KR20020047286A - 천연유사 입체형태를 가진 산화 환원 가역적 ｈｃｖ 단백질 - Google Patents

천연유사 입체형태를 가진 산화 환원 가역적 ｈｃｖ 단백질 Download PDF

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Abstract

본 발명은 시스테인 잔기가 정제 동안 가역적으로 보호되는 HCV 단백질에 관한 것이다. 결국, 상기 정제 절차는 해당 항원결정부를 제공하는, 천연 유사 입체구조 및 생물학적 활성을 갖는 HCV 단백질을 초래한다. 본 발명은 또한 이들 HCV 단백질을 이용한 약물 스크리닝 방법, 및 백신 및 약물과 같은, 진단용 및 치료용 적용에 관한 것이다.

Description

천연유사 입체형태를 가진 산화 환원 가역적 ＨＣＶ 단백질 {REDOX REVERSIBLE HCV PROTEINS WITH NATIVE-LIKE CONFORMATION}
C형간염바이러스 (HCV)는 선진국 및 개발 도상국 양자에서 주요한 건강 문제이다. 세계 인구의 약 1 내지 5%가 바이러스에 의해 영향을 받는다고 평가된다. HCV 감염은 수혈 관련된 간염의 가장 중요한 원인으로 나타나고, 자주 만성 간 손상으로 진전한다. 더욱이, 간세포성 암의 유도에 HCV가 관여된 증거가 존재한다. 결과적으로, 믿을 수 있는 진단 방법 및 효과적인 치료제의 요구가 높다. 또한 HCV로 오염된 혈액 제품의 민감하고 특이적인 스크리닝 방법 및 HCV를 배양하는 개선된 방법이 필요하다.
HCV는 적어도 3개의 구조적 및 6개의 비구조적 단백질을 코딩하는 대략 9,600 염기의 양성 가닥 RNA 바이러스이다. 서열 유사성에 기초하여, 구조 단백질은 하나의 단일 핵심(core) 단백질 및 두개의 피막 단백질(envelope protein)로서 지정되었다: E1 및 E2. E1 단백질은 192개의 아미노산으로 구성되고, HCV 유전자형에 의존하여 5 내지 6 개의 N-글리코실화 자리를 포함한다. E2 단백질은 363 내지 370개의 아미노산으로 구성되고, HCV 유전자형에 의존하여 9 내지 11 개의 N-글리코실화 자리를 포함한다 (검토를 위해 하기 참조: Major 및 Feinstone, 1997; Maertens 및 Stuyver, 1997). E1 단백질은 다양한 가변성 도메인을 포함한 반면에 (Maertens 및 Stuyver, 1997), E2 단백질은 3개의 과가변 도메인을 포함하는데, 이 중에서 주요 도메인은 단백질의 N-말단에 위치한다 (Maertens 및 Stuyver, 1997). 이들 피막 단백질은 대장균, 곤충 세포, 효모 세포 및 포유동물 세포에서 재조합 기술에 의해 생산되었다.
NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A 및 NS5B 는 비구조적 (non-structural: NS) 단백질이다. NS3는 약 70 kDa이고, 단백질가수분해효소 및 헬리카아제 활성을 가진다. 헬리카아제 활성에 필수적인 NS3에서의 서열은 또한 RNA 결합, Mg++결합, 및 ATP 결합 성질을 가진다. 항-NS3 항체는 종종 혈청-전환 계열로 먼저 나타난다. NS3 단백질의 면역 반응성은 오늘날 유용한 다양한 상업적 분석에서 상이한 것 같다.
지금까지, 질병에 대한 예방접종은 질병을 조절하는 가장 비용 효과적이고 유효한 방법인 것으로 증명되었다. 그러나, 효능 있는 HCV 백신을 개발하기 위한 노력이 어려움에 처해졌다. 백신에 대한 필수조건은 환자내의 면역 반응의유도이다. 따라서, HCV 항원결정부가 확인되어야 하고, 적당한 세팅으로 환자에게 투여되어야 한다. 항원결정부는 적어도 두 개의 형태, 즉 선형 및 입체형태적 항원결정부로 구분될 수 있다. 입체형태적 항원결정부는 3차원 공간에서 분자의 폴딩(folding)으로부터 생긴다. 일반적으로, 입체형태적 항원결정부는 천연 유사 HCV 항원결정부를 닮는 항원결정부를 제공하기 때문에, 가장 효능있는 백신을 인식할 것으로 믿고 있다. 그러나, 단지 소량의 비리온을 생산하는 HCV 배양에 극복할 수 없는 문제가 표면상으로는 존재한다. 게다가, 올바로 폴딩되지 않은 단백질을 생산하는, 재조합 단백질의 발현 및 정제에 대해서도 방대한 문제가 존재한다. 그러므로, 대부분의 HCV 단백질의 생체내 구조는 불명확하여, 입체형태적 항원결정부에 관한 어떠한 실질적인 연구도 수행되지 않았다.
게다가, 적당한 시험관내 배양 시스템 및 작은 동물 모델의 부족으로 C형 간염 감염에 대한 신규 항바이러스 약물의 개발이 심하게 방해되었다. 침팬지가 HCV 감염, 예방 및 치료의 연구에 대한 유일한 유용한 오늘날의 모델이나, 이 시스템은 단지 이전에 선택된 화합물의 연구를 허용한다.
E1 피막 단백질은 적당한 폴딩 상태에 도달하기 위해 E2 피막 단백질을 필요로 한다고 제안되었다 (Deleersnyder 등, 1997). 게다가, E1 및 E2 는 바이러스 피막의 기본적인 단위를 형성할 수 있는 이형이합체를 형성한다고 제안되었다 (Yi 등, 1997). 그러나, Houghton (1997)은 3 마리의 만성적으로 HCV-감염된 침팬지의 재조합 gpE1E2 (4 x 25 ㎍)로의 반복된 면역화는 현저한 면역 반응을 유도하지 못했다고 보고했다. C형 간염을 가진 환자에서 항-피막 면역 반응의 유도는 정말로 환자에게 바람직하고 이로울 수 있는데, 이는 높은 수준의 그러한 항체가 인터페론 치료에 대한 양호한 반응과 관계있는 것 같으므로, 환자에게서 바이러스를 제거하는 것을 도울 수 있기 때문이다 (PCT/EP 95/03031 Maertens 등에게 허여). 만성 HCV 보균자에서 E1에 대한 항체 수준은 모든 HCV 항체의 가장 낮은 수준에 있으므로, 숙주에 의한 감염의 조절 또는 심지어 제거를 유도하기 위해, 그러한 항체 수준, 및 아마도 세포 반응을 올리는데 이로울 수 있다. 또한, E1에 대한 높은 수준의 세포 면역은 인터페론 치료에 대한 양호한 반응과 관계있는 것 같다 (Leroux-Roels 등, 1996). 중요하게는, 상기 기재된 연구는 천연 유사 E1 펩티드에 의존하지 않았다.
HCV 양성 혈청의 검출을 위한 NS3에서 가장 결정적인 항원결정부는 입체형태적 항원결정부와 관계 있다. 명백히, NS3 항원결정부는 NS3 단백질에 걸쳐 분산된다 (또한 Leroux-Roels 등, 1996; Rehermann 등, 1996, 1997; Diepolder 등, 1995, 1997을 참조). 분석에서 맨먼저 NS3 단백질이 펩티드 대신에 사용되었다.
분자 생물학 및 유전 공학의 진전으로 이종 발현 시스템을 사용하여 대량의 단백질 산물을 생산하는 것이 가능하였다. 그러나, 이종 숙주의 사용은 재조합 산물의 생물학적 및/또는 구조적 성질에서 차이를 초래할 수 있다. 세포내에서 합성 및 이은 정제 동안 또는 이후 단계에서 단백질에 일어날 수 있는 생화학적 변형 중에, 디술피드결합의 형성 및 유지가 중요하다. 시스테인 산화 환원 상태가 디술피드결합의 단백질의 올바른 폴딩 또는 조립과 복잡하게 연결된다. 더욱이, 매우 종종 단백질의 생물학적 기능은 이의 황화수소기의 산화 상태에 의해 조절되거나 적어도 영향을 받는다. 이것은 황화수소기의 산화의 가역성 및 시기가 생리학적 조절 기작으로서 제안된 일부 효소 활성에 대해 사실이다 (또한 Thomas 등, 1995; Nakamura 등, 1997; Aslund 및 Beckwith, 1999 참조).
시스테인의 산화환원 상태(티올에 대해 디술피드 결합 형성)를 촉매하는 몇 가지 단백질 인자가 규명되었다 (Mossner 등, 1998; Prinz 등, 1997; Loferer & Hennecke, 1994). 우세하게, 상기 단백질 인자는 "티오레독신 단백질 슈퍼패밀리"에 속하고, 이의 일원은 Cys-X-X-Cys 공통 서열 (X=임의의 아미노산)로 2개의 산화환원-활성 시스테인을 포함한다. 이 슈퍼패밀리는 활성 부위의 산화환원 전위, 기질 특이성 또는 생물학적 활성에 기초하여 상이한 부류로 구분될 수 있다. 또다른 분류는 산화환원-활성 중심의 공통 서열에 의존하는데, 즉:
(i) 티오레독신(TRX)으로 흔히 표시되는 하나의 부류는 작은 편재하는 단백질로 구성된다. 산화환원-활성 중심은 세균에서 식물 및 포유동물에 이르는 많은 종에서 매우 보존된 공통 서열 Cys-X-Pro-Cys (X=임의의 아미노산)을 가진다. 산화된 TRXox는 TRX-환원효소, FAD 및 NADPH를 가진 복합체에서 이의 환원된 형태로 재생된다.
(ii) 글루타레독신(Glutharedoxine: GRX)은 티오레독신 슈퍼패밀리의 두번째 부류의 흔한 대표이다. 산화환원-활성 중심은 공통 서열 Cys-Pro-X-Cys를 가지는데, 여기에서 X는 바람직하게는 방향족 아미노산, 즉 Tyr 또는 Phe이다. GRX뿐만 아니라 TRX도 디술피드를 가진 환원제로서 작용하나, GRX는 예를 들면, 티올화 단백질의 환원에서 특정 글루타티온(GSH)-혼합된 디술피드 환원효소일 수 있다.
CXXC 모티프가 또한 다양한 세포내 및 세포외 생화학적 및 생물학적 기능, 예를 들면, 티올/디술피드 교환 반응, 전이금속의 결합, 지질 혼입 부위, 및 예를 들면, 유전자 전사의 조절, 시토카인등으로서 기능하는 것을 포함한, 신호 전달의 조절, 및 단백질의 (탈)티올화 상태의 조절과 같은 조절 활성에 관여될 수 있다는 것이 증명되었다. 중요하게, CXXC 모티프는 3차뿐만 아니라 4차 단백질 구조에서 기능할 수 있다 (또한 Thomas 등, 1995; Pinter 등, 1997; Aslund 및 Beckwith, 1999; Nakamura 등, l997 참조).
HCV 단백질은 CXXC 모티프를 함유한다. 그러나, 지금까지 상기 CXXC 모티프의 가역적 산화환원 상태가 HCV 에 중요하다는, 선행기술에서 제안이나 징조는 없다. 지금까지 기재된 정제 절차는 CXXC 모티프에서 가역적인 -S-S- 브리지(bridge)를 설명하지 못했다. 그 결과, 정제된 HCV 단백질의 입체형태뿐만 아니라 이의 생물학적 활성이 손상된다.
천연 HCV 단백질을 연구하는 수많은 시도가 있어 왔다. 직면한 문제는 올바른 또는 천연 유사 입체형태를 가진 HCV 단백질을 정제하지 못하는 것이었다. 따라서, 입체형태적 항원결정부뿐만 아니라 천연 유사 입체형태에 의존하는 다른 생화학적 및 생물학적 기능 및 활성이 수수께끼로 남아 있다. 게다가, 간 질환 및 바이러스 간염에 대한 약물 표적은 동일한 단점으로부터 고생하고, 약물 스크리닝 프로그램은 반드시 실패한다.
발명의 개요/목적
그리하여 발현 및 정제 시스템의 부족 또는 비효율성때문에 단백질의 올바른 폴딩 또는 조립이 손상되는 것 같다. 그러한 정제된 단백질은 종종 생물학적으로 활성이 없고/없거나 올바르지 않은 단백질 구조를 가진다. 그 결과, 천연 항-HCV 항체는 상기 단백질상의 항원결정부의 중요한 서브세트를 인지하지 못한다 (예를 들면, Houghton (1997)을 참조).
본 발명은 시스테인 잔기의 가역적 산화환원 상태에 기인한, 천연 유사 입체형태를 가진 HCV 단백질을 기재하고 처음으로 제조하기 때문에, 이들 문제를 극복한다. 그리하여, HCV 단백질의 신규 구조가 개시된다. 특히, 본 발명은 생물학적으로 활성이고/활성이거나 천연 유사 입체형태를 가진 HCV 단백질의 정제를 허용한다. 천연 유사 HCV 단백질은 신규 입체형태적 및 올리고머화-의존성 항원결정부를 초래한다.
천연 유사 HCV 단백질의 직접 또는 간접적인 (매개된) 시험관내 및 생체내 활성은 생화학적 및 생물학적 경로 및 단계, 예를 들면 대사, 효소, 신호전달, 면역반응성을 연구하는 가능성을 야기한다. 활성 중심, 결합 부위 및 상호작용 도메인 (단백질-단백질, 단백질-당, 단백질-핵산 및 단백질-소분자)의 확인으로 간염과 연관된 세포 및 바이러스 과정을 방해하는 약물의 개발이 가능하다.
시스테인 차폐기 (shielding group)가 제거된 본 발명의 정제 및 폴딩 방법에 이은, HCV 단백질내의 시스테인 잔기의 재폴딩 및 재산화는 HCV 단백질의 천연 유사 입체형태의 회복을 허용한다.
목적
본 발명은 가역적 산화환원 상태를 가지는, Cys-아미노산을 함유하는, HCV 단백질, 또는 이의 임의의 기능적으로 동등한 부분을 목적으로 한다. 특히, 본 발명은 가역적 산화환원 상태를 가진 두 개 이상의 Cys-아미노산을 함유한, HCV 단백질에 관한 것이다. 후자의 Cys-아미노산은 다른 아미노산에 의해 간격이 생길 수 있다. 바람직하게는 상기 Cys 아미노산은 아미노산 서열 Cys-X1-X2-Cys에 포함된다 (식 중, 아미노산 X1및 X2는 임의의 아미노산을 나타낸다). 더욱 바람직하게는, 아미노산 X1은 아미노산 Val, Leu 또는 Ile 중의 하나를 나타내고, 아미노산 X2는 아미노산 Pro를 나타낸다.
더욱이, 본 발명은 상기에 따라, 하기 과정에 의해 수득될 수 있는 가역적 산화환원 상태를 가진, 두 개 이상의 Cys-아미노산을 함유한, HCV 단백질, 또는 이의 임의의 기능적으로 동등한 부분을 제공하는 것을 목적으로 한다:
(a) 시스테인 잔기가 화학적으로 및/또는 효소학적으로 가역적으로 보호되는, HCV 단백질, 또는 이의 임의의 기능적으로 동등한 부분을 정제하는 것,
(b) 시스테인 잔기의 가역적으로 보호 상태의 제거,
(c) 시스테인 잔기가 가역적 산화환원 상태를 가지는, HCV 단백질, 또는 이의 임의의 기능적으로 동등한 부분을 수득하는 것.
더욱이, 본 발명은 약제로서 사용하기 위해, 상기에 정의된 바와 같은, HCV 단백질, 또는 이의 임의의 기능적으로 동등한 부분을 제공하는 것을 목적으로 한다.
더욱이, 본 발명은 HCV 백신 조성물, 특히 치료용 백신 또는 예방용 백신의 제조를 위해, 상기에 정의된 바와 같은, HCV 단백질, 또는 이의 임의의 기능적으로 동등한 부분의 용도를 목적으로 한다.
더욱이, 본 발명은 특정 항체를 증가시키기 위해, 상기에 정의된 바와 같은, HCV 단백질, 또는 이의 임의의 기능적으로 동등한 부분을 제공하는 것을 목적으로 한다.
게다가, 본 발명은 HCV 항체-HCV 단백질 복합체의 형성을 결정함으로써 HCV 항체를 검출하기 위한 면역학적 분석을 제공하는 것을 목적으로 한다.
결국, 본 발명은 산화환원효소 활성의 변화를 모니터링함으로써, 상기에 정의된 바와 같은 HCV 단백질의 활성을 조절하는 화합물을 확인하기 위한 생물학적 분석을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 모든 목적은 하기에 설정된 구현예에 의해 만족되는 것으로 생각된다.
본 발명은 시스테인 잔기가 정제 동안 가역적으로 보호되는 HCV 단백질에 관한 것이다. 결국, 상기 정제 절차는 해당 항원결정부(epitope)를 제공하는, 천연 유사 입체구조 및 생물학적 활성을 갖는 HCV 단백질을 초래한다. 본 발명은 또한 이들 HCV 단백질을 이용한 약물 스크리닝 방법, 및 백신 및 약물과 같은, 진단용 및 치료용 적용에 관한 것이다.
도 1: L-아스코르베이트의 존재하에 용해(lysis) 후에 가역적으로 보호되고, 비가역적으로 봉쇄된 베로(Vero) 시료의 크기 배제.
베로 세포를 1mM L-아스코르베이트의 존재하에 Triton X-100으로써 용해하였다. 용해액을 렌틸 렉틴 (Lentil Lectin)상에 적재하고, [PCT EP95/03031, Maertens 등에게 허여]에 기재된 바와 같이 pH 7.2에서 7.5mM DTT로써 환원시켰다.환원된 E1s를 (1) 소듐 테트라티오네이트로써 술폰화시키고, (2) N-에틸말레이미드로써 비가역적으로 봉쇄시키거나 (3) 미처리된 상태로 방치하나, 용액의 pH는 6으로 감소시켰다.
[PCT EP95/03031, Maertens 등에게 허여]에 의한 절차에 따른 SEC 프로필이 기준으로서 포함된다.
Superdex G200 10/30 (Pharmacia)상의 겔 여과를 조건(3)을 제외하고는, PBS, pH 7.2, 3% Empigen에서 수행하였다. 이 겔 여과를 10 mM 포스페이트, 150 mM NaCl, pH 6.0에서 수행하였다.
SEC 프로필:
A: 아스코르베이트의 존재하에 용해 및 DTT로써 환원후에 술폰화
B: 아스코르베이트의 존재하에 용해 및 DTT로써 환원후에 비가역적으로 봉쇄
C: 아스코르베이트의 존재하에 용해 및 추가의 처리없이, SEC를 pH 6.0에서 수행하였다
D: 기준: 용해액 중의 NEM/NEM.bio로써 봉쇄 및 DTT 환원 후 (PCT EP95/03031, Maertens 등에게 허여)
바(bar)는 은 염색 및 웨스턴 블롯팅에 의한 분석에 대한 풀(pool)을 나타낸다.
히스토그램은 샌드위치 ELISA 결과를 제공한다: Mab 14H11B2 (IGH 207)을 코팅을 위해 사용하고, HRP 표지된 25C3 (IGH 200)으로써 검출을 수행하였다.
도 2: 술폰화제의 존재하에 용해 후에 가역적으로 보호되고, 비가역적으로봉쇄된 베로 E1s의 크기 배제 크로마토그래피.
베로 세포를 [PCT EP95/03031, Maertens 등에게 허여]에 기재된 바와 같이 용해시켰으나, 소듐 테트라티오네이트를 NEM/NEM.bio 대신에 첨가하였다.
렌틸상의 정제 및 환원을 [PCT EP95/03031, Maertens 등에게 허여]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 환원된 물질을 (1) 소듐 테트라티오네이트로써 술폰화시키거나, (2) IAA로써 처리하였다 (비가역적으로 봉쇄함).
[PCT EP95/03031, Maertens 등에게 허여]에 기재된 방법에 의해 수득된 물질은 기준으로서 포함된다.
3개의 상이한 E1s 시료를 PBS, 3% Empigen, pH 7.2로써 평형화된, Superdex G200 10/30 칼럼상에서 분리하였다.
A: 베로 세포 용해액의 술폰화 및 DTT로써 환원후에 술폰화
B: 베로 세포 용해액의 술폰화 및 요오도-아세트아미드로써 비가역적인 봉쇄
C: [PCT EP95/03031, Maertens 등에게 허여]에 기재된 NEM/NEM.bio로써 비가역적인 봉쇄 후에 수득된 베로 E1s
D: SEC 프로필의 겹침
샌드위치 ELISA의 결과를 히스토그램으로 제시한다.
E1s 분획을 바로써 나타낸 바와 같이 모으고, 은 염색 및 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다.
도 3: SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅에 의해 3% Empigen 중의 SEC의 분획 분석.
(A): 가역적인 보호 및 비가역적인 봉쇄의 상이한 조건 후에 수득된 SEC 분획을 SDS-PAGE 및 은 염색에 의해 분석하였다.
아스코르베이트에서 용해 및 pH 6에서 겔 여과 (도 1C 참조) 또는 아스코르베이트에서 용해 및 술폰화 (도 1A)후에 수득된 분획의 SDS-PAGE 분석을 도 3A-1에 예로서 제시한다. 도 3A-2는 도 1C에 기재된 조건에 대해 11B7D8을 이용하여 웨스턴 블롯에 의한 분획 스크리닝을 보여준다 (아스코르베이트에서 용해 및 DTT 환원 후에 pH 6에서 SEC).
(B) SEC-풀의 웨스턴 블롯을 아미노- 및 카르복시-말단 항원결정부를 각각 인지하는, 항-E1s MAbs 5E1A10으로써 수행하였다.
풀을 도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이 제조하였다.
레인 1 및 6: 분자량 마커
레인 2 및 7: [PCT EP95/03031, Maertens 등에게 허여]에 의해 제조된 기준 물질
레인 3 및 8: 비가역적으로 봉쇄된 시스테인으로써 제조된 기준 물질 (요오도-아세트아미드로써 처리)
레인 4 및 9: 용해액의 술폰화 및 환원 후의 술폰화 후에 수득된 물질
레인 5 및 10: 아스코르베이트의 존재하에 용해 및 환원 후의 술폰화 후에 수득된 물질.
도 4: 대장균 발현된 (his)6-태깅된 NS3 융합 단백질
가역적으로 보호 후에 금속 친화성 크로마토그래피상의 정제뿐만 아니라ELISA 용 시료 제조를 도시한다.
+/- AO: 가역적 보호제 (AO)의 존재 또는 부재하에
도 5: 상이한 코팅 조건 후에 mTNF(His)6NS3 융합 단백질의 ELISA 반응성.
도 5A: 90% 순수한 mTNF(His)6NS3B9 융합 단백질을 200mM DTT로써 환원 후에 25 mM 시트레이트, 1mM EDTA, pH 4로 탈염하였다. 융합 단백질을 탈염 완충액에서 500㎍/ml 까지 희석하고 티올 보호제 (항산화제군 1, 군 2)의 존재 또는 부재하에 -70℃에 저장하였다.
시료를 티올 보호제 (항산화제)의 존재 또는 부재하에 ELISA 코팅 완충액 (50 mM 비카르보네이트 완충액, pH 9.6)에서 0.5㎍/ml로 희석하였다. 웰을 보호제의 존재 또는 부재하에 PBS로써 봉쇄하였다.
혈청 시료 인큐베이션을 10 mM DTT의 존재 또는 부재하에 수행하고, 세척 후에 HRP 접합된 토끼 항 인간 항체 (Dako, Denmark)로써 ELISA를 생성하였다. 반응을 2N H2SO4의 첨가로 중지시켰다.
혈청 (17790, 17826, 17832, 17838)을 시험하였다. 혈청 17790 및 17832는 200 mM DTT로써 처리 후에 HCV 양성 혈청으로서 단지 검출되기 때문에 (양성 대조군), 어려운 혈청으로서 고려된다. 10 mM DTT 처리는 이들 혈청에 대한 음성 대조군으로서 포함된다. 혈청 17826 및 17838은 10 mM DTT 처리 후에 NS3B9 단백질과 반응하는 혈청이다 (그리고 용이하게 검출가능한 HCV 혈청으로서 고려된다).
항산화제군 1: 1mM EDTA, 1mM L-아스코르브산, 1 mM 환원된 글루타티온.
봉쇄를 보호제의 존재하에 수행한다면, ELISA 과정 동안 상기 티올 보호제에 1mM 토코페롤을 보충적으로 첨가하였다.
항산화제군 2: 1mM 티오디에틸렌글리콜 (TEG), 1mM 티오펜카르복실산 (TPCB), 1mM 피롤리돈 디티오카르바메이트 (PDTC), 1mM 디에틸 디티오카르바메이트 (DETC).
도 5B: 티올 화합물 및 NS3 B9 반응성
가역적 보호기로서 모노- 및 디티오 화합물의 효과 (유형 및 농도)를 더욱 상세히 조사한 것을 제외하고는, 도 5A에 기재한 바와 같이 ELISA를 수행하였다.
시료 희석액을 항상 3 mM DTT의 존재하에 상기 ELISA에서 인큐베이션하였다.
항산화제 1= 1mM EDTA, 1 mM L-아스코르베이트
항산화제 2= 1mM 티오펜카르복실산 (TPBC), 1 mM 티오에틸렌글리콜 (TEG), 1 mM 디에틸 디티오카르바메이트 (DETC), 1mM 피롤리돈 디티오카르바메이트 (PDTC).
4 mM DTC = 2 mM DETC, 2 mM PDTC
4 mM 모노-SH = 2 mM TPBC, 2mM TEG.
GSH 및 Cys는 각각 환원된 글루타티온 및 시스테인이다.
도 6: 금속 친화성 크로마토그래피 후에 정제되고 가역적으로 보호된 (his)6-태깅된 HCV 단백질의 SDS-PAGE 분석
6A: 대장균 발현된 mTNF(His)6NS3B9 (배치(batch) NS3B9 B960925II).
비환원 조건하에 항 mTNF를 이용한 웨스턴 블롯 및 은 염색된 SDS-PAGE (1㎍ 단백질/레인).
6B: 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevesiae) (효모) 발현된 (his)6-태깅된 E1s
단백질을 (a) 은 염색; (b) 항 E1s 웨스턴 블롯팅 또는 (c) GNA 블롯팅으로 보았다.
Maertens 등 (PCT EP95/03031)에 의해 기재된 바와 같이 정제되고, 우두 발현된 E1s를 기준으로서 포함하였다.
본원에 기재된 발명은 이전에 공개된 작업 및 계류중인 특허출원에 의존한다. 실시예를 통해, 그러한 작업은 과학 논문, 특허 또는 계류중인 특허출원으로 구성된다. 이전에 또는 하기에 인용된, 모든 이들 공개 및 출원은 여기에 참고로 포함된다.
본 발명은 특정 입체형태를 가진 HCV 단백질에 관한 것이다. 최초로 천연 유사 입체형태를 가진 HCV 단백질, 특히 HCV E1 단백질이 생성된다. 상기 HCV 단백질의 입체형태에 관련된 특정 시스테인 결합이 중요하다고 발견되었다. 실시예의 하나의 방식으로서, 천연 유사 입체형태를 가진 HCV 단백질의 정제를 가능하게 하는 신규하고 진보적인 정제 절차가 개시된다. 상기 신규 HCV 단백질은 입체형태적 항원결정부를 제공할 뿐만 아니라 생물학적 활성을 나타낼 수 있다.이들 신규 HCV 단백질은 다양한 연구, 예를 들면, 약물 스크리닝, 생물학적 활성, 신호전달 경로, 세포내 및 세포외 가공, HCV 및/또는 비-HCV 분자사이의 상호작용 및 결합, 올리고머화, 입체형태적 항원결정부, 항체 스크리닝, 대사 및 효소학적 활성, 면역 반응성에 관한 연구에 사용될 수 있다. 명백히, 상기 연구는 결국 진단용 및/또는 치료용 적용에 대한 내용에 위치할 수 있다.
본 발명은 HCV 단백질이 시스테인 잔기의 가역적 산화환원 상태에 기인하여, 특정 천연 유사 입체형태 및 생물학적 활성을 갖는다는 발견에 기초한다.
본 발명은 그러므로 가역적 산화환원 상태를 가지는, Cys-아미노산을 함유하는, HCV 단백질, 또는 이의 임의의 기능적으로 동등한 부분에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 가역적 산화환원 상태를 가진 두 개 이상의 Cys-아미노산을 함유한, HCV 단백질에 관한 것이다. 후자의 Cys-아미노산은 다른 아미노산에 의해 간격이 생길 수 있다. 바람직하게는 상기 Cys 아미노산은 아미노산 서열 Cys-X1-X2-Cys에 포함된다 (식 중, 아미노산 X1및 X2는 임의의 아미노산을 나타낸다). 더욱 바람직하게는, 아미노산 X1은 아미노산 Val, Leu 또는 Ile 중의 하나를 나타내고, 아미노산 X2는 아미노산 Pro를 나타낸다.
HCV
이에 대해, 본 발명은 HCV, 및 플라비비리대(Flaviviridae) 속의 다른 일원, 예를 들면, G형간염 바이러스, 뎅기열 바이러스(Dengue virus), 황열병 바이러스(Yellow Fever Virus)에 관한 것이다. 그리하여, 용어 "HCV"는 플라비비리대속의 모든 일원을 고려한다.
단백질
본원에 사용된 용어 "단백질"은 이의 아미노산 서열에서 산화환원 상태가 가변적인(하기 참조), 하나 이상의 시스테인을 함유하는, HCV 단백질, 또는 이의 임의의 기능적으로 동등한 부분을 말한다. 또한, 이의 아미노산 서열에서 하나 이상의 시스테인을 함유한 단백질 "도메인"은 용어 "단백질"로 고려된다. 본원에 사용된 용어 "이의 기능적으로 동등한 부분"은 이의 아미노산 서열에서 산화환원 상태가 가변적인, 하나 이상의 시스테인을 함유하는, 상기 HCV 단백질의 부분 또는 절편을 말한다. 특히, 용어 "단백질" 및 "이의 기능적으로 동등한 부분"은 산화환원 활성 중심을 함유한 HCV 단백질 및 이의 절편, 예를 들면, HCV E1 단백질을 말한다. 더욱 특별하게는, 본 발명은 HCV E1s 및 HCV E1p에 관한 것이다. 이에 대해, 본원에 사용된 용어 "산화환원 활성 중심"은 공통 서열 CXXC를 가진 단백질 모티프를 함축한다.
용어 "펩티드"는 주지의 HCV 단백질 (Linnen 등, 1996; Maertens 및 Stuyver, 1997)로부터 유도된 아미노산 (aa)의 중합체를 말한다. 용어 "HCV E1"은 당업자에게 주지의 단백질이다 (Wengler, 1991). 이전에 비구조 단백질 1 (NS1) 또는 E2/NS1이라 불려진, HCV E2와 함께, HCV E1은 HCV의 피막 부위를 구성한다.
HCV E1s (192-326)
YEVRNVSGMY HVTNDCSNSS IVYEAADMIM HTPGCVPCVR ENNSSRCWVA
LTPTLAARNA SVPTTTIRRH VDLLVGAAAF CSAMYVGDLC GSVFLVSQLF
TISPRRHETV QDCNCSIYPG HITGHRMAWD MMMNW
HCV E1p (192-237)
YEVRNVSGMY HVTNDCSNSS IVYEAADMIM HTPGCVPCVR ENNSSR
용어 "펩티드"는 아미노산의 중합체를 말하고, 산물의 특정 길이를 말하지 않는다. 용어 "펩티드", "폴리펩티드", "다중단백질" 및 "단백질"은 "펩티드"의 정의내에 포함되고, 본원에 상호교환하여 사용된다. 용어 "펩티드"는 펩티드의 발현 후 변형, 예를 들면, 글리코실화, 아세틸화, 인산화 등을 언급하지 않거나 배제한다. 펩티드의 정의내에 포함된 것은, 예를 들면, 아미노산의 하나 이상의 동족체 (예를 들면, 비천연 아미노산, PNA (Nielsen 등, 1991, 1993)등을 함유)를 함유한 폴리펩티드, 천연 및 비천연적으로 발생하는, 치환된 연결뿐만 아니라 당업계에 공지된 다른 변형을 가진 펩티드이다. 그리하여, 펩티드는 D- 또는 L-아미노산으로 구성된, 선형, 원형 또는 제한될 (본 발명외에 따라, 'S-S' 브리지에 의해 원형화되거나 안정화됨) 수 있고; 펩티드는 다합체, 분지형, 파아지상에 제공되거나 상이한 성질의 중합체, 예를 들면, 유기, 지질, 탄수화물, 단백질, 핵산 중합체상에 공유적으로 또는 비공유적으로 고정화될 수 있거나; 펩티드는 골격(scaffold)에 존재할 수 있다. 그리하여 펩티드 모방물(peptidomimetics) 또는 미모토프(mimotope)가 용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"에 본질적인 것으로 이해되어야 한다.
중합체상의 고정화는 HCV 펩티드 자체의 잔기 또는 다른 분자에, 예를 들면,his-태그 (Dietrich 등, 1996) 또는 지질 킬레이터 (Dietrich 등, 1995)를 거쳐 융합되거나 연결된 HCV 펩티드에 의해 인식될 수 있다.
용어 "미모토프"는 본원에 면역학적으로 정의된 폴리펩티드를 모방하는 폴리펩티드를 말한다. 서열 가변성이 HCV에 대해 관찰되었기 때문에, 상이한 계통의 항원결정부를 더욱 잘 모방하기 위해 하나 이상의 아미노산을 변하게 하는 것은 바람직할 수 있다. 그러한 미모토프는 대상 화합물이 HCV의 하나 이상의 계통과 면역학적 경쟁을 제공할 수 있는 한, 임의의 특정 HCV 서열과 동일할 필요는 없다고 이해되어야 한다.
용어 "펩티드 모방물"은 전적으로 아미노산으로 구성될 필요가 없으나, 본원에 면역학적으로 정의된 폴리펩티드를 모방하는 분자를 말한다.
본 발명은 구체적으로 고전적인 화학 합성에 의해 제조된 펩티드를 말한다.
합성은 균질 용액 또는 고상에서 수행될 수 있다. 예를 들면, 사용될 수 있는 균질 용액에서의 합성 기술은 Houbenweyl (1974)에 의해 기재된 것이다. 본 발명의 펩티드는 또한 Atherton 및 Shepard (1989)에 의해 기재된 방법에 따라 고상에 의해 제조될 수 있다. 게다가, 덴드리머(dendrimer) (Zhang & Tam, 1997), 폴리케타이드 (Carreras & Santi, 1998) 또는 인테인 기술 (Southworth 등, 1999)에 의해 합성된 HCV 펩티드, 펩티도메틱스(peptidometics) 및 미모토프가 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명에 따른 펩티드는 또한 Sambrook 등 (1989)에 기재된 것과 같은, 재조합 DNA 기술에 의해 원핵세포 또는 하등 또는 고등 진핵세포에서 제조될 수 있다. 용어 "하등 진핵세포"는 효모, 곰팡이 등과 같은 숙주 세포를 말한다. 하등 진핵세포는 일반적으로 (그러나 반드시는 아님) 단세포이다. 용어 "원핵세포"는 대장균(E.coli), 락토바실러스(Lactobacillus), 락토코쿠스(Lactococcus), 살모넬라(Salmonella), 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 또는 스트렙토마이세스(Streptomyces)와 같은 숙주를 말한다. 또한 상기 숙주는 본 발명내로 고려된다. 바람직한 하등 진핵세포는 효모이고, 특히 쉬조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 사카로마이세스(Saccharomyces), 클루이베로마이세스(Kluiveromyces), 피키아(Pichia) (예를 들면, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)), 한세눌라(Hansenula) (예를 들면, 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)), 쉬바니오마이세스(Schiwaniomyces), 야로위아(Yarowia), 지고사카로마이세스(Zygosaccharomyces) 등내의 종이다. 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 칼스베르겐시스(Saccharomyces carlsbergensis) 및 클루이베로마이세스 락티스(K.lactis)가 가장 흔히 사용되는 효모 숙주이고, 편리한 곰팡이 숙주이다. 용어 "고등 진핵세포"는 포유동물, 파충류, 곤충 등과 같은, 고등 동물로부터 유래된 숙주 세포를 말한다. 현재로 바람직한 고등 진핵 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 (예를 들면, CHO), 원숭이 (예를 들면, COS 및 베로 세포), 어린 햄스터 신장 (BHK), 돼지 신장 (PK15), 토끼 신장 13 세포 (RK13), 인간 골육종 세포주 143 B, 인간 세포주 HeLa 및 Hep G2 같은 인간 간암 세포주, 및 곤충 세포주 (예를 들면, 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda))로부터 유래된다. 숙주 세포는 플라스크 배양, 조직 배양, 기관 배양 등의 현탁액으로 제공될 수 있다. 대안적으로 숙주 세포는 또한 트랜스제닉 동물일 수 있다.
본 발명에 따른 단백질은 또한 포유동물 숙주, 특히 마우스 또는 영장류, 예를 들면, 인간뿐만 아니라 비인간으로부터 분리될 수 있다.
아미노산이 이들 완전한 이름, 3 글자 약어 및 1 글자 기호에 의해 표시될 수 있다는 것은 당업계에 주지되어 있다 (예를 들면, Stryer, 1981 참조).
더욱이, 본 발명은 특히 예를 들면, 하기와 같은 세포내 또는 세포간 숙주 분자 (숙주 유래된 분자)를 결합하는, 상기에 정의된 HCV 단백질 또는 이의 부분에 관한 것이다:
(i) 수용체 단백질, 예를 들면, 아넥신 V, 아포지단백 B, 튜불린, 24 kDa 원형질막 단백질 (Abrigani WO 97/09349), 만노오스 수용체, 아시알로당단백질 수용체;
(ii) 산화환원 조절에 관련된 분자 (단백질 또는 비단백질 화합물), 예를 들면, 글루타티온, TRX 및 GRX;
(iii) 샤페론 단백질, 예를 들면 칼넥신;
(iv) 다양한 글리코스아미노글리칸 (펩티드 및/또는 당 핵심);
(v) 핵산 또는 지질.
더욱이, 본 발명은 동형- 및/또는 이형 올리고머 복합체를 초래하는, 또다른 HCV 단백질 또는 HCV 핵산 (HCV-유래된 분자), 또는 이의 부분에 특히 결합하는,상기에 정의된 HCV 단백질 또는 이의 부분에 관한 것이다.
다른 HCV 유래 분자 또는 숙주 유래 분자에 결합된 상기 정의된, HCV 단백질, 또는 이의 부분에 기인한 복합체는 일상적으로 "HCV 유래 복합체"로 나타낸다. 그리하여, "HCV 유래 복합체"는 또다른 분자, 즉 (HCV-단백질)-X (식 중, X는 숙주 유래 분자 또는 HCV 유래 분자이다)에 연결된 상기에 정의된, 적어도 HCV 단백질로 구성된다.
순수
본원에 적용된 용어 "정제된"은 예를 들면, HCV 피막 단백질과 같은 원하는 성분이 조성물 중에 총 성분의 35% 이상을 구성하는 조성물을 말한다. 원하는 성분은 바람직하게는 조성물의 총 성분 분획의 약 40% 이상, 더욱 바람직하게는 약 50% 이상, 더 더욱 바람직하게는 약 60% 이상, 더 더욱 바람직하게는 약 70% 이상, 더 더욱 바람직하게는 약 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 약 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 약 95% 이상, 가장 바람직하게는 약 98% 이상을 구성한다. 조성물은 본원에 사용된 순수%의 결정에 영향을 주지 않고, 다른 화합물, 예를 들면, 탄수화물, 염, 지질, 용매 등을 함유할 수 있다. "분리된" HCV 단백질은 35% 이상 순수한 HCV 단백질 조성물을 의도한다. 이에 대해 본원에 사용된 용어 "정제된 HCV 단백질"은 본질적으로 순수한 형태로 분리된 HCV 단백질을 말한다는 것을 명백히 해야 한다. 본원에 사용된 용어 "본질적으로 정제된 HCV 단백질"은 이들이 시험관내 진단용 방법 및 치료용에 사용될 수 있는 HCV 단백질을 말한다. 상기 HCV 단백질은 세포 단백질, 벡터 유래된 단백질 또는 다른 HCV 바이러스 성분이 실질적으로 없다. 통상, 상기 단백질은 균질하게 정제되는데, 80% 이상 순수, 바람직하게는 85%, 더욱 바람직하게는 90%, 더욱 바람직하게는 95%, 더욱 바람직하게는 97%, 더욱 바람직하게는 98%, 더욱 바람직하게는 99%, 더 더욱 바람직하게는 99.5% 이상 순수하고, 가장 바람직하게는 오염 단백질이 SDS-PAGE 및 은 염색과 같은 종래의 방법에 의해 검출되지 않아야 한다.
항체
본 발명은 또한 상기에 기재된 HCV 펩티드를 인지할 수 있는 HCV 항체에 관한 것이다.
더욱이, 본 발명은 HCV 단백질 또는 이의 기능적으로 동등한 부분을 특이적으로 인지하는, 항 HCV 항체를 증가시키기 위한, 상기 정의된 HCV 단백질 또는 이의 기능적으로 동등한 부분에 관한 것이다.
용어 "HCV 항체"는 본 발명의 HCV 단백질 또는 HCV 유래된 복합체에 결합하는 임의의 다중클론 또는 단클론 항체를 말한다.
더욱이, 용어 "HCV 항체"는 또한 상기 HCV 단백질에서 S-S 브리지의 존재로 인한 HCV 단백질의 입체형태로부터 생기는 항원결정부에 대해 증가된 특정 HCV 항체를 함축한다. 특히, 상기 S-S 브리지는 내재하거나 항원결정부의 부분일 수 있다. 그러나 시스테인의 산화-환원 상태 (환원된 또는 산화된; 티올화 또는 S-접합된 형태로)는 상기 시스테인 잔기를 포함하거나 포함할 수 없는, 신규 항원결정부를 초래하는, 단백질 입체형태 (상기 시스테인 잔기의 근처 또는 근처가 아님)를 변화시키거나 안정화시킬 수 있다. 상기 신규 항원결정부가 또한 본 발명의 부분이다. 게다가, 용어 "HCV 항체"는 또한 상기에 정의된, 미모토프에 결합하는 임의의 다중클론 또는 단클론 항체를 말한다.
게다가, 용어 "HCV 항체"는 그리하여 또한 HCV 유래된 복합체의 특정 입체형태로부터 생기는 항원 결정부에 결합하는 항체, 즉 본 발명의 HCV 펩티드 또는 상기 HCV 펩티드가 결합하는 분자, 예를 들면, 본 발명의 HCV 펩티드 및 글리코스아미노글리칸 (GAG), 헤파린, 핵산, 지질, 금속 이온과 같은 보조인자 등과 같은 비단백질 화합물사이의 상호작용으로부터 이들 기원을 찾는 항원결정부상에 존재하지 않는 항원 결정부에 결합하는 항체에 관한 것이다. 더욱이, 항원결정부는 예를 들면 단백질 가공, 절단 또는 pH 변화에 의해 도입된 것과 같은 입체형태적 변화에 의해 형성될 수 있다.
용어 "항원결정부"는 항체 결합 자리에 의해 특이적으로 결합되는 항원-항체 복합체의 부분을 말한다. 항원결정부는 당업계에 공지된 임의의 기술에 의해 결정될 수 있거나 당업계에 공지된 다양한 컴퓨터 예측 모델에 의해 예상될 수 있다.
본 발명에 사용된 표현 "인지", "결합", 또는 "항체-단백질 복합체의 형성"은 항원 및 항체 사이의 결합, 즉 상호작용이 항체 및 항원의 면역학적 성질을 고려하는 모든 조건하에 일어나야 하는 것으로 해석되어야 한다.
더욱이, 본 발명의 절차와 상이한, HCV 펩티드를 생산하기 위해 공지된 다양한 다른 절차가 존재한다. 상기 다른 절차는 항원결정부를 제공할 수 있는 HCV 펩티드를 초래할 수 있다. 상기 다양하고 상이한 절차에 의해 수득된, HCV 펩티드가 본 발명의 항원결정부와 유사한 항원결정부를 제공할 수 있다는 것을 생각할 수 있다. 그리하여, 유사한 항원결정부는 하나의 동일한 항체에 의해 인지가능하나, 본 발명과는 상이한 생산 또는 정제 절차로부터 생기는 항원결정부이다. 그러나, 본 발명의 단백질은 극도로 효율적인 항원결정부를 제공한다. 따라서, 단백질상의 항원결정부는 더욱 면역원성이다. 그러므로, 본 발명은 또한 단백질상의 항원결정부에 관한 것으로, 상기 항원결정부가 본 발명에 따라 생산되지 않고, 가역적 산화환원 상태를 가진 시스테인 잔기를 가지지 않는, HCV 펩티드상의 항원결정부보다 10배 이상, 바람직하게는 20배 이상, 바람직하게는 50배 이상, 바람직하게는 100배 이상, 바람직하게는 500배 이상, 가장 바람직하게는 1000배 이상 더욱 면역원성이다. 상기 면역원성은 예를 들면, 검출될 수 있고, 그리하여 각 방법에 의해 생산된, 필적할 만한 펩티드 양을 투여함으로써 포유동물을 면역화시킴으로써 비교될 수 있다는 것이 당업자에 의해 인식될 것이다.
더욱 구체적으로, 용어 "HCV 항체"는 천연, 재조합 또는 합성 HCV 단백질에 결합하는 항체, 특히 HCV, 또는 임의의 기능적으로 동등한 변이체 또는 이의 부분으로부터 유래된 천연, 재조합 또는 합성 E1, E1s, E1p 및/또는 NS3 단백질에 결합하는 항체 (각각 항-HCV-E1-, 항-HCV-E1s-, 항-HCV-E1p- 또는 HCV-NS3- 항체)를 말한다. HCV 항체는 체액의 시료에 존재할 수 있고, HCV-E1-항체, HCV-E1s-항체, HCV-E1p-항체 또는 HCV-NS3-항체일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "단클론 항체"는 균질 항체군을 가진 항체 조성물을 말한다. 용어는 항체의 종 또는 기원에 관하여 제한되지 않고, 그것이 제조된 방식에 의해서도 제한되지 않을 의도이다. 그리하여, 용어 "항체"는 또한 낙타 (아라비아 및 쌍봉낙타), 또는 라마속으로부터 유래된 항체를 고려한다.
그리하여, 용어 "항체"는 또한 파아지 현시 기술 또는 약물 스크리닝 프로그램으로부터 유래된 항체를 말한다.
게다가, 용어 "항체"는 또한 면역글로불린의 골격 부위의 적어도 일부분이 미국 특허 제 4,946,778호에 기재된 인간 면역글로불린 서열 및 단일 사슬 항체로부터 유래되는 인간화된 항체 및 Fab, F'(ab)2, Fv, 및 부모 항체의 항원 결합능 및 특이성을 보유하는 다른 절편과 같은 항체의 절편을 말한다. 용어 "항체"는 또한 디아보디(diabody), 트리아보디(triabody) 또는 다합체 (모노-, 비-, 테트라- 또는 다가/모노-, 비- 또는 다중특이적) 항체뿐만 아니라, 엔지보디(enzybody), 즉 효소 활성을 가진 인공적인 항체를 말한다. 친화성 또는 특이성을 증가시키는 임의의 다른 분자와 항체의 조합이 또한 용어 "항체" 내에 고려된다. 항체는 또한 변형된 형태 (예를 들면, mPEG화 또는 폴리시알화 형태, Fernandes & Gregoriadis, 1997)뿐만 아니라 공유적으로 또는 비공유적으로 중합체 결합된 형태를 포함한다.
게다가, 용어 "항체"는 또한 임의의 성질의 항체 모방 화합물, 예를 들면, 지질, 탄수화물, 핵산 또는 동족체, 예를 들면 PNA, 압타머(aptamer)(Jayasena, 1999 참조)로부터 유래된 것에 관한 것이다.
HCV 항체는 HCV 감염된 혈액의 풀 또는 HCV 백신으로부터 수득된 혈액으로부터 정제된 후에 예방접종에 의해 유도될 수 있거나 주사에 의해 수동적으로 전이될수 있다.
본 발명은 또한 본원에 정의된 HCV 펩티드를 검출하기 위한 HCV 항체를 함유하는 키트에 관한 것이다.
정제 절차
본 발명은 추가로 HCV 단백질의 하나 이상의 시스테인 잔기가 가역적 산화환원 상태를 가지는 HCV 단백질을 초래하는, 본원에 기재된 정제 절차뿐만 아니라, 상기 정제 절차에 의해 수득가능한 HCV 단백질에 관한 것이다. 정제 동안 적어도 시스테인 잔기가 화학적 및/또는 효소학적 수단에 의해 가역적으로 보호된다 (또한 실시예 섹션을 참조).
이에 대해, 본원에 사용된 용어 "가역적 산화환원 상태"는 환원 상태에서 산화 상태 및 그 역으로 변화하는 능력을 가진 시스테인의 황을 말한다. 산화환원 상태에서 이 변화는 전자 전달이 관여한다. 본원에 사용된 용어 "산화환원효소 활성"은 산화환원 활성 중심의 산화환원 전위를 말하며, 그리하여 전자를 기질 분자로부터 및 기질 분자에게 전달하는 능력을 말한다. 이 능력은 기질 분자의 산화환원 전위 및 화학적 환경에 의존한다.
천연 HCV 단백질은 특정 입체형태를 가지며 생물학적 활성을 나타낼 수 있다. 본 발명의 정제 절차는 HCV 단백질의 천연 생물학적 활성 및/또는 입체형태와 동일하거나 거의 동일한 (천연 유사) 생물학적 활성 및/또는 입체형태를 가진 정제된 HCV 단백질을 초래한다. 본 발명의 정제 절차는 하기를 특징으로 한다:
-A- 본 발명의 정제 절차에서 제 1 국면은 시스테인 잔기의 반응성을 가역적으로 보호하는 의도이다.
본질적으로, 제 1 국면은 PCT EP95/03031 (Maertens 등에게 허여)에 광대하게 기재된 절차로 구성되나, 하나의 기본적인 차이에 대해, 특히 시스테인 잔기가 가역적으로 보호된다.
시스테인 잔기의 가역적인 보호는 하기 조건 (i) 변형기, 또는 (ii) 티올 및/또는 디술피드 브리지의 안정화 중의 하나에 의해 성취될 수 있다.
실제로, 상기 보호는 HCV 단백질을 안정화하는데, 즉 티올 및/또는 디술피드 브리지는 반응하려는 경향이 없다.
그리하여, 제 1 국면은 결국 가역적으로 보호되는 시스테인을 가진 순수 산물을 초래한다;
-B- 본 발명의 정제 절차에서 제 2 국면은 시스테인 잔기의 반응성을 회복할 의도이다.
정제 절차의 제 1 국면 후에, 시스테인 잔기가 가역적으로 보호되는 조건이 제거된다.
상기 제거는 시스테인 잔기의 가역적 산화환원 상태의 회복을 가능하게 한다.
그리하여, 결국 시스테인 잔기가 가역적 산화환원 상태를 가지는 HCV 펩티드, 또는 이의 임의의 기능적으로 동등한 부분이 수득된다.
가역적 산화환원 상태는 생물학적 활성 및/또는 천연 유사 입체형태를 가지는 반응성인 HCV 단백질을 허용한다.
그러므로, 본 발명은 하기 과정에 의해 수득가능한, 상기에 정의된, 가역적 산화환원 상태를 가지는, 두 개 이상의 Cys-아미노산을 함유하는, HCV 단백질, 또는 이의 임의의 기능적으로 동등한 부분에 관한 것이다:
(a) 시스테인 잔기가 화학적 및/또는 효소학적 수단에 의해 가역적으로 보호되는, HCV 단백질, 또는 이의 임의의 기능적으로 동등한 부분을 정제하는 것,
(b) 시스테인 잔기의 가역적으로 보호 상태의 제거,
(c) 시스테인 잔기가 가역적 산화환원 상태를 가지는, HCV 단백질, 또는 이의 임의의 기능적으로 동등한 부분을 수득하는 것.
그리하여, 본 발명은 또한 후자 과정에 관한 것이다.
선택적으로, 보조인자 및 항산화제가 단백질 안정화를 돕기 위해 첨가된다.
가역적 보호의 목적은 HCV 단백질을 안정화시키는 것으로 이해되어야 한다. 특히, 가역적으로 보호 후에 황-함유 작용기 (예를 들면 티올 및 디술피드)는 비반응성 조건으로 유지된다. 황-함유 작용기는 그리하여 다른 화합물과 반응할 수 없는데, 예를 들면, 하기와 같은 디술피드 결합을 형성하거나 교환하는 경향이 없다;
티올 및/또는 디술피드 잔기 사이의 기재된 반응은 분자간 과정에 제한되지 않고, 또한 분자내에서 일어날 수 있다.
본원에 기재된 용어 "가역적으로 보호"는 시스테인 잔기에 변형제의 공유적인 결합뿐만 아니라, 티올기의 산화환원 상태가 정제 절차의 이후 단계 내내 영향을 받지 않도록 (차폐), HCV 단백질의 환경을 다루는 것을 고려한다.
시스테인 잔기의 가역적 보호는 화학적으로 또는 효소학적으로 수행될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "효소학적 수단에 의한 가역적 보호"는 효소, 예를 들면 팔미토일 아실전달효소와 같은, 예를 들면 티오-에스테르화를 촉매하는데 관여하는 아실전달효소에 의해 매개되는 가역적 보호를 고려한다 (하기 및 Das 등, 1997 참조).
본원에 사용된 용어 "화학적 수단에 의한 가역적 보호"는 하기 가역적 보호를 고려한다:
(1) 예를 들면 술폰화 및 티오-에스테르화에 의한 것과 같은 시스테인을 가역적으로 변형시키는 변형제에 의해;
술폰화는 디술피드 브리지에 관여된 티올 또는 시스테인이 S-술포네이트로 변형되는 반응이다: RSH →RS-SO3 -(Andre Darbre) 또는 RS-SR →2 RS-SO3 -(술피톨분해; Kumar 등, 1986). 술폰화제는 예를 들면 Na2SO3, 또는 소듐 테트라티오네이트이다. 후자의 술폰화제는 10-200 mM, 더욱 바람직하게는 50-200 mM 의 농도로 사용된다. 선택적으로 술폰화는 예를 들면 Cu2+(100μM - 1mM) 또는 시스테인 (1 - 10mM)과 같은 촉매의 존재하에 수행될 수 있다.
반응은 단백질 변성뿐만 아니라 천연 조건하에 수행될 수 있다 (Kumar 등, 1985; Kumar 등, 1986).
티오에스테르 결합 형성, 또는 티오-에스테르화는 하기의 특징이 있다:
RSH + R'COX →RS-COR'
(식 중, 화합물 R'CO-X 에서 X는 바람직하게는 할로겐화물이다).
(2) 예를 들면, 중금속, 특히 Zn2+, Cd2+(Matts 등, 1991), 모노-, 디티오- 및 디술피드 화합물 (예를 들면, 아릴- 및 알킬메탄티오술포네이트, 디티오피리딘, 디티오모르폴린, 디히드로리포아미드, Ellmann 시약, aldrothiolTM(Aldrich) (Rein 등, 1996), 디티오카르바메이트), 또는 티올화제 (예를 들면, 글루타티온, N-아세틸 시스테인, 시스테인아민)와 같은, 본 발명의 시스테인을 가역적으로 변형시키는 변형제에 의해. 디티오카르바메이트는 이들에게 술프히드릴기와 반응하는 능력을 제공하는, R1R2NC(S)SR3작용기를 가지는 광대한 부류의 분자를 함유한다. 티올을 함유한 화합물은 바람직하게는 0.1-50 mM, 더욱 바람직하게는 1-50 mM, 더 더욱 바람직하게는 10-50 mM의 농도로 사용된다;
(3) 10μM-10 mM, 더욱 바람직하게는 1-10 mM의 농도 범위의 티올 상태를 보존하는 (안정화) 변형제, 특히 항산화제 예를 들면, DTT, 디히드로아스코르베이트, 비타민 및 유도체, 만니톨, 아미노산, 펩티드 및 유도체 (예를 들면, 히스티딘, 에르고티오네인, 카르노신, 메티오닌), 갈레이트(gallate), 히드록시아니솔, 히드록시톨루엔, 히드로퀴논, 히드록시메틸페놀 및 이들 유도체의 존재에 의해;
(4) 예를 들면, (i) 금속 이온 (Zn2+, Mg2+), ATP와 같은 보조인자, (ii) pH 조절 (예를 들면, 단백질에 대해 대개의 경우에 pH∼5이거나 pH는 바람직하게는 티올 pKa-2이고; 예를 들면 펩티드에 대해 pH∼2에서 역상 크로마토그래피에 의해 정제됨)과 같은, 티올 안정화 조건에 의해.
(1), (2), (3) 및 (4)에 기재된 가역적 보호의 조합은 유사하게 순수하고 재폴딩된 HCV 단백질을 초래할 수 있다. 실제로, 예를 들면, 바람직하게는 1-10 mM의 농도로 Z103 (Zn 카르노신)과 같은 조합 화합물이 사용될 수 있다.
가역적 보호는 또한 상기에 기재된 변형기 또는 차폐외에, 펩티드 골격을 파괴하지 않고, 효소학적으로 또는 화학적으로 가역적일 수 있는 임의의 시스테인 보호 방법을 말한다는 것을 명확히 해야 한다. 이 점에서, 본 발명은 구체적으로 고전적인 화학 합성 (상기 참조)에 의해 제조된 펩티드를 말한는데, 여기에서 예를 들면, 결합된 티오에스테르가 티오에스테라아제, 염기성 완충액 조건 (Beekman 등, 1997) 또는 히드록실아민 처리 (Vingerhoeds 등, 1996)에 의해 절단된다.
티올 함유 HCV 단백질은 예를 들면, (1) 디술피드 결합을 함유한 절단가능한 커넥터 팔 (예를 들면 고정된 5,5' 디티오비스(2-니트로벤조산)(Jayabaskaran 등, 1987) 및 활성화된 티올-Sepharose 4B (Pharmacia)상의 공유 크로마토그래피) 또는 (2) 고정된 리간드로서 아미노헥사노일-4-아미노페닐아르신을 포함한 친화성 크로마토그래피 수지상에서 정제될 수 있다. 후자 친화성 매트릭스는 산화환원 조절을 받는, 단백질 및 산화 스트레스의 표적인 디티올 단백질의 정제에 사용되어왔다 (Kalef 등, 1993).
가역적 보호는 또한 펩티드의 가용화 및 추출을 증가시키기 위해 사용될 수 있다 (Pomroy & Deber, 1998).
가역적 보호 및 티올 안정화 화합물은 단량체, 중합체 또는 리포좀 형태로 제공될 수 있다.
시스테인 잔기의 가역적으로 보호 상태의 제거는 예를 들면 하기에 의해 화학적으로 또는 효소학적으로 수행될 수 있다:
- 특히 1-200 mM, 더욱 바람직하게는 50-200 mM의 농도로, 환원제, 특히 DTT, DTE, 2-메르캅토에탄올, 디티오나이트, SnCl2, 소듐 보로히드리드, 히드록실아민, TCEP;
- 예를 들면 pH 증가에 의한 티올 안정화 조건 또는 제제의 제거;
- 특히, 0.01-5μM, 더 더욱 특히 0.1-5μM의 농도로, 효소, 특히 티오에스테라아제, 글루타레독신, 티오레독신;
- 상기 기재된 화학적 및/또는 효소학적 조건의 조합.
시스테인 잔기의 가역적으로 보호 상태의 제거는 시험관내 또는 생체내, 예를 들면, 세포내 또는 개인내에서 수행될 수 있다.
정제 절차의 제 2 국면 후에, 시스테인 잔기는 비가역적으로 봉쇄되거나 봉쇄되지 않을 수 있거나, 상기에 열거된, 임의의 가역적 변형제에 의해 대체될 수 있다는 것이 인지될 것이다.
본 발명에 따른 환원제는 시스테인 잔기의 황, 예를 들면, "S-S" 디술피드 브리지의 환원 및 시스테인 잔기를 탈술폰화 (RS-SO3 -→RSH)시키는 임의의 물질이다. 항산화제는 티올 상태를 보존하거나 "S-S" 형성 및/또는 교환을 최소화하는 임의의 물질이다. "S-S" 디술피드 브리지의 환원은 이에 의해 디술피드가 티올(-SH)로 환원되는 화학 반응이다. WO 96/04385에 개시된 디술피드 브리지 절단제 및 방법이 본 명세서에 참고로 포함된다. "S-S" 환원은 (1) 효소학적 단계 경로 또는 (2) 환원 화합물에 의해 수득될 수 있다. 티오레독신, 글루타레독신과 같은 효소는 디술피드의 생체내 환원에 관여한다고 공지되며, 또한 시험관내에서 "S-S" 브리지를 환원시키는데 효과적이라고 제시되었다. 디술피드 결합은 DTT를 이용한 반응에 대한 해당하는 속도 상수보다 약 104배 더 큰 명백한 2차 속도를 가진, pH 7.0에서 환원된 티오레독신에 의해 신속하게 절단된다. 환원 반응 속도는 1mM DTT 또는 디히드로리포아미드로써 단백질 용액을 미리 인큐베이션함으로써 극적으로 증가될 수 있다 (Holmgren, 1979).
단백질 디술피드 브리지를 환원시킬 수 있는 티올 화합물은 예를 들면 디티오트레이톨 (DTT), 디티오에리트리톨 (DTE), β-메르캅토에탄올, 티오카르바메이트, 비스(2-메르캅토에틸)술폰 및 N,N'-비스(메르캅토아세틸)히드라진, 및 소듐-디티오나이트이다.
단클론 항체의 디술피드 브리지의 환원에 매우 유용하다고 보여진 (Thakur등, 1991), 아스코르베이트 또는 염화주석 (SnCl2)과 같은 티올기가 없는 환원제기 또한 HCV 단백질의 환원에 사용될 수 있다. 게다가, pH 값의 변화는 HCV 단백질의 산화환원 상태에 영향을 줄 수 있다. 소듐 보로히드리드 처리는 펩티드의 디술피드 브리지의 환원에 효과적이라고 보여져 왔다 (Gailit, 1993). 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP)은 낮은 pH에서 디술피드를 환원시킬 수 있다 (Burns 등, 1991). 셀레놀은 DTT 또는 소듐 보로히드리드가 환원제로서 사용될 때 디술피드의 티올로의 환원을 촉매한다. 시판되는 디셀레나이드인 셀레노시스테아민이 촉매의 전구체로서 사용되었다 (Singh 및 Kats, 1995).
상기에 인용된 문헌의 모든 정의를 포함한, 전체 내용이 본 출원에서 참고로 포함된다는 것을 다시 강조한다. 그리하여, HCV 단백질의 산화환원 상태를 변형시키는 상기 언급한 방법 및 화합물은 모두 본 발명에서 고려된다.
생활성 자리
본 발명은 추가로 생물학적으로 활성인 CXXC 모티프를 함유한 HCV 단백질에 관한 것이다. 본원에 사용된 용어 "생물학적으로 활성인" 및 "산화환원효소 활성"은 다양한 세포내 및 세포외 생화학적 및 생물학적 기능, 예를 들면, 티올/디술피드 교환 반응, 전이 금속의 결합, 지질 혼입, 및 조절 활성 (예를 들면, 유전자 전사의 조절, 시토카인 등으로서 기능하는 것을 포함한, 신호전달의 조절 및 단백질의 (탈)티올화 상태의 조절)을 매개하는 능력을 가지며, 가역적 산화환원 상태를 가진, HCV 펩티드내의 CXXC 자리, 또는 이의 기능적으로 동등한 부분을 고려한다.
시스테인 산화환원 상태에 의해 초래되는 구조적 또는 입체형태적 변화는 항원결정부의 출현 또는 사라짐에 기초한, 생물리학적 방법, 예를 들면 분광 광도법 (흡광도, 원편광 이색성, 적외선, 형광, NMR) 또는 면역화학적 방법 (예를 들면, ELISA, EIA 등)로써 계속될 수 있다. 항원결정부에 관여된 서열은 복합체의 가교 및 친화성 정제 후에 질량 분광학 (MS) 및 서열 결정에 의해 확인될 수 있다. 입체형태적 또는 신규 검출가능한 선형 항원결정부는 삼차 또는 사차 구조 수준에서 폴딩 과정으로부터 생길 수 있다.
활성 자리에 금속 이온 혼입은 방사성 분해 측정 또는 원자 흡수 분광학에 의해 측정될 수 있다.
본 발명의 HCV 단백질의 다른 분자, 예를 들면, 수용체, 탄수화물, 지질, 핵산 (또한 상기 참조)에의 결합은 예를 들면, FACS, Biacore, 면역학적 분석 (웨스턴 블롯팅, EIA, ELISA 등), 가교 및 크로마토그래피 방법 (예를 들면 친화성 크로마토그래피, 겔 여과)에 의해 연구될 수 있다.
HCV 단백질의 티오레독신 효소 활성은 Holmgren 등 (1979)에 의해 기재된 방법에 따라 디술피드 브리지를 환원시키는 전위를 연구함으로써 확인될 수 있다. DTT 또는 디히드로리포아미드와 같은, 보조인자의 효과가 또한 상기 방법에서 확인될 수 있다. 비단백질성 화합물 (예를 들면, Ellmann 시약, 알드로티올)뿐만 아니라 단백질 (예를 들면, 응집된 인슐린)이 기질로서 취해질 수 있다.
혼합된 디술피드의 형성 (하기 참조)은 단백질 폴딩 및 활성 자리의 회복과 관련된 활성이다. 혼합된 디술피드의 형성은 "정제 절차"에 기재된 것과 같은,상이한 물질 (예를 들면, DTT)로써 환원제 처리, 이은 질량 분광학 분석 전 및 후에 티올기의 가역적 보호 또는 비가역적 봉쇄에 의해 증명될 수 있다.
-CXXC- 함유 단백질에서 티올기의 pKa는 pH의 함수(적정)로 알킬화제로써 처리에 의해 정의된다. 잔기의 시차 보호 및/또는 봉쇄 및 MS는 CXXC 자리에서 시스테인 잔기로 시작하는 반응의 정보를 제공한다.
아미노 말단 아미노산 서열 결정은 HCV 단백질의 가공, 절단 산물 및 도메인 구조에 관한 정보를 제공할 수 있다.
상기 절단 산물의 조직 및 세포내 분포는 면역 조직화학적 방법에 의해 배치된다.
백신
본 발명은 또한 상기에 정의된 단백질을 함유한 조성물에 관한 것이다. 더욱 특히 본 발명은 백신 조성물에 관한 것이다. 용어 "백신 조성물"은 부분적으로 또는 완전하게, HCV에 대해 보호를 유도할 수 있는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 그러므로, 그것은 상기에 정의된, HCV 펩티드, 단백질, 폴리뉴클레오티드, HCV 유래 분자 또는 HCV 유래 입자를 포함한다. HCV에 대한 보호는 특히 인간을 말하나, 또한 비인간 영장류, 트리메라 마우스 (Zauberman 등, 1999), 또는 다른 포유동물을 말한다.
본 발명의 단백질은 바이오티닐화 형태 (WO 93/18054에서 설명된 바와 같이) 및/또는 뉴트라라이트 아비딘 (Neutralite Avidin)에 복합체 (Molecular Probes Inc., Eugene, OR, USA)로서 사용될 수 있다. "백신 조성물"은 활성 물질외에,홀로, 조성물을 수용하는 개인에게 해로운 항체의 생산을 유도하지 않고, 보호를 유도하지도 않는, 적당한 부형제, 희석제, 담체 및/또는 보조제를 함유한다는 것이 또한 주목되어야 한다. 적당한 담체는 전형적으로 단백질, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체 아미노산, 아미노산 공중합체 및 불활성 바이러스 입자와 같은 크고, 천천히 대사되는 거대분자이다. 그러한 담체는 당업자에게 주지되어 있다. 조성물의 효율성을 증가시키는 바람직한 보조제는 이에 제한되지 않고, 하기를 포함한다: 콜로이드성 수산화철 (Leibl 등, 1999), 수산화알루미늄, WO 93/19780에 기재된 3-O-탈아실화 모노포스포릴 지질 A와 조합된 알루미늄, WO 93/24148에 기재된 알루미늄 포스페이트, 미국 특허 제 4,606,918호에 기재된 N-아세틸-무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민, N-아세틸-노르무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민, N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타밀-L-알라닌2-(1'2'디팔미토일-sn-글리세로-3-히드록시-포스포릴옥시)에틸아민 및 2% 스쿠알렌/트윈 80 에멀션중에 모노포스포릴 지질 A, 탈독성화된 내독소, 트리할로오스-6,6-디마이콜레이트, 및 세포벽 골격 (MPL + TDM + CWS)을 함유한 RIBI (ImmunoChem Research Inc., Hamilton, MT, USA). 임의의 세 개의 성분 MPL, TDM 또는 CWS는 단독으로 또는 2X2로 조합될 수 있다. 부가적으로, Stimulon (Cambridge Bioscience, Worcester, MA, USA) 또는 SAF-1 (Syntex)와 같은 보조제뿐만 아니라, QS21 및 3-디(de)-O-아세틸화 모노포스포릴 지질 A 사이의 조합물 (WO94/00153), 또는 MF-59 (Chiron), 또는 폴리[디(카르복실아토페녹시)포스파젠] 기재 보조제 (Virus Research Institute), 또는 Optivax (Vaxcel, Cythx)와 같은 블록공중합체 기재 보조제 또는 알가물린 (Algammulin) 및 감마이눌린 (Gammainulin) (Anutech)와 같은 이눌린 기재 보조제, 불완전 프로인드 (Freund's) 보조제 (IFA) 또는 Gerbu 제제 (Gerbu Biotechnik)가 사용될 수 있다. 완전 프로인드 보조제 (CFA)가 비인간 적용 및 연구 목적에도 사용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. "백신 조성물"은 추가로 물, 염수, 글리세롤, 에탄올, 습윤제 또는 에멀션화제, pH 완충액 물질, 보존제 등과 같은, 본질적으로 비독성이고 비치료용인 부형제 및 희석제를 함유할 것이다.
본 발명의 HCV 펩티드의 시스테인 잔기의 가역적 변형은 상기 HCV 펩티드가 예를 들면, 중합체 또는 리포좀과 같은, 화학적으로 활성화된 담체 분자에 공유적으로 결합될 수 있거나 HCV 펩티드 자체가 다른 HCV 관련 또는 HCV 무관한 면역원성 단백질 (혼합 백신)에 결합하는 담체로서 기능하도록 허용한다. 티오에스테르에 의해 리포좀에 연결된 HCV 펩티드는 결합이 숙주 티오에스테라아제에 의해 생체내에서 절단되어, 느린 항원 방출 및 표시를 초래한다는 이점을 가진다. 중합체 또는 리포좀에 HCV 펩티드의 혼입 또는 결합은 또한 리간드 사이의 친화성을 이용한, 비공유 상호작용에 기초할 수 있다.
전형적으로, 백신 조성물은 주사가능한 액체 용액 또는 현탁액으로서 제조된다. 주사 전에 액체 운반체상의 용액, 또는 액체 운반체 중의 현탁액에 적합한, 고형이 또한 제조될 수 있다. 제제는 또한 보조제 효과를 증진시키기 위해 리포좀내에 에멀션화되거나 캡슐화될 수 있다. 폴리펩티드는 또한 사포닌과의 면역 자극 복합체, 예를 들면 Quil A (ISCOMS)내로 혼입될 수 있다. 백신 조성물은 면역학적 유효량의 본 발명의 폴리펩티드뿐만 아니라, 상기 언급한 성분의 임의의 다른 것을 함유한다. "면역학적 유효량"은 개인에게 단일 투여 또는 일련의 일부로서 상기 양의 투여가 예방 또는 치료에 효과적인 것을 의미한다. 상기 양은 치료될 개인의 건강 및 신체적 조건, 치료될 개인의 분류군 (예를 들면, 인간, 비인간 영장류, 영장류 등), 효과적인 면역 반응을 증가시킬 개인의 면역 시스템의 능력, 목적 보호 정도, 백신의 제형, 치료의의 평가, HCV 감염 계통 및 다른 관련 인자에 의존하여 다양하다. 상기 양이 일상적인 시도를 통해 결정될 수 있는 비교적 폭넓은 범위에 해당할 것으로 기대된다. 통상, 양은 0.01 내지 1000 ㎍/1회분, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 100 ㎍/1회분으로 다양할 것이다. 백신 조성물은 통상적으로 비경구적으로, 전형적으로 주사, 예를 들면, 피하 또는 근육내로 투여된다. 다른 투여 방법에 적합한 부가적인 제형물은 경구 제형물 및 좌약을 포함한다. 투약 치료는 단일 투여 계획 또는 복수 투여 계획일 수 있다. 백신은 다른 면역조절제와 함께 투여될 수 있다.
DNA 백신
숙주의 세포내 환경은 본 발명의 HCV 단백질의 가역적 산화환원 상태의 기초를 제공할 수 있다. 이에 대해, HCV DNA 백신 조성물은 전사 조절 원소에 작동가능하게 연결된, 상기에 기재된 HCV 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유한 플라스미드 벡터를 함유한다는 것을 명백히 해야 한다. 본원에 사용된 "플라스미드 벡터"는 연결된 또다른 핵산을 이동시킬 수 있는 핵산 분자를 말한다. 바람직한 벡터는 연결된 핵산의 자율 복제 및/또는 발현을 할 수 있는 것이다.일반적으로, 이에 제한되지 않고, 플라스미드 벡터는 이들 벡터 형태로는, 염색체에 결합하지 않는 원형 이중가닥 DNA 루프이다. 본원에 사용된 "폴리뉴클레오티드 서열"은 데옥시리보핵산 (DNA) 및 적당한 경우에, 리보핵산 (RNA)과 같은 폴리뉴클레오티드를 말한다. 용어는 또한 동등한 것으로서, 뉴클레오티드 유사체로부터 제조된 RNA 또는 DNA의 유사체 및 단일 (센스 또는 안티센스) 및 이중가닥 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에 사용된 용어 "전사 조절 원소"는 살아 있는 척추동물내로 도입시 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 번역 산물을 생산하도록 세포 기구를 이끌 수 있도록 하는, 본질적인 조절 원소를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 말한다. 용어 "작동가능하게 연결된"은 성분이 이들 통상적인 기능을 수행하기 위해 배치되는 병렬을 말한다. 그리하여, 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 전사조절 원소는 상기 뉴클레오티드 서열의 발현을 초래할 수 있다. 당업자는 상이한 전사 프로모터, 종결자, 운반체 벡터 또는 특정 유전자 서열이 성공적으로 사용될 수 있다는 것을 인식할 수 있다.
본 발명은 그리하여 또한 HCV 에 대한 면역을 예방적으로 유도하기 위해 본원에 정의된 HCV 단백질의 용도에 관한 것이다 (예방적 백신). 백신은 또한 그 경우에 "치료용 백신"이라 불리는, 상기에 지적된 개인의 치료에 유용할 수 있다는 것이 주목되어야 한다.
본 발명은 또한 HCV 백신 조성물의 제조를 위해 상기에 정의된 단백질 또는 상기에 정의된 조성물의 용도에 관한 것이라는 것은 상기로부터 명백하다. 특히, 본 발명은 만성 HCV 보균자에서 HCV 에 대한 면역을 유도하기 위해 본원에 정의된 단백질의 용도에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 예를 들면, HCV 를 치료하는 작은 약물, 예를 들면, 리바비린의 투여와 조합하여 또는 조합하지 않고 주지의 인터페론 치료와 같은, 임의의 다른 치료 전, 치료와 동시에 또는 치료후에 만성 HCV 보균자에서 HCV 에 대한 면역을 유도하기 위해 본원에 정의된 단백질의 용도에 관한 것이다. 그러한 조성물은 또한 간 이식 전 또는 후, 또는 예상된 감염, 예를 들면, 바늘 상처후에 사용될 수 있다. 게다가, 본 발명은 생물학적 시료에 존재하는 HCV 항체를 검출하기 위해 본 발명의 HCV 단백질을 포함한 키트에 관한 것이다.
본원에 사용된 용어 "생물학적 시료"는 이에 제한되지 않고, 예를 들면, 혈청, 혈장, 림프액, 피부의 외부 절단면, 호흡기, 내장, 비뇨생식기로, 난모세포, 눈물, 타액, 우유, 혈액세포, 종양, 기관, 위분비액, 점액, 척수액, 예를 들면, 배설물, 뇨, 정자 등과 같은 외부 분비액을 포함한, 개인으로부터 분리된 조직 또는 액체 시료를 말한다.
본 발명의 HCV 단백질은 매우 면역원성이고, 체액성 및 세포성 면역 반응 모두를 자극하기 때문에, 본 발명은 또한 본 발명의 HCV 단백질을 포함한, HCV 관련된 T 세포 반응을 검출하기 위한 키트에 관한 것이다. HCV T 세포 반응은 예를 들면 PCT/EP 94/03555 (Leroux-Roels 등에게 허여)에 기재된 바와 같이 측정될 수 있다. 상기 문헌의 모든 정의를 포함한, 전체 내용이 본 출원에서 참고로 포함된다는 것이 강조되어야 한다.
본 발명은 또한 HCV 핵심, E1, E2, P7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A 및/또는 NS5B 단백질, 또는 이의 부분을 또한 함유하는 상기에 정의된 조성물에 관한 것이다. E1, E2 및/또는 E1E2 입자는 예를 들면, T 세포 자극 항원, 예를 들면, 핵심, P7, NS3, NS4A, NS4B, NS5A 및/또는 NS5B와 조합될 수 있다.
더욱이, 본 발명은 또한 HCV 단백질에 대한 항체를 검출하기 위해 상기에 기재된 단백질, 또는 상기에 기재된 조성물의 용도를 특징으로 한다. 본원에 사용된, 용어 "검출하기 위해"는 검출에 적합한 당업계에 공지된 임의의 분석을 말한다. 특히, 용어는 WO 96/13590에 기재된 임의의 면역학적 분석을 말한다.
약물 스크리닝
본 발명은 HCV 감염의 특징이 있는 (또는 연관된) 병을 치료하기 위해 사용될 수 있는 화합물 또는 물질을 확인하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 또한 본원에 "약물 스크리닝 분석" 또는 "생물학적 분석"으로서 언급되고, 전형적으로 HCV 단백질과 표적 분자의 상호작용을 조절, 및/또는 HCV 핵산 발현 및/또는 HCV 단백질 활성을 조절하기 위해 HCV 단백질과 상호작용하는 (예를 들면, 결합하는) 능력에 대해 후보/시험 화합물 또는 물질을 스크리닝하는 단계를 포함한다. 이들 능력의 하나 이상을 가진 후보/시험 화합물 또는 물질이 HCV 감염, HCV 핵산 발현 및/또는 HCV 단백질 활성의 특징이 있는 병을 치료하기 위한 약물로서 사용될 수 있다. 작은 분자, 예를 들면, 작은 유기 분자, 및 다른 약물 후보와 같은 후보/시험 화합물이 예를 들면, 조합 및 천연 산물 라이브러리로부터 수득될 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 HCV 단백질, 또는 이의 임의의 기능적으로 동등한 부분과 상호작용하는 (예를 들면, 결합하는) 후보/시험 화합물을 스크리닝하는 분석을 제공한다. 전형적으로, 분석은 예를 들면, 복합체를 형성하기 위해 HCV 단백질 또는 이의 부분과 후보/시험 화합물의 상호작용 (예를 들면, 결합)을 허용하는 조건하에, 본 발명의 HCV 단백질, 이의 촉매활성, 즉 산화환원효소 활성, 또는 이의 면역원성 절편, 및 후보/시험 화합물을 조합하는 단계, 및 HCV 단백질 또는 이의 부분과 상호작용하는 (예를 들면, 결합하는) 후보 화합물의 능력이 상기 복합체내의 후보 화합물의 존재에 의해 나타나는, 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함하는 무세포 분석이다. HCV 단백질 및 후보 화합물 사이의 복합체의 형성은 예를 들면, 표준 면역학적 분석을 사용하여, 정량화될 수 있다.
그러한 시험에서 사용된 HCV 단백질, 이의 촉매 또는 이의 면역원성 절편 또는 올리고펩티드는 용액내에서 자유롭거나, 고체 지지체에 고정될 수 있거나, 세포 표면상에 있을 수 있거나, 세포내 위치할 수 있다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 HCV 단백질 및 HCV 단백질이 정상적으로 상호작용하는 분자 (표적 분자), 또는 HCV 단백질을 특이적으로 인지하는 항체 사이의 상호작용 (및 또한 가장 그럴듯한 HCV 단백질 활성)을 조절하는 (예를 들면, 자극 또는 저해하는) 후보/시험 화합물을 확인하기 위한 스크리닝 분석을 제공한다. 그러한 표적 분자의 예는 HCV 단백질과 동일한 신호 경로의 단백질, 예를 들면, HCV 단백질 신호 경로의 상류 (활성의 자극제 및 저해제 양자를 포함) 또는 하류에서 기능할 수 있는 단백질 [Zn-핑거, 프로테아제 활성, 시스테인 산화환원 상태의조절자]을 포함한다.
전형적으로, 분석은 예를 들면, 후보 화합물이 없었더라면, HCV 단백질 또는 이의 생물학적으로 활성인 부분이 표적 분자 또는 항체와 상호작용하는 (예를 들면, 결합하는) 조건하에, 본 발명의 HCV 단백질, 이의 촉매활성 또는 이의 면역원성 절편, HCV 단백질 표적 분자 (예를 들면, HCV 단백질 리간드) 또는 특정 항체 및 후보/시험 화합물을 조합하는 단계, 및 HCV 단백질 및 표적 분자 또는 항체를 포함하는 복합체의 형성을 검출하는 단계, 또는 HCV 단백질 및 표적 분자 또는 항체의 상호작용/반응을 검출하는 단계를 포함하는 무세포 분석이다.
복합체 형성의 검출은 예를 들면, HCV 단백질의 유도 효과를 측정함으로써 복합체의 직접적인 정량화를 포함할 수 있다. (후보 화합물의 부재하에 검출된 것에 상대적으로) 후보 화합물의 존재하에 HCV 단백질 및 표적 분자의 상호작용에서 (예를 들면, HCV 단백질 및 표적 분자사이의 복합체의 형성에서), 감소와 같은 통계학적으로 현저한 변화는 HCV 단백질 및 표적 분자사이의 상호작용의 조절 (예를 들면, 자극 또는 저해)의 표시이다. HCV 단백질 및 표적 분자 사이의 복합체의 형성의 조절은 예를 들면, 면역학적 분석을 사용하여, 정량화될 수 있다.
그러므로, 본 발명은 결합 파트너중의 하나 이상이 상기에 정의된 HCV 단백질인, 복합체내의 결합 파트너사이의 상호작용을 조절하는 화합물을 확인하는 방법, 및 하기를 포함하는 상기 방법을 고려한다:
(a) 복합체내의 상호작용을 조절하는데 충분한 시간 동안 시험 화합물과 복합체를 접촉시키는 것; 및 그 후에
(b) 상호작용에서 변화가 검출된다면, 상호작용을 조절하는 화합물이 확인되도록 하기 위해, 상호작용에서의 변화에 대해 상기 복합체를 모니터링하는 것.
특히, 본 발명은 결합 파트너 중의 하나 이상이 하기의 군으로부터 선택되는 후자 방법을 고려한다:
(i) HCV 유래 분자, 예를 들면 핵산 (프로모터 또는 인핸서)(HCV 입자내에 포장된 HCV RNA) 또는 단백질 (구조적 또는 비구조적 단백질)
(ii) 세포내, 숙주 유래 분자 (HCV 펩티드의 산화환원 상태의 변형제, (TRX, GRX, 티오에스테라아제 등))
(iii) 세포외 숙주 유래 분자 (수용체, 글루코사민, 헤파린).
본원에 기재된 임의의 방법에 의해 확인될 경우에 복합체내의 결합 파트너사이의 상호작용에 대한 조절제가 본 발명에 고려된다는 것이 명백해야 한다.
상기 기재된 약물 스크리닝 분석을 수행하기 위해, 단백질의 하나 또는 양자의 비복합체 형태로부터 복합체의 분리를 용이하게 하기 위할 뿐만 아니라, 분석의 자동화를 수용하기 위해 HCV 단백질 또는 이의 표적 분자를 고정시키는 것은 그럴 듯하다. 후보 화합물의 존재 및 부재하에, HCV 단백질의 표적 분자와의 상호작용 (예를 들면, 결합)은 반응물을 함유하기에 적합한 임의의 용기내에서 수행될 수 있다. 그러한 용기의 예는 마이크로타이터(microtitre) 플레이트, 시험관, 및 미세원심분리관을 포함한다. 하나의 구현예에서, 단백질이 매트릭스에 결합하도록 허용하는 도메인을 첨가하는 융합 단백질이 제공될 수 있다. 예를 들면, HCV 단백질-His 태깅은 Ni-NTA 마이크로타이터 플레이트에 흡착될 수 있거나(Paborsky 등, 1996), HCV 단백질-ProtA 융합은 IgG에 흡착될 수 있고, 이는 이어서 세포 용해액 (예를 들면, (35)S-표지된) 및 후보 화합물과 조합되고, 혼합물은 복합체 형성에 이로운 조건하에 (예를 들면, 염 및 pH에 대한 생리적 조건에서) 인큐베이션한다. 인큐베이션에 이어, 플레이트를 세척하여 임의의 결합되지 않은 표지를 제거하고, 매트릭스를 고정시키고 방사성 표지를 직접, 또는 복합체를 해리시킨 후 현탁액내에서 측정한다. 대안적으로, 복합체는 매트릭스로부터 해리되어, SDS-PAGE에 의해 분리될 수 있고, 구슬 분획내에 발견된 HCV 단백질-결합 단백질의 수준을 표준 전기영동 기술을 사용하여 겔로부터 정량화할 수 있다.
매트릭스 상의 단백질을 고정시키는 다른 기술은 또한 본 발명의 약물 스크리닝 분석에서 사용될 수 있다. 예를 들면, HCV 단백질 또는 이의 표적 분자는 바이오틴 및 스트렙트아비딘의 접합을 사용하여 고정될 수 있다. 바이오틴화된 HCV 단백질 분자는 당업계에 주지된 기술 (예를 들면, 바이오틴화 키트, Pierce Chemicals, Rockford, III)을 사용하여 바이오틴-NHS (N-히드록시-숙신이미드)로부터 제조될 수 있고, 스트렙트아비딘 코팅된 96 웰 플레이트 (Pierce Chemical)의 웰에 고정될 수 있다. 대안적으로, HCV 단백질에 반응성이나 이의 표적 분자에 단백질의 결합을 방해하지 않는 항체가 플레이트의 웰에 유도화될 수 있고, HCV 단백질은 항체 접합에 의해 웰내에 포획될 수 있다. 상기에 기재된 바와 같이, HCV 단백질-결합 단백질 및 후보 화합물의 제제를 플레이트의 HCV 단백질-제공하는 웰에서 인큐베이션하고, 웰내에 포획된 복합체의 양을 정량할 수 있다. GST-고정 복합체에 대해 상기에 기재된 것에다가, 그러한 복합체를 검출하는 방법은 HCV 단백질 표적 분자, 또는 HCV 단백질과 반응성이고, 표적 분자와 경쟁하는 항체를 사용하여 복합체의 면역학적 검출을 포함할뿐만 아니라; 표적 분자와 연관된 효소 활성의 검출에 의존하는 효소-연결된 분석을 포함한다.
HCV 단백질에 적당한 결합 친화성을 가진 화합물의 고처리량 스크리닝을 제공하는 약물 스크리닝에 대한 또다른 기술이 ["Determination of Amino Acid Sequence Antigenicity", Geysen HN, WO 출원번호 84/03564, 1984.09.13 공개]에 상세히 기재되고, 본원에 참고로 포함된다. 요약하면, 다수의 상이한 작은 펩티드 시험 화합물이 플라스틱 핀 또는 일부 다른 표면과 같은, 고체 지지체상에서 합성된다. 단백질 시험 화합물을 HCV 단백질의 절편과 반응시키고 세척한다. 결합된 HCV 단백질을 이어서 당업계에 주지된 방법에 의해 검출한다. 정제된 HCV 단백질은 또한 전술한 약물 스크리닝 기술에 사용하기 위해 플레이트상에 직접 코팅할 수 있다. 대안적으로, 비중화 항체가 펩티드를 포획하고 고체 지지체상에 펩티드를 고정하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 HCV 단백질을 특이적으로 결합할 수 있는 중화 항체가 HCV 단백질을 결합하는 시험 화합물과 경쟁하는 경쟁적 약물 스크리닝 분석의 용도를 고려한다. 이 방식으로, 항체는 HCV 단백질과 하나 이상의 항원 결정부를 공유하는 임의의 단백질의 존재를 검출하기 위해 사용될 수 있다.
여전히 또다른 구현예에서, 본 발명은 HCV 감염, HCV 핵산 발현 또는 HCV 단백질 활성의 특징이 있는 (또는 연관된) 병의 치료에 사용할 수 있는 화합물을 확인하는 방법 (예를 들면, 스크리닝 분석)을 제공한다. 상기 방법은 전형적으로 HCV 핵산의 발현 또는 HCV 단백질의 활성을 조절하는 화합물 또는 물질의 능력을 분석하고, 이에 의해 HCV 감염, HCV 핵산 발현 또는 HCV 단백질 활성의 특징이 있는 병을 치료하는 화합물을 확인하는 단계를 포함한다.
상기 약물 스크리닝 분석에 따라 확인된 HCV 감염, HCV 단백질 활성 및/또는 HCV 핵산 발현의 조절제가 예를 들면, HCV 감염 또는 HCV 감염과 관련된 병을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
상기 치료 방법은 예를 들면, 상기에 기재된 약제학적 조성물로, HCV 단백질 활성 및/또는 HCV 핵산 발현의 조절제를 그러한 치료가 필요한 대상, 예를 들면, HCV 감염된 대상에 투여하는 단계를 포함한다. 약물의 조직 또는 세포 특이성은 약물 표적 방법 (Davis, 1997 참조) 또는 세포내 면역화를 사용함으로써 증진될 수 있다. 간 표적 도구는 예를 들면 빌리루빈 커플링된 약물 (Kramer 등, 1992), 약물의 아시알로당단백질 수용체 또는 지단백질 매개 전달이다 (Vingerhoeds 등, 1996). 약물은 세포 소기관 특정 표적 태그를 통해 DNA 발현된 분자의 세포 소기관 표적으로써 세포내로 표적화될 수도 있다 (Persic 등, 1997).
HCV 감염, HCV 핵산 발현 또는 HCV 단백질 활성을 조절하는 화합물 또는 물질의 능력을 분석하는 방법은 전형적으로 세포 기재 분석이다. 그러나, HCV 감염된 동물은 또한 본원에서 고려된다. 예를 들면, 환원제 또는 산화제에 민감하거나, HCV 단백질이 관여한 경로를 통해 신호를 변환하는 HCV 감염된 또는 트랜스펙션된 세포는 후보 화합물의 존재 및 부재하에 HCV 단백질을 과발현하기 위해 유도될 수 있다.
HCV 단백질 의존성 반응 (자극 또는 저해)에서 통계학적으로 현저한 변화를 생산하는 후보 화합물이 확인될 수 있다.
하나의 구현예에서, HCV 에 의한 표적 세포의 감염, HCV 핵산의 발현 또는 HCV 단백질의 산화환원효소 활성이 세포내에서 조절되고, 후보 화합물의 관심 있는 (감염속도, 세포 증식 또는 분화, 또는 산화환원효소 활성과 같은)정보에의 효과가 측정된다. 예를 들면, 티올화 형태에서 S-접합된 형태, 즉 S-S 브리지 형태로의 전이 속도가 분석될 수 있다. 예를 들면, HCV 단백질-의존성 신호 캐스케이드에 반응하여 상류 또는 하류 조절된 유전자의 발현이 분석될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 그러한 유전자의 조절 부위, 예를 들면, 5' 측면 프로모터 및 인핸서 부위가 쉽게 검출될 수 있는 유전자 산물을 코딩하는 검출가능한 마커 (루시페라아제)에 작동가능하게 연결된다. HCV 단백질 또는 HCV 단백질 표적 분자의 인산화는 또한 예를 들면, 면역블롯팅에 의해 측정될 수 있다.
그러므로, 본 발명은 상기에 정의된 HCV 단백질의 산화환원효소 활성을 조절하는 화합물을 확인하는 생물학적 분석에 관한 것으로, 상기 생물학적 분석은 하기를 함유한다:
(a) 상기 단백질의 산화환원효소 활성을 조절하는 능력이 측정될 하나 이상의 화합물에 상기 정의된 HCV 단백질, 또는 이의 임의의 기능적으로 동등한 부분을 발현한 세포를 노출시키는 것; 및 그 후에
(b) 산화환원효소 활성의 변화에 대해 상기 단백질을 모니터링하는 것.
가역적으로 보호된 HCV 펩티드는 예를 들면, 올리고머화 상태로 (1) 화학적 다중항원 제제 (E1s 커플링된 항원이 반드시 HCV 관련되지는 않아서 복수 질병 스크리닝에 사용될 수 있다); 고정화 및 면역학적 검출 (예를 들면, 바이오틴화, 형광)에 대한 표적 또는 (3) 차례로 초분자 항체 (예를 들면, 바이러스 유사 입자상의 항체)를 초래할 수 있는, 항체 접합에 대해 진단용 커플링 목적으로 사용될 수 있다. 표지 및 항체 접합은 단백질의 올리고머화에 의한 증폭 단계로 인한 민감도의 증가를 초래한다.
펩티드상의 임의의 반응기 (당,아미노, 카르복실, 티올, 히스티딘 등)가 커플링 또는 접합을 위해 이용될 수 있다는 것이 언급되어야 한다. 가역적으로 보호된 기는 반응의 특이성을 증가시키기 위해 사용될 수 있고, 티올 반응성은 탈보호후에 접합의 이후 단계/상에서 이용될 수 있다.
결국, 본 발명은 HCV 항체를 검출하는 면역학적 분석에 관한 것으로, 상기 면역학적 분석은 하기를 포함한다: (1) 상기에 정의된 정제된 HCV 단백질, 또는 이의 기능적으로 동등한 부분을 제공하는 것, (2) 항체-항원 복합체의 형성을 허용하는 조건하에 상기 HCV 단백질과 생물학적 시료를 인큐베이션하는 것, (3) 상기 HCV 단백질을 함유한 상기 항체-항원 복합체가 형성되는 지를 결정하는 것.
본 발명은 지금 특히 유리한 구현예를 설명한 하기 실시예를 참고로 설명될 것이다. 그러나, 상기 구현예는 단지 예증이지 어떠한 식으로든 본 발명을 제한하는 것으로 해석될 수 없다는 것을 주목해야 한다.
실시예 1: 우두 발현된 E1s에서 티올-디술피드 상태의 결정
HCV E1s 단백질 (아미노산 192-326)을 티올기의 봉쇄를 각각 용해 동안 및 DTT로써 환원후에, 요오도아세트아미드 및 N-에틸말레이미드 (NEM)로써 수행한 것을 제외하고는, Maertens 등 (PCT/EP 95/03031)에 기재된 절차에 따라 재조합 우두 바이러스 pv-HCV11A를 사용하여 발현시키고, 베로 세포로부터 정제하였다. 그리하여, 용해 완충액 중의 IAA (요오도아세트아미드)로써 자유 티올의 봉쇄, 및 DTT로써 환원 단계 후에 NEM 으로써 알킬화.
정제된 E1s를 한외여과 (Centricon 10, Millipore)에 의해 농축하고, 제조자에 의해 기재된 바와 같이 N-글리코시다아제 F (PGNase F; Boehringer Mannheim)로써 탈당한 후, Els를 15% 폴리아크릴아미드 미니겔상에 적재하였다. SDS-PAGE를 Laemmli에 기재된 바와 같이 수행하였다. 단백질 밴드를 크기 분리 및 염색 후에 약 18 킬로달톤에서 절단하였다.
단백질을 제자리에서 트립신분해에 의해 절단하고, 생성된 펩티드 절편을 상이한 시스테인 잔기의 유도화 상태를 결정하기 위해 질량 분광학 (MS; MALDI-TOFF)에 의해 분석하였다.
MS 결과는 CXXC-모티프내의 시스테인에 대해 보여준다:
(1) CXXC-모티프의 약 10%에서, 양자 시스테인은 IAA 유도화된 산물로서 존재했고;
(2) CXXC-모티프의 약 30%에서, 하나의 시스테인이 IAA로써 봉쇄되고, 다른시스테인은 NEM-유도화된 산물로서 존재했고;
(3) CXXC-모티프의 약 60%에서, 양자 시스테인은 NEM-유도화된 산물로서 회수되었다.
상기 데이타는 놀랍게도 하기를 보여준다:
(1) 시스테인 두 개가 충분히 환원된 ("티올") 상태로서 존재했고;
(2) 시스테인 중의 하나가 혼합 디술피드 브리지에 관여했고, 두 번째 시스테인은 자유 티올 (중간체 형태)로서 존재했고;
(3) 양자의 시스테인이 산화된 형태 (디술피드 브리지)로 존재했다.
실험을 즉, 감염성 병원균으로부터 유래된, HCV 펩티드로써 수행하지만, 상기 세 가지 형태는 TRX 슈퍼패밀리내의 -CXXC-모티프에 대해 기재된 상이한 산화 상태와 잘 연관되고, 티올 산화환원효소, 즉 세포내의 산화환원 환경을 조절하는데 관련된 분자에 대해 기재된 활성 패턴과 일치한다 (Rietsch & Beckwith, 1998; Loferer & Hennecke, 1994; Aslund & Beckwith, 1999; Huppa & Ploegh, 1999).
티오레독신 활성 자리의 시스테인이 산화되고, 기질내의 디술피드 브리지가 환원되기 때문에, 과량의 산화 형태 (60%)가 티오레독신 활성과 일치한다. 놀랍게도, 상기 결과는 E1s가 (자가)폴딩 기작에 관련되고, 활성 자리의 환원 형태로의 재생을 위해 세포내 산화 상태에 의존하는 것을 나타내는 경향이 있다. 그러므로, E1s, 우두 및 숙주 단백질로 구성된 -S-S- 단백질 기재 집합물이 단백질 폴딩의 수준에서 방해하거나 시스테인의 세포내 산화환원 상태를 방해하는/영향을 주는 배양 배지내의 화합물의 첨가에 의해 감소될 수 있다.
실시예 2: 시스테인의 가역적 변형후에 효모 E1s-His 의 정제
his-태깅된 HCV Els를 생산하는 사카로마이세스 세레비지애 (효모) 세포를 미세여과 및 원심분리에 의해 수확하였다. 세포 펠레트를 5배 부피 용해 완충액 (50mM 포스페이트, 6M 구아니디늄-HCl, pH 7.4 (=완충액 A) )중에 재현탁시키고, 고체 Na2SO3, Na2S4O6을 각각 160mM 및 65mM 의 최종농도가 될 때까지 용액에 첨가하였다. Cu2+(NH3중의 100mM 저장 용액)를 100μM의 농도까지 촉매로서 첨가하고, 용액을 상온에서 밤새 인큐베이션한다. 용해액을 -70℃에서 저장하고, 동결-융해 사이클후에 원심분리 (JA 20 로터, 4℃에서 27 kg)하여 깨끗하게 했다.
이미다졸 및 EmpigenTM(Albright & Wilson, UK)을 20mM 및 1%(w/v)의 최종농도가 될 때까지 각각 상징액에 첨가하고, 시료를 평형 완충액 (완충액 A, 20mM 이미다졸, 1% Empigen)으로써 희석 후에 Ni-IDA Sepharose FF 칼럼 (Pharmacia)상에 적용한다.
수지를 280nm의 흡광도가 기준선 수준에 도달할 때까지 평형 완충액으로써 세척하고, 결합된 단백질을 이미다졸 단계 구배를 적용함으로써 용출한다.
SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석은 90% 초과의 순수한 E1s-His 단백질이 변성 조건 및 IMAC 하에 술피톨분해 후에 200mM 이미다졸 용출 풀 중에 회수된다는 것을 보여준다 (도 6B).
술폰화된 HCV E1s를 티올 상태를 회복하고, 분자내 및 분자간 디술피드 브리지의 형성을 허용하기 위해 DTT의 첨가로 탈술폰화한다.
실시예 3: 대장균 NS3 융합 단백질의 정제 및 면역학적 반응성
mTNF(His)6NS3 B9 융합 단백질을 생산하는 대장균 세포를 수확하고, 세포를 완충액 A(실시예 2 참조) 중에 재현탁하였다. 술폰화, 시료 제조 및 Ni-IDA Sepharose FF (Pharmacia)상에서 행한 금속 크로마토그래피가 효모에 대해 기재된 바와 같이 (실시예 2) 행해졌다. mTNF(His)6 NS3 b9 융합 단백질을 200mM 이미다졸 용출 풀에서 회수하였다. SDS-PAGE 겔의 쿠마시 염색 및 웨스턴 블롯은 HCV 융합 단백질이 술피톨분해 및 IMAC 후에 90% 초과로 순수하다는 것을 보여주었다 (도 6A 참조).
융합 단백질의 면역 반응성을 HCV 양성 인간 혈청을 이용한 ELISA에 의해 검사하였다. 정제된 융합 단백질을 200mM DTT로써 환원하고, 단백질을 Sephadex G25 칼럼 (Pharmacia)상에서 35mM 아세테이트, 6M 우레아, pH 4로 탈염하였다. NS3 융합 단백질 반응성에 항산화제 및 가역적 보호 물질 (디티오카르바메이트, GSH, 시스테인)의 효과는 -70℃에서 동결전에 상기 물질을 첨가함으로써 또는 ELISA 코팅 완충액에서 희석동안 상기 화합물을 첨가함으로써 확인되었다.
10mM 또는 200mM DTT의 존재하에 코팅된 NS3 융합 단백질을 각각 양성 및 음성 대조군으로서 포함하였다. 혈청 (17790, 17832)은 어렵게 검출가능한 혈청이고 (HCV NS3 전환 혈청), 혈청 (17826, 17838)은 쉽게 검출가능한 HCV 양성 혈청이다. 검출하기 어려운 HCV 혈청은 (1) 다른 HCV 항원 (단지 NS3)과 반응하지 않거나 최소로 반응하는 혈청 또는 (2) 200mM DTT로써 술폰화된 NS3 b9의 처리 후에 항체에 의해 단지 제공되고, 인지되는 NS3 항원결정부와 반응하는 혈청이다. 대조적으로, 쉽게 검출가능한 혈청에 대해서는 술폰화된 NS3 b9의 10mM DTT로써 처리로 면역학적 반응성을 회복하는데 충분하다. ELISA 결과를 도 5A 및 5B에 제시한다.
결과는 항원결정부의 디스포니빌리티(disponibility)가 티올 산화환원 상태에 강하게 의존한다는 것을 보여주는데, 즉, 어려운 HCV 혈청은 NS3 시료가 티올 함유한 항산화제 및/또는 가역적 보호제로써 희석된다면, (1) 코팅 완충액 중의 200mM DTT로써 NS3의 환원 후에 또는 (2) 10mM 또는 3mM DTT의 존재하에 시료 희석제의 인큐베이션에 의해 단지 검출된다. 면역학적 반응성의 회복은 글루타티온, 시스테인 또는 티오펜카르복실산 (TPCB) 또는 티오디에틸렌글리콜 (TEG)로써 보다 디티오카르바메이트로써 더욱 현저하다. 글루타티온은 차례로 시스테인 또는 다른 시험된 모노-SH (TEG, TPCB) 산물보다 우수하였다. 최상의 ELISA 신호는 -70℃에서 인큐베이션되고, 티올 안정화제 및 가역적 보호제의 존재하에 희석된, NS3B9 융합 단백질에 대해 수득되었다.
티올 함유 화합물의 첨가 후에 면역 반응성을 회복하기 위해 DTT 환원 단계의 필요는 티올 물질 및 NS3 b9 융합 단백질의 시스테인 잔기사이의 혼합 디술피드 브리지의 형성을 보여주었다. 티올 화합물의 첨가는 단지 200mM DTT로써 환원될 수 있는, 매우 안정한 분자내 디술피드 결합의 재형성을 저해하였다. 상기 혼합 디술피드 브리지 상태는 단백질의 생체내 티올화를 닮는데, 이는 조절자 생물학적 활성으로 공지되고, 환원 상태로 전이되는데 (효소학적으로 또는 'S-S' 환원제에 의해) 최소 에너지가 투입된다.
실시예 4: CXXC 자리의 시스테인 잔기와 겹치는 E1 항원결정부에 대한 단클론 항체의 지도작성
E1의 N-말단 부위를 인지한 E1에 대한 10 개의 단클론 항체를 확인하였다. 상기 단클론을 이들 최소 항원결정부에 관하여 규명하였다. 그렇게 하기 위해, 두 개의 펩티드를 합성하고, 각 단클론의 이들 펩티드에 대한 반응성을 경쟁을 평가함으로써 분석하였다. 재조합물 E1을 마이트로타이터 플레이트에 흡착시키고, 단클론 항체를 과량의 펩티드의 존재하에 반응하도록 허용하였다. 상기 결과에 기초하여 10 개의 단클론 항체를 두 개의 군으로 나눌 수 있다 (표 1). 제 1 군에 대해, 최소 항원결정부는 아미노산 209-227이고, 특히 아미노산 225-227을 포함하지 않는 펩티드와의 반응성의 부족은 상기 단클론이 티오레독신 유사 부위, 더욱 구체적으로 상기 부위의 첫번째 시스테인과 겹치는 항원결정부를 포함한다는 것을 증명한다. 제 2 군 단클론의 최소 항원결정부는 티오레독신 유사 부위에 도달하지는 못한다. 상기 결과를 표 1에 요약한다.
E1에 대한 단클론 항체의 최소 항원결정부 도해
E1 단클론 항체군 1: IGH 198, 199 및 200서열 아미노산부위 IGP*결과NDCPNSSIVYEAHDAILHTP 205-224 263 비경쟁Bio-GG-SNSSIVYEAADMIMHTPGCV 208-227 436 경쟁
E1 단클론 항체군 2: IGH 201,202,203,204,205,206 및 208서열 아미노산부위 IGP*결과NDCPNSSIVYEAHDAILHTP 205-224 263 경쟁Bio-GG-SNSSIVYEAHDAILHTPGCV 208-227 436 경쟁
각 군에 대한 최소 항원결정부를 밑줄그었다.*IGP는 펩티드 코드 번호를 말한다.
주 1또한 E1의 C-말단 부분에서 항원결정부를 인지하는 단클론이 유용하다 (IGH 207, 209 및 210, 아미노산 307-326; PCT/EP99/02154 참조). 상기 단클론은 티오레독신 유사 자리에 이웃하지 않은 부위를 인지하기 때문에, 대조군으로서 사용될 수 있다.
주 2IGH 198 = 23C12 IGH 203 = 15G6 IGH 208 = 5C6IGH 199 = 15B5 IGH 204 = 8A8 IGH 209 = 5E1IGH 200 = 25CF3 IGH 205 = 3H2 IGH 210 = 7D2IGH 201 = 11B7 IGH 206 = 7C4IGH 202 = 3F3 IGH 207 = 14H11
그리하여, 본 발명의 펩티드의 생물학적 활성 및/또는 입체형태의 변화를 결정하기 위한 도구로서 사용될 수 있는 단클론이 유용하다.
실시예 5: Cys-잔기의 가역적 변형 후에 HCV E1s 정제
우두 RK13 세포를 Maertens 등 (PCT EP95/03031)에 기재된 바와 같이 용해하였으나, 비가역적 티올 봉쇄제 N-에틸말레이미드 (NEM) 대신에 고체 소듐 테트라티오네이트를 65mM 이하로 용해액에 첨가하였다. 용해액을 4℃에서 밤새 인큐베이션하고, 정제 단계 (렌틸 렉틴 (LCA) 크로마토그래피, LCA 용출액의 농축 및 DTT로써 환원)를 Maertens 등 (PCT EP95/03031)에 기재된 바와 같이 수행하였다. 농축물을 2개로 나누고, 4℃에서 Na2S4O6에 의해 밤새 술폰화하거나 기준 물질로서 N-에틸-말레이미드 (NEM)로써 비가역적으로 봉쇄하였다. 술폰화뿐만 아니라NEM-처리된 E1s를 Empigen의 존재하에 Superdex G200 (Pharmacia)상에 적용하고 (도 1 참조), E1s 피크를 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다.
크로마토그램 겹침뿐만 아니라 ELISA 프로필은, 비가역적으로 보호되고 술폰화된 E1s 산물이 Empigen의 존재하에 SEC 상에서 유사하게 행동한다는 것을 보여준다. SDS-PAGE 및 은 염색은 유사한 순도의 2개의 산물을 보여준다.
실시예 6: 티올 안정화제의 존재하에 용해 후에 비변성 조건하에 HCV E1s 정제
우두 감염된 RK13 세포를 Maertens 등 (PCT EP95/03031)에 기재된 바와 같이 용해하였으나, 아스코르베이트 (1mM)를 NEM 대신에 티올 안정화제로서 용해액에 첨가하였다. 시료를 LCA 수지상에 적용하고, LCA 용출액을 1M 아세트산으로써 pH 5.5까지 산성화하였다. 산성화된 용출액을 농축한 후에, pH를 7.2로 조절하고 Maertens 등 (PCT EP95/03031)에 기재된 바와 같이 DTT로써 처리하였다.
환원된 단백질 용액을 나누고 하기 중의 하나와 같이 처리하였다: (1) pH 6 으로 산성화 (티올 안정화 조건) 또는 (2) 소듐 테트라티오네이트로써 술폰화 (가역적으로 보호) 또는 (3) NEM.bio로써 처리 (비가역적 봉쇄). 산성화된 (pH 6) 시료의 SEC를 또한 pH 6.0에서 수행하였다. 다른 2개의 시료를 Maertens 등 (PCT EP95/03031)에 기재된 바와 같이 Empigen의 존재하에 Superdex G200상에서 분리하였다. 용출 분획을 ELISA, SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다.
Maertens 등 (PCT EP95/03031)에 기재된 바와 같이 제조된 물질을 SEC에 대한 기준 물질로서 포함한다.
분획 분석은 순수한 E1s가 상이한 조건에 대해 회수된다는 것을 보여준다 (도 3A-1 및 도 3A-2). NEM.bio E1s 물질의 외견의 높은 Mr은 아마도 E1s상에 부피가 큰 봉쇄 군의 삽입에 기인한다.
도 3B는 실시예 5 및 6에 기재된 바와 같이 상이한 절차에 의해 수득된, E1s 풀의 웨스턴 블롯을 보여준다.
실시예 5 및 6은 순수한 E1s가 (1) 가역적 변형제를 사용함으로써 또는 (2) 티올 안정화 조건 (항산화제, 낮은 pH)하에 크로마토그래피를 수행함으로써 비변성 조건하에 수득되는 것을 설명한다.
실시예 7: 베로 E1s의 가공 및 티오레독신과 같은, 성장 인자로써 절단 유추
우두 감염된 베로 세포를 Maertens 등 (PCT EP95/03031)에 기재된 바와 같이 용해하였으나, 요오도아세트아미드 (IAA)를 비가역적 봉쇄제로서 첨가하고, 아프로티닌을 4℃에서 밤새 인큐베이션 후에 첨가하였다.
LCA 수지 (Pharmacia)상의 크로마토그래피, DTT로써 환원 및 겔 여과를 IAA가 NEM 대신에 비가역적 봉쇄제로서 사용된 것을 제외하고는, 기재된 바와 같이 수행하였다. E1s 풀을 은 염색 및 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다.
반 정제된 산물의 웨스턴 블롯 분석은 27-32 kDa 부위의 4중선 밴드외에 또한 약 18 kDa 의 Mr인 E1s 밴드를 보여주었다. 밴드를 NH2-말단 아미노산 서열결정에 의해 규명하였다.
4중선의 상이한 밴드의 주요 신호 서열:
Y E V R ? V S G
(올바로 가공된 E1S의 아미노 말단)
E1S 분해 산물의 서열:
? ? V A L T P T L A A
상기 분해 산물은 CVPC 자리의 상류에 위치한, Arg 237 다음의 카르복시 말단에서 특정 절단으로부터 생긴다. 시스테인 및 트립토판 아미노산이 에드만 서열결정 방법에 의해 파괴되기 때문에, 첫번째 및 두번째 잔기는 확인되지 않는다.
놀랍게도, 다른 염기성 잔기 및 이염기성 서열이 E1s에 존재하지만, 어떠한 다른 분해 산물도 회수되지 않았다. 이 특정 절단 패턴은 티오레독신과 같은 성장 인자의 가공에 대해 기재되고, 상기 절단이 ECEF의 형성을 초래하는, E1s 도메인 구조와 일치한다 (Balcewicz- Sablinska, 등, 1991; Newman 등, 1994).
실시예 8: E1s CVPC-자리내의 시스테인의 pKa의 적정
반응 단계의 서열을 확립하기 위해, 즉 C1VPC2-자리의 시스테인을 먼저 반응하고, 상기 시스테인의 pKa를 적정한다. E1s의 C1VPC2-자리의 시스테인의 pKa는 pH의 함수로 E1s 또는 합성 펩티드내의 시스테인의 변형에 의해 결정된다.
변형은 미리설정된 pH에서 IAA로써 처리에 의해 수행되고, 그 후에 시료를 트리플루오로아세트산 (TFA)으로써 pH를 2로 낮춘 후에 RPC 상에 적재한다.
가장 반응성인 시스테인을 결정하기 위해, 과량의 IAA 시약을 RPC에 의해 제거한다. 미반응된 티올기를 에틸렌이민 (EI) 또는 브로모-에탄올아민 (BEA)의첨가 후에 pH를 올림으로써 변형한다.
EI 또는 BEA로써의 처리는 보충적인 트립신분해 자리를 생성하는, 라이신 모방 시스테인 부가물의 도입을 초래한다. 이 보충적인 자리는 펩티드 지문법 및 MS를 통해 -C1VPC2-자리내의 가장 반응성인 시스테인의 확인을 허용한다 (또한 실시예 1 참조).
참고 문헌

Claims (11)

  1. 가역적 산화환원 상태를 가지는, 두 개 이상의 Cys-아미노산을 함유하고, 상기 Cys-아미노산이 아미노산 서열 Cys-X1-X2-Cys (식 중, 아미노산 X1은 임의의 아미노산을 나타내고, 아미노산 X2는 임의의 아미노산을 나타낸다)에 포함되는, HCV 단백질, 또는 이의 임의의 기능적으로 동등한 부분.
  2. 제 1 항에 있어서, 아미노산 X1이 아미노산 Val, Leu 또는 Ile 중의 하나를 나타내고, 아미노산 X2가 임의의 아미노산을 나타내는, HCV 단백질, 또는 이의 임의의 기능적으로 동등한 부분.
  3. 제 1 항에 있어서, 아미노산 X1이 임의의 아미노산을 나타내고, 아미노산 X2가 아미노산 Pro를 나타내는, HCV 단백질, 또는 이의 임의의 기능적으로 동등한 부분.
  4. 제 1 항에 있어서, 아미노산 X1이 아미노산 Val, Leu 또는 Ile 중의 하나를 나타내고, 아미노산 X2가 아미노산 Pro를 나타내는, HCV 단백질, 또는 이의 임의의 기능적으로 동등한 부분.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 HCV 단백질이 E1s 또는 E1p 군으로부터 선택되는, HCV 단백질, 또는 이의 임의의 기능적으로 동등한 부분.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 가역적 산화환원 상태를 가진 두 개 이상의 Cys-아미노산을 함유하고, 하기 과정에 의해 수득가능한, HCV 단백질, 또는 이의 임의의 기능적으로 동등한 부분:
    (a) 시스테인 잔기가 화학적 및/또는 효소학적 수단에 의해 가역적으로 보호되는, HCV 단백질, 또는 이의 임의의 기능적으로 동등한 부분을 정제하는 과정;
    (b) 시스테인 잔기의 가역적 보호 상태를 제거하는 과정;
    (c) 시스테인 잔기가 가역적 산화환원 상태를 가지는, HCV 단백질, 또는 이의 임의의 기능적으로 동등한 부분을 수득하는 과정.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 약제로서 사용되는, HCV 단백질, 또는 이의 임의의 기능적으로 동등한 부분.
  8. HCV 백신 조성물, 특히 치료용 백신 조성물 또는 예방용 백신 조성물의 제조를 위한, 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른, HCV 단백질, 또는 이의 임의의 기능적으로 동등한 부분의 용도.
  9. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HCV 단백질, 또는 이의 임의의 기능적으로 동등한 부분을 특이적으로 인지하는 항체를 증가시키기 위한, HCV 단백질, 또는 이의 임의의 기능적으로 동등한 부분.
  10. 하기를 포함하는, HCV 항체를 검출하는 면역학적 분석법:
    (1) 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른, HCV 단백질, 또는 이의 임의의 기능적으로 동등한 부분을 제공하는 것;
    (2) HCV 항체-HCV 단백질 복합체의 형성을 허용하는 조건하에 상기 HCV 단백질과 생물학적 시료를 인큐베이션하는 것;
    (3) 상기 HCV 항체-HCV 단백질 복합체가 형성되는지를 결정하는 것.
  11. 하기를 함유하는, 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 HCV 단백질의 산화환원효소 활성을 조절하는 화합물을 확인하기 위한 생물학적 분석법:
    (a) 상기 단백질의 산화환원효소 활성을 조절하는 능력을 측정될 하나 이상의 화합물에, 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 HCV 단백질, 또는 이의 임의의 기능적으로 동등한 부분을 발현하는 세포를 노출시키는 것; 및 그 후에
    (b) 산화환원효소 활성의 변화에 대해 상기 단백질을 모니터링하는 것.
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