Lösungsmittelexponierter Phe-Rest (F14) durch Asn ersetzt wurde (Mufioz et al., 1994a; Lopez-Hernandez et al., 1997). In diesem Fall war die Veränderung in dem Verlauf auf eine relative Destabilisierung eines Faltungs-Zwischenproduktes zurückzuführen, was nur kinetisch detektiert werden konnte. Vorliegend wurde versucht, die Gleichgewichtsdenaturierungskurve und die Renaturierungskurve von IL-4 unter Annahme eines Drei-Zustand-Modells anzupassen. Ähnlich wie für CheY wurde vorliegend keine bedeutende Verbesserung in der Anpassung der Kurven festgestellt. Aus diesen Gründen kann gegenwärtig die Veränderung in dem m-Wert nicht einer Destabilisierung eines Gleichgewichts-Faltungszwischenproduktes zugeordnet werden, das in der Faltung des oxidierten Proteins vorliegt.
Bezüglich einer Helix-Stabilisierung konnte gezeigt werden, dass diese immer zu einem Anstieg in der Protein-Stabilität führt, und dass diese in einigen Fällen thermostabile Proteine produzieren konnte (Villegas et al., 1996, siehe Kapitel 2), jedoch war der Anstieg in der Stabilität immer niedriger als basierend auf den theoretischen Vorhersagen. Dies ist auf die gleichzeitige Stabilisierung des denaturierten Zustands unter nativen Bedingungen zurückzuführen. Die in Helix-C eingeführten Mutationen stabilisieren das Protein zu einem niedrigeren Ausmaß (0,5 kcal/mol) und induzieren eine kleinere Verschiebung (6°C) in der Tm von IL-4WT. In diesem Fall rühren die Stabilisierungseffekte aus einer Kombination eines Anstiegs in der Geschwindigkeit des Übergangs (m-Wert) her, und aus einem leichten Anstieg in der GdnHCl-Konzentration, die zur Denaturierung der Hälfte des Proteins notwendig ist [GdnHCl]_1/2. Obgleich der Anstieg im m-Wert, der für diese Mutante beobachtet wurde, nicht groß ist, wurde er durchgängig in zwei unabhängigen Denaturierungs- und Renaturierungsversuchen beobachtet.
Es sollte bemerkt werden, dass die m-Werte, die mit der vorliegenden Untersuchung erhalten wurden (Tabelle 1) für ein Protein der Größe von IL-4 (15 kDa) recht klein ist. Dies kann auf die Tatsache zurückzuführen sein, dass die Entfaltungs- und Rückfaltungsversuche in Abwesenheit von reduzierenden Substanzen durchgeführt wurden. Daher bilden sich drei Disulfid-Brücken im denaturierten Zustand, die zu dem Vorliegen einer bestimmten Reststruktur führen könnten.
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Stabilisierung eines Cytokins, wobei das Verfahren die folgenden Schritte aufweist: a) Mutieren der Aminosäuresequenz des Cytokins, um Lösungsmittel-exponierte hydrophobe Reste durch Aminosäuresubstitution zu entfernen; und b) Mutieren der Aminosäuresequenz des Cytokins, um Helix-stabilisierende Reste einzuführen; derart, dass während der Faltung des Cytokins ein Zwischenprodukt, das während der Faltung des Cytokins gebildet wird, im Verhältnis zum Cytokin in dessen gefalteten Zustand destabilisiert ist.
Verfahren nach Anspruch 1, in welchem die Mutationsschritte auf die C-Helix des Cytokins angewandt werden.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, in welchem das Cytokin IL-4 ist.
Verfahren nach Anspruch 3, in welchem das IL-4 menschliches IL-4 ist.
Verfahren nach Anspruch 4, in welchem Schritt a) den Schritt der Einführung eines Serinrestes an Position 23 und/oder 91 in der vollen Länge der IL-4-Aminosäuresequenz aufweist.
Verfahren nach Anspruch 4, welches die Einführung eines Serinrestes an Position 69 und der Sequenz Ala-Glu-Ala-Asn an den Positionen 71–74 in der vollen Länge der IL-4-Aminosäuresequenz aufweist.
Verfahren nach Anspruch 4, welches die Einführung einer oder mehrerer der folgenden Mutationen aufweist: Threonin 69 zu Serin; Glutamin 71 zu Alanin; Glutamin 72 zu Glutamat, Phenylalanin 73 zu Alanin; Histidin 74 zu Asparagin.
Verfahren nach Anspruch 4, welches die Codierung für die Sequenz ASAAEANRHKQLIRFLKRLDRNLWGLAG an den Positionen 68–95 in der vollen Länge der Aminosäuresequenz aufweist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, welches zusätzlich den folgenden Schritt aufweist: c) Einschließen der Pro-Sequenz von Cytokin an dessen N-Terminus.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, in welchem das Cytokin weiter mutiert wird, so dass die Bindung des Cytokins an IL-4Rα ermöglicht wird, wobei jedoch die Bindung des Cytokins an IL-13Rα und/oder die γ_c-Kette verhindert wird.
Verfahren nach Anspruch 10, welches die Substitution eines Aspartat-Restes an Position 121 und/oder 124 in der vollen Länge der IL-4-Aminosäuresequenz aufweist.
Menschliches IL-4, das an löslichen exponierten hydrophoben Resten an Position 23, an Position 91 oder an beiden Positionen 23 und 91 der vollen Länge der Sequenz durch Aminosäuresubstitution mutiert ist, und das durch Einführung von Helix-stabilisierenden Resten mutiert ist, derart, dass während der Faltung des Cytokins ein Zwischenprodukt, welches während der Faltung des Cytokins gebildet wird, im Verhältnis zum Cytokin in dessen gefaltetem Zustand destabilisiert ist.
Menschliches IL-4 nach Anspruch 12, bei welchem die Mutation an Position 23, Position 91 oder an beiden Positionen 23 und 91 in der vollen Länge der Sequenz ein Serinrest ist.
Menschliches IL-4 nach Anspruch 12 oder 13, welches eine oder mehrere der folgenden Helix-stabilisierenden Mutationen aufweist: Threonin 69 zu Serin; Glutamin 71 zu Alanin; Glutamin 72 zu Glutamat, Phenylalanin 73 zu Alanin; Histidin 74 zu Asparagin.
Menschliches IL-4 nach Anspruch 12 oder Anspruch 13, welches an den Positionen 68–95 in der vollen Länge der Aminosäuresequenz für die Sequenz ASAAEANRHKQLIRFLKRLDRNLWGLAG codiert, sowie funktionell äquivalente Fragmente davon.
Peptid, welches das funktionell äquivalente Fragment eines mutierten Cytokins nach Anspruch 15 aufweist.
Verfahren zur Herstellung eines Cytokins nach einem der Ansprüche 12–15, oder eines Peptids nach Anspruch 16, wobei das Verfahren den Schritt der Einführung einer für das Cytokin oder Peptid codierenden Nucleinsäure in eine Wirtszelle aufweist.
Verfahren nach Anspruch 17, bei welchem die Wirtszelle ein E. coli-Bakterium ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 oder 18, welches zusätzlich den Schritt des Einschlusses der Pro-Sequenz von Cytokin am N-Terminus des Cytokins mit einschließt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17–19, welches zusätzlich den Schritt der Exprimierung des Cytokins in der Wirtszelle in Verbindung mit einem Chaperon-Protein aufweist.
Verfahren nach Anspruch 20, bei welchem das Chaperon das GroEL/ES-System oder Thioredoxin ist.
Cytokin nach einem der Ansprüche 12–15 oder Peptid nach Anspruch 16 zur Verwendung als pharmazeutisches Mittel.
Verwendung eines Cytokins nach einem der Ansprüche 12–15 oder eines Peptids nach Anspruch 16 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prävention einer Allergie bei einem Säugetier, vorzugsweise einem Menschen.
Pharmazeutische Zusammensetzung, welche ein Cytokin nach einem der Ansprüche 12–15 oder ein Peptid nach Anspruch 16 aufweist, ggf. als pharmazeutisch-akzeptierbares Salz, in Kombination mit einem pharmazeutischakzeptierbaren Träger.
Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 24, bei welchem ein Cytokin nach einem der Ansprüche 12–15 oder ein Peptid nach Anspruch 16 mit einem pharmazeutisch-akzeptierbaren Träger in Verbindung gebracht wird.
Diagnostisches Kit, welches ein Cytokin nach einem der Ansprüche 12–15 oder ein Peptid nach Anspruch 16 aufweist.
Transgenes nicht-menschliches Säugetier, das ein Transgen trägt, welches für ein Cytokin nach einem der Ansprüche 12–15 oder ein Peptid nach Anspruch 16 codiert.
Verfahren zur Herstellung eines nicht-menschlichen transgenen Tieres, welches den Schritt der Einführung einer DNA in den Embryo eines nichtmenschlichen Säugetiers, vorzugsweise einer Maus, aufweist, wobei die DNA für ein Cytokin gemäß einem der Ansprüche 12–15 oder für ein Peptid nach Anspruch 16 codiert.