PT1007698E - ''expressão de proteínas heterólogas'' - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO EPÍGRAFE: "EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS HETERÓLOGAS"

Campo do Invento 0 presente invento relaciona-se com um sistema de expressão que proporciona proteínas heterólogas expressas por um organismo hospedeiro não nativo mas detentoras de actividade biológica e/ou estrutura semelhante à das proteínas nativas.

Antecedentes do Invento

Os desenvolvimentos verificados durante a última década nos campos da biologia molecular e da engenharia genética tornaram possível a produção de grandes quantidades de produtos proteicos usando sistemas de expressão heterólogos. 0 uso de hospedeiros heterólogos para a produção de, por exemplo, proteínas terapêuticas poderá conduzir, no entanto, a diferenças a nível das propriedades biológicas e/ou da estrutura do produto recombinante. Entre as modificações bioquímicas que vulgarmente ocorrem durante ou após a síntese das proteínas pela célula, a formação de pontes dissulfito torna-se relevante devido à influência desta modificação sobre a correcta dobragem ou reunião das moléculas de proteínas com ligações dissulfito (revisto por J.C.A. Bardwell e J.

Beckwith, Cell, 74:769-771, 1993; R.B. Freedman, em Protein

Folding, T.E. Creighton (ed.), W.H. Freeman & Co., New York, págs. 455-539, 1992).

Em bactérias e outras células hospedeiras, por exemplo, sob certas condições, algumas proteínas heterólogas sofrem 1 precipitação no interior das células sob a forma de corpos "refringentes" ou "de inclusão". Tais corpos refringentes ou de inclusão consistem em massas densas de proteína heteróloga reduzida, parcialmente dobrada, que frequentemente se encontra numa forma biologicamente inactiva (S.B. Storrs et al., Protein Folding - American Chemical Society Symposium Series 470, Capítulo 15:197-204, 1991). Crê-se que a inactividade biológica das proteínas heterólogas refringentes ou de inclusão, que possuem ligações dissulfito na sua forma nativa, se deve a uma incorrecta dobragem ou reunião das moléculas de proteína causados pela não formação, ou formação incorrecta, das ligações dissulfito no seio da proteína. Crê-se que a inactividade biológica das proteínas heterólogas refringentes ou de inclusão devida a um processo incorrecto de dobragem ou reunião ocorra antes ou após a precipitação intracelular ou durante o isolamento das proteínas.

Adicionalmente, com bastante frequência a função biológica de uma proteína é regulada ou, pelo menos, influenciada pelo estado de oxidação dos seus grupos sulfidrilo. Tal é verificado em algumas actividades enzimáticas, considerando-se que a sua reversibilidade e a altura em que se processa a oxidação dos grupos sulfidrilo constituem um mecanismo fisiológico de controlo.

Encontram-se na literatura numerosos exemplos de proteínas com ligações dissulfito. Por exemplo, sabe-se que a maioria das glicoproteínas virais e alguns factores de crescimento possuem ligações dissulfito. De modo geral, as ligações dissulfito são essenciais para a dobragem correcta da proteína. Como exemplos de proteínas heterólogas recombinantes com ligações dissulfito que se verificou apresentarem uma dobragem incorrecta quando expressas em, por exemplo, células de levedura encontram-se a grande proteína de superfície do vírus da hepatite B (Biemans et al., DNA Cell Biol., 10: 191- 2 200, 1991), α-1-antitripsina (Moir e Dumais, Gene, 56: 209- 217, 1987) e eritropoietina (Elliott et al., Gene, 79: 167- 180, 1989) . Os exemplos de proteínas recombinantes expressas em, por exemplo, células de insecto ou de mamífero, para as quais se demonstrou que as ligações dissulfito são essenciais para a dobragem correcta da proteína incluem o factor estimulador de colónias de granulócitos/macrófagos (GM-CSF) (Kaushansky et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 86:1213-1217, 1989), glicoproteína gp55 do vírus da eritroleucémia de Friend (SFFV) (Gliniak et al., J. Biol. Chem., 266:22991-22997, 1991) , glicoproteína do vírus da estomatite vesicular (VSV-G) (Grigera et al., J. Virol., 66:3749-3757, 1992), proteína surfactante pulmonar D (Crouch et al., J. Biol. Chem., 269: 15808-15813, 1994), receptor da lipoproteína de baixa densidade (LDL) (Bieri et al., Biochemistry, 34: 13059-13065, 1995), factor de crescimento semelhante à insulina (Nahri et al., Biochemistry, 32: 5214-5221, 1993) e enzima conversora da angiotensina (ECA) (Sturrock et al., Biochemistry, 35: 9560- 9566, 1996) . Deverá notar-se que, em todos estes casos, a expressão de proteínas heterólogas em células hospedeiras particulares foi usada apenas para produzir a proteína em causa em quantidade suficiente para permitir a realização de estudos estruturais.

Foram já caracterizados diversos factores proteicos que catalisam a formação de ligações dissulfito. A proteína dissulfito isomerase (PDI) é uma proteína multifuncional presente em abundância no lúmen do retículo endoplasmático (RE) que promove a formação adequada de ligações dissulfito em proteínas de secreção e de superfície celular (LaMantia et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88: 4453-4457, 1991; Farquhar et al., Gene, 108: 81-89, 1991; Freedman, Cell, 57:1069-1072, 1989; Laboissière et al., J. Biol. Chem., 270: 28006-28009, 1995). 3

Atribui-se uma função similar, mas num compartimento celular diferente, a outra proteína ubiquitária pequena, a tioredoxina (TRX) (Gan, J. Biol. Chem., 266: 1692-1696, 1991; Muller, J. Biol. Chem., 266: 9194-9202, 1991; Chivers et al., EMBO J.f 15: 2659-2667, 1996) que possui uma sequência de local activo semelhante à da PDI. As tioredoxinas são polipéptidos do citosol que têm a capacidade de catalisar a redução de dissulfitos usando o glutatião como redutor (Holmgren, J. Biol. Chem., 264: 13963-13966, 1989). Postulou-se que a tioredoxina poderia estar igualmente envolvida na redução de ligações dissulfito prematuramente formadas em proteínas que entraram no RE. Uma vez que a actividade biológica de diversas enzimas-chave que se encontram envolvidas em vias metabólicas cruciais depende do sistema redox do citosol, parece plausível que a TRX desempenhe um papel relevante na modificação de proteínas submetidas a dobragem em outros compartimentos celulares que não o citosol.

Nos numerosos organismos, por exemplo, bactérias, leveduras, células de mamífero e células de insecto, que têm sido geneticamente modificadas para (sobre)expressar proteínas heterólogas, o problema verificado com a maioria dos sistemas de expressão tem correspondido à sua incapacidade para expressar proteínas biologicamente activas.

Resumo do Invento

Crê-se presentemente que é devido à falta ou à quantidade deficiente de enzimas necessárias à correcta dobragem ou reunião das proteínas heterólogas em hospedeiros de expressão não nativos que tais proteínas heterólogas expressas são com frequência biologicamente inactivas e/ou possuem uma estrutura proteica incorrecta. O presente invento ultrapassa este problema e permite conseguir a expressão de proteínas heterólogas biologicamente 4 activas e/ou com uma estrutura correcta em hospedeiros de expressão não nativos.

Verificou-se agora que poderão utilizar-se cassettes de expressão contendo PDI ou TRX para transformar um organismo hospedeiro, conferindo-lhe deste modo a capacidade de sobreexpressar PDI ou TRX. Preferencialmente, o organismo hospedeiro corresponde a levedura. As células de levedura, por exemplo, que sobreexpressem estas proteínas poderão ser subsequentemente ou simultaneamente transformadas com vectores de expressão que codifiquem para uma ou mais proteínas heterólogas desejadas. As proteínas heterólogas expressas por tais células de levedura transformadas por PDI/TRX encontram-se sob uma forma apropriadamente dobrada e biologicamente activa devido à actividade de formação de ligações dissulfito evidenciada pelas enzimas PDI ou TRX que são co-expressas na mesma célula.

Tais sistemas para a produção de proteínas heterólogas biologicamente activas poderão ser utilizados com vantagem para produzir, por exemplo, proteínas para uso veterinário em terapêutica e/ou diagnóstico ou outras proteínas de interesse para comercialização ou pesquisa. A dobragem correcta e a óptima actividade biológica promovidos pelos métodos do presente invento são fundamentais para a produção de, por exemplo, fármacos e reagentes de diagnóstico eficazes.

Verificou-se que a sobreexpressão de PDI em Saccharomyces cerevisiae aumentava a secreção de homodímero do factor de crescimento B derivado de plaquetas humano (PDGF-BB) para o meio de cultura (Robinson et al., Bio/Technology, 12:381-384, 1994) .

No âmbito do presente invento, foi demonstrado um nível aumentado de eficiência de dobragem das proteínas heterólogas a nível das células. 5

De acordo com um primeiro aspecto do invento, é fornecido um vector com uma cassette de expressão compreendendo uma sequência de DNA que codifica para uma proteína capaz de catalisar a formação de ligações dissulfito. 0 uso de um tal vector resulta desejavelmente na (sobre)expressão da proteína numa célula hospedeira transformada, proporcionando desta forma as condições necessárias à dobragem correcta da proteína heteróloga. A proteína poderá corresponder a qualquer proteína que tenha a capacidade de catalisar a formação de ligações dissulfito e corresponderá preferencialmente a proteína dissulfito isomerase (PDI) ou a tioredoxina (TRX), ou a uma combinação destas. Os genes que codificam para PDI ou TRX são preferencialmente obtidos a partir de leveduras, mais preferencialmente de S. cerevisiae. No entanto, as fontes de PDI e TRX poderão igualmente incluir, por exemplo, sequências de cDNA humano de tipos selvagem e mutante.

Tal como aqui é usado, o termo "cassete de expressão" pretende indicar uma sequência de DNA que compreende pelo menos uma sequência de DNA estrutural codificando para uma proteína e sequências apropriadas de expressão e, opcionalmente, de controlo para facilitar a expressão da sequência de DNA estrutural. 0 vector poderá compreender mais do que uma sequência de DNA codificando para uma proteína com a capacidade de catalisar a formação de ligações dissulfito, em uma ou mais cassettes de expressão. As sequências de DNA poderão consistir em repetições da mesma sequência de DNA ou poderão codificar para diferentes proteínas com a capacidade de catalisar a formação de ligações dissulfito. 0 fornecimento de múltiplas cópias de sequências de DNA das mesmas proteínas, ou de proteínas diferentes, com a capacidade de catalisar a formação de ligações dissulfito representa uma forma de atingir a 6 desejável sobreexpressão das proteínas e, deste modo, concretizar o vantajoso efeito técnico deste invento. A cassette de expressão poderá igualmente compreender uma sequência de DNA que codifica para um péptido leader de secreção fundido à extremidade 5' do gene que codifica para a proteína com a capacidade de catalisar a formação de ligações dissulfito. Deste modo, a construção desejavelmente resultará em (1) (sobre)expressão da proteína pela célula transformada, e (2) localização da proteína (sobre)expressa no RE, e/ou em outros compartimentos secretórios, a nível dos quais poderá exercer a sua função, deste modo proporcionando as condições para uma dobragem correcta da proteína heteróloga. 0 vector do primeiro aspecto do invento poderá ainda compreender uma cassette de expressão que compreende sequência (s) de DNA codificando para uma ou mais proteínas heterólogas. Preferencialmente, a proteína heteróloga corresponderá à glicoproteína E27;L5 do envelope do vírus da hepatite C (HCV) ou ao factor de crescimento induzido por c-fos humano (FIGF). 0 vector segundo o primeiro aspecto do invento poderá ser integrativo ou epissómico quando transformado sobre um organismo hospedeiro. De preferência, o vector terá a capacidade de se integrar no genoma do organismo hospedeiro.

De acordo com um segundo aspecto do invento, é fornecido um organismo hospedeiro transformado com um vector de acordo com o primeiro aspecto do invento.

Do mesmo modo, poderão encontrar-se presentes múltiplas cópias do vector, tanto sob a forma de vectores epissómicos como de vectores integrados no genoma do organismo hospedeiro, para facilitar a (sobre)expressão da proteína que possui a capacidade de catalisar a formação de ligações dissulfito.

De acordo com um terceiro aspecto do invento, é proporcionado um organismo hospedeiro de acordo com o segundo 7 aspecto do invento, adicionalmente transformado com um vector que compreende uma cassette de expressão compreendendo sequência (s) de DNA que codifica (m) para uma ou mais proteínas heterólogas. Este vector poderá ser integrativo ou epissómico quando transformado sobre o organismo hospedeiro. 0 organismo hospedeiro poderá ser co-transfectado com mais de um vector compreendendo uma cassette de expressão com sequência (s) de DNA que codifica (m) para uma ou mais proteínas heterólogas. 0 organismo hospedeiro poderá corresponder a qualquer organismo hospedeiro no qual a expressão de uma proteína heteróloga esteja sujeita à formação incorrecta de ligações dissulfito. A proteína heteróloga poderá corresponder a qualquer proteína que normalmente não é produzida pelo organismo hospedeiro e que, na ausência de (sobre)expressão da proteína capaz de catalisar a formação de ligações dissulfito, será produzida sob uma forma contendo ligações dissulfito incorrectas. De preferência, a proteína heteróloga corresponde à glicoproteína E2715 do envelope do HCV ou ao FIGF humano.

De preferência, o organismo hospedeiro utilizado de acordo com o segundo e o terceiro aspectos do invento corresponde a uma levedura, e mais preferencialmente a S. cerevisiae.

De acordo com um quarto aspecto do invento, é fornecido um método para a produção de um organismo hospedeiro de acordo com o segundo aspecto do invento, compreendendo a transformação de um organismo hospedeiro com um vector de acordo com o primeiro aspecto do invento.

De acordo com um quinto aspecto do invento, é fornecido um método para a produção de um organismo hospedeiro de acordo com o terceiro aspecto do invento, compreendendo a transformação adicional, subsequente ou simultânea, de um organismo hospedeiro de acordo com o segundo aspecto do invento com um vector compreendendo uma cassette de expressão com sequência(s) de DNA codificando para uma ou mais proteínas heterólogas.

De acordo com um sexto aspecto do invento, é fornecido um método para a expressão de proteína (s) heteróloga (s) biologicamente activa(s) e/ou correctamente estruturada(s) num organismo hospedeiro, compreendendo os passos de: (a) transformação de um organismo hospedeiro com um ou mais vectores de acordo com o primeiro aspecto do presente invento; (b) transformação adicional, subsequente ou simultânea, do organismo hospedeiro do passo (a) com um ou mais vectores compreendendo sequência (s) de DNA que codifica(m) para uma ou mais proteínas heterólogas; e (c) cultivo do organismo hospedeiro do passo (b) sob condições adequadas à expressão de uma ou mais destas proteínas heterólogas.

De acordo com um sétimo aspecto do invento, é proporcionado um método para a expressão de proteína (s) biologicamente activa(s) e/ou correctamente estruturada(s) num organismo hospedeiro, compreendendo: (a) transformação, subsequente ou simultânea, de um organismo hospedeiro de acordo com o segundo aspecto do invento com um ou mais vectores compreendendo sequência (s) de DNA que codifica (m) para uma ou mais proteínas heterólogas; e (b) cultivo do organismo hospedeiro do passo (a) sob condições adequadas à expressão de uma ou mais destas proteínas heterólogas.

De acordo com um oitavo aspecto deste invento, é fornecido um método para a expressão de proteína(s) biologicamente 9 activa(s) e/ou correctamente estruturada(s) num organismo hospedeiro, compreendendo o passo de cultivo de um organismo hospedeiro transformado com um ou mais vectores de acordo com o terceiro aspecto do invento sob condições adequadas à expressão de uma ou mais destas proteínas heterólogas.

De acordo com um nono aspecto do invento, é fornecido um método para a expressão da glicoproteína E27i5 do envelope do HCV ou de FIGF humano num organismo hospedeiro.

De acordo com um décimo aspecto do invento, é proporcionado um método para a preparação de uma composição imunogénica, compreendendo a colocação da glicoproteína E27i5 do envelope do HCV ou do FIGF humano, produzidos pelo método de acordo com o nono aspecto do invento, em associação a um veículo farmaceuticamente aceitável e, opcionalmente, a um adjuvante.

Descrição de Formas de Realização Específicas A colocação em prática do presente invento utilizará, ao não ser que de outro modo indicado, técnicas convencionais de biologia molecular, microbiologia, DNA recombinante e imunologia, as quais são bem conhecidas neste campo técnico. Tais técnicas encontram-se descritas em detalhe na literatura (ver, p.ex., Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed. (1989) ou 3a Ed. (2000); D.N. Glover (ed.), DNA Cloning, Volumes I e II, 1985; M.J. Gait (ed.), Oligonucleotide Synthesis, 1984; B.D. Hames & S.J. Higgins (eds.), Nucleic Acid Hybridization, 1984; B.D. Hames & S.J. Higgins (eds.), Transcription and Translation, 1984; R.I. Freshney (ed.), Animal Cell Culture, 1986; Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986; B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, 1984; a série Methods in Enzymology, Academic Press, Inc.; J.H. Miller e M.P. Calos (eds.), Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, Cold Spring Harbor 10

Laboratory, 1987; Wu e Grossman (eds.) e Wu (ed.), Methods in Enzymology, Volumes 154 e 155, respectivamente; Mayer e Walker (eds.), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, Academic Press, London, 1987; Scopes, Protein Purification: Principies and Practice, 2a Ed., Springer-Verlag, New York, 1987; e D.M. Weir e C.C. Blackwell (eds.), Handbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV, 1986).

Tal como acima se mencionou, os exemplos de proteínas que possuem a capacidade de catalisar a formação de ligações dissulfito e que podem ser usadas no âmbito deste invento incluem polipéptidos com variações mínimas da sequência de aminoácidos da proteína PDI ou TRX especificamente descrita.

Uma vantagem significativa da produção de proteínas heterólogas por técnicas de DNA recombinante, em lugar do isolamento e purificação de uma proteína a partir de fontes naturais, é a de ser possível produzir quantidades equivalentes de proteína utilizando menos material de partida do que o necessário para isolar a proteína a partir de uma fonte natural. A produção de proteína por técnicas recombinantes permite igualmente que a proteína seja isolada na ausência de algumas moléculas que normalmente se encontram presentes nas células. De facto, poderão facilmente produzir-se composições de proteína inteiramente isentas de quaisquer contaminantes de proteínas humanas, já que a única proteína humana que é produzida pelo hospedeiro recombinante não humano é a própria proteína recombinante de interesse. É igualmente evitada a contaminação com potenciais agentes virais provenientes das fontes naturais e com componentes virais patogénicos para os seres humanos.

Os veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem qualquer veículo que não induza por si mesmo a produção de anticorpos prejudiciais para o indivíduo que recebe a composição. Os veículos adequados correspondem tipicamente a macromoléculas 11 grandes que são lentamente metabolizadas, tais como proteínas, polissacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, agregados lipídicos (tais como gotículas de óleo ou lipossomas) e partículas virais inactivas. Tais veículos são bem conhecidos dos técnicos de perícia média neste campo. Adicionalmente, estes veículos poderão funcionar como agentes imunoestimuladores (adjuvantes).

Os adjuvantes preferidos para acentuar a eficácia da composição incluem, de modo não limitativo: sais de alumínio (alum) tais como hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, sulfato de alumínio, etc., formulações de emulsão em óleo, com ou sem outros agentes imunoestimuladores específicos tais como muramil-péptidos ou componentes da parede celular bacteriana, tais como, por exemplo, (1) MF59 (Pedido de Patente Internacional Publicado WO-A-90/14837), contendo 5% de esqualeno, 0,5% de Tween® 80, 0,5% de Span® 85 (contendo opcionalmente quantidades diversas de MTP-PE (ver abaixo), se bem que tal não seja necessário), formulado em partículas submicrónicas por meio de um microfluidificador, tal como o microfluidificador Modelo 110Y (Microfluidics, Newton, MA 02164), (2) SAF, contendo 10% de esqualeno, 0,4% de Tween 80, 5% de polímero L121 bloqueado por plurónico, e thr-MDP (ver abaixo), microfluidizado até uma emulsão submicrónica ou vortexado para gerar uma emulsão com partículas de maior tamanho, e (3) sistema adjuvante RIBI® (RAS) (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) contendo 2% de esqualeno, 0,2% de Tween® 80 e um ou mais componentes da parede celular bacteriana pertencentes ao grupo que consiste em monofosforil-lípido A (MPL), dimicolato de trealose (TDM) e esqueleto da parede celular (CWS), preferencialmente MPL+CWS (Detox®), muramil-péptidos tais como N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N- 12 acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE) , etc., e citocinas, tal como as interleucinas (IL-1, IL-2, etc.), o factor estimulador de colónias de macrófagos (M-CSF), o factor de necrose de tumor (TNF), etc. Adicionalmente, poderão usar-se adjuvantes de saponinas, tal como o Stimulon® (Cambridge Bioscience, Worcester, MA), ou partículas criadas a partir destes, tal como os ISCOMS (complexos imunoestimuladores) . Poderão ainda utilizar-se o Adjuvante Completo de Freund (CFA) e o Adjuvante Incompleto de Freund (IFA). É dada preferência ao alum e ao MF59.

As composições imunogénicas (p.ex., o antigénio, o veículo farmaceuticamente aceitável e o adjuvante) conterão tipicamente diluentes, tais como água, soro fisiológico, glicerol, etanol, etc. Adicionalmente, poderão encontrar-se presentes em tais veículos substâncias auxiliares, tais como agentes molhantes ou emulsificantes, substâncias tamponantes de pH e semelhantes.

Tipicamente, as composições imunogénicas são preparadas sob a forma de injectáveis, em soluções líquidas ou suspensões; poderão ainda preparar-se formas sólidas adequadas para solução, ou suspensão, em veículos líquidos antes da injecção. A preparação poderá igualmente ser emulsifiçada ou encapsulada em lipossomas para acentuar o seu efeito adjuvante, tal como acima se referiu para os veículos farmaceuticamente aceitáveis.

As composições imunogénicas que são usadas como vacinas compreendem uma quantidade imunologicamente eficaz dos polipéptidos antigénicos, assim como de qualquer dos componentes acima mencionados, segundo requerido. Por "quantidade imunologicamente eficaz" pretende-se significar que a administração de tal quantidade a um indivíduo, em dose única ou como parte de uma série de doses, é eficaz para 13 tratamento ou prevenção. Esta quantidade varia segundo o estado de saúde e as condições fisicas do indivíduo a ser tratado, o grupo taxonómico do indivíduo a ser tratado (p.ex., um primata não humano, um primata, etc.) a capacidade de produção de anticorpos evidenciada pelo sistema imunológico do indivíduo, o grau de protecção desejada, a formulação da vacina, a avaliação da situação clínica por parte do médico e outros factores relevantes. Será de esperar que esta quantidade se encontre dentro de um intervalo relativamente alargado que poderá ser determinado através de ensaios de rotina.

As composições imunogénicas são convencionalmente administradas por via parentérica, p.ex. por injecção subcutânea ou intramuscular. As formulações adicionais adequadas para outros modos de administração incluem as formulações orais e pulmonares, os supositórios e as aplicações transdérmicas. A dosagem de tratamento poderá ser administrada num regime de dose única ou num regime de doses múltiplas. A vacina poderá ser administrada em conjunção com outros agentes imunoreguladores. 0 termo "polipéptido recombinante", tal como aqui é usado, pretende indicar um polinucleótido de origem genómica, de cDNA, semi-sintética ou sintética que, por virtude da sua origem ou manipulação: (1) não se encontra associado com o todo ou parte de um polinucleótido com o qual se encontra associado na natureza, (2) se encontra ligado a um polinucleótido distinto daquele ao qual se encontra associado na natureza, ou (3) não ocorre na natureza. 0 termo "polinucleótido", tal como aqui é usado, refere-se a uma forma polimérica de nucleótidos - ribonucleótidos ou desoxirribonucleótidos - de qualquer extensão. Este termo refere-se apenas à estrutura primária da molécula. Assim, este termo inclui DNA e RNA de cadeia dupla e de cadeia simples. 14 São igualmente abrangidos tipos conhecidos de modificações, por exemplo, marcadores conhecidos neste campo técnico, metilação, "caps", substituição de um ou mais dos nucleótidos de ocorrência natural por um análogo, modificações inter-nucleotídicas tal como, por exemplo, nucleótidos com ligações não carregadas (p.ex., metil-fosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) e com ligações carregadas (p.ex., fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), com extensões de porções moleculares, tais como, por exemplo, proteínas (incluindo, p.ex., nucleases, toxinas, anticorpos, péptidos de sinal, poli-L-lisina, etc.), com intercaladores (p.ex., acridina, psoraleno, etc.), com quelantes (p.ex., metais, metais radioactivos, boro, metais oxidativos, etc.), com alquiladores, com ligações modificadas (p.ex., ácidos nucleicos alfa-anoméricos, etc.), assim como as formas não modificadas do polinucleótido.

Um "replicon" corresponde a qualquer elemento genético, p.ex., um plasmídeo, um cromossoma, um vírus, um cosmídeo, etc., que se comporte como uma unidade autónoma de replicação polinucleotídica no interior de uma célula; i.e., que tem a capacidade de se replicar sob o seu próprio controlo. Tal poderá incluir marcadores de selecção.

Um "vector" corresponde a um replicon ao qual se encontra ligado outro segmento de polinucleótido, tal permitindo a replicação e/ou a expressão do segmento ligado. 0 termo "sequência de controlo" refere-se a sequências polinucleotídicas que são necessárias para efectuar a expressão de sequências codificantes às quais se encontram ligadas. A natureza de tais sequências de controlo difere, dependendo do organismo hospedeiro; nos procariotas, tais sequências de controlo incluem geralmente um promotor, um local de ligação ao ribossoma e uma sequência de terminação da transcrição; nos eucariotas, geralmente, tais sequências de 15 controlo incluem promotores e uma sequência de terminação da transcrição. 0 termo "sequências de controlo" pretende incluir, no minimo, todos os componentes cuja presença seja necessária para a expressão, e poderão igualmente incluir componentes adicionais cuja presença seja vantajosa, por exemplo, sequências leader e sequências de parceiros de fusão. 0 termo "ligado de modo operativo" refere-se a uma justaposição em que os componentes assim descritos se encontram numa relação que permite o seu funcionamento do modo pretendido. Uma sequência de controlo "ligada de modo operativo" a uma sequência codificante encontra-se ligada de modo a que a expressão da sequência codificante seja atingida sob condições compatíveis com as sequências de controlo.

Um "molde aberto de leitura" (ORF) é uma região de uma sequência polinucleotídica que codifica para um polipéptido; a região poderá representar uma porção da sequência codificante ou uma sequência codificante total.

Uma "sequência codificante" corresponde a uma sequência polinucleotídica que é traduzida para um polipéptido, usualmente por meio de mRNA, quando colocada sob o controlo de sequências reguladoras apropriadas. As fronteiras da sequência codificante são determinadas por um codão de iniciação da tradução a nível da extremidade 5' e por um codão de terminação da tradução na extremidade 3'. Uma sequência codificante poderá incluir, de forma não limitativa, cDNA e sequências polinucleotídicas recombinantes. 0 termo "PCR" refere-se à técnica de reacção em cadeia por polimerase tal como se descreve em Saiki et al., Nature 324:163, 1986; Scharf et al., Science 233:1076-1078, 1986; patente dos EUA N°. 4.683.195; e patente dos EUA N° 4.683.202.

Tal como aqui é usado, x é "heterólogo" relativamente a y se x não se encontrar naturalmente associado com y numa forma idêntica; i.e., se x não se encontra associado com y na 16 natureza ou se x não se encontra associado a y do mesmo modo que é encontrado na natureza. 0 termo "homologia" refere-se ao grau de similariedade que existe entre x e y. A correspondência entre a sequência de um e de outro poderá ser determinada através de técnicas conhecidas neste campo técnico. Por exemplo, esta poderá ser determinada por comparação directa da informação da sequência do polinucleótido. Alternativamente, a homologia poderá ser determinada por hibridização dos polinucleótidos sob condições que permitam a formação de duplexes estáveis entre regiões homólogas (por exemplo, as que seriam usadas antes da digestão por Si), seguindo-se a digestão por nuclease(s) especifica (s) para cadeia simples e subsequente determinação da dimensão dos fragmentos digeridos.

Tal como aqui é usado, o termo "polipéptido" refere-se a um polímero de aminoácidos e não se refere a uma extensão específica do produto; assim, tanto os péptidos como os oligopéptidos e as proteínas se encontram abrangidos pela definição de polipéptido. Do mesmo modo, este termo não se refere a, ou exclui, modificações pós-expressão do polipéptido, por exemplo, glicosilações, acetilações, fosforilações e semelhantes. Encontram-se incluídas nesta definição, por exemplo, polipéptidos contendo um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo, por exemplo, aminoácidos não naturais, etc.), polipéptidos com ligações substituídas, assim como outras modificações conhecidas neste campo técnico, tanto as de ocorrência natural como as que não ocorrem na natureza.

Um polipéptido ou sequência de aminoácidos "derivada de" uma determinada sequência de ácido nucleico refere-se a um polipéptido que possui uma sequência de aminoácidos idêntica à de um polipéptido codificado por essa sequência, ou de uma sua porção em que a porção consiste em pelo menos 3-5 aminoácidos, 17 mais preferencialmente em pelo menos 8-10 aminoácidos, e ainda mais preferencialmente em pelo menos 11-15 aminoácidos, ou que é imunologicamente identificável com um polipéptido codificado pela sequência. Esta terminologia inclui igualmente um polipéptido expresso a partir de uma determinada sequência de ácido nucleico. A proteína poderá ser usada para a produção de anticorpos, monoclonais ou policlonais, específicos contra a proteína. Os métodos de produção destes anticorpos são bem conhecidos da técnica.

Os termos "células hospedeiras recombinantes", "células hospedeiras", "células", "culturas celulares" e outros termos correspondentes referem-se, por exemplo, a microorganismos, células de insecto e células de mamífero que poderão ser, ou foram, usadas como recipientes para um vector recombinante ou outro DNA de transferência, e que incluem a descendência da célula original que foi transformada. Deve entender-se que a descendência de uma só célula-mãe poderá não ser necessariamente idêntica por completo, em termos morfológicos ou de complementaridade genómica ou de DNA total, à célula-mãe original, em consequência de mutação natural, acidental ou deliberada. Os exemplos de células hospedeiras de mamífero incluem as células de ovário de hamster chinês (CHO) e as células de rim de macaco (COS).

Especificamente, tal como aqui é usado, o termo "linha celular" refere-se a uma população de células que tem a capacidade de crescer e dividir-se in vitro de modo contínuo ou prolongado. Frequentemente, as linhas celulares correspondem a populações clonais derivadas de uma só célula progenitora. É sabido que poderão ocorrer alterações espontâneas ou induzidas do cariotipo durante o armazenamento ou transferência de tais populações clonais. Deste modo, as células derivadas da linha celular referida poderão não ser 18 precisamente idênticas às células ou culturas originais, e a linha celular referida inclui tais variantes. 0 termo "linhas celulares" inclui igualmente as células imortalizadas. De preferência, as linhas celulares incluem linhas celulares não híbridas ou hibridomas de apenas dois tipos de células.

Tal como aqui é usado, o termo "microorganismo" inclui espécies microbianas procarióticas e eucarióticas tais como bactérias e fungos, estes últimos incluindo leveduras e fungos filamentosos. 0 termo "transformação", tal como aqui é usado, refere-se à inserção de um polinucleótido exógeno numa célula hospedeira, independentemente do método usado para a inserção, por exemplo, captação directa, transdução, conjugação por factor f ou electroporação. 0 polinucleótido exógeno poderá ser mantido sob a forma de um vector não integrado, como um plasmídeo, por exemplo, ou, alternativamente, poderá ser integrado no genoma da célula hospedeira.

Por "genómico" pretende-se indicar uma colecção ou biblioteca de moléculas de DNA derivadas de fragmentos de restrição que foram clonados em vectores. Tal poderá incluir o todo ou parte do material genético de um organismo.

Por "cDNA" pretende-se indicar uma sequência de DNA complementar que se hibridiza com uma cadeia complementar de DNA.

Por "purificado" e "isolado" pretende-se indicar, quando em referência a um polipéptido ou sequência nucleotídica, que a molécula indicada se encontra presente na ausência substancial de outras macromoléculas biológicas do mesmo tipo. 0 termo "purificado", tal como aqui é usado, refere-se a pelo menos 75% em peso, mais preferencialmente a pelo menos 85% em peso, mais preferencialmente ainda a pelo menos 95% em peso, e de modo particularmente preferido a pelo menos 98% em peso, de presença de macromoléculas biológicas do mesmo tipo 19 (podendo, no entanto, encontrar-se presentes água, tampões e outras moléculas pequenas, especialmente moléculas com um peso molecular inferior a 1000) .

Uma vez isolada a sequência codificante apropriada, esta poderá ser expressa em uma variedade de sistemas de expressão diferentes; por exemplo, os usados com células de mamífero, baculovirus, bactérias e leveduras. i. Sistemas de mamíferos

Os sistemas de expressão de mamíferos são bem conhecidos neste campo técnico. Um promotor de mamífero corresponde a qualquer sequência de DNA que tem a capacidade de se ligar a uma RNA polimerase de mamífero e iniciar a transcrição a jusante (3') de uma sequência codificante (p.ex. um gene estrutural) para mRNA. Um promotor terá uma região de iniciação da transcrição, que geralmente está colocada em posição proximal relativamente à extremidade 5' da sequência codificante, e uma TATA box, geralmente localizada 25-30 pares de bases (pb) a montante do local de iniciação da transcrição. Pensa-se que a TATA box dirija a RNA polimerase II para iniciar a síntese de RNA no local correcto. Um promotor de mamífero conterá igualmente um elemento promotor a montante, geralmente localizado entre 100 a 200 pb a montante da TATA box. Um elemento promotor a montante determina a rapidez à qual se inicia a transcrição e pode actuar em ambas as orientações (Sambrook et al., "Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells", em Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2a ed., 1989).

Os genes de vírus que infectam mamíferos são frequentemente expressos em frequência elevada e possuem uma larga variedade de hospedeiros; assim, as sequências que codificam para genes de vírus que infectam mamíferos constituem sequências promotoras particularmente úteis. Como 20 exemplos destes promotores encontram-se o promotor precoce de SV4 0, o promotor LTR virai do tumor mamário de ratinho, o promotor principal tardio de adenovirus (AdMLP) e o promotor do vírus herpes simplex. Adicionalmente, as sequências derivadas de genes não virais, tal como o gene de metalotionina murino, proporcionam igualmente sequências promotoras úteis. A expressão poderá ser constitutiva ou regulada (indutível), dependendo de o promotor ser ou não susceptível a indução com glucocorticóides em células hormono-responsivas. A presença de um elemento enhancer, combinado com os elementos promotores acima descritos, aumentará geralmente os níveis de expressão. Um enhancer é uma sequência reguladora de DNA que tem a capacidade de estimular a transcrição em até 1000 vezes quando ligada a promotores homólogos ou heterólogos, sendo a síntese iniciada no local normal de iniciação do RNA. Os enhancers são igualmente activos quando colocados a montante ou a jusante do local de iniciação da transcrição, na orientação normal ou invertida, ou a uma distância de mais do que 1000 nucleótidos de afastamento do promotor (Maniatis et al., Science 236:1231, 1987; Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, 2a ed., 1989). Os elementos enhancer derivados de vírus poderão ser particularmente úteis, uma vez que estes possuem geralmente uma gama mais alargada de hospedeiros. Os exemplos incluem o enhancer do gene precoce de SV4 0 (Dijkema et al., EMBO J. 4:761, 1985) e o enhancer/promotores derivados da longa sequência repetitiva terminal (LTR) do vírus de sarcoma Rous (Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 79:6111, 1982b) e do citomegalovírus humano (Boshart et al., Cell 41:521, 1985).

Adicionalmente, alguns enhancers são reguláveis e tornam-se activos apenas na presença de um indutor, tal como uma hormona 21 ou um ião metálico (Sassone-Corsi e Borelli, Trends Genet 2:215, 1986; Maniatis et al., Science 236:1237, 1987).

Uma molécula de DNA poderá ser expressa intracelularmente em células de mamiferos. Uma sequência promotora poderá encontrar-se directamente ligada à molécula de DNA, caso em que o primeiro aminoácido na extremidade N da proteína recombinante será sempre uma metionina, a qual é codificada pelo codão de iniciação ATG. Se desejado, a extremidade N será removida da proteína por incubação in vitro com brometo de cianogénio.

Alternativamente, as proteínas estranhas poderão também ser secretadas pela célula para o meio de cultura através da criação de moléculas quiméricas de DNA codificando para uma proteína de fusão composta por um fragmento de sequência leader que proporcione a secreção da proteína estranha em células de mamífero. De preferência, existirão locais de processamento codificados entre o fragmento leader e o gene estranho que poderão ser submetidos a corte in vivo ou in vitro. 0 fragmento de sequência leader codifica geralmente para um péptido de sinal composto por aminoácidos hidrofóbicos que dirigem a secreção da proteína pela célula. 0 leader tripartido de adenovírus constitui um exemplo de uma sequência leader que proporciona a secreção de uma proteína estranha por células de mamífero.

Geralmente, as sequências de terminação da transcrição e de poliadenilação que são reconhecidas pelas células de mamíferos correspondem a regiões reguladoras localizadas a 3' relativamente ao codão de paragem da tradução, que deste modo flanqueiam, juntamente com os elementos promotores, a sequência codificante. A extremidade 3' do mRNA maduro é formada, após a transcrição, por corte e poliadenilação específicos de local (Birnstiel et al., Cell 41:349, 1985; Proudfoot e Whitelaw, "Termination and 3' end processing of 22 eukaryotic RNA", em: Transcription and splicing (eds. B.D. Hames e D.M. Glover), 1988; Proudfoot, Trends Biochem. Sei.14:105, 1989). Estas sequências dirigem a transcrição de um mRNA que pode ser traduzido para o polipéptido codificado pelo DNA. Como exemplos de terminadores da transcrição/sinais de poliadenilação encontram-se os derivados do SV40 (Sambrook et al., "Expression of cloned genes in cultured mammalian cells", em: Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 1989) .

Alguns genes poderão ser expressos de modo mais eficiente quando se encontram presentes introns (também designados por sequências intervenientes) . Diversos cDNAs, no entanto, têm sido expressos de modo eficiente a partir de vectores que não possuem sinais de splicing (também designados por locais dadores e aceitadores de splice) (ver, p.ex., Gothing e Sambrook, Nature 293:620, 1981). Os introns correspondem a sequências intervenientes não codificantes no interior de uma sequência codificante que contêm locais dadores e aceitadores de splice. Estas sequências são removidas através de um processo designado por "splicing", após a poliadenilação do produto de transcrição primário (Nevins, Annu. Rev. Biochem. 52:441, 1983; Green, Annu. Rev. Genet. 20:671, 1986; Padgett et al., Annu. Rev. Biochem. 55:1119, 1986; Krainer e Maniatis, "RNA splicing", em: Transcription and splicing (eds. B.D. Hames e D.M. Glover), 1988).

Habitualmente, os componentes acima descritos, compreendendo um promotor, um sinal de poliadenilação e uma sequência de terminação da transcrição, são reunidos em construções de expressão. Se desejado, podem igualmente incluir-se numa construção de expressão enhancers, introns com locais dadores e aceitadores de splice funcionais e sequências leader. As construções de expressão são frequentemente mantidas num replicon, tal como um elemento extracromossómico (p.ex., plasmideos) que tem a capacidade de se manter de forma 23 estável num hospedeiro, tal como células de mamíferos ou bactérias. Os sistemas de replicação em mamíferos incluem os derivados de vírus que infectam animais, os quais requerem factores trans-actuantes para a sua replicação. Por exemplo, os plasmídeos contendo os sistemas de replicação de papovavírus, tal como o SV40 (Gluzman, Cell 23:175, 1981) ou poliomavírus, replicam-se até um número muito elevado de cópias na presença do antigénio T virai apropriado. Como exemplos adicionais de replicons de mamífero encontram-se os derivados do papilomavírus bovino e do vírus de Epstein-Barr. Adicionalmente, o replicon poderá possuir dois sistemas de replicação, permitindo deste modo a sua manutenção, por exemplo, em células de mamíferos para a expressão e num hospedeiro procariótico para a clonagem e amplificação. Os exemplos de tais vectores de vai-vem de mamíferos-bactérias incluem o pMT2 (Kaufman et al., Mol. Cell Biol. 9:946, 1989) e pHEBO (Shimizu et al., Mol. Cell Biol. 6:1014, 1986). 0 procedimento de transformação usado depende do hospedeiro a ser transformado. Os métodos para introdução de polinucleótidos heterólogos em células de mamíferos são bem conhecidos da técnica e incluem os processos de transfecção mediada por dextrano, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção mediada por polibreno, fusão de protoplastos, electroporação, encapsulação do(s) polinucleótido(s) em lipossomas e microinjecção directa do DNA nos núcleos.

As linhas celulares de mamífero disponíveis para uso como hospedeiros para expressão são conhecidas neste campo técnico e incluem muitas linhas celulares imortalizadas disponíveis através da American Type Culture Collection (ATCC), incluindo, mas de modo não limitativo, células de ovário de hamster chinês (CHO), células HeLa, células de rim de hamster bebé (BHK), células de rim de macaco (COS), células de carcinoma 24 hepatocelular humano (p.ex., Hep G2), e diversas outras linhas celulares. ii. Sistemas de Baculovirus 0 polinucleótido que codifica para a proteína poderá igualmente ser inserido num vector adequado para expressão em células de insecto, estando ligado de modo operativo aos elementos de controlo que se encontram nesse vector. A construção de vectores utiliza técnicas conhecidas neste campo.

Geralmente, os componentes do sistema de expressão incluem um vector de transferência, geralmente um plasmídeo bacteriano, que contém um fragmento de genoma do baculovirus e um local de restrição conveniente para inserção no gene ou genes heterólogo (s) a ser expresso (s); um baculovirus de tipo selvagem com uma sequência homóloga ao fragmento específico de baculovirus no vector de transferência (tal permite a recombinação homóloga do gene heterólogo com o genoma do baculovirus); e as células hospedeiras de insecto e meio de cultura apropriados.

Após a inserção da sequência de DNA que codifica para a proteína no vector de transferência, o vector e o genoma virai de tipo selvagem são transfectados numa célula hospedeira de insecto, na qual se dá a recombinação do vector e do genoma virai. 0 vírus recombinante empacotado é expresso e as placas recombinantes são identificadas e purificadas. Os materiais e métodos usados para os sistemas de expressão de baculovírus/células de insecto encontram-se comercialmente disponíveis sob a forma de kit, que, entre outras possibilidades, é fornecido pela empresa Invitrogen, San Diego, CA (kit "MaxBac") . Estas técnicas são geralmente conhecidas dos peritos neste campo e encontram-se descritas em detalhe em Summers e Smith, Texas Agricultural Experiment 25

Station Bulletin No. 1555,_1987 (referência aqui designada por "Summers e Smith").

Anteriormente à inserção da sequência de DNA codificando para a proteína no genoma do baculovírus, os componentes acima descritos, compreendendo um promotor, um leader (se desejado), a sequência codificante de interesse e uma sequência de terminação da transcrição, são geralmente reunidas numa construção de transcolocação intermédia (vector de transferência) . Esta construção poderá conter um único gene e elementos reguladores ligados de modo operativo; múltiplos genes, cada um com o seu próprio conjunto de elementos reguladores ligados de modo operativo; ou múltiplos genes, regulados pelo mesmo conjunto de elementos reguladores. As construções de transcolocação intermédia são frequentemente mantidas num replicon, tal como um elemento extracromossómico (p.ex., plasmídeos) com a capacidade de se manter de modo estável num hospedeiro, tal como uma bactéria. 0 replicon possuirá um sistema de replicação, deste modo permitindo a sua manutenção num hospedeiro adequado para clonagem e amplificação.

Actualmente, o vector de transferência mais vulgarmente usado para a introdução de genes estranhos no AcNPV é o pAc373. Têm igualmente sido concebidos muitos outros vectores já conhecidos dos peritos da técnica. Estes incluem, por exemplo, o pVL985 (que altera o codão de iniciação da polihedrina de ATG para ATT, e que introduz um local de clonagem para BamHl 32 pares de bases a jusante do ATT; ver Luckow e Summers, Virology, 17:31, 1989). 0 plasmídeo geralmente contém também o sinal de poliadenilação da polihedrina (Miller et al., Ann. Rev. Microbiol. 42:111, 1988) e um gene procariótico de resistência à ampicilina (amp) e origem de replicação para selecção e propagação em Escherichia coli. 26

Os vectores de transferência de baculovírus contêm geralmente um promotor de baculovírus. Um promotor de baculovírus corresponde a qualquer sequência de DNA com a capacidade de se ligar a uma RNA polimerase de baculovírus e de iniciar a transcrição a jusante (5' para 3') de uma sequência codificante (p.ex., gene estrutural) para mRNA. Um promotor terá uma região de iniciação da transcrição que é geralmente colocada em posição proximal relativamente à extremidade 5' da sequência codificante. Esta região de iniciação da transcrição inclui geralmente um local de ligação à RNA polimerase e um local de iniciação da transcrição. Um vector de transferência de baculovírus poderá igualmente conter um segundo domínio designado por enhancer, o qual, se presente, se encontra geralmente em posição distai relativamente ao gene estrutural. A expressão poderá ser regulada ou constitutiva.

Os genes estruturais, abundantemente transcritos em períodos tardios num ciclo de infecção virai, proporcionam sequências promotoras particularmente úteis. Como exemplos encontram-se as sequências derivadas do gene que codifica para a proteína do poliedro virai (Friesen et al., "The Regulation of Baculovírus Gene Expression", em: The Molecular Biology of Baculoviruses (ed. Walter Doerfler), 1986; e Publs. EPO nos. 127 839 e 155 476) e o gene codificando para a proteína plO (Vlak et al., J. Gen. Virol. 69:165, 1988). 0 DNA codificando para sequências de sinal apropriadas poderá derivar de genes para proteínas secretadas por células de insecto ou por baculovírus, tal como o gene de polihedrina do baculovírus (Carbonell et al., Gene, 73:409, 1988).

Alternativamente, uma vez que os sinais para as modificações pós-tradução em células de mamífero (tais como o corte do péptido de sinal, o corte proteolítico e a fosforilação) parecem ser reconhecidos pelas células de insecto, e que os 27 sinais requeridos para a secreção e a acumulação no núcleo parecem igualmente ser conservados entre as células de invertebrados e as células de vertebrados, os leaders que não provêm de insectos, tais como os que derivam de genes codificando para o α-interferão humano (Maeda et al., Nature 315:592, 1985), o péptido humano de libertação da gastrina (Lebacq-Verheyden et al., Molec. Cell Biol. 8:3129, 1988), IL-2 humana (Smith et al., Proc. Nat'l Acad. Sei USA 82:8404, 1985), IL-3 de ratinho (Miyajima et al., Gene 58:273, 1987), e glucocerebrosidase humana (Martin et al., DNA 7:99, 1988), poderão igualmente ser usados para possibilitar a secreção em insectos.

Um polipéptido ou poliproteina recombinante poderá ser expresso intracelularmente ou, se expresso com as sequências reguladoras apropriadas, poderá ser secretado. Uma boa expressão intracelular de proteínas estranhas não fundidas requer geralmente genes heterólogos que idealmente possuam uma curta sequência leader contendo sinais de iniciação da tradução adequados precedendo um sinal de iniciação ATG. Se desejado, a metionina na extremidade N poderá ser cortada da proteína madura através da incubação in vitro com brometo de cianogénio.

Alternativamente, as poliproteínas ou proteínas recombinantes que não são naturalmente secretadas poderão ser secretadas pelas células de insecto por meio da criação de moléculas quiméricas de DNA codificando para uma proteína de fusão composta por um fragmento de sequência leader que proporciona a secreção da proteína estranha em insectos. O fragmento de sequência leader codifica geralmente para um péptido de sinal composto por aminoácidos hidrofóbicos que dirige a translocação da proteína para o retículo endoplasmático. 28

Após a inserção da sequência de DNA e/ou do gene codificando para o produto de expressão precursor da proteína, uma célula hospedeira de insecto é co-transformada com o DNA heterólogo do vector de transferência e com o DNA genómico do baculovírus de tipo selvagem - geralmente por co-transfecção. 0 promotor e a sequência de terminação da transcrição desta construção compreenderão geralmente uma secção de 2-5 kb do genoma do baculovírus. Os métodos para a introdução de DNA heterólogo no local desejado do baculovírus são bem conhecidos da técnica (ver Summers e Smith, supra; Smith et al., Mol. Cell Biol. r 3:2156, 1983; e Luckow e Summers, supra). Por exemplo, a inserção poderá efectuar-se num gene tal como o gene da polihedrina, por recombinação homóloga com crossover duplo; a inserção poderá igualmente dar-se num local de restrição de um enzima construído no gene de baculovírus desejado (Miller et al., Bioessays 4:91, 1989). A sequência de DNA, quando clonada em lugar do gene da polihedrina no vector de expressão, é flanqueada em 5' e em 3' por sequências específicas de polihedrina e está posicionada a jusante do promotor da polihedrina. 0 vector de expressão de baculovírus recém-formado é subsequentemente empacotado num baculovírus recombinante infeccioso. A recombinação homóloga ocorre a uma baixa frequência (entre cerca de 1% e cerca de 5%); assim, a maior parte do vírus produzido após a co-transfecção corresponde ainda ao vírus de tipo selvagem. Deste modo, será necessário recorrer a um método de identificação dos vírus recombinantes. Uma vantagem do sistema de expressão é a de que uma inspecção visual permite a distinção dos vírus recombinantes. A proteína de polihedrina, a qual é produzida pelo vírus nativo, é

produzida em níveis muito elevados no núcleo das células infectadas num período tardio após a infecção virai. A proteína de polihedrina acumulada forma corpos de oclusão que 29 contêm também partículas incorporadas. Estes corpos de oclusão, que possuem uma dimensão de até 15 ym, são muito refringentes, o que lhes dá uma aparência bastante brilhante que é facilmente visualizada ao microscópio. As células infectadas com vírus recombinantes não apresentam corpos de oclusão. Para distinguir os vírus recombinantes dos vírus de tipo selvagem, o sobrenadante da transfecção é plaqueado sobre uma monocamada de células de insecto recorrendo a técnicas conhecidas dos peritos neste campo. Nomeadamente, as placas são inspeccionadas ao microscópio para avaliar a presença (indicativa de vírus de tipo selvagem) ou ausência (indicativa de vírus recombinante) de corpos de oclusão (Ausubel et al., eds., "Current Protocols in Microbiology”, Vol.2 em 16.8 (supl. 10), 1990; Summers e Smith, supra; Miller et al., supra) . Têm sido desenvolvidos vectores de expressão recombinantes de baculovírus para a infecção de diversas células de insecto. Por exemplo, foram desenvolvidos baculovírus recombinantes para as células de, entre outros: Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda e Trichoplusia ni (Publ. PCT No. WO 89/046699; Carbonell et al., J. Virol. 56:153, 1985; Wright, Nature 321:718, 1986; Smith et al., Mol. Cell Biol. 3:2156, 1983; e ver, genericamente, Fraser et al., In Vitro Cell. Dev. Biol. 25:225, 1989).

Encontram-se disponíveis no mercado células e meios de cultura celular destinados a expressão directa, e a expressão em produtos de fusão, de polipéptidos heterólogos num sistema de expressão de baculovírus; a tecnologia aplicada à cultura celular encontra-se difundida entre os peritos na técnica (ver, p.ex., Summers e Smith, supra).

As células de insecto modificadas poderão então ser cultivadas num meio com nutrientes apropriados, o qual permite 30 a manutenção estável do(s) plasmídeo(s) que se encontra(m) presente(s) no hospedeiro de insecto modificado. Quando o gene do produto de expressão se encontra sob controlo indutivel, o hospedeiro poderá ser cultivado até uma elevada densidade e a expressão poderá ser induzida. Alternativamente, quando a expressão é constitutiva, o produto será expresso de modo continuo para o meio e o meio com nutrientes terá de ser continuamente renovado, removendo o produto de interesse e aumentando os nutrientes consumidos. 0 produto poderá ser purificado por técnicas como a cromatografia, p.ex., HPLC, cromatografia de afinidade, cromatografia de troca iónica, etc.; electroforese; centrifugação em gradiente de densidade; extracção por solvente, ou semelhantes. Quando apropriado, o produto poderá ser purificado de modo mais completo para remover substancialmente todas as proteínas de insecto que são também secretadas para o meio ou resultam da lise das células de insecto, desta forma se obtendo um produto que se encontra pelo menos substancialmente isento de resíduos do hospedeiro, p.ex., proteínas, lípidos e polisacáridos.

De modo a se obter a expressão das proteínas, as células recombinantes do hospedeiro que derivam dos transformantes são incubadas sob condições que possibilitam a expressão da sequência que codifica para a proteína recombinante. Estas condições variam, dependendo da célula de hospedeiro seleccionada. No entanto, as condições são facilmente discerníveis pelos técnicos de perícia média, tomando como base os conhecimentos difundidos neste campo técnico. iii. Sistemas Bacterianos

As técnicas de expressão bacteriana são já conhecidas da técnica. Um promotor bacteriano corresponde a qualquer sequência de DNA que tem a capacidade de se ligar a uma RNA 31 polimerase bacteriana e iniciar a transcrição a jusante (3') de uma sequência codificante (p.ex. um gene estrutural) para mRNA. Um promotor possuirá uma região de iniciação da transcrição que geralmente se encontra colocada em posição proximal relativamente à extremidade 5' da sequência codificante. Esta região de iniciação da transcrição inclui geralmente um local de ligação à RNA polimerase e um local de iniciação da transcrição. Um promotor bacteriano poderá igualmente conter um segundo domínio, designado por operador, que se poderá sobrepor a um local adjacente de ligação à RNA polimerase a nível do qual tem início a síntese de RNA. 0 operador permite uma transcrição negativamente regulada (indutível), já que uma proteína repressora de um gene se poderá ligar ao operador e deste modo inibir a transcrição deste gene específico. A expressão constitutiva poderá ocorrer na ausência de elementos de regulação negativa, tal como o operador. Adicionalmente, a regulação positiva poderá ser atingida por meio de uma sequência de ligação a uma proteína activadora do gene, a qual, quando presente, se encontra geralmente em posição proximal (5') relativamente à sequência de ligação à RNA polimerase. Como exemplo de uma proteína activadora de gene encontra-se a proteína activadora de catabolitos (CAP), a qual ajuda a iniciar a transcrição do operão lac em E. coli (Raibaud et al, Annu. Rev. Genet. 18:173, 1984). A expressão poderá deste modo sofrer uma regulação positiva ou negativa, deste modo se acentuando ou reduzindo a transcrição.

As sequências que codificam para enzimas de vias metabólicas fornecem sequências promotoras particularmente úteis. Os exemplos destas sequências incluem sequências promotoras derivadas de enzimas metabolizadoras de açúcares tais como a galactose, a lactose (lac) (Chang et al., Nature 198:1056, 1977) e a maltose. Outros exemplos incluem as 32

sequências promotoras derivadas de enzimas biossintéticas como o triptofano (trp) (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8:4057, 1980; Yelverton et al., Nucl. Acids Res. 9:731, 1981; Patente dos EUA N° 4.738.921; e Publ. EPO nos. 036776 e 121775). O sistema promotor da beta-lactamase (bla) (Weissman (1981) "The cloning of interferon and other mistakes", em: Interferon 3 (ed. I. Grosser), 1981) e os sistemas promotores do bacteriófago lambda PL (Shimatake et al., Nature 292:128, 1981) e do T5 (Patente dos EUA N° 4.689.406) proporcionam igualmente sequências promotoras úteis.

Adicionalmente, certos promotores sintéticos que não ocorrem na natureza funcionam também como promotores em bactérias. Por exemplo, as sequências de activação da transcrição de um promotor bacteriano ou de bacteriófago poderão ser reunidas com as sequências de operâo de outro promotor bacteriano ou de bacteriófago, criando um promotor sintético híbrido (Patente dos EUA N° 4.551.433). Por exemplo, o promotor tac corresponde a um promotor híbrido trp-lac, composto pelo promotor trp e pelas sequências de operão lac, que é regulado pelo repressor lac (Amann et al., Gene 25:167, 1983; de Boer et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 80:21, 1983).

Ainda, um promotor bacteriano poderá incluir promotores de ocorrência natural com origem não bacteriana que possuam a capacidade de se ligar a RNA polimerase bacteriana e iniciar a transcrição. Um promotor de ocorrência natural e de origem não bacteriana poderá igualmente ser acoplado a uma RNA polimerase compatível para produzir elevados níveis de expressão de alguns genes em procariotas. O sistema de RNA polimerase de bacteriófago T7/promotor constitui um exemplo de um sistema promotor acoplado (Studier et al., J. Mol. Biol. 189:113, 1986; Tabor et al., Proc. Natl. Acad. Sei 82:1074, 1985).

Adicionalmente, um promotor híbrido poderá igualmente ser 33 composto por um promotor de bacteriófago e por uma região operadora de E. coli (Publ. EPO N° 267851).

Para além de uma sequência promotora funcional, a presença de um local eficiente de ligação ao ribossoma é também útil para a expressão de genes estranhos em procariotas. Em E. coli, o local de ligação ao ribossoma é designado por sequência de Shine-Dalgarno (SD) e inclui um codâo de iniciação (ATG) e uma sequência com 3-9 nucleótidos de extensão localizada 3-11 nucleótidos a montante do codão de iniciação (Shine et al., Nature 254:34, 1975). Pensa-se que a sequência SD promova a ligação do mRNA ao ribossoma através do emparelhamento de bases entre a sequência SD e a extremidade 3' do rRNA 16S de E. coli (Steitz et al., "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA", em Biological Regulation and Development: Gene Expression (ed. R.F. Goldberger), 1979) . Acerca da expressão de genes eucarióticos e genes procarióticos com um fraco local de ligação ao ribossoma, ver Sambrook et al., "Expression of cloned genes in Escherichia coli", em "Molecular Cloning: a Laboratory Manual", 1989.

Uma molécula de DNA pode ser expressa intracelularmente. Poderá existir uma sequência promotora directamente ligada à molécula de DNA, caso em que o primeiro aminoácido na extremidade N será sempre uma metionina, a qual é codificada pelo codão de iniciação ATG. Se desejado, a metionina na extremidade N poderá ser cortada da proteína por incubação in vitro com brometo de cianogénio ou por incubação in vivo ou in vitro com uma metionina N-terminal peptidase bacteriana (Publ. EPO N° 219 237).

As proteínas de fusão proporcionam uma alternativa à expressão directa. Geralmente, uma sequência de DNA que codifica para a porção N-terminal de uma proteína bacteriana endógena, ou outra proteína estável, é fundida à extremidade 34 5' de sequências codificantes heterólogas. Após a expressão, a construção proporcionará uma fusão das duas sequências de aminoácidos. Por exemplo, o gene celular do bacteriófago lambda poderá ser ligado a extremidade 5' de um gene estranho e expresso em bactérias. A proteína de fusão resultante retém de preferência um local para uma enzima de processamento (factor Xa), para o corte da proteína de bacteriófago a partir da proteína estranha (Nagai et al., Nature 309:810, 1984). As proteínas de fusão poderão igualmente ser produzidas a partir de sequências dos genes lacZ (Jia et al., Gene 60:197, 1987), trpE (Allen et al., J. Biotechnol. 5:93, 1987; Makoff et al., J. Gen. Microbiol. 135:11, 1989), e Chey (Publ. EPO N° 324 647) . A sequência de DNA que se encontra na junção das duas sequências de aminoácidos poderá ou não codificar para um local susceptível de corte. Outro exemplo é o de uma proteína de fusão de ubiquitina. Uma tal proteína de fusão é produzida com a região da ubiquitina que retém de preferência um local para uma enzima de processamento (p.ex., protease de processamento ubiquitina-específica) para cortar a ubiquitina a partir da proteína estranha. Usando este método, é possível isolar a proteína estranha nativa (Miller et al., Bio/Technology 7:698, 1989).

Alternativamente, as proteínas estranhas poderão igualmente ser secretadas pela célula através da criação de moléculas quiméricas de DNA que codificam para uma proteína de fusão compreendendo um fragmento de uma sequência de péptido de sinal que proporciona a secreção da proteína estranha em bactérias (Patente dos EUA N° 4.336.336). O fragmento de sequência de sinal codifica geralmente para um péptido de sinal composto por aminoácidos hidrofóbicos que dirigem a secreção da proteína a partir da célula. A proteína poderá ser secretada para o meio de crescimento (bactérias gram-positivas) ou para o espaço periplásmico, localizado entre as 35 membranas celulares interna e externa (bactérias gram-negativas). Existirão de preferência locais de processamento, que poderão ser cortados in vivo ou in vitro, codificados entre o fragmento de péptido de sinal e o gene estranho. 0 DNA codificando para sequências de sinal adequadas poderá derivar de genes para proteínas bacterianas secretadas, tal como o gene da proteína da membrana externa de E. coli (ompA) (Masui et al., em: Experimental Manipulation of Gene Expression, 1983; Ghrayeb et al., EMBO J. 3:2437, 1984) e a sequência de sinal da fosfatase alcalina de E. coli (phoA) (Oka et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 82:1212, 1985). Como exemplo adicional, a sequência de sinal do gene da alfa-amilase proveniente de diversas estirpes de Bacillus poderá ser usada para secretar proteínas heterólogas de B. subtilis (Paiva et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79:5582, 1982; Publ. EPO N° 244 042) .

Geralmente, as sequências de terminação da transcrição que são reconhecidas por bactérias correspondem a regiões reguladoras localizadas em posição 3' relativamente ao codão de paragem da tradução, deste modo flanqueando, juntamente com o promotor, a sequência codificante. Estas sequências dirigem a transcrição de um mRNA que pode ser traduzido para o polipéptido codificado pelo DNA. As sequências de terminação da transcrição incluem frequentemente sequências de DNA com cerca de 50 nucleótidos que têm a capacidade de formar estruturas em gancho que auxiliam na terminação da transcrição. Os exemplos destas sequências incluem sequências de terminação de transcrição derivadas de genes com promotores fortes, tal como o gene trp de E. coli, assim como outros genes biossintéticos.

Geralmente, os componentes acima descritos, compreendendo um promotor, uma sequência de sinal (se desejado), a sequência codificante de interesse e uma sequência de terminação da 36 transcrição, são reunidos em construções de expressão. As construções de expressão são frequentemente mantidas num replicon, tal como um elemento extracromossómico (p.ex. plasmideos), que tem a capacidade de se manter de forma estável num hospedeiro, tal como uma bactéria. 0 replicon possui um sistema de replicação, o que possibilita a sua manutenção num hospedeiro procariótico para expressão ou para clonagem e amplificação. Adicionalmente, um replicon poderá corresponder a um plasmideo de baixo número de cópias ou de elevado número de cópias. Um plasmideo de elevado número de cópias possuirá geralmente um número de cópias que varia entre cerca de 5 e cerca de 200, e geralmente entre cerca de 10 e cerca de 150. Um hospedeiro contendo um plasmideo de elevado número de cópias conterá preferencialmente pelo menos cerca de 10, e mais preferencialmente pelo menos cerca de 20 plasmideos. Poderá seleccionar-se um vector com um elevado ou com um baixo número de cópias, dependendo do efeito que o vector e a proteína estranha exercem sobre o hospedeiro.

Alternativamente, as construções de expressão poderão ser integradas no genoma bacteriano por meio de um vector integrativo. Os vectores integrativos contêm geralmente pelo menos uma sequência homóloga ao cromossoma bacteriano que permite a integração do vector. As integrações parecem resultar de recombinações entre o DNA homólogo do vector e o cromossoma bacteriano. Por exemplo, os vectores integrativos construídos a partir de DNA proveniente de diversas estirpes de Bacillus integram-se no cromossoma de Bacillus (Publ. EPO N° 127 328) . Os vectores integrativos poderão igualmente ser compostos por sequências de bacteriófago ou de transposão.

Geralmente, as construções de expressão extracromossómicas e integrativas conterão marcadores de selecção que permitam a selecção das estirpes bacterianas que foram transformadas. 37

Os marcadores de selecção poderão ser expressos pelo hospedeiro bacteriano e poderão incluir genes que tornem a bactéria resistente a antibióticos como a ampicilina, o cloranfenicol, a eritromicina, a kanamicina (neomicina) e a tetraciclina (Davies et al., Annu. Rev. Microbiol. 32:469, 1978) . Os marcadores de selecção poderão igualmente incluir genes biossintéticos, tal como os genes das vias metabólicas da histidina, triptofano e leucina.

Alternativamente, alguns dos componentes acima descritos poderão ser reunidos em vectores de transformação. Os vectores de transformação incluem geralmente um marcador de selecção que poderá ser mantido num replicon ou desenvolvido para um vector integrativo, tal como acima descrito. Têm sido desenvolvidos diversos vectores de expressão e de transformação, tanto sob a forma de replicons extracromossómicos como de vectores integrativos, para a transformação de um grande número de bactérias. Por exemplo, foram desenvolvidos vectores de expressão para as seguintes bactérias, entre outras: B. subtilis (Paiva et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79:5582, 1982; Publs. EPO Nos. 036 259 e 063 953; Publ. PCT N° WO 84/04541), E. coli (Shimatake et al., Nature 292:128, 1981; Amann et al., Gene 40:183, 1985; Studier et al., J. Mol. Biol. 189:113, 1986; Publs. EPO Nos. 036 776, 136 829 e 136 907), Streptococcus cremoris (Powell et al., Appl. Environ. Microbiol. 54:655, 1988); Streptococcus lividans (Powell et al., Appl. Environ. Microbiol. 54:655, 1988) e Streptomyces lividans (Patente dos EUA N° 4.745.056).

Os métodos para a introdução de DNA exógeno em hospedeiros bacterianos são bem conhecidos neste campo técnico e incluem geralmente a transformação de bactérias tratadas com CaCl2 ou com outros agentes, tal como catiões divalentes e DMSO. O DNA poderá também ser introduzido nas células bacterianas por electroporação. Os procedimentos de transformação variam 38 geralmente com a espécie bacteriana a transformar (ver, p.ex., Masson et al., FEMS Microbiol. Lett. 60:213, 1989; Paiva et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79:5582, 1982; Publs. EPO Nos. 036 259 e 063 953; Publ. PCT N° WO 84/04541 [Bacillus] , Miller et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 85:856, 1988; Wang et al., J. Bacteriol. 172:949, 1990 [Campylobacter] , Cohen et al., Proc.

Natl. Acad. Sei. 69:2110, 1973; Dower et al., Nucleic Acids

Res. 16:6127, 1988; Kushner, "An improved method for transformation of Escherichia coli with ColEl-derived plasmids", em: Genetic Engineering: Proceedings of the International Symposium on Genetic Engineering (eds. H.W. Boyer e S. Nicosia), 1978; Mandei et al., J. Mol. Biol. 53:159, 1970; Taketo, Biochim. Biophys. Acta 949:318, 1988 [Escherichia], Chassy et al., FEMS Microbiol. Lett. 44:173, 1987 [Lactobacillus], Fiedler et al.,Anal. Biochem. 170:38, 1988 [Pseudomonas] , Augustin et al., FEMS Microbiol. Lett. 66:203, 1990 [Staphylococcus] , Barany et al., J. Bacteriol. 144:698, 1980; Harlander, "Transformation of Streptococcus lactis by electroporation", em: Streptococcal Genetics (eds. J. Ferretti e R. Curtiss III), 1987; Perry et al., Infec. Immun. 32:1295, 1981; Powell et al., Appl. Environ. Microbiol. 54:655, 1988; Somkuti et al., Proc. 4th Evr. Congo

Biotechnology 1:412, 1987 [Streptococcus]. iv. Expressão em Leveduras

Os sistemas de expressão em leveduras são igualmente familiares aos técnicos de perícia média neste campo. Um promotor de levedura corresponde a qualquer sequência de DNA que possua a capacidade de se ligar à RNA polimerase de levedura e de iniciar a transcrição a jusante (3') de uma sequência codificante (p.ex. um gene estrutural) para mRNA. Um promotor conterá uma região de iniciação da transcrição que é geralmente colocada em posição proximal relativamente à 39 extremidade 5' da sequência codificante. Esta região de iniciação da transcrição inclui geralmente um local de ligação à RNA polimerase (a "TATA box") e um local de iniciação da transcrição. 0 promotor de levedura poderá igualmente conter um segundo domínio, designado por sequência activadora a montante (UAS), que, se presente, se encontra geralmente em posição distai relativamente ao gene estrutural. A UAS permite uma expressão regulada (indutível). A expressão constitutiva ocorre na ausência de uma UAS. A expressão regulada poderá ser positiva ou negativa, ou seja, a transcrição poderá ser aumentada ou reduzida.

Uma levedura é um organismo fermentativo com uma via metabólica activa, pelo que as sequências que codifiquem para enzimas da via metabólica constituirão sequências promotoras particularmente úteis. Como exemplos destas enzimas encontram-se a álcool desidrogenase (ADH) (Publ. EPO N° 284 044), enolase, glucoquinase, glucose-6-fosfato isomerase, gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase (GAP ou GAPDH), hexoquinase, fosfofrutoquinase, 3-fosfoglicerato mutase e piruvatoquinase (PyK) (Publ. EPO N° 329 203). O gene PHQ5 de levedura, codificando para a fosfatase ácida, proporciona igualmente sequências promotoras úteis (Myanohara et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:1, 1983).

Adicionalmente, certos promotores sintéticos que não ocorrem na natureza poderão também funcionar como promotores de levedura. Por exemplo, as sequências UAS de um promotor de levedura poderão ser reunidas com a região de activação da transcrição de outro promotor de levedura, criando-se um promotor híbrido sintético. Os exemplos de tais promotores híbridos incluem a sequência reguladora da ADH ligada à região de activação da transcrição da GAP (Patentes dos EUA Nos. 4.876.197 e 4.880.734). Outros exemplos de promotores híbridos incluem promotores que correspondem às sequências reguladoras 40 dos genes ADH2, GAL4, GAL1Q ou PH05, combinadas com a região de activação da transcrição de um gene de uma enzima glicolitica como a GAP ou a PyK (Publ. EPO N° 164 556). Adicionalmente, um promotor de levedura poderá incluir promotores de ocorrência natural não derivados de leveduras que possuam a capacidade de se ligar à RNA polimerase de levedura e iniciar a transcrição. Os exemplos de tais promotores incluem, entre outros, Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:1078, 1980; Henikoff et al., Nature 283:835, 1981; Hollenberg et al., Current Topics Microbiol. Immunol. 96:119, 1981; Hollenberg et al., "The Expression of Bacterial Antibiotic Resistance Genes in the Yeast Saccharomyces cerevisae", em: Plasmids of Medicai, Environmental and Commercial Importance (eds. K.N. Timmis e A. Puhler), 1979; Mercerau-Puigalon et al., Gene 11:163, 1980; Panthier et al., Curr. Genet. 2:109, 1980.

Uma molécula de DNA poderá ser expressa intracelularmente em leveduras. Poderá existir uma sequência promotora directamente ligada à molécula de DNA, caso em que o primeiro aminoácido localizado na extremidade N-terminal da proteína recombinante será sempre uma metionina, a qual é codificada pelo codão de iniciação ATG. Se desejado, a metionina na extremidade N poderá ser cortada da proteína por incubação in vitro com brometo de cianogénio.

As proteínas de fusão proporcionam uma alternativa aos sistemas de expressão em leveduras, assim como aos sistemas de expressão em mamíferos, baculovírus e bactérias. Geralmente, uma sequência de DNA que codifica para a porção N-terminal de uma proteína endógena de levedura, ou outra proteína estável, é fundida à extremidade 5' de sequências codificantes heterólogas. Após a expressão, esta construção proporcionará uma fusão das duas sequências de aminoácidos. Por exemplo, o gene da superóxido dismutase (SOD) humana ou de levedura 41 poderá ser ligado à extremidade 5' de um gene estranho e expresso em leveduras. A sequência de DNA que se encontra na junção das duas sequências de aminoácidos poderá ou não conter um local susceptivel de corte. Ver, p.ex., a Publ. EPO N° 196 056. Um exemplo é o de uma proteína de fusão de ubiquitina. Uma tal proteína de fusão é produzida com a região da ubiquitina que retém de preferência um local para uma enzima de processamento (p.ex., protease de processamento ubiquitina-específica) para cortar a ubiquitina a partir da proteína estranha. Usando este método, é possível isolar a proteína estranha nativa (ver, p.ex., a Publ. PCT N° WO 88/024066).

Alternativamente, as proteínas estranhas poderão igualmente ser secretadas pela célula para o meio de cultura, recorrendo à criação de moléculas quiméricas de DNA que codifiquem para uma proteína de fusão composta por um fragmento de sequência leader que proporcione a secreção da proteína estranha pela levedura. De preferência, existirão locais de processamento codificados entre o fragmento leader e o gene estranho que poderão ser submetidos a corte in vivo ou in vitro. O fragmento de sequência leader codifica geralmente para um péptido de sinal composto por aminoácidos hidrofóbicos que dirigem a secreção da proteína pela célula. O DNA codificando para sequências de sinal adequadas poderá derivar de genes de proteínas secretadas por leveduras, tal como o gene da invertase de levedura (Publ. EPO N° 012 873; Publ. JPO N° 62.096.086) e o gene do factor A de levedura (Patente dos EUA N° 4.588.684). Alternativamente, existem leaders não derivados de leveduras, tal como um leader de interferão, que proporcionam igualmente a secreção por leveduras (Publ. EPO N° 060 057). É particularmente preferida uma classe de leaders de secreção que utilizam um fragmento do gene do factor alfa de levedura, o qual contém tanto uma sequência de sinal "pré" 42 como uma região "pró". Os tipos de fragmentos de factor alfa que podem ser utilizados incluem o leader de factor alfa pré-pró de extensão completa (com cerca de 83 resíduos de aminoácidos) assim como leaders de factor alfa truncados (geralmente com cerca de 25 a cerca de 50 resíduos de aminoácidos) (Patentes dos EUA Nos. 4.546.083 e 4.870.008; publ. EPO N° 324 274). Outros leaders que utilizam um fragmento do leader de factor alfa para proporcionar a secreção incluem leaders híbridos de factor alfa construídos com uma pré-sequência de uma primeira levedura, mas uma pró-região proveniente de um segundo factor alfa de levedura (ver, p.ex., a Publ. PCT N° WO 89/02463).

Geralmente, as sequências de terminação da transcrição que são reconhecidas por leveduras correspondem a regiões reguladoras localizadas em posição 3' relativamente ao codâo de paragem da tradução, deste modo flanqueando, juntamente com o promotor, a sequência codificante. Estas sequências dirigem a transcrição de um mRNA que poderá ser traduzido para o polipéptido que é codificado pelo DNA. Existem diversos exemplos de sequências terminadoras da transcrição e de outras sequências de terminação reconhecidas por leveduras, tais como as que codificam para enzimas glicolíticas.

Geralmente, os componentes acima descritos, compreendendo um promotor, um leader (se desejado), a sequência codificante de interesse e uma sequência de terminação da transcrição, são geralmente reunidas em construções de expressão. As construções de expressão são frequentemente mantidas num replicon, tal como um elemento extracromossómico (p.ex., plasmídeos) com a capacidade de se manter de modo estável num hospedeiro, tal como uma levedura ou bactéria. O replicon poderá possuir dois sistemas de replicação, deste modo permitindo a sua manutenção, por exemplo, numa levedura para a expressão e num hospedeiro procariótico para clonagem e 43 amplificação. Os exemplos de tais vectores de vai-vem de levedura-bactéria incluem o YEp24 (Botstein et ai., Gene 8:17-24, 1979), pCl/1 (Brake et al., Proc. Natl. Acad. Sei USA 81:4642-4646, 1984) e YRpl7 (Stinchcomb et al., J. Mol. Biol. 158:157, 1982). Adicionalmente, um replicon poderá corresponder a um plasmídeo de elevado número de cópias ou de baixo número de cópias. Um plasmídeo de elevado número de cópias possuirá geralmente um número de cópias que varia entre cerca de 5 e cerca de 200, e geralmente entre cerca de 10 e cerca de 150. Um hospedeiro contendo um plasmídeo de elevado número de cópias conterá preferencialmente pelo menos cerca de 10, e mais preferencialmente pelo menos cerca de 20 plasmídeos. Poderá seleccionar-se um vector com um elevado ou com um baixo número de cópias, dependendo do efeito que o vector e a proteína estranha exercem sobre o hospedeiro. Ver, p.ex., Brake et al., supra.

Alternativamente, as construções de expressão poderão ser integradas no genoma de levedura através de um vector integrativo. Os vectores integrativos contêm geralmente pelo menos uma sequência homóloga a um cromossoma de levedura que permite a integração do vector, e de preferência contêm duas sequências homólogas flanqueando a construção de expressão. As integrações parecem resultar de recombinações entre o DNA homólogo no vector e o cromossoma da levedura (Orr-Weaver et al., Methods in Enzymol. 101:228-245, 1983). Um vector integrativo poderá ser dirigido para um locus específico na levedura através da selecção da sequência homóloga apropriada para inclusão no vector. Ver Orr-Weaver et al., supra. Um ou mais construções de expressão poderão sofrer integração, possivelmente afectando os níveis de proteína recombinante produzidos (Rine et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:6750, 1983). As sequências cromossómicas incluídas no vector poderão ocorrer sob a forma de um único segmento no vector, o que 44 resulta na integração do vector completo, ou de dois segmentos homólogos a segmentos adjacentes no cromossoma e flanqueando a construção de expressão no vector, o que poderá resultar na integração estável de apenas a construção de expressão.

Usualmente, as construções de expressão extracromossómicas e integrativas poderão conter marcadores de selecção que permitam a selecção das estirpes de leveduras que foram transformadas. Os marcadores de selecção poderão incluir genes biossintéticos que podem ser expressos no hospedeiro de levedura, tal como os genes ADE2, HIS4, LEU2, TRP1 e ALG7, e o gene de resistência a G418, que conferem resistência em células de leveduras à tunicamicina e a G418, respectivamente. Adicionalmente, um marcador de selecção apropriado poderá igualmente conferir à levedura a capacidade de se desenvolver na presença de compostos tóxicos, como metais. Por exemplo, a presença de CUP1 permite à levedura crescer na presença de iões de cobre (Butt et al., Microbiol. Rev. 51:351, 1987).

Alternativamente, alguns dos componentes acima descritos poderão ser reunidos em vectores de transformação. Os vectores de transformação incluem geralmente um marcador de selecção que poderá ser mantido num replicon ou desenvolvido para um vector integrativo, tal como acima descrito. Têm sido desenvolvidos diversos vectores de expressão e de transformação, tanto sob a forma de replicons extracromossómicos como de vectores integrativos, para a transformação de um grande número de leveduras. Por exemplo, foram desenvolvidos vectores de expressão para as seguintes leveduras, entre outras: Candida albicans (Kurtz et al., Mol. Cell. Biol. 6:142, 1986), Candida maltose (Kunze et al., J. Basic Microbiol. 25:141, 1985), Hansenula polymorpha (Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132:3459, 1986; Roggenkamp et al., Mol. Gen. Genet. 202:302, 1986), Kluyveromyces fragilis (Das et al., J. Bacteriol. 158:1165, 1984), Kluyveromyces lactis 45 (De Louvencourt et al., J. Bacteriol. 154:737, 1983; Van den Berg et al., Bio/Technology 8:135, 1990), Pichia guillerimondii (Kunze et al., J. Basic Microbiol. 25:141, 1985), Pichia pastoris (Cregg et al., Mol. Cell. Biol. 5:3376, 1985; Patentes dos EUA Nos. 4.837.148 e 4.929.555), Saccharomyces cerevisiae (Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75:1929, 1978; Ito et al., J. Bacteriol. 153:163, 1983), Schizosaccharomyces pombe (Beach e Nurse, Nature 300:106, 1981) e Yarrowia lipolytica (Davidow et al., Curr. Genet. 10:380471, 1985; Gaillardin et al., Curr. Genet. 10:49, 1985).

Os métodos para introdução de DNA exógeno em hospedeiros de levedura são bem conhecidos neste campo técnico, e incluem geralmente a transformação de esferoplastos, ou de células de levedura intactas, com tratamento por catiões alcalinos. Os procedimentos de transformação variam geralmente segundo a espécie de levedura a ser transformada (ver, p.ex., (Kurtz et al., Mol. Cell. Biol. 6:142, 1986; Kunze et al., J. Basic Microbiol. 25:141, 1985 [Candida]; (Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132:3459, 1986; Roggenkamp et al., Mol. Gen. Genet. 202:302, 1986 [Hansenula]; (Das et al., J. Bacteriol. 158:1165, 1984; De Louvencourt et al., J. Bacteriol. 154:1165, 1983; Van den Berg et al., Bio/Technology 8:135, 1990 [Kluyveromyces]; (Cregg et al., Mol. Cell Biol. 5:3376, 1985; Kunze et al., J. Basic Microbiol. 25:141, 1985; Patentes dos EUA Nos. 4.837.148 e 4.929.555 [Pichia] ; (Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75:1929, 1978; Ito et al., J. Bacteriol. 153:163, 1983 [Saccharomyces] ; (Beach e Nurse, Nature 300:106, 1981 [Schizosaccharomyces]; (Davidow et al., Curr. Genet. 10:39, 1985; Gaillardin et al., Curr. Genet. 10:49, 1985 [Yarrowia] . O presente invento é ilustrado, com fins exemplificativos, por referência às seguintes figuras: 46 A Fig. IA corresponde a um mapa linear de restrição da cassette integrativa relativo à inserção da cassette de expressão Yipex-PDI no locus cromossómico ADE2 de S. cerevisiae, mostrando a direcção de transcrição da PDI a partir do promotor indutivel GAL/CYC (seta a branco). São apresentados alguns locais de restrição seleccionados. A Fig. 1B corresponde a um mapa de restrição da cassette integrativa para a inserção da mesma cassette de expressão da Fig. IA no locus cromossómico LYS2 de S. cerevisiae. A Fig. 1C corresponde a um mapa de restrição da cassette integrativa em LYS2 contendo a sequência codificante TRX2 de S. cerevisiae inserida na cassette de expressão. A Fig. 1D corresponde a um mapa de restrição da cassette integrativa em LYS2 contendo a sequência codificante TRX2 de S. cerevisiae inserida na cassette de expressão em fusão com a sequência do péptido de sinal de Yepsecl. A Fig. 2A apresenta uma análise por Northern blot do RNA extraído de estirpes de S. cerevisiae portadoras de inserções cromossómicas do gene de PDI usando uma sonda específica para PDI. As pontas de seta indicam o produto de transcrição do gene endógeno (PDI) e das construções integradas de PDI (::PDI) . A Figura 2B apresenta o RNA extraído de estirpes de S. cerevisiae incluindo inserções cromossómicas do gene de TRX2 e o plasmídeo Y-E2715 hibridizado com uma sonda específica para TRX2 (painel superior) e com uma sonda específica para HCV-E27i5 (painel inferior). As pontas de seta indicam o produto de transcrição do gene endógeno (TRX2), das construções integradas de TRX2 (::TRX2) e do cDNA de HCV-E27i5 clonado em Yepsecl (Y-E27i5) . A Fig. 3 apresenta uma análise por Western blot das proteínas solúveis provenientes de extractos celulares de 47 estirpes de levedura modificadas que expressam HCV-E27i5 , usando um anticorpo monoclonal (mAc) anti-E2. As proteínas foram separadas por SDS-PAGE na presença (+ DTT) ou na ausência (- DTT) de um agente redutor. A Fig. 4 apresenta uma análise por dot-blot de Ε27χ5 purificada por cromatografia de afinidade (10 yg/dot) a partir das estirpes de levedura modificadas. São usados um mAc contra a proteína E27is do HCV expressa em células de insecto (3E5-1), um antisoro de chimpanzé contra HCV-E1E2 co-purificada a partir de células HeLa (L559) (Choo et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 91:1294-1298, 1994) e três mAcs conformacionais específicos anti-E27i5 (291A2, 5E5-A7, 6A1) (Rosa et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 93:1759-1763, 1996) para o imunoblot. A Fig. 5 apresenta uma análise da fluorescência ligada a células usando células MOLT-4 pré-incubadas com diferentes formas da proteína E2 do HCV expressa por estirpes de levedura modificadas e por células CHO. As células MOLT-4 pré-incubadas são incubadas com um mAc anti-E2 e, após incubação com um fragmento F(ab')2 de igG marcado por fluorescência, a ligação às células-alvo é indirectamente detectada por citometria de fluxo sob a forma de fluorescência ligada às células (número relativo de células (eixo dos y) versus intensidade média da fluorescência (eixo dos x) . As células MOLT-4 pré-incubadas (sem proteínas E2 do HCV) constituem o controlo negativo.

EXEMPLOS

Estirpes, Plasmídeos e Meios É apresentada uma descrição das estirpes e dos plasmídeos usados na Tabela 1 e nas Figuras 1A-D. As Figuras IA a 1D apresentam esquematicamente as cassetes integrativas utilizadas para modificar as estirpes de S. cerevisiae. As 48 caixas a branco representam as sequências cromossómicas de S. cerevisiae ade2 (Fig. IA) e lys2 (Fig. 1B-D) usadas para integração nos loci cromossómicos homólogos. Os marcadores genéticos usados para selecção das estirpes integrantes (HIS3 e TRP1) são apresentados como setas a ponteado, enquanto que a seta a branco (GAL/CYC) indica a sequência promotora. A caixa a negro (termo) representa as sequências de terminação da transcrição. As sequências do vector plasmidico não são apresentadas. TABELA 1

Descrição das estirpes de leveduras Estirpes de S. cerevisiae Genotipo Cassette integrativa W303-1B MATa leul.3-112 ura3-l trpl-1 his3.11-15 ade2-l canl-100 nenhuma W303-PB1 MATa leu2.3-112ura3~52 trpl-289 his 3-Δ1 ade2-l canl-100 lys2:;TRPl::PDI Ylpexl-PDIB (lys2:;TRP1) S150-2B MATa leu2.3~112ura3~52 trpl-289 his 3-Δ1 nenhuma S150-LyT MATa leu2.3-112 ura3~52 trpl-289 his3-Al lys2::TRP1::yex" " Ylpexl (lys2::TRP1) SI 50-PAI MATa leu2.3-112 ura3-52 trpl-289 his3-Al Lys2::TRP1::PDI Ylpexl-PDIA (lys2::TRP1) S150-BP1 MATa leu2.3-112 ura3~52 trpl-289 his3-Al lys2::TRP1::PDI Ylpexl-PDIB (lys2::TRP1) S150-PA2 MATa leu2.3-112 ura3~52 trpl-289 his3-Al Ade 2::HIS3::PDI Ylpex2-PDIA (ade2:;HIS3J S150-X21 MATa leu2.3-112 ura3~52 trpl-289 his3-Al lys2::TRP1::TRX2 Ylpexl-TRX2 (lys2;;TRP1) S150-SX21 MATaleu 2.3-112 ura3-52 trpl-289 his3-Al lys2::TRP1::sTRX2 Ylpexl-sTRX2 (lys2::TRP1) SX21-PA2 MATaleu 2.3-112 ura3-52 trpl-289 his3~Al lys2:;TRP1::sTRX2 ade2::HIS3::PDI Ylpexl-TRX2 (lys2::TRP1) Ylpex2-PDIA (ade2::HIS3) Descrição dos plasmideos 49 (continuação)

Descrição das estirpes de leveduras Estirpes de S. cerevisiae Genotipo Cassette integrativa pUC18yex 1.238 pb de Yepsec 1, clonado no local Notl no pUC 18Not de restrição de pUC8-Lys fragmento de PCR com 1.318 pb de LYS2 clonado nos locais de restrição de EcoRI-HindIII no pUC8 pUC8-Adc fragmento de PCR com 1.059 pb de ADE2 clonado nos locais de restrição de EcoRI-PstI no pUC8 YlpLyT Clone de PCR com 854 pb de TRP1 digerido com BglII, clonado no local de restrição de BglII no pUC8-Lys YlpAH Clone de PCR com 931 pb de HIS3 digerido por BamHI, clonado no local de restrição de BglII no pUC8-Adc

Foi usada a estirpe de E. coli HB101 (F~ hsdS20 recA13 ara-14 proA2 lacYl galK2 rpsL20 xyl-5 metl-1 supE44) para as construções de plasmideos. A transformação das células de E. coli e a análise dos plasmideos recombinantes foram efectuadas tal como descrito em Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, EUA, 1989.

As estirpes de S. cerevisiae são cultivadas a 30°C em meio sintético contendo 2% de fonte de carbono e 0,67% de base nitrogenada de levedura (Difco Laboratories, Detroit, MI, EUA) e suplementado com os aminoácidos requeridos (50 yg/ml) ou em meio completo contendo 2% de glucose (YPD) ou galactose (GalYP), 1% de extracto de levedura, 2% de peptona e 0,3% de K2HP04.

Construções de Plasmideos e Manipulações Genéticas

As enzimas de restrição, a DNA ligase de T4 e os outros enzimas usados para as manipulações de DNA e de RNA são obtidos a partir das empresas New England Biolabs (Hitchin, 50 RU) ou Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Alemanha) . A amplificação por PCR de fragmentos específicos de DNA é efectuada com um termociclador da Perkin Elmer (Norwalk, CT, EUA) usando oligonucleótidos sintéticos. A sequenciação de DNA é realizada utilizando um Sequenciador de DNA Modelo 373 da Applied Biosystems (Norwalk, CT, EUA) . 0 DNA ou RNA total da levedura é extraído de acordo com procedimentos padronizados (Sherman et al., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, EUA, 1983) . Todas as outras manipulações de DNA são efectuadas tal como descrito por Sambrook et al., supra. As estirpes de S. cerevisiae são transformadas através do método de LiCl (Rothstein, em: DNA Cloning (Glover, D.M., ed.), Vol. 11, págs. 45-66, IRL Press, 1985). São construídas duas cassettes integrativas para a inserção da cassette de expressão em dois loci cromossómicos diferentes de S. cerevisiae, LYS2 e ADE2. 0 plasmídeo integrativo YipLyT (Tabela 1) é obtido por clonagem de um fragmento de PCR resultante da digestão por EcoRI-HindIII, compreendendo 1.318 pb do gene LYS2 de S. cerevisiae entre os locais de restrição de EcoRI e de HindIII no plasmídeo pUC8. 0 plasmídeo pUC8-Lys resultante (Tabela 1) contém um local único de restrição para BglII localizado no interior da sequência de LYS2, o qual é usado para a clonagem do marcador seleccionável TRP1 de S. cerevisiae, obtido por amplificação por PCR do gene TRP1 do plasmídeo YRpl7. 0 plasmídeo integrativo YIpAH (Tabela 1) é construído inserindo a nível dos locais de restrição de EcoRI-PstI no pUC8 o fragmento com 1.059 pb, gerado por xbal, do gene ADE2 de S. cerevisiae amplificado por PCR adicionando um local de restrição para EcoRI na extremidade 5' e um local de restrição para PstI na extremidade 3' . O marcador seleccionável HIS3 de S. cerevisiae é amplificado por PCR adicionando locais de restrição para BamHI-Spel-Notl na extremidade 5' e um local de restrição para BamHI na 51 extremidade 3' . 0 produto de PCR resultante da digestão do gene HIS3 por BamHI é clonado a nivel do local único de restrição de BglII em pUC8-Ade para fornecer o plasmideo YipAH. 0 plasmideo pUC18yex portador da cassette de expressão é construído através da clonagem de um fragmento com 1.238 pb gerado por Notl, e amplificado por PCR, do plasmideo Yepsecl (Baldari et al., EMBO J., 6:229-234, 1987; Galeotti et al., Patente dos EUA 5.432.082, 11 de Julho de 1995), abrangendo desde o promotor até às sequências de terminação, sobre o vector pUC18Not (Herrero et al., J. Bacteriol., 172:6557-6567, 1990) . A inserção da sequência codificando para a PDI de S. cerevisiae (LaMantia et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88, 4453-4457, 1991) na cassette de expressão de pUCyex é obtida clonando um fragmento de digestão por SacI-PstI amplificado por PCR nos locais de restrição para SacI-PstI de pUC18yex. Similarmente, a sequência que codifica para TRX2 em S. cerevisiae (Muller, J. Biol. Chem., 266:9194-9202, 1991) é amplificada por PCR adicionando um local de restrição para Saci em posição proximal relativamente ao codão ATG e um local de restrição para Saill em posição distai relativamente ao codão de terminação TGA, e é clonada a nível dos locais de restrição para Sacl-Sall no pUCl8yex. A versão sTRX do clone é obtida substituindo o primer de PCR de SacI-ATG com um primer de PCR de Smal, procedimento que amplifica a sequência codificante de TRX2 a partir do segundo codão (TAG) em molde com a sequência do péptido de sinal de pUCl8yex, e clonando o fragmento de PCR sobre os locais de restrição de Smal-Sall do pUC18yex. Todos os clones de PCR são sequenciados após clonagem sobre o plasmideo pUC18yex. O vector Yipex2-PDI (Fig. IA) é obtido inserindo o fragmento de restrição por Notl-Xbal do pUC18yex contendo a cassette de expressão de PDI a nível dos locais de restrição 52 de Notl-Spel no plasmídeo YIpAH (Tabela 1) de modo a remover o local de restrição de Xbal localizado na extremidade 3' da cassette de expressão e a deixar apenas os locais de restrição de Xbal nas duas extremidades da cassette integrativa de ADE2. A transformação da estirpe S150-2B com YIpex2-PDI digerido por Xbal resulta na integração da cassette de expressão de PDI a nível do locus cromossómico ADE2 da estirpe S150-PA2 (Tabela D . A clonagem do fragmento de restrição por Notl do yex-PDI sobre o local de restrição de Notl no YIpLyT (Tabela 1) dá origem a dois plasmídeos gue contêm a cassette de expressão de PDI em orientação oposta relativamente ao locus de integração LYS2. 0 plasmídeo YIpexl-PDIA (Fig. 1B) possui a mesma orientação que YIpex2-PDI, enquanto que no plasmídeo Ylpexl-PDIB o fragmento inserido yex-PDI se encontra na orientação oposta. A transformação de S. cerevisiae com YIpexl-PDIA/B é realizada usando uma cassette integrativa resultante de restrição por Spel. A estirpe S150-PA1 (Tabela 1) é uma estirpe integrativa portadora da versão yex-PDIA, enquanto que as estirpes W303-PB1 e S150-PB1 (Tabela 1) resultam da integração de yex-PDIB.

Os plasmídeos YIpexl-TRX2 e YIpexl-sTRX2 (Figs. 1C e 1D) são gerados por subclonagem do fragmento de restrição por Notl de pUC18yex-TRX e de pUC18yex-sTRX, respectivamente, a nível do local de restrição de Notl no pUC18yex. A orientação dos fragmentos clonados escolhidos para produzir integrantes de S. cerevisiae é a mesma de Ylpex-PDIA. As estirpes integrantes S150-X21 e SX21-PA2 são obtidas por transformação das estirpes S150-2B e S150-PA2 (Tabela 1) com YIpexl-TRX2 digerido por Spel, enquanto que a transformação de S150-2B com YIpexl-sTRX2 gera a estirpe integrante S150-sX21 (Tabela 1) . As diferentes estirpes integrantes de S. cerevisiae são subsequentemente 53 transformadas com o plasmideo Yepsecl-E27i5 para a expressão da glicoproteina E27;L5 do envelope do HCV em leveduras.

Seguindo um método similar, a estirpe de levedura (sobre)expressando PDI (S150-PA1, Tabela 1) foi igualmente usada para obter FIGF humano numa forma solúvel. 0 mesmo factor é insolúvel quando expresso pela estirpe de levedura de tipo selvagem (S150-2B).

Análise da Transcrição dos Genes Integrados 0 RNA das diferentes estirpes integrantes cultivadas sob condições repressoras (YPD) ou indutoras (GalYP) é separado num gel de agarose a 1,2%-formaldeido 2,2M, transferido para uma membrana de nitrocelulose e hibridizado com sondas especificas marcadas com 32P de modo a determinar se o local de integração e/ou orientação da cassette de expressão influencia a transcrição do gene de PDI ou TRX2 integrado. 0 uso de uma sonda especifica para PDI para a análise por Northern blot das estirpes integrantes de PDI mostra que a transcrição do PDI integrado a partir do promotor indutivel por galactose é correctamente regulada, i.e., reprimida pelo crescimento num meio com glucose (Fig. 2A) . Adicionalmente, tanto a orientação da unidade de transcrição como o local da integração influenciam o nivel de transcrição. Observa-se um nivel inferior de transcrição do PDI integrado relativamente ao gene endógeno nas estirpes integrantes portadoras da orientação B (S150-PB1, W303-PB1) em comparação com a orientação A (S150-PAl) da construção, e a integração em ade2 (S150-PA2) conduz a uma redução ainda maior. A análise da transcrição do cDNA de HCV-E27i5 clonado em Yepsecl (Y-E27i5) nas estirpes integrantes lys2: :TRX2 e lys2::sTRX2 cultivadas em GalYP mostra que a inserção de um gene TRX2 regulado por galactose nestas estirpes não influencia o nivel de mRNA de Ε27χ5, ainda que a expressão de 54 ambos os genes requeira os mesmos factores de transcrição (Fig. 2B) . A Sobreexpressão de PDI e de TRX2 Facilita a Dobragem de HCV-E27i5 em S. cerevisiae

Prepararam-se extractos celulares a partir de culturas de leveduras por fragmentação das membranas celulares com esferas de vidro num homogeneizador Braun (B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Alemanha) durante 20 seg a 4°C. Após a fragmentação, as suspensões celulares são diluídas em PBS e purificadas por cromatografia de afinidade (ver abaixo). As amostras de proteínas são analisadas por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) tal como descrito por Laemmli (Laemmli, Nature, 227:680-685, 1970) em tampão LSB (2% SDS, 10% glicerol, DTT 200mM, Tris-HCl 62,5mM, pH 6,8) e transferidas para uma membrana de nitrocelulose (Nitrobind, MSI, Wetsborough, MA, EUA) (Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76:4350-4354, 1979). A membrana é incubada num tampão contendo PBS, 3% de leite em pó e 0,1% de Triton. São usados no imunoblot um anticorpo monoclonal (mAc) contra um epitopo linear da proteína HCV-E27i5 expressa em células de insecto (3E5-1) , dois mAcs conformacionais (291A2 e 5E5-H7) e um antisoro de chimpanzé contra HCV-E1E2 co-purificado a partir de células HeLa (L559) (Choo et al., Proc. Natl. Acad.

Sei. USAr 91:1294-1298, 1994; Rosa et al., Proc. Natl. Acad.

Sei. USAr 93:1759-1763, 1996). Os imunoblots são revelados através de quimioluminescência aumentada (ECL, Amersham, Arlington Heights, IL, EUA). A proteína HCV-E27i5 é purificada a partir de culturas de leveduras através de cromatografia por afinidade usando uma coluna de lectina (lectina de agarose de Galanthus nivalis -GNL); a GNL comercial que foi usada em particular foi a GNA, Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, EUA). A coluna é 55 equilibrada com PBS a 40 cm/h, lavada com NaCl 0,9M em PBS e a glicoproteina é eluida usando a-metil-D-manosido 1M, NaCl 0,9M em PBS. As fracções eluidas da coluna são dialisadas contra PBS, as concentrações das proteínas são determinadas usando o método de Lowry (DC Protein Assay da Bio-Rad, Bio-Rad, Hercules, CA, EUA) e é efectuada a sua análise por dot-blot com anticorpos monoclonais anti-E2. A análise por Western blot das proteínas purificadas por afinidade a partir de extractos celulares das estirpes integrantes lys2::TRX2, lys2::PDI, lys2::TRX2-ade2::PDI expressando HCV-E27i5 revela que uma proporção da glicoproteina E27i5 penetrará no gel de separação na ausência de DTT apenas nas amostras provenientes de integrantes que sobreexpressem PDI. A quantidade relativa de glicoproteina que penetra no gel de separação sem um agente redutor parece ser ainda superior na amostra do integrante duplo SX21-PA2 (Fig. 3) . O imunoblot da proteína E27;L5 não desnaturada obtida a partir das diferentes estirpes de leveduras mostra que a glicoproteina purificada a partir da estirpe integrante de PDI se liga a 5E5-H7 e, em menor extensão, aos anticorpos conformacionais 291A2 (Fig. 4).

As Diferentes Formas de Proteína HCV-E2 Expressas em Estirpes de Levedura Modificadas Ligam-se a Células MOLT-4 A proteína HCV-E2 é expressa na natureza por células de mamíferos e liga-se a células humanas com elevada afinidade. Para verificar se as proteínas E2 expressas por leveduras modificadas possuem actividade biológica semelhante e têm a capacidade de se ligar a células humanas, incubaram-se células MOLT-4, de uma linha de linfoma de células T, a 4°C com diferentes formas de proteína E2 expressa por leveduras modificadas (8,7 yg/ml). Como controlo positivo, é usada proteína E2 expressa por células CHO na mesma concentração. 56

Como controlo negativo, as células MOLT-4 são incubadas na ausência de proteínas E2. Subsequentemente, o pellet celular é incubado com mAc contra E2. Após incubação com o fragmento F(ab')2 de IgG de cabra anti-ratinho marcado com ficoeritrina, a ligação às células-alvo é indirectamente detectada por citometria de fluxo como fluorescência ligada às células (Fig. 5) .

Tal como mostra a Figura 5, as células MOLT-4 pré-incubadas com proteína HCV-E2 expressa por células CHO (E2 CHO GNL) exibem a máxima intensidade média de fluorescência (M = 133,78) quando comparadas com as células MOLT-4 pré-incubadas com proteínas E2 expressas por leveduras modificadas (M = 26,24 (E2 Levedura PDI GNL); M = 5,32 (E2 Levedura TRX GNL)). No entanto, as células MOLT-4 pré-incubadas com proteína E2 expressa por leveduras modificadas exibem uma intensidade média de fluorescência que é ainda assim superior à das células MOLT-4 pré-incubadas na ausência de proteínas E2 (M = 3.97 (controlo negativo)). A ligação das diferentes formas de proteína E2 às células MOLT-4 é influenciada pela estrutura das proteínas. A proteína E2 expressa pelas células CHO possui ligações dissulfito apropriadamente formadas, pelo que apresenta uma dobragem correcta e é biologicamente activa. Como consequência de tal, verifica-se uma elevada afinidade de ligação da proteína E2 expressa por células CHO às superfícies celulares das células MOLT-4, resultando numa elevada intensidade média de fluorescência. Similarmente, as proteínas E2 expressas por leveduras modificadas parecem também ser biologicamente activas, uma vez que se ligam a células MOLT-4, daí resultando uma intensidade média de fluorescência mais elevada quando comparada com a do controlo negativo.

Se bem que a intensidade média de fluorescência (e, consequentemente, a afinidade de ligação às células MOLT-4) 57 seja inferior para as proteínas E2 expressas por leveduras modificadas quando comparada com a da proteína E2 expressa por células CHO, a proteína E2 expressa por leveduras não modificadas (i.e., expressa em células de levedura sem a co-expressão de PDI ou de TRX) não possui a capacidade de se ligar a células MOLT-4 (ver Rosa et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 93: 1759-1763, 1996; particularmente as linhas 16 a 18 do parágrafo de Resultados na página 1760 e a Fig. 1) . Assim, o sistema hospedeiro de expressão modificado fornecido pelo presente invento possibilita a produção de proteínas heterólogas com uma actividade biológica e/ou estrutura similares às das proteínas nativas produzidas pelos seus hospedeiros naturais.

Lisboa, 17 de Julho de 2007 58

Claims (5)

1. REIVINDICAÇÕES 1- Um método para a obtenção de proteína (s) heteróloga (s) biologicamente activa(s) e/ou correctamente estruturada(s) num organismo hospedeiro, compreendeendo a purificação da(s) dita(s) proteína (s) heteróloga(s) a partir do extracto celular de um organismo hospedeiro, caracterizado por: (a) o dito organismo hospedeiro ser transformado in vitro com um vector, compreendendo: (i) uma cassette de expressão compreendendo uma sequência de DNA codificando para uma proteína que tem a capacidade de catalisar a formação de ligações dissulfito, sendo que esta proteína corresponde à proteína dissulfito isomerase (PDI) ou à tioredoxina (TRX); (ii) uma cassette de expressão compreendendo sequência (s) de DNA codificando para uma ou mais proteínas heterólogas; e (b) o organismo hospedeiro do passo (a) ser cultivado sob condições adequadas à expressão das ditas uma ou mais proteínas heterólogas; e (c) a(s) dita(s) proteína (s) heteróloga(s) biologicamente activa(s) e/ou correctamente estruturada(s) ser/serem purificada (s) a partir do extracto celular do organismo hospedeiro, o dito organismo hospedeiro correspondendo a uma espécie microbiana eucariótica, a uma célula de insecto ou a uma célula de mamífero. 2- 0 método, de acordo com a Reivindicação N°.l, caracterizado por a(s) dita(s) uma ou mais proteína(s) heteróloga (s) não formar(em) proteína (s) de fusão com a dita TRX. 1 3- 0 método, de acordo com as Reivindicações N°.l ou N°.2, caracterizado por o vector compreender ainda sequência (s) de DNA codificando para um ou mais péptidos leader para a secreção para o RE e/ou outros compartimentos secretórios. 4- 0 método, de acordo com as Reivindicações N°.l a N°.3, caracterizado por a proteína heteróloga corresponder à glicoproteína E27is do envelope do vírus da hepatite C (HCV) ou ao factor de crescimento induzido por c-fos humano (FIGF). 5- 0 método, de acordo com qualquer das Reivindicações anteriores, caracterizado por o vector possuir a capacidade de se integrar no genoma de um organismo hospedeiro.
2. 6- Um método para a obtenção de proteína (s) heteróloga(s) biologicamente activa(s) e/ou correctamente estruturada(s) num organismo hospedeiro, compreendendo a purificação da(s) dita(s) proteína(s) heteróloga(s) a partir do extracto celular de um organismo hospedeiro, caracterizado por (a) o dito organismo hospedeiro ser transformado in vitro com (i) um ou mais dos vectores tais como definido por qualquer das Reivindicações 1 a 5; e/ou (ii) um ou mais vectores compreendeendo uma cassette de expressão compreendendo uma sequência de DNA codificando para uma proteína que tem a capacidade de catalisar a formação de ligações dissulfito, sendo que esta proteína corresponde à proteína dissulfito isomerase (PDI) ou à tioredoxina (TRX); e (b) o organismo hospedeiro do passo (a) ser cultivado sob condições adequadas à expressão das ditas uma ou mais proteínas heterólogas; e (c) a(s) dita(s) proteína (s) heteróloga (s) biologicamente activa(s) e/ou correctamente 2 estruturada(s) ser/serem purificada(s) a partir do extracto celular do organismo hospedeiro; e em que, quando o dito organismo hospedeiro é transformado com (a) (ii), o dito organismo hospedeiro é ainda submetido a uma transformação adicional com um ou mais vectores compreendeendo uma cassette de expressão que compreende sequência (s) de DNA codificando para as ditas uma ou mais proteinas heterólogas; e em que, quando o dito organismo hospedeiro é transformado com um ou mais vectores compreendendo uma cassette de expressão que compreende uma sequência de DNA codificando para TRX, as ditas uma ou mais proteinas heterólogas não forma(m) proteína (s) de fusão com a dita TRX; e em que o dito organismo hospedeiro corresponde a uma espécie microbiana eucariótica, a uma célula de insecto ou a uma célula de mamífero.
3. 7- Um método, de acordo com a Reivindicação N°.6, caracterizado por a dita transformação adicional ser efectuada numa altura subsequente ou em simultâneo.
4. 8- Um método, de acordo com as Reivindicações N°.6 ou N°.7, caracterizado por a dita transformação ser efectuada usando um vector compreendendo uma cassette de expressão que compreende sequência(s) de DNA codificando para a glicoproteína E27i5 do envelope do vírus da hepatite C (HCV) ou para o FIGF humano.
5. 9- Um método para a preparação de uma composição imunogénica, compreendendo: (A) a obtenção de proteína(s) heteróloga(s) biologicamente activa(s) e/ou correctamente estruturada(s) num organismo hospedeiro não humano, compreendendo a purificação da(s) dita(s) proteína(s) heteróloga(s) a partir do extracto celular de um organismo hospedeiro não humano, em que (a) o dito organismo hospedeiro é transformado in vitro com 3 (i) um ou mais dos vectores tais como definido por qualquer das Reivindicações N°.l a N°.5; e/ou (ii) um ou mais vectores que compreendem uma cassette de expressão que compreendem uma sequência de DNA codificando para uma proteína que tem a capacidade de catalisar a formação de liqações dissulfito, correspondendo esta proteína à proteína dissulfito isomerase (PDI) ou à tioredoxina (TRX); e (b) o orqanismo hospedeiro do passo (a) é cultivado sob condições adequadas à expressão das ditas uma ou mais proteínas heteróloqas; e (c) a(s) dita(s) proteína (s) heteróloqa(s) biologicamente activa(s) e/ou correctamente estruturada(s) é/são purificada(s) a partir do extracto celular do organismo hospedeiro; e Caracterizado por , quando o dito organismo hospedeiro é transformado com (a) (ii), o dito organismo hospedeiro é submetido a uma transformação adicional com um ou mais vectores compreendendo sequência (s) de DNA codificando para as ditas uma ou mais proteínas heterólogas; e e em que, quando o dito organismo hospedeiro é transformado com um ou mais vectores compreendendo uma cassette de expressão que compreende uma sequência de DNA codificando para TRX, as ditas uma ou mais proteínas heterólogas não forma(m) proteína(s) de fusão com a dita TRX; e (B) a colocação da(s) dita(s) proteína (s) heteróloga (s) biologicamente activa(s) e/ou correctamente estruturada(s) em associação com um veículo farmaceuticamente aceitável e opcionalmente com um adjuvante; sendo que que a(s) proteína (s) heteróloga (s) biologicamente activa(s) e/ou correctamente estruturada (s) corresponde(m) à proteína E2715 do envelope do HCV ou ao FIGF humano. 4 Lisboa, 17 de Julho de 2007 5