CZ20021819A3

CZ20021819A3 - Oxidačně redukční reverzibilní HCV proteiny s konformací podobnou nativním proteinům

Info

Publication number: CZ20021819A3
Application number: CZ20021819A
Authority: CZ
Inventors: Alfons Bosman; Erik Depla; Geert Maertens
Original assignee: Innogenetics N. V.
Priority date: 1999-10-27
Filing date: 2000-10-25
Publication date: 2003-06-18
Also published as: JP2003513022A; MXPA02004052A; HUP0203195A3; CN1384839A; WO2001030815A1; BR0015170A; HUP0203195A2; NZ518095A; AU1144501A; ZA200203169B; PL354990A1; RU2002109480A; CA2387666A1; EP1224214A1

Description

OXIDAČNĚ REDUKČNÍ REVERZIBILNÍ HCV PROTEINY S KONFORMACÍ PODOBNOU NATIVNÍM PROTEINŮM

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká HCV proteinů, ve kterých jsou cysteinové zbytky reverzibilně chráněny během purifikace. Tento purifikační postup vede k získání HCV proteinů s biologickou aktivitou a konformací podobnou nativním proteinům, které prezentují odpovídající epitopy. Předkládaný vynález se také týká způsobů screeningu léčiv s využitím těchto HCV proteinů, a dále se týká využití HCV proteinů v diagnostických a terapeutických aplikacích, jako jsou například vakcíny a léčiva.

Dosavadní stav techniky

Infekce virem hepatitidy C (HCV) je závažný zdravotní problém jak v rozvinutých tak rozvojových zemích. Je odhadováno, že přibližně 1 až 5 % světové populace je postiženo tímto virem. Ukazuje se, že infekce HCV je nejdůležitější příčina hepatitidy sdružené s transfúzí a často progreduje k chronickému poškození jater. Kromě toho existuje důkaz pro zapojení HCV do indukce hepatocelulárního karcinomu. V důsledku toho jsou vysoké požadavky na spolehlivé diagnostické metody a účinné terapeutické přípravky. Jsou zapotřebí také citlivé a specifické screeningové metody HCV kontaminovaných krevních produktů a zlepšené metody kultivace HCV.

HCV je vláknitý virus s pozitivní RNA o velikosti přibližně 9 600 bází, který kóduje alespoň tři strukturální a • · · · • · šest nestrukturálních proteinů. Na základě homologie sekvencí byly strukturální proteiny funkčně přiřazeny jako jeden jádrový protein a dva obalové proteiny: El a E2. Protein El sestává ze 192 aminokyselin a obsahuje 5 až 6 N-glykosylačních míst, v závislosti na HCV genotypu. Protein E2 sestává z 363 až 370 aminokyselin a obsahuje 9 až 11 N-glykosylačních míst, v závislosti na HCV genotypu (pro přehled viz: Major a Feinstone, 1997, Maertens a Stuyver, 1997). Protein El obsahuje různé variabilní domény (Maertens a Stuyver, 1997), zatímco protein E2 obsahuje tři hypervariabilní domény, jejichž hlavní doména je lokalizována na N-konci proteinu (Maertens a Stuyver, 1997) . Tyto obalové proteiny byly vytvořeny rekombinantní technikami v Escherichia coli, hmyzích buňkách, kvasinkových buňkách a savčích buňkách.

NS₂, NS3, NS4A, NS4B, NS5A a NS5B jsou nestrukturální (NS) proteiny. NS₃ je veliký přibližně 70 kD a má aktivitu proteázy a helikázy. Sekvence v NS3, které jsou podstatné pro aktivitu helikázy, mají také RNA vazebné, Mg⁺⁺ vazebné a ATP vazebné vlastnosti. Anti-NS3 protilátky se často objevují první v séro-konveržních řadách. Imunoreaktivita NS3 proteinu se v různých komerčních testech dnes dostupných různí.

Doposud bylo prokázáno, že nejefektivnšjší a nejúčinnější způsob kontroly nemoci je očkování proti ní. Nicméně úsilí vyvinout účinnou HCV vakcínu je spojeno s obtížemi. Conditio sine qua non pro vakcíny je indukce imunitní reakce u pacientů. V důsledku toho by měly být identifikovány HCV antigenní determinanty a podávány pacientům v řádné úpravě. Antigenní determinanty mohou být rozděleny na alespoň dvě formy, tj . lineární a konformační epitopy. Konformační epitopy jsou výsledkem skládání molekuly v trojrozměrném prostoru. Obecně se má za to, že konformační epitopy realizují nejúčinnější vakcíny, protože reprezentují epitopy, které se podobají nativním epitopům HCV. Nicméně • · · · existují zdánlivě nezdolatelné problémy s kultivací HCV, které mají za následek pouze nepatrná množství virionů. Kromě toho existují obrovské problémy s expresí a purifikací rekombinantních proteinů, které mají za následek nevhodně složené proteiny. In vivo struktura většiny HCV proteinů je tedy neznámá a nebyla provedena tudíž žádná solidní studie konformačních epitopů.

Kromě toho, nedostatek vhodných in vitro kultivačních systémů a modelů s malými zvířaty závažně zdržuje rozvoj nových antivirových léků pro infekce hepatitidou C. V současnosti jediným dostupným modelem pro studium profylaxe a terapie infekce HCV je šimpanz, ale tento systém umožňuje studovat jedině předem vybrané sloučeniny.

Bylo navrženo, že obalový protein El potřebuje obalový protein E2, aby dosáhl řádného složení (Deleersnyder et al., 1997) . Kromě toho bylo navrženo, že El a E2 tvoří heterodimery, které mohou tvořit základní jednotku virového obalu (Yi et al., 1997). Ale Houghton (1997) publikoval, že opakované imunizace rekombinantním gpElE2 (4 x 25 μg) 3 šimpanzů s chronickou infekcí HCV neindukovaly významnou imunitní reakci. Indukce imunitní reakce proti obalu u pacientů s hepatitidou C by opravdu byla žádoucí a pacientovi prospěšná, protože se zdá, že vyšší hladiny těchto protilátek korelují s dobrou reakcí na terapii interferonem a mohou proto pomoci pacientovi odstranit virus (PCT/EP 95/03031, Maertens et al.). Hladiny protilátek proti El u chronických HCV nosičů jsou nejnižší ze všech HCV protilátek, může proto být prospěšné zvýšit tyto hladiny protilátek a možná buněčnou reakci, pro indukci kontroly nebo dokonce clearance infekce hostitelem. Vypadá také, že vyšší hladiny buněčné imunity proti El korelují s dobrou reakcí na terapii interferonem (Leroux-Roels et al., 1996). Je důležité, • · že výše popisované studie nespoléhají na peptidy El podobné nativním.

Většina rozhodujících epitopu v NS3 pro detekci HCV pozitivních sér jsou příbuzné s konformačními epitopy. Očividně jsou NS3 epitopy rozptýleny všude v NS3 proteinu (viz také Leroux-Roels et al. 1996, Rehermann et al., 1996, 1997, Diepolder et al., 1995, 1997). V testech byl místo peptidů použit v první řadě NS3 protein.

Pokroky v molekulární biologii a genetickém inženýrství umožnily vytvořit velká s použitím heterologních heterologních hostitelů v biologických a/nebo množství proteinových produktů expresních systémů. Použití nicméně může vést k rozdílům strukturálních vlastnostech rekombinantního produktu. Z biochemických modifikací, které se mohou stav proteinům během syntézy nebo po syntéze v buňce a následné purifikaci, je důležité vytvoření a udržení disulfidové vazby. Oxidačně redukční stav cysteinu je složitě spojován se správným skládáním nebo sestrojením proteinů vázaných disulfidy. Navíc je velmi často biologická funkce proteinu regulována nebo alespoň ovlivňována stavem oxidace jeho sulfhydrylových skupin. To je případ některých enzymatických aktivit, kde reverzibilita a načasování oxidace sulfhydrylových skupin bylo navrženo jako fyziologický kontrolní mechanismus (viz také Thomas et al., 1995, Nakamura et al., 1997, Aslund a Beckwith, 1999).

Bylo charakterizováno několik proteinových faktorů, které katalyzují cysteinylový oxidačně redukční stav (vytvoření thiolové vazby proti disulfidové vazbě) (Mossner et al, 1998, Prinz et al, 1997, Loferer & Hennecke, 1994) . Tyto proteinové faktory patří převážně k nadrodině („superfamily) thioredoxinových proteinů, jejíž členové obsahují 2 oxidačně redukční aktivní cysteiny v Cys-X-X-Cys kanonické sekvenci. (X = kterákoliv aminokyselina). Tato • · · ·

nadrodina může být rozdělena do různých tříd na základě oxidačně redukčního potenciálu aktivního místa, substrátové specificity nebo biologické aktivity. Další klasifikace se spoléhá na kanonickou sekvenci oxidačně redukčního aktivního centra, zejména:

(i) jedna třída, obecně reprezentována thioredoxinem (TRX), sestává z malých všudypřítomných proteinů. Oxidačně redukční aktivní centrum má kanonickou sekvenci Cys=XPro-Cys, která je vysoce konzervativní u mnoha druhů v rozsahu od baktérií k rostlinám a savcům (X = kterákoliv aminokyselina). Oxidovaný TRXO_x je regenerován na svou redukovanou formu v komplexu s TRXreduktázou, FAD a NADPH:

(ii) glutharedoxin (GRX) je obecný zástupce druhé třídy nadrodiny thioredoxinů. Oxidačně redukční aktivní centrum má kanonickou sekvenci Cys-Pro-X-Cys, ve kterém X je výhodně aromatická aminokyselina, tj . Tyr nebo Phe. GRX, a také TRX působí jako redukční činidla s disulfidy, ale GRX je specifická glutathion (GSH)smíšená disulfidreduktáza, uplatňující se např. při redukci thiolovaných proteinů.

Bylo dokázáno, že CXXC motiv může také být zapojen do různých intra- a extracelulárních biochemických a biologických funkcí, jako jsou např. thiol/disulfid výměnné reakce, vazba přechodových kovů, místo inkorporace lipidu, a regulačních aktivit, jako například kontrola genové transkripce, regulace signální transdukce, včetně působení jako cytokin, apod. a kontrola (de)thiolačního stavu proteinů. Je důležité, že CXXC motiv může působit v terciálních, jakož i kvartérních proteinových strukturách (viz také Thomas et al., 1995, Pinter et al., 1997, Aslund a Beckwith, 1999, Nakamura et al., 1997).

• 4 • 44 ·· · •4 · · * *

4 4 · · • 4 4 4 · · · · 4 4 4 ·

444 44 ·· ··

HCV proteiny obsahují CXXC motivy. Nicméně doposud ve stavu techniky neexistuje žádný návrh ani indikace, že reverzibilní oxidačně redukční stav těchto CXXC motivů je důležitý pro HCV. Purifikační protokoly doposud popsané nevysvětlují reverzibilní -S-S-můstek v CXXC motivu. V důsledku toho je zhoršena konformace purifikovaných HCV proteinů, jakož i jejich biologická aktivita.

Byly podniknuty četné pokusy studovat nativní HCV proteiny. Problém, se kterým se potkávaly, byla neschopnost purifikovat HCV proteiny se správnou konformací nebo konformací podobnou nativnímu proteinu. V důsledku toho zůstaly neznámé konformační epitopy, a také další biochemické a biologické funkce a aktivity závislé na konformaci podobné nativní. Kromě toho, cílení léků při nemocích jater a virové hepatitidě trpí stejným nedostatkem a programy screeningu léků selháváj í.

Podstata vynálezu

Zdá se, že správné sestavení nebo složení proteinů je zhoršeno díky chybějícím nebo neúčinným expresním a purifikačním systémům. Proteiny purifikované stávajícími metodami jsou často biologicky neúčinné a/nebo mají nesprávnou proteinovou protilátky strukturu. V důsledku toho nativní anti-HCV nedokážou rozpoznávat důležitou podmnožinu antigenních determinant na těchto proteinech, viz například Houghton (1997).

Předkládaný vynález překonává tyto problémy, protože popisuje a vytváří poprvé HCV proteiny s konformací podobnou nativním proteinům díky reverzibilnímu oxidačně redukčnímu stavu cysteinylových zbytků. Jsou tedy popsány nové struktury HCV proteinů. Konkrétně předkládaný vynález umožňuje

purifikaci HCV proteinů, které jsou biologicky účinné a/nebo mají konformaci podobnou nativním proteinům. HCV proteiny podobné nativním mají za následek nové konformační epitopy a epitopy závislé na oligomerizaci.

Přímé nebo nepřímé (zprostředkované) in vitro a in vivo aktivity HCV proteinů podobných nativním proteinům vytvářejí možnost studovat biochemické a biologické dráhy a kaskády, např. metabolické, enzymatické dráhy, signální transdukci a imunoreaktivitu. Identifikace účinných center, vazebných míst a interakčních domén (protein-protein, protein-sacharid, protein-nukleová kyselina a protein-malá molekula) umožní rozvoj léků, které interferují s buněčnými a virovými procesy zapojenými do hepatitidy.

Způsob purifikace a skládání proteinu podle předkládaného vynálezu, ve kterém je odstraněna cysteinylová chránící skupina, následovaný opětným složením a reoxidací cysteinových zbytků v HCV proteinu, umožňuje obnovit konformaci HCV proteinů podobnou nativním proteinům.

Cíle vynálezu

Předkládaný vynález se týká HCV proteinu nebo jeho kterékoliv funkčně rovnocenné části, obsahující aminokyselinu Cys, která má reverzibilní oxidačně redukční status. Konkrétně se předkládaný vynález týká HCV proteinu, který obsahuje alespoň dvě aminokyseliny Cys s reverzibilním oxidačně redukční stavem. Tyto dvě aminokyseliny Cys mohou být odděleny jinými. aminokyselinami. Výhodně jsou Cys aminokyseliny obsaženy v aminokyselinové sekvenci Cys-Xi-X₂-Cys, ve které aminokyselina X₄ označuje jakoukoliv aminokyselinu a aminokyselina X₂ označuje také jakoukoliv aminokyselinu. Výhodněji aminokyselina Xi označuje buď aminokyselinu Val, Leu nebo Ile a aminokyselina X₂ označuje aminokyselinu Pro.

ftft » « ftft ftft ··· · ·· ····

Kromě toho se předkládaný vynález dále týká HCV proteinu, nebo jeho kterékoliv funkčně rovnocenné části, obsahující alespoň dvě Cys aminokyseliny, s reverzibilním oxidačně redukční způsobem:

stavem, který je získán následujícím (a) purifikace HCV proteinu nebo jeho kterékoliv funkčně rovnocenné části, ve kterém cysteinové zbytky jsou chemicky a/nebo enzymaticky reverzibilně chráněny, (b) odstranění reverzibilně ochranného stavu cysteinových. zbytků, (c) získání HCV proteinu nebo jeho kterékoliv funkčně rovnocenné části, ve kterém cysteinové zbytky mají reverzibilní oxidačně redukční stav.

Navíc se předkládaný vynález týká HCV proteinu nebo jeho kterékoliv funkčně rovnocenné části, jak byl definován výše, pro použití jako lék.

Kromě toho se předkládaný vynález týká použití HCV proteinu nebo jeho kterékoliv funkčně rovnocenné části, jak byl definován výše, pro výrobu HCV vakcinačního přípravku, konkrétně terapeutické vakcíny nebo profylaktické vakcíny.

Navíc se předkládaný vynález týká HCV proteinu nebo jeho kterékoliv funkčně rovnocenné části, jak byl definován výše, pro vyvolání specifických protilátek.

Kromě toho se předkládaný vynález týká imunotestu pro detekci HCV protilátek zjišťováním tvorby komplexu HCV protilátka-HCV protein.

Konečně se předkládaný vynález týká biologického testu pro identifikaci sloučenin, které modulují aktivitu HCV proteinů, jak byly definovány výše, sledováním změn v aktivitě oxidoreduktázy.

► « 9 4 •Μ 99 9 9

9999

Má se za to, že všechny předměty předkládaného vynálezu byly realizovány v příkladech výhodných provedení popsaných dále.

Popis obrázků

Obrázek 1: Vylučovací chromatografie reverzibilně chráněných a ireverzibilně blokovaných Věro vzorků po lýze v přítomnosti L-askorbátu.

Věro buňky byly lyžovány Triton X-100 v přítomnosti 1 mM L-askorbátu. Lyzát byl nanesen na Lentil Lektin a redukován

7,5 mM DTT v pH 7,2, jak bylo popsáno v PCT EP95/03031, Maertens et al. Redukovaný Els byl buď (1) sulfonován tetrathionátem sodným, (2) ireverzibilně blokován

N-ethylmaleimidem nebo (3) ponechán neošetřen, ale pH roztoku bylo sníženo na 6.

SEC profil podle protokolu z PCT EP95/03031, Maertens et al., je zahrnut formou odkazu.

Gelové filtrace na koloně Superdex G200 10/30 (Pharmacia) byly prováděny v PBS, pH 7,2, 3% Empigen, kromě podmínky (3). Tato gelová filtrace byla prováděna v lOmM fosfátu, 150mM NaCl, pH 6,0.

SEC profily:

A: lýza v přítomnosti askorbátu a sulfonace po redukci DTT

B: lýza v přítomnosti askorbátu a ireverzibilní blokáda po redukci DTT

C: lýza v přítomnosti askorbátu a bez dalšího ošetření, ale SEC byl prováděn v pH 6,0

D: odkaz: blokáda. NEM/NEM.bio v lyzátu a po redukci DTT (PCT EP95/03031, Maertens et al.)

0099

Sloupce ukazují pooly pro analýzu barvením stříbrem a Western blotováním.

Histogram uvádí výsledky ze „sendvičového testu ELISA: Mab 14HnB2 (IGH 207) byla použita pro povlak a detekce byla prováděna s 25C3 (IGH 200) značenou HRP.

Obr. 2: Vylučovací chromatografie reverzibilně chráněných a ireverzibilně blokovaných Věro Els po lýze v přítomnosti sulfonačních činidel

Věro buňky byly lyžovány, jak bylo popsáno v PCT EP95/03031, Maertens et al., ale místo NEM/NEM.bio byl přidán tetrathionát sodný.

Purifikace na lentinu a redukce byly prováděny, jak bylo popsáno v PCT EP95/03031, Maertens et al. Redukovaná látka byla buď (1) sulfonována tetrathionátem sodným nebo (2) podrobena působení IAA (= ireverzibilně blokovaná).

Látka získaná způsobem popsaným v PCT EP95/03031, Maertens et al., je zahrnuta formou odkazu.

různé vzorky Els byly separovány na koloně Superdex G200 10/30, která byla ekvilibrována PBS, 3% Empigen, pH 7,2.

A: Sulfonace lyzátu buněk Věro a sulfonace po redukci DTT

B: Sulfonace lyzátu buněk Věro a ireverzibilní blokáda j odacetamidem

C: Věro Els získané po ireverzibilní blokádě s NEM/NEM.bio, jak bylo popsáno v PCT EP95/03031, Maertens et al.

D: překryv SEC profilů

Výsledky „sendvičového testu ELISA jsou předloženy v histogramech.

Els frakce byly shromážděny, jako ukázáno sloupci a analyzovány barvením stříbrem a Western blotováním.

·* W « v • · * · • 9 99 • 9 9 • © · * * © 9 · > >

·9

Empigen podmínkách • 49 • 9 · 9

99 • 9 · 4 • · 9 ·♦· 49

Obr. 3: Frakční analýza SEC v 3% prostřednictvím SDS-PAGE a Western blotováním.

(A) : SEC frakce získané po různých reverzibilní ochrany a ireverzibilní blokády byly analyzovány prostřednictvím SDS-PAGE a barvení stříbrem.

SDS-PAGE analýza frakcí získaných po lýze v askorbátu a gelové filtraci v pH 6 (viz obr l.c) nebo lýze v askorbátu a sulfonaci (obr. l.a) je uvedena jako příklady na obr. 3A.1. Obr. 3A.2 ukazuje screening frakcí Western blotováním s 11B7D8 v podmínkách popsaných pro obr l.C (lýza v askorbátu a SEC v pH 6 po redukci DTT).

(B) Western bloty SEC poolů byly prováděny s anti-Els MAb 5E1A10, která rozpoznává amino- a karboxy-koncový epitop, v daném pořadí.

Pooly byly získány, jak ukázáno na obr 1 a obr. 2.

Dráha 1 a 6: ukazovatelé molekulové hmotnosti

Dráha 2 a 7: referenční látka připravená dle PCT EP95/03031, Maertens et al.

Dráha 3 a 8: referenční látka připravená s ireverzibilně blokovanými cysteiny (ošetření s jodacetamidem)

Dráha 4 a 9: látka získaná po sulfonaci lyzátu a sulfonaci po redukci

Dráha 5 a 10: látka získaná po lýze v přítomnosti askorbátu a sulfonaci po redukci.

• ·· ·

Obr. 4 NS3 fúzní protein značený (His)6 exprimovaný E.

coli'

Ve schématu je uvedena purifikace na kovové afinitní koloně po reverzibilní protekci, a také příprava vzorku pro test ELISA.

+/-/A0: v přítomnosti nebo nepřítomnosti reverzibilně chránícího činidla (AO)

Obr. 5 reaktivita mTNF(His) ₆NS3 fúzních proteinů v testu ELISA v různých vazebných podmínkách.

Obr 5A: 90% čistý mTNF (His) 6NS3B9 fúzní protein byl odsolen v 25mM citrát, 1 mM EDTA, pH 4, po redukci 200mM DTT. Fúzní protein byl naředěn na 500 μς/ ml v odsolovacím pufru a uložen v -70°C v přítomnosti nebo nepřítomnosti činidel chránících thiol (skupina 1, skupina 2 antioxidantů).

Vzorky byly naředěny na 0,5 gg/ml ve vazebném pufru pro testy ELISA (50mM hydrouhličitanový pufr, pH 9,6) s činidly chránícími thiol (antioxidanty) nebo bez nich. Jamky byly blokovány PBS v přítomnosti nebo nepřítomnosti chránících činidel.

Inkubace vzorku séra byla prováděna v přítomnosti nebo nepřítomnosti lOmM DTT a ELISA byla vyvolána králičími antihumánními protilátkami konjugovanými s HRP (Dako, Dánsko) po promytí. Reakce byla zastavena přidáním 2N H2SO4.

Byla testována séra (17790, 17826, 17832, 17838). Séra 17790 a 17832 byla považována za obtížná séra, protože byla jediná detekován jako HCV pozitivní séra po ošetření 200mM DTT (pozitivní kontrola) . lOmM DTT je pro tato séra zahrnuto jako negativní kontrola. Séra 17826 a 17838 jsou séra, která reagují s NS3B9 proteinem po ošetření lOmM DTT (a jsou považována za snadno detekovatelná HCV séra).

·· ·· ···· ·· ···· • * · · · · · ·· · · · · · · • · · · ··· · ·

Skupina antioxidantů 1: lmM EDTA, lmM L-askorbová kyselina, lmM redukovaný glutathion.

Jestliže blokáda byla prováděna v přítomnosti protektivního činidla, byl během testu ELISA přidán k těmto činidlům chránícím thiol jako doplněk lmM tokoferol.

Skupina antioxidantů 2: lmM thiodiethylenglykol (TEG), lmM thiofenkarboxylová kyselina (TPCB), lmM pyrolidondithiokarbamát (PDTC), lmM diethyldithiokarbamát (DETC).

Obr 5Β: Thiolové sloučeniny a reaktivita NS3B9

ELISA byla prováděna tak, jak bylo popsáno pro obr. 5A, kromě toho, že byl detailněji zkoumán účinek (typ a koncentrace) mono- a dithio- sloučenin jako reverzibilních chránících skupin.

Vzorek ředidla byl inkubován v tomto testu ELISA vždy v přítomnosti 3mM DTT.

Antioxidant 1 = lmM EDTA, lmM L-askorbát

Antioxidant 2 = lmM thiofenkarboxylová (TPBC) kyselina, lmM thioethylenglykol (TEG), lmM diethyldithiokarbamát (DETC), lmM pyrolidondithiokarbamát (PDTC).

4mM DTC = 2mM DETC, 2mM PDTC

4mM Mono-SH = 2mM TPBC, 2mM TEG.

GSH a Cys jsou redukovaný glutathion a cystein, v daném pořadí.

Obr. 6 SDS-PAGE analýza purifikovaných reverzibilně chráněných (His) ₆-značených HCV proteinů po kovové afinitní chromatografií

6A: mTNF(His) ₆NS3B9 (dávka NS3B9 Β960925ΙΙ) exprimovaný v E. coli • ·

Western blot s anti-mTNF a stříbrem obarvená SDS-PAGE za neredukčních podmínek. (1 μς protein/dráha).

6B: (His)6~značený Els exprimovaný Saccharomyces cerevesiae (kvasinky)

Proteiny byly zobrazeny (a) barvením stříbrem, (b) Western blotováním anti Els nebo (c) GNA blotováním.

Els exprimovaný vakcínií, purifikovaný dle popisu autorů Maertens et al. (PCT EP95/03031), byl zahrnut jako reference.

Podrobný popis vynálezu

Vynález popsaný v tomto textu se vztahuje k dříve vydaným pracím a projednávaným patentovým přihláškám. Příkladem těchto prací jsou vědecké články, patenty nebo projednávané patentové přihlášky. Všechny tyto publikace a přihlášky, které jsou v předkládaném popisu citované, jsou tímto zahrnuty formou odkazu.

Předkládaný vynález se týká HCV proteinů se specifickou konformací. Poprvé byly připraveny HCV proteiny s konformací podobnou nativním proteinům, konkrétně HCV protein El. Bylo zjištěno, že jsou důležité specifické cysteinové vazby zapojené do konformace těchto HCV proteinů. Jako příklad je popsán nový a vynálezecký purifikační protokol, který umožní purifikovat HCV proteiny s konformací podobnou nativním proteinům. Tyto nové HCV proteiny jsou schopné nejenom prezentovat konformační epitopy, ale také projevují biologickou aktivitu. Tyto nové HCV proteiny mohou být použity pro různé studie, jako jsou například screeningové studie léků, biologické aktivity, dráhy signální transdukce, intra- a extracelulární procesy, interakce a vazby mezi molekulami HCV a/nebo ne-HCV molekulami, oligomerizace, konformační epitopy, • · · screening protilátek, metabolismus a enzymatická aktivita, imunoreaktivita. Očividně tyto studie mohou být umístěny v kontextu konečné diagnostické a/nebo terapeutické aplikace.

Předkládaný vynález je založen na zjištění, že HCV proteiny mají specifické konformace podobné nativním a biologickou aktivitu díky reverzibilnímu oxidačně redukčnímu stavu cysteinylových zbytků.

Předkládaný vynález se proto týká HCV proteinu nebo jeho kterékoliv funkčně rovnocenné části, obsahující Cys aminokyselinu, která má reverzibilní oxidačně redukční stav. Konkrétně se předkládaný vynález týká HCV proteinu, který obsahuje alespoň dvě Cys aminokyseliny s reverzibilním oxidačně redukční stavem. Uvedené Cys aminokyseliny mohou být odděleny jinými aminokyselinami. Výhodně jsou Cys aminokyseliny obsaženy v aminokyselinové sekvenci Cys-Xi-X2~ Cys, ve které aminokyselina Xi označuje kteroukoliv aminokyselinu a aminokyselina X2 označuje také kteroukoliv aminokyselinu. Výhodněji aminokyselina Xi označuje buď aminokyselinu Val, Leu nebo Ile a aminokyselina X2 označuje aminokyselinu Pro.

HCV

Předkládaný vynález se týká HCV a dalších členů rodu Flaviviridae, jako je například virus hepatitidy G, virus Dengue, virus žluté zimnice. Termín HCV tak zahrnuje všechny členy rodu Flaviviridae.

Protein

Termín protein, jak se v tomto textu používá, se týká HCV proteinu nebo kterékoliv jeho funkčně rovnocenné části, obsahující ve své aminokyselinové sekvenci alespoň jeden • · · cystein, jehož oxidačně redukční stav je variabilní (viz níže). Do termínu protein jsou také zahrnuty proteinové domény obsahující alespoň jeden cystein aminokyselinové sekvenci. Termín jeho funkčně část, jak se v tomto textu používá, se týká části nebo fragmentu HCV proteinu, který obsahuje ve své aminokyselinové sekvenci nejméně jeden cystein, jehož oxidačně redukční stav je variabilní. Konkrétně se termíny protein a jeho funkčně rovnocenné části týkají HCV proteinů a jejich fragmentů obsahujících oxidačně redukční aktivní centra, jako například HCV protein El. Konkrétně se předkládaný vynález týká HCV Els a HCV Elp. V tomto ohledu termín oxidačně redukční aktivní centrum, jak se v tomto textu používá, označuje proteinový motiv s kanonickou sekvencí CXXC.

ve sve rovnocenná

Termín peptid se týká polymeru aminokyselin (aa) pocházejícího ze známých HCV proteinů (Linnen et al., 1996, Maertens a Stuyver, 1997). Termín HCV El je odborníkovi známý protein (Wengler, 1991). HCV El, spolu s HCV E2, který byl dříve nazývaný nestrukturální protein 1 (NS1) nebo E2/NS1, tvoří obalový úsek HCV.

HCV E1s (192-326) * YEVRNVSGMY HVTNDCSNSS IVYEAADMIM HTPGCVPCVR ENNSSRCWVA LTPTLAARNA SVPTTTIRRH VDLLVGAAAF CSAMYVGDLC GSVFLVSQLF TISPRRHETV QDCNCSIYPG HITGHRMAWD MMMNW

HCV E1p (192-237)

YEVRNVSGMY HVTNDCSNSS IVYEAADMIM HTPGCVPCVR ENNSSR

Termín peptid se týká polymeru aminokyselin a neodkazuje na specifickou délku produktu. Termíny peptid, polypeptid, polyprotein a protein jsou tedy zahrnuty do definice peptid a jsou používány v tomto textu zaměnitelně. Termín peptid se netýká nebo nevylučuje modifikace peptidu

po expresi, například glykosylace, acetylace, fosforylace, apod. V definici peptidu jsou například zahrnuty polypeptidy obsahující jeden nebo více analogů aminokyselin (včetně, například nepřirozených aminokyseliny, PNA (Nielsen et al., 1991, 1993), apod.), peptidy se substituovanými vazbami, a také jinými modifikacemi v oboru známými, vyskytující přirozeně se a nepřirozeně. Peptidy mohou být tudíž lineární, cirkulární nebo „vázané (cyklizované nebo stabilizované prostřednictvím 'S-S' můstků, jinak než podle předkládaného vynálezu), tvořené D- nebo L-aminokyselinami, peptidy mohou být multimerní, rozvětvené, předložené na fágovi nebo imobilizované kovalentně nebo nekovalentně na polymerech různé povahy, jako jsou například organické, lipidové, sacharidové, proteinové polymery, polymery nukleových kyselin nebo mohou být peptidy přítomny ve skeletu. Rozumí se, že peptidomimetika nebo mimotopy jsou automaticky obsaženy v termínech polypeptid, peptid a protein.

Imobilizace na polymerech může být prováděna zbytky HCV

peptidu samotného nebo	HCV peptidem	fúzovaným	nebo
kondenzovaným	k jiným	molekulám,	jako	například
prostřednictvím	his-značky	(Dietrich et	al.,	1996)	nebo
lipidových chelatačních činidel (Dietrich et	al.,	1995).

Termín mimotopy se týká polypeptidů, které napodobují polypeptidy, jak jsou imunologicky definovány v tomto textu. Protože u HCV byla pozorována variabilita sekvencí, může být žádoucí měnit jednu nebo více aminokyselin, pokud jde o lepší napodobení epitopů různých kmenů. Rozumí se, že tyto mimotopy nemusí být totožné s kteroukoliv konkrétní HCV sekvencí, dokud jsou pacientovi sloučeniny schopné poskytnout imunologickou kompetici s alespoň jedním kmenem HCV.

Termín peptidomimetika se týká molekul, které nemusí být složeny pouze z aminokyselin, ale napodobují polypeptidy imunologicky, jak bylo definováno v tomto textu.

• 9

Předkládaný vynález se specificky týká peptidu připravených klasickou chemickou syntézou. Syntéza může být uskutečněna v homogenním roztoku nebo na pevné fázi. Například technika syntézy v homogenním roztoku, která může být použita, je technika popsaná autorem Houbenweyl (1974). Peptidy podle předkládaného vynálezu mohou také být připraveny s pomocí pevné fáze podle metody popisované autory Atherton a Shepard (1989). Kromě toho jsou v předkládaném vynálezu také zahrnuty HCV peptidy, peptidomimetika a mimotopy syntetizované technologiemi dendrimerů (viz Zhang Tam, 1997), polyketidů (viz Carreras a Santi, 1998) nebo inteinů (viz Southworth et al, 1999).

Peptidy podle předkládaného vynálezu mohou také být připraveny prostředky rekombinantních DNA technik, jak bylo například popsáno v práci Sambrook et al. (1989), v prokaryotech nebo nižších či vyšších eukaryotech. Termín „nižší eukaryota se týká hostitelských buněk, jako jsou kvasinky, houby apod. nižší eukaryota jsou obecně (ale ne nutně) jednobuněčná. Termín „prokaryota se týká hostitelů, jako je například E.coli, Lactobacillus, Lactococcus, Salmonella, Streptococcus, Bacillus subtilis nebo

Streptomyces. v předkládaném

Také- tito hostitelé vynálezu. Výhodná nižší jsou zvažovaný eukaryota jsou kvasinky, konkrétně druhy Schizosaccharomyces, Saccharomyces,

Kluiveromyces, Pichia (např. Hansenula Schizosaccharomyces, (např. Pichia pastoris), Hansenula polymorpha) , Schwaniomyces,

Yarowia, Zygosaccharomyces apod.

Saccharomyces cerevisiae, S. Carlsbergensis a K. Lactis jsou nejběžněji používaní kvasinkoví hostitelé a jsou to výhodní houboví hostitelé. Termín „vyšší eukaryota se týká hostitelských buněk pocházející z vyšších zvířat, jako jsou například savci, plazi, hmyz apod. v současnosti výhodné hostitelské buňky vyšších eukaryot pocházejí z čínského křečka

(např. CHO), opice (např. COS a Věro buňky), z ledviny mláďat křečků (BHK), z ledviny prasete (PK15), buňky 13 z ledviny králíků (RK13), buněčná linie 143 B z humánního osteosarkomu, humánní buněčná linie HeLa a buněčné linie z humánního hepatomu, jako je například Hep G2 a hmyzí buněčné linie (např. Spodoptera frugiperda). Hostitelské buňky mohou být poskytovány v suspenzi nebo kulturách v lahvích, ve tkáňových kulturách, orgánových kulturách apod. alternativně hostitelské buňky mohou také být v transgenních zvířatech.

Proteiny podle předkládaného vynálezu mohou také být izolovány ze savčích hostitelů, konkrétně myší nebo primátů, např. lidí, a také primátů jiného než lidského původu.

V oboru je známo, že aminokyseliny mohou být označovány svým plným jménem, třípísmennými zkratkami nebo jednopísmennými symboly (viz např. Stryer, 1981).

Kromě toho se předkládaný vynález týká HCV proteinu nebo jeho části, jak bylo definováno výše, která specificky váže intra- nebo intercelulární hostitelské molekuly (molekuly pocházející od hostitele), jako jsou například (i) receptorové proteiny, např. annexin V, apolipoprotein B, tubulin, protein plazmatické membrány o velikosti 24 kD (Abrigani WO 97/09349/), receptor mannózy, asialoglykoproteinový receptor, (ii) molekuly (proteinové nebo neproteinové sloučeniny) zapojené do oxidačně redukční regulace, např. glutathion, TRX a GRX, (iii) chaperonové proteiny, např. kalnexin, (iv) různé glykozoaminoglykany (peptidové a/nebo sacharidové jádro), a (v) nukleové kyseliny nebo lipidy.

»··· ·· · ··· • · · · • · · · ·

Kromě toho se předkládaný vynález týká HCV proteinu nebo jeho části, jak bylo definováno výše, která specificky váže další HCV protein nebo HCV nukleovou kyselinu (molekuly pocházející z HCV) nebo jejich části, což má za následek homoa/nebo heterooligomerní komplexy.

Komplexy vytvářené z HCV proteinů nebo jejich částí, jak bylo definováno výše, navázaných k jiným molekulám pocházejícím z HCV nebo molekulám pocházejícím z hostitele, jsou hovorově označovány komplex pocházející z HCV. Komplex pocházející z HCV sestává tedy alespoň z HCV proteinu, jak bylo definováno výše, připojeného k další molekule, tj . (HCV-protein)-X, kde X je molekula pocházející z hostitele nebo molekula pocházející z HCV.

Čistý/purifikovaný

Termín purifikovaný nebo zaměnitelně „čistý, jak se používá v tomto textu, se týká preparátu, kde požadované složky, jako například HCV obalové proteiny, zahrnují alespoň 35 % celkových složek v preparátu. Požadované složky výhodně obsahují přibližně alespoň 40 %, výhodněji přibližně alespoň 50 %, ještě výhodněji přibližně alespoň 60 %, ještě výhodněji přibližně alespoň 70 %, dokonce výhodněji přibližně alespoň %, dokonce výhodněji přibližně alespoň 90 %, dokonce výhodněji přibližně alespoň 95 % a nejvýhodněji přibližně alespoň 98 % celkové frakce složek preparátu. Preparát přitom může obsahovat další sloučeniny, jako jsou například sacharidy, soli, lipidy, rozpouštědla, apod., bez ovlivnění zjištění procenta čistoty, jak se v tomto textu používá. Izolovaný HCV protein míní preparát HCV proteinu, který je alespoň z 35 % čistý. V tomto ohledu je jasné, že termín purifikovaný HCV protein, jak se v tomto textu používá, se týká izolovaných HCV proteinů v podstatě čisté formě. Termín

0« • · « 0

v podstatě purifikované HCV proteiny, jak se v tomto textu používá, se týká takových HCV proteinů, které mohou být použity pro in vitro diagnostické metody a léčiva. Tyto HCV proteiny jsou v podstatě bez buněčných proteinů, proteinů pocházejících z vektorů nebo jiných virových složek HCV. Obvykle jsou tyto proteiny purifikovány do homogenity, čisté z alespoň 80 %, výhodně 85 %, výhodněji 90 %, výhodněji 95 %, výhodněji 97 %, výhodněji 98 %, výhodněji 99 %, ještě výhodněji 99,5 % a nejvýhodněji by kontaminující proteiny neměly být detekovatelné obvyklými metodami, jako je například SDS-PAGE a barvení stříbrem.

Protilátky

Předkládaný vynález se také týká protilátky HCV, která může rozpoznávat HCV peptid, jak byl popsán výše.

Kromě toho se předkládaný vynález týká HCV proteinu nebo jeho funkčně rovnocenné části, jak bylo definováno výše, pro zvyšování anti-HCV protilátek, které specificky rozpoznávají HCV protein nebo jeho funkčně rovnocennou část.

Termín protilátka HCV se týká kterékoliv polyklonální nebo monoklonální protilátky vázající se na HCV protein podle předkládaného vynálezu nebo komplex pocházející z HCV.

Navíc termín protilátky HCV také označuje specifické protilátky HCV, které jsou vyvolávány proti epitopům, které jsou důsledkem konformace HCV proteinů díky přítomnosti

S-S můstků v těchto HCV proteinech. Je pozoruhodné, že S-S můstky mohou být vnitřní částí epitopu. Ale oxidačně redukční stav cysteinů (redukované nebo oxidované, v thiolované nebo S-konjugované formě) může měnit nebo stabilizovat konformaci proteinu (v blízkosti těchto cysteinových zbytků nebo ne v jejich blízkosti), což má za následek nové epitopy, které mohou nebo nemusí obsahovat tyto cysteinové zbytky. Tyto nové ·· ···· • · ♦ · · ·

	22	• ·* ···· ·· · · · · * • ·· * · · ······ · • · · · · · · ··· ♦· ·· ··	• · ♦ · · · • · · • · · • · · · • · · · ·· »·
epitopy jsou také částí	vynálezu. Kromě	toho se termín	HCV
protilátka také týká kterékoliv	polyklonální	nebo
monoklonální protilátky	vázající se na	mimotopy, jak	bylo
definováno výše.

Kromě toho se termín protilátka HCV tedy také týká protilátek, které vážou antigenní determinanty plynoucí ze specifické konformace komplexů pocházejících z HCV, tj. protilátek, které vážou antigenní determinanty, které nejsou přítomný buď na HCV peptidu podle předkládaného vynálezu nebo molekula HCV peptidu váže například epitopy, které pocházejí z interakce mezi HCV peptidem podle předkládaného vynálezu a neproteinovými sloučeninami, jako jsou například glykozaminoglykany (GAG), heparin, nukleové kyseliny, lipidy, kofaktory, jako například kovové ionty, apod. navíc antigenní determinanty mohou být tvořeny konformační změnami, jako jsou například zavedené zpracováním proteinu, štěpením nebo změnami pH.

Termín epitop se týká té části komplexu antigenprotilátka, která je specificky vázána kombinačním místem protilátky. Epitopy mohou být určeny kteroukoliv technikou v oboru známou nebo mohou být předpovězeny celou řadou počítačových predikčních modelů v oboru známých.·

Výrazy rozpoznávající, vazebný nebo vytvoření komplexu protilátka-protein, jak se používají v předkládaném vynálezu, jsou interpretovány tak, že vazba, tj. interakce mezi antigenem a protilátkou, nastane za všech podmínek, které respektují imunologické vlastnosti protilátky a antigenu.

Kromě toho existují různé další postupy, o kterých je známo, že umožní získat HCV peptidy, které se liší od postupu podle předkládaného vynálezu. Tyto jiné procedury by mohly poskytnout HCV peptidy schopné prezentovat epitopy. Je představitelné, že HCV peptidy, získané těmito různými a »9 «999

9« 9999 • 99

9· *

9 9 9

9 9

99 9«

9 »99

9 9 9 9 *

9 9 « 9 9 fl

99 99 odlišnými procedurami, jsou schopny prezentovat epitopy podobné epitopům podle předkládaného vynálezu. Podobné epitopy jsou tedy epitopy vyplývající z různých produkčních nebo purifikačních postupů, než způsob podle předkládaného vynálezu, ale jsou rozeznatelné jednou a tutéž protilátkou. Nicméně proteiny podle předkládaného vynálezu prezentují epitopy extrémně účinné. Tudíž jsou epitopy na proteinech více imunogenní. Předkládaný vynález se tudíž také týká epitopu na proteinech, kde epitopy jsou alespoň 10 krát, výhodně alespoň 20 krát, výhodně alespoň 50, výhodně alespoň 100 krát, výhodně alespoň 500 krát a nejvýhodněji alespoň 1 000 krát více imunogenní než epitopy na HCV peptidech, které nejsou vytvořeny způsobem podle předkládaného vynálezu a které nemají cysteinylové zbytky s reverzibilním oxidačně redukčním stavem. Odborník ocení, že imunogenicita může být například detekována, a proto srovnávána očkováním savců pomocí podávání srovnatelných množství peptidů vytvořených každou z metod.

Konkrétněji se termín protilátka HCV týká protilátky vázající se k přírodním, rekombinantním nebo syntetickým HCV proteinům, konkrétně vázající se k přírodním, rekombinantním nebo syntetickým El, Els, Elp a/nebo NS3 proteinům pocházejícím z HCV nebo jeho kterékoliv funkčně rovnocenné varianty nebo části (anti-HCV-ΕΙ-, anti-HCV-Els-, anti-HCVElp- nebo HCV-NS3-protilátka, v daném pořadí). Protilátka HCV může být přítomna ve vzorku tělesné tekutiny a může to být HCV-El-protilátka, HCV-Els-protilátka, HCV-Elp-protilátka nebo HCV-NS3-protilátka.

Termín monoklonální protilátka používaný v tomto textu se týká protilátkového přípravku majícího homogenní protilátkovou populaci. Termín není omezován s ohledem na druh nebo zdroj protilátky ani není zamýšleno, aby byl limitován způsobem, jak je protilátka vyrobena. Proto termín ·· » 0 • ··

0 0

0 Ο

000 ·*

0« 0040 00 0000 β 0 0 0 0

0·· »00 » 0 0 0 0 0 ·

00 0 0 00 ·

00 0 · 00 protilátka označuje také protilátky pocházející od velbloudů (jednohrbý a dvouhrbý) nebo rodu lama.

Termín protilátka se tedy také týká protilátek pocházejících z technologie vystavování na fágu („phage display) nebo programů na screening léků.

Kromě toho se termín protilátka také týká humanizovaných protilátek, ve kterých alespoň část úseků čtecího rámce imunoglobulinu pochází ze sekvence humánního imunoglobulinu a jednořetězcových protilátek, jak bylo popsáno v patentu Spojených Států č. 4 946 778, a fragmentů protilátek, jako jsou například F_ab, F_(ab)₂, F_v, a další fragmenty, které si podržely funkci vázat antigen a specificitu základní protilátky. Termín protilátka se také týká tzv. „diabodies, „triabodies nebo multimerních (mono-, bi-, tetra- nebo polyvalentních/ mono-, bi- nebo polyspecifických) protilátek, a také tzv. „enzybodies, tj . umělých protilátek s enzymovou aktivitou. Kombinace protilátek s kteroukoliv jinou molekulou, která zvýší afinitu nebo specificitu, jsou také zahrnuty v termínu protilátky. Protilátky také zahrnují modifikované formy (např. mPEGylovanou nebo polysialylovanou formu (Femandes & Gregoriadis, 1997), a také formy vázané kovalentně nebo nekovalentně k polymeru.

Kromě toho se termín protilátka také týká sloučenin napodobujících protilátky kterékoliv povahy, pocházející například od lipidů, sacharidů, nukleových kyselin nebo analogů, např. PNA, aptamerů(viz Jayasena, 1999).

HCV protilátky mohou být indukovány očkováním nebo mohou být pasivně přeneseny injekcí po purifikaci protilátek z poolů krve infikované HCV nebo z krve získané od osob očkovaných proti HCV.

····· ·· ·· ·· · ·

Předkládaný vynález se také týká kitu (soupravy) obsahujícího protilátky HCV pro detekci HCV peptidů, jak byly definovány v tomto textu.

Purifikační postup

Vynález se dále týká purifikačního postupu, jak byl popsán v tomto textu, který poskytuje HCV proteiny, ve kterých má alespoň jeden cysteinylový zbytek reverzibilní oxidačně redukční stav, a také HCV proteinů získatelných tímto purifikačním postupem. V průběhu purifikace jsou alespoň cysteinové zbytky reverzibilně chráněny chemickými a/nebo enzymatickými prostředky (viz také část příklady).

V tomto ohledu se termín reverzibilní oxidačně redukční stav, jak se v tomto textu používá, týká síry cysteinů, které mají schopnost změny od redukovaného stavu k oxidovanému stavu a naopak. Tato změna oxidačně redukčního stavu zahrnuje transfer elektronu. Termín oxido-reduktázová aktivita, jak se v tomto textu používá, se týká oxidačně redukčního potenciálu oxidačně redukčního aktivního centra, a tak jeho schopnosti přenést elektrony od molekul substrátu a k nim. Tato schopnost je závislá oxidačně redukčním potenciálu molekul substrátu a chemickém prostředí.

Nativní HCV proteiny mají specifickou konformaci a mohou projevovat biologickou aktivitu. Purifikační postup podle předkládaného vynálezu má za následek purifikované HCV proteiny s biologickou aktivitou a/nebo konformaci, která je totožná nebo téměř totožná (podobná nativní) s nativní biologickou aktivitou a/nebo konformaci HCV proteinů. Purifikační postup podle předkládaného vynálezu je charakterizovaný následujícím:

·· ·· ···· ·· ···· ···«·· · · · · · ·· · · · · · · ·· · ··· · · · · ·· · · ··

A) První fáze purifikačního postupu podle předkládaného vynálezu je určena k tomu, aby reverzibilně chránila reaktivitu cysteinových zbytků.

V podstatě se první fáze skládá z postupu, jak byl obsáhle popsán v PCT EP95/03031, Maertens et al., ale s jedním základním rozdílem, že konkrétně cysteinové zbytky jsou reverzibilně chráněny.

Reverzibilní ochrany cysteinových zbytků může být dosaženo jednou z následujících podmínek (i) modifikační skupinou nebo (ii) stabilizací thiolů a/nebo disulfidovými můstky. V podstatě tato ochrana stabilizuje HCV protein, tj. thioly a/nebo disulfidové můstky nemají tendenci reagovat.

Proto má první fáze nakonec poskytuje čistý produkt s reverzibilně chráněnými cysteiny.

B) Druhá fáze purifikačního postupu podle předkládaného vynálezu je určena k obnovení reaktivity cysteinových zbytků.

Podmínky, ve kterých jsou cysteinové zbytky reverzibilně chráněny, jsou odstraněny po první fázi purifikačního postupu.

Toto odstranění umožní obnovu reverzibilního oxidačně redukčního stavu cysteinových zbytků. Tak je konečně získán HCV peptid nebo jeho kterákoliv funkčně rovnocenná část, ve které mají cysteinové zbytky reverzibilní oxidačně redukční stav.

Reverzibilní oxidačně redukční stav poskytuje reaktivní HCV proteiny s biologickou aktivitou a/nebo s konformací podobnou nativnímu proteinu.

Proto se předkládaný vynález týká HCV proteinu nebo jakékoliv jeho funkčně rovnocenné části, obsahující alespoň dvě Cys aminokyseliny, které máji reverzibilní oxidačně ·· Φ· ···· ·· ···· • · · · · · · · · · · • · · ···· · φ φ · • · · · · φ · · · φ · · φ redukční stav, jak bylo definováno výše, dosažitelný následujícím postupem, který zahrnuje kroky:

(a) purifikace HCV proteinu nebo jeho kterékoliv funkčně rovnocenné části, ve kterém jsou cysteinové zbytky reverzibilně chráněny chemickými a/nebo enzymatickými prostředky, (b) odstranění reverzibilně ochranného stavu cysteinových zbytků, (c) získání HCV proteinu nebo jeho kterékoliv funkčně rovnocenné části, ve kterém mají cysteinové zbytky reverzibilní oxidačně redukční stav.

Předkládaný vynález se také týká tohoto druhého uvedeného postupu.

Volitelně jsou přidávány kofaktory a antioxidanty, aby napomohly stabilizaci proteinu.

Je třeba rozumět, že účelem reverzibilní ochrany je stabilizovat HCV protein. Obzvláště po reverzibilní ochraně je funkční skupina obsahující síru (např. thiolů a disulfidů) udržována v nereaktivních podmínkách.' Funkční skupina obsahující síru je tak neschopna reakce s jinými sloučeninami, např. není tendence k tvoření nebo výměně disulfidových vazeb, jako jsou například:

Rl-SH + R₂-SH —x—>

R_x-S-S-R₂ + r₃-sh -x->

Ri~S-S-R₂ + R₃—S-S-R4 — x->

Ri~S-S-R₂,

Ri~S-S-R₃ + r₂-sh,

Ri-S-S-R₃ + R2-S-S-R4

Popisované reakce mezi thioly nebo disulfidovými zbytky nejsou omezeny na intermolekulární procesy, ale mohou také nastat intramolekulárně.

Termín reverzibilně chránící, jak se v tomto textu používá, označuje kovalentní vazbu modifikačních činidel ·· ·· ···· ·· ···· ····· · · · · · ····· · · · β ·· · · k cysteinovému zbytku, a také takovou manipulaci prostředí HCV proteinu, že oxidačně redukční stav thiolových skupin zůstane neovlivněn v následujících krocích purifikačního postupu (krytí).

Reverzibilní ochrana cysteinových zbytků může být uskutečněna chemicky nebo enzymaticky.

Termín reverzibilní ochrana enzymatickými prostředky, jak se v tomto textu používá, označuje reverzibilní ochranu zprostředkovanou enzymy, jako jsou například acyltransferázy, např. acyltransferázy, které jsou zapojeny do katalýzy thioesterifikace, jako je například palmitoylacyltransferáza (viz níže a Das et al, 1997).

Termín reverzibilní ochrana chemickými prostředky, jak se v.tomto textu používá, označuje reverzibilní ochranu:

(1) modifikačními činidly, která reverzibilně modifikují cysteinylové zbytky, jako například sulfonací a thio-esterifikací,

Sulfonace je reakce, kde thiol nebo cysteiny zapojené do disulfidových můstků jsou modifikovaný na S-sulfonát: RSH -> RS-SO₃” (André Darbre) nebo RS-SR -> 2 RS-SO3 (sulf itolýza, Kumar et al, 198 6) . činidla pro sulfonací jsou např. Na₂SO3 nebo tetrathionát sodný. Druhá uvedená činidla pro sulfonací jsou použita v koncentraci 10 - 200 mM a výhodněji v koncentraci 50 - 200 mM. Volitelně sulfonace může být prováděna v přítomnosti katalyzátoru, jako je například Cu²⁺(100 μΜ -1 mM) nebo cystein (1 - 10 mM).

Reakce může být prováděna v protein denaturujících podmínkách, a také v nativních podmínkách (Kumar et al., 1985, Kumar et al. , 198 6).

Vytvoření thioesterové vazby nebo thio-esterifikace je charakterizována rovnicí:

• ·· 9 · ···· ·· ···« · · · · · ··· 9·· ···

999 9 999 9 9 • · 9 · 9 · 9 · · 9 9

999 9 4 99 99 99 99

RSH + R'COX -> RS-COR' kde X je výhodně halogenid ve sloučenině R'CO-X.

(2) modifikačními činidly, která reverzibilně modifikují cysteinylové zbytky podle předkládaného vynálezu, jako jsou například těžké kovy, konkrétně Zn²⁺, Cd²⁺ (Matts et al, 1991), mono-, dithio- a disulfidové sloučeniny (např. aryl- a alkytmethanthiosulfonát, dithiopyridin, dithiomorfolin, dihydrolipoamid, Ellmannovo činidlo, aldrothiol™ (Aldrich) (Rein et al, 1996), dithiokarbamáty) nebo thiolační činidla (např. glutathion, N-acetylcystein, cysteinamin). Dithiokarbamát zahrnuje širokou skupinu molekul majících funkční skupinu RxR₂NC (S) SR₃, která jim propůjčuje schopnost reagovat se sulfydrylovými skupinami. Sloučeniny obsahující thiol jsou výhodně použity v koncentraci 0,1 - 50 mM, výhodněji v koncentraci 1 - 50 mM a ještě výhodněji v koncentraci 10-50 mM, (3) přítomností modifikačních činidel, která chrání stav thiolu (stabilizují), konkrétně antioxidanty, jako je například DTT, dihydroaskorbát, vitamín s a deriváty, mannitol, aminokyseliny, peptidy a deriváty (např. histidin, ergothionein, karnozin, methionin), galáty, hydroxyanisol, hydoxytoluen, hydrochinon, hydroxymethylfenol a jejich deriváty v rozsahu koncentrace 10 μΜ-10 mM, výhodněji v koncentraci 1-10 mM, (4) podmínkami stabilizujícími thiol, jako například (i) kofaktory, jako jsou kovové ionty (Zn²⁺, Mg²⁺) , ATP, (ii) kontrolou pH (např. pro proteiny ve většině případů pH ~5 nebo pH je výhodně thiol pK_a-2, např. pro peptidy purifikované chromatografii s převráceným poměrem fází v pH ~2).

Kombinace reverzibilního ochrany, jak bylo popsáno v (1), (2), (3) a (4) může poskytnout podobně čisté a opětně složené HCV proteiny. V podstatě mohou být použit kombinační • · · ·

sloučeniny, jako je například Z103 (Zn karnosin), výhodně v koncentraci 1 - 10 mM.

Mělo by být jasné, že reverzibilní ochrana se také týká, kromě modifikačních skupin nebo ochrany popisované výše, kteréhokoliv způsobu chránění cysteinylových zbytků, který může být zvrácen enzymaticky nebo chemicky bez porušení peptidové kostry. V tomto ohledu se předkládaný vynález specificky týká peptidů připravených klasickou chemickou syntézou (viz výše), ve kterých jsou například thioesterové vazby štěpeny thioesterázou, bazickými podmínkami pufru (Beekman et al., 1997) nebo ošetřením hydroxylaminem (Vingerhoeds et al, 1996).

HCV proteiny obsahující thiol mohou být purifikovány, například na pryskyřicích pro afinitní chromatografií, které obsahují (1) štěpitelné konektorové raménko obsahující disulfidovou vazbu (např. imobilizovaná 5,5'-dithiobis-(2nitrobenzoová kyselina) (Jayabaskaran et al., 1987) a kovalentní chromatografie na aktivované koloně thiol-Sepharose 4B (Pharmacia)) nebo (2) aminohexanoyl-4-aminofenylarsin jako imobilizovaný ligand. Druhá uvedená afinitní matice byla použita pro purifikaci proteinů, které jsou podrobeni oxidačně redukční regulaci a dithiolových proteinů, které jsou cíli pro oxidační stres (Kalef et al., 1993).

Reverzibilní ochrana může také být použita ke zvýšení solubilizace a extrakce peptidů (Pomroy a Deber, 1998).

Reverzibilní ochrana a sloučeniny stabilizující thiol mohou.být prezentovány v monomerní, polymerní nebo lipozomické formě.

Odstranění reverzibilně ochranného stavu cysteinových zbytků může být prováděno chemicky nebo enzymaticky např.:

redukčním činidlem, jako je konkrétně DTT, DTE, 2-merkaptoethanol, dithionit, SnCl₂, borohydrid sodný, ··· · * «· * · · · · · hydroxylamin, TCEP, obzvláště v koncentraci 1 - 200 mM, výhodněji v koncentraci 50 - 200 mM, odstraněním podmínek nebo činidel stabilizujících thiol např. zvýšením pH, enzymy, jako jsou konkrétně thioesterázy, glutaredoxin, thioredoxin, obzvláště v koncentraci 0,01 - 5 μΜ, ještě výhodněji v koncentraci 0,1-5 μΜ, kombinací výše popsaných chemických a/nebo enzymatických podmínek.

Odstranění reverzibilně ochranného stavu cysteinových zbytků může být uskutečněno in vitro nebo in vivo,· např. v buňce nebo v organizmu.

Rozumí se, že po druhé fázi purifikačního postupu, cysteinové blokovány nemusí být kterýmkoliv ireverzibilně reverzibilním zbytky mohou nebo nebo nahrazeny modifikačním činidlem, jak uvedeny výše.

Redukční činidlo podle předkládaného vynálezu je kterékoliv činidlo, které docílí redukce síry v cysteinových zbytcích, např. S-S disulfidových můstků, desulfonace cysteinového zbytku (RS-SCh^- -> RSH). Antioxidant je kterékoliv činidlo, které konzervuje stav thiolu nebo minimalizuje vytváření a/nebo výměnu S-S. Redukce S-S disulfidových můstků je chemická reakce, přičemž disulfid je redukován na thiol (-SH). Činidla a metody rozbíjející disulfidový můstek popsané ve WO 96/04385 jsou tímto zahrnuty formou odkazu v předkládaném popisu. S-S redukce může být dosaženo (1) dráhami enzymatické kaskády nebo (2) redukcí sloučenin. Je známo, že enzymy, jako je například thioredoxin, glutaredoxin, jsou zapojeny do in vivo redukce disulfidů, a také bylo ukázáno, že jsou být účinné v redukci S-S můstků in vitro. Disulfidové vazby jsou rychle štěpeny redukovaným * ·· ·* ···♦ 44 44*4 • · · ♦ ·· · * · ·

44» 444 4*4 *44 4 4 4 4 * ·

4* 4*4* 4*4 4

4 4 4 4 4 4 44 4* 44 thioredoxinem v pH 7,0, se zjevnou rychlostí druhého řádu, která je přibližně 10⁴ krát větší než odpovídající rychlostní konstanta pro reakci s DTT. Redukční kinetika může být dramaticky zvýšena preinkubací proteinového roztoku s lmM DTT nebo dihydrolipoamidem (Holmgren, 1979).

Thiolové sloučeniny schopné redukovat proteinové disulfidové můstky jsou dithioerythritol (DTE), bis(2-merkaptoethyl)sulfon a sodiumdithionit.

například dithiothreitol (DTT),

3-merkaptoethanol, thiokarbamáty, a N,N'-bis(merkaptoacetyl)hydrazin

Redukční činidla bez thiolových skupin, jako například askorbát nebo chlorid cínatý (SnCl2), která byla ukázána jako velmi užitečná v redukci disulfidových můstků v monoklonálních protilátkách (Thakur et al., 1991), mohou také být použita pro redukci HCV proteinů. Kromě toho změny v pH hodnotách mohou ovlivňovat oxidačně redukční stav HCV proteinů. Bylo ukázáno, že ošetření borohydridem sodným je účinné pro redukci disulfidových můstků v peptidech (Gailit, 1993). Tris(2karboxyethyl)fosfin (TCEP) je schopný redukovat disulfidy při nízkém pH (Burns et al., 1991). Selen katalyzuje redukci disulfidů na thioly, když je jako redukční činidlo použit DTT nebo borohydrid sodný. Selenocysteamin, komerčně dostupný diselenid, byl použit jako prekurzor katalyzátoru (Singh a Kats, 1995).

Je nutno znovu zdůraznit, že celý obsah dokumentů citovaných výše, včetně všech definic, je zahrnut formou odkazu v předkládané přihlášce. Proto jsou všechny výše uvedené metody a sloučeniny pro modifikaci oxidačně redukčního stavu HCV proteinů uvažovány v předkládaném vynálezu.

• » ·* ···· ·· 9··· ·9«· · · · © ·»♦··· · * 9 9 · « · · © 9 · 9 9999

99© · © ©9 99 9* 9©

Biologicky aktivní místo

Předkládaný vynález se dále týká HCV proteinů obsahujících biologicky účinný CXXC-motiv. Termíny biologicky účinný a oxido-reduktázová aktivita, jak se v tomto textu používají, uvažují o CXXC-místu v HCV peptidu nebo jeho funkčně rovnocenné části, s reverzibilním oxidačně redukčním stavem, které má schopnost zprostředkovat různé intra- a extracelulární biochemické a biologické funkce, jako například výměnné reakce thiol/disulfid, vazbu přechodných kovů, inkorporaci lipidu a regulační aktivity (např. kontrola genové transkripce, regulace signální transdukce, včetně působení jako cytokin, apod. a kontrola (de)thiolačního stavu proteinů).

Strukturální nebo konformační změny prováděné cysteinylovým oxidačně redukčním stavem mohou být sledovány biofyzikálními metodami, jako je například spektrofotometrie (absorbance, cirkulární dichroismus, infračervené světlo, fluorescence, NMR) nebo imunochemickými metodami (např. ELISA, EIA, apod.), které jsou založeny na výskytu nebo úbytku epitopů. Sekvence zapojené do epitopů mohou být identifikovány hmotovou spektrometrií (MS) a sekvencováním po zesítění a afinitní purifikaci komplexu. Konformační nebo nově zjistitelné lineární epitopy mohou vyplývat z procesů skládání na terciárním nebo kvartérním stupni struktury.

Inkorporace kovového iontu do aktivního místa může být měřena měřením radioaktivního rozpadu nebo atomovou absorpční spektrometrií.

Vazba HCV proteinů podle předkládaného vynálezu k jiným molekulám, jako jsou například receptory, sacharidy, lipidy, nukleové . kyseliny (viz také výše) může být studována pomocí např. FACS, Biacore, imunologickými testy (Western blot, EIA, * · · ·

ELISA, apod.), zesítěním a chromatografickými metodami (např. afinitní chromatografie, gelová filtrace).

Thioredoxinová enzymatická aktivita HCV proteinů může být identifikována studiem potenciálu redukovat disulfidové můstky podle způsobu popsaného autory Holmgren et al. (1979). Účinek kofaktorů, jako je například DTT nebo dihydrolipoamid, může být v tomto způsobu také ověřen. Jako substráty mohou být vzaty neproteinové sloučeniny (např. Ellmannovo činidlo, aldrothiol) , a také proteiny (např. agregovaný inzulín).

Tvorba smíšených disulfidů (viz níže) je aktivita, která je ve vztahu ke skládání proteinu a obnově aktivního místa. Tvorba smíšených disulfidů může být demonstrována reverzibilní ochranou nebo ireverzibilní blokádou thiolových skupin před ošetřením redukčním činidlem a po ošetření s ním, s různými činidly (např. DTT), jako jsou například popisovány v purifikačním postupu, což je následováno analýzou hmotovou spektrometrií.

pKa thiolových skupin v proteinu obsahujícím -CXXC- je definována působením alkylačních činidel ve funkci pH (titrace). Rozdílná ochrana a/nebo blokáda zbytků a MS dávají informaci o reakci iniciující cysteinylový zbytek v místě CXXC. Sekvencování amino-koncových aminokyselin může dát informaci o zpracování, štěpných produktech a doménové struktuře HCV proteinu.

Tkáňová a intracelulární distribuce těchto štěpných produktů je zjišťována imunohistochemickými metodami.

Vakcína

Předkládaný vynález se také týká přípravku obsahujícího protein, jak byl definován výše. Konkrétněji se předkládaný vynález týká vakcinačního přípravku. Termín vakcinační ft ·· ·· ···· ·· ftftft· ftftftft·· ··« · ft·· ftft* ··· ftftftft·· ···· · ··· ·· · ft · · · · ·· přípravek se týká imunogenního přípravku schopného vyvolat ochranu před HCV, ať parciální nebo kompletní. Zahrnuje proto HCV peptidy, proteiny, polynukleotidy, molekuly pocházející z HCV nebo částice pocházející z HCV, jak bylo definováno výše. Ochrana proti HCV se týká konkrétně lidí, ale týká se také primátů jiného než lidského původu, myší trimera (Zauberman et al., 1999) nebo dalších savců.

Proteiny podle předkládaného vynálezu mohou být použity jako takové, v biotinylované formě (jak vysvětleno ve WO 93/18054) a/nebo v komplexu s Neutralitě Avidin (Molecular Probes Inc., Eugene, OR, USA). Je také nutné poznamenat, že vakcinační přípravek obsahuje kromě účinné látky, vhodný excipient, ředidlo, nosič a/nebo adjuvans, které samo o sobě neindukuje produkci protilátek škodlivých jednotlivci přijímajícímu přípravek ani nevyvolá ochranu. Vhodné nosiče jsou typicky velké pomalu metabolizované makromolekuly, jako jsou například proteiny, polysacharidy, polymléčné kyseliny, polyglykolové kyseliny, polymerní aminokyseliny, kopolymery aminokyselin a inaktivní virové částice. Tyto nosiče jsou odborníkům známy. Výhodná adjuvancia ke zlepšení účinnosti přípravku zahrnují bez omezení: koloidní hydroxid železa (Leibl et al., 1999), hydroxid hlinitý, hliník v kombinaci s 3-0-deacylovaným monofosforyllipidem A, jak bylo popsáno ve WO 93/19780, fosfát hlinitý, jak bylo popsáno ve WO 93/24148, N-acetylmuramyl-L-threonyl-D-isoglutamin, jak bylo popsáno v patentu Spojených Států č. 4 606 918, N-acetylnormuramyl-Lalanyl-D-isoglutamin, N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamylL-alanin-2-(1'2'dipalmitoy1-sn-glycero-3-hydroxyfosforyloxy)ethylamin a RIBI (ImmunoChem Research Inc., Hamilton, MT, USA) který obsahuje monofosforyllipid A, detoxikovaný endotoxin, trehalózo-6,6-dimykolát a skelet buněčně stěny (MPL + TDM + CWS) v emulzi 2% skvalen/Tween 80. Kterákoliv ze tří složek MPL, TDM nebo CWS může také být použita samotná nebo spojená 2 ·♦ ·<·««· ·« • · · · · ♦ · »· · · · · · · ····· · · · ♦ · s 2. Navíc mohou být použita adjuvancia, jako je například Stimulon (Cambridge Bioscience, Worcester, MA, USA) nebo SAF-1 (Syntex), a také adjuvancia, jako je například kombinace mezi QS21 a 3-de-O-acetylovaným monofosforyllipidem A (W094/00153) nebo MF-59 (Chiron) nebo adjuvancia na základě póly[di(karboxylatofenoxy)fosfazenu] (Virus Research Institute) nebo adjuvancia založená na blokovém kopolymerů, jako je například Optivax (Vaxcel, Cythx) nebo adjuvancia založená na inulinu, jako je například Algammulin a Gammalnulin (Anutech), nekompletní Freundovo adjuvans (IFA) nebo přípravky Gerbu (Gerbu Biotechnik). Rozumí se, že kompletní Freundovo adjuvans (CFA) může být použito pro aplikace jiné než týkající se člověka, a také pro výzkumné účely. Vakcinačni přípravek dále obsahuje excipienty a ředidla, která jsou podstatně netoxická a bez terapeutického účinku, jako je například voda, fyziologický roztok, glycerol, ethanol, smáčedla nebo emulgátory, pH pufry, konzervační činidla apod. reverzibilní modifikace cysteinylových zbytků HCV peptidů podle předkládaného vynálezu umožňuje, že tyto HCV peptidy mohou být kovalentně kondenzovány k chemicky aktivované molekule nosiče, jako jsou například polymery nebo lipozomy nebo že HCV peptid samotný funguje jako nosič pro vazbu jiných HCV příbuzných nebo HCV nepříbuzných imunogenních proteinů (smíšené vakcíny). HCV peptidy spojené s lipozomy pomocí thioesteru mají výhodu, že vazby jsou porušeny in vivo hostitelovými thioesterázami, což má za následek pomalé uvolňování antigenu a prezentaci. Inkorporace nebo vazba HCV peptidu k polymeru nebo lipozomu může . také být založena na nekovalentních interakcích využívajících afinitu mezi ligandy.

Typicky je vakcinačni přípravek připraven ve formě pro injekci, buď jako kapalný roztok nebo suspenze. Mohou také být připraveny pevné formy vhodné pro přípravu roztoku nebo suspenze v kapalných vehikulech před injekcí. Přípravek může • 4« 4* 4444 44 ·4·0 ······ 4 4 4 · • 44 4 4 4 · « « • 4 444 4 444 4 4 ··· 4 · · 4 4 4··

44··· ·4 ·· 44 04 také být emulgován nebo opouzdřen v lipozomech pro zesílení účinku adjuvans. Polypeptidy mohou také být inkorporovány do imunitních stimulačních komplexů spolu se saponiny, například Quil A (ISCOMS). Vakcinační přípravky obsahují imunologicky účinné množství polypeptidů podle předkládaného vynálezu, a také kteroukoliv další výše uvedenou složku. Imunologicky účinné množství znamená, že podávání tohoto množství jednotlivci, buď v jedné dávce nebo jako součást série, je účinné pro prevenci nebo léčbu. Toto množství se mění v závislosti na zdraví a fyzikálním stavu léčeného jednotlivce, taxonomické skupině léčeného jednotlivce (např. člověk, primát jiného než lidského původu, primát, apod.), kapacitě individuálního imunitního systému zahájit účinnou imunitní reakci, požadované míře ochrany, formulaci vakciny, stanovení ošetřujícího lékaře, infikujícím kmeni HCV a dalších relevantních faktorech. Očekává se, že množství bude spadat do relativně širokého rozsahu, které může být určováno rutinními klinickými zkouškami. Obvykle množství kolísá od 0,01 do 1000 gg/dávka, konkrétněji od 0,1 do 100 gg/dávka. Vakcinační přípravky jsou konvenčně podávány parenterálně, typicky injekcí například subkutánně nebo intramuskulárně. Další formulace vhodné k jiným způsobům podávání zahrnují perorální formulace a čípky. Dávkování při léčbě může být podle schématu jedna dávka nebo několikanásobná dávka. Vakcína může být podávána ve spojení s jinými imunoregulačními činidly.

DNA vakcína

Intracelulární prostředí hostitele může poskytnout základ pro reverzibilní oxidačně redukční stav HCV proteinů podle předkládaného vynálezu. V tomto ohledu by mělo být jasné, že HCV DNA vakcinační přípravek obsahuje plazmidový vektor obsahující polynukleotidovou sekvenci kódující HCV «·» · ·· «·· · protein, jak byl popsán výše, operativně navázaný k transkripčním regulačním prvkům. Termín plazmidový vektor, jak se v tomto textu používá, se. týká molekuly nukleové kyseliny schopné transportovat další nukleovou kyselinu, se kterou byla spojena. Výhodné vektory jsou vektory schopné autonomní replikace a/nebo exprese nukleových kyselin, se kterými byly spojeny. Obecně, ale bez omezení pouze na ně, jsou plazmidové vektory cirkulární dvojvláknové smyčky DNA, které ve své formě vektoru nejsou vázány k chromozómu. Termín polynukleotidová sekvence, jak se v tomto textu používá, se týká polynukleotidů, jako je například deoxyribonukleová kyselina (DNA), a kde je to odpovídající, ribonukleová kyselina (RNA). Rozumí se, že termín by měl také zahrnovat buď RNA nebo a jednovláknové antisense) a dvojvláknové polynukleotidy. Termín transkripční regulační prvky, jak se v tomto textu používá, se týká nukleotidové sekvence, která obsahuje esenciální regulační prvky, takže po zavedení do živé buňky obratlovce je schopná řídit buněčné mechanismy, aby vytvářely translační produkty kódované polynukleotidem. Termín „operativně navázaný nebo operativně spojený se týká postavení vedle sebe, přičemž složky jsou konfigurovány tak, aby vykonávaly své funkce. Transkripční regulační prvky operativně s nukleotidovou sekvencí jsou tedy schopné provádět expresi nukleotidové sekvence. Odborníci ocení, že mohou být úspěšně použity různé transkripční promotory, terminátory, nosičové vektory nebo specifické genové sekvence.

jako ekvivalenty analogy z nukleotidových analogů

DNA vytvořené (sense nebo obvyklé spoj ené

Předkládaný vynález se tedy také týká použití HCV proteinu, jak byl definován v tomto textu, pro profylaktickou indukci imunity proti HCV (profylaktická vakcínu). Je nutné poznamenat, že vakcína může také být použitelná pro léčbu

999 9 «« ·««·

9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 • ·· · 9 9 9 9

99 99 99 jednotlivce, jak poukázáno výše, v tomto případě je nazývána terapeutická vakcína.

Z výše uvedeného je jasné, že předkládaný vynález se také týká použití proteinu, jak byl definován výše, nebo přípravku, jak byl definován výše, pro výrobu HCV vakcinačního přípravku. Konkrétně se předkládaný vynález týká použití proteinu, jak byl definován v tomto textu, pro indukci imunity proti HCV u chronického HCV nosiče. Konkrétně se předkládaný vynález týká použití proteinu, jak byl definován v tomto textu, pro indukci imunity proti HCV u chronického HCV nosiče před kteroukoliv jinou terapií, současně s ní nebo po ní, jako je například známá terapie interferonem buď v kombinaci s podáváním malých léků pro léčení HCV, jako je například ribavirin, nebo bez kombinace. Takový přípravek může také být použit před transplantací jater nebo po ní nebo po předpokládané infekci, jako je například poranění špičkou jehly. Kromě toho se předkládaný vynález týká kitu obsahujícího HCV proteiny podle předkládaného vynálezu pro detekci HCV protilátek přítomných v biologickém vzorku.

Termín biologický vzorek, jak se v tomto textu používá, se týká vzorku tkáně nebo tekutiny izolované od jednotlivce, včetně například, ale bez omezení, séra, plazmy, lymfatické tekutiny, vnějších částí kůže, respiračního, intestinálního a močopohlavního traktu, oocytů, slz, slin, mléka, krvinek, nádorů, orgánů, gastrických sekretů, hlenu, míšní tekutiny, vnějších sekretů, jako jsou například exkrementy, moč, spermie, apod.

Protože HCV proteiny podle předkládaného vynálezu jsou vysoce imunogenní a stimulují jak humorální tak buněčnou imunitní reakci, předkládaný vynález se také týká kitu pro detekci reakce T lymfocytů se vztahem k HCV, obsahující HCV protein posle předkládaného vynálezu. Reakce T lymfocytů se vztahem k HCV může například být měřena tak, jak bylo popsáno ·· » « ·· ·* ·Μ«

4« 444* v PCT/EP 94/03555, Leroux-Roels et al. Mělo by být zdůrazněno, že celý obsah tohoto dokumentu, včetně všech definic, je zahrnut formou odkazu v předkládané přihlášce.

Předkládaný vynález se také týká přípravku, jak byl definován výše, který také obsahuje proteiny jádra HCV, El, E2, P7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NSSA a/nebo NS5B proteiny nebo jejich části, částice El, E2, a/nebo E1E2 mohou například být spojeny s antigeny stimulujícími T lymfocyty, jako jsou například proteiny jádra, P7, NS3, NS4A, NS4B, NS5A a/nebo NS5B.

Navíc předkládaný vynález také uvádí použití proteinu, jak byl popsán výše, nebo přípravku, jak byl popsán výše, pro detekci protilátek proti HCV proteinům. Termín pro detekci, jak se v tomto textu používá, se týká kteréhokoliv testu v oboru známého vhodného pro detekci. Konkrétně se termín týká kteréhokoliv imunotestu, jak byl popsán ve WO 96/13590.

Screening léků

Vynález poskytuje způsoby identifikace sloučenin nebo činidel, která mohou být použita k léčbě chorobných stavů charakterizovaných (nebo spojených s) infekcí HCV. Tyto způsoby jsou také nazývány v tomto textu jako screeningové testy léků nebo biologické testy a typicky zahrnují screening uvažované/testované sloučeniny nebo činidla na schopnost interagovat (např. vazba) s HCV proteinem pro modulaci interakce HCV proteinu a cílové molekuly a/nebo pro modulaci exprese HCV nukleové kyseliny a/nebo aktivity HCV proteinu. Uvažované/testované sloučeniny nebo činidla, která mají jednu nebo více těchto schopností, mohou být použita jako léky k léčbě chorobných stavů charakterizovaných infekcí HCV, exprese HCV nukleové kyseliny a/nebo aktivitou HCV proteinu. Uvažované/testované sloučeniny, jako jsou například malé

00 • 0 00 0* 0 00 0

00 000 00« •0 «00 · 000 0 0

000 0009 0900

000 0* 00 00 00 09

0000 molekuly, např. malé organické molekuly a jiné uvažované léky mohou být získány například z kombinatorických knihoven a knihoven přírodních produktů.

V jednom provedení vynález poskytuje testy pro screening uvažovaných/testovaných sloučenin, které interagují (např. vazba) s HCV proteinem nebo nějakou jeho funkčně rovnocennou částí. Testy jsou typicky bezbuněčné testy, které zahrnují kroky kombinace HCV proteinů podle předkládaného vynálezu, jeho katalytické, tj . s oxido-reduktázovou aktivitou, nebo jeho imunogenní části s uvažovanou/testovanou sloučeninu, např. za podmínek, které umožňují interakce (např. vazbu) uvažované/testované sloučeniny s HCV proteinem nebo jeho částí za vzniku komplexu a detekci vytváření komplexu, kdy je schopnost uvažované sloučeniny interagovat (např. vazbou) s HCV proteinem nebo jeho částí ukázána přítomností uvažované sloučeniny v komplexu. Vytváření komplexů mezi HCV proteinem a uvažovanou sloučeninou může být kvantifikováno, například s použitím standardních imunotestů.

HCV proteiny, jejich katalytické nebo jejich imunogenní fragmenty nebo oligopeptidy použité v takovém testu mohou být volné v roztoku, připevněné k pevné fázi, nesené na buněčném povrchu nebo lokalizované intracelulárně.

V dalším provedení vynález poskytuje screeningové testy k identifikaci uvažovaných/testovaných sloučenin, které modulují (např. stimulují nebo inhibují) interakce (a nejpravděpodobněji také aktivitu HCV proteinu) mezi HCV proteinem a molekulou (cílovou molekulou), se kterou HCV protein normálně interaguje, nebo protilátkami, které specificky rozpoznávají HCV protein. Příklady takových cílových molekul zahrnují proteiny ze stejné signální dráhy jako je HCV protein, např. proteiny, které mohou fungovat v protisměru (včetně jak stimulátorů tak inhibitorů aktivity) nebo po směru od signální dráhy HCV proteinu (Zn-prsty, ♦· 9999 ·ν·· • 99 • 9 9 9 «9

9« 9 9 • 9 · 9 9 9 • · 9 · ·

9·· 9* 99 • 99 >

• 9 9 9 • 99* 9

9 9 9 9 ·9 «9 proteázová aktivita, regulátory oxidačně redukčního stavu cysteinu).

Testy jsou typicky bezbuněčné testy, které zahrnují kroky kombinace HCV proteinu podle předkládaného vynálezu, jeho katalytických nebo imunogenních fragmentů, s cílovou molekulou HCV proteinu (např. ligand HCV proteinu) nebo specifickou protilátkou a uvažovanou/testovanou sloučeninou, např. za podmínek, kdy díky přítomnosti uvažované sloučeniny, HCV protein nebo jeho biologicky aktivní část interaguje (např. vazbou) s cílovou molekulou nebo protilátkou, a detekce vytváření komplexu, který zahrnuje HCV protein a cílovou molekulu nebo protilátku nebo detekce interakce/reakce HCV proteinu a cílové molekuly nebo protilátky.

Detekce tvorby komplexu může zahrnovat přímou kvantifikaci komplexu například změřením indukčních účinků HCV proteinu. Statisticky významná změna, jako například pokles, interakce HCV proteinu a cílové molekuly (např. při tvoření komplexu mezi HCV proteinem a cílovou molekulou) v přítomnosti uvažované sloučeniny (relativní k té, která je detekována bez výskytu uvažované sloučeniny) svědčí o modulaci (např. stimulaci nebo inhibicí) interakce mezi HCV proteinem a cílovou molekulou. Modulace tvoření komplexů mezi HCV proteinem a cílovou molekulou může být kvantifikováno s použitím například imunotestu.

Předkládaný vynález tedy poskytuje způsob identifikace sloučenin, které modulují interakci mezi vazebnými partnery v komplexu, ve kterém alespoň jeden z vazebných partnerů je HCV protein, jak byl definován výše, a způsob zahrnuje:

(a) kontakt testované sloučeniny s komplexem po dobu dostatečnou pro modulaci interakce v komplexu, a potom ·· ···· »0 0000 • 00 • ••••0 000 · • ·· 0 0 0 000 •0 000 0 000 0 · ®· 0 0 00 · 0 0·· • 00 00 00 00 00 00 (b) sledování komplexu na. změny interakcí tak, že když je detekována změna interakce, je identifikována sloučenina, která interakci moduluje.

Konkrétně předkládaný vynález poskytuje druhý uvedený způsob, ve kterém je alespoň jeden z vazebných partnerů vybrán ze skupiny, kterou tvoří:

(i) molekuly pocházející z HCV, např. nukleové kyseliny (promotory nebo enhancery) (HCV RNA zabalená v částicích HCV) nebo proteiny (strukturální nebo nestrukturální proteiny) (ii) intracelulární molekuly pocházející z hostitele (modifikátory oxidačně redukčního stavu HCV peptidů, (TRX, GRX, thioesteráza, apod.)) (iii) extracelulární molekuly pocházející z hostitele (receptory, glukózaminy, heparin)

Mělo by být jasné, že ve vynálezu jsou uvažovány modulátory interakce mezi vazebnými partnery v komplexu, jsou-li identifikovány kteroukoliv z metod popsaných v tomto textu.

Pro provádění výše popsaných lékových screeningových testů je možné imobilizovat buď HCV protein nebo jeho cílovou molekulu pro usnadnění separace komplexů od forem, které nejsou v komplexu, jednoho nebo obou proteinů, a také provádět automatizaci testu. Interakce (např. vazba) HCV proteinu k cílové molekule, v přítomnosti a nepřítomnosti uvažované sloučeniny, může být uskutečněna v kterékoliv nádobě vhodné pojmout reagující složky. Příklady těchto nádob zahrnuji mikrotitrační destičky, testovací zkumavky a mikrocentrifugační zkumavky. V jednom provedení může být poskytnut fúzní protein, který přidá doménu, která umožní, že protein je navázán k matici. Například HCV protein značený His může být adsorbován na mikrotitrační destičky Ni-NTA (Paborsky • ·· · · ···· ·· ···· · · · · · · ··· · · · ··· ······ ···· · ··· ···· ···· ····· ·· ·· · · ·· et al., 1996) nebo fúze HCV protein-ProtA adsorbovány na IgG, což je pak smícháno s buněčnými lyzáty (např. značeno (³⁵)S) a uvažovanou sloučeninou a směs je inkubována v podmínkách napomáhajícím tvorbě komplexů (např. ve fyziologických podmínkách, co se týče soli a pH) . Po inkubaci byly destičky promyty pro odstranění nenavázaného značení a imobilizovaná matice a radioaktivní značení bylo určováno přímo nebo v supernatantu po disociaci komplexů. Alternativně mohou být komplexy odděleny od matice, separovány pomocí SDS-PAGE a hladina komplexů HCV protein-vazebný protein zjištěná v perličkové frakci kvantifikována z gelu s použitím standardních technik elektroforézy.

V lékových screeningových testech podle vynálezu mohou také být použity další techniky pro imobilizaci proteinu na matici. Například může být imobilizován buď HCV protein nebo jeho cílová molekula s použitím konjugace biotinu a streptavidinu. Biotinylované molekuly HCV proteinu mohou být připraveny z biotin-NHS (N-hydroxysukcinimid) s použitím techniky v oboru známé (např. biotinylační kit, Pierce Chemicals, Rockford, III.) a imobilizovány v jamkách streptavidinem potažené 96 jamkové destičky (Pierce Chemicals). Alternativně protilátky reaktivní s HCV proteinem, ale který neinterferují s vazbou proteinu k jeho cílové molekule, mohou být derivatizovány do jamek destičky a HCV protein zachycen v jamkách konjugací s protilátkou. Jak bylo popsáno výše, preparáty komplexů HCV protein-vazebný protein a uvažované sloučeniny byly inkubovány v jamkách destičky prezentujících HCV protein a množství komplexu zachyceného v jamce může být kvantifikováno. Metody detekce těchto komplexů, kromě těch popsaných výše pro GST-imobilizované komplexy, zahrnují imunodetekci komplexů s použitím protilátek reaktivních s cílovou molekulou HCV proteinu nebo které jsou reaktivní s HCV proteinem a kompetují s cílovou molekulou, • · • ·· ······ ··· • · · · ·· · · · • ·· · · · · · a také enzymatické testy, které se spoléhají na detekci enzymatické aktivity spojené s cílovou molekulou.

Další technika pro lékový screening, která poskytuje vysoce výkonný screening sloučenin majících vhodnou vazebnou afinitu k HCV proteinu, je popsána podrobně v práci Determination of Amino Acid Sequence Antigenicity, Geysen HN, WO přihláška 84/03564, publikovaná 13.09.84 a zahrnuta v tomto textu formou odkazu. Souhrnem velká množství různých malých peptidových testovaných sloučenin jsou syntetizována na pevném substrátu, jako například na plastických válečkách nebo nějakém jiném povrchu. Proteinové testované sloučeniny se nechají reagovat s fragmenty HCV proteinu a promyjí se. Navázaný HCV protein je pak detekován metodami v oboru známými. Purifikovaným HCV proteinem mohou také být potaženy přímo destičky použité ve výše uvedených lékových screeningových technikách. Alternativně protilátky bez neutralizační schopnosti mohou být použity pro zachycení peptidu a jeho imobilizaci na pevné fázi.

Tento vynález se také týká použití kompetitivních lékových screeningových testů, ve kterých neutralizační protilátky schopné vázat HCV protein specificky kompetují s testovanou sloučeninou o vazbu HCV proteinu. Tímto způsobem mohou být protilátky použity pro detekci přítomnosti kteréhokoliv proteinu, který sdílí jednu nebo více antigenních determinant s HCV proteinem.

V ještě dalším provedení vynález poskytuje způsob identifikace sloučeniny (např. screeningový test) způsobilé pro použití v léčbě chorobného stavu charakterizovaného (nebo spojeného s) infekcí HCV, expresí HCV nukleové kyseliny nebo aktivitou HCV proteinu. Tento způsob typicky zahrnuje krok testování schopnosti sloučeniny nebo činidla modulovat expresi HCV nukleové kyseliny nebo aktivitu HCV proteinu, a tím identifikovat sloučeninu pro léčení chorobného stavu • ·· ·· ···· ·· ···· • · · · ·· · ·· · • ·· ··· · · · ······ · · · · · ··· ···· ···· • · · ·· ·· · · ·· © · charakterizovaného infekcí HCV, expresí HCV nukleové kyseliny nebo aktivitou HCV proteinu.

Modulátory infekce HCV, aktivity HCV proteinu a/nebo exprese HCV nukleové kyseliny identifikované podle těchto lékových screeningových testů mohou být použity k léčbě, například infekce HCV nebo chorobných stavů ve vztahu k infekci HCV.

Tyto léčebné postupy zahrnují kroky podávání modulátorů aktivity HCV proteinu a/nebo exprese HCV nukleové kyseliny, např. ve farmaceutickém přípravku, jak byl popsán výše, pacientovi, který tuto léčbu potřebuje, např. pacientovi s infekcí HCV. Tkáňová nebo buněčná specificita léku mohou být zvýšeny s použitím metod pro cílení léku (viz Davis, 1997) nebo intracelulární imunizací. Nástroje pomáhající cílit játra jsou například léky kondenzované k bilirubinu (Kramer et al. 1992), transfer léků zprostředkovaný asialoglykoproteinovým receptorem nebo lipoproteinem (Vingerhoeds et al. 1996). Léky mohou dokonce být intracelulárně cíleny na buněčné organely tím, že se užijí mířící značky („tags) specifické pro buněčné organely (Persic et al 1997) .

Metody testování schopnosti sloučeniny nebo činidla modulovat infekci HCV, expresi HCV nukleové kyseliny nebo aktivitu HCV proteinu jsou typicky testy založené na buňkách. Nicméně v tomto textu jsou také zvažována zvířata infikovaná HCV. Například buňky infikované nebo transfekované HCV, které jsou citlivé na redukční činidla nebo oxidanty nebo které transdukují signály prostřednictvím dráhy zahrnující HCV protein, mohou být indukovány k nadměrné expresi HCV proteinu v přítomnosti a nepřítomnosti uvažované sloučeniny.

Mohou být identifikovány uvažované sloučeniny, které produkují statisticky významnou změnu reakcí závislých na HCV proteinu (buď stimulaci nebo inhibici).

• · · · • · · • · · • · · ·

V jednom provedení je modulována infekce cílových buněk

HCV, exprese HCV nukleové kyseliny nebo oxido-reduktázová aktivita HCV proteinu v buňkách a jsou měřeny účinky uvažovaných sloučenin na požadovaný výstup (jako například rychlost infekce, buněčná proliferace nebo diferenciace nebo oxido-reduktázová aktivita). Například může být testována rychlost přechodu z thiolované formy na S-konjugovanou formu, tj . formu S-S-můstku. Například může být testována exprese genů, které jsou up- nebo down-regulovány v reakci na signální kaskádu závislou na HCV proteinu. Ve výhodném provedení jsou regulační úseky těchto genů, např. 5' hraniční úseky promotoru a enhanceru, operativně spojeny s detekovatelným markérem (jako je například luciferáza), který kóduje genový produkt, který může být snadno detekován. Může také být měřena fosforylace HCV proteinu nebo cílové molekuly HCV proteinu, například imunoblotováním.

Předkládaný vynález se týká biologického testu pro identifikaci sloučeniny, které modulují oxido-reduktázovou aktivitu HCV proteinů, jak bylo definováno výše, přičemž tento biologický test zahrnuje:

(a) expozici buněk exprimujících HCV proteiny nebo jejich kterékoliv funkčně rovnocenné části, jak bylo definováno výše, alespoň jedné sloučenině, jejíž schopnost modulovat oxido-reduktázovou aktivitu proteinů je určována, a potom (b) sledování proteinů na změny oxido-reduktázové aktivity.

Reverzibilně chráněný HCV peptid může být použit pro diagnostické kondenzační účely například v oligomerizovaném stavu jako (1) chemické polyantigenní přípravky (Els kondenzované antigeny nejsou nezbytně ve vztahu s HCV a mohou být tedy použity pro screening mnoha nemocí), (2) cíle pro imobilizaci a imunodetekci (např. biotinylace, fluorescence) nebo (3) pro konjugaci protilátky, která dále může poskytnout • · · ·

tzv. „supramolekulární protilátky (např. protilátky na částicích podobných viru). Značení a konjugace protilátky vedou ke zvýšení citlivosti díky amplifikačnímu kroku oligomerizací proteinu.

Je nutné uvést, že kterákoliv reaktivní skupina na peptidu (sacharidy, aminoskupina, karboxylová skupina, thiol, histidin, apod.) může být využita pro kondenzaci nebo konjugaci. Reverzibilně chráněná skupina může být použita pro zvýšení specificity reakce a reaktivita thiolu může být využita v pozdějším kroku/fázi konjugace po odstranění chránící skupiny.

Konečně se předkládaný vynález týká imunotestu pro detekci HCV protilátek, tento imunotest zahrnuje:

(1) poskytnutí purifikovaného HCV protein, jak byl definován v tomto textu, nebo jeho funkčního ekvivalentu, (2) inkubaci biologického vzorku s HCV proteinem v podmínkách, které umožní vytvoření komplexu protilátkaantigen, a (3) zjištění, zda je vytvořen komplex protilátka-antigen obsahující HCV protein.

Předkládaný vynález bude nyní podrobněji objasněn následujícími příklady, které uvádějí obzvláště výhodná provedení. Nicméně je nutné poznamenat, že tato provedení jsou pouze ilustrativní a žádným způsobem nemohou být vykládána jako omezující vynález.

• · · ·

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Stanovení thiol-disulfidového stavu v Els exprimovaném vakcínií

HCV Els protein (aminokyseliny 192-326) byl exprimován a purifikován z Věro buněk s použitím rekombinantní viru vakcínie pv-HCVllA podle protokolu, jak byl popsán v Maertens et al. (PCT/EP 95/03031), kromě toho, že blokáda thiolových skupin byla prováděna s jodacetamidem a N-ethylmaleimidem (NEM) během lýzy a po redukci s DTT, v daném pořadí. Tedy, blokáda volných thiolů IAA (jodacetamid) v lyzačním pufru a alkylace NEM po redukci DTT.

Purifikovaný Els byl koncentrován ultrafiltrací (Centricon 10, Millipore), deglykosylován s N-glykosidázou F (PGNase F, Boehringer Mannheim), jak bylo popsáno výrobcem, a poté byl Els nanesen na 15% polyakrylamidový minigel. SDS-PAGE byla prováděna, jak bylo popsáno Laemmlim. Proteinové pásy byly vyříznuty v oblasti přibližně 18 kD po separaci podle velikosti a obarvení.

Proteiny byly štěpeny in šitu trypsinolýzou a výsledný peptidový fragment byl analyzován hmotovou spektroskopií (MS, MALDI-TOFF) pro určení stavu derivatizace různých cysteinových zbytků.

MS výsledky, co se týče cysteinů v motivu CXXC, ukazuj i:

(1) přibližně v 10 % motivů CXXC byly oba cysteiny přítomný jako IAA derivatizované produkty, ··

(2) přibližně ve 30 % motivů CXXC byl jeden cystein blokován IAA, další cystein byl přítomný jako NEM derivatizovaný produkt, (3) přibližně v 60 % motivů CXXC byly oba cysteiny získány jako NEM derivatizovaný produkt.

Tato data překvapivě ukázala, že (1) každý z obou cysteinů byl přítomen v úplně redukovaném (thiol formě) stavu, a (2) jeden cystein byl zapojen do smíšeného disulfidového můstku a druhý cystein byl přítomný jako volný thiol (forma meziproduktu), a (3) oba cysteiny byly přítomny v oxidované formě (disulfidový můstek).

Ačkoli experiment byl prováděn s HCV peptidem, tj. pocházejícím z infekčního patogenu, tyto tři formy dobře korelují s odlišným oxidačním stavem, který byl popisován pro motiv -CXXC- v TRX nadrodině a odpovídá typu aktivity popisované pro thioloxidoreduktázy, tj . molekuly zapojené do regulace oxidačně redukčního prostředí v buňce (Rietsch & Beckwith, 1998, Loferer & Hennecke, 1994, Aslund & Beckwith, 1999, Huppa & Ploegh, 1999).

Protože cysteiny v aktivním místě thioredoxinu jsou oxidovány a disulfidový můstek v substrátu je redukován, nadbytek oxidované formy (60 %) je ve shodě s aktivitou thioredoxinu. Překvapivě mají tyto výsledky tendenci indikovat, že Els je zapojen v (auto)skládacím mechanismu, který je závislý na intracelulárním oxidačním stavu pro regeneraci aktivního místa na redukovanou formu. Proto agregát založený na -S-S- proteinu, který tvoří Els, vakcínie a hostitelské proteiny, může být zmenšen interferencí na úrovni • ·· ·· ···· ·· ···· • · · · · · · ·· · • ·· ··· · · « ······ · · · · · ··· ·· ·· »· ·· ·· skládání proteinu nebo přidáním sloučenin do kultivačních médií, které interferují/ovlivňuji intracelulární oxidačně redukční stav cysteinů.

Příklad 2

Purifikace kvasinkových Els-His po reverzibilní modifikaci cysteinů

Buňky Saccharomyces cerevisiae (kvasinky) produkující HCV Els značený His byly získávány mikrofiltrací a centrifugací. Buněčné pelety byly resuspendovány v 5 objemech lyzačního pufru (50mM fosfát, 6M guanidinium-HCl, pH 7,4 (= pufr A) ) a pevné Na₂SO3, Na2S₄C>6 byly přidány k roztoku až do konečných koncentrací 160mM a 65mM, v daném pořadí. Cu²⁺ (lOOmM zásobní roztok v NH₃) byl přidán jako katalyzátor až do koncentrace 100 μΜ a roztok byl inkubován přes noc při teplotě místnosti. Lyzát byl uložen v -70°C a vyčištěn centrifugací (JA 20 rotor, 27 kg v 4°C) po cyklu zmražení-tání.

Imidazol a Empigen™	.(Alhright	a	Wilson, Velká
Británie)	byly přidány k supernatantu, v	daném	pořadí, až	do
konečných	koncentrací 20mM a 1%	(hmotnost/obj eir	i) a vzorek	byl
aplikován	na kolonu Ni-IDA	Sepharose	FF	(Pharmacia)	po
naředění	ekvilibračním pufrem	(Pufr A,	20mM	imidazol,	1%

Empigen) .

Pryskyřice byla promyta ekvilibračním pufrem dokud absorbance ve 280 nm nedosáhla bazální hodnoty a navázané proteiny byly eluovány nanesením na imidazolový gradient.

Analýza SDS-PAGE a Western bloty ukázala, že >90 % čistý protein Els-His byl získán v elučním poolu 200mM • · · ·

4 4 4 4 * 4 ·* ·

44 *44 44« • 4 4 4 ·· 444 4 4 • 44 4 4 4 4 4444 • 44 ·4 44 4» ·· 44 ⁵² imidazolu po sulfitolýze v denaturačních podmínkách a IMAC (obr. 6B).

Sulfonovaný HCV Els byl desulfonován přidáním DTT za obnovy stavu thiolu a umožnění tvorby intra- a intermolekulárního disulfidového můstku.

Příklad 3

Purifikace a imunologická reaktivita fúzního proteinu NS3 z E. coli

Buňky E. coli produkující fúzní protein mTNF(His)6NS3 B9 byly sklizeny a buňky byly resuspendovány v pufru A (viz příklad 2) . Sulfonace, příprava vzorku a chromatografie prováděná na koloně Ni-IDA Sepharose FF (Pharmacia) byly prováděny, jak bylo popsáno pro kvasinky (Příklad 2) . Fúzní protein mTNF(His)₆NS3 b9 byl získán v elučním poolu 200mM imidazolu. Barvení SDS-PAGE gelů Coomassie modří a Western bloty ukázaly, že HCV fúzní protein byl >90% čistý po sulfitolýze a IMAC (viz Obr. 6A).

Imunitní reaktivita fúzního proteinu byla kontrolována testem ELISA s HCV pozitivními humánními séry. Purifikovaný fúzní protein byl redukován 200mM DTT a protein byl odsolen 35mM acetátem, 6M ureou, pH 4, na koloně Sephadex G25 (Pharmacia). Účinek antioxidantů a reverzibilních chránících činidel (dithiokarbamát, GSH, cystein) na reaktivitu NS3 fúzního proteinu byl ověřen přidáním těchto činidel buď před zmražením v -70 °C nebo přidáním těchto sloučenin během ředění ve vazebném pufru pro test ELISA.

NS3 fúzní protein potažený v přítomnosti lOmM nebo 200mM DTT byly zahrnuty jako pozitivní a negativní kontrola,

999 9

9··· 9 99 9 • 99 99· 999 »9 999 9 999 9 ·

999 ···· 9999

999 99 99 99 99 99 v daném pořadí. Séra (17790, 17832) byla obtížně detekovatelné séra (HCV NS3 konvertuj ící séra) a séra (17826, 17838) byla snadno detekovatelné HCV pozitivní séra. HCV séra, která byla obtížná pro detekci jsou (1) séra, která nereagovala nebo minimálně reagovala s jinými HCV antigeny (jen NS3) nebo (2) séra, která reagovala s NS3-epitopy, které jsou prezentovány a rozpoznávány protilátkami pouze po ošetření sulfonovaného NS3 b9 s 200mM DTT. Na rozdíl od toho, pro snadno detekovatelné séra ošetření s lOmM DTT sulfonovaného NS3b9 bylo dostatečné pro obnovení imunologické reaktivita. Výsledky testu ELISA jsou uvedeny na obrázcích 5A a SB.

Výsledky ukazují, že disponibility epitopů je silně závislá na thiolovém oxidačně redukčním stavu, tj. obtížná HCV séra byla detekována pouze buď (1) po redukci NS3 s 200mM DTT ve vazebném pufru nebo (2) inkubací vzorku ředidla v přítomnosti lOmM nebo 3mM DTT, za předpokladu, že NS3 vzorek byl naředěn thiol obsahujícími antioxidanty a/nebo reverzibilními ochrannými činidly reaktivity byla více vyjádřena u glutathionu, cysteinu nebo thiofenkarboxylové kyseliny (TPCB) nebo thiodiethylenglykolu (TEG). Glutathion byl dále nadřazen c-ystein-u nebo jiným testovaným mono-SH - (TEG, TP-GB) - produktům.

Obnova imunologické dithiokarbamátů než u

Nej lepší ELISA signály byly získány pro NS3B9 fúzní protein, který byl inkubován v -70°C a naředěn v přítomnosti thiol stabilizujících a reverzibilních ochranných činidel.

Potřeba DTT redukce pro, obnovu imunitní reaktivity po přidání thiol obsahujících sloučenin ukázala tvoření smíšených disulfidových můstků mezi thiolovými činidly a cysteinovými zbytky NS3 b9 fúzního proteinu. Přidání thiolových sloučenin inhibovalo opětné tvoření velmi stabilní intramolekulární disulfidové vazby, která mohla být redukována pouze 200mM DTT. Tento stav smíšených disulfidových můstků se podobá in vivo thiolaci proteinů, což je známý regulátor biologické aktivity, • 9 9·· ·

• · 9 9 9 9 • 9 * · · · • · 0 9 · 9 9 • · · 9 9 09 · • 9 99 99 99 a je s minimálním vynaložením energie přeměněn (enzymaticky nebo 'S-S' redukčním činidlem) do redukovaného stavu.

Příklad 4

Mapování monoklonálních protilátek proti El epitopu překrývajícího se s cysteinovými zbytky místa CXXC

Bylo identifikováno deset monoklonálních protilátek, namířených proti El, které rozpoznávají N-koncový úsek El. Tyto monoklonální protilátky byly charakterizovány s ohledem na jejich minimální epitop. Aby se tak stalo, byly syntetizovány dva peptidy a reaktivita každé monoklonální protilátky k těmto peptidům byla analyzována zhodnocením kompetice. Rekombinantní El byly adsorbovány na mikrotitrační destičky a monoklonální protilátka byla ponechána reagovat v přítomnosti nadbytku peptidu. Na základě těchto výsledků mohlo být deset monoklonálních protilátek rozděleno do dvou skupin (Tabulka 1). Pro první skupinu byl minimální epitop aa 209 až 227, obzvláště nedostatek reaktivity peptidu neobsahujícího aminokyseliny 225 až 227 dokázal, že tyto monoklonální protilátky pokrývají epitop překrývající se s místem podobným thioredoxinu, konkrétněji s prvním cysteinem tohoto místa. Minimální epitop monoklonálních protilátek skupiny 2 nedosahuje do místa podobnému thioredoxinu. Tyto výsledky jsou shrnuty v tabulce 1.

·· · · · · ·· ···· • · · · φ 9

Tabulka 1

Minimální epitopové úseky monoklonálních protilátek nmaířených proti El

El monoklonální protilátky skupiny 1: IGH 198, 199 a 200

Sekvence	aa úsek	IGP*	výsledek
NDCPNSSIVYEAHDAILHTP	205-224	263	žádná kompeti
Bio-GG-SNSSIVYEAADMIMHTPGCV	208-227	436	kompetice
El monoklonální protilátky 205, 206 a 208	skupiny 2: IGH	201,	202, 203, 204,
Sekvence	aa úsek	IGP*	výsledek
NDCPNSSIVYEAHDAILHTP	205-224	263	kompetice
Bio-GG-SNSSIVYEAHDAILHTPGCV	208-227	436	kompetice

Minimální epitop pro každou skupinu je podtržen.

*IGP se týká klasifikačního čísla peptidu

Poznámka 1

Jsou také dostupné monoklonální protilátky rozpoznávající epitop v C-koncové části El (IGH 207, 209 a

210, aa 307 až 326, viz PCT/EP99/02154) . Tyto monoklonální protilátky mohou být použity jako kontroly, protože rozpoznávají úsek, který není vůbec v sousedství místa podobného thioredoxinu.

«· ··· ♦

I · » 4 · 4 • 4 4«

Poznámka 2

IGH	198	= 23C12	IGH	203 =	15G6	IGH	208	= 5C6
IGH	199	= 15B5	IGH	204 =	8A8	IGH	209	= 5E1
IGH	200	= 25CF3	IGH	205 =	3H2	IGH	210	= 7D2
IGH	201	= 11B7	IGH	206 =	7C4
IGH	202	= 3F3	IGH	207 =	14H11

Jsou tedy dostupné monoklonální protilátky, které mohou být použity jako nástroje pro určování změn biologické aktivity a/nebo konformace peptidu podle předkládaného vynálezu.

Příklad 5

Purifikace HCV Els po reverzibilní modifikaci Cys-zbytků

Buňky infikované vakcínií RK13 byly lyžovány, jak bylo popsáno v Maertens et al. (PCT EP95/03031), ale k lyzátu byl přidán - mrs-to- irever-zibilního thiol blokujícího činidla N-ethylmaleimidu (NEM) pevný tetrathionát sodný až do koncentrace 65mM. Lyzát byl inkubován přes noc ve 4°C a purifikace (Lentil lektin (LCA) chromatografie, koncentrace LCA eluátu a redukce s DTT) byly prováděny tak, jak bylo popsáno v Maertens et al. (PCT EP95/03031). Koncentrát byl rozdělen do 2 částí a byl buď sulfonován přes noc ve 4°C pomocí Na₂S₄O₆ nebo ireverzibilně blokován N-ethylmaleimidem (NEM) jako referenční látka. Sulfonovaný Els, a také ošetřený NEM, byly aplikovány na kolonu Superdex G200 (Pharmacia) v přítomnosti Empigenu (viz obrázek 1) a Els vrchol byl analyzován pomocí SDS-PAGE a Western blotů.

•· ···· ·· ····

Chromatogramy, a také ELISA profily ukázaly, že ireverzibilně chráněný a sulfonovaný Els produkt se choval analogicky, co se týče SEC v přítomnosti Empigenu. SDS-PAGE a barvení stříbrem ukazovalo podobný stupeň čistoty těchto 2 produktů.

Příklad 6

Purifikace HCV Els v nedenaturačních podmínkách po lýze v přítomnosti thiol stabilizujících činidel

Buňky infikované vakcínií RK13 byly lyžovány, jak bylo popsáno v Maertens et al. (PCT EP95/03031), ale k lyzátu byl přidán jako stabilizátor thiolu lmM askorbát namísto NEM. Vzorek byl aplikován na LCA pryskyřici a LCA eluát byl acidifikován 1M octovou kyselinou do pH 5,5. Acidifikovaný eluát byl koncentrován, poté bylo pH upraveno na 7,2 a podroben působení DTT, jak bylo popsáno v Maertens et al. (PCT EP95/03031).

Roztok redukovaného proteinu byl rozdělen a ošetřen takto: buď byl (1) acidifikován na pH 6 (thiol stabilizující podmínky) nebo (2) (reverzibilně chráněn) sulfonován tetrathionátem sodným nebo (3) podroben působení NEM.bio (ireverzibilní blokáda). SEC acidifikovaného (pH 6) vzorku bylo také prováděno v pH 6,0. Jiné 2 vzorky byly odděleny na koloně Superdex G2Q0 v přítomnosti Empigenu, jak bylo popsáno v Maertens et al. (PCT EP95/03031). Eluční frakce byly analyzovány testem ELISA, SDS-PAGE a Western blotováním.

Látka, připravená tak, jak bylo popsáno v Maertens et al. (PCT EP95/03031), byla zahrnuta jako referenční látka pro

SEC.

«44* • 4« ·· · · · 4 · · « « ·4· ·4· ··« • 4 · · · « · · · · · • · · 4 4 « · ···»

44· 4« ·· ·· ·« «· ····

Frakční analýza ukázala, že čistý Els byl získán v různých podmínkách (obr. 3A.1 a obr 3A.2). Vyšší zjevná Mr NEM.bio Els materiálu byla pravděpodobně způsobena inzercí objemné blokovací skupiny na Els.

Obrázek 3B ukazuje Western bloty Els poolů, získané různými postupy, jak bylo popsáno v příkladech 5 a 6.

Příklady 5 a 6 ilustrují, že čistý Els byl získán v nedenaturačních podmínkách (1) s použitím reverzibilního modifikačního činidla nebo (2) prováděním chromatografií za thiol stabilizujících podmínek (antioxidant, nízké pH).

Příklad 7

Opracování Věro Els a štěpení analogické s růstovými faktory, jako například thioredoxinem

Věro buňky infikované vakcínií byly lyžovány tak, jak bylo popsáno v Maertens et al. (PCT EP95/03031) , ale jako ireverzibilní’ blokující činidlo byl přidán jodacetamid (IAA) a po inkubaci přes noc ve 4°C byl přidán aprotinin.

Chromatografie na LCA pryskyřici (Pharmacia), redukce s DTT a gelová filtrace byly prováděny tak, jak bylo popsáno, kromě toho, že jako ireverzibilní blokující činidlo byl použit IAA namísto NEM. Els pool byl analyzován barvením stříbrem a Western blotováním.

Analýza Western bloty semi-purifikovaného produktu ukázala vedle pásu kvartetu v úseku 27 až 32 kD také Els pás s Mr přibližně 18 kD. Pásy byly charakterizovány NH₂-koncovým sekvencováním aminokyselin.

• ·«		• 0	• 004	• 0	• 004
00 0	0	0	•	• 0	4
• 0 0	4	4	•	• 0	•
• 0 0	• ·	0	0 ·	0 0	•
440 04		0 0	40	• 4	00

Hlavní signální sekvence různých pásů kvartetu:

YEVR7VSG (amino-konec správně zpracovaného Els)

Sekvence Els degradačního produktu:

??VALTPTLAA

Tento degradační produkt je důsledkem specifického štěpení na karboxy-konci po Arg 237, který je lokalizoval v protisměru od místa CVPC. První a druhý zbytek nejsou identifikovány, protože aminokyseliny cystein a tryptofan byly zničeny Edmanovým způsobem sekvencování.

Překvapivě nebyly získány žádné jiné degradační produkty, ačkoli v Els jsou přítomny jiné bazické zbytky a dokonce dibazické sekvence. Tento specifický typ štěpení odpovídá struktuře domény Els, která byla popsána pro zpracování růstových faktorů, jako je například thioredoxin, toto štěpení mělo za následek vytvoření ECEF (BalcewiczSablinska, et al., 1991, Newman et al., 1994).

Příklad 8

Titrace pKa cysteinů v Els místě CVPC

Aby se stanovil sled reakčních kroků, tj. který cystein místa C_XVPC₂ reaguje první, byla titrována pKa těchto cysteinů. pKa cysteinů v místě CxVPC2 z Els byla určena modifikací cysteinů v Els nebo syntetických peptidů jako funkce pH.

Modifikace byla prováděna působením IAA v předem nastaveném pH, a poté byl vzorek nanesen na RPC po snížení pH na 2 trifluoroctovou kyselinou (TFA).

•e ···· ·· ···· • · · • ·

Aby se určil nejreaktivnější cystein, byl nadbytek IAA

• 0 · • » ·· « · • · · • ♦ • · · • 0 ·« činidla odstraněn pomocí RPC. Nezreagované thiolové skupiny byly modifikovány zvýšením pH po přidání ethyleniminu (El) nebo bromethanolaminu (BEA).

Ošetření s El nebo BEA má za následek zavedení lysin napodobující cysteinové adiční sloučeniny, která vytvoří doplňkové místo trypsinolýzy. Toto doplňkové místo umožňuje identifikaci nejreaktivnějšího cysteinu v místě -C1VPC2prostřednictvím peptidových „otisků prstů (ůfingerprinting) a MS (viz také příklad 1).

SEZNAM LITERATURY

Atherton and Shepard in Solid phase peptide sythesis IRL Press, Oxford, 1989.

Aslund, F. And Beckwith, J. (1999) Bridge over troubled waters: sensing stress by disulfide bond formation. Cell 96: 751-753.

Balcewicz-Sablinska,M, Wollman,E.,Gorti, R & Silberstein,D., Human eosinophil cytotoxicity-enhancing factor. Multiple forms synthesised by U937 cells and their relationship to thioredoxin/adult T cell leukemia -derived factor. J. Immunol. 147, 2170-2174,1991.

Beekman,N., Schaaper, W., Tesser,G., Dalsgaard,K., Kamstrup,S., Langeveld,J., Boshuizen,R.& Meloen,R., Synthetic peptide vaccines: palmitoylation of peptide antigens by a thioester bond increases immunogenicity, J.Peptide Res., 50, 357-364,1997.

Bums, J., Butler,J. & Whitesides, G., Selective reduction of disulfides by tris (2-carboxyethyl)phosphine. J.Org. Chem. 56, 2648-2650 (1991).

• ·

Carreras, C.,& Santi, D., Engineering of modular polyketide synthases to produce novel polyketides. Curr.

Opion in Biotech., 9, 403-411 (1998).

Darbre, A., Practical protein Chemistry: A handbook.A Whiley- interscience publication. Ed. J. Whiley & Sons Ltd.,1986.

Das, A.K., Dasgupta, Β. , Bhattacharya, R. Basu. J. (1997) Purification and biochemical characterisation of a protein-palmitoyl acyltransferase from human erythrocytes. J.Biol.Chem. 272:11021-11025.

Davis, S.S. (1997) Biomedical applications of nanotechnology - implications for drug targeting and gene therapy. Tibtech 15: 217-223.

Deleersnyder V., Pillez A., Wychowski C., Blight Κ., Xu J. , Hahn Y.S., Rice C.M., Dubuisson J. Formation of native hepatitis C virus glycoprotein complexes. J. Virol. 1997: 71: 697-704.

Diepolder HM, Zachoval R, Hoffmann RM, Wierenga EA, Santantonio T, Jung MC, Eichenlaub D, Pape GR. Possible mechanism involving T-lymphocyte response to nonstructural protein 3 in viral clearance in acute hepatitis C virus infection. Lancet 1995: 34fi: 1006-1007.

Diepofder HM, Gerlach JT, Zachoval R, Hoffmann RM, Jung MC, Wierenga EA, Scholz S, Santantonio T, Houghton M, Southwood S, Sette A, Pape GR. Immunodominant CD4+ T-cell epitope within nonstructural protein 3 in acute hepatitis C virus infection. J. Virol., 1997: 71: 6011-6019.

Dietrich, C . , Boshemen, 0, Schart,K., .Schmitt,L.& Tampe, R. , Functional immobilisation of a DNA-binding protein at a membrane interface via a histidine tag and synthetic chelator lipids. Biochemistry, 35, 1100-1105 (1996), • · ···· ·· • · · · · • · · · · • · · · · ·

Dietrich,C., Schmitt, L.& Tampe, R.,Molecular organisation of histidine-tagged bimolecules at šelf assembled lipid interfaces using a new class of chelator lipids. PNAS, 92, 9014-9018, 1995).

Fancy, D.A., Melcher, K., Johnston, S. T. And Kodadek, T. New chemistry for the study of multiprotein complexes: the six-histidine tag as a receptor for a protein crosslinking reagent. Chem Biol (1996) 3: 551-559.

Fernandes, A. & Gregoriadis,G., Polysialylated asparaginase: preparation, activity and pharmacokinetics. Biochem. Biophys. Acta, 1341, 26-34, 1997.

Gailit, J. Restoring free sulfydryl groups in synthetic peptides. Anal. Biochem.,214,334-335 (1993).

Hermanson, G.T. In Bioconjugate Techniques (1996) Part I section 1.43 and section 2.2.1, Academie Press San Diego CA, USA.

Holmgren,A., Thioredoxin catalyzes the reduction of insulin disulfides by dithiothreitol and dihydrolipoamide. J. Biol. Chem., 254, 9627-9632 (1979).

Houbenweyl in_ .Methode der Organischen. .Chemie editedby E.Wunsch, vol 15-1 et II. Thieme, Stuttgart (1974).

Houghton M. Immunity to HCV: The čase for vaccine development. 4th International meeting on hepatitis C Virus and related viruses. Sattelite Symposium: New approach to prevention and therapy of HCV infection. March 7, 1997, Kyoto, Japan.

Huang H., Rabenstein, D.L. (1999) A cleavage cocktail for methionine-containing peptides. J.Peptide. Res. 53: 548553. Reagent H, lOh, in šitu oxidation of cysteine, dišulfide forms of peptides.

• ·

Huppa, J & Ploegh, H., The eS-Sence of -SH in the ER. Cell, 92, 145-148 (1999).

Jayasbaskaran, J., Davison,P. & Paulus,H., Facile preparation and some applications of an affinity matrix with a cleavable connector arm containing a disulfide bond. Prep. Biochem., 17,121-141 (1987).

Jayasena, S.D. (1999) Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics. Clin. Chem. 45: 1628-1650.

Kalef, E, Walfish, P.& Gitler C., Arsenical based affinity chromatography of vicinal dithiol-containing proteins: Purification of L1210 Leukemia cytoplasmatic proteins and the recombinant rat c-erb Αβ_χ T₃ receptor. Anal. Biochem.,212,325-334(1993).

Kramer, W., Wess,G., Schubert, G., Bickel,M., Girbig,F., Gutjahr,U., Kowalewski,S., Baringhaus,KH., Ehnsen, A., Glombik, H., Mullner, S., Neckermann,G., Schulz,S. & Petzinger,E., (1992) Liver-specific drug targeting by coupling to bile acids. J.Biol.Chem. 267: 18598-18604.

Kumar, N, Kella, D & Kinsella,J., Anomalous effect of denaturants on sulfitolysis of protein disulfide bonds. Int. J. Peptide Protein Res., 28, 586-592, (1986).

Kumar, N, Kella, D.& Kinsella,J., A method for the controlled cleavage of disulfide bonds in proteins in the absence of denaturants. J. Biochem. Biophys. Meth., 11, 253-261,1985. Leroux-Roels G, Esquivel CA, DeLeys R, Stuyver L, Elewaut A, Philippe J, Desombere I, Paradijs J, Maertens G Lymphoproliferative responses to hepatitis C virus core, El, E2, and NS3 in patients with chronic hepatitis C infection treated with interferon alfa. Hepatology 1996: 23: 8-16.

• ·· 99 ···· ·· ···· ···· · · · ·· · ····· · · · · · ·· ·· · · ··

Leibl H, Tomasits R, Bruhl P, Kerschbaum A, Eibl MM, Mannhalter JW (1999) Humoral and cellular immunity induced by antigens adjuvanted with colloidal iron hydroxide. Vaccine 17:1017-23.

Loferer,H.& Hennecke,H., Protein disulfide oxidoreductases in bacteria. TIBS, 19, 169= 171,(1 994).

Maertens G, and Stuyver L. Genotypes and genetic variation of hepatitis C virus. In: The molecular medicine of viral hepatitis. Ed: Harrison T.J. And Zuckerman A.J. 1997.

Maertens G., Depla E., Ducatteeuw A., Vandeponseete P., Bosman F., Venneman A., de Martynoff G., Stuyver L., Dekeyser F., Vandeperre B., Zrein M. And Buyse M.-A. Hepatology 1997: 26: 186A.

Major M.E. And Feinstone S.M. The molecular virology of hepatitis C. Hepatology 1997: 25:1527-1538.

Mossner, E., Huber-Wunderlich, M.& Glockshuber,R., Characterisation of E. coli thioredoxin variants mimicking the active místos of other thio/disulfide oxidoreductases. Prot. Science, 7, 1233-1244, 1998.

Matts,R. , . Schatz, J. , . Hurst., _ R Kagen,_ R. , Toxic heavy metal ions activate the heme-regulated eucaryotic initiation factor 2 kinase by inhibiting the capacity of hemin-supplemented reticulocyte lysates to reduce disulfide bonds. J.Biol. Chem., 6, 12695-12702 (1991).

Nakamura, H., Nakamura, K. And Yodvi, J. (1997) Redox regulation of cellular activation. Annu. Rev. Immunol. 15: 351-369.

Newman,GW, Balcewicz-Sablinska,MK, Guarnaccia, J, Remold, H & Silberstein,D, Opposing regulátory effects of thioredoxin and eosinophil cytotoxicity-enhancing factor

·· · ·· · · ·· · · ·· on the development of human immunodeficiency virus 1. J. Exp. Med., 180, 359-363, 1994.

-	Nielsen, P.,	Egholm, M,	Berg, R. ,	and	Buchardt,	0.	(1991)
	Science 254:	1497-1500.
-	Nielsen, P.,	Egholm, M,	Berg, R. ,	and	Buchardt,	0.	(1993)
	Nucl. Acids	Res. 21: 197	-200.
-	Paborsky, et	al. (1996)	Anal. Biochem.	234: 60-65

Persic,L., Righi,M., Roberts,A., Hoogenboom,HR, Cattaneo,A & Bradbury,A., Targeting vectors for intracellular immunisation. Gene,187, 1-8,1997.

Pinter, A., Kopelman, R. , Li, Z., Kayman, S.C. And Sanders, D.A. (1997) Localization of the labile disulfide bond between SU and TM of the murine Leukemia virus envelope protein complex to a highly conserved CWLC motif in SU that resembles the active-místo of the thioldisulfide exchange enzymes. J. Virology 71: 8073-8077.

Pomroy,N & Deber, C. , Soiubilisation of hydrophobic peptides by reversible cysteine PEGylation. Biochem. & Biophys. Res. Commun., 245, 618-621 (1998).

Prinz,''W;} Aslund, F,^_ ‘Holmgreny A.& Beckwxth, J., The role· of thioredoxin and glutaredoxin pathways in reducing protein disulfide bonds in E. coli cytoplasm. J. Biol. Chem., 272, 1566115667, 1997.

Rehermann B, Chang KM, McHutchinson J, Kokka R, Houghton M, Rice CM, Chisari FV. Differential cytotoxic Tlymphocyte responsiveness to the hepatitis B and C viruses in chronically infected patients. J Virol 1996 70: 70927102.

Rehermann B, Takaki A, Liebetrau A, Luda S, Seifert U, Salha K, Manns M, Wiese M. Characterization of the • *· ·· ···· ·· ···· ···· © · · ·© · ·· ··© ···

9© ··· · ·©· © © ··· ·© ·· ·· ·· ·· cytotoxic and helper T cell response in patients 18 years after a single source outbreak of HCV infection. Hepatology, 1997:26: 406A.

Rein, A., Ott, D. , Mirro, J. , Arthur,L, Rice,W.& Henderson,L., Inactivation of Murine leukemia virus by compounds that react with the Zn-finger in viral nucleocapsid protein. J. Virol., 70, 4966-4972,1996.

Rietsch, A. & Beckwith,J.,The genetics of disulfide bond metabolism. Annu. Rev. Genet., 32, 163-184(1998).

Sambrook, J., Fritsch, E.F. And Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, second edition. Cold Spring Harbor University Press, Cold Spring Harbor, NY USA.

Singh,R. & Kats,L., Catalysis of reduction of disulfide by selenol. Anal. Biochem., 232,86-91 (1995).

Southworth,Μ., Amaya,K., Evans, T., Xu M:& Perler, F. , Purification of proteins to either the amino or carboxy terminus of the Mycobacterium xenopii gyrase A intein. Biotechniques, 27, 110-120>1999.

Thakur,M., Defutvio,J,, Richardy _ M. & _Park,. C. Technetium₇99m labelled monoclonal antibodies: evaluation of reducing agents. Nuc. Med. Biol., 18, 227-2333(1991).

Thomas, J.A., Poland, B. And Honzatko, R. (1995) Protein sulfhydryls and their role in the antioxidant function of protein S-thiolátion. Arch. Biochem. Biophys. 319: 1-9.

Van Doorn LJ, Kleter B, Pike I, Quint W. Analysis of hepatitis C virus isolates by serotyping and genotyping. J Clin Microbiol 1996, 34: 1784-1787.

Villa E., Buttafoco P., Grottola A., Scarcelli A., Giannini F. , Manerti F. Neutralizing antibodies against ♦ · *···*»· ···«·· > · · · · · · · • · « ·· ··

HCV: líver transplant

Hepatol. 1998: 28.

as an experimental model. J.

Vingerhoeds,M., Haisma,H., Crommelin, D. & Storm,G, carriers (immunoenzyzomes) prodrug therapy (ADEPT):

Belliot, S., Smit, R.,

Immunoliposomes as enzymefor antibody-dírected enzyme optimization of prodrug activating capacity. Pharm.Res., 13,603610 (1996).

Weiner AJ, Erickson AL, Kansopon J, Crawford K, Muchmore

E, Houghton	M,	Walker CM	Association	of	cytotoxic T
lymphocyte	(CTL) escape	mutations	with	persistent
hepatitis C	virus (HCV)	infection. Princess Takamatsu
Symp, 1995:	25:	227-235.
Yi M., Nakamoto	Y., Kaneko	S., Yamashita	T.,	Murakami S.
Delineation	of	regions	important	for	heteromeric
association	of	Hepatitis	C virus El	and	E2. Virol.

1997AAA: 231: 119-129.

Zauberman, A., Nussbaum, O., Han, E., Eren, R., BenMoshe, 0., Arazi, Y., Berre, S., Lubin, L, Shouval, D., Gaiun, E., Reisner, Y. And Dagan, S. The trimera mouše systém: a mouše model for hepatitis C infection and eva-luation- of -therapeut-ic agents. June 6-9-, -1-999,- Oral

4.3. In: 6th International Symposium on Hepatitis C & Related Víruses: Bethesda USA.

Zhang, L & Tam, J.P.,Synthesis and application of unprotected cyclic peptides dendrimers. J.Am. Chem. Soc.

Zrein, M., Louwagie, J. , Hendrickx, G., Bosman, F. , Bonifáce, M. And Šaman, E as building blocks for peptide

119, 2363-	2370, 1997.
Boeykens,	Η. , Govers,	L. ,
Šablon, E. ,	Demarquilly,	c.,
(1998) Assessment of a	new

confirmation and immunoassay for serological t <

·· ♦ · 9999

9 9 ( • · · 4

99 * 9 99 9 discrimination of human T-cell lymphotropic virus infections. Clin. Diagn. Lab. Imm. 5: 45-49.

0 0« 0 9 0	00	0000 0 »	00 9 · <0 9	0 40
0 9	• 0
	0 0 0
00	0*	00		40	44	4 0

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. HCV protein nebo kterákoliv jeho funkčně rovnocenná část, obsahující alespoň dvě Cys aminokyseliny, které mají reverzibilní oxidačně redukční stav, přičemž Cys aminokyseliny jsou obsaženy v aminokyselinové sekvenci Cys-Xi-X2~Cys, ve které aminokyselina Χχ označuje kteroukoliv aminokyselinu a aminokyselina X₂ označuje kteroukoliv aminokyselinu.
2. HCV protein nebo kterákoliv jeho funkčně rovnocenná část podle nároku 1, kde aminokyselina Χχ označuje buď aminokyselinu Val, Leu nebo Ile a aminokyselina X₂ označuje kteroukoliv aminokyselinu.
3. HCV protein nebo kterákoliv jeho funkčně rovnocenná část podle nároku 1, kde aminokyselina Χχ označuje kteroukoliv aminokyselinu a aminokyselina X₂ označuje aminokyselinu Pro.
4. HCV protein nebo kterákoliv jeho funkčně rovnocenná část podle nároku 1, kde aminokyselina Χχ označuje buď aminokyselinu Val, Leu nebo Ile a aminokyselina X₂ označuje aminokyselinu Pro.
5. HCV protein nebo kterákoliv jeho funkčně rovnocenná část podle nároku 1, kde HCV protein je vybrán ze skupiny Els nebo Elp.
6. HCV protein nebo kterákoliv jeho funkčně rovnocenná část obsahující alespoň dvě Cys aminokyseliny, které mají ··· · · ·· ·* ·· ·· reverzibilní oxidačně redukční stav, podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, připravitelný následujícím způsobem:

(a) purifikuje se HCV protein nebo kterákoliv jeho funkčně rovnocenná část, kde cysteinové zbytky byly reverzibilně chráněny chemickými a/nebo enzymatickými prostředky, (b) odstraní se reverzibilní ochranný stav cysteinových zbytků, a (c) získá se HCV protein nebo kterákoliv jeho funkčně rovnocenná část, kde cysteinové zbytky mají reverzibilní oxidačně redukční stav.
7. HCV protein nebo kterákoliv jeho funkčně rovnocenná část podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6 pro použití jako lék.
8. Použití HCV proteinu nebo kterékoliv jeho funkčně rovnocenné části podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6 pro výrobu HCV vakcinačního přípravku, konkrétně terapeutického vakcinačního přípravku nebo profylaktického vakcinačního přípravku.
9. HCV protein nebo kterákoliv jeho funkčně rovnocenná část podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7 pro vyvolání protilátek, které specificky rozpoznávají HCV protein nebo kteroukoliv jeho funkčně rovnocennou část.
10. Imunotest pro detekci HCV protilátky vyznačuj ící se tím, že zahrnuje:

(1) poskytnutí HCV proteinu nebo kterékoliv jeho funkčně rovnocenné části podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, (2) inkubaci biologického vzorku s HCV proteinem za podmínek, které umožní vytvoření komplexu HCV protilátka-HCV protein, (3) zjištění, zda byl vytvořen komplex HCV protilátka-HCV protein.
11. Biologický test pro identifikaci sloučenin, které modulují oxido-reduktázovou aktivitu HCV proteinů podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že zahrnuje:

(a) expozici buněk exprimujících HCV proteiny nebo kterékoliv jejich funkčně rovnocenné části podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7 alespoň jedné sloučenině, jejíž schopnost modulovat oxido-reduktázovou aktivitu proteinů se testuje, a potom (b) sledování proteinů na změny oxido-reduktázové aktivity.