DE69837604T2

DE69837604T2 - Expression heterologer proteine

Info

Publication number: DE69837604T2
Application number: DE69837604T
Authority: DE
Inventors: Cesira Galeotti
Original assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics SRL
Current assignee: GSK Vaccines SRL
Priority date: 1997-02-19
Filing date: 1998-02-18
Publication date: 2008-01-03
Anticipated expiration: 2018-02-19
Also published as: ES2286844T3; US6361969B1; GB9703406D0; DK1007698T3; PT1007698E; EP1007698A1; ATE360079T1; JP2001514490A; EP1007698B1; DE69837604D1; JP2008173126A; WO1998037208A1; JP4308916B2; US20020146793A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Expressionssystem, das heterologe Proteine liefert, die durch einen nicht-nativen Wirtsorganismus exprimiert werden, die jedoch die biologische Aktivität und/oder die Struktur wie bei einem nativen Protein aufweisen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Fortschritte in der Molekularbiologie und der Gentechnik während der letzten Dekade machten es möglich, große Mengen an Proteinprodukten unter Verwendung von heterologen Expressionssystemen zu erzeugen.
Die Verwendung von heterologen Wirten zur Erzeugung beispielsweise von therapeutischen Proteinen kann allerdings zu Unterschieden in den biologischen und/oder strukturellen Eigenschaften des Rekombinationsprodukts führen. Von den biochemischen Modifizierungen, die üblicherweise bei Proteinen während oder nach ihrer Synthese in der Zelle auftreten, ist die Bildung von Disulfidbrücken von Relevanz, da diese Modifizierung mit der korrekten Faltung oder Assemblierung von über Disulfidbrücken gebundenen Proteinen gekoppelt ist (Übersicht von J.C.A. Bardwell und J. Beckwith, Cell. 74: 769–771, 1993; R.B. Freedman in Protein Folding, T.E. Creighton (Hrsg.), W.H. Freeman and Co., New York, Seiten 455–539, 1992).
In Bakterien und anderen Wirtszellen werden zum Beispiel unter bestimmten Bedingungen manche heterologe Proteine innerhalb der Zellen als "refraktile Körper" oder "Einschlusskörper" präzipitiert. Solche refraktile Körper oder Einschlusskörper bestehen aus dichten Massen von teilweise gefaltetem, reduziertem heterologem Protein, das oft in einer Form vorliegt, die nicht biologisch aktiv ist (S.B. Storrs et al., Protein Folding – American Chemical Society Symposium Series 470, Kapitel 15: 197–204, 1991). Es wird angenommen, dass die biologische Inaktivität von nativ disulfidgebundenen refraktilen heterologen Proteinen oder heterologen Einschlussproteinen durch die nicht-korrekte Proteinfaltung oder Assemblierung bedingt ist, die dadurch hervorgerufen wird, dass die Disulfidbindungen in den Proteinen nicht oder nicht richtig gebildet werden. Es wird angenommen, das die biologische Inaktivität von refraktilen heterologen Proteinen oder heterologen Einschlussproteinen durch den Prozess einer nicht-korrekten Proteinfaltung oder Assemblierung bedingt ist, der entweder vor oder nach der intrazellulären Präzipitation oder während der Isolierung der Proteine eintritt.
Darüber hinaus wird die biologische Funktion eines Proteins sehr oft durch den Oxidationszustand seiner Sulfydrylgruppen reguliert oder zumindest beeinflusst. Dies ist hinsichtlich einiger Enzymaktivitäten der Fall, wobei die Reversibilität und das Timing der Oxidation von Sulfydrylgruppen als physiologischer Kontrollmechanismus angegeben wurde.
Es gibt zahlreiche Beispiele für disulfidgebundene Proteine in der Literatur. So ist zum Beispiel bekannt, dass die meisten viralen Glycoproteine sowie einige Wachstumsfaktoren Disulfidbindungen aufweisen. Disulfidbindungen sind allgemein für eine korrekte Proteinfaltung wesentlich. Zu den Beispielen für disulfidgebundene rekombinierte heterologe Proteine, bei denen gezeigt wurde, dass sie fehlgefaltet sind, wenn sie beispielsweise in Hefezellen exprimiert werden, gehören das große Oberflächenprotein des Hepatitis-B-Virus (Biemans et al., DNA Cell Biol., 10: 191–200, 1991), α-1-Antitrypsin (Moir und Dumais, Gene, 56: 209–217, 1987) und Erythropoietin (Elliott et al., Gene, 79: 167–180, 1989). Zu den Beispielen für rekombinierte Proteine, die beispielsweise in Insektenzellen oder Säugerzellen exprimiert werden und bei denen gezeigt wurde, dass Disulfidbindungen für eine korrekte Proteinfaltung wesentlich sind, gehören der Granulocyten/Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (GM-CSF) (Kaushansky et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 1213–1217, 1989), das Glycoprotein gp55 des Friend-Erythroleukämie-Virus (SFFV) (Gliniak et al., J. Biol. Chem., 266: 22991–22997, 1991), das Glycoprotein des Virus der vesikulären Stomatitis (VSV-G) (Grigera et al., J. Virol., 66: 3749–3757, 1992), das Lungen-Surfactant-Protein D (Crouch et al., J. Biol. Chem., 269: 15808–15813, 1994), der Low-Density-Lipoprotein(LDL)-Rezeptor (Bieri et al., Biochemistry, 34: 13059–13065, 1995), der insulinähnliche Wachstumsfaktor (Nahri et al., Biochemistry, 32: 5214–5221, 1993) sowie das Angiotensin-umwandelnde Enzym (ACE) (Sturrock et al., Biochemistry, 35: 9560–9566, 1996). Es ist festzuhalten, dass in all diesen Fällen die Expression heterologer Proteine in speziellen Wirtszellen lediglich verwendet wurde, um ausreichende Mengen des betreffenden Proteins zu erzeugen, um die Durchführung von Strukturuntersuchungen zu ermöglichen.
Verschiedene Proteinfaktoren, welche die Bildung von Disulfidbindungen katalysieren, wurden bereits charakterisiert. Proteindisulfidisomerase (PDI) ist ein abundantes, multifunktionelles Protein, das im Lumen des endoplasmatischen Reticulums (ER) vorkommt und die richtige Bildung von Disulfidbindungen bei sekretorischen Proteinen und Zelloberflächenproteinen fördert (LaMantia et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 4453–4457, 1991; Farquhar et al., Gene, 108: 81–89, 1991; Freedman, Cell, 57: 1069–1072, 1989; Laboissiere et al., J. Biol. Chem., 270: 28006–28009, 1995).
Eine ähnliche Funktion, jedoch in einem unterschiedlichen zellulären Compartment, wurde einem anderen, kleinen ubiquitären Protein, dem Thioredoxin (TRX), zugeschrieben (Gan, J. Biol. Chem., 266: 1692–1696, 1991; Muller, J. Biol. Chem., 266: 9194–9202, 1991; Chivers et al., EMBO J., 15: 2659–2667, 1996), das eine Sequenz an der aktiven Stelle aufweist, die der von PDI ähnlich ist. Thioredoxine sind im Cytosol vorkommende Polypeptide, die befähigt sind, die Reduktion von Disulfiden unter Verwendung von Glutathion als Reduktionsmittel zu katalysieren (Holmgren, J. Biol. Chem., 264: 13963–13966, 1989). Es wurde postuliert, dass Thioredoxin auch bei der Reduktion von vorzeitig gebildeten Disulfiden bei Proteinen beteiligt sein kann, die in das ER eintraten. Da die biologische Aktivität einer Reihe von Schlüsselenzymen, die bei entscheidenden Stoffwechselwegen beteiligt sind, vom Cytosol-Redoxsystem abhängt, ist es plausibel, dass TRX bei der Modifizierung von Proteinen, die bei der Faltung in anderen zellulären Compartments als dem Cytosol beteiligt sind, eine relevante Rolle spielt.
Bei zahlreichen Organismen, zum Beispiel bei Bakterien, Hefen, Säugerzellen und Insektenzellen, die genetisch so modifiziert wurden, dass sie heterologe Proteine exprimieren bzw. überexprimieren, besteht das Problem, das bei den meisten Expressionssystemen auftritt, in der Unfähigkeit, Proteine zu exprimieren, die biologisch aktiv sind.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es hat nun den Anschein, dass aufgrund des Fehlens der für eine korrekte Faltung oder Assemblierung von heterologen Proteinen in nicht-nativen Expressionswirten erforderlichen Enzyme oder aufgrund einer ungenügenden Menge davon solche exprimierten heterologen Proteine oft nicht biologisch aktiv sind und/oder eine nicht-korrekte Proteinstruktur aufweisen.
Die vorliegende Erfindung beseitigt dieses Problem und ermöglicht eine Expression biologisch aktiver heterologer Proteine und/oder heterologer Proteine mit korrekter Struktur in nicht-nativen Expressionswirten.
Es wurde nun festgestellt, das Expressionskassetten, die PDI oder TRX codieren, zur Transformation eines Wirtsorganismus verwendet werden können, wodurch es ermöglicht wird, PDI oder TRX zu überexprimieren. Der Wirtsorganismus ist bevorzugt eine Hefe.
Hefezellen, die zum Beispiel diese Proteine überexprimieren, können anschließend oder gleichzeitig mit Expressionsvektoren transformiert werden, die ein erwünschtes heterologes Protein oder mehrere erwünschte heterologe Proteine codieren. Die in solchen PDI-TRX-transformierten Hefezellen exprimierten heterologen Proteine liegen aufgrund der Aktivität der Enzyme PDI oder TRX, die in der gleichen Zelle coexprimiert werden, zur Erzeugung von Disulfidbindungen in einer richtig gefalteten, biologisch aktiven Form vor.
Solche Systeme zur Erzeugung biologisch aktiver heterologer Proteine können vorteilhaft zur Herstellung beispielsweise von Proteinen zur Verwendung in der Human- oder Veterinärtherapie und/oder zur diagnostischen Verwendung oder zur Herstellung anderer Proteine von kommerziellem Interesse oder von Interesse für die Forschung verwendet werden. Die korrekte und optimale biologische Aktivität, die durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung erzielt wird, ist beispielsweise bei der Herstellung von wirksamen Arzneimitteln und diagnostischen Reagenzien von höchster Bedeutung.
Es wurde festgestellt, dass die PDI-Überexpression in Saccharomyces cerevisiae die Sekretion des Homodimers von humanem Platelet-derived Growth-Factor B (PDGF-BB) in das Kulturmedium fördert (Robinson et al., Bio/Technology, 12: 381–384, 1994).
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde ein erhöhtes Niveau der Wirksamkeit der Faltung heterologer Proteine in Zellen nachgewiesen.
Gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung wird ein Vektor angegeben, der eine Expressionskassette aufweist, die eine DNA-Sequenz enthält, die ein Protein codiert, das befähigt ist, die Bildung von Disulfidbrücken zu katalysieren.
Ein derartiger Vektor führt wünschenswerterweise zu einer (Über)expression des Proteins in einer transformierten Wirtszelle, wodurch die Bedingungen für eine korrekte Faltung des heterologen Proteins erzielt werden.
Das Protein kann ein beliebiges Protein sein, das befähigt ist, die Ausbildung von Disulfidbrücken zu katalysieren, und ist bevorzugt Proteindisulfidisomerase (PDI) oder Thioredoxin (TRX) oder eine Kombination davon. Die Gene, die PDI und TRX codieren, werden vorzugsweise aus Hefe erhalten, noch bevorzugter aus S. cerevisiae. Die Quellen für PDI und TRX können jedoch auch beispielsweise humane Wildtyp-cDNA-Sequenzen und mutante cDNA-Sequenzen umfassen.
Der Ausdruck "Expressionskassette", wie er hier verwendet wird, bezeichnet eine DNA-Sequenz, die mindestens eine strukturelle DNA-Sequenz umfasst, die ein Protein und geeignete Expressionssequenzen und wahlweise Kontrollsequenzen codiert, um die Expression der strukturellen DNA-Sequenz zu erleichtern.
Der Vektor kann mehr als eine DNA-Sequenz, die ein Protein codiert, das befähigt ist, die Bildung von Disulfidbindungen zu katalysieren, in einer oder mehreren Expressionskassetten enthalten. Die DNA-Sequenzen können Wiederholungen der gleichen DNA-Sequenz darstellen oder können verschiedene Proteine codieren, die befähigt sind, die Bildung von Disulfidbindungen zu katalysieren. Das Vorsehen von mehrfachen Kopien von DNA-Sequenzen des gleichen Proteins oder von unterschiedlichen Proteinen, die befähigt sind, die Bildung von Disulfidbindungen zu katalysieren, stellt einen Weg zur Erzielung der gewünschten Überexpression der Proteine und damit zur Erzielung des vorteilhaften und erfinderischen technischen Effekts dar.
Die Expressionskassette kann ferner eine DNA-Sequenz enthalten, die ein Leader-Peptid zur Sekretion enthält, das am 5'-Ende des Gens fusioniert ist, welches das Protein codiert, das befähigt ist, die Bildung von Disulfidbindungen zu katalysieren. Wenn so verfahren wird, führt das Konstrukt günstigerweise (1) zu einer (Über)expression des Proteins in der transformierten Zelle und (2) zu einer Lokalisation des (über)exprimierten Proteins im ER und/oder anderen sekretorischen Compartments, wo es seine Funktion ausüben kann, wodurch die Bedingungen für eine korrekte Faltung des heterologen Proteins hergestellt werden.
Der Vektor des ersten Aspekts der Erfindung kann ferner auch eine Expressionskassette aufweisen, die eine oder mehrere DNA-Sequenzen enthält, die ein heterologes Protein oder mehrere heterologe Proteine codieren. Das heterologe Protein ist bevorzugt das E2₇₁₅-Hüll-Glycoprotein des Hepatitis C-Virus oder humaner c-fos-induzierter Wachstumsfaktor (FIGF).
Der Vektor des ersten Aspekts der Erfindung kann integrativ oder episomal sein, wenn er durch Transformation in einen Wirtsorganismus eingebracht wurde. Der Vektor ist vorzugsweise zur Integration in den Wirtsorganismus befähigt.
Gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung wird ein Wirtsorganismus angegeben, der mit einem Vektor gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung transformiert ist.
Auch in diesem Fall können wiederum mehrfache Kopien des Vektors entweder als episomale Vektoren oder als in das Genom des Wirtsorganismus integrierte Vektoren vorliegen, um zur (Über)expression des Proteins beizutragen, das befähigt ist, die Bildung von Disulfidbindungen zu katalysieren.
Gemäß einem dritten Aspekt der Erfindung wird ein Wirtsorganismus des zweiten Aspekts der Erfindung angegeben, der ferner mit einem Vektor transformiert ist, der eine Expressionskassette enthält, die eine oder mehrere DNA-Sequenzen enthält, die ein heterologes Protein oder mehrere heterologe Proteine codieren. Dieser weitere Vektor kann bei Transformation in den Wirtsorganismus integrativ oder episomal sein.
Der Wirtsorganismus kann der Co-Transfektion mit mehr als einem Vektor unterzogen werden, der eine Expressionskassette enthält, die eine oder mehrere DNA-Sequenzen umfasst, die ein heterologes Protein oder mehrere heterologe Proteine codieren.
Der Wirtsorganismus kann ein beliebiger Wirtsorganismus sein, in dem bei der Expression eines heterologen Proteins das Risiko der Bildung einer nicht-korrekten Disulfidbindung besteht.
Das heterologe Protein kann ein beliebiges Protein sein, das im Wirtsorganismus normalerweise nicht erzeugt wird und das bei Nicht-Vorliegen einer (Über)expression des Proteins, das befähigt ist, die Bildung von Disulfidbindungen zu katalysieren, in einer Form mit nicht-korrektren Disulfidbindungen erzeugt würde. Das heterologe Protein ist bevorzugt das HCV-E2₇₁₅-Hüll-Glycoprotein oder humaner Wachstumsfaktor FIGF.
Der Wirtsorganismus gemäß dem zweiten und dem dritten Aspekt der Erfindung ist bevorzugt eine Hefe und noch bevorzugter S. cerevisiae.
Nach einem vierten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Erzeugung eines Wirtsorganismus gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung angegeben, das die Transformation eines Wirtsorganismus mit einem Vektor des ersten Aspekts der Erfindung umfasst.
Gemäß einem fünften Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Erzeugung eines Wirtsorganismus gemäß dem dritten Aspekt der Erfindung angegeben, das ferner die Transformation eines Wirtsorganismus des zweiten Aspekts der Erfindung entweder anschließend oder gleichzeitig mit einem Vektor umfasst, der eine Expressionskassette aufweist, die eine DNA-Sequenz oder mehrere DNA-Sequenzen enthält, die ein heterologes Protein oder mehrere heterologe Proteine codieren.
Gemäß einem sechsten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Expression eines heterologen Proteins oder mehrerer heterologer Proteine mit biologischer Aktivität und/oder korrekter Struktur in einem Wirtsorganismus angegeben, das folgende Schritte umfasst:

(a) Transformieren eines Wirtsorganismus mit einem oder mehreren Vektoren gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung;
(b) weitere Transformation des Wirtsorganismus von Schritt (a) entweder anschließend oder gleichzeitig mit einem oder mehreren Vektoren, die eine oder mehrere Sequenzen enthalten, die ein oder mehrere heterologe Proteine codieren, und
(c) Kultivieren des Wirtsorganismus von Schritt (b) unter Bedingungen, die für die Expression des einen heterologen Proteins oder der mehreren heterologen Proteine geeignet sind.

Gemäß einem siebten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Expression eines oder mehrerer heterologer Proteine mit biologischer Aktivität und/oder korrekter Struktur in einem Wirtsorganismus angegeben, das folgende Schritt umfasst:

(a) Transformieren eines Wirtsorganismus gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung entweder anschließend oder gleichzeitig mit einem oder mehreren Vektoren, die eine oder mehrere DNA-Sequenzen enthalten, die ein heterologes Protein oder mehrere heterologe Proteine codieren, und
(b) Kultivieren des Wirtsorganismus von Schritt (a) unter Bedingungen, die für die Expression des einen heterologen Proteins oder der mehreren heterologen Proteine geeignet sind.

Gemäß einem achten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Expression eines heterologen Proteins oder mehrerer heterologer Proteine mit biologischer Aktivität und/oder korrekter Struktur in einem Wirtsorganismus angegeben, das den Schritt der Kultivierung eines Wirtsorganismus, der mit einem oder mehreren Vektoren gemäß dem dritten Aspekt der Erfindung tranformiert ist, unter Bedingungen umfasst, die zur Expression des einen heterologen Proteins oder der mehreren heterologen Protein geeignet sind.
Gemäß einem neunten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Expression des HCV-E2₇₁₅-Hüll-Glycoproteins oder des humanen Wachstumsfaktors FIGF in einem Wirtsorganismus angegeben.
Gemäß einem zehnten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Erzeugung einer immunogenen Zusammensetzung angegeben, das die Maßnahme des Zusammenbringens von HCV-E2₇₁₅-Hüll-Glycoprotein oder humanem Wachstumsfaktor FIGF, die nach dem Verfahren gemäß dem neunten Aspekt der Erfindung erzeugt wurden, mit einem pharmazeutischen Träger und wahlweise einem Adjuvans umfasst.
BESCHREIBUNG SPEZIELLER AUSFÜHRUNGSFORMEN
Bei der praktischen Ausführung der vorliegenden Erfindung werden, wenn nichts anderes angegeben ist, herkömmliche Techniken der Molekularbiologie, der Mikrobiologie, der DNA-Rekombination und der Immunologie angewandt, die zum geläufigen Fachwissen dieses Gebiets gehören. Derartige Techniken sind vollständig in der Literatur erläutert (vgl. zum Beispiel Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite Auflage, 1989; D.N Glover (Hrsg.), DNA Cloning, Bände I and II, 1985; M.J. Gait (Hrsg.), Oligonucleotide Synthesis, 1984; B.D. Hames und S.J. Higgins (Hrsg.), Nucleic Acid Hybridization, 1984; B.D. Hames und S.J. Higgins (Hrsg.), Transcription and Translation, 1984; R.I. Freshney (Hrsg.), Animal Cell Culture, 1986; Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986; B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, 1984; The series, Methods in Enzymology, Academic Press, Inc.; J.H. Miller and M.P. Calos (Hrsg.), Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, Cold Spring Harbor Laboratory, 1987; Wu und Grossman (Hrsg.) sowie Wu (Hrsg.), Methods in Enzymology, Band 154 bzw. 155; Mayer und Walker (Hrsg.), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, Academic Press, London, 1987; Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, zweite Auflage, Springer-Verlag, New York, 1987, und D.M. Weir and C.C. Blackwell (Hrsg.), Handbook of Experimental Immunology, Bände I–IV, 1986).
Wie oben erwähnt, umfassen Beispiele für das Protein, das befähigt ist, die Bildung von Disulfidbindungen zu katalysieren, und das in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, Polypeptide mit geringfügigen Aminosäurevariationen der Aminosäuresequenz der speziell beschriebenen Proteine PDI oder TRX.
Ein signifikanter Vorteil der Erzeugung heterologer Proteine durch DNA-Rekombinationstechniken anstelle der Isolierung und Reinigung eines Proteins aus natürlichen Quellen besteht darin, dass äquivalente Mengen des Proteins unter Verwendung von weniger Ausgangsmaterial erzeugt werden können, als zur Isolierung des Proteins aus einer natürlichen Quelle erforderlich wäre. Die Erzeugung des Proteins durch Rekombinationsverfahren erlaubt es ferner, das Protein in Abwesenheit einiger Moleküle zu isolieren, die normalerweise in Zellen vorliegen. Somit können leicht Proteinzusammensetzungen erzeugt werden, die völlig von irgendwelchen Spuren an verunreinigenden humanen Proteinen frei sind, da das einzige humane Protein, das durch den rekombinanten nicht-humanen Wirt erzeugt wird, das rekombinante Protein ist, um das es geht. Potentielle virale Mittel aus natürlichen Quellen und Viruskomponenten, die für Menschen pathogen sind, werden ebenfalls vermieden.
Zu den Beispielen für pharmazeutisch akzeptable Träger gehören beliebige Träger, die nicht selbst die Produktion von Antikörpern induzieren, die für das Individuum schädlich sind, das die Zusammensetzung erhält. Geeignete Träger sind typischerweise große, langsam metabolisierte Makromoleküle, wie Proteine, Polysaccharide, Polymilchsäuren, Polyglycolsäuren, polymere Aminosäuren, Aminosäure-Copolymere, Lipidaggregate (wie etwa Öltröpfchen oder Liposomen) sowie inaktive Viruspartikel. Solche Träger sind Fachleuten auf dem vorliegenden Gebiet geläufig. Diese Träger können zusätzlich auch als immunstimulierende Mittel (Adjuvantien) fungieren.
Zu den Beispielen für bevorzugte Adjuvantien zur Förderung der Wirksamkeit der Zusammensetzung gehören, ohne dass eine Beschränkung hierauf vorläge: Aluminiumsalze (Alum), wie Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat, Aluminiumsulfat etc., Ölemulsionsformulierungen mit oder ohne weitere spezielle immunstimulierende Mittel, wie Muramylpeptide oder Bakterienzellwandbestandteile, wie zum Beispiel (1) MF59 (veröffentlichte internationale Patentanmeldung WO-A-90/14837 ), das 5 % Squalen, 0,5 % Tween^® 80, 0,5 % Span^® 85 (das wahlweise verschiedene Mengen an MTP-PE (vergleiche unten) enthält, allerdings nicht zwingend), das unter Verwendung eines Mikrofluidizers wie etwa des Mikrofluidizers Modell 110Y (Microfluidics, Newton, MA 02164, USA) zu Submikrometer-Partikeln formuliert ist, (2) SAF, das 10 % Squalen, 0,4 % Tween 80,5 % Pluronic-geblocktes Polymer L121 und thr-MDP (vergleiche unten) enthält und entweder zu einer Submikrometer-Emulsion mikrofluidisiert oder zur Erzeugung einer Emulsion mit größerer Teilchengröße gevortext ist, und (3) das RIBI^TM-Adjuvanssystem (RAS) (Ribi Immunochem, Hamilton, MT, USA), das 2 % Squalen, 0.2 % Tween^® 80 sowie eine oder mehrere Baketerienzellwandbestandteile aus der Gruppe enthält, die besteht aus Monophosphoryllipid A (MPL), Trehalosedimycolat (TDM) und Zellwandgerüst (cell wall skeleton, CWS), bevorzugt MPL + CWS (Detox^TM), Muramylpeptiden, wie N-Acetyl-muramyl-L-threonyl-D-isoglutamin (thr-MDP), N-Acetyl-normuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin (nor-MDP), N-Acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(1',2'-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamin (MTP-PE) etc., and Cytokinen, wie Interleukinen (IL-1, IL-2 etc.), Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor (M-CSF), Tumornecrosefaktor (TNF), etc. Zusätzlich können Saponin-Adjuvantien, wie Stimulon^TM (Cambridge Bioscience, Worcester, MA, USA), oder Partikel, die daraus hergestellt sind, wie ISCOMS (immunstimulierende Komplexe), Verwendung finden. Ferner können komplettes Freund-Adjuvans (CFA) und inkomplettes Freund-Adjuvans (IFA) verwendet werden. Aluminiumhydroxidgel (Alum) und MF59 sind bevorzugt.
Die immunogenen Zusammensetzungen (z.B. das Antigen, der pharmazeutisch akzeptable Träger und das Adjuvans) enthalten typischerweise Verdünnungsmitttel, wie Wasser, Kochsalzlösung, Glycerin, Ethanol, etc. Ferner können Hilfssubstanzen, wie Netzmittel oder Emulgatoren, pH-Puffersubstanzen und dergleichen, in solchen Trägern vorliegen.
Die immunogenen Zusammensetzungen werden typischerweise als injizierbare Zusammensetzungen hergestellt, entweder als flüssige Lösungen oder als Suspensionen; ferner können auch feste Formen hergestellt werden, die zum Lösen oder Suspendieren in flüssigen Trägern vor der Injektion geeignet sind. Die Präparation kann ferner auch emulgiert oder in Liposomen verkapselt werden, um die Adjuvans-Wirkung zu verstärken, wie oben in Bezug auf die pharmazeutisch akzeptablen Träger erläutert wurde.
Immunogene Zusammensetzungen, die als Impfstoffe verwendet werden, enthalten eine immunologisch wirksame Menge der antigenen Polypeptide sowie erforderlichenfalls beliebige weitere Bestandteile, wie sie oben erwähnt wurden. Unter einer "immunologisch wirksamen Menge" wird verstanden, dass die Verabreichung dieser Menge an ein Individuum entweder in einer einzigen Dosis oder als Teil einer Reihe von Verabreichungen zur Behandlung oder Vorbeugung wirksam ist. Diese Menge hängt von dem Gesundheitszustand und dem körperlichen Zustand des zu behandelnden Individuums, der taxonomischen Gruppe des zu behandelnden Individuums (z.B. nicht-humaner Primat, Primat, etc.), der Fähigkeit des Immunsystems des Individuums zur Synthese von Antikörpern, dem Grad des angestrebten Schutzes, der Formulierung des Impfstoffs, der Einschätzung der medizinischen Situation durch den behandelnden Arzt und anderen relevanten Faktoren ab. Es ist zu erwarten, dass diese Menge innerhalb eines relativ breiten Bereichs liegt, der durch Routineversuche ermittelt werden kann.
Die immunogenen Zusammensetzungen werden herkömmlicherweise parenteral verabreicht, z.B. durch Injektion, entweder subkutan oder intramuskulär. Weitere Formulierungen, die für andere Verabreichungsarten geeignet sind, umfassen orale und pulmonale Formulierungen, Suppositorien und transdermale Anwendungen. Das Behandlungsregime kann ein Einzeldosenregime oder ein Mehrfachdosenregime sein. Der Impfstoff kann in Verbindung mit anderen immunregulatorischen Mitteln verabreicht werden.
Der Ausdruck "rekombinantes Polynucleotid", wie er hier verwendet ist, soll ein Polynucleotid genomischen Ursprungs, aus einer cDNA oder halbsynthetischen oder synthetischen Ursprungs bezeichnen, das aufgrund seines Ursprungs oder Manipulation (1) nicht mit einem ganzen Polynucleotid oder einem Teil davon assoziiert ist, mit dem es in der Natur assoziiert ist, (2) mit einem anderen Polynucleotid als dem verknüpft ist, mit dem es in der Natur verknüpft ist, oder (3) in der Natur nicht vorkommt.
Der Ausdruck "Polynucleotid", wie er hier verwendet ist, bezieht sich auf eine polymere Form von Nucleotiden beliebiger Länge, bei denen es sich entweder um Ribonucleotide oder um Desoxyribonucleotide handelt. Dieser Ausdruck bezieht sich lediglich auf die Primärstruktur des Moleküls. Dementsprechend umfasst dieser Ausdruck doppeltsträngige und einzelsträngige DNA und RNA. Er umfasst ferner bekannte Typen von Modifizierungen, zum Beispiel Markierungen, die auf diesem Gebiet bekannt sind, die Methylierung, "Caps", den Austausch von einem oder mehreren der natürlich vorkommenden Nucleotide gegen ein Analogon, Internucleotid-Modifizierungen, wie beispielsweise solche mit ungeladenen Verknüpfungen (z.B. Methylphosphonate, Phosphorsäuretriester, Phosphoramidate, Carbamate, etc.) und mit geladenen Verknüpfungen (z.B. Phosphorthioate, Phosphordithioate, etc.), solche, die Seitenreste enthalten, wie zum Beispiel Proteine, wozu beispielsweise Nucleasen, Toxine, Antikörper, Signalpeptide, Poly-L-Lysin, etc. gehören), solche mit interkalierten Verbindungen (z.B. Acridin, Psoralen, etc.), solche, die Chelatbildner enthalten (z.B. Metalle, radioaktive Metalle, Bor, oxidative Metalle, etc.), solche, die Alkylierungsmittel enthalten, solche, die modifizierte Verknüpfungen enthalten (z.B. alpha-anomere Nucleinsäuren, etc.) sowie nichtmodifizierte Formen des Polynucleotids.
Ein "Replicon" ist ein beliebiges genetisches Element, z.B. ein Plasmid, ein Chromosom, ein Virus, ein Cosmid, etc., das sich wie eine autonome Einheit der Polynucleotid-Replikation innerhalb einer Zelle verhält, d.h., das zur Replikation unter seiner eigenen Kontrolle befähigt ist. Hierzu können wählbare Marker gehören.
Ein "Vektor" ist ein Replicon, in dem ein weiteres Polynucleotidsegment angefügt ist, um so die Replikation und/oder Expression des angefügten Segments zu erzielen.
Der Ausdruck "Kontrollsequenz" bezieht sich auf Polynucleotidsequenzen, die erforderlich sind, um die Expression von codierenden Sequenzen, mit denen sie ligasiert sind, zu bewirken. Die Art solcher Kontrollsequenzen ist je nach dem Wirtsorganismus verschieden; bei Prokaryonten umfassen solche Kontrollsequenzen allgemein Promotoren, die ribosomale Bindungsstelle und die Transkriptionsterminationssequenz; bei Eukaryonten umfassen solche Kontrollsequenzen allgemein Promotoren und die Transkriptionsterminationssequenz. Der Ausdruck "Kontrollsequenzen" soll zumindest sämtliche Bestandteile umfassen, deren Vorliegen für eine Expression erforderlich ist, und kann ferner zusätzliche Bestandteile umfassen, deren Vorliegen vorteilhaft ist, zum Beispiel Leader-Sequenzen und Sequenzen von Fusionspartnern.
"Operativ verknüpft" bezieht sich auf eine räumliche Nähe, bei der die so beschriebenen Bestandteile in einer Beziehung stehen, die es ihnen erlaubt, in ihrer bestimmungsgemäßen Weise zu funktionieren. Eine mit einer codierenden Sequenz "operativ verknüpfte" Kontrollsequenz ist in einer solchen Weise ligasiert, dass die Expression der codierenden Sequenz unter Bedingungen erzielt wird, die mit den Kontrollsequenzen kompatibel sind.
Ein "offener Leserahmen" (Open Reading Frame, ORF) ist ein Bereich einer Polynucleotidsequenz, der ein Polypeptid codiert; dieser Bereich kann einen Teil einer codierenden Sequenz oder eine vollständige codierende Sequenz darstellen.
Eine "codierende Sequenz" ist eine Polynucleotidsequenz, die, üblicherweise über mRNA, in ein Polypeptid übersetzt wird, wenn sie unter die Kontrolle von geeigneten Regulatorsequenzen gebracht wird. Die Grenzen der codierenden Sequenz werden durch ein Translations-Startcodon am 5'-Terminus und ein Translations-Stoppcodon am 3'-Terminus bestimmt. Eine codierende Sequenz kann, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, cDNA und rekombinante Polynucleotidsequenzen umfassen.
"PCR" bezieht sich auf die Technik der Polymerase-Kettenreaktion, wie sie beschrieben ist in Saiki et al., Nature, 324: 163, 1986; Scharf et al., Science, 233: 1076–1078, 1986, und den Patenten US 4 683 195 und US 4 683 202 .
Im hier unterstellten Sinne ist x "heterolog" in Bezug auf y, wenn x nicht natürlich in identischer Weise mit y assoziiert ist, was bedeutet, dass x in der Natur nicht mit y assoziiert ist oder x mit y nicht in der gleichen Weise assoziiert ist, wie dies in der Natur aufgefunden wird.
"Homologie" bezieht sich auf den Grad der Ähnlichkeit zwischen x und y. Die Übereinstimmung der Sequenz einer Form mit der einer anderen Form kann nach auf diesem Gebiet bekannten Techniken ermittelt werden. Die Übereinstimmungen können zum Beispiel durch einen direkten Vergleich der Sequenzinformation des Polynucleotids ermittelt werden. Alternativ dazu kann Homologie ermittelt werden durch Hybridisierung der Polynucleotide unter Bedingungen, unter denen sich stabile Doppelstränge zwischen homologen Bereichen bilden (zum Beispiel solchen, die vor dem S₁-Verdau verwendet würden), und anschließenden Verdau mit einer oder mehreren einzelstrangspezifischen Nucleasen und danach Ermittlung der Größe der durch den Abbau erhaltenen Fragmente.
Der Ausdruck "Polypeptid", wie er hier verwendet ist, bezieht sich auf ein Polymer von Aminosäuren, aber nicht auf eine spezielle Länge des Produkts; daher sind Peptide, Oligopeptide und Proteine in der Definition des Polypeptids eingeschlossen. Dieser Ausdruck bezieht sich ferner nicht auf Modifizierungen des Polypeptids nach der Expression, die auch nicht ausgeschlossen sind, z.B. Glycosylierungen, Acetylierungen, Phosphorylierungen und dergleichen. In dieser Definition eingeschlossen sind beispielsweise Polypeptide, die ein oder mehrere Analoga einer Aminosäure enthalten (hierzu gehören zum Beispiel nicht-natürliche Aminosäuren, etc.), Polypeptide mit substituierten Bindungen sowie andere auf diesem Gebiet bekannte Modifizierungen, und zwar sowohl natürlich vorkommende als auch nicht-natürlich vorkommende Modifizierungen.
Ein Polypeptid oder eine Aminosäuresequenz, die von einer bestimmten Nucleinsäuresequenz "abgeleitet" ist, bezieht sich auf ein Polypeptid mit einer Aminsäuresequenz, die mit der eines in der Sequenz codierten Polypeptids identisch ist, oder einen Teil davon, wobei der Teil aus mindestens 3–5 Aminosäuren besteht, noch bevorzugter aus mindestens 8–10 Aminosäuren und noch bevorzugter aus mindestens 11–15 Aminosäure, oder der immunologisch mit einem Polypeptid identifizierbar ist, das in der Sequenz codiert ist. Diese Terminologie umfasst ferner ein Polypeptid, das durch eine bestimmte Nucleinsäuresequenz exprimiert wird.
Das Protein kann zur Erzeugung von Antikörpern Verwendung finden, die für das Protein spezifisch sind, wobei es sich um monoklonale oder um polyklonale Antikörper handelt. Die Verfahren zur Erzeugung dieser Antikörper sind auf diesem Gebiet bekannt.
"Rekombinante Wirtszellen", "Wirtszellen", "Zellen," "Zellkulturen", und andere derartige Ausdrücke bezeichnen zum Beispiel Mikroorganismen, Insektenzellen und Säugerzellen, die als Empfänger für rekombinante Vektoren oder andere Transfer-DNA verwendet werden können oder verwendet wurden, und schließen die Nachkommenschaft der ursprünglichen Zelle ein, die transformiert wurde. Selbstverständlich ist die Nachkommenschaft einer einzelnen Mutterzelle aufgrund natürlicher, zufälliger oder absichtlicher Mutation nicht notwendigerweise in ihrer Morphologie oder hinsichtlich des genomischen oder des gesamten DNA-Komplements mit der ursprünglichen Mutterzelle vollständig identisch. Zu den Beispielen für Säuger-Wirtszellen gehören Eizellen vom chinesischen Hamster (CHO-Zellen) und Affen-Nierenzellen (COS-Zellen).
Der Ausdruck "Zelllinie", wie er hier verwendet wird, bezieht sich speziell auf eine Population von Zellen, die befähigt sind, in vitro kontinuierlich oder über eine längere Zeit zu wachsen und sich zu teilen. Zelllinien sind oft klonierte Populationen, die von einer einzigen Vorläuferzelle abgeleitet sind. Es ist ferner im Stand der Technik bekannt, dass während der Lagerung oder des Transfers solcher klonierter Populationen spontane oder induzierte Änderungen im Karyotyp auftreten können. Daher ist es möglich, dass Zellen, die sich von einer solchen Zelllinie ableiten, nicht genau mit den Ur-Zellen oder Ur-Kulturen identisch sind, und die betreffende Zelllinie solche Varianten enthält. Der Ausdruck "Zelllinie" schließt auch immortalisierte Zellen ein. Zelllinien umfassen bevorzugt nicht-hybride Zelllinien oder Hybridome aus lediglich zwei Zelltypen.
Der Ausdruck "Mikroorganismus", wie er hier verwendet ist, umfasst prokaryotische und eukaryotische Mikroorganismen-Species, wie etwa Bakterien und Pilze, wobei der letztere Ausdruck Hefen und filamentäre Pilze einschließt.
Der Begriff "Transformation", wie er hier verwendet ist, bezieht sich auf die Einführung eines exogenen Polynucleotids in eine Wirtszelle, unabhängig von dem zur Einführung angewandten Verfahren, zum Beispiel durch direkte Aufnahme, Transduktion, Übertragung durch F-Plasmide oder Elektroporation. Das exogene Polynucleotid kann als nicht-integrierter Vektor, zum Beispiel als Plasmid, erhalten bleiben oder alternativ in das Wirtsgenom integriert. werden.
Mit "genomisch" ist eine Sammlung oder Bibliothek von DNA-Molekülen gemeint, die sich von Restriktionsfragmenten ableiten, die in Vektoren kloniert wurden. Hierbei kann das gesamte genetische Material eines Organismus oder ein Teil davon umfasst sein.
Der Begriff "cDNA" bezeichnet eine komplementäre DNA-Sequenz, die mit einem komplementären DNA-Strang hybridisiert.
"Gereinigt" und "isoliert" bedeutet, wenn ein Polypeptid oder eine Nucleotidsequenz gemeint ist, dass das angegebene Molekül vorliegt, während andere biologische Makromoleküle des gleichen Typs im Wesentlichen fehlen. Der Ausdruck "gereinigt", wie er hier verwendet ist, bedeutet vorzugsweise, dass biologische Makromoleküle des gleichen Typs zu mindestens 75 Gew.-%, noch bevorzugter zu mindestens 85 Gew.-% und noch weiter bevorzugt zu mindestens 95 Gew.-% und am meisten bevorzugt zu mindestens 98 Gew.-% vorliegen (wobei Wasser, Puffer und andere kleine Moleküle, besonders Moleküle mit einem Molekulargewicht von weniger als 1000, vorliegen können).
Wenn die geeignete codierende Sequenz einmal isoliert ist, kann sie in einer Vielzahl unterschiedlicher Expressionssysteme exprimiert werden, zum Beispiel in Expressionssystemen, bei denen Säugerzellen, Baculoviren, Bakterien und Hefen verwendet werden.
i. Säugersysteme
Säuger-Expressionssysteme sind im Stand der Technik bekannt. Ein Säuger-Promotor ist eine beliebige DNA-Sequenz, die befähigt ist, Säuger-RNA-Polymerase zu binden und stromabwärts (3') die Transkription einer codierenden Sequenz (z.B. eines Strukturgens) in mRNA zu initiieren. Ein Promotor besitzt eine die Transkription-Initiationsregion, die sich üblicherweise in der Nähe des 5'-Endes der codierenden Sequenz befindet, und eine TATA-Box, die sich üblicherweise 25 bis 30 Basenpaare (bp) stromaufwärts der Transkriptions-Initiationsstelle befindet. Es wird angenommen, dass die TATA-Box die RNA-Polymerase II lenkt, damit die RNA-Synthese an der korrekten Stelle beginnt. Ein Säuger-Promotor enthält ferner ein stromaufwärts angeordnetes Promotorelement, das sich üblicherweise innerhalb von 100 bis 200 bp stromaufwärts der TATA-Box befindet. Ein stromaufwärts angeordnetes Promotorelement bestimmt die Rate, mit der die Transkription initiiert wird, und kann in beiden Richtungen wirken (Sambrook et al., "Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells", in: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, 1989).
Gene von Säuger-Viren werden oft mit hoher Rate exprimiert und weisen ein breites Wirtsspektrum auf; daher ergeben Sequenzen, die Gene von Säuger-Viren codieren, besonders geeignete Promotorsequenzen. Zu den Beispielen hierfür gehören der frühe SV40-Promotor, der Mäuse-Mammatumorvirus-LTR-Promotor, der späte Haupt-Promotor des Adenovirus (Ad MLP) und der Herpes-Simplex-Virus-Promotor. Ferner ergeben von nicht-viralen Genen abgeleitete Sequenzen, wie etwa das murine Metallothionein-Gen, ebenfalls günstige Promotorsequenzen. Die Expression kann entweder konstitutiv oder reguliert (induzierbar) sein, je nachdem, ob der Promotor in auf Hormone ansprechenden Zellen mit Glucocorticoid induziert werden kann.
Das Vorliegen eines Enhancer-Elements (Enhancer), in Kombination mit den oben beschriebenen Promotor-Elementen, erhöht üblicherweise die Expressionsniveaus. Ein Enhancer ist eine regulatorische DNA-Sequenz, welche die Transkription bis zu 1000-fach zu stimulieren vermag, wenn sie mit homologen oder heterologen Promotoren verknüpft ist, wobei die Synthese an der normalen RNA-Startstelle beginnt. Enhancer sind auch aktiv, wenn. sie stromaufwärts oder stromabwärts von der Transkription-Initiationsstelle entweder in normaler oder umgekehrter Orientierung oder in einem Abstand von mehr als 1000 Nucleotiden vom Promotor angeordnet sind (Maniatis et al., Science, 236: 1237, 1987; Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, 2. Auflage, 1989). Enhancer-Elemente, die von Viren abgleitet sind, können besonders nützlich sein, da sie üblicherweise ein breiteres Wirtsspektrum aufweisen. Zu den Beispielen hierfür gehören der Enhancer für das frühe SV40-Gen (Dijkema et al., EMBO J., 4: 761, 1985) und Enhancer/Promotoren, die abgeleitet sind vom langen terminalen Repeat (LTR) des Rous-Sarkoma-Virus (Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 6777, 1982b) und vom humanen Cytomegalie-Virus (Boshart et al., Cell, 41: 521, 1985). Einige Enhancer sind ferner regulierbar und werden erst in Gegenwart eines Induktors wie etwa eines Hormons oder eines Metallions aktiv (Sassone-Corsi und Borelli, Trends Genet., 2: 215, 1986; Maniatis et al., Science, 236: 1237, 1987).
Ein DNA-Molekül kann in Säugerzellen intrazellulär exprimiert werden. Eine Promotorsequenz kann direkt mit dem DNA-Molekül verknüpft werden, wobei in diesem Fall die erste Aminosäure am N-Terminus des rekombinanten Proteins stets ein Methionin ist, das durch das ATG-Startcodon codiert wird. Erwünschtenfalls kann der N-Terminus durch Inkubation mit Bromcyan in vitro vom Protein abgespalten werden.
Alternativ können auch Fremdproteine aus der Zelle in die Wachstumsmedien hinein sezerniert werden, indem chimäre DNA-Moleküle erzeugt werden, die ein Fusionsprotein codieren, das ein Leadersequenzfragment enthält, das für eine Sekretion des Fremdproteins in Säugerzellen sorgt. Vorzugsweise sind zwischen dem Leaderfragment und dem Fremdgen Prozessierungsstellen codiert, die entweder in vivo oder in vitro gespalten werden können. Das Leadersequenzfragment codiert üblicherweise ein Signalpeptid, das hydrophobe Aminosäuren beinhaltet, welche die Sekretion des Proteins aus der Zelle lenken. Der dreiteilige Adenovirus-Leader ist ein Beispiel für eine Leadersequenz, die zur Sekretion eines Fremdproteins in Säugerzellen führt.
Die Transkriptions-Terminations- und Polyadenylierungssequenzen, die durch Säugerzellen erkannt werden, sind üblicherweise regulatorische Bereiche, die sich 3' vom Translations-Stoppcodon befinden und somit, zusammen mit den Promotorelementen, die codierende Sequenz flankieren. Der 3'-Terminus der reifen mRNA wird durch ortsspezifische posttranslationale Spaltung und Polyadenylierung erzeugt (Birnstiel et al., Cell, 41: 349, 1985; Proudfoot und Whitelaw, "Termination and 3' end processing of eukaryotic RNA", in: Transcription and Splicing (Hrsg. B.D. Hames und D.M. Glover), 1988; Proudfoot, Trends Biochem. Sci., 14: 105, 1989). Diese Sequenzen lenken die Transkription einer mRNA, die in das durch die DNA codierte Polypeptid translatiert werden kann. Zu den Beispielen für Transkriptions-Terminator/Polyadenylierungs-Signale gehören Signale, die von SV40 abgeleitet sind (Sambrook et al., "Expression of cloned genes in cultured mammalian cells", in: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989).
Einige Gene können in wirksamerer Weise exprimiert werden, wenn Introns (die auch als zwischengeschaltete Sequenzen bezeichnet werden) vorliegen. Einige cDNAs wurden allerdings wirksam aus Vektoren exprimiert, bei denen keine Spleiß-Signale (auch als Spleiß-Donor- und Spleiß-Akzeptor-Stellen bezeichnet) vorlagen (vergleiche zum Beispiel Gothing und Sambrook, Nature, 293: 620, 1981). Introns sind zwischengeschaltete nicht-codierende Sequenzen innerhalb einer codierenden Sequenz, die Spleiß-Donor- und -Akzeptor-Stellen enthalten. Sie werden in Anschluss an die Polyadenylierung des primären Transkripts durch einen Prozess entfernt, der als "Spleißen" bezeichnet wird (Nevins, Ann. Rev. Biochem., 52: 441, 1983; Green, Ann. Rev. Genet., 20: 671, 1986; Padgett et al., Ann. Rev. Biochem. 55: 1119, 1986; Krainer und Maniatis, "RNA splicing", in: Transcription and Splicing (Hrsg. B.D. Hawes und D.M. Glover), 1988).
Üblicherweise werden die oben beschriebenen Bestandteile, die einen Promotor, ein Polyadenylierungssignal und eine Transkriptions-Terminationssequenz umfassen, zu Expressionskonstrukten zusammengebaut. In einem Expressionskonstrukt können gewünschtenfalls auch Enhancer, Introns mit funktionellen Spleiß-Donor und -Akzeptor-Stellen sowie Leadersequenzen vorliegen. Die Expressionskonstrukte werden oft in einem Replicon, wie etwa einem extrachromosomalen Element (z.B. in Plasmiden) aufrechterhalten, das die Fähigkeit besitzt, in einem Wirt stabil bestehen zu bleiben, zum Beispiel in Sängerzellen oder Bakterien. Zu den Säuger-Replikationssystemen gehören solche, die von Tierviren abgeleitet sind, die zur Replikation transagierende Faktoren erfordern. So replizieren beispielsweise Plasmide, welche die Replikationssysteme von Papovaviren, wie SV40 (Gluzman, Cell, 23: 175, 1981), oder Polyomaviren enthalten, in Gegenwart des geeigneten viralen T-Antigens unter Erzeugung einer extrem hohen Kopienzahl. Zu weiteren Beispielen für Säuger-Replicons gehören solche, die von Rinder-Papillomavirus und Epstein-Barr-Virus abgeleitet sind. Das Replicon kann ferner zwei Replikationssysteme aufweisen, wodurch es möglich wird, dass es zum Beispiel in Säugerzellen zur Expression und in einem prokaryotischen Wirt zur Klonierung und Amplifizierung gehalten werden kann. Zu den Beispielen für solche Säuger-Bakterien-Shuttlevektoren gehörten pMT2 (Kaufman et al., Mol. Cell. Biol., 9: 946,1989) und pHEBO (Shimizu et al., Mol. Cell. Biol., 6: 1074, 1986).
Die angewandte Transformationsprozedur hängt von dem zu transformierenden Wirt ab. Verfahren zur Einführung heterologer Polynucleotide in Sängerzellen sind im Stand der Technik bekannt und umfassen die Dextran-vermittelte Transfektion, die Calciumphosphat-Fällung, die Polybren-vermittelte Transfektion, die Protoplastenfusion, die Elektroporation, die Verkapselung des oder der Polynucleotide in Liposomen und die direkte Mikroinjektion der DNA in Zellkerne.
Säugerzelllinien, die als Wirtszellen zur Expression verfügbar sind, sind im Stand der Technik bekannt; hierzu gehören zahlreiche immortalisierte Zelllinien, die von der American Type Culture Collection (ATCC) erhältlich sind; hierzu gehören, ohne dass damit eine Einschränkung verbunden wäre, Eizellen des chinesischen Hamsters (CHO-Zellen), HeLa-Zellen, Babyhamster-Nierenzellen (BHK-Zellen), Affennierenzellen (COS-Zellen), humane hepatozelluläre Karzinom-Zellen (z.B. Hep G2) sowie eine Reihe anderer Zelllinien.
ii. Baculovirus-Systeme
Das Polynucleotid, welches das Protein codiert, kann auch in einen geeigneten Insekten-Expressionsvektor eingebracht werden und ist mit den Kontrollelementen in diesem Vektor operativ verknüpft. Zur Konstruktion des Vektors werden Techniken angewandt, die auf diesem Gebiet bekannt sind.
Die Komponenten des Expressionssystems umfassen allgemein einen Transfervektor, üblicherweise ein bakterielles Plasmid, das sowohl ein Fragment des Baculovirus-Genoms als auch eine geeignete Restriktionsstelle zur Einfügung des zu exprimierenden heterologen Gens oder der zu exprimierenden heterologen Gene enthält; ein Wildtyp-Baculovirus mit einer zu dem Baculovirusspezifischen Fragment im Transfervektor homologen Sequenz (dies erlaubt die homologe Rekombination des heterologen Gens in das Baculovirus-Genom hinein) sowie geeignete Insekten--Wirtszellen und Züchtungsmedien.
Nach dem Einfügen der DNA-Sequenz, die das Protein codiert, in den Transfervektor werden der Vektor und das virale Wildtyp-Genom durch Transfektion in eine Insekten-Wirtszelle eingebracht, in welcher der Vektor und das virale Genom rekombinieren können. Das verpackte rekombinante Virus wird exprimiert, und rekombinante Plaques werden identifiziert und gereinigt. Materialien und Methoden für Baculovirus/Insektenzellen-Expressionssysteme sind in Kitform unter anderem von Invitrogen, San Diego, CA, USA im Handel erhältlich ("MacBac"-Kit). Diese Techniken sind Fachleuten dieses Gebiets allgemein bekannt und umfassend beschrieben in Summers und Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555, 1987 (im Folgenden "Summers und Smith").
Vor der Einführung der DNA-Sequenz, die das Protein codiert, in das Baculovirus-Genom werden die oben beschriebenen Komponenten, die einen Promotor, einen Leader (gewünschtenfalls), die interessierende codierende Sequenz und die Transkriptions-Terminationsequenz umfassen, üblicherweise zu einem Übertragungs-Zwischenkonstrukt (Transfervektor) zusammengesetzt. Dieses Konstrukt kann ein einzelnes Gen und operativ verknüpfte regulatorische Elemente, mehrere Gene, von denen jedes seinen eigenen Satz operativ verknüpfter regulatorischer Elemente aufweist, oder mehrere Gene enthalten, die durch den gleichen Satz regulatorischer Elemente reguliert werden. Übertragungs-Zwischenkonstrukte werden oft in einem Replicon, wie etwa einem extrachromosomalen. Element (zum Beispiel Plasmide) gehalten, das zu einer stabilen Aufrechterhaltung in einem Wirt, wie etwa einem Bakterium, befähigt ist. Das Replicon besitzt ein Replikationssystem, wodurch es in einem geeigneten Wirt zur Klonierung und Amplifizierung aufrechterhalten werden kann.
Gegenwärtig ist der allgemein am meisten verwendete Transfervektor zur Einführung von Fremdgenen in AcNPV der Transfervektor pAc373. Es wurden ferner auch zahlreiche andere Vektoren konstruiert, die Fachleuten des vorliegenden Gebiets bekannt sind. Hierzu gehört zum Beispiel pVL985 (der das Polyhedrin-Startcodon von ATG in ATT ändert und der eine BamHI-Klonierungsstelle 32 Basenpaare stromabwärts vom ATT einführt, siehe Luckow und Summers, Virology, 17: 31, 1989).
Das Plasmid enthält üblicherweise auch das Polyhedrin-Polyadenylierungssignal (Miller et al., Ann. Rev. Microbiol., 42: 177, 1988) und ein prokaryotisches Ampicillinresistenz(amp)-Gen sowie einen Replikationsursprung zur Selektion und Propagierung in Escherichia coli.
Baculovirus-Transfervektoren enthalten üblicherweise einen Baculovirus-Promotor. Ein Baculovirus-Promotor ist eine beliebige DNA-Sequenz, die zur Bindung einer Baculovirus-RNA-Polymerase und zur Initiierung der Transkription einer codierenden Sequenz (auch zum Beispiel eines Strukturgens) in mRNA stromabwärts (5' nach 3') befähigt ist. Ein Promotor weist eine Transkriptions-Initiationsregion auf, die üblicherweise nahe am 5'-Ende der codierenden Sequenz liegt. Diese Transkriptions-Initiationsregion enthält üblicherweise eine RNA-Polymerase-Bindungsstelle und eine Transkriptions-Initiationsstelle. Ein Baculovirus-Transfervektor kann ferner auch eine zweite, als Enhancer bezeichnete Domäne enthalten, die, falls sie vorliegt, üblicherweise distal zum Strukturgen liegt. Die Expression kann entweder reguliert oder konstitutiv sein.
Strukturgene, die zu späten Zeitpunkten in einem viralen Infektionszyklus in großer Menge transkribiert werden, ergeben besonders geeignete Promotorsequenzen. Zu den Beispielen hierfür gehören Sequenzen, die von dem Gen abgeleitet sind, welches das virale Polyhedrin-Protein codiert (Friesen et al., "The Regulation of Baculovirus Gene Expression", in: The Molecular Biology of Baculoviruses (Herausgeber Walter Doerfler), 1986; und die Veröffentlichungen EP 127 839 und EP 155 476 ) sowie das Gen, welches das p10-Protein codiert (Vlak et al., J. Gen. Virol., 69: 765, 1988).
Eine DNA, die geeignete Signalsequenzen codiert, kann von Genen für sezernierte Insektenproteine oder Baculovirus-Proteine abgeleitet werden, etwa dem Baculovirus-Polyhedrin-Gen (Varbonell et al., Gene, 73: 409, 1988). Da die Signale posttranslationale Modifizierungen bei Sängerzellen (wie etwa die Signalpeptidspaltung, die proteolytische Spaltung und die Phosphorylierung) offenbar durch Insektenzellen erkannt werden und es ferner den Anschein hat, dass die zur Sekretion und nukleären Akkumulation erforderlichen Signale ebenfalls zwischen Invertebratenzellen und Vertebratenzellen konserviert werden, können alternativ auch Leader, die nicht von Insekten stammen, wie etwa solche, die von Genen abgeleitet sind, die humanes α-Interferon codieren (Maeda et al., Nature, 315: 592, 1985), humanes Gastrin-freisetzendes Peptid (Lebacq-Verheyden et al., Mol. Cell. Biol., 8: 3129, 1988), humanes IL-2 (Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 8404, 1985), Maus-IL-3 (Miyajima et al., Gene, 58: 273, 1987) sowie humane Glucocerebrosidase (Martin et al., DNA, 7: 99, 1988) verwendet werden, um eine Sekretion in Insekten zu erzielen.
Ein rekombinantes Polypeptid oder Polyprotein kann intrazellulär exprimiert oder, falls es mit den geeigneten regulatorischen Sequenzen exprimiert wird, sezerniert werden. Eine gute intrazelluläre Expression nicht-fusionierter Fremdproteine erfordert normalerweise heterologe Gene, die im Idealfall eine kurze Leadersequenz aufweisen, die geeignete Translations-Initiationssignale vor einem ATG-Startsignal enthalten. Gewünschtenfalls kann Methionin am N-Terminus durch Inkubation mit Bromcyan in vitro vom reifen Protein abgespalten werden.
Alternativ können rekombinante Polyproteine oder Proteine, die natürlicherweise nicht sezerniert werden, dadurch aus der Insektenzelle sezerniert werden, dass chimäre DNA-Moleküle erzeugt werden, die ein Fusionsprotein codieren, das ein Leadersequenzfragment enthält, das eine Sekretion des Fremdproteins in Insekten ergibt. Dieses Leadersequenzfragment codiert üblicherweise ein Signalpeptid, das hydrophobe Aminosäuren enthält, welche die Translokation des Proteins in das Endoplasmatische Reticulum lenken.
Nach der Einführung der DNA-Sequenz und/oder des Gens, die beziehungsweise das den Expressionsprodukt-Vorläufer des Proteins codiert, wird eine Insekten-Wirtszelle mit der heterologen DNA des Transfervektors und der genomischen DNA des Wildtyp-Balculovirus cotransformiert, üblicherweise durch Cotransfektion. Der Promotor und die Transkriptions-Terminationssequenz des Konstrukts enthalten üblicherweise einen Abschnitt des Baculovirus-Genoms von 2 bis 5 kb. Verfahren zur Einführung einer heterologen DNA an der gewünschten Stelle im Baculovirus-Virus sind auf dem vorliegenden Gebiet bekannt (siehe Summers und Smith, supra; Smith et al., Mol. Cell. Biol., 3: 2156, 1983, sowie Luckow und Summers, supra). Als Beispiel kann die Einführung in ein Gen wie etwa das Polyhedrin-Gen durch homologe doppelte Crossover-Rekombination erfolgen; die Einführung kann ferner auch in eine Restriktionsenzymstelle erfolgen, die in dem gewünschten Baculovirus-Gen konstruiert wurde (Miller et al., Bioessays, 4: 91, 1989). Die DNA-Sequenz ist, wenn sie anstelle des Polyhedrin-Gens in den Expressionsvektor kloniert wurde, sowohl an 5' als auch an 3' durch Polyhedrin-spezifische Sequenzen flankiert und befindet sich stromabwärts des Polyhedrin-Promotors.
Der neu erzeugte Baculovirus-Expressionsvektor wird anschließend in einem infektiösen rekombinanten Baculovirus verpackt. Die homologe Rekombination erfolgt mit geringer Häufigkeit (zwischen etwa 1 % und etwa 5 %); somit ist die überwiegende Menge des nach Cotransfektion erzeugten Virus noch vom Wildtyp. Daher ist ein Verfahren erforderlich, um rekombinante Viren zu identifizieren. Ein Vorteil des Espressionssystems ist die visuelle Durchmusterung, die eine Unterscheidung von rekombinanten Viren von anderen erlaubt.
Das Polyhedrin-Protein, das durch das native Virus erzeugt wird, wird in den Zellkernen infizierter Zellen zu späten Zeiten nach der viralen Infektion in großen Mengen erzeugt. Angesammeltes Polyhedrin-Protein bildet Okklusionskörper, die auch eingebettete Partikel enthalten. Diese Okklusionskörper, deren Größe bis zu 15 μm beträgt, sind stark lichtbrechend, was ihnen ein hell leuchtendes Aussehen verleiht, das unter dem Lichtmikroskop leicht zu erkennen ist. Zellen, die mit rekombinanten Viren infiziert sind, weisen keine Okklusionskörper auf. Zur Unterscheidung des rekombinanten Virus vom Wildtyp-Virus wird der Transfektionsüberstand als Plaques auf eine Monoschicht von Insektenzellen nach Verfahren ausplattiert, die Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind. Die Plaques werden dann unter dem Lichtmikroskop auf das Vorliegen (Hinweis auf Wildtyp-Virus) oder Fehlen (Hinweis auf rekombinantes Virus) von Okklusionskörpern hin untersucht (Ansubel et al. (Hrsg.), "Current Protocols in Microbiology", Bd. 2 unter 16.8 (Supp. 10), 1990; Summers und Smith, supra; Miller et al., supra).
Rekombinante Baculovirus-Expressionsvektoren wurden für die Einführung in verschiedene Insektenzellen durch Infektion entwickelt. So wurden zum Beispiel rekombinante Baculoviren unter anderem entwickelt für Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda und Trichoplusia ni (PCT-Veröffentlichung WO 89/046699 ; Carbonell et al., J. Virol., 56: 153, 1985; Wright, Nature, 321: 718, 1986; Smith et al., Mol. Cell. Biol., 3: 2156, 1983; siehe allgemein Fraser et al., In Vitro Cell. Dev. Biol., 25: 225, 1989).
Zellen und Zellkulturmedien sowohl zur direkten als auch zur über Fusionierung erfolgenden Expression von heterologen Polypeptiden in einem Baculovirus-Expressionssystem sind im Handel erhältlich; die Zellkulturtechnologie ist Fachleuten allgemein geläufig (vgl. z.B. Summers und Smith, supra).
Die modifizierten Insektenzellen können dann in einem geeigneten Nährmedium kultiviert werden, das eine stabile Erhaltung des oder der im modifizierten Insektenwirt vorliegenden Plasmide erlaubt. Wenn das Gen für das Expressionsprodukt unter induzierbarer Kontrolle steht, können die Wirtszellen zu hohen Dichten gezüchtet werden, und die Expression kann induziert werden. Alternativ wird das Produkt, wenn die Expression konstitutiv ist, kontinuierlich in das Medium hinein exprimiert, und das Nährmedium muss kontinuierlich in Zirkulation gehalten werden, wobei das interessierende Produkt entfernt und verbrauchte Nährstoffe ergänzt werden. Das Produkt kann durch Techniken wie Chromatographie, zum Beispiel HPLC, Affinitätschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, etc., Elektrophorese, Dichtegradientenzentrifugierung, Lösungsmittelextraktion oder dergleichen gereinigt werden. Soweit nötig, kann das Produkt erforderlichenfalls weiter gereinigt werden, um irgendwelche Insektenproteine, die ebenfalls in das Medium hinein sezerniert werden oder aus der Lyse von Insektenzellen herrühren, im Wesentlichen zu entfernen und so ein Produkt zu erzielen, das im Wesentlichen frei ist von Bruchstücken von Wirtszellen, wie z.B. Proteinen, Lipiden und Polysacchariden.
Zur Erzielung einer Proteinexpression werden rekombinante Wirtszellen, die von den Transformanten abgeleitet sind, unter Bedingungen inkubiert, die eine Expression der das rekombinante Protein codierenden Sequenz erlauben. Diese Bedingungen variieren je nach der ausgewählten Wirtszelle. Die Bedingungen sind jedoch für Durchschnitts-Fachleute dieses Gebiets auf der Basis des bekannten Fachwissens leicht zu ermitteln.
iii. Bakterielle Systeme
Verfahren zur bakteriellen Expression sind im Stand der Technik bekannt. Ein bakterieller Promotor ist eine beliebige DNA-Sequenz, die zur Bindung von bakterieller RNA-Polymerase und zur Initiierung der Transkription einer codierenden Sequenz (zum Beispiel eines Strukturgens) in mRNA stromabwärts (3') in der Lage ist. Ein Promotor besitzt eine Transkriptions-Initiationsregion, die üblicherweise proximal zum 5'-Ende der codierenden Sequenz angeordnet ist. Diese Transkriptions-Initiationsregion umfasst üblicherweise eine RNA-Polymerase-Bindungsstelle und eine Transkriptions-Initiationsstelle. Ein bakterieller Promotor kann ferner auch eine zweite Domäne aufweisen, die als Operator bezeichnet wird, die eine benachbarte RNA-Polymerase-Bindungsstelle überlappen kann, an der die RNA-Synthese beginnt. Der Operator erlaubt eine negativ regulierte (induzierbare) Transkription, da ein Gen-Repressorprotein den Operator binden und dadurch die Transkription eines speziellen Gens inhibieren kann. Konstitutive Expression kann bei Fehlen von negativen regulatorischen Elementen auftreten, wie etwa eines Operators. Zusätzlich kann eine positive Regulation durch eine Gen-Aktivatorprotein bindende Sequenz erzielt werden, die, falls vorhanden, üblicherweise proximal (5') zur RNA-Polymerase-Bindungssequenz angeordnet ist. Ein Beispiel für ein Gen-Aktivatorprotein ist das Katabolit-Aktivator-Protein (CAP), das dazu beiträgt, die Transkription des lac-Operons in E. coli zu initiieren (Raibaud et al., Ann. Rev. Genet., 18: 173, 1984). Die regulierte Expression kann daher entweder positiv oder negativ sein, wodurch die Transkription entweder verstärkt oder abgeschwächt wird.
Sequenzen, die Enzyme von Stoffwechselwegen codieren, ergeben besonders geeignete Promotorsequenzen. Zu den Beispielen hierfür gehören Promotorsequenzen, die von Enzymen abgeleitet sind, die Zucker, wie Galactose, Lactose (lac) (Chang et al., Nature, 198: 1056, 1977) und Maltose, metabolisieren. Zu weiteren Beispielen gehören Promotorsequenzen, die von biosynthetischen Enzymen, die zum Beispiel Tryptophan (trp) erzeugen, abgeleitet sind (Goeddel et al., Nuc. Acids Res., 8: 4057, 1980; Yelverton et al., Nuc. Acids Res., 9: 731, 1981; Patent US 4 738 921 und die Publikationen EP 036 776 und EP 121 775 ). Das β-Lactamase (bla)-Promotorsystem (Weissmann, "The cloning of interferon and other mistakes" in: Interferon 3 (Hrsg. I. Gresser), 1981), das Promotorsystem PL des Bakteriophagen Lamda (Shimatake et al., Nature, 292: 128, 1981) und das Promotorsystem T5 (Patent US 4 689 406 ) liefern ebenfalls nützliche Promotorsequenzen.
Zusätzlich funktionieren auch synthetische Promotoren, die in der Natur nicht vorkommen, als bakterielle Promotoren. So können zum Beispiel Transkriptions-aktivierende Sequenzen eines bakteriellen Promotors oder eines Bakteriophagen-Promotors mit den Operonsequenzen eines anderen bakteriellen Promotors oder Bakterio phagen-Promotors verbunden werden, um einen synthetischen Hybridpromotor zu erzeugen (Patent US 4 551 433 ). Zum Beispiel ist der tac-Promotor ein trp-lac-Hybridpromotor, der sowohl trp-Promotorsequenzen als auch lac-Operonsequenzen enthält und durch den lac-Repressor reguliert wird (Amann et al., Gene, 25: 167, 1983; de Boer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21, 1983). Ferner kann ein bakterieller Promotor natürlich vorkommende Promotoren nicht-bakteriellen Ursprungs enthalten, welche die Fähigkeit besitzen, eine bakterielle RNA-Polymerase zu binden und die Transkription zu initiieren. Ein natürlich vorkommender Promotor nicht-bakteriellen Ursprungs kann auch mit einer kompatiblen RNA-Polymerase gekoppelt werden, um hohe Expressionsniveaus einiger Gene in Prokaryonten zu erzielen. Das RNA-Polymerase/Promotor-System des Bakteriophagen T7 ist ein Beispiel für ein gekoppeltes Promotorsystem (Studier et al., J. Mot. Biol., 189: 113, 1986; Tabor et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 1074, 1985). Ferner kann ein Hybridpromotor einen Bakteriophagen-Promotor und einen Operatorbereich von E. coli enthalten (Veröffentlichung EP 267 851 ).
Zusätzlich zu einer funktionellen Promotorsequenz ist auch eine wirksame Ribosomen-Bindungsstelle für die Expression von Fremdgenen in Prokaryonten nützlich. In E. coli wird die Ribosomen-Bindungsstelle als Shine-Dalgarno(SD)-Sequenz bezeichnet und umfasst ein Initiationscodon (ATG) und eine Sequenz einer Länge von 3 bis 9 Nucleotiden, die sich in einem Abstand von 3 bis 11 Nucleotiden stromaufwärts des Initiationscodons befindet (Shine et al., Nature, 254: 34, 1975). Es wird angenommen, dass die SD-Sequenz die Bindung der mRNA an das Ribosom durch Paaren der Basen zwischen der SD-Sequenz und dem 3'-Ende der 16S-rRNA von E. coli begünstigt (Steitz et al., "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA", in: Biological Regulation and Development: Gene Expression (Hrsg. R.F. Goldberger), 1979). Zur Expression von eukaryotischen Genen und prokaryotischen Genen mit schwachen Ribosom-Bindungsstellen siehe Sambrook et al., "Expression of cloned genes in Escherichia coli", in: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989.
Ein DNA-Molekül kann intrazellulär exprimiert werden. Eine Promotorsequenz kann direkt mit dem DNA-Molekül verknüpft sein, wobei in diesem Fall die erste Aminosäure am N-Terminus immer ein Methionin ist, das durch das ATG-Startcodon codiert wird. Gewünschtenfalls kann das Methionin am N-Terminus durch Inkubation mit Bromcyan in vitro oder durch Inkubation mit einer bakteriellen Peptidase, die N-terminales Methionin abspaltet (Publikation EP 219 237 ), vom Protein abgespalten werden.
Fusionsproteine bilden eine Alternative zur direktere Expression. Üblicherweise wird eine DNA-Sequenz, die den N-terminalen Teil eines endogenen Bakterienproteins oder ein anderes stabiles Protein codiert, an das 5'-Ende von heterologen codierenden Sequenzen fusioniert. Bei der Expression liefert dieses Konstrukt eine Fusion der beiden Aminosäuresequenzen. So kann zum Beispiel das cII-Gen des Bakteriophagen Lambda am 5'-Terminus eines Fremdgens verknüpft und in Bakterien exprimiert werden. Das resultierende Fusionsprotein enthält bevorzugt eine Erkennungsstelle für ein prozessierendes Enzym (Faktor Xa) zur Abspaltung des Bakteriophagen-Proteins vom Fremdgen (Nagai et al., Nature, 309: 810, 1984). Fusionsproteine können auch mit Sequenzen des Gens lacZ (Jia et al., Gene, 60: 197, 1987), des Gens trpE (Allen et al., J. Biotechnol., 5: 93, 1987; Makoff et al., J. Gen. Microbiol., 135: 11, 1989) und des Gens Chey (Veröffentlichung EP 324 647 ) hergestellt werden. Die DNA-Sequenz zur Verbindung der beiden Aminosäuresequenzen kann eine spaltbare Stelle codieren oder auch nicht. Ein weiteres Beispiel ist ein Ubiquitin-Fusionsprotein. Ein solches Fusionsprotein wird unter Verwendung der Ubiquitin-Region hergestellt, die bevorzugt eine Erkennungsstelle für ein prozessierendes Enzym enthält (zum Beispiel eine Ubiquitin-spezifische Protease), um das Ubiquitin vom Fremdprotein abzuspalten. Durch dieses Verfahren kann Fremdprotein isoliert werden (Miller et al., Bio/Technology 7: 698, 1989).
Alternativ können Fremdproteine auch dadurch von der Zelle sezerniert werden, dass chimäre DNA-Moleküle erzeugt werden, die ein Fusionsprotein codieren, das ein Signalpeptidsequenz-Fragment enthält, das die Sekretion des Fremdproteins in Bakterien ermöglicht (Patent US 4 336 336 ). Das Signalsequenzfragment codiert üblicherweise ein Signalpeptid, das hydrophobe Aminosäuren enthält, welche die Sekretion des Proteins aus der Zelle lenken. Das Protein wird entweder in das Kulturmedium hinein (Gram-positive Bakterien) oder in den periplasmatischen Raum hinein exprimiert, der sich zwischen der inneren und der äußeren Zellmembran befindet (Gram-negative Bakterien). Vorzugsweise sind Prozessierungsstellen zwischen dem Signalpeptidfragment und dem Fremdgen codiert, die entweder in vivo oder in vitro gespalten werden können.
DNA, die geeignete Signalsequenzen codiert, kann von Genen für sezernierte bakterielle Proteine abgeleitet werden, wie zum Beispiel aus dem Gen für das äußere Membranprotein (ompA) von E. coli (Masui et al., in: Experimental Manipulation of Gene Expression, 1983; Ghrayeb et al., EMBO J., 3: 2437, 1984) und der Signalsequenz für Alkalische Phosphatase (phoA) von E. coli (Oka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 7212, 1985). Als weiteres Beispiel kann die Signalsequenz des Alpha-Amylase-Gens von verschiedenen Bacillus-Stämmen zur Sekretion heterologer Proteine aus B. subtilis herangezogen werden (Palva et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 5582, 1982; Veröffentlichung EP 244 042 ).
Üblicherweise sind von Bakterien erkannte Transkriptions-Terminationssequenzen regulatorische Bereiche, die 3' vom Translations-Stoppcodon liegen und daher zusammen mit dem Promotor die codierende Sequenz flankieren. Diese Sequenzen steuern die Transkription einer mRNA, die in das durch die DNA codierte Polypeptid übersetzt werden kann. Transkriptions-Terminationssequenzen enthalten häufig DNA-Sequenzen von etwa 50 Nucleotiden, die befähigt sind, Stamm-Schleifen-Strukturen auszubilden, die zur Termination der Transkription. beitragen. Zu den Beispielen hierfür gehören Transkriptions-Terminationssequenzen, die von Genen mit starken Promotoren, wie etwa dem Gen trp von E. coli, wie auch von anderen biosynthetischen Genen abgeleitet sind.
Üblicherweise werden die oben beschriebenen Bestandteile, die einen Promotor, eine Signalsequenz (gewünschtenfalls), eine interessierende codierende Sequenz sowie eine Transkriptions- Terminationssequenz umfassen, zu Expressionskonstrukten vereinigt. Expressionskonstrukte werden oft in einem Replicon aufrechterhalten, wie zum Beispiel einem extrachromosomalen Element (zum Beispiel Plasmide), das zu einer stabilen Aufrechterhaltung in einem Wirt, wie zum Beispiel einem Bakterium, befähigt ist. Das Replicon besitzt ein Replikationssystem, aufgrund dessen es in einem prokaryotischen Wirt entweder zur Expression oder zur Klonierung und Amplifizierung aufrechterhalten werden kann. Ein Replicon kann ferner auch ein Plasmid mit hoher oder niedriger Kopienzahl sein. Ein Plasmid mit hoher Kopienzahl hat allgemein eine Kopienzahl im Bereich von etwa 5 bis etwa 200 und üblicherweise von etwa 10 bis etwa 150. Eine Wirtszelle, die ein Plasmid mit einer hohen Kopienzahl enthält, enthält bevorzugt mindestens etwa 10 und noch bevorzugter mindestens etwa 20 Plasmide. Je nach der Wirkung des Vektors und des Fremdproteins auf die Wirtszelle kann ein Vektor mit hoher oder mit niedriger Kopienzahl ausgewählt werden.
Alternativ können die Expressionskonstrukte mit einem integrierenden Vektor in das Bakteriengenom integriert werden. Integrierende Vektoren enthalten üblicherweise mindestens eine zum Bakterienchromosom homologe Sequenz, die eine Integration des Vektors erlaubt. Integrationen scheinen das Ergebnis von Rekombinationen zwischen homologer DNA im Vektor und dem Bakterienchromosom zu entstehen. So werden zum Beispiel integrierende Vektoren, die mit DNA von verschiedenen Bacillus-Stämmen konstruiert sind, in das Bacillus-Chromosom integriert (Veröffentlichung EP 127 328 ). Integrierende Vektoren können auch Bakteriophagen- oder Transposon-Sequenzen enthalten.
Üblicherweise können extrachromosomale und integrierende Expressionskonstrukte selektierbare Marker enthalten, um die Selektion von Bakterienstämmen, die transformiert wurden, zu ermöglichen. Selektierbare Marker können in der bakteriellen Wirtszelle exprimiert werden und können Gene aufweisen, welche die Bakterien gegen Antibiotica wie Ampicillin, Chloramphenicol, Erythromycin, Kanamycin (Neomycin) und Tetracyclin resistent machen (Davies et al., Ann. Rev. Microbiol., 32: 469, 1978). Selektierbare Marker können ferner auch biosynthetische Gene umfassen wie etwa solche des Histidin-, Tryptophan- und Leucin-Biosynthesewegs.
Alternativ können einige der oben beschriebenen Bestandteile in Transformationsvektoren zusammengebaut werden. Transformationsvektoren enthalten üblicherweise einen selektierbaren Marker, der entweder in einem Replicon aufrechterhalten oder zu einem integrierenden Vektor entwickelt wird, wie oben beschrieben wurde.
Expressionsvektoren und Transformationsvektoren, entweder als extrachromosomale Replicons oder integrierende Vektoren, wurden zur Transformation zahlreicher Bakterien entwickelt. So wurden zum Beispiel Expressionsvektoren unter anderem für folgende Bakterien entwickelt: B. substilis (Palva et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 5582, 1982; Veröffentlichungen EP 036 259 und EP 063 953 ; PCT-Veröffentlichung WO 84/04541 ), E. coli. (Shimatake et al., Nature, 292: 128, 1981; Amann et al., Gene, 40: 183, 1985; Studier et al., J. Mol. Biol., 189: 113, 1986; Veröffentlichungen EP 036 776, 136 829 und 136 907 ), Streptococcus cremoris (Powell et al., Appl. Environ. Microbiol., 54: 655, 1988), Streptococcus lividans (Powell et al., Appl. Environ. Microbiol., 54: 655, 1988) und Streptomyces lividans ( Patent US 4 745 056 ).
Verfahren zum Einbringen exogener DNA in bakterielle Wirtszellen sind auf dem vorliegenden Gebiet wohl bekannt und umfassen üblicherweise die Transformation von Bakterien durch Behandlung mit CaCl₂ oder anderen Mitteln, wie etwa zweiwertigen Kationen und DMSO. DNA kann ferner auch durch Elektroporation in Bakterienzellen eingebracht werden. Die Transformationsverfahren variieren üblicherweise mit der zu transformierenden Bakterienspecies (siehe z.B. Masson et al., FEMS Microbiol. Lett., 60: 273, 1989; Palva et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 5582, 1982; Veröffentlichungen EP 036 259 und 063 953; PCT-Veröffentlichung WO 84/04541 [Bacillus]; Miller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8: 856, 1988; Wang et al., J. Bacteriol., 172: 949, 1990 [Campylobacter], Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69: 2110, 1973; Dower et al., Nuc. Acids Res., 16: 6127, 1988; Kushner, "An improved method for tansformation of Escherichia coli with Co1E1-derived plasmids", in: Genetic Engineering: Proceedings of the International Symposium an Genetic Engineering (Hrsg. H.W. Boyer und S. Nicosia), 1978; Mandel et al., J. Mot. Biol., 53: 159, 1970; Taketo, Biochim. Biophys. Acta, 949: 318, 1988 [Escherichia], Chassy et al., FEMS Microbiol. Lett., 44: 173, 1987 [Lactobacillus], Fiedler et al., Anal. Biochem, 170: 38, 1988 [Pseudomonas], Augustin et al., FEMS Microbiol. Lett., 66: 203, 1990 (Staphylococcus], Barany et al., J. Bacteriol., 144: 698, 1980; Harlander, "Transformation of Streptococcus lactis by electroporation", in: Streptococcal Genetics (Hrsg. J. Ferretti und R. Curtiss III), 1987; Perry et al., Infec. Immun., 32: 1295, 1981; Powell et al., Appl. Environ. Microbiol. 54: 655, 1988; Somkuti et al., Proc. 4th Eur. Cong. Biotechnology, 1: 412, 1987 [Streptococcus]).
iv: Expression in Hefen
Hefe-Expressionssysteme sind Durchschnittsfachleuten ebenfalls bekannt. Ein Hefe-Promotor ist eine beliebige DNA-Sequenz, die befähigt ist, eine bakterielle RNA-Polymerase zu binden und die stromabwärtige (3') Transkription einer codierenden. Sequenz (zum Beispiel eines Strukturgens) in mRNA zu initiieren. Ein Promotor besitzt eine Transkriptions-Initiationsregion, die üblicherweise proximal zum 5'-Ende der codierenden Sequenz angeordnet ist. Diese Transkriptions-Initiationsregion enthält üblicherweise eine RNA-Polymerase-Bindungsstelle (die "TATA-Box") und eine Transkriptions-Initiationsstelle. Ein Hefe-Promotor kann ferner auch eine zweite, als Upstream Activator Sequence (UAS) bezeichnete Domäne enthalten, die sich, falls sie vorliegt, üblicherweise distal zum Strukturgen befindet. Die UAS erlaubt eine regulierte (induzierbare) Expression. Konstitutive Expression erfolgt in Abwesenheit einer UAS. Die regulierte Expression kann entweder positiv oder negativ sein, wodurch die Transkription entweder verstärkt oder abgeschwächt wird.
Hefe ist ein fermentierender Organismus mit einem aktiven Stoffwechselgeschehen, weshalb Sequenzen, die Enzyme von Stoffwechselwegen codieren, besonders geeignete Promotor-Sequenzen liefern. Zu den Beispielen hierfür gehören Alkoholdehydrogenase (ADH) (Veröffentlichung EP 284 044 ), Enolase, Glucokinase, Glucose-6-phosphat-Isomerase, Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAP oder GAPDH), Hexokinase, Phosphofructokinase, 3-Phosphoglycerat-Mutase und Pyruvatkinase (PyK) (Veröffentlichung EP 329 203 ). Das Hefe-Gen PHO5, das eine saure Phosphatase codiert, liefert ebenfalls nützliche Promotor-Sequenzen (Myanohara et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 1, 1983).
Darüber hinaus wirken synthetische Promotoren, die nicht in der Natur vorkommen, ebenfalls als Hefe-Promotoren. Zum Beispiel können UAS-Sequenzen eines Hefe-Promotors mit der Transkriptions-aktivierenden Region eines anderen Hefe-Promotors verbunden werden, wodurch ein synthetischer Hybrid-Promotor erzeugt wird. Zu den Beispielen für solche Hybrid-Promotoren gehören die regulatorische ADH-Sequenz, die mit der Transkriptions-aktivierenden Region von GAP verbunden ist (Patente US 4 876 197 und US 4 880 734 ). Weitere Beispiele für Hybrid-Promotoren umfassen Promotoren, die aus den regulatorischen Sequenzen der Gene ADH2, GAL4, GAL10 oder PHO5 bestehen, die mit der Transkriptions-aktivierenden Region eines Gens für ein glycolytisches Enzym, wie etwa GAP oder PaK, kombiniert sind (Veröffentlichung EP 164 556 ). Ein Hefe-Promotor kann ferner natürlich vorkommende Promotoren, die nicht aus Hefe stammen, enthalten, welche die Fähigkeit besitzen, Hefe-RNA-Polymerase zu binden und die Transkription zu initiieren. Beispiele für solche Promotoren finden sich, unter anderem, in folgenden Veröffentlichungen: Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 1078, 1980; Henikoff et al., Nature, 283: 835, 1981; Hollenberg et al., Curr. Topics Microbiol. Immunol., 96: 119, 1981; Hollenberg et al., "The Expression of Bacterial Antibiotic Resistance Genes in the Yeast Saccharomyces cerevisiae", in: Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance (Herausgeber K.N. Timmis and A. Puhler), 1979; Mercerau-Puigalon et al., Gene, 11: 163, 1980; Panthier et al., Curr. Genet., 2: 109, 1980.
Ein DNA-Molekül kann intrazellulär in Hefe exprimiert werden. Eine Promotor-Sequenz kann direkt mit dem DNA-Molekül verknüpft sein, wobei dann die erste Aminosäure am N-Terminus des rekombinanten Proteins stets ein Methionin ist, das vom ATG-Startcodon codiert wird. Erwünschtenfalls kann das Methionin am N-Terminus durch Inkubation mit Bromcyan in vitro vom Protein abgespalten werden.
Fusionsproteine stellen eine Alternative zu Hefe-Expressionssystemen dar, und zwar in Säuger-, Baculovirus- und Bakterien-Expressionssystemen. Üblicherweise wird eine DNA-Sequenz, die den N-terminalen Teil eines endogenen Hefe-Proteins oder ein anderes stabiles Protein codiert, mit dem 5'-Ende der heterologen codierenden Sequenz fusioniert. Nach der Expression ergibt dieses Konstrukt eine Fusion der beiden Aminosäuresequenzen. So kann zum Beispiel das Gen der Superoxid-Dismutase (SD) aus Hefe oder humanen Ursprungs am 5'-Terminus eines Fremdgens verknüpft und in Hefe exprimiert werden. Die DNA-Sequenz an der Verbindungsstelle der beiden Aminosäuresequenzen kann eine spaltbare Stelle codieren oder nicht (siehe zum Beispiel die Veröffentlichung EP 196 056 ). Ein weiteres Beispiel ist ein Ubiquitin-Fusionsprotein. Ein solches Fusionsprotein wird unter Verwendung der Ubiquitin-Region hergestellt, die bevorzugt eine Erkennungsstelle für ein prozessierendes Enzym aufweist (zum Beispiel eine Ubiquitin-spezifische Protease), um das Ubiquitin vom Fremdprotein abzuspalten. Durch dieses Verfahren können daher native Fremdproteine isoliert werden (siehe zum Beispiel die PCT-Veröffentlichung WO 88/024066 ).
Alternativ dazu können Fremdproteine auch durch Erzeugung von chimären DNA-Molekülen, die ein Fusionsprotein codieren, das ein Leadersquenz-Fragment enthält, das die Sekretion des Fremdproteins in Hefe ermöglicht, von der Zelle in die Wachstumsmedien hinein sezerniert werden. Bevorzugt sind Prozessierungsstellen zwischen dem Leader-Fragment und dem Fremdgen codiert, die in vivo oder in vitro gespalten werden können. Das Leadersequenz-Fragment codiert üblicherweis ein Signalpeptid, das hydrophobe Aminosäuren enthält, welche die Sekretion des Proteins aus der Zelle steuern.
DNA, die geeignete Signalsequenzen codiert, kann aus Genen für sezernierte Hefeproteine abgeleitet werden, zum Beispiel aus dem Gen der Hefe-Invertase (Veröffentlichung EP 012 873 ; Veröffentlichung JP 62-096 086 ) und dem Gen des A-Faktors (Patent US 4 588 684 ). Alternativ gibt es Leader, die nicht aus Hefe stammen, wie etwa einen Interferon-Leader, die ebenfalls eine Sekretion in Hefe ergeben (Veröffentlichung EP 060 057 ).
Eine bevorzugte Klasse von Sekretionsleadern sind solche, die ein Fragment des Alpha-Faktor-Gens von Hefe verwenden, das eine "Prä"-Signalsequenz sowie eine "Pro"-Region enthält. Zu den Arten von Alpha-Faktor-Fragmenten, die verwendet werden können, gehören der Volllängen-Prä-Pro-Alpha-Faktor-Leader (etwa 83 Aminosäurereste) wie auch trunkierte Alpha-Faktor-Leader (üblicherweise etwa 25 bis etwa 50 Aminosäurereste) (Patente US 4 546 083 und US 4 870 008 ; Veröffentlichung EP 324 274 ). Zu weiteren Leadern, die ein Alpha-Faktor-Leaderfragment verwenden, das eine Sekretion ergibt, gehören hybride Alpha-Faktor-Leader, die mit einer Prä-Sequenz einer ersten Hefe, aber mit einer Pro-Region des Alpha-Faktors einer zweiten Hefe hergestellt sind (siehe zum Beispiel die PCT-Veröffentlichung WO 89/02463 ).
Üblicherweise sind von Hefen erkannte Transkriptions-Terminationssequenzen regulatorische Regionen, die 3' vom Translations-Stoppcodon liegen und daher zusammen mit dem Promotor die codierende Sequenz flankieren. Diese Sequenzen steuern die Transkription einer mRNA, die in das durch die DNA-codierte Polypeptid übersetzt werden kann. Beispiele für eine Transkriptions-Terminationssequenz und andere von Hefe erkannte Terminationssequenzen, wie etwa solche, die glycolytische Enzyme codieren, sind wohl bekannt.
Üblicherweise werden die oben beschriebenen Bestandteile, die einen Promotor, einen Leader (falls gewünscht), die interessierende codierende Sequenz und eine Transkriptions-Terminationssequenz umfassen, zu Expressions-Konstrukten vereinigt. Expressions-Konstrukte werden oft in einem Replicon, wie etwa einem extrachromosomalen Element (zum Beispiel Plasmide) aufrechterhalten, das in einem Wirt, wie einer Hefe oder einem Bakterium, stabil aufrechterhalten werden kann. Das Replicon kann zwei Replikationssysteme aufweisen, wodurch es zum Beispiel in Hefe zur Expression und in einem prokaryotischen Wirt zur Klonierung und Amplifizierung aufrechterhalten werden kann. Zu den Beispielen für solche Hefe-Bakterien-Shuttlevektoren gehören YEp24 (Rotstein, et al., Gene, 8: 17–24, 1979), pcl/1 (Brake, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 4642–4646, 1984) und YRp17 (Stinchcomb et al., J. Mot. Biol., 158: 157, 1982). Ein Replicon kann ferner ein Plasmid mit einer hohen einer niedrigen Kopienzahl sein. Ein Plasmid mit einer hohen Kopienzahl hat allgemein eine Kopienzahl im Bereich von etwa 5 bis etwa 200 und üblicherweise von etwa 10 bis etwa 150. Eine Wirtszelle, die ein Plasmid mit hoher Kopienzahl enthält, weist bevorzugt mindestens etwa 10 und noch bevorzugter mindestens etwa 20 Plasmide auf. Je nach der Wirkung des Vektors und des Fremdproteins auf die Wirtszelle kann entweder ein Vektor mit hoher Kopienzahl oder ein Vektor mit niederiger Kopienzahl ausgewählt werden (siehe z.B. Brake et al., supra).
Alternativ können die Expressionskonstrukte mit einem integrierenden Vektor in das Hefe-Genom integriert werden. Integrierende Vektoren enthalten üblicherweise mindestens eine zu einem Hefe-Chromosom homologe Sequenz, durch die eine Integration des Vektors ermöglicht wird, und enthalten bevorzugt zwei homologe Sequenzen, die das Expressionskonstrukt flankieren. Integrationen scheinen aus Rekombinationen zwischen homologer DNA im Vektor und dem Hefe-Chromosom zu entstehen (Orr-Weaver et al., Methods in Enzymol., 101: 228–245, 1983). Ein integrierendeer Vektor kann durch Wahl der geeigneten homologen Sequenz zum Einschluss im Vektor zu einem spezifischen Genort in der Hefe gesteuert werden (siehe Orr-Weaver et al., supra). Ein oder mehrere Expressionskonstrukte können integrieren, wodurch möglicherweise die Niveaus an erzeugtem rekombinantem Protein beeinflusst werden (Rine et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 6750, 1983). Die im Vektor enthaltenen chromosomalen Sequenzen können entweder als singuläres Segment im Vektor vorliegen, was zur Integration des gesamten Vektors führt, oder sie können als zwei Segmente vorliegen, die zu benachbarten Segmenten im Chromosom homolog sind und das Expressionskonstrukt im Vektor flankieren, was zu einer stabilen Integration lediglich des Expressionskonstrukts führen kann.
Üblicherweise können extrachromosomale und integrierende Expressions-Konstrukte selektierbare Marker enthalten, um die Selektion von Hefestämmen zu ermöglichen, die transformiert wurden. Selektierbare Marker können biosynthetische Gene umfassen, die in der Hefe als Wirtszelle exprimiert werden können, zum Beispiel ADE2, HIS4, LEU2, TRP1 und ALG7 sowie das Resistenzgen G418, die den Hefezellen Resistenz gegen Tunicamycin beziehungsweise G418 verleihen. Darüber hinaus kann ein geeigneter selektierbarer Marker auch der Hefe die Fähigkeit zum Wachstum in Gegenwart toxischer Verbindungen wie etwa Metallen verleihen. So ermöglicht zum Beispiel das Vorliegen von CUP1 der Hefe das Wachstum in Gegenwart von Kupferionen (Butt et al., Microbiol. Rev., 51: 351, 1987).
In einer Alternative können einige der oben beschriebenen Komponenten zu Transformationsvektoren kombiniert werden. Transformationsvektoren enthalten üblicherweise einen selektierbaren Marker, der entweder in einem Replicon aufrechterhalten oder zu einem integrierenden Vektor entwickelt wird, wie oben beschrieben wurde.
Expressions- und Transformationsvektoren, entweder als extrachromosomale Replicons oder als integrierende Vektoren, wurden zur Transformation zahlreicher Hefen bereits entwickelt. So wurden zum Beispiel Expressionsvektoren unter anderem für folgende Hefen entwickelt: Candida albicans (Kurtz et al., Mol. Cell. Biol., 6: 142, 1986), Candida maltosa (Kunze et al., J. Basic Microbiol., 25: 141, 1985), Hansenula polymorpha (Gleeson et al., J. Gen. Microbiol., 132: 3459, 1986; Roggenkamp et al., Mot. Gen. Genet., 202: 302, 1986), Kluyveromyces fragilis (Das et al., J. Bacteriol., 158: 1165, 1984), Kluyveromyces lactis (De Louvencourt et al., J. Bacteriol., 154: 737, 1983; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8: 135, 1990), Pichia guillerimondii (Kunze et al., J. Basic Microbiol., 25: 141, 1985), Pichia pastoris (Cregg et al., Mol. Cell. Biol., 5: 3376, 1985; Patente US 4 837 148 und US 4 929 555 ), Saccharomyces cerevisiae (Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 1929, 1978; Ito et al., J. Bacteriol., 153: 163, 1983), Schizosaccharomyces pombe (Beach und Nurse, Nature, 300: 706, 1981) und Yarrowia lipolytica (Davidow et al., Curr. Genet., 10: 39, 1985; Gaillardin et al., Curr. Genet., 10: 49, 1985).
Verfahren zur Einführung von exogener DNA in Hefe-Wirtszellen sind auf dem vorliegenden Gebiet wohl bekannt und umfassen üblicherweise entweder die Transformation von Sphäroplasten oder von mit Alkalikationen behandelten intakten Hefezellen. Die Transformationsverfahren variieren üblicherweise mit der zu transformierenden Hefespecies (siehe z.B. Kurtz et al., Mol. Cell. Biol., 6: 142, 1986; Kunze et al., J. Basic Microbiol., 25: 141, 1985 [Candida]; Gleeson et al., J. Gen. Microbiol., 132: 3459, 1986; Roggenkamp et al., Mol. Gen. Genet., 202: 302, 1986 [Hansenula]; Das et al., J. Bacteriol., 158: 1165, 1984; De Louvencourt et al., J. Bacteriol., 154: 737, 1983; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8: 135, 1990 [Kluyveromyces], Cregg et al., Mol. Cell. Biol., 5: 3376, 1985; Kunze et al., J. Basic Microbiol., 25: 141, 1985; Patente US 4 837 148 and US 4 929 555 [Pichia], Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 1929, 1978; Ito et al., J. Bacteriol., 153: 163, 1983 [Saccharomyces], Beach und Nurse, Nature, 300: 706, 1981 [Schizosaccharomyces] und Davidow et al., Cum. Genet., 10: 39; 1985; Gaillardin et al., Curr. Genet., 10: 49, 1985 [Yarrowia]).
Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden anhand von Beispielen unter Bezug auf die folgenden Figuren erläutert:
1A ist eine lineare Restriktionskarte der integrativen Kassette zur Einführung der Expressionskassette YIpex-PDI in den chromosomalen Genort ADE2 von S. cerevisiae, welche die Richtung der Transkription von PDI vom induzierbaren GAL/CYC-Promotor zeigt (offener Pfeil). Ausgewählte Restriktionsstellen sind angegeben.
1B ist eine Restriktionskarte der integrativen Kassette zum Einbringen der gleichen Expressionskassette, wie sie in 1A dargestellt ist, in den chromosomalen Genort LYS2 von S. cerevisiae.
1C ist eine Restriktionsmappe der integrativen Kassette für LYS2, welche die codierende Sequenz TRX2 von S. cerevisiae enthält, die in die Expressionskassette eingefügt ist.
1D ist eine Restriktionskarte der integrativen Kassette für LYS2, welche die codierende Sequenz TRX2 von S. cerevisiae enthält, die in die Expressionskassette eingefügt ist, die im Leserahmen mit der Signalpeptidsequenz von YEpsec1 fusioniert ist.
2A zeigt eine Northern Blot-Analyse von RNA, die aus S. cerevisiae-Stämmen extrahiert wurde, die chromosomale Insertionen des PDI-Gens unter Verwendung einer PDI-spezifischen Sonde aufwiesen. Die Pfeile bezeichnen das Transkript des endogenen Gens (PDI) und der integrierten PDI-Konstrukte (::PDI).
2B zeigt RNA, die aus S. cerevisiae-Stämmen extrahiert wurde, die chromosomale Insertionen des TRX2-Gens und des Y-E2₇₁₅-Plasmids aufwiesen, das mit einer TRX2-spezifischen Sonde (oberes Feld) und einer HCV-E2₇₁₅-spezifischen Sonde (unteres Feld) hybridisiert war. Die Pfeile bezeichnen das Transkript des endogenen Gens (TRX2), der integrierten TRX2-Konstrukte (::TRX2) und der HCV-E2₇₁₅-cDNA, die in YEpsec1 kloniert ist (Y-E2₇₁₅).
3 zeigt eine Western Blot-Analyse löslicher Proteine aus Zellextrakten von modifizierten Hefestämmen, die HCV-E2₇₁₅ exprimieren, unter Verwendung eines monoklonalen Anti-E2-Antikörpers (mAb). Die Proteine wurden durch SDS-PAGE in Gegenwart (+ DTT) oder in Abwesenheit (–DTT) eines Reduktionsmittels getrennt.
4 zeigt eine Dot-Blot-Analyse von affinitätsgereinigtem E2₇₁₅ (10 μg/Dot) von den modifizierten Hefestämmen. Zum Immunblot sind verwendet: ein mAb gegen HCV-E2₇₁₅-Protein, das in Insektenzellen exprimiert wird (3E5-1), ein Schimpansen-Antiserum gegen HCV-E1E2, das aus HeLa-Zellen (L559) cogereinigt wurde (Choo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 1294–1298, 1994), und drei Anti-E2₇₁₅-spezifische konformationelle mAbs (291A2, 5E5-H7, 6A1) (Rosa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 1759–1763, 1996).
5 zeigt eine Analyse der zellgebundenen Fluoreszenz von MOLT-4-Zellen, die mit verschiedenen Formen von HCV-E2-Protein inkubiert wurden, das durch modifizierte Hefestämme und CHO-Zellen exprimiert wird. Die vorinkubierten MOLT-4-Zellen werden mit einem Anti-E2-mAb inkubiert, und nach der Inkubation mit fluoreszenzmarkiertem F(ab')₂-Fragment-IgG wird die Bindung an Targetzellen indirekt durch Durchflusscytometrie als zellgebundene Fluoreszenz erfasst (relative Zellzahl (a-Achse) in Abhängigkeit von der mittleren Fluoreszenzintensität (x-Achse)). Vorinkubierte MOLT-4-Zellen (ohne HCV-E2-Proteine) dienen als Negativkontrolle.
BEISPIELE
Stämme, Plasmide und Medien

Eine Beschreibung der verwendeten Stämme und Plasmide ist in Tabelle 1 sowie in den 1A bis 1D gegeben. Die 1A bis 1D zeigen schematisch die integrativen Kassetten, die zur Modifizierung der Stämme von S. cerevisiae verwendet wurden. TABELLE 1

Beschreibung der Hefestämme
S.cerevisiae-Stamm	Genotyp	integrative Kassette
W303-1B	MATα leu2.3-112 ura3-1 trp1-1 his3.11-15 ade2-1 can1-100	keine
W303-PB1	MATα leu2.3-112 ura3-52 trp1 -289 his3-Δ1 ade2-1 can1-100 lys2::TRP1::PDI	YIpex1-PDIB (lys2::TRP1)
S150-2B	MATα leu2.3-112 ura3-52 trp1 -289 his3-Δ1	keine
S150-LyT	MATα leu2.3-112 ura3-52 trp1-289 his3-Δ1 lys2::TRP1::yex	YIpex1 (lys2::TRP1)
S150-PA1	MATα leu2.3-112 ura3-52 trp1 -289 his3-Δ1 lys2::TRP1::PDI	YIpex1-PDIA (lys2::TRP1)
S150-PB1	MATα leu2.3-112 ura3-52 trp1-289 his3-Δ1 lys2::TRP1::PDI	YIpex1-PDIB (lys2::TRP1)
S150-PA2	MATα leu2.3-112 ura3-52 trp1-289 his3-Δ1 ade2::HIS3::PDI	YIpex2-PDIA (ade2::HIS3)
S150-X21	MATα leu2.3-112 ura3-52 trp1-289 his3-Δ1 lys2::TRP1::TRX2	YIpex1-TRX2 (lys2::TRP1)
S150-sX21	MATα leu2.3-112 ura3-52 trp1 -289 his3-Δ1 lys2::TRP1::sTRX2	YIpex1-sTRX2 (lys2::TRP1)
SX21-PA2	MATα leu2.3-112 ura3-52 trp1-289 his3-Δ1 lys2::TRP1::TRX2 ade2::HIS3::PDI	YIpex1-TRX2(lys2::TRP1) YIpex2-PDIA(ade2::HIS3)
Beschreibung der Plasmide
pUC18yex pUC8-Lys pUC8-Ade YIpLyT YIpAH	1238 bp von YEPsecI kloniert an der NotI-Stelle von pUC18Not 1318 bp LYS2-PCR-Fragment in EcoRI-HindIII-Stellen von pUC8 1059 bp ADE2-PCR-Fragment in EcoRI-PstI-Stellen von pUC8 854 bp BglII-PCR-Klon von TRPI in BglII-Stelle von pUC8-Lys 931 bp BamHI-PCR-Klon von HIS3 in BglII-Stelle von pUC8-Ade

Die offenen Kästen stellen die chromosomalen Sequenzen ade2 (1A) und lys2 (1B bis 1D) von S. cerevisiae dar, die zur Integration in die homologen chromosomalen Loci verwendet wurden. Die zur Selektion der Integranten (HIS3 und TRP1) verwendeten genetischen Marker sind als schraffierte Pfeile dargestellt, während der offene Pfeil (GAL/CYC) die Promotorsequenz angibt. Der schwarze Kasten (Term) stellt die Transkriptions-Terminationssequenzen dar. Die Plasmidvektorsequenzen sind nicht dargestellt.
Der E. coli.-Stamm HB101 (F hsdS20 recA13 ara-14 proA2 lacY1 galK2 rpsL20 xyl-5 metl-1 supE44) wurde für Plasmidkonstruktionen verwendet. Die Transformation von E. coli-Zellen und die Analyse rekombinanter Plasmide wurden durchgeführt wie beschrieben von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA, 1989.
S. cerevisiae-Stämme wurden bei 30°C in einem synthetischen Medium kultiviert, das 2 % Kohlenstoffquelle und 0,67 % Hefestickstoffbasis enthielt (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) und das mit den erforderlichen Aminosäuren supplementiert war (50 μg/ml), oder in einem vollständigen Medium, das 2 % Glucose (YPD) oder Galactose (GalYP), 1 % Hefeextrakt, 2 % Pepton und 0,3 % KH₂PO₄ enthielt.
Plasmidkonstruktionen und genetische Manipulationen
Restriktionsenzyme, T4-DNA-Ligase und andere Enzyme, die für die DNA- und RNA-Manipulationen verwendet wurden, waren von New England Biolabs (Hitchin, UK) oder Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland) bezogen. Die PCR-Amplifizierung spezieller DNA-Fragmente wird mit einem Perkin Elmer Thermal Cycler (Norwalk, CT, USA) unter Verwendung synthetischer Oligonucleotide durchgeführt. Die DNA-Sequenzierung wird mit einem DNA-Sequencer von Applied Biosystems (Norwalk, CT, USA), Modell 373 vorgenommen. Die gesamte Hefe-DNA oder Hefe-RNA wird gemäß Standardverfahren extrahiert (Sherman et al., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA, 1983). Alle anderen DNA-Manipulationen werden durchgeführt, wie von Sambrook et al., supra, beschrieben wurde. S. cerevisiae-Stämme wurden nach dem LiCl-Verfahren transformiert (Rothstein in: DNA Cloning (Hrsg. Glover, D.M.), Band. 11, Seiten 45–66, IRL Press, 1985).
Zum Einbringen der Expressionskassette in zwei unterschiedliche Chromosomenorte von S. cerevisiae, LYS2 und ADE2, wurden zwei integrative Kassetten konstruiert. Das integrative Plasmid YIpLyT (Tabelle 1) wird durch Klonieren eines EcoRI-HindIII-PCR-Fragments des LYS2-Gens von S. cerevisiae, das 1318 bp aufweist, zwischen die Stellen EcoRI und HindIII des Plasmid pUC8 kloniert. Das resultierende Plasmid pUC8-Lys (Tabelle 1) enthält eine nur einmal vorhandene BglII-Stelle, die sich innerhalb der LYS2-Sequenz befindet, die zur Klonierung des selektierbaren Markers TRP1 von S. cerevisiae verwendet wird, der durch PCR-Amplifizierung des TRP1- Gens des Plasmids YRp17 erhalten wird. Das integrative Plasmid YIpAH (Tabelle 1) wird durch Einfügen des XbaI-Fragments des ADE2-Gens von S. cerevisiae mit 1059 bp, das durch PCR amplifiziert wird, in die Stellen EcoRI-PstI von pUC8 konstruiert, wobei eine EcoRI-Stelle am 5'-Ende und eine PstI-Stelle am 3'-Ende angefügt wird. Der selektierbare Marker HIS3 von S. cerevisiae wird durch PCR amplifiziert, wobei Restriktionsstellen BamHI-SpeI-NotI am 5'-Ende und eine BamHI-Stelle am 3'-Ende hinzugefügt werden. Das BamHI-verdaute PCR-Produkt HIS3 wird in die nur einmal vorhandene BglII-Stelle von pUC8-Ade unter Erhalt des Plasmids YIpAH kloniert.
Das Plasmid pUC18yex, das die Expressionskassette trägt, wird durch Klonieren eines PCR-amplifizierten Fragments NotI mit 1238 bp des Plasmids YEpsecl (Baldari et al., EMBO) J., 6: 229–234, 1987; Galeotti et al., Patent US 5 432 082, 11 . Juli 1995), das die Promotorsequenzen bis zu den Terminatorsequenzen überspannt, in den Vektor pUC18Not konstruiert (Herrero et al., J. Bacteriol., 172: 6557–6567, 1990). Die Einfügung der Sequenz, die PDI von S. cerevisiae codiert (LaMantia et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 4453–4457, 1991), in die Expressionskassette von pUCyex wird durch Klonieren eines PCR-Fragments SacI-PstI zwischen die Stellen SacI-PstI von pUC18yex erhalten. In ähnlicher Weise wird die codierende Sequenz TRX2 von S. cerevisiae (Müller, J. Biol. Chem., 266: 9194–9202, 1991) durch PCR amplifiziert, wobei eine SacI-Stelle proximal zum ATG-Codon und eine SalI-Stelle distal vom TGA-Stoppcodon hinzugefügt wird, und zwischen die Stellen SacI-SalI von pUC18yex kloniert. Die sTRX-Version des Klons wird durch Ersetzen des SacI-ATG-PCR-Primers durch einen SmaI-PCR-Primer, der die codierende Sequenz TRX2 vom zweiten Codon (TAG) in fortlaufenden Leserahmen mit der Signalpeptidsequenz von pUC18yex amplifiziert, und Klonieren des PCR-Fragment zwischen den Stellen SmaI-SalI von pUC18yex erhalten. Sämtliche PCR-Klone werden nach der Klonierung in das Plasmid pUC18yex sequenziert.
Der Vektor YIpex2-PDI (1A) wird durch Einfügen des NotI-XbaI-Fragments von pUC18yex, das die PDI-Expressionskassette enthält, zwischen die Stellen NotI-SpeI des Plasmid YIpAH erhalten (Tabelle 1), um die XbaI-Stelle am 3'-Ende der Expressionskassette zu entfernen und lediglich die XbaI-Stellen an den beiden Enden der integrativen ADE2-Kassette zu belassen. Die Transformation des Stamms S150-2B mit XbaI-verdauter YIpex2-PDI führt zur Integration der PDI-Expressionskassette in den Chromosomenort ADE2 des Stamms S150-PA2 (Tabelle 1).
Die Klonierung des yex-PDI-NotI-Fragments in die NotI-Stelle von YIpLyT (Tabelle 1) führt zu zwei Plasmiden, welche die PDI-Expressionskassette in entgegengesetzten Orientierungen bezüglich der LYS2-Integrationsstelle enthalten. Das Plasmid YIpexI-PDIA (1B) besitzt die gleiche Orientierung wie YIpex2-PDI, während in dem Plasmid YIpexI-PDIB das Insert yex-PDI in entgegengesetzter Orientierung vorliegt. Die Transformation von S. cerevisiae mit YIpexl-PDIA/B wird unter Verwendung einer SpeI-geschnittenen integrativen Kassette vorgenommen. Der Stamm S150-PA1 (Tabelle 1) ist ein Integrant, der die yex-PDIA-Version trägt, während die Stämme W303-PB1 und S150-PB1 (Tabelle 1) aus der Integration von yex-PDIB resultieren.
Die Plasmide YIpex1-TRX2 und YIpex1-sTRX2 (1C und 1D) werden durch Subklonieren des NotI-Fragment von pUC18yex-TRX bzw. pUC18yex-sTRX in die NotI-Stelle von pUC18yex erzeugt. Die Orientierung der klonierten Fragmente, die zur Erzeugung von S. cerevisiae-Integranten verwendet wurden, ist die gleiche wie bei YIpex-PDIA. Die Integranten S150-X21 und SX21-PA2 werden durch Transformieren der Stämme S150-2B und S150-PA2 (Tabelle 1) mit SpeI-verdautem YIpex1-TRX2 erhalten, während die Transformation von S150-2B mit YIpex1-sTRX2 den Integranten S150-sX21 erzeugt (Tabelle 1). Die verschiedenen S. cerevisiae-Integranten werden anschließend mit dem Plasmid YEpsec1-E2₇₁₅ zur Expression des Hüll-Glycoproteins HCV-E2₇₁₅ in Hefe transformiert.
Bei einer ähnlichen Verfahrensweise wurde auch der. PDI-(über)exprimierende Hefestamm (S150-PA1, Tabelle 1) verwendet, um menschlichen Wachstumsfaktor FIGF in einer löslichen Form zu erhalten. Der gleiche Faktor ist unlöslich, wenn er im Wildtyp-Hefestamm ((S150-2B) exprimiert wird.
Analyse der Transkription der integrierten Gene
RNA von den verschiedenen Integranten, die unter Repressionsbedingungen (YPD) oder Induktionsbedingungen (GalYP) kultiviert wurden, wird auf einem 2,2M-Formaldehyd-1,2%-Agarosegel getrennt, auf eine Nitrocellulosemembran übertragen und mit ³²P-markierten spezifischen Sonden hybridisiert, um zu ermitteln, ob die Integrationsstelle und/oder die Orientierung der Expressionskassette die Transkription von integriertem PDI oder TRX2 beeinflusst. Die Verwendung einer PDI-spezifischen Sonde zur Northern-Analyse von PDI-Integranten zeigt, dass die Transkription vom Galactose-induzierbaren Promotor des integrierten PDI korrekt reguliert wird, d.h. durch Wachstum in Glucosemedium unterdrückt wird (2A). Darüber hinaus beeinflussen sowohl die Orientierung der Transkriptionseinheit als auch die Integrationsstelle das Niveau der Transkription. Ein niedrigeres Verhältnis zwischen dem Transkript der integrierten PDI und dem des endogenen Gens wird bei Integranten, welche die B-Orientierung (S150-PB1, W303-PB1) tragen, gegenüber der A-Orientierung (S150-PA1) des Konstrukts festgestellt, und die Integration in ade2 (S150-PA2) führt zu einer noch größeren Verringerung.
Die Analyse der Transkription der in YEpsecl klonierten HCV-E2₇₁₅-cDNA in den Integranten lys2::TRX2 und lys2::sTRX2, die in GalYP kultiviert wurden, zeigt, dass die Insertion eines Galactoseregulierten TRX2-Gens in diesen Stämmen das Niveau der E2₇₁₅-mRNA nicht beeinflusst, obgleich die Expression beider Gene die gleichen Transkriptionsfaktoren erfordert (2B).
Überexpression von PDI und TRX2 erleichtert die Faltung von HCV-E2₇₁₅ in S. cerevisiae
Aus Hefekulturen werden durch Aufbrechen der Zellen mit Glaskügelchen in einem Braun-Homogenisator (B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland) während 20 s bei 4°C Zellextrakte hergestellt. Nach dem Aufbrechen der Zellen werden die Zellsuspensionen in PBS verdünnt und durch Affinitäts chromatographie gereinigt (vgl. unten). Die Proteinproben werden durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE), wie von Laemmli beschrieben (Laemmli, Nature, 227: 680–685, 1970), in LSG-Puffer (2 % SDS, 10 % Glycerin, 200 mM DTT, 62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8) analysiert und auf eine Nitrocellulosemembran (Nitrobind, MSI, Westborough, MA, USA) (Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 4350–4354, 1979) übertragen. Die Membran wird in einer Pufferlösung inkubiert, die PBS, 3 % Milchpulver und 0,1 % Triton enthält. Zum Immunblotten wurden verwendet: ein monoklonaler Antikörper (mAb) gegen ein lineares Epitop des HCV-E2₇₁₅-Proteins, das in Insektenzellen exprimiert wird (3E5-1), zwei konformationelle mAbs (291A2 und 5E5-H7) sowie ein Schimpansen-Antiserum gegen HCV-E1E2, das HeLa-Zellen (L559) co-gereinigt wurde (Choo et al., Prod. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 1294–1298, 1994; Rosa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 1759–1763, 1996). Die Immunblots werden mit verstärkter Chemolumineszenz (ECL, Amersham, Arlington Heights, IL, USA) entwickelt.
HCV-E2₇₁₅ wird aus Hefekulturen durch Affinititätschromatogrpahie unter Verwendung einer Lektinsäule gereinigt (Galanthus nivalis-Agarose-Lektin (GNL); das spezielle im Handel erhältliche GNL, das verwendet wurde, war GNA, Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA). Die Säule wird bei 40 cm/h mit PBS äquilibriert und mit 0,9 M NaCl in PBS gewaschen, wonach das Glycoprotein unter Verwendung von 1 M α-Methyl-D-mannosid mit 0,9 M NaCl in PBS eluiert wird. Die Säulenfraktionen werden gegen PBS dialysiert; die Proteinkonzentrationen werden unter Anwendung des Lowry-Verfahrens (Bio-Rad DC Protein Assay, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) bestimmt, worauf durch Dot-Blot-Analyse mit monoklonalen Anti-E2-Antikörpern analysiert wird.
Die Western-Blot-Analyse der durch Affinitätschromatographie gereinigten Proteine aus Zellextrakten von lys2::TRX2-, lys2::PDI- und lys2::TRX2-ade2::PDI-Integranten, die HCV-E2₇₁₅ exprimieren, zeigt, dass ein Teil des E2₇₁₅-Glycoproteins bei Abwesenheit von DTT lediglich in Proben aus Integranten, die PDI überexprimieren, in das Trenngel eintreten kann. Die relative Menge des Glycoproteins, das ohne ein Reduktionsmittel in das Gel eindringt, scheint bei der Probe von dem Doppelintegranten SX21-PA2 noch größer zu sein (3).
Der Immunblot von nicht-denaturiertem E2₇₁₅ von den verschiedenen Hefestämmen zeigt, dass das von den PDI-Integranten gereinigte Glycoprotein den konformationellen Antikörper 5E5-H7 und, in einem geringeren Ausmaß, auch den konformationellen Antikörper 291A2 bindet (4).
Verschiedene Formen von in modifizierten Hefestämmen exprimiertem HCV-E2-Protein binden an MOLT-4-Zellen
HCV-E2-Protein wird in der Natur in Säugerzellen exprimiert und bindet mit hoher Affinität an humanen Zellen. Zur Untersuchung, ob modifizierte, durch Hefe exprimierte E2-Proteine ähnliche biologische Aktivität besitzen und humane Zellen zu binden vermögen, werden Zellen der humanen T-Zell-Lymphom-Zelllinie MOLT-4 bei 4°C mit verschiedenen Formen von durch modifizierte Hefe exprimiertem E2-Protein (8,7 μg/ml) inkubiert. Als positive Kontrolle wird CHO-exprimiertes E2-Protein bei der gleichen Konzentration verwendet. Als negative Kontrolle werden MOLT-4-Zellen in Abwesenheit von E2-Proteinen inkubiert. Anschließend wird das Zell-Pellet mit gegen E2 erzeugtem mAb inkubiert. Nach Inkubation mit Phycoerythrin-markiertem F(ab')₂-Fragment von Ziegen-anti-Maus-IgG wird die Bindung an Targetzellen indirekt durch Durchflusscytometrie als zellgebundene Fluoreszenz erfasst (5).
Wie in 5 dargestellt ist, besitzen die MOLT-4-Zellen, die mit CHO-exprimiertem HCV-E2-Protein vorinkubiert waren (E2 CHO GNL), die höchste mittlere Fluoreszenzintensität (M = 133,78) im Vergleich mit den MOLT-4-Zellen, die mit E2-Proteinen inkubiert wurden, die durch modifizierte Hefe exprimiert wurden (M = 26,24 (E2 Hefe PDI GNL); M = 5,32 (E2 Hefe TRX GNL)). Die MOLT-4-Zellen, die mit durch modifizierte Hefe exprimiertem E2-Protein vorinkubiert worden waren, ergaben dennoch eine höhere mittlere Fluoreszenzintensität als die MOLT-4-Zellen, die ohne E2-Proteine vorinkubiert worden waren (M = 3,97 (-ve/Kontrolle)).
Der Bindung der verschiedenen Formen des E2-Proteins an die MOLT-4-Zellen wird durch die Struktur der Proteine beeinflusst. Das CHO-exprimierte E2-Protein besitzt in geeigneter Weise ausgebildete Disulfidbindungen und ist daher korrekt gefaltet und biologisch aktiv. Die Konsequenz hiervon ist eine hohe Bindungsaffinität des CHO-exprimierten E2-Proteins für Zelloberflächen der MOLT-4-Zellen, was zu einer hohen mittleren Fluoreszenzintensität führt. In ähnlicher Weise scheinen die durch modifizierte Hefe exprimierten E2-Proteine ebenfalls biologisch aktiv zu sein, da sie MOLT-4-Zellen binden und dadurch zu einer höheren mittleren Fluoreszenzintensität im Vergleich mit der negativen Kontrolle führen.
Obgleich die mittlere Fluoreszenzintensität (und daher die Bindungsaffinität für MOLT-4-Zellen) bei den durch die modifizierten Hefen exprimierten E2-Proteinen im Vergleich mit dem CHO-exprimierten E2-Protein kleiner ist, ist E2-Protein, das durch nichtmodifizierte Hefen exprimiert wird (d.h. in Hefezellen ohne Coexpression von PDI oder TRX exprimiert wird), nicht befähigt, MOLT-4-Zellen zu binden (vgl. Rosa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 1759–1763, 1996, insbesondere Zeilen 16 bis 18 des Abschnitts "Results" auf Seite 1760 und 1). Daher kann das Expressionssystem der vorliegenden Erfindung mit modifizierten Wirtszellen heterologe Proteine erzeugen, die eine ähnliche biologische Aktivität und/oder Struktur aufweisen wie die durch ihre natürlichen Wirtszellen erzeugten nativen Proteine.

Claims

Verfahren zur Erzeugung eines heterologen Proteins oder von heterologen Proteinen mit biologischer Aktivität und/oder korrekter Struktur in einem Wirtsorganismus, das die Reinigung des heterologen Proteins oder der heterologen Proteine aus dem Zellextrakt eines Wirtsorganismus umfasst, bei dem folgende Schritte durchgeführt werden: (a) Transformieren des Wirtsorganismus in vitro mit einem Vektor, der aufweist: (i) eine Expressionskassette, die eine DNA-Sequenz enthält, die ein Protein codiert, das befähigt ist, die Bildung von Disulfidbindungen zu katalysieren, wobei das Protein Proteindisulfidisomerase (PDI) oder Thioredoxin (TRX) ist; (ii) eine Expressionskassette, die eine oder mehrere DNA-Sequenzen enthält, die ein oder mehrere heterologe Proteine codieren; (b) Kultivieren des Wirtsorganismus von Schritt (a) unter Bedingungen, die für die Expression des einen heterologen Proteins oder der mehreren heterologen Proteine geeignet sind, und (c) Reinigung des heterologen Proteins oder der heterologen Proteine mit biologischer Aktivität und/oder korrekter Struktur aus dem Zellextrakt des Wirtsorganismus, wobei der Wirtsorganismus eine eukaryotische Mikroorganismus-Species, eine Insektenzelle oder eine Säugerzelle ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das eine heterologe Protein oder die mehreren heterologen Proteine kein(e) Fusionsprotein(e) mit TRX bilde(t)(n).
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem der Vektor ferner eine oder mehrere DNA-Sequenzen enthält, die eine oder mehrere Leader-Peptide zur Sekretion in das ER und/oder andere sekretorische Compartments codieren.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem das heterologe Protein das E2₇₁₅-Hüll-Glycoprotein des Hepatitis-C-Virus (HCV) oder humaner c-fos-induzierter Wachstumsfaktor (FIGF) ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem der Vektor zur Integration in das Genom eines Wirtsorganismus befähigt ist.
Verfahren zur Erzeugung eines heterologen Proteins oder von heterologen Proteinen mit biologischer Aktivität: und/oder korrekter Struktur in einem Wirtsorganismus, das die Reinigung des heterologen Proteins oder der heterologen Proteine aus dem Zellextrakt eines Wirtsorganismus umfasst, bei dem folgende Schritte durchgeführt werden: (a) Transformieren des Wirtsorganismus in vitro mit (i) einem oder mehreren der in einem der Ansprüche 1 bis 5 definierten Vektoren und/oder (ii) einem oder mehreren Vektoren, die eine Expressionskassette aufweisen, die eine DNA-Sequenz enthält, die ein Protein codiert, das befähigt ist, die Bildung von Disulfidbindungen zu katalysieren, wobei das Protein Proteindisulfidisomerase (PDI) oder Thioredoxin (TRX) ist, (b) Kultivieren des Wirtsorganismus von Schritt (a) unter Bedingungen, die für die Expression des einen heterologen Proteins oder der mehreren heterologen Proteine geeignet sind, und (c) Reinigung des heterologen Proteins oder der heterologen Proteine mit biologischer Aktivität und/oder korrekter Struktur aus dem Zellextrakt des Mikroorganismus, wobei, wenn der Wirtsorganismus nach (a)(ii) transformiert wird, er ferner mit einem oder mehreren Vektoren transformiert wird, die eine Expressionskassette aufweisen, die eine oder mehrere DNA-Sequenzen enthält, die das eine heterologe Protein oder die mehreren heterologen Proteine codieren, und, wenn der Wirtsorganismus mit einem oder mehreren Vektoren transformiert wird, die eine Expressionskassette aufweisen, die eine DNA-Sequenz enthält, die TRX codiert, das eine heterologe Protein oder die mehreren heterologen Proteine kein(e) Fusionsprotein(e) mit TRX bilde(t)(n), und wobei der Wirtsorganismus eine eukaryotische Mikroorganismus-Species, eine Insektenzelle oder eine Säugerzelle ist.
Verfahren nach Anspruch 6, bei dem die weiter; Transformation entweder anschließend oder gleichzeitig durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, bei dem die weitere Transformation mit einem Vektor durchgeführt wird, der eine Expressionskassette aufweist, die DNA-Sequenz(en) enthält, die das E2₇₁₅-Hüll-Glycoprotein des Hepatitis-C-Virus (HCV) oder humanen Wachstumsfaktor (FIGF) codieren.
Verfahren zur Herstellung einer immunogenen Zusammensetzung, das folgende Maßnahmen umfasst: (A) Erzeugen eines heterologen Proteins oder mehrerer heterologer Proteine mit biologischer Aktivität und/oder korrekter Struktur in einem nicht-humanen Wirtsorganismus, das die Reinigung des heterologen Proteins oder der heterologen Proteine aus dem Zellextrakt eines nicht-humanen Wirtsorganismus umfasst, wobei folgende Schritte durchgeführt werden: (a) Transformieren des Wirtsorganismus in vitro mit (i) einem oder mehreren der in einem der Ansprüche 1 bis 5 definierten Vektoren und/oder (ii) einem oder mehreren Vektoren, die eine Expressionskassette aufweisen, die eine DNA-Sequenz enthält, die ein Protein codiert, das befähigt ist, die Bildung von Disulfidbindungen zu katalysieren, wobei das Protein Proteindisulfidisomerase (PDI) oder Thioredoxin (TRX) ist, (b) Kultivieren des Wirtsorganismus von Schritt (a) unter Bedingungen, die für die Expression des einen heterologen Proteins oder der mehreren heterologen Proteine geeignet sind, und (c) Reinigung des heterologen Proteins oder der heterologen Proteine mit biologischer Aktivität und/oder korrekter Struktur aus dem Zellextrakt des Wirtsorganismus, wobei, wenn der Wirtsorganismus nach (a)(ii) transformiert wird, er ferner mit einem oder mehreren Vektoren transformiert wird, die eine Expressionskassette aufweisen, die eine oder mehrere DNA-Sequenzen enthält, die das eine heterologe Protein oder die mehreren heterologen Proteine codieren, und, wenn der Mikroorganismus mit einem oder mehreren Vektoren transformiert wird, die eine Expressionskassette aufweisen, die eine DNA-Sequenz enthält, die TRX codiert, das eine heterologe Protein oder die mehreren heterologen Proteine kein(e) Fusionsprotein(e) mit TRX bilde(t)(n), und (B) Zusammenbringen des erhaltenen heterologen Proteins oder der erhaltenen heterologen Proteine mit biologischer Aktivität und/oder korrekter Struktur mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger und wahlweise einem Adjuvans, wobei es sich bei dem heterologen Protein oder den heterologen Proteinen mit biologischer Aktivität und/oder korrekter Struktur um das HCV-E2₇₁₅-Hüll-Glycoprotein oder humanen Wachstumsfaktor (FIGF) handelt.