MXPA02004052A

MXPA02004052A - Proteinas de hcv reversibles por redox con conformacion pseudo-nativa.

Info

Publication number: MXPA02004052A
Application number: MXPA02004052A
Authority: MX
Inventors: Bosman Alfons
Original assignee: Innogenetics Nv
Priority date: 1999-10-27
Filing date: 2000-10-25
Publication date: 2002-11-07
Also published as: NZ518095A; WO2001030815A1; RU2002109480A; EP1224214A1; CA2387666A1; CN1384839A; ZA200203169B; BR0015170A; CZ20021819A3; AU1144501A; PL354990A1; HUP0203195A3; HUP0203195A2; JP2003513022A

Abstract

La presente invencion se refiere a las proteinas de HCV en las cuales los residuos de cisteina son reversiblemente preferidos durante la purificacion. Eventualmente, el procedimiento de purificacion da como resultado proteinas de HCV con actividad biologica y una conformacion de proteina pseudo-nativa, que presentan epitopes correspondientes. La presente invencion pertenece tambien a los metodos de seleccion de farmacos utilizando estas proteinas de HCV, y las aplicaciones de diagnostico y terapeuticas, tales como vacunas y farmacos.

Description

PROTEÍNAS DE HCV REVERSIBLES POR REDOX CON CONFORMACIÓN PSEÜDO-NATIVA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a las proteínas HCV en las cuales los residuos de cisteína son reversiblemente protegidos durante la purificación. Eventualmente, este procedimiento de purificación da como resultado proteínas de HCV con actividad biológica y una conformación de proteína seudo-nativa, que presentan epítopes correspondientes . La presente invención pertenece también a los métodos de selección de fármacos utilizando estas proteínas de HCV, y a las aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas, tales como vacunas y fármacos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La infección por el virus C (HCV) es un problema de salud mayor en países desarrollados y en desarrollo. Se estima que aproximadamente 1 a 5% de la población mundial está afectada por el virus. La infección por HCV parece ser la causa más importante de la hepatitis asociada a la transfusión y frecuentemente progresa a daño hepático crónico. Además, existe evidencia que implica al HCV en la REF: 137981 inducción del carcinoma hepatocelular. En consecuencia, es alta la demanda para métodos de diagnóstico confiables y agentes terapéuticos efectivos. También, se necesitan métodos de selección sensibles y específicos de los productos sanguíneos contaminados con HCV y los métodos mejorados para cultivar el HCV. El HCV es un virus de ARN de hebra positiva de aproximadamente 9,600 bases que codifican para al menos tres proteínas estructurales y seis proteínas no estructurales. Con base en la homología de la secuencia, las proteínas estructurales han sido funcionalmente asignadas como una proteína de núcleo simple y dos proteínas de envoltura: El y E2. La proteína El consiste de 192 aminoácidos y contiene 5 a 6 sitios de N-glucosilación, dependiendo del genotipo del HCV. La proteína E2 consiste de 363 y 370 aminoácidos y contiene 9 a 11 sitios de N-glucosilación, dependiendo del genotipo del HCV (para revisión ver: Major and Feinstone, 1997; Maertens and Stuyver, 1997) . La proteína El contiene varios dominios variables (Maertens and Stuyver, 1997) , mientras que la proteína E2 contiene tres dominios hipervariables, de los cuales el dominio mayor está localizado en el extremo N de la proteína (Maertens and Stuyver, 1997) . Estas proteínas de envoltura han sido producidas mediante técnicas recombinantes en Escherichia coli , células de insecto, células de levadura y células de mamífero. NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B son proteínas no estructurales (NS) . NS3 es de aproximadamente 70 kDa, y tiene actividad de proteasa y helicasa. Las secuencias NS3 que son esenciales para la actividad de la helicasa tienen también propiedades de enlace al ARN, enlace al Mg++ y enlace al ATP. Los anticuerpos Anti-?S3 frecuentemente aparecen primeramente en las series de sero-conversión. La inmunorreactividad de la proteína ?S3 parece ser diferente en los diversos ensayos comerciales disponibles hoy en día. A la fecha, se ha probado que la vacunación contra enfermedades es el método de menor costo y más eficiente para controlar enfermedades. Los esfuerzos para desarrollar una vacuna para HCV eficaz no obstante, han estado plagados con dificultades. Una condición primordial para las vacunas es la inducción de una respuesta inmune en los pacientes. En consecuencia, los determinantes antigénicos de HCV deben ser identificados, y administrados a los pacientes en un programa adecuado. Los determinantes antigénicos pueden ser divididos en al menos dos formas, por ejemplo, epítopes lineales y conformacionales. Los epítopes conformacionales resultan del plegamiento de una molécula en un espacio tridimensional . En general , se cree que los epítopes conformacionales harán las vacunas más eficaces, ya que éstos representan epítopes que asemejan epítopes HCV pseudo-nativos . No obstante, existen al parecer problemas insalvables con el cultivo de HCV, que dan como resultado solamente cantidades diminutas de viriones. Además, existen vastos problemas con la expresión y purificación de las proteínas recombinantes, que dan como resultado proteínas no adecuadamente plegadas. Por lo tanto, la estructura in vivo de la mayoría de las proteínas HCV es oscura, y por lo tanto no ha sido conocido ningún estudio sólido sobre los epítopes conformacionales. Además, la falta de sistemas de cultivo in vi tro y modelos animales pequeños, adecuados, ha impedido severamente el desarrollo de nuevos fármacos antivirales para las infecciones por hepatitis C. El chimpancé es el único modelo disponible hoy en día para el estudio de la infección por HCV, la profilaxis y la terapia para el mismo, pero el sistema únicamente permite estudiar compuestos previamente seleccionados. Se ha sugerido que la proteína de envoltura El necesita la proteína de envoltura E2 para alcanzar un estado de plegamiento adecuado (Deleersnyder y colaboradores, 1997) . Además, se ha sugerido que El y E2 forman heterodímeros que pueden formar la unidad básica de la envoltura viral (Yi y colaboradores, 1997) . But, Houghton (1997) reportaron que las inmunizaciones repetidas con gpElE2 recombinante (4 x 25 µg) de tres chimpancés crónicamente infectados con el HCV no indujo una respuesta inmune significativa. La inducción de una respuesta inmune anti-envoltura en pacientes con hepatitis C podría ser por supuesto deseable y benéfica para el paciente, ya que más altos niveles de anticuerpos parecen correlacionar con la buena respuesta a la terapia con interferón, y puede por lo tanto ayudar al paciente a despejar el virus (PCT/EP 95/03031 Maertens y colaboradores) . Los niveles de anticuerpo contra El en portadores crónicos de HCV están entre los más bajos de todos los anticuerpos para HCV, puede por lo tanto ser benéfico el elevar esos niveles de anticuerpo, y posiblemente la respuesta celular, para inducir el control e incluso el despejo de la inducción por el huésped o anfitrión. También, los más altos niveles de inmunidad celular contra El parecen correlacionar con la buena respuesta hacia la terapia con interferón (Leroux-Roels y colaboradores, 1996) . De manera importante, los estudios anteriormente descritos no confiaron en los péptidos de El pseudo-nativos. Los epítopes más cruciales en NS3 para la detección de los sueros positivos al HCV están relacionados a los epítopes conformacionales. Aparentemente, los epítopes NS3 están dispersos todos sobre la proteína NS3 (ver también Leuroux-Roels y colaboradores, 1996; Rehermann y colaboradores, 1996, 1997; Diepolder y colaboradores, 1995, 1997) . En los primeros ensayos la proteína NS3 ha sido empleada en vez de los péptidos. Los avances en la biología molecular y en la ingeniería genética han hecho posible el producir grandes cantidades de productos proteicos utilizando sistemas de expresión heterólogos. El uso de huéspedes heterólogos, no obstante, puede conducir a diferencias en las propiedades biológicas y/o estructurales del producto recombinante. Entre las modificaciones bioquímicas que pueden ocurrir a las proteínas durante o después de la síntesis en la célula y la purificación subsiguiente, la formación y el sostenimiento de los enlaces disulfuro • es de importancia. El estado redox de la cisteína está intrincadamente ligado al plegamiento correcto o al montaje correcto de las proteínas enlazadas por puentes disulfuro. Además, muy frecuentemente la función biológica de una proteína es regulada o al menos influenciada por el estado de oxidación de sus grupos sulfhidrilo. Este es el caso para algunas actividades enzimáticas donde la reversibilidad y la sincronización de la oxidación de los grupos sulfhidrilo han sido propuestas como un mecanismo de control fisiológico (ver también Thomas y colaboradores, 1995; Nakamura y colaboradores, 1997; Aslund y Becke ith, 1999) .

Varios factores proteicos que catalizan el estado redox del grupo cisteinilo (formación del enlace tiol versus disulfuro) han sido caracterizados (Mossner y colaboradores, 1998; Prinz y colaboradores, 1997, Loferer & Hennecke, 1994) . Predominantemente, estos factores proteicos pertenecen a la "superfamilia de proteínas de "tiorredoxina" , de las cuales los miembros contienen 2 residuos activos por redox en la secuencia de consenso Cys-X-X-Cys (X= cualquier aminoácido) . Esta superfamilia puede ser dividida en diferentes clases, con base en el potencial redox del sitio activo, la especificidad de substrato o la actividad biológica. Otra clasificación más confía en la secuencia de consenso del centro redox-activo, a saber: (i) Una clase, comúnmente representada por Tiorredoxina (TRX), consiste de pequeñas proteínas ubicuas. El centro redox-activo tiene la secuencia de consenso Cys-X-Pro-Cys, que está altamente conservada en muchas especies, en el interior de bacterias hasta plantas y mamíferos (X = cualquier aminoácido) . TRXox oxidada es regenerada a su forma reducida en un complejo con la TRX-reductasa, FAD y NADPH. (ii) La glutarredoxina (GRX) es un representante común de una segunda clase de la superfamilia de tiorredoxinas. El centro redox-activo tiene la secuencia de consenso Cys-Pro-X-Cys, en la cual X es preferentemente un aminoácido aromático por ejemplo Tyr o Phe. GRX así como TRX actúa ambos como reductores con los disulfuros, pero GRX podría ser una disulfuro-reductasa mezclada con glutatión específico (GSH), por ejemplo, en la reducción de las proteínas tioladas. Se ha demostrado que la porción CXXC puede también estar involucrada en diversas funciones bioquímicas y biológicas intra- y extracelulares, por ejemplo las reacciones de intercambio tiol/disulfuro, el enlace de los metales de transición, el sitio de incorporación del lípido, y las actividades reguladoras, tales como, por ejemplo, el control de la transcripción de los genes, la regulación de la transducción de las señales, incluyendo el funcionamiento como una citosina, y similares, y el control del estado de (des) tiolación de las proteínas. De manera importante, la porción CXXC puede funcionar en las estructuras terciarias así como cuaternarias (ver también Thomas y colaboradores, 1995; Pinter y colaboradores, 1997; Aslund y Beck ith, 1999; Nakamura y colaboradores, 1997) . Las proteínas HCV contienen porciones CXXC. No obstante, a la fecha no existe sugerencia ni indicación en la técnica anterior de que el estado redox reversible de estas porciones CXXC sea de importancia para el HCV. El protocolo de purificación descrito a la fecha no explica un puente -S-S-reversible en la porción CXXC. Como consecuencia, la conformación de las proteínas HCV purificadas así como su actividad biológica son deterioradas . Han existido numerosos intentos para estudiar proteínas HCV nativas. El problema encontrado fue la incapacidad para purificar proteínas de HCV con la conformación correcta o pseudo-nativa. En consecuencia, los epítopes conformacionales así como otras funciones y actividades bioquímicas y biológicas dependientes de la conformación pseudo-nativa, permanecen siendo enigmáticos. Además, los objetivos farmacéuticos para las enfermedades hepáticas y hepatitis viral sufren del mismo inconveniente, y los programas de selección de fármacos están propensos a fallar.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCION/OBJETIVOS Parece de este modo que debido a la falta de o a la expresión ineficiente y a los sistemas de purificación, el plegamento correcto y el montaje correcto de las proteínas es deteriorado. Tales proteínas purificadas son a menudo no biológicamente activas y/o tienen una estructura proteica incorrecta. Como consecuencia, los anticuerpos anti-HCV nativos fallan en reconocer un subgrupo importante de determinantes antigénicos sobre estas proteínas, ver por ejemplo Houghton (1997) . La presente invención supera estos problemas, ya que describe y elabora por primera vez proteínas de HCV con una conformación pseudo-nativa, debido a un estado redox reversible de los residuos de cisteinilo. De este modo, son descritas nuevas estructuras de las proteínas de HCV. En particular, la presente invención permite la purificación de proteínas de HCV que son biológicamente activas y/o tienen una conformación pseudo-nativa. Las proteínas HCV pseudo-nativas dan como resultado nuevos epítopes conformacionales y dependientes de la oligomerización. Las actividades in vi tro e in vivo directas o indirectas (mediadas) de las proteínas de HCV pseudo-nativas crean la posibilidad de estudiar las vías y cascadas bioquímicas y biológicas, por ejemplo, las metabólicas, enzimáticas, transducción de las señales, y la inmuno-reactividad. La identificación de los centros activos, los sitios de enlace y los dominios de interacción (proteína-proteína, proteína-azúcar, proteína-ácido nucleico y proteína-molécula pequeña) permite el desarrollo de fármacos, que interfieren con los procesos celulares y virales involucrados en la hepatitis. - el método de purificación y plegamiento de la presente invención, en el cual es removido un grupo protector del cisteinilo, seguido por el replegamiento y la reoxidación de los residuos de cisteinilo en la proteína de HCV, permite restaurar la conformación pseudo-nativa de las proteínas de HCV.

OBJETIVOS La presente invención está encaminada a una proteína HCV, o a cualquier parte funcionalmente equivalente de la misma, que comprende un aminoácido Cys, que tiene un estado redox reversible. En particular, la presente invención pertenece a una proteína de HCV, que comprende al menos dos aminoácidos Cys con un estado redox reversible. Los últimos dos aminoácidos Cys pueden estar separados por otros aminoácidos. Preferentemente, dichos aminoácidos Cys están comprendidos en la secuencia de aminoácidos Cys-X?-X2-Cys, en la cual el aminoácido Xi denota cualquier aminoácido, y el aminoácido X2 denota cualquier aminoácido. Más preferentemente, el aminoácido Xi denota ya sea el aminoácido Val, Leu o ile, y el aminoácido X2 denota el aminoácido Pro. Además, la presente invención se dirige a la provisión de una proteína de HVC, o cualquier parte funcionalmente equivalente de la misma, que comprende al menos dos aminoácidos Cys, con un estado redox reversible, de acuerdo a lo anterior, obtenible mediante el siguiente proceso: (a) purificación de una proteína de HCV, o cualquier parte funcionalmente equivalente de la misma, en la cual los residuos de cisteína son química y/o enzimáticamente reversiblemente protegidos, (b) eliminación del estado de protección reversible de los residuos de cisteína, (c) obtención de una proteína de HCV, o cualquier parte funcionalmente equivalente de la misma, en la cual los residuos de cisteína tienen un estado redox reversible. Además, la presente invención se dirige a la provisión de la proteína de HCV, o cualquier parte funcionalmente equivalente de la misma, como se define anteriormente, para el uso como un medicamento. Además, la presente invención se dirige al uso de la proteína de HCV, o cualquier parte funcionalmente equivalente de la misma, como se definió anteriormente, para la fabricación de una composición de vacuna de HCV, en particular una vacuna terapéutica o una vacuna profiláctica. Además, la presente invención se dirige a la provisión de la proteína de HCV, o cualquier parte funcionalmente equivalente de la misma, como se define anteriormente, para producir anticuerpos específicos. Además, la presente invención se dirige a la provisión de un inmuno-ensayo para detectar el anticuerpo para HCV mediante la determinación de la formación de un complejo de anticuerpo de HCV-proteína de HCV. Finalmente, la presente invención se dirige a la provisión de un bioensayo para identificar los compuestos que modulan la actividad de las proteínas de HCV como se definen anteriormente, mediante la verificación periódica de los cambios en la actividad de la óxido-reductasa. Se considera que todos los objetivos de la presente invención han sido cumplidos por las modalidades como se describen enseguida.

LEYENDAS DE LAS FIGURAS Figura 1 : Exclusión de tamaño de muestras de células Vero reversiblemente protegidas e irreversiblemente bloqueadas, después de la lisis en presencia de L-ascorbato . Las células Vero fueron lisadas con Tritón X-100 en presencia de L-ascorbato lmM. El lisado fue cargado sobre Lentil Lectin y se redujo con DTT 7.5 mM a pH 7.2 como se describe en la solicitud PCT EP95/03031 a Maertens y colaboradores. Els reducida fue ya sea (1) sulfonatada con tetrationato de sodio, (2) y reversiblemente bloqueada con N-etilmaleimida ó (3) dejada sin tratar pero el pH de la solución fue disminuido a 6. Un perfil de SEC siguiendo el protocolo por PCT EP95/03031 a Maertens y colaboradores, es incluido como referencia. Las filtraciones en gel sobre Superdex G200 10/30 (Pharmacia) fueron corridas en PBS, pH 7.2, 3% de Empigen, excepto para la condición (3) . Esta filtración en gel fue corrida con fosfato 10 mM, cloruro de sodio 150 mM, pH 6.0.

Perfiles de SEC: A: lisis en presencia de ascorbato y sulfonación después de la reducción con DTT B: lisis en presencia de ascorbato y bloqueo irreversible después de la reducción con DTT C: lisis en presencia de ascorbato y sin tratamiento adicional, pero la SEC fue corrida a pH 6.0 D: referencia: bloqueo con NEM/NEM.bio en el lisado y después reducción con DTT (PCT EP95/03031 a Maertens y colaboradores) Las barras indican los combinados para el análisis mediante tinción con plata y transferencia de Western. El histograma da los resultados del ELISA de emparedado: se utilizó Mab 14H11B2 (IGH 207) para el recubrimiento, y la detección fue realizada con 25C3 marcado con HRP (IGH 200) .

Figura 2 : Cromatografía de exclusión de tamaño de Els de células Vero reversiblemente protegidas e irreversiblemente bloqueadas, después de la lisis en presencia de agentes de sulfonación. Las células Vero fueron usadas como se describe en PCT EP95/03031 a Maertens y colaboradores, pero se agregó tetrationato de sodio en vez de NEM/NEM.bio. La purificación sobre Lentil y reducción se realizaron como se describe en PCT EP95/03031 a Maertens y colaboradores. El material reducido fue ya sea (1) sulfonatado por tetrationato de sodio o bien (2) tratado con IAA (= irreversiblemente bloqueado) . El material obtenido mediante el método como se describe en PCT EP95/03031 a Maertens y colaboradores es incluido como referencia. Las tres diferentes muestras de Els fueron separadas sobre una columna Superdex G200 10/30, la cual había sido equilibrada con PBS, 3% de Empigen, pH 7.2. A: Sulfonación del lisado de células Vero y sulfonatación después de la reducción con DTT B: Sulfonación del lisado de células Vero y bloqueo irreversible con yodo-acetamida C: Els de Vero obtenida después del bloqueo irreversible con NEM/NEM.bio como se describe en PCT EP95/03031 a Maertens y colaboradores . D: Traslape de los perfiles de SEC.

Los resultados de la prueba de ELISA de emparedado se presentan en los histogramas . Las fracciones de Els fueron combinadas como se indica con las barras y analizadas mediante tinción con plata y transferencia de Western.

Figura 3: Análisis fraccional de la SEC en 3% de Empigen mediante SDS-PAGE y transferencia de Western. (A) : Fracciones de SEC obtenidas después de las diferentes condiciones de protección reversible y bloqueo irreversible fueron analizadas mediante SDS-PAGE y tinción con plata. El análisis de SDS-PAGE de las fracciones obtenidas después de la lisis en ascorbato y filtración en gel a pH 6 (ver figura l.c) o la lisis en ascorbato y sulfonación (figura l.a) se dan como ejemplos en la figura 3A .1. La figura 3A.2 muestra la selección fraccional mediante transferencia de Western con 11B7D8 para las condiciones descritas como en la figura l.C (lisis en ascorbato y SEC a pH 6 después de la reducción con DTT) . (B) Transferencias de Western de los combinados de SEC fueron realizadas con Mabs 5E1A10 anti-Els, que reconocen el epítope amino- y carboxilo-terminal, respectivamente.

Los combinados fueron elaborados como se indica en la figura 1 y en la figura 2. Banda 1 y 6: Marcadores de peso molecular Banda 2 y 7: Material de referencia como fue preparado por PCT/EP95/03031 a Maertens y colaboradores. Banda 3 y 8: Material de referencia preparado con cisteínas irreversiblemente bloqueadas (Tratamiento con yodo-acetamidas) . Banda 4 y 9: Material obtenido después de la sulfonación del lisado y sulfonación después de la reducción. Banda 5 y 10: Material obtenido después de la lisis en presencia de ascorbato y sulfonación después de la reducción.

Figura 4: proteína de fusión NS3 marcada con (his) 6 expresada en E. Coli . Se esquematiza la purificación sobre afinidad metálica después de la protección reversible así como preparación de la muestra para ELISA. +/- AO: en presencia o ausencia del agente protector reversible (AO) .

Figura 5 : Reactividad de ELISA de las proteínas de fusión NS3 de mTNF(His)6 después de diferentes condiciones de recubrimiento. Figura 5A: proteína de fusión mTNF(His) 6NS3B9 90% pura se desaló a citrato 25 mM, EDTA l M, pH 4 después de la reducción con DTT 200 mM. La proteína de fusión fue diluida hasta 500 µg/ml en amortiguador de desalación y se almacenó a -70°C en presencia o ausencia de agentes protectores de tiol (grupo antioxidante 1, grupo 2) . Las muestras fueron diluidas a 0.5 µg/ml en amortiguador de recubrimiento de ELISA (amortiguador de bicarbonato 50 mM, pH 9.6) con o sin agentes de protección de tiol (antioxidantes) . Los pozos fueron bloqueados con PBS en presencia o ausencia de agente protector. La incubación de la muestra sérica se realizó en presencia o ausencia de DTT 10 mM y la ELISA se reveló con anticuerpos de conejo antihumano, conjugados a la HRP (Dako, Dinamarca) después del lavado. La reacción se detuvo mediante la adición de H2S04 2N. Los sueros (17790, 17826, 17832, 17838) fueron probados. Los sueros 17790 y 17832 son considerados como sueros difíciles, debido a que éstos son únicamente detectados como sueros positivos a HCV después del tratamiento con DTT 200 mM (control positivo) . El tratamiento con DTT 10 mM es incluido como control negativo para estos sueros. Los sueros 17826 y 17838 son sueros, que reaccionan con la proteína NS3B9 después del tratamiento con DTT 10 mM (y son considerados como sueros de HCV fácilmente detectables) . Grupo antioxidante 1: EDTA lmM, ácido L-ascórbico l M, glutatión reducido l M. Tocoferol lmM fue agregado suplementariamente a estos agentes de protección de tiol durante el proceso de ELISA, si el bloqueo fue realizado en presencia de agente protector. Grupo antioxidante 2 : Tiodietilenglicol (TEG) lmM, ácido tiofencarboxílico (TPCB) lmM, ditiocarbamato de pirrolidona (PDTC) lmM, ditiocarbamato de dietilo lmM (DETC) . Figura 5B: Compuestos de tiol y reactividad de NS3B9 La ELISA se realizó como se describe en la figura 5A, excepto que se investigó con más detalle el efecto (tipo y concentración) de los compuestos mono y ditio como grupo de protección reversible. El diluyente de la muestra fue incubado en esta ELISA siempre en presencia de DTT 3mM. Antioxidante 1 = EDTA l M, L-ascorbato lmM Antioxidante 2 = ácido tiofencarboxilico (TPBC) lmM, tioetilenglicol (TEG) lmM, ditiocarbamato de dietilo lmM (DETC), ditiocarbamato de pirrolidona lmM (PDTC) . DTC 4mM = DETC 2p?M, PDTC 2 mM. Mono-SH lmM = TPBC 2mM, TEG 2mM. GSH y Cys son glutatión reducido y cisteína, respectivamente .

Figura 6 análisis de SDS-PAGE de las proteínas HCV marcadas con (his) 6 reversiblemente protegidas, purificadas, después de la cromatografía de afinidad metálica . Figura 6A: mTNF (His) 6NS3B9 expresada en E . Col i (lote NS3B9 B960925II) . Transferencia de Western con anti-mTNF y SDS-PAGE teñida con plata bajo condiciones no reductoras (lµg proteína/banda) . Figura 6B: Els marcada con (his) 6 expresada en Saccharomyces cerevesiae (levadura) Las proteínas fueron visualizadas mediante (a) tinción con plata; (b) transferencia de Western anti-Els o (c) transferencia de GNA. Els expresada en Vaccinia, purificada como se describe en Maertens y colaboradores (PCT/EP95/03031 ) se incluyó como referencia.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención descrita en la presente hace referencia al trabajo previamente publicado y a solicitudes de patente pendientes. A manera de ejemplo, tal trabajo consiste de documentos científicos, patentes o solicitudes de patente pendientes. Todas estas solicitudes y publicaciones, citadas previamente o más adelante son incorporadas por referencia en la presente . La presente invención se refiere a las proteínas de HCV con conformaciones específicas. Por primera vez las proteínas de HCV con una conformación pseudo-nativa son generadas, en particular la proteína Els del HCV. Se encontró que los enlaces específicos de cisteína, involucrados en la conformación de estas proteínas de HCV, eran importantes. A manera de ejemplo, se describe un nuevo e inventivo protocolo de purificación que hace posible purificar las proteínas de HCV con una conformación pseudo-nativa. Estas nuevas proteínas de HCV son capaces no solamente de presentar epítopes conformacionales sino también de mostrar actividad biológica. Estas nuevas proteínas de HCV pueden ser utilizadas para diversos estudios, tales como, por ejemplo, estudios sobre selección de fármacos, actividades biológicas, vías de transducción de señales, procesamiento intra- y extracelular, interacciones y enlace entre las moléculas de HCV y/o no-HCV, oligomerización, epítopes conformacionales, selección de anticuerpos, metabolismo y actividad enzimática, inmunorreactividad. Aparentemente, estos estudios pueden ser colocados en un contexto para una aplicación eventualmente diagnóstica y/o terapéutica. La presente invención está basada en el hallazgo de que las proteínas de HCV tienen conformaciones pseudo-nativas, específicas y actividad biológica, debido al estado redox reversible de los residuos de cisteinilo. La presente invención pertenece por lo tanto a una proteína de HCV, o cualquier parte funcionalmente equivalente de la misma, que comprende un aminoácido Cys, que tiene un estado redox reversible. En particular, La presente invención pertenece a una proteína de HCV, la cual comprende al menos dos aminoácidos Cys con un estado redox reversible. Los últimos aminoácidos Cys pueden estar separados por otros aminoácidos. Preferentemente, dichos aminoácidos Cys están comprendidos en la secuencia de aminoácidos Cys-X?-X2-Cys, en la cual el aminoácido Xi denota cualquier aminoácido, y el aminoácido X2 denota cualquier aminoácido. Más preferentemente, el aminoácido Xi denota ya sea el aminoácido Val, Leu o lie, y el aminoácido X2 denota el aminoácido Pro.

HCV A este respecto, la presente invención se refiere a HCV, y a otros miembros del género Flaviviridae, tales como, por ejemplo, el virus de la Hepatitis G, virus del Dengue, Virus de la Fiebre Amarilla. De este modo, el término "HCV" contempla todos los miembros del género Flaviviridae .

PROTEÍNA El término "proteína" como se utiliza en la presente, se refiere a una proteína de HCV, o cualquier parte funcionalmente equivalente de la misma, que contiene en su secuencia de aminoácidos al menos una cisteína, el estado redox de la cual es variable (ver más adelante) . También, los "dominios" de la proteína que contienen al menos una cisteína en su secuencia de aminoácidos son contemplados en el término "proteína" . El término "parte funcionalmente equivalente del mismo" como se utiliza en la presente se refiere a una parte o fragmento de la proteína de HCV que contiene en su secuencia de aminoácidos al menos una cisteína, el estado redox de la cual es variable. En particular los términos "proteína" y "parte funcionalmente equivalente de la misma" se refieren a las proteínas de HCV y fragmentos de la misma que comprenden un centro activo redox, tal como, por ejemplo, la proteína El del HCV. Más particularmente, la presente invención se refiere a la Els de HCV y a Elp de HCV. A este respecto, el término "centro activo redox" como se utiliza en la presente, da a entender una porción de proteína con la secuencia de consenso CXXC. El término "un péptido" se refiere a un polímero de aminoácidos (aa's) derivado de las proteínas de HCV conocidas (Linnen y colaboradores, 1996; Maertens y Stuyver, 1997) . El término "El de HCV" es una proteína bien conocida por una persona de experiencia en la técnica (Wengler, 1991) . El de HCV, junto con la E2 de HCV, que fue previamente llamada proteína 1 no estructural (NS1) o E2/NS1, constituyen la región de envoltura del HCV.

Els de HCV (192 -326) YEVR VSGMY HVTNDCSNSS IVYEAADMIM HTPGCVPCVR ENNSSRCWVA LTPTLAARNA SVPTTTIRRH VDLLVGAAAF CSAMYVGDLC GSVFLVSQLF TISPRRHETV QDCNCSIYPG HITGHRMAWD MMMN Elp de HCV (192 -237) YEVRNVSGMY HVTNDCSNSS IVYEAADMIM HTPGCVPCVR ENSR El término "péptido" se refiere a un polímero de aminoácidos y no se refiere a una longitud específica del producto. El término "péptido", "polipéptido", "poliproteína" y "proteína" son de este modo incluidos dentro de la definición de "péptido", y son utilizados intercambiablemente en la presente. El término "péptido" no se refiere a o excluye las modificaciones post-expresión del péptido, por ejemplo, glucosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones, y similares. Incluidos dentro de la definición de péptido están, por ejemplo, los polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, PNA (Nielsen y colaboradores, 1991, 1993), etc.), los péptidos con enlaces sustituidos, así como otras modificaciones conocidas dentro de la técnica, de origen natural y de origen no natural. Por lo tanto, los péptidos pueden ser lineales o circulares o constreñidos (ciclisados o estabilizados por puentes "S-S", diferentes a aquellos de acuerdo a la presente invención) , que consisten de D- y L-aminoácidos; los péptidos pueden ser multiméricos, ramificados, presentados sobre fagos o inmovilizados covalente o no covalentemente sobre polímeros de diferente naturaleza, tales como, por ejemplo, polímeros orgánicos, lipidíeos, carbohidratos, proteínas y ácidos nucleicos; o los péptidos pueden estar presentes en forma de un andamio. Se debe entender de este modo que los peptidomiméticos o los mimótopos son inherentes en los términos "polipéptidos", "péptidos" y "proteínas". La inmovilización sobre polímeros puede ser realizada por residuos del péptido de HCV mismo o por el péptido de HCV fusionado o acoplado a otras moléculas, tales como, por ejemplo por medio de una etiqueta de his (Dietrich y colaboradores, 1996) o quelantes lipidíeos (Dietrich y colaboradores, 1995) . El término "mimótopos" se refiere a los polipéptidos que imitan a los polipéptidos como se definen en la presente, inmunológicamente. Ya que la variabilidad secuencial ha sido observada para HCV, puede ser deseable el variar uno o más aminoácidos para imitar mejor los epítopes de diferentes cepas. Se debe entender que tales mimótopos no necesitan ser idénticos a cualquier secuencia de HCV particular, siempre y cuando los compuestos objetivo sean capaces de proporcionar la competencia inmunológica con al menos una cepa de HCV. El término "peptidomiméticos" se refiere a las moléculas que no necesitan estar compuestas únicamente de aminoácidos, sino que imitan los polipéptidos como se definen en la presente, inmunológicamente. La presente invención se refiere específicamente a los péptidos preparados mediante síntesis química clásica. La síntesis puede ser llevada a cabo en solución homogénea o sobre fase sólida. Por ejemplo, la técnica de síntesis en solución homogénea, que puede ser utilizada, es una descrita por Houbenweyl (1974) . Los péptidos de la siguiente invención pueden también ser preparados mediante fase sólida de acuerdo a los métodos descritos por Atherton y Shepard (1989) . Además, los péptidos de HCV, los peptidomiméticos, y los mimótopos sintetizados por tecnología de dendrímeros (Zhang y Tam, 1997), policétidos (Carreras y Santi, 1998) o inteina (Southworth y colaboradores, 1999) son también incluidos en la presente invención. Los péptidos de acuerdo a la presente invención pueden también ser preparados por medio de técnicas de ADN recombinante, tal como se describe en Sambrook y colaboradores (1989) , en procariotes o eucariotes inferiores o superiores . El término "eucariote inferior" se refiere a las células huésped tales como levaduras, hongos y similares. Los eucariotes inferiores son en general (pero no necesariamente) unicelulares. El término "procariotes" se refiere a los huéspedes tales como E. coli, Lactobacillus , Lactococcus , Salmonella, Streptococcus , Bacillus subtilis o Streptomyces . También estos huéspedes son contemplados dentro de la presente invención. Los eucariotes inferiores preferidos son levaduras, particularmente especies dentro de Schi zosaccharomyces , Saccharomyces , Klui veromyces , Pichia (por ejemplo Pichia pastoris) , Hansenula (por ejemplo Hansenula polymorpha) , Schwani omyces , Schi zosaccharomyces , Yarowia, Zygosaccharomyces y similares. Saccharomyces cerevisiae, S. Carlsbergensis y K. Lactis son los huéspedes levaduras más comúnmente utilizadas, y son huéspedes fúngicos convenientes. El término "eucariote superior" se refiere a las células huéspedes derivadas de animales superiores, tales como mamíferos, reptiles, insectos y similares. Las células huéspedes de eucariotes superiores actualmente preferidas son derivadas de células de hámster chino (por ejemplo CHO) , de mono (por ejemplo células COS y Vero) , de riñon de hámster bebé (BHK) , de riñon de cerdo (PK15) , de riñon de conejo (RK13) , la línea celular de osteosarcoma humano 143 B, la línea de células humanas HeLa y las líneas celulares de hepatoma humano como Hep G2, y las líneas celulares de insecto (por ejemplo Spodoptera frugiperda) . Las células huésped pueden ser proporcionadas en suspensión o en cultivos en matraz, cultivo de tejidos, cultivo de órganos y similares. Alternativamente, las células huésped pueden también ser animales transgénicos. Las proteínas de acuerdo a la presente invención pueden también ser aisladas de huéspedes mamíferos, en particular ratones y primates, por ejemplo, humanos tales como no humanos .

Es bien conocido en la técnica que los aminoácidos pueden ser denotados por su nombre completo, abreviatura de tres letras, y símbolo de una sola letra (ver por ejemplo Stryer, 1981) . Además, la presente invención pertenece a una proteína de HCV o parte de la misma como se define anteriormente, la cual se enlaza específicamente a moléculas huéspedes intra- o intercelulares (moléculas derivadas del huésped) , tales como, por ejemplo, (i) proteínas receptoras, por ejemplo anexina V, apolipoproteína B, tubulina, proteína membranal plasmática de 24 kDa (Abrigan WO 97/09349) , receptor de mañosa, receptor de asialoglucoproteína; (ii) moléculas (compuestos proteicos o no proteicos) involucradas en la regulación redox, por ejemplo Glutatión, TRX y GRX; (iii) proteínas chaperonas, por ejemplo calnexina,- (iv) diversos glucosaminoglucanos (núcleo peptídico y/o de azúcar) ; (v) ácidos nucleicos o lípidos. Además, la presente invención pertenece a una proteína de HCV o parte de la misma como se define anteriormente, la cual se enlaza específicamente a otra proteína de HCV o a un ácido nucleico de HCV (moléculas derivadas de HCV) , o partes de las mismas, que dan como resultado complejos homo- y/o hetero-oligoméricos. Los complejos resultantes de las proteínas de HCV, o partes de las mismas, como se definen anteriormente, enlazadas a otras moléculas derivadas de HCV o moléculas derivadas del huésped son coloquialmente denotadas como "Complejo Derivado de HCV". De este modo, un "Complejo Derivado de HCV" consiste de al menos una proteína de HCV como se define anteriormente conectada a otra molécula, por ejemplo (proteína de HCV) -X, en la cual X es una molécula derivada del huésped o una molécula derivada de HCV.

PURO El término "purificada o purificado" como se aplica en la presente se refiere a una composición en donde los componentes deseados, tales como, por ejemplo, las proteínas de envoltura del HCV, comprenden al menos 35% de los componentes totales en la composición. Los componentes deseados comprenden preferentemente al menos aproximadamente 40%, preferentemente al menos aproximadamente 50%, todavía más preferentemente al menos aproximadamente 60%, todavía más preferentemente al menos aproximadamente 70%, aún más preferentemente al menos aproximadamente 80%, aún más preferentemente al menos aproximadamente 90%, aún más preferentemente al menos aproximadamente 95%, y lo más preferentemente al menos aproximadamente 98% de la fracción componente total de la composición. La composición puede contener otros compuestos, tales como, por ejemplo, carbohidratos, sales, lípidos, solventes y similares, sin afectar la determinación del porcentaje de pureza como se utiliza en la presente. Una proteína de HCV "aislada" da a entender una composición de proteínas de HCV que es al menos 35% pura. A este respecto, debe ser claro que el término "proteína de HCV purificada" como se utiliza en la presente, se refiere a las proteínas de HCV aisladas, en forma esencialmente pura. El término "proteínas de HCV esencialmente purificadas" como se utiliza en la presente se refiere a las proteínas de HCV tal que éstas pueden ser utilizados para métodos de diagnóstico in vi tro y para métodos terapéuticos. Estas proteínas de HCV están sustancialmente libres de proteínas celulares, proteínas de derivadas de vectores u otros componentes virales de HCV. Usualmente, estas proteínas son purificadas hasta la homogeneidad. Al menos 80% puras, preferentemente 85%, más preferentemente 90%, más preferentemente 95%, más preferentemente 97%, más preferentemente 98%, más preferentemente 99%, aún más preferentemente 99.5% y lo más preferentemente las proteínas contaminantes deben ser no detectables mediante métodos convencionales tales como SDS-PAGE y tinción con plata.

ANTICUERPOS La presente invención se refiere también a un anticuerpo para HCV, que puede reconocer un péptido de HCV como se describe anteriormente. Además, la presente invención se refiere a una proteína de HCV o una parte funcionalmente equivalente de la misma como se define anteriormente, para producir anticuerpos anti-HCV, que reconocen específicamente dicha proteína de HCV o una parte funcionalmente equivalente de la misma. El término un "anticuerpo de HCV" se refiere a un anticuerpo policlonal o monoclonal que se enlaza a una proteína de HCV de la presente invención o un complejo derivado de HCV. Además, el término "anticuerpos para HCV" también da a entender los anticuerpos específicos para HCV que son producidos contra epítopes que resultan de la conformación de las proteínas de HCV, debido a la presencia de puentes S-S en estas proteínas de HCV. Notablemente, dichos puentes S-S pueden ser una parte intrínseca del epítope. Pero el estado de óxido-reducción de las cisteínas (reducidas u oxidadas; en una forma tiolada o conjugada a S) puede cambiar o estabilizar la conformación de la proteína (en la cercanía o no de estos residuos de cisteína) que dan como resultado nuevos epítopes que pueden o no contener estos residuos de cisteína. Estos nuevos epítopes son también parte de la invención. Además, el término un "anticuerpo para HCV" se refiere también a cualquier anticuerpo policlonal o monoclonal que se enlaza a los minítopes, como se definen anteriormente. Además, el término "anticuerpo para HCV" pertenece de este modo también a los anticuerpos que se enlazan a los determinantes antigénicos que resultan de la conformación específica de los complejos derivados del HCV, por ejemplo, los anticuerpos que se enlazan a los determinantes antigénicos que no están presentes sobre el péptido de HCV de la presente invención o la molécula a la que se enlaza el péptido de HCV, tal como por ejemplo, los epítopes que encuentran su origen a partir de la interacción entre el péptido de HCV de la presente invención y los compuestos no proteicos como los glucosaminoglucanos (GAGs) , heparina, ácidos nucleicos, lípidos, cofactores como iones metálicos, y similares. Además, los determinantes antigénicos pueden ser formados mediante cambios conformacionales, tales como por ejemplo introducidos mediante el procesamiento de proteínas, escisión o cambios de pH.

El término "epítope" se refiere a aquella porción del complejo antígeno-anticuerpo que es enlazada específicamente por un sitio que se combina al anticuerpo. Los epítopes pueden ser determinados mediante cualquiera de las técnicas conocidas en la materia, o pueden ser predichos por una variedad de modelos de predicción por computadora conocidos en la técnica. Las expresiones "reconocimiento" , "enlace" o "formación de un complejo anticuerpo-proteína" como se utilizan en la presente se deben interpretar como aquel enlace, por ejemplo, la interacción, entre el antígeno y el anticuerpo que ocurre bajo todas las condiciones que respetan las propiedades inmunológicas del anticuerpo y del antígeno. Además, existen otros diversos procedimientos conocidos para producir los péptidos de HCV que difieren del procedimiento de la presente invención. Este y otros procedimientos pueden dar como resultado los péptidos de HCV capaces de presentar epítopes. Es concebible que los péptidos de HCV, obtenidos mediante estos diversos y diferentes procedimientos, sean capaces de presentar epítopes similares a los epítopes de la presente invención. De este modo, epítopes similares son epítopes que resultan de procedimientos de producción o purificación diferentes a los de la presente invención, pero reconocibles mediante cualquiera y el mismo anticuerpo. No obstante, las proteínas de la presente invención presentan epítopes extremadamente eficientes. En consecuencia, los epítopes sobre las proteínas son más inmunogénicos. Por lo tanto, la presente invención también pertenece a los epítopes sobre las proteínas, dichos epítopes son al menos 10 veces, preferentemente al menos 20 veces, preferentemente al menos 50 veces, preferentemente al menos 100 veces, preferentemente al menos 500 veces, y lo más preferentemente 1000 veces más inmunogénicos que los epítopes sobre los péptidos de HCV, que no son producidos de acuerdo a la presente invención, y que no tienen residuos de cisteinilo con un estado redox reversible. Será apreciado por aquellos expertos en la técnica que la inmunogenicidad puede, por ejemplo, ser detectada y por lo tanto comparada mediante inmunización de mamíferos por medio de la administración de cantidades comparables de los péptidos, producidos mediante cualquier método. Más particularmente, el término "anticuerpo para HCV" se refiere a un anticuerpo que se enlaza a las proteínas de HCV naturales, recombinantes o sintéticas. En particular que se enlazan a las proteínas El, Els, Elp y/o NS3 recombinantes o sintéticas derivadas de HCV, o cualquier variante funcionalmente equivalente o parte de las mismas (anticuerpo anti-HCV-El- , anti-HCV-Els- , anti-HCV-Elp, o HCV-NS3-, respectivamente). El anticuerpo para HCV puede estar presente en una muestra de fluido corporal, y puede ser un anticuerpo para HCV-E1, anticuerpo para HCV-Els, anticuerpo para HCV-Elp o anticuerpo para HCV-NS3. El término "anticuerpo monoclonal" utilizado en la presente se refiere a una composición de anticuerpo que tiene una población homogénea de anticuerpos. El término no es limitante respecto a la especie o a la fuente del anticuerpo, y tampoco se pretende que esté limitada por la manera en la cual éste es elaborado. Por lo tanto, el término "anticuerpo" contempla también los anticuerpos derivados de camellos (Árabes y Bactrianos) , o del género llama. De este modo, el término "anticuerpo" también se refiere a los anticuerpos derivados de programas de tecnología de representación visual de fagos o de selección de fármacos . Además, el término "anticuerpo" también se refiere a los anticuerpos humanizados en los cuales al menos una porción de las regiones estructurales de una inmunoglobulina son derivadas de secuencias de inmunoglobulina humana y anticuerpos de cadena simple como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 4,946,778 y a los fragmentos de anticuerpo tales como Fab F'(ab)2, Fv, y otros fragmentos que conservan la función de enlace al antígeno y la especificidad del anticuerpo progenitor. El término "anticuerpo" también se refiere a los diacuerpos, triacuerpos, o anticuerpos multiméricos (mono-, bi-, tetra- o polivalentes/mono-, bi- o 5 poliespecífieos) , así como a los enzicuerpos, por ejemplo, anticuerpos artificiales con actividad enzimática. Las combinaciones de anticuerpos con cualquier otra molécula que incremente la afinidad o la especificidad, son también contemplados dentro del término "anticuerpos" . Los 10 anticuerpos también incluyen formas modificadas (por ejemplo, la forma mPEGilada o polisialilada (Fernandes y Gregoriadis, 1997) así como las formas covalente o no covalentemente enlazadas al polímero. Además, el término "anticuerpo" también pertenece 15 a los compuestos que imitan los anticuerpos de cualquier naturaleza, tales como por ejemplo, derivados de lípidos, carbohidratos, ácidos nucleicos o análogos, por ejemplo, PNA, aptámeros (ver Jayasena, 1999) . Los anticuerpos para HCV pueden ser inducidos mediante vacunación o pueden ser 20 pasivamente transferidos mediante inyección después que los anticuerpos han sido purificados a partir de combinados de la sangre infectada por HCV, o provenientes de sangre obtenida de vacunados con HCV. La presente invención se refiere también a un 25 equipo que comprende los anticuerpos para HCV, para •**'•'--'—*>jt' detectar los péptidos de HCV como se definen en la presente .

PROCEDIMIENTO DE PURIFICACIÓN La invención pertenece además a un procedimiento de purificación como se describe en la presente, que da como resultado las proteínas de HCV de las cuales al menos un residuo de cesteinilo tiene un estado redox reversible, así como las proteínas de HCV obtenibles mediante dicho procedimiento de purificación. Durante la purificación al menos los residuos de cisteína son reversiblemente protegidos por medios químicos y/o enzimáticos (ver también la sección de Ejemplos) . A este respecto, el término "estado redox reversible" como se utiliza en la presente, se refiere al azufre de los residuos de cisteína que tiene la habilidad para cambiar del estado reducido al estado oxidado y viceversa. Este cambio en el estado redox involucra la transferencia de electrones. El término "actividad de óxido-reductasa" como se utiliza en la presente se refiere al potencial redox del centro activo redox, y de este modo a su habilidad para transferir electrones desde y hacia las moléculas de sustrato. Esta habilidad es dependiente del 4 » S. i potencial redox de las moléculas de sustrato y del ambiente químico. Las proteínas de HCV nativas tienen una conformación específica y pueden mostrar actividad biológica. El procedimiento de purificación de la presente invención da como resultado proteínas de HCV purificadas, con una actividad biológica y/o conformación que es idéntica a o casi idéntica (pseudo-nativa) a la actividad biológica nativa y/o a la conformación de las proteínas de HCV. El procedimiento de purificación de la presente invención está caracterizado por lo siguiente: -A- La primera fase en el procedimiento de purificación de la presente invención se pretende que proteja reversiblemente la reactividad de los residuos de cisteína. En esencia, la primera fase consiste del procedimiento como se describe extensamente en la solicitud PCT EP95/03031 a Maertens y colaboradores, pero por una diferencia fundamental, en particular, los residuos de cisteína están reversiblemente protegidos. La protección reversible de los residuos de cisteína puede ser lograda mediante una de las siguientes condiciones (i) un grupo de modificación, o mediante (ii) la estabilización de los tioles y/o puentes disulfuro. En efecto, esta protección estabiliza la proteína de HCV, por ejemplo, los tioles y/o los puentes disulfuro no tienen tendencia a reaccionar. Por lo tanto, la primera fase da como resultado tarde o temprano un producto puro con cisteínas reversiblemente protegidas; -B- La segunda fase en el procedimiento de purificación de la presente invención se pretende que restaure la actividad de los residuos de cisteína. La condición en la cual los residuos de cisteína son reversiblemente protegidos, es eliminada, después de la primera fase del procedimiento de purificación. Esta eliminación hace posible la restauración del estado redox reversible de los residuos de cisteína. De este modo, es obtenido finalmente un péptido de HCV, o cualquier parte funcionalmente equivalente del mismo, en el cual los residuos de cisteína tienen un estado redox reversible. El estado redox reversible permite proteínas de HCV reactivas con actividad biológica y/o con una conformación pseudo-nativa.

Por lo tanto, la presente invención pertenece a un proteína de HCV, o cualquier parte funcionalmente equivalente de la misma, que comprende al menos dos residuos de aminoácidos Cys, que tienen un estado redox reversible, como se define anteriormente, obtenible mediante el siguiente proceso: (a) la purificación de una proteína de HCV, o cualquier parte funcionalmente equivalente de la misma, en la cual, los residuos de cisteína están reversiblemente protegidos por medios químicos y/o enzimáticos, (b) la eliminación del estado de protección reversible de los residuos de cisteína, (c) la obtención de una proteína de HCV, o cualquier parte funcionalmente equivalente de la misma, en la cual los residuos de cisteína tienen un estado redox reversible . De este modo, la presente invención pertenece también al último proceso. Opcionalmente, los cofactores y antioxidantes son agregados para ayudar a la estabilización de la proteína. Se debe entender que el propósito de la protección reversible es estabilizar la proteína de HCV. Especialmente, después de la protección reversible, el grupo funcional que contiene azufre (por ejemplo, tioles y disulfuros) es retenido en una condición no reactiva. El grupo funcional que contiene azufre es de este modo incapaz de reaccionar con otros compuestos, por ejemplo, no tiene tendencia a la formación o intercambio de puentes disulfuro, tales como por ejemplo RiSH + R2-SH -x-> R?-S-S-R2; RiS-S-Rs + R3-SH -x-> R1-S-S-R3 + R2-SH; R1S-S-R2 + R3-S-S-R4 -x-> R1-S-S-R3 + R2-S-S-R4.

Las reacciones descritas entre los residuos de tiol y/o disulfuro no están limitadas a los procesos intermoleculares, sino pueden también ocurrir intramolecularmente . El término "protección reversible" como se utiliza en la presente contempla el enlace covalente de los agentes de modificación al residuo de cisteína, así como la manipulación del ambiente de la proteína de HCV, tal que el estado redox de los grupos tiol permanece no afectado a todo lo largo de los pasos siguientes del procedimiento de purificación (protección) . La proteína reversible de los residuos de cisteína puede ser llevada a cabo química o enzimáticamente . El término "protección reversible por medios enzimáticos" como se utiliza en la presente contempla la protección reversible mediada por enzimas, tales como por ejemplo, las acil-transferasas, por ejemplo, acil-transferasas que están involucradas en la catálisis de la tio-esterificación, tales como la palmitoil-aciltransferasa (ver más adelante y Das y colaboradores, 1997) . El término "protección reversible por medios químicos" como se utiliza en la presente contempla la protección reversible: (1) por agentes de modificación que modifican reversiblemente los grupos cisteinilo, tales como por ejemplo, mediante sulfonación y tio-esterificación; La sulfonación es una reacción donde el tiol o la cisteína involucrados en los puentes disulfuro son modificados a S-sulfonato; RSH - RS-S03" (André Darbre) o RS-SR ? 2 RS-S03 (sulfitolisis; Kumar et al, 1986) . Los reactivos para la sulfonación, son por ejemplo, Na2S03 o tetrationato de sodio. Los últimos reactivos para la sulfonación son utilizados en una concentración de 10 - 200 mM, y más preferentemente en una concentración de 50 - 200 mM. Opcionalmente, la sulfonación puede ser realizada en presencia de un catalizador tal como, por ejemplo, Cu2+ (100 µM - 1 M) o cisteína (1 - 10 mM) . La reacción puede ser realizada bajo desnaturalización de proteínas, así como condiciones nativas (Kumar y colaboradores, 1985; Kumar y colaboradores, 1986) . La formación del enlace tioéster o la tioesterificación está caracterizada por: RSH + R'COX -» RS-COR' En la cual X es preferentemente un halogenuro en el compuesto R'CO-X. (2) por agentes de modificación que modifican reversiblemente los cisteinilos de la presente invención tales como, por ejemplo, por metales pesados, en particular Zn2+, Cd2+ (Matts y colaboradores, 1991) , compuestos de mono-, ditio- y disulfuro (por ejemplo, aril- y alquilmetantiosulfonato, ditiopiridina, ditiomorfolina, dihidrolipoamida, reactivo de Ellmann, Aldrothiol" (Aldrich) (Rein y colaboradores, 1996) , ditiocarbamatos) , o agentes de tiolación (por ejemplo, glutatión, N-acetilcisteína, cisteína ina) . El ditiocarbamato comprende una clase amplia de moléculas que poseen un grupo funcional R?R2NC(S) SR3, que les da la habilidad para reaccionar con grupos sulfhidrilo. Los compuestos que contienen tiol son preferentemente utilizados en una concentración de 0.1 - 50 mM, más preferentemente en una concentración de 1 - 50 mM; y aún más preferentemente en una concentración de 10 - 50 mM; (3) por la presencia de los agentes de modificación que preservan el estado del tiol (estabilizan) en particular, antioxidantes, tales como por ejemplo DTT, dihidroascorbato, vitaminas y derivados, manitol, aminoácidos, péptidos y derivados (por ejemplo, histidina, ergotioneina, carnosina, metionina) , galatos, hidroxianisol, hidroxitolueno, hidroquinona, hidroximetilfenol y sus derivados en un intervalo de concentración de 10 µM - 10 M, más preferentemente en una concentración de 1 - 10 mM; (4) mediante las condiciones de estabilización de tiol tales como por ejemplo, (i) cofactores como iones metálicos (Zn2+, Mg2+) , ATP, (ii) control del pH (por ejemplo, para proteínas en la mayoría de los casos pH aproximadamente de 5 o el pH es preferentemente el pKa -2 del tiol; por ejemplo para los péptidos purificados mediante Cromatografía de Fase Inversa a pH aproximadamente de 2) . Las combinaciones de protección reversible como se describen en (1), (2), (3) y (4) pueden dar como resultado proteínas de HCV similarmente puras y replegadas. En efecto, pueden ser utilizados compuestos en combinación, tales como, por ejemplo, Z103 (carnosina de zinc) , preferentemente en una concentración de 1 - 10 mM. Debe ser claro que la protección reversible también se refiere a, además de los grupos de modificación o la protección descritos anteriormente, cualquier método de protección de cisteinilo que puede ser revertido enzimática o químicamente, sin perturbar la cadena principal peptídica. A este respecto, la presente invención se refiere específicamente a los péptidos preparados mediante síntesis química clásica (ver arriba) , en la cual, por ejemplo, los enlaces tioéster son escindidos por la tioesterasa, condiciones de amortiguador básico (Beekman y colaboradores, 1997) o mediante tratamiento con hidroxilamina (Vingerhoeds y colaboradores, 1996) . Las proteínas de HCV que contienen tiol pueden ser purificadas, por ejemplo, sobre resinas de cromatografía de afinidad que contienen (1) un brazo conectador escindible que contiene un enlace disulfuro (por ejemplo, 5, 5' -ditobis (2-ácido nitrobenzoico) inmobilizado (Jayabaskaran y colaboradores, 1987) y cromatografía covalente sobre tio-sefarosa 4B activada (Pharmacia) o (2) una aminohexanoil -4 -aminofenilarsina como ligando inmovilizado. La última matriz de afinidad ha sido utilizada para la purificación de proteínas que están sujetas a regulación redox y proteínas de ditiol que son objetivos para la tensión oxidativa (Kalef y colaboradores, 1993) . La protección reversible puede también ser utilizada para incrementar las solubilización y extracción de los péptidos (Pomroy y Deber, 1998) . La protección reversible y los compuestos de estabilización de tiol pueden ser presentados bajo una forma monomérica, polimérica o liposómica. La eliminación del estado de protección reversible de los residuos de cisteína puede ser química o enzimáticamente lograda, por ejemplo, mediante: un reductor, en particular DDT, DTE, 2-mercaptoetanol, ditionito, SnCl2, borohidruro de sodio, hidroxilamina, TCEC, en particular en una concentración de 1 - 200 mM, más preferentemente en una concentración de 50 - 200 mM; - eliminación de las condiciones o de los agentes de estabilización del tiol, por ejemplo mediante incremento del pH; enzimas, en particular tioesterasas, glutarredoxina, tiorredoxina, en particular en una concentración de 0.01 -5 µM, aún más particularmente en una concentración de 0.1 a 5 µ ; combinaciones de las condiciones químicas y/o enzimáticas anteriormente descritas. La eliminación del estado de protección reversible de los residuos de cisteína, puede ser llevada a cabo in vi tro o in vivo, en una célula o en un individuo. Se apreciará que después de la segunda fase del procedimiento de purificación, los residuos de cisteína pueden o no ser irreversiblemente bloqueados, o reemplazados por cualquier agente de modificación reversible, como se listaron anteriormente. Un reductor de acuerdo a la presente invención es cualquier agente que logra la reducción del azufre en los residuos de cisteína, por ejemplo, los puentes disulfuro "S-S", la desulfonación del residuo de cisteína (RS-S03~ -> RSH) . Un antioxidante es cualquier reactivo que preserva el estado tiol o minimiza la formación de "S-S" y/o los intercambios del mismo. La reducción de los puentes disulfuro "S-S" es una reacción química mediante la cual los disulfuros son reducidos al tiol (-SH) . Los métodos y agentes del rompimiento del puente disulfuro descritos en WO96/04385 son incorporados por referencia en la siguiente descripción. La reducción "S-S" puede ser obtenida mediante (1) las vías de la cascada enzimática o mediante (2) la reducción de los compuestos. Las enzimas como tiorredoxina, glutarredoxina son conocidas por estar involucradas en la reducción in vivo de los disulfuros, y se ha mostrado que son efectivas en la reducción de los puentes "S-S" in vi tro. Los enlaces disulfuro son rápidamente escindidos mediante la tiorredoxina reducida a pH 7.0, con una velocidad de segundo orden aparente que es alrededor de 104 veces mayor que la constante de velocidad correspondiente para la reacción con DTT. La cinética de reducción puede ser dramáticamente incrementada mediante la preincubación de la solución de proteína con DTT 1 mM o dihidrolipoamida (Holmgren, 1979) . Los compuestos tiol capaces de reducir los puentes disulfuro de las proteínas son por ejemplo ditiotreitol (DTT) , ditioeritritol (DTE) , 3-mercaptoetanol, tiocarbamatos, bis (2-mercaptoetil) sulfona, y N,N' -bis (mercaptoacetil) hidrazina, y ditionito de sodio. Los agentes reductores sin grupos tiol como ascorbato y cloruro estannoso (SnCl2) , que han mostrado que son muy útiles en la reducción de los puentes disulfuro en los anticuerpos monoclonales (Thakur et al., 1991), pueden también ser utilizados para la reducción de las proteínas de HCV. Además, los cambios en los valores de pH pueden influenciar el estado redox de las proteínas de HCV. El tratamiento con borohidruro de sodio ha mostrado que es efectivo para la reducción de los puentes disulfuro en los péptidos (Gailit, 1993). La tris- (2-carboxietil) fosfina (TCEP) es capaz de reducir los disulfuros a bajo pH (Burns et al., 1991). El selenol cataliza la reducción del disulfuro a los tioles cuando se utiliza DTT o borohidruro de sodio como reductor. La selenocisteamina, un diseleniuro comercialmente disponible, se utilizó como precursor del catalizador (Singh y Kats, 1995) . Se enfatiza nuevamente que el contenido completo, incluyendo todas las definiciones de los documentos citados anteriormente, son incorporados por referencia en la presente solicitud. Por lo tanto, los métodos y compuestos anteriormente mencionados para mostrar el estado redox de las proteínas de HCV son todos contemplados en la presente invención.

SITIO BIO-ACTIVO La presente invención pertenece además a las proteínas de HCV que contienen una porción CXXC biológicamente activa. Los términos "biológicamente activa" y "actividad de óxido-reductasa" como se utilizan en la presente contemplan un sitio CXXC en un péptido de HCV, o una parte funcionalmente equivalente del mismo, con un estado redox reversible, que tiene la habilidad para mediar diversas funciones bioquímicas y biológicas intra- y extracelulares, tales como, por ejemplo, reacciones de intercambio tiol/disulfuro, enlace de los metales de transición, incorporación de lípidos y actividades reguladoras (por ejemplo, control de la transcripción de genes, regulación de la transducción de señales, incluyendo el funcionamiento como una citocina, y similares, y el control del estado de (des) tiolación de las proteínas). Los cambios estructurales o conformacionales efectuados por el estado redox del cisteinilo pueden ser seguidos por métodos biofísicos, tales como por ejemplo mediante espectrofotometría (absorbancia, Dicroismo Circular, infrarrojo, fluorescencia, RMN) , o con métodos inmunoquímicos (por ejemplo ELISA, EIA, y similares) , que están basados en la aparición o desaparición de epítopes. Las secuencias involucradas en los epítopes pueden ser identificadas mediante espectroscopia de masa (MS) y secuenciamiento después de la reticulación y purificación por afinidad del complejo. Los epítopes lineales conformacionales o detectables nuevos pueden resultar de los procesos de plegamiento a nivel de la estructura terciaria o cuaternaria. La incorporación de iones metálicos en el sitio activo puede ser medida mediante mediciones de decaimiento radioactivo o espectometría de absorbancia atómica. El enlace de las proteínas de HCV de la presente invención a otras moléculas, tales como por ejemplo receptores, carbohidratos, lípidos, ácidos nucleicos (ver también arriba) puede ser estudiado por ejemplo mediante FACS, Biacore, ensayos inmunológicos (transferencia de Western, EIA, ELISA, y similares) , métodos cromatográficos y de reticulación (por ejemplo, cromatografía de afinidad, filtración en gel) . La actividad enzimática de la tiorredoxina de las proteínas de HCV puede ser identificada mediante el estudio del potencial para reducir los puentes disulfuro de acuerdo al método como se describe por Holmgren et al. (1979). El efecto de los cofactores tales como DTT o dihidrolipoamida, puede ser verificado en este método también. Los compuestos no proteicos (por ejemplo el reactivo de Ell ann, aldrotiol) así como las proteínas (por ejemplo insulina agregada) pueden ser tomados como sustratos. La formación de los disulfuros mixtos (ver más adelante) , es una actividad que está relacionada al plegamiento de las proteínas, y a la restauración del sitio activo. La formación de los disulfuros mixtos puede ser demostrada mediante protección reversible o bloqueo irreversible de los grupos tiol antes y después del tratamiento con reductor con diferentes agentes (por ejemplo, DTT) , tal como se describe en el "procedimiento de purificación", seguido por el análisis de espectrometría de masa. La pKa de los grupos tiol en la proteína que contiene CXXC es definida por el tratamiento con los agentes de alquilación en función del pH (titulación) . La protección diferencial y/o el bloqueo de los residuos y la MS dan información del residuo de cisteinilo que inicia la reacción, en el sitio CXXC. El secuenciamiento de aminoácidos amino-terminal puede dar información respecto al procesamiento, los productos de escisión y la estructura del dominio de la proteína de HCV. La distribución tisular e intracelular de estos productos de escisión es localizada mediante métodos inmunohistoquímicos .

VACUNA La presente invención también se refiere a una composición que comprende una proteína como se describe anteriormente. Más particularmente, la presente invención se refiere a una composición de vacuna. El término "composición de vacuna" se refiere a una composición inmunogénica capaz de promover protección contra el HCV, ya sea parcial o completa. Esta incluye por lo tanto los péptidos, las proteínas, polinucleótidos, las moléculas derivadas de HCV o las partículas derivadas de HCV, como se definen anteriormente. La protección contra HCV se refiere en particular a los humanos, pero se refiere también a los primates no humanos, el ratón trímera (Zauberman et al., 1999), u otros mamíferos. Las proteínas de la presente invención pueden ser utilizadas como tales, en una forma biotinilada (como se explica en WO93/18054) y/o formadas en complejo a Neutrali te Avidin (Molecular Probes Inc., Eugene, OR, EUA). Se debe notar también que una "composición de vacuna" comprende, además de una sustancia activa, un excipiente, diluyente, portador y/o adyuvante adecuado, los cuales, por sí mismos, no inducen la producción de anticuerpos dañinos para el individuo que recibe la composición, ni tampoco promueven protección. Los portadores adecuados son típicamente moléculas grandes lentamente metabolizadas tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y partículas virales inactivas. Tales portadores son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Los adyuvantes preferidos para aumentar la efectividad de la composición incluyen, pero no están limitados a: hidróxido de hierro coloidal (Leibl et al., 1999) , hidróxido de aluminio, aluminio en combinación con el monofosforil-lípido A 3-O-desacilado, como se describe en el docuemnto WO93/19780, fosfato de aluminio como se describe en el documento W093/24148, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 4,606,918, N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina, N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutamil-L-alanin-2- (1 ' 2 ' -dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxi-fosforiloxi) etilamina y RIBI (ImmunoChem Research Inc., Hamilton, MT, EUA) que contiene monofosforil-lípido A, endotoxina destoxificada, trehalosa-6, 6-dimicolato, y esqueleto de la pared celular (MPL + TDM + CWS) en una emulsión al 2% de escualeno/T een 80. Cualquiera de los tres componentes MPL, TDM o CWS pueden también ser utilizados solos o combinados 2 por 2. Adicionalmente, los adyuvantes tales como Stimulon (Cambridge Bioscience, Worcester, MA, EUA) o SAF-1 (Syntex) pueden ser utilizados, así como los adyuvantes tales como las combinaciones entre QS21 y monofosforil-lípido A 3-des-0-acetilado (WO94/00153) , o MF-59 (Chiron) , o adyuvantes basados en poli [di (carboxilatofenoxi) -fosfazeno] (Virus Research 5 Institute) , o adyuvantes basados en copolímero en bloque como Optivax (Vaxcel, Cythx) o adyuvantes basados en inulina, tales como Algammulin y Gammalnulin (Anutech) , Adyuvante Incompleto de Freund (IFA) o preparaciones de Gerbu (Gerbu Biotechnik) . Se debe entender que el 10 Adyuvante Completo de Freund (CFA) puede ser utilizado para aplicaciones no humanas y para fines de investigación también. Una "composición de vacuna" contendrá además excipientes y diluyentes, los cuales son inherentemente no tóxicos y no terapéuticos, tales como agua, solución 15 salina, glicerol, etanol, agentes humectantes o emulsificantes, sustancias amortiguadoras del pH, conservadores, y similares. La modificación reversible de los residuos de cisteinilo de los péptidos de HCV de la presente invención, permite que estos péptidos HCV puedan 20 ser acoplados covalentemente a una molécula portadora químicamente activa, tal como, por ejemplo, polímeros o liposomas, o que el péptido HCV mismo funcione como portador para enlazarse a otras proteínas inmunogénicas relacionadas al HCV o no relacionadas al HCV (vacunas 25 mixtas) . Los péptidos de HCV ligados a los liposomas por •'_f__*- * " -"-*- un enlace tioéster tienen la ventaja de que los enlaces son rotos in vivo por las tioesterasas del huésped, dando como resultado una liberación y presentación lenta del antígeno. La incorporación o el enlace del péptido HCV al polímero o 5 al liposoma puede también estar basado en las interacciones no covalentes, explotando la afinidad entre los ligandos. Típicamente, se prepara una composición de vacuna como una solución inyectable, ya sea como una solución o suspensión líquida. Las formas sólidas, adecuadas para la 10 solución, o suspensión en, vehículos líquidos antes de la invención, pueden también ser preparadas. La preparación puede también ser emulsificada o encapsulada en liposomas para aumentar el efecto adyuvante. Los polipéptidos pueden también ser incorporados en Complejos Estimuladores de la 15 Respuesta Inmune junto con saponinas, por ejemplo, Quil A (ISCOMS) . Las composiciones de vacuna comprenden una cantidad inmunológicamente efectiva de los polipéptidos de la presente invención, así como cualesquiera otros componentes anteriormente mencionados. "Cantidad 20 inmunológicamente efectiva" significa que la administración de esta cantidad a un individuo, ya sea en una dosis simple o como parte de una serie, es efectiva para la prevención o el tratamiento. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y de la condición física del individuo que va a ser 25 tratado, del grupo taxonómico del individuo que va a ser afilitíU. tratado (por ejemplo, humano, primate no humano, primate, etc . ) , la capacidad del sistema inmune del individuo para montar una respuesta inmune efectiva, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la 5 evaluación del médico que trata, la cepa del HCV infeccioso y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad caerá en un intervalo relativamente amplio que puede ser determinado a través de pruebas rutinarias. Usualmente, la cantidad variará desde 0.01 hasta 1000 µg/dosis, más 10 particularmente de 0.1 a 100 µg/dosis. Las composiciones de vacuna son convencionalmente administradas parenteralmente, típicamente mediante inyección, por ejemplo, subcutánea o intramuscular. Las formulaciones adicionales adecuadas para otros métodos de administración 15 incluyen formulaciones orales y supositorios. El tratamiento de dosificación puede ser un esquema de dosis simple o un esquema de dosis múltiples. La vacuna puede ser administrada en conjunto con otros agentes inmunorreguladores . 20 Vacuna de ADN El ambiente intracelular de un huésped o anfitrión puede proporcionar la base para el estado redox 25 reversible de las proteínas de HCV de la presente ?if,Ji" j»*»-g invención. A este respecto, se debe ser claro que una composición de vacuna de ADN de HCV comprende un vector plasmídico que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica para una proteína de HCV como se describe anteriormente, operablemente enlazada a los elementos reguladores de la transcripción. Como se utiliza en la presente, un "vector plasmídico" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual éste ha sido enlazado. Los vectores preferidos son aquellos capaces de realizar la replicación y/o expresión autónoma de los ácidos nucleicos a los cuales éstos han sido enlazados. En general, pero no limitados a éstos, los vectores plasmídicos son rizos de ADN circulares de doble hebra los cuales, en su forma de vector, no se enlazan al cromosoma. Como se utiliza en la presente, una "secuencia polinucleotídica" se refiere a los polinucleótidos tales como el ácido desoxirribonucleico (ADN) , y, donde sea apropiado al ácido ribonucleico (ARN) . El término debe también ser comprendido como que incluye, como equivalentes, análogos ya sea de ARN o de ADN elaborados a partir de los análogos nucleotídicos, y polinucleótidos de una sola hebra (en sentido o antisentido) y de doble hebra. Como se utiliza en la presente, el término "elementos reguladores de la transcripción" se refiere a una secuencia nucleotídica que contiene elementos reguladores esenciales, tales que después de la introducción dentro de una célula viva de vertebrado, es capaz de dirigir la maquinaria celular para producir productos de traducción codificados por el polinucleótido. El término "operablemente enlazado" se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes están configurados para realizar su función usual. De este modo, los elementos reguladores de la transcripción operablemente enlazados a una secuencia nucleotídica son capaces de efectuar la expresión de la secuencia nucleotídica. Aquellos expertos en la técnica pueden apreciar que pueden ser exitosamente utilizados diferentes promotores de la transcripción, terminadores, vectores, portadores o secuencias génicas específicas. La presente invención pertenece de este modo también al uso de una proteína de HCV como se define en la presente, para inducir profilácticamente la inmunidad contra el HCV (vacuna profiláctica) . Se debe notar que una vacuna puede también ser útil para el tratamiento de un individuo como se señaló anteriormente, en cuyo caso ésta es llamada una "vacuna terapéutica". Es claro a partir de lo anterior que la presente invención también se refiere al uso de una proteína como se define anteriormente o una composición como se define anteriormente para la fabricación de una composición de vacuna de HCV. En particular, la presente invención se refiere al uso de una proteína como se define en la presente, para inducir inmunidad contra el HCV en portadores de HCV crónicos. Más en particular, la presente invención se refiere al uso de una proteína como se define en la presente, para inducir la inmunidad contra el HCV en portadores de HCV crónicos antes de, simultáneamente a o después de cualquier otra terapia, tal como, por ejemplo, la terapia con interferón bien conocida ya sea en combinación o no con la administración de fármacos pequeños para el tratamiento del HCV, tales como, por ejemplo, ribavirina. Tal composición puede también ser empleada antes o después del transplante de hígado, o después de la presunta infección, tal como, por ejemplo, daño por piquete de aguja. Además, la presente invención se refiere a un equipo que contiene las proteínas de HCV de la presente invención para detectar los anticuerpos para HCV presentes en una muestra biológica. El término "muestra biológica" como se utiliza en la presente, se refiere a una muestra de tejido o fluido aislado de un individuo, incluyendo pero no limitado a, por ejemplo, suero, plasma, fluido linfático, las secciones externas de la piel, los tractos respiratorio, intestinal y genitourinario, oocitos, lágrimas, saliva, leche, células sanguíneas, tumores, órganos, secreciones gástricas, moco, fluido de la médula espinal, secreciones externas tales como, por ejemplo, excremento, orina, esperma, y similares. Ya que las proteínas del HCV de la presente invención son altamente inmunogénicas, y estimulan la respuesta inmune tumoral y celular, la presente invención se refiere también a un equipo para detectar la respuesta de células T relacionada a HCV, que comprende la proteína de HCV de la presente invención. La respuesta de la célula T para HCV puede por ejemplo ser medida como se describe en la solicitud de patente internacional PCT/EP94/03555 a Leroux-Roels et al. Se debe enfatizar que el contenido completo, incluyendo todas las definiciones, de este documento se incorporan por referencia en la presente solicitud. La presente invención también se refiere a una composición como se define anteriormente, la cual también comprende el núcleo de HCV, la proteína El, E2, P7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A y/o NS5B, o partes de las mismas. Partículas de El, E2 y/o E1E2 pueden, por ejemplo, ser combinadas con antígenos estimuladores de las células T, tales como, por ejemplo, núcleo, P7, NS3, NS4A, NS4B, NS5A y/o NS5B. Además, la presente invención también caracteriza el uso de una proteína como se describe anteriormente, o una composición como se describe anteriormente para detectar los anticuerpos contra las proteínas de HCV. Como se utiliza en la presente, el término "para detectar" se refiere a cualquier ensayo conocido en la técnica, adecuado para la detección. En particular, el término se refiere a cualquier inmunoensayo como se describe en el documento WO96/13590.

SELECCIÓN DE FÁRMACOS La invención proporciona los métodos para identificar compuestos o agentes que pueden ser utilizados para tratar desórdenes caracterizados por (o asociados con) la infección por el HCV. Estos métodos son también denominados en la presente como "ensayos de selección de fármacos" o "bioensayos" y típicamente incluyen el paso de seleccionar un compuesto o un agente candidato/de prueba para la habilidad de interactuar con (por ejemplo, enlazarse a) una proteína de HCV, para modular la interacción de una proteína de HCV y una molécula objetivo, y/o para modular la expresión del ácido nucleico de HCV y/o la actividad de la proteína de HCV. Los compuestos o agentes candidatos/de prueba que tienen una o más de estas habilidades pueden ser utilizados como fármacos para tratar desórdenes caracterizados por la infección por el HCV, expresión del ácido nucleico de HCV y/o actividad de la proteína de HCV. Los compuestos candidatos/de prueba tales como moléculas pequeñas, por ejemplo, moléculas orgánicas pequeñas, y otros candidatos farmacéuticos pueden ser obtenidos, por ejemplo, a partir de las bibliotecas de productos naturales y en combinación. En una modalidad, la invención proporciona los ensayos para seleccionar los compuestos candidatos/de prueba que interactúan con (por ejemplo, se enlazan a) la proteína de HCV, o cualquier parte funcionalmente equivalente de los mismos. Típicamente, los ensayos son ensayos libres de células que incluyen los pasos de combinar las proteínas de HCV de la presente invención, su actividad catalítica, por ejemplo de óxido-reductasa, o fragmentos inmunogénicos de las mismas, y un compuesto candidato/de prueba, por ejemplo, bajo condiciones que permiten la interacción de (por ejemplo, el enlace de) el compuesto candidato/de prueba para la proteína de HCV o una porción de la misma, para formar un compuesto, y detectando la formación de un complejo, en el cual la habilidad del compuesto candidato para interactuar con (por ejemplo, enlazarse a) la proteína de HCV o porción de la misma, es indicada por la presencia de un compuesto candidato en el complejo. La formación de los complejos entre la proteína de HCV y el compuesto candidato puede ser cuantificada, por ejemplo, utilizando inmunoensayos estándares.

Las proteínas de HCV, sus fragmentos catalíticos o inmunogénicos o los oligopéptidos de los mismos, empleados en tal prueba pueden estar libres en solución, fijados a un soporte sólido, llevados sobre una superficie celular, o localizados intracelularmente . En otra modalidad más, la invención proporciona los ensayos de selección para identificar los compuestos candidatos/de prueba que modulan (por ejemplo, estimulan o inhiben) la interacción (y más probablemente también la actividad de la proteína de HCV) entre una proteína de HCV y una molécula (molécula objetivo) con la cual la proteína de HCV normalmente interactúa, o anticuerpos que reconocen específicamente la proteína de HCV. Los ejemplos de tales moléculas objetivo incluyen proteínas en la misma vía de señalización que la proteína de HCV, por ejemplo, proteínas que pueden funcionar corriente arriba (incluyendo estimuladores e inhibidores de la actividad) o corriente abajo de la vía de señalización de la proteína de HCV [dedos de Zn, actividad de proteasa, reguladores del estado redox de la cisteína] . Típicamente, los ensayos son ensayos libres de células que incluyen los pasos de combinar una proteína de HCV de la presente invención, sus fragmentos catalíticos o inmunogénicos, una molécula diana u objetivo de proteína de HCV (por ejemplo un ligando de la proteína de HCV) o un anticuerpo específico y un compuesto candidato/de prueba, por ejemplo, bajo condiciones en donde la presencia del compuesto candidato, la proteína de HCV o la porción biológicamente activa de la misma, interactúa con (por ejemplo, se enlaza a) la molécula objetivo o el anticuerpo, y detectando la formación de un complejo que incluye la proteína de HCV y la molécula objetivo o el anticuerpo, o detectando la interacción/reacción de la proteína de HCV y la molécula o anticuerpo objetivo. La detección de la formación del complejo puede incluir la cuantificación directa del complejo mediante, por ejemplo, medición de los efectos inductivos de la proteína de HCV. Un cambio estadísticamente significativo, tal como una disminución en la interacción de la proteína de HCV y la molécula objetivo (por ejemplo, en la formación de un complejo entre la proteína de HCV y la molécula objetivo) en presencia de un compuesto candidato (con relación a lo que se detecta en ausencia del compuesto candidato) es indicadora de una modulación (por ejemplo, estimulación o inhibición) de la interacción entre la proteína de HCV y la molécula objetivo. La modulación de la formación de complejos entre la proteína de HCV y la molécula objetivo puede ser cuantificada utilizando, por ejemplo, un inmunoensayo.

Por lo tanto, la presente invención contempla un método para identificar los compuestos que modulan la interacción entre los socios de enlace en un complejo, en el cual al menos uno de los socios de enlace es la proteína de HCV como se define anteriormente, y el método comprende: a) poner en contacto el compuesto de prueba con el complejo, por un tiempo suficiente para modular la interacción en el complejo; y después de esto b) la verificación periódica del complejo para los cambios en las interacciones, de modo que si es detectado un cambio en la interacción, es identificado un compuesto que modula la interacción. En particular, la presente invención contempla el último método en el cual al menos uno de los socios de enlace es seleccionado del grupo de: i) moléculas derivadas del HCV, por ejemplo ácidos nucleicos (promotores o aumentadores) (ARN del HCV empaquetado en partículas de HCV) o proteínas (proteínas estructurales o no estructurales) ii) moléculas intracelulares derivadas del huésped (modificadores del estado redox de los péptidos de HCV, (TRX, GRX, tioesterasa, etc.)) iii) moléculas extracelulares derivadas del huésped (receptoras, glucosaminas, heparina) .

Debe ser claro que son contemplados en la invención los moduladores para la interacción entre los socios de enlace en un complejo, cuando son identificados mediante cualquiera de los métodos descritos en la presente. Para realizar los ensayos de selección de fármaco anteriormente descritos, es factible inmovilizar ya sea la proteína del HCV o su molécula diana u objetivo para facilitar la separación de los complejos a partir de formas no complejadas de una o ambas de las proteínas, así como para acomodar la automatización del ensayo. La interacción (por ejemplo, enlace de) la proteína de HCV a una molécula objetivo, en presencia y ausencia de un compuesto candidato, puede ser lograda en cualquier recipiente adecuado, para contener los reactivos. Los ejemplos de tales recipientes incluyen placas de microtitulación, tubos de ensayo, y tubos para microcentrífuga. En una modalidad, puede ser proporcionada una proteína de fusión la cual agrega un dominio que permite que la proteína sea enlazada a una matriz. Por ejemplo, la proteína de HCV marcada con His puede ser adsorbida sobre placas de microtitulación de Ni-NTA (Paborsky et al., 1996), o las fusiones de proteína de HCV-ProtA adsorbidas a la IgG, que son luego combinadas con los lisados celulares (por ejemplo, marcados con 35S) y el compuesto candidato, y la mezcla incubada bajo condiciones que conducen la formación del complejo (por ejemplo, a condiciones fisiológicas para la sal y el pH) . Después de la incubación, las placas son lavadas para eliminar cualquier marcador no enlazado, y la matriz inmovilizada y la radiomarcación se determina directamente, o en el sobrenadante después de que son disociados los complejos. Alternativamente, los complejos pueden ser disociados de la matriz, separados por SDS-PAGE, y el nivel de proteína de enlace a la proteína del HCV encontrado en la fracción de la esfera, se cuantifica a partir del gel utilizando técnicas electroforéticas estándares. Otras técnicas para inmovilizar proteínas sobre matrices, pueden también ser utilizadas en los ensayos de selección de fármacos de la invención. Por ejemplo, la proteína de HCV o su molécula objetivo o diana puede ser inmovilizada utilizando una conjugación de la biotina y la estreptavidina. Las moléculas de proteína de HCV biotiniladas pueden ser preparadas a partir de biotina-NHS (N-hidroxi-succinimida) utilizando técnicas bien conocidas en la materia (por ejemplo, equipo de biotinilación Pierce Chemicals, Rockford, 111.), e inmovilizadas en los pozos de las placas de 96 pozos recubiertas con estreptavidina (Pierce Chemical) . Alternativamente, los anticuerpos de la proteína de HCV pero que no interfieren con el enlace de la proteína a su molécula objetivo, pueden ser derivatizados a los pozos de la placa, y la proteína de HCV atrapada en los pozos mediante conjugación del anticuerpo. Como se describió anteriormente, las preparaciones de una proteína que se enlaza a la proteína de HCV y un compuesto candidato son incubadas en los pozos que presentan la proteína de HCV de la placa, y puede ser cuantificada la cantidad del complejo atrapado en el pozo. Los métodos para detectar tales complejos, además de aquellos descritos anteriormente para los complejos inmovilizados por GST, incluyen la inmunodetección de complejos utilizando anticuerpos reactivos con la molécula objetivo de la proteína de HCV, o que son reactivos con la proteína de HCV y compiten con la molécula objetivo; así como los ensayos ligados a enzima que contienen la detección de una actividad enzimática asociada con la molécula objetivo. Otra técnica para la selección de fármacos que proporcionan la selección de alto rendimiento de los compuestos que tienen actividad de enlace adecuada a la proteína de HCV, se describe con detalle en "Determination of Amino Acid Sequence Antigenicity" por Geysen HN, Solicitud Internacional WO84/03564, publicada el 13/09/84, e incorporada en la presente por referencia. En resumen, números grandes de diferentes compuestos de prueba peptídicos, pequeños, son sintetizados sobre un sustrato sólido, tales como espigas de plástico o alguna otra superficie. Los compuestos de prueba proteicos se hacen reaccionar con fragmentos de la proteína de HCV y se lavan. La proteína de HCV enlazada es luego detectada mediante métodos bien conocidos en la materia. La proteína de HCV purificada puede también ser recubierta directamente sobre las placas para el uso en las técnicas de selección de fármacos, anteriormente mencionadas. Alternativamente, los anticuerpos no neutralizadores pueden ser utilizados para capturar el péptido e inmovilizarlo sobre un soporte sólido. Esta invención también contempla el uso de los ensayos de selección de fármacos competitivos en los cuales los anticuerpos neutralizadores capaces de enlazarse a la proteína de HCV, compiten específicamente con un compuesto de prueba para enlazarse a la proteína de HCV. De esta manera, los anticuerpos pueden ser utilizados para detectar la presencia de cualquier proteína que comparta uno o más determinantes antigénicos con la proteína de HCV. En otra modalidad más, la invención proporciona un método para identificar un compuesto (por ejemplo, un ensayo de selección) capaz de utilizarse en el tratamiento de un desorden caracterizado por (o asociado con) la infección por el HCV, la expresión del ácido nucleico del HCV o la actividad de la proteína del HCV. Este método incluye típicamente el paso de evaluar la habilidad del compuesto o del agente para modular la expresión del ácido nucleico del HCV o la actividad de la proteína del HCV, con lo cual se identifica un compuesto para tratar un desorden caracterizado por la infección del HCV, la expresión del ácido nucleico del HCV o la actividad de la proteína del HCV. Los moduladores de la infección por el HCV, la actividad de la proteína del HCV y/o la expresión del ácido nucleico del HCV identificada de acuerdo a estos ensayos de selección del fármaco, pueden ser utilizados para tratar, por ejemplo, la infección por el HCV o los desórdenes relacionados a la infección por el HCV. Estos métodos de tratamiento incluyen los pasos de administrar los moduladores de la actividad de la proteína de HCV y/o la expresión del ácido nucleico de HCV, por ejemplo, en una composición farmacéutica como se describe anteriormente, a un sujeto en necesidad de tal tratamiento, por ejemplo, un sujeto con una infección por HCV. La especificidad tisular o celular del fármaco puede ser aumentada mediante el uso de los métodos de dirección al objetivo, con fármacos (ver Davis, 1997) o la inmunización intracelular. Las herramientas de dirección al hígado son por ejemplo fármacos acoplados a la bilirrubina (Kramer et al. 1992), el receptor de asialoglucoproteína o la transferencia de fármacos mediada por lipoproteína (Vingernoeds et al. 1996). Los fármacos pueden incluso ser intracelularmente dirigidos con la dirección a los organelos celulares de la molécula expresada del ADN, vía los marcadores de dirección a objetivos específicos de organelos celulares (Persic et al. 1997) . Los métodos para evaluar la habilidad del compuesto o agente para modular la infección del HCV, la expresión del ácido nucleico del HCV o la actividad de la proteína del HCV, son típicamente ensayos basados en células. No obstante, los animales infectados por el HCV son también contemplados en la presente. Por ejemplo, las células infectadas o transfectadas con el HCV que son sensibles a los reductores u oxidantes, o que transducen las señales por medio de una vía que involucra la proteína de HCV, pueden ser inducidos para sobreexpresar una proteína de HCV en presencia y ausencia de un compuesto candidato. Pueden ser identificados los compuestos candidatos que producen un cambio estadísticamente significativo en las respuestas dependientes de la proteína del HCV (ya sea estimulación o inhibición) . En una modalidad, la infección de las células objetivo por el HCV, la expresión del ácido nucleico del HCV o la actividad de la óxido-reductasa de una proteína de HCV, es modulada en células, y se miden los efectos de los compuestos candidatos sobre la lectura de interés (tal como las proporciones de infección, la proliferación o diferenciación celular, o la actividad de la óxido-reductasa) . Por ejemplo, puede ser evaluada la proporción de transición de la forma tiolada a la forma conjugada al azufre, por ejemplo, el puente S-S. Por ejemplo, puede también ser evaluada la expresión de los genes que están supra- o sub-regulados en respuesta a una cascada de señales dependiente de la proteína de HCV. En modalidades preferidas, las regiones reguladoras de tales genes, por ejemplo, el promotor que flanquea el extremo 5' y las regiones aumentadoras, están operablemente enlazados a un marcador detectable (tal como la luciferasa) que codifica para un producto génico que puede ser fácilmente detectado. La fosforilación de la proteína de HCV o las moléculas objetivo de la proteína de HCV puede también ser medida mediante inmunotransferencia. Por lo tanto, la presente invención pertenece a un bioensayo para identificar los compuestos que modulan la actividad de la óxido-reductasa de las proteínas de HCV como se definió anteriormente, dicho bioensayo comprende: a) la exposición de las células que expresan las proteínas de HCV, o cualquier parte funcionalmente equivalente de las mismas, como se define anteriormente, al menos a un compuesto cuya habilidad para modular la actividad de la óxido-reductasa de las proteínas se busca que sea determinada; y después de esto b) se verifican periódicamente las proteínas para los cambios en la actividad de la óxido-reductasa. El péptido de HCV reversiblemente protegido puede ser utilizado para fines de acoplamiento de diagnóstico en, por ejemplo, un estado oligomerizado como (1) preparaciones del poliantígeno químico (los agentes acoplados a Els no están necesariamente relacionados al HCV y pueden de este modo ser utilizados para la selección de enfermedades múltiples) ; (2) objetivos para la inmovilización e inmunodetección (por ejemplo, biotinilación, fluorescencia) o (3) para la conjugación del anticuerpo, que a su vez puede dar como resultado anticuerpos supramoleculares (por ejemplo, anticuerpos o partículas similares al virus) . La marcación y la conjugación del anticuerpo puede dar como resultado un incremento de la sensibilidad debido al paso de amplificación por oligomerización de la proteína. Se ha mencionado que cualquier grupo reactivo sobre el péptido (azucares, grupos amino, carboxilo, tiol, histidina y similares) puede ser explotado para el acoplamiento o conjugación. El grupo protegido reversiblemente puede ser utilizado para aumentar la especificidad de la reacción, y la reactividad del grupo tiol puede ser explotada en un paso/fase posterior de conjugación después de la desprotección. Finalmente, la presente invención se refiere a un inmunoensayo para detectar el anticuerpo para HCV, cuyo inmunoensayo comprende: (1) la provisión de la proteína de HCV purificada como se define en la presente, o un equivalente funcional de la misma, (2) la incubación de una muestra biológica con la proteína de HCV bajo condiciones que permiten la formación del complejo anticuerpo-antígeno, (3) determinar si se forma o no el complejo anticuerpo-antígeno que comprende la proteína de HCV. La presente invención será ahora ilustrada con referencia a los siguientes ejemplos, los cuales describen modalidades particularmente ventajosas. No obstante, se debe notar que estas modalidades son meramente ilustrativas y no pueden ser consideradas como restrictivas de la invención, de ningún modo.

EJEMPLOS Ejemplo 1: Determinación del estado de tiol-disulfuro en Els expresada en vaccinia La proteína Els del HCV (aminoácidos 192-326) fue expresada y purificada a partir de células Vero utilizando el virus recombinante de la vaccinia, pv-HCVHA, de acuerdo al protocolo como se describe en Maertens et al . (PCT/EP95/03031) , excepto que el bloqueo de los grupos tiol fue realizado con yodo-acetamida y N-etilmaleimida (NEM) durante la lisis y después de la reducción con DTT, respectivamente. De este modo, el bloqueo de los grupos tiol libres con IAA (yodoacetamida) en el amortiguador de lisis, y la alquilación con NEM después del paso de reducción con DTT. La Els purificada fue concentrada mediante ultrafiltración (Centricon 10, Millipore) , desglucosilada con N-glucosidasa F (PGNase F; Boehringer Mannheim) como se describe por el fabricante, después de lo cual la Els fue cargada sobre un minigel de poliacrilamida al 15%. Se realizó la SDS-PAGE como se describe por Laemmli. Las bandas de proteína fueron cortadas en la región de aproximadamente 18 kDalton después de la preparación por tamaño y la tinción.

Las proteínas fueron escindidas mediante tripsinolisis in si tu, y el digerido peptídico resultante fue analizado mediante espectroscopia de masa (MS; MALDI- TOFF) para determinar el estado de derivatización de los diferentes residuos de cisteína. Los resultados de MS muestran para las cisteínas en la porción CXXC que: 1) en aproximadamente 10% de las porciones CXXC, ambas cisteínas estuvieron presentes como productos derivatizados con IAA; 2) en aproximadamente 30% de las porciones CXXC, una cisteína fue bloqueada con IAA, y la otra cisteína estuvo presente como producto derivatizado con NEM; 3) en aproximadamente 60% de las porciones de CXXC, ambas cisteínas fueron recuperadas como producto derivatizado con NEM. Estos datos muestran sorprendentemente que: 1) cualquiera de las dos cisteínas estuvieron presentes en un estado completamente reducido ("tiol"); y 2) cualquiera de las cisteínas estuvo involucrada en un puente disulfuro mixto y la segunda cisteína estuvo presente como el tiol libre (forma intermediaria) ; y 3) que ambas cisteínas estuvieron presentes en la forma oxidada (puente disulfuro) .

Aunque el experimento es realizado con un péptido de HCV, por ejemplo derivado de un patógeno infeccioso, estas tres formas correlacionan perfectamente con los diferentes estados de oxidación que han sido descritos para la porción -CXXC- en la superfamilia TRX, y corresponden con el patrón de actividad descrito para las óxido-reductasas del tiol, por ejemplo moléculas involucradas en la regulación del ambiente de óxido-reducción en la célula (Rietsch S Beckwith, 1998; Loferer & Hennecke, 1994; Aslund & Beckwith, 1999; Huppa & Ploegh, 1999) . Ya que las cisteínas en el sitio activo de la tiorredoxina son oxidadas y el puente disulfuro en el sustrato es reducido, el exceso de la forma oxidada (60%) está en concordancia con la actividad de la tiorredoxina. Sorprendentemente, estos resultados tienden a indicar que Els está involucrada en un mecanismo de (auto)plegamiento, que es dependiente del estado de oxidación intracelular para la regeneración del sitio activo a la forma reducida. Por lo tanto, el agregado basado en la proteína -S-S- que consiste de Els, proteínas de la vaccinia y del huésped, puede ser disminuido al interferir al nivel de plegamiento de proteínas o mediante adición de los compuestos en el medio de cultivo que interfieren/influyen el estado redox íntracelular de las cisteínas.

Ejemplo 2: Purificación de Levadura Esl-His después de la modificación reversible de las cisteínas Células de Saccharomyces cerevisiae (levadura) que producen Els de HCV marcada con his se cosecharon mediante mcirofiltración y centrifugación. Los botones celulares se resuspendieron en 5 volúmenes de amortiguador de lisis (fosfato 50 mM, clorhidrato de guanidinio 6M, pH 7.4 (= amortiguador A), y Na2S03 sólido, Na2S06 son agregados a la solución hasta una concentración final de 160 mM y 65 mM, respectivamente. Se agrega Cu2+ (solución de reserva 100 M en amoniaco) como catalizador hasta que se logra una concentración de 100 µM y la solución se incuba toda la noche a temperatura ambiente. El lisado se almacena a -70°C y se despeja mediante centrifugación (rotor JA 20, 27 kg a 4°C) después del ciclo de congelamiento-descongelamiento. Se agregaron imidazol y Empigen"1* (Albright & Wilson, Reino Unido) al sobrenadante, respectivamente, hasta una concentración final de 20 mM y 1% (p/v) y la muestra se aplicó sobre una columna de Ni-IDA Sepharose FF (Pharmacia) después de la dilución con el amortiguador de equilibrio (Amortiguador A, imidazol 20 mM, 1% de Empigen) . La resina fue lavada con amortiguador de equilibrio hasta que la absorbancia a 280 nm alcanza el nivel de línea base y las proteínas enlazadas son eluidas mediante la aplicación de un gradiente gradual de imidazol . El análisis de SDS-PAGE y transferencia de Western muestran que es recuperada la proteína Els-His más del 90% pura en el combinado de elución de imidazol 200 mM después de la sulfitolisis bajo condiciones de desnaturalización e IMAC (Figura 6B) . La Els de HCV sulfonatada es des-sulfonatada mediante la adición de DTT para restaurar el estado tiol y permitir la formación del puente disulfuro intra- e intermolecular.

Ejemplo 3: Purificación y reactividad inmunológica de la proteína de fusión NS3 de E. coli Las células de E. coli que producen la proteína de fusión mTNF (His) 6NS3 B9 fueron cosechadas y las células fueron resuspendidas en amortiguador A (ver Ejemplo 2) . La sulfonación, la preparación de la muestra y la cromatografía metálica corrida sobre Ni-IDA Sepharose FF (Pharmacia) fueron realizadas como se describe para levadura (Ejemplo 2). La proteína de fusión mTNF (His) 6 NS3 b9 fue recuperada en el combinado de elución de imidazol 200 mM. La tinción de Coomassie de los geles de SDS-PAGE y transferencia de Western mostraron que la proteína de fusión de HCV es más de 90% pura después de la sulfitolisis e IMAC (ver Figura 6A) . La reactividad inmune de la proteína de fusión fue verificada mediante ELISA con los sueros humanos positivos a HCV. La proteína de fusión purificada fue reducida con DTT 200 mM y la proteína fue desalada a acetato 35 mM, urea 6 M, pH 4 sobre una columna Sephadex G25 (Pharmacia) . El efecto de los anti-oxidantes y los agentes protectores reversibles (ditiocarbamato, GSH, cisteína) sobre la reactividad de la proteína de fusión NS3 fue verificada mediante la adición de estos agentes ya sea antes del congelamiento a -70°C o mediante la adición de estos compuestos durante la dilución en el amortiguador de recubrimiento de ELISA. La proteína de fusión NS3 recubierta en presencia de 10 mM o 20 mM de DTT fueron incluidas como control positivo y negativo, respectivamente. Los sueros (17790, 17832) son sueros difícilmente detectables (suero de conversión de NS3 de HCV) y los sueros (17826, 17838) fueron sueros positivos a HCV fácilmente detectables. Los sueros de HCV que son difíciles de detectar son (1) sueros que no reaccionan o que reaccionan mínimamente con otros antígenos de HCV (NS3 únicamente) o (2) sueros que reaccionan con los epítopes de NS3 que son únicamente presentados y reconocidos por anticuerpos después del tratamiento de NS3 b9 sulfonatado con DDT 200 mM. En contraste, para los sueros fácilmente detectables es suficiente un tratamiento con DTT 10 M de NS3b9 sulfonatado, para restaurar la actividad inmunológica. Los resultados de ELISA se dan en las Figuras 5A y 5B. Los resultados muestran que la disponibilidad de los epítopes es fuertemente dependiente del estado redox del tiol, por ejemplo, los sueros de HCV difíciles son únicamente detectados ya sea (1) después de la reducción de NS3 con DTT 20 mM en el amortiguador de recubrimiento o (2) mediante incubación del diluyente de muestra en presencia de DTT 10 mM o 3 mM, con la condición de que la muestra de NS3 sea diluida con antioxidantes que contienen tiol y/o agentes de protección reversibles. La restauración de la reactividad inmunológica fue más pronunciada con los ditiocarbamatos que con el glutatión, cisteína o ácido tiofencarboxílico (TPCB) o tiodietilenglicol (TEG) . El glutatión fue a su vez superior a la cisteína o a otros productos mono-SH probados (TEG, TPCB) . Las mejores señales de ELISA fueron obtenidas para la proteína de fusión NS3B9, que fue incubada a -70°C y diluida en presencia de agentes protectores estabilizadores de tiol y reversibles . La necesidad del paso de reducción con DTT para restaurar la actividad inmune después de la adición de los compuestos que contienen tiol, mostró la formación de puentes disulfuro mixtos entre los agentes tiol y los residuos de cisteína de la proteína de fusión NS3 b9. La adición de los compuestos tiol ha inhibido la reformación del puente disulfuro intramolecular muy estable, que únicamente podría ser reducido con DTT 20 mM. Este estado de puente disulfuro mixto se asemeja a la tiolación in vivo de las proteínas, que se sabe es una actividad biológica reguladora y es con aporte mínimo de energía transferido (enzimáticamente o mediante un reductor de 'S-S') al estado reducido.

Ejemplo 4: Trazado del mapa de los anticuerpos monoclonales contra un epítope El que se traslapa con los residuos de cisteína provenientes del sitio CXXC Diez anticuerpos monoclonales, dirigidos contra El, fueron identificados, los cuales reconocen la región N-terminal de El. Estos monoclonales fueron caracterizados considerando su epítope mínimo. Con el fin de hacerlo así, fueron sintetizados dos péptidos y la reactividad de cada anticuerpo monoclonal hacia estos péptidos fue analizada mediante la evaluación de la competencia. El recombinante fue adsorbida a placas de microtitulación y el anticuerpo monoclonal se dejó reaccionar en presencia de un exceso del péptido. Con base en estos resultados los diez anticuerpos monoclonales pueden ser divididos en dos grupos (Tabla 1) . Para el primer grupo el epítope mínimo es los aminoácidos 209-227, especialmente la falta de reactividad con un péptido que no contiene los aminoácidos 225-227 prueba que estos monoclonales cubren un epítope que se traslapa con el sitio similar a la tiorredoxina, más específicamente con la primera cisteína de este sitio. El epítope mínimo de los monoclonales del grupo 2 no alcanza el sitio similar a la tiorredoxina. Estos resultados son resumidos en la Tabla 1.

Tabla 1: Delineación de epítope mínimo de los anticuerpos monoclonales dirigidos contra El Anticuerpo monoclonal El del grupo 1 : IGH, 198 , 199 y 200 Secuencia Región IGP* resultado aa NDCPNSSIVYEAHDAILHTP 205-224 263 Sin competencia Bio-GG-sNssivYEAADMiMHTPGCv 208 -227 436 competencia Anticuerpos monoclonales El del grupo 2 : IGH 201 , 202 , 203 , 204 , 205 , 206 y 208 Secuencia Región IGP* resultado aa NDCPNSSIVYEAHDAILHTP 205-224 263 Competencia Bio-GG-SNSSIVYEAHDAI HTPGCV 208-227 436 competencia El epítope mínimo para cada grupo está subrayado *IGP se refiere al número de código del péptido Nota 1 También los monoclonales son disponibles para el reconocimiento de un epítope en la parte C-terminal de El (IGH 207, 209 y 210, aa 307-326; ver PCT/EP99/02154) .

Estos monoclonales pueden ser utilizados como controles, ya que éstos reconocen una región que no está del todo en la vecindad del sitio similar a la tiorredoxina.

Nota 2 IGH 198 = 23C12 IGH 203 = 15G6 IGH 208 = 5C6 IGH 199 = 15B5 IGH 204 = 8A8 IGH 209 = 5E1 IGH 200 = 25CF3 IGH 205 = 3H2 IGH 210 = 7D2 IGH 201 = 11B7 IGH 206 = 7C4 IGH 202 — 3F3 IGH 207 = 14H11 De este modo, los monoclonales son disponibles, los cuales pueden ser utilizados como herramientas para determinar los cambios en la actividad biológica y/o la conformación de los péptidos de la presente invención.

Ejemplo 5: Purificación de El de HCV después de la modificación reversible de los residuos de Cys Células RK13 de la vaccinia fueron lisadas como se describe en Maertens et al. (PCT EP95/03031) , pero se agregó tetrationato de sodio sólido al lisado hasta 65 mM en vez del agente de bloqueo de tiol irreversible N-etilmaleimida (NEM) . El lisado fue incubado toda la noche a 4°C y los pasos de purificación (cromatografía de Lentil-lectin (LCA) , la concentración del eluido de LCA y reducción con DTT) se realizaron como se describe en Maertens et al. (PCT EP95/03031) . El concentrado fue dividido en 2 y fue ya sea sulfonatado toda la noche a 4°C por Na2S406 o bloqueado irreversiblemente con N-etil-maleimida (NEM) como material de referencia. La Els sulfonatada así como la tratada con NEM fueron aplicadas sobre Superdex G200 (Pharmacia) en presencia de Empigen (ver Figura 1) y el pico Els fue analizado por SDS-PAGE y transferencia de Western. El traslape del cromatograma así como los perfiles de ELISA muestran que el producto Els protegido irreversiblemente y sulfonatado se comportan análogamente sobre SEC en presencia de Empigen. La SDS- PAGE y la tinción con plata muestran un grado de pureza similar de los 2 productos. 5 Ejemplo 6: Purificación de Els de HCV bajo condiciones no desnaturalizantes después de la lisis en presencia de agentes estabilizadores de tiol 10 Células RK13 infectadas con vaccinia fueron lisadas como se describe en Maertens et al. (PCT EP95/03031) , pero fue agregado ascorbato (1 mM) al lisado como estabilizador de tiol en vez de NEM. La muestra fue aplicada sobre la resina LCA y el eluido de LCA fue 15 acidificado hasta pH 5.5 con ácido acético 1 M. El eluido acidificado fue concentrado, después de lo cual el pH se ajustó a 7.2 y se trató con DTT como se describe en Maertens et al. (PCT EP95/03031) . La solución de la proteína reducida fue dividida 20 y tratada como sigue: ya sea (1) acidificada a pH 6 (condiciones de estabilización de tiol) o (2) sulfonatada con tetrationato de sodio (reversiblemente protegida) o (3) tratada con NEM.bio (bloqueo irreversible) . La SEC de la muestra acidificada (pH 6) fue también realizada a pH 6.0. 25 Las otras 2 muestras fueron separadas sobre Superdex G200 -t? --mmn^-**-^ ' • • en presencia de Empigen como se describe en Maertens et al .

(PCT EP95/03031) . Las fracciones de elución fueron analizadas mediante ELISA, mediante SDS-PAGE y transferencia de Western. El material, preparado como se describe en Maertens et al. (PCT EP95/03031) es incluido como material de referencia para la SEC. El análisis fraccional muestra que la Els pura es recuperada para las diferentes condiciones (Figura 3A.1 y Figura 3A.2) . El Mr aparente más alto de los materiales Els de NEM.bio es probablemente causado por la inserción del grupo bloqueador voluminoso sobre Els. La Figura 3B muestra una transferencia de Western de los combinados de Els, obtenidos mediante diferentes procedimiento como se describen en los Ejemplos 5 y 6. Los Ejemplos 5 y 6 ilustran que la Els pura es obtenida bajo condiciones no desnaturalizantes mediante (1) el uso de agentes de modificación reversibles o (2) la corrida de la cromatografía bajo condiciones estabilizadoras del tiol (antioxidante, pH bajo) .

Ejemplo 7: Procesamiento de Els de Vero y analogía de escisión con factores de crecimiento, tales como tiorredoxina Células Vero infectadas con la vaccinia, fueron lisadas como se describe en Maertens et al. (PCT EP95/03031) , pero se agregó yodoacetamida (IAA) como agente bloqueador irreversible y aprotinina después de una incubación de toda la noche a 4°C. La cromatografía sobre la resina LCA (Pharmacia) , la reducción con DTT y las filtraciones en gel fueron realizadas como se describe, excepto que se utilizó IAA como agente bloqueador irreversible en vez de NEM. El combinado de Els fue analizado mediante tinción con plata y transferencia de Western. El análisis de transferencia de Western del producto semi-purificado mostró además de la banda de cuadruplete en la región de 27-32 kDa también una banda Els con un Mr de aproximadamente 18 kDa. Las bandas fueron caracterizadas mediante secuenciamiento de aminoácidos NH2-terminal . La secuencia de señal media de las diferentes bandas del cuadruplete : Y E V R 7 V S G (extremo amino de la Els correctamente procesada) Secuencia de producto de degradación de Els ? 7 VA L T P T L AA Este producto de degradación resulta de una escisión específica en el extremo carboxilo después de Arg 237, que está localizado corriente arriba del sitio CVPC. El primero y el segundo residuos no son identificados, debido a que los residuos de cisteína y de triptofano son destruidos por el método de secuenciamiento de Edman. 5 Sorprendentemente, no fueron recuperados productos de degradación, aunque están presentes otros residuos básicos e incluso secuencias dibásicas en la Els. Este patrón de escisión específica corresponde con la estructura de dominio Els, que ha sido descrita para el 10 procesamiento de los factores de crecimiento, tales como la tiorredoxina, cuya escisión ha dado como resultado la formación de ECEF (Balcewicz-Sablinska, et al., 1991; Newman et al., 1994). 15 Ejemplo 8: Titulación del pKa de las cisteínas en el sitio CVPC de Els Con el fin de establecer la secuencia de los pasos de reacción, por ejemplo cuál cisteína del sitio 20 C?VPC2 reacciona primeramente, el pKa de estas cisteínas es titulado. El pKa de las cisteínas en el sitio C?VPC2 de Els es determinado mediante modificación de las cisteínas en Els o los péptidos sintéticos en función del pH. La modificación es realizada mediante el 25 tratamiento con IAA al pH preestablecido, después de lo •-"*•' ...^-te^^^rf cual la muestra es cargada sobre RPC después de disminuir el pH hasta 2 con ácido trifluoroacético (TFA) . Con el fin de determinar la cisteína más reactiva, el exceso de reactivo IAA es removido mediante RPC. Los grupos tiol que no reaccionaron son modificados mediante la elevación del pH después de la adición de etilendiamina (El) o bromo-etanolamina (BEA) . El tratamiento con El o BEA da como resultado la introducción de un aducto de cisteína que imita a la lisina, que crea un sitio de tripsinolisis suplementario. Este sitio suplementario permite la identificación de la cisteína más reactiva en el sitio -C?VPC2 vía la huella digital del péptido y MS (ver también Ejemplo 1) .

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Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención es el que resulta claro de la presente descripción de la invención dátfilU^MÜÉÉ

Claims

REIVINDICACIONES
Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Una proteína de HCV, o cualquier parte funcionalmente equivalente de la misma, caracterizada porque comprende al menos dos aminoácidos Cys, que tienen un estado redox reversible, y dichos aminoácidos Cys están comprendidos en la secuencia de aminoácidos Cys-X?-X2-Cys, en la cual el aminoácido Xi denota cualquier aminoácido, y el aminoácido X2 denota cualquier aminoácido. 2. La proteína de HCV, o cualquier parte funcionalmente equivalente de la misma, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el aminoácido Xi denota ya sea el aminoácido Val, Leu o lie, y el aminoácido X2 denota cualquier aminoácido.
3. La proteína de HCV, o cualquier parte funcionalmente equivalente de la misma, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el aminoácido Xi denota cualquier aminoácido y el aminoácido X2 denota el aminoácido Pro.
4. La proteína de HCV, o cualquier parte funcionalmente equivalente de la misma, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el aminoácido Xi denota ya sea el aminoácido Val, Leu o lie, y el aminoácido X2 denota el aminoácido Pro.
5. La proteína de HCV, o cualquier parte funcionalmente equivalente de la misma, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la proteína de HCV es elegida del grupo de Els o Elp.
6. Una proteína de HCV, o cualquier parte funcionalmente equivalente de la misma, caracterizada porque comprende al menos dos aminoácidos Cys, que tienen un estado redox reversible, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, obtenible mediante el siguiente proceso: a) purificación de una proteína de HCV, o cualquier parte funcionalmente equivalente de la misma, en la cual los residuos de cisteína son reversiblemente protegidos por medios químicos y/o enzimáticos, b) la eliminación del estado de protección reversible de los residuos de cisteína, c) la obtención de una proteína de HCV, o cualquier parte funcionalmente equivalente de la misma, en la cual los residuos de cisteína tienen un estado redox reversible.
7. La proteína de HCV, o cualquier parte funcionalmente equivalente de la misma, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para el uso como un medicamento.
8. El uso de la proteína de HCV, o cualquier parte funcionalmente equivalente de la misma, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para la fabricación de una composición de vacuna para HCV, en particular una composición de vacuna terapéutica o una composición de vacuna profiláctica.
9. La proteína de HCV, o cualquier parte funcionalmente equivalente de la misma, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para producir anticuerpos que reconocen específicamente dicha proteína de HCV, o cualquier parte funcionalmente equivalente de la misma.
10. Un inmunoensayo para detectar el anticuerpo de HCV, caracterizado el inmunoensayo porque comprende: 1) la provisión de la proteína de HCV, o cualquier parte funcionalmente equivalente de la misma de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7; 2) la incubación de una muestra biológica con la proteína de HCV, bajo condiciones que permiten la formación del complejo anticuerpo de HCV-proteína de HCV; 3) la determinación de si el complejo de anticuerpo de HCV-proteína de HCV es formado. ...^.. t .t
11. Un bioensayo para identificar los compuestos que modulan la actividad de óxido-reductasa de las proteínas de HCV de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, el bioensayo está caracterizado porque comprende : a) la exposición de las células que expresan las proteínas de HCV, o cualquier parte funcionalmente equivalente de las mismas, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, al menos a un compuesto cuya habilidad para modular la actividad de óxido-reductasa de dichas proteínas se busca sea determinada; y después de esto b) la verificación periódica de las proteínas para los cambios en la actividad de óxido-reductasa.