JPH09500784A

JPH09500784A - 非ａ、非ｂ型肝炎の診断及び検出に有効である直鎖及び分枝鎖ペプチド

Info

Publication number: JPH09500784A
Application number: JP7503081A
Authority: JP
Inventors: ワン，チャン・イ; ホセイン，バーバラ
Original assignee: United Biomedical Inc
Current assignee: United Biomedical Inc
Priority date: 1993-06-28
Filing date: 1994-06-22
Publication date: 1997-01-28
Also published as: CA2165053A1; EP0710294A1; US5639594A; WO1995000670A1; AU7212394A; EP0710294A4

Abstract

(57)【要約】本発明は、非Ａ、非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢＨ）及びＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染症の診断及び予防に特異的である新規直鎖及び分枝ペプチドに関する。より詳細には、本発明は、イムノアッセイ技術を用いたＮＡＮＢＨ患者におけるＮＡＮＢＨ関連抗体の検出に有効な少なくとも一つのエピトープを含有する、ＨＣＶのＮＳ−３に特徴的である直鎖ペプチド、並びに分枝、合成、置換及びハイブリッドペプチドに関するものである。更に、本発明は、本発明ペプチドを用いたＮＡＮＢＨの検出及び診断のためのイムノアッセイ、ＮＡＮＢＨ又はＨＣＶ感染症の予防及び治療のためのワクチン組成物、並びにＮＡＮＢＨ及びＨＣＶ感染症を治療又は予防する方法を提供するものである。

Description

【発明の詳細な説明】非Ａ、非Ｂ型肝炎の診断及び検出に有効である直鎖及び分枝鎖ペプチド本出願は、１９９２年９月１５日に出願されたU.S．Serial No．946,054 の一部継続出願であり、これは、１９９１年３月１１日に出願されたU.S．Serial No ．667,275 の一部継続出願であり、これは、１９９１年２月７日に出願されたU. S．Serial No．651,735 及び１９９１年１２月１１日に出願されたU.S．Serial No．805,374の一部継続出願であり、これは、１９９０年７月２６日に出願され、現在、U.S．Patent No．5,106,726 であるU.S．Serial No．558,799 の分割出願であり、これは、１９９０年４月１６日に出願され、放棄されたU.S．Serial No．510,153 の一部継続出願であり、これは、１９９０年２月１６日に出願され、放棄されたU.S．Serial No．481,348 の一部継続出願である。発明の分野本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染症を含む、非Ａ、非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢＨ）の診断及び予防に特異的である新規直鎖及び分枝鎖ペプチドに関する。より詳細には、本発明は、ＮＡＮＢＨを有する患者における、イムノアッセイ技術を用いた、ＮＡＮＢＨ関連抗体の検出に有効である、少なくとも一つのエピトープを含有する直鎖及び分枝鎖合成ペプチドに関する。更に、本発明は、ここに記載するペプチドのハイブリッドである合成ペプチドに関する。加えて、本発明ペプチドは、ＨＣＶに対するモノクローナル又はポリクローナル抗体を誘導する抗原として、そしてＮＡＮＢＨ又はＨＣＶ感染症の予防及び治療のためのワクチンにおける免疫原として、使用することができる。発明の背景非Ａ、非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢＨ）は、輸血後肝炎の最も多い形であり、潜在的供血者及び本疾患のキャリアーであるかもしれないその他の人とを識別するための、感度が高く特異的な診断スクリーニング法が、強く求められている。そこで、血液供給品より、高度の信頼度をもって、汚染血液及び汚染血液製品を除去することを可能とする正確なスクリーニング法が、求められている。ＮＡＮＢＨの原因物質、ＨＣＶは、幾つかのグループにより、クローン化され、同定されている［Houghton et al.，EP 0318216,１９８９年５月に公開；Okam oto et al．(1990) Jpn．J．Exp.Med. 60:167; Houghton et al.，EP 0388232，１９９０年９月に公開；Kato et al．(1990)Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:95 24; Arima et al．(1989a) Gastroenterologia Japonica 24:540; Reyes et al ．(1990) Science 247:1335; Arima et al．(1989b)Gastroenterologia Japonic a 24:545; Maeno et al．(1990)Nucleic Acids Res．18:2685］。ＨＣＶゲノムは、長さが約１０キロ（kb）ベースであり、単一のポリプロテインをコードしており、このポリプロテインが、加工されて、構造タンパク質及び非構造タンパク質となる。Ｎ末端から、このポリプロテインは、構造領域のキャプシド及びエンベロープタンパク質、並びに非構造領域のＮＳ−１〜ＮＳ−５タンパク質を含む。ＨＣＶの抗原領域のあるものは、同定されているが、これらの領域由来のペプチド及び組替えタンパク質では、ＮＡＮＢＨキャリアーの検出及び診断における感受性並びに選択性は、まちまちである。抗原領域は、そのコア又はキャプシドタンパク質［Hosein et al．(1991) Proc．Natl．Acad．Sci．US A 88:3647; UBI HCV EIA添付文書(1990); Okamoto et al．(1990) Jap．J．Exp ．Med. 60:223; U.S．Patent No．5,106,726; Takahashi et al．(1992) J.Gen ．Virol ．73:667; Kotwal et al．(1992) Proc．Natl．Acad.Sci．USA 89:4486 ］；エンベロープ、ＮＳ−１、ＮＳ−２及びＮＳ−３タンパク質［Wang et al. ，EP 0468527,１９９２年１月２９日に公開］；ＮＳ−４タンパク質［Houghton (1989); Kuo et al．(1989) Science 244:362; U.S．Patent No．5,106,726］そしてＮＳ−５タンパク質［Maeno et al．(1990) Nucleic Acids Res.18:2685; W ang (1992)］において報告されている。ＨＣＶ由来の抗原に加えて、ホスト細胞の配列によりコードされていると考えられるその他のＮＡＮＢＨ関連抗原が存在する。ＧＯＲエピトープとして知られるこのような抗原の一つは、ＨＣＶに対してＰＣＲ陽性である人から得た血清に対して反応性である［Mishiro et al．(1990) Lancet 336:1400］。 Wang（1992）及びU.S．Patent No．5,106,726 に記載されているように、特定のＨＣＶ抗原領域内におけるエピトープをマッピングするために、血清学的解析が行われているが、この両者を、参考のため、ここに記載する。これらのマッピングに関する研究では、良好に特徴づけられているＮＡＮＢＨ血清パネルをスクリーニングするために、合成ペプチドが使用されており、これにより、高度に免疫反応性であるＨＣＶ抗原の同定が可能となった。血清学的バリデーション技術を使用したエピトープ解析を更に改良した結果、ＨＣＶゲノムの異なる領域由来の、一つ又はそれ以上のエピトープを含有する、より長いペプチド又はペプチド融合物内に含まれるアミノ酸残基の小さいクラスターにより、ＮＡＮＢＨキャリアーの診断及び検出のため、そしてＨＣＶ感染症のための、優れた、より感受性の高い検定法が提供されることが発見されるに至った。ＮＳ−３領域をカバーする、長く、重複するペプチドを、広範囲に試験した結果、高次エピトープを含有する免疫優性ペプチドの一群が、同定された。このペプチドの一群は、ＮＡＮＢＨ関連抗体の検出に、特に有用である。発明の概要本発明は、ＮＡＮＢＨ及びＨＣＶ感染症の診断及び検出のための直鎖及び分枝鎖合成ペプチドに関する。詳細には、本発明ペプチドは、少なくとも一つの直鎖ペプチド又は少なくとも一つの分枝鎖ペプチドを有するペプチド組成物として提供される。直鎖ペプチドは、ＨＣＶに対する抗体と、特異的に免疫反応性であり、及びの配列、並びにその類似体、セグメント、ポリマー及び混合物からなる群由来のアミノ酸配列より誘導される。分枝鎖ペプチドは、式：［ペプチド］₂ Ｘ［ペプチド］₄ Ｘ₂ Ｘ［ペプチド］₈ Ｘ₄ Ｘ₂ Ｘ［ペプチド］₁₆Ｘ₈ Ｘ₄ Ｘ₂ Ｘ（式中、Ｘは、それぞれの基が、ペプチド結合を形成し得る二つのアミノ基及び一つのカルボキシル基を有するアミノ酸又はアミノ酸類似体であり、ここで、ペプチド部分、つまり［ペプチド］は、ＨＣＶに対する抗体と、特異的に免疫反応性である少なくとも一つのエピトープを含む）で示される。このペプチド部分は、更に、配列：又はＨＣＶ株若しくは単離株における対応する領域由来の、これらの配列の一つに対応する配列由来の、約３〜約２０の連続するアミノ酸の、少なくとも一つのクラスターを含む。更に、このペプチド部分が、二つ又はそれ以上のクラスターを含む場合、クラスターは、結合基により結合しているか、或いはクラスターが、それぞれ、上記の配列の異なる一つ由来の配列を有する場合は、クラスターは、直接、又は結合基により結合することができる。ペプチド部分が、上記の配列の異なる配列由来の配列を含む場合、このようなペプチドは、ハイブリッドペプチドと称される。ハイブリッドペプチドは、クラスターを含むことができるが、必ずしも含むわけではない。ハイブリッドペプチド中のクラスターは、直接、又は結合基により、結合することができる。ハイブリッドペプチドでは、それぞれの配列由来の連続するアミノ酸の長さは、最高で、約６０残基であることができる。本発明のもう一つの特徴は、免疫有効量の本発明ペプチド組成物を、イムノアッセイ操作、そして詳細には、ＥＬＩＳＡ操作又は受動血球凝集（ＰＨＡ）アッセイに用いて、ＨＣＶに対する抗体を検出、又はＨＣＶ感染症若しくはＮＡＮＢＨを診断する方法を提供するものである。ＮＡＮＢＨ及びＨＣＶ感染症の検出及び診断のためのイムノアッセイ並びにキットもまた、提供される。本発明のまたもう一つの特徴は、免疫原として、本発明の分枝鎖ハイブリッド及びクラスターペプチド又はペプチド組成物を用いた、ＮＡＮＢＨ又はＨＣＶ感染症を予防或いは治療するためのワクチンを提供するものである。これらのワクチン組成物を用いたＮＡＮＢＨ若しくはＨＣＶ感染症を予防又は治療する方法もまた、提供される。発明の詳細な説明本発明によると、血清学的解析を広く行った結果、ＮＡＮＢＨ及びＨＣＶ感染症の検出並びに診断に有用な免疫反応性ペプチドが、改良され、更に定義された。この解析により、ＮＡＮＢＨ又はＨＣＶ感染症のための有効な診断用ペプチドは、ＮＳ−３由来の直鎖及び分枝鎖ペプチドを含むことが確立された。場合により分枝している本ペプチドは、異なるペプチド由来の一つ又はそれ以上のＨＣＶエピトープを含有するペプチドのハイブリッドであることができ、ここでは、ハイブリッドペプチドとして記載する。更に、本発明ペプチドは、ＨＣＶに対する抗体と、特異的に免疫反応性である少なくとも一つのエピトープを有し、Ｐｅｐ３、Ｐｅｐ８、Ｐｅｐ１１、Ｐｅｐ１８、Ｐｅｐ２５、ＩＩＨ、ＩＩＩＤ、Ｖ、ＶＩＩＩＥ、ＰｅｐＡ、ＰｅｐＢ、ＰｅｐＣと表示されるペプチド又はＨＣＶの別の株若しくは単離株中の対応する領域由来の相同ペプチド由来の約３〜約２０の連続するアミノ酸の、一つ又はそれ以上のクラスターを含むペプチド部分を有するペプチドもまた、包含する。Ｐｅｐ３、Ｐｅｐ８、Ｐｅｐ２５、ＩＩＩＤ、Ｖ及びＰｅｐＡと表示されるペプチドのアミノ酸配列は、１９９２年９月１５日出願のU.S．Serial No．946,054 において提供されており、これを、参照のためにここに記載する。更に、これらのペプチドのペプチド部分も、クラスターペプチドとしてここに記載するが、これらのペプチド部分が、二つ又はそれ以上のクラスターを含む場合、これらのクラスターは、結合基により結合している。結合基は、一つ又はそれ以上の天然アミノ酸、一つ又はそれ以上の非天然アミノ酸、或いはペプチジル結合（若しくはペプチジル様結合）を形成することができ、ペプチド合成の間に用いる条件に安定である一つ又はそれ以上のアミノ酸類似体からなるが、これらに限定されるわけではない。クラスターを含むハリブリッドペプチドの場合、クラスターは、直接又は結合基により結合することができる。更に、ＮＳ−３の直鎖ペプチドは、ここで定義したようなハイブリッドペプチド又はクラスターペプチドのペプチド部分からなるように、修飾することができる。詳細な血清学的解析に付したペプチド配列であって、それより本発明の直鎖及び分枝鎖ペプチドのペプチド部分が誘導されるペプチドの配列は、以下の通りである：（式中、Ｘは、−ＯＨ又は−ＮＨ₂ である）又はＨＣＶの別の株若しくは単離株における対応する領域由来の相同ペプチド、並びにこれらのペプチドの類似体及びセグメント。ここに使用するように、直鎖ペプチドは、約５０〜約１００のアミノ酸、好ましくは、約６０〜約９０のアミノ酸、より好ましくは、約７５〜９０のアミノ酸を有する。直鎖ペプチドは、ＨＣＶ抗体との特異的免疫反応性が保持されているのであれば、ここで定義するようなＨＣＶ配列のクラスターを含むことができる。ここに使用するような「クラスター」は、ここに記載するペプチド配列の一つ又はその類似体若しくはセグメント由来の３〜約２０の連続するアミノ酸の配列である。好ましい実施態様においては、クラスターは、３〜９の連続するアミノ酸の配列を有する。その類似体及びセグメントを含む、本発明の直鎖ペプチド、分枝鎖ハイブリッド及びクラスターペプチドは、体液中のＨＣＶに対する抗体の検出、ＮＡＮＢＨの診断、及び健康な哺乳類、詳細にはヒトのワクチン接種において、中和抗体又は防御抗体を含むＨＣＶに対する抗体の産生を刺激するために有用である。本発明の直鎖及び分枝鎖ペプチドは、結合物或いはセグメント、つまり非天然アミノ酸を含むアミノ酸を更に末端アミノ酸に付加させるか、又はいずれかの末端からアミノ酸を除去することによって、延長或いは短縮されたペプチド鎖を含むことができる。例えば、配列ＫＫＫ（Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）は、これらのいずれのペプチドのアミノ末端にも付加することができる。分枝鎖ペプチドについては、Ｍ（メチオニン）残基は、ペプチド部分のカルボキシ末端、つまりペプチド部分と分枝鎖構造の間で、配置されることができる。ここで用いる「セグメント」は、ＮＡＮＢＨ関連抗体の検出に有効であるエピトープを保持する、親ペプチドの、より短い領域を意味する。例えば、ＬＩＡは、その親ペプチドであるＰｅｐＢのセグメントである。セグメントは、その親ペプチドのいずれかの末端、又はその親ペプチドの内部配列から誘導することができる。本発明の分枝鎖ペプチドは、異なるＨＣＶ単離株間での株間の変動を緩和するための類似体、又はエピトープの免疫原性に影響しない所定の配列におけるその他の置換体を含むこともできる。ＨＣＶは、突然変異を頻繁に起こすことが示されている。ＰＴ、Ｊ、Ｊ１及びＪ４［Houghton，1989; Okamoto，1990; Houghto n，1990;及びKato，1990］などの数種の変異株／単離株が存在することが知られており、その他の変異株が存在することも予想される。保存的置換、及び非保存的置換も含まれる代替物からの選択のための調節は、所定の配列において行うことができる。したがって、直鎖及び分枝鎖合成ペプチド、特にハイブリッドペプチドの類似体は、ＨＣＶに対する抗体により認識される免疫反応性が、保持されている限り、各種株を調節するために、上記の配列の記載したアミノ酸の置換体、挿入体及び／又は欠失体を含むことができる。加えて、類似体における置換体、挿入体及び欠失体は、このような変化によっても、ＨＣＶに対する免疫反応性を保持するペプチドが産生されるのであれば、その他のＨＣＶ株によりコードされている必要はない。置換及び挿入は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、又はペプチジル結合若しくはペプチド様結合を形成し得るアミノ酸類似体（例えば、ペプチドチオール類似体）を用いて行うことができる。本発明による類似体ペプチドを合成し、ＨＣＶ血清パネルに対する試験を行って、以下に記載するように、ペプチドの免疫反応性を求める。更に、適当なアミノ酸修飾又は置換により、バックグラウンド値が低い、又は固相に対する結合能が良好であるとの、ＨＣＶ抗体スクリーニングアッセイに有用である特性を有する所定のアミノ酸配列に基づく各種ペプチド類似体を、合成することができる。詳細には、非天然アミノ酸を含有するペプチドは、バックグラウンド値を有意に低下させることができる。本発明の直鎖又は分枝鎖ペプチドは、複合体（コンジュゲート）を形成するために使用することもできる、つまり本ペプチドを、当業界に公知の方法により、直接又は間接的に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの担体タンパク質又は赤血球若しくはラテックス粒子に結合させることができる。ここで用いるように、天然アミノ酸は、タンパク質に通常認められる２０のアミノ酸である（つまり、アラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、アルギニン、システイン、グリシン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシン、トリプトファン及びバリン）。ここで用いるように、天然アミノ酸は、このようなアミノ酸のＤ−及びＬ−体をも含む。ここで用いるように、「非天然アミノ酸」は、タンパク質に認められるものであろうと、自然界に認められるものであろうと、合成されるものであろうと、その他のいかなるアミノ酸のＤ−及びＬ−体をも含む。非天然アミノ酸は、β−アラニン、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、チロキシン、ガンマ−アミノ酪酸、ホモセリン、シトルリンなどを含むことができるが、これらに限定されるわけではない。本発明の直鎖ペプチドは、式：［ペプチド］−Ｙ（式中、Ｙは、−ＯＨ又は−ＮＨ₂ である）で示され、これらの直鎖ペプチドの類似体、セグメント、混合物、コンジュゲート及びポリマーを含む。このペプチドは、ＨＣＶに対する抗体と、特異的に免疫反応性である少なくとも一つのエピトープを含む。更に、本直鎖ペプチドのペプチド部分は、分枝鎖ペプチドのペプチド部分に関して以下に記載するように、定義することができる、つまり直鎖ペプチドは、ＨＣＶエピトープのクラスター又はハイブリッドを含むことができる。本発明の分枝鎖ペプチドは、式：［ペプチド］₂ Ｘ［ペプチド］₄ Ｘ₂ Ｘ［ペプチド］₈ Ｘ₄ Ｘ₂ Ｘ［ペプチド］₁₆Ｘ₈ Ｘ₄ Ｘ₂ Ｘ（式中、Ｘは、それぞれの基が、ペプチド結合を形成し得る二つのアミノ基及び一つのカルボキシル基を有するアミノ酸又はアミノ酸類似体である）の一つにより示される。好ましくは、Ｘは、リシン、又はオルニチンなどのリシン類似体である。アミノ酸類似体は、ペプチド結合を形成するために利用可能である二つのアミノ基及び一つのカルボキシル基を有する、α−アミノ酸、β−アミノ酸、又はその他のいかなる天然若しくは非天然アミノ酸であることもできる。本発明の好ましい分枝鎖ペプチドは、二量体、四量体及び八量体、特にリシンからなる分枝鎖コア構造を有するそれら（ここで、Ｘは、リシンである）である。分枝鎖二量体が、特に好ましい。分枝鎖ペプチドのペプチド部分は、約１０〜約１００のアミノ酸残基の長さ内で、変動することができる。好ましくは、ペプチド部分は、約１７〜約６０のアミノ酸残基を含む。更に、ハイブリッド及びクラスターペプチド部分は、ＮＡＮＢＨ関連抗体の検出に有効なエピトープを含有するが、本発明の優れた感受性及び選択性を保持するのに必要な最少の全長に調節することができる。本発明の好ましいペプチドは、表１に示す。各ペプチドの供給源は、表２に示す。本発明のペプチド組成物は、直鎖ペプチド（ハイブリッド若しくはクラスターを含む、又は含まない）、分枝鎖ハイブリッドペプチド、分枝鎖クラスターペプチド若しくはこれらのペプチドの組み合わせの一つ又はそれ以上からなることができる。好ましくは、このような組成物は、１〜１０のペプチド、より好ましくは１〜４のペプチドを含有する。好ましい実施態様においては、本発明のペプチド組成物は、ＰｅｐＢ及びＰｅｐＣ由来のペプチドＬ１Ｃ、３ＫＬ１Ｃ、Ｌ２Ｃ、Ｌ３Ａ、３ＫＬ４Ｃ及びＣ１２を含み、より好ましくは、ペプチドＬ１Ｃ、３ＫＬ１Ｃ及びＣ１２を含む。ペプチド３ＫＬ１Ｃは、ＨＣＶ抗体検出のためのＰＨＡイムノアッセイに、特に有用である。本発明のその他の好ましいペプチドは、ペプチドＣ６Ｃ、３ＫＣ１０Ｃ、Ｃ１１及び３ＫＨ８を含む。更に、本発明ペプチド組成物は、ペプチド混合物を包含する。本発明ペプチドの混合物を含むペプチド組成物中に存在するＮＡＮＢＨ又はＨＣＶを診断又は検出するためのペプチドの有効な比率は、当業界の通常の技術者によって、容易に決定することができる。代表的には、これらの比率は、ペプチドの重量に基づき、約１〜約５０である。ＮＡＮＢＨ又はＨＣＶ感染症の診断及び検出のための好ましいペプチド組成物は、ペプチド３ＫＣ１０Ｃ二量体、Ｃ１１二量体、Ｃ１２直鎖及び３ＫＨ８二量体の、重量比１：１：３：２の混合物である。ＮＡＮＢＨ及びＨＣＶ感染症の検出及び診断における本発明ペプチドの有効性を決定するために、ＨＣＶとの免疫反応性についてスクリーニングを行った数千もの患者及び正常人の血清から予め選択した標本との免疫反応性について、ペプチドの試験を行った。このような血清パネルは、市販されており、その例は、実施例中に記載する。血清学的バリデーションの方針は、標的エピトープの予想される特徴次第である。例えば、ＨＩＶ−１のｇｐ４１トランスメンブランペプチドなどの一般的な免疫優性エピトープは、本ウイルスに感染していることが判明している患者より得た単一の代表的な血清試料によりスクリーニングすることができる。感染している全ての個体により認識されるわけではないエピトープ、又はそれに対する抗体が、後になって産生される、若しくは一時的にしか産生されないエピトープ、特に中和抗体の産生をもたらすエピトープは、大規模な血清パネルによりスクリーニングしなければならない。本発明においては、本発明ペプチドを用いたＨＣＶのエピトープ解析を改良するには、いずれのスクリーニング法も用いることができるが、後者の方法は、その優れた選択性及び感受性のため、本発明ペプチドを評価するのに、特に有用である。免疫反応性エピトープの同定は、用いる血清パネルにも依存する。より厳密には、パネルは、エピトープに対して、血清反応陽性である可能性が最も高く、エピトープが同定され、完全にマッピングされる可能性が高い集団を示す。したがって、予め同定されたエピトープを含むアッセイの反応性の範囲を広げるには、感染している危険はあるが、公知のエピトープに対する血清反応は陰性である個体由来の多数の試料を、スクリーニングに使用しなければならない。「血清学的バリデーション」の工程は、同定すべきエピトープが、感染した患者群の小集団においてのみ、抗体を誘導する場合、特に困難である。このようなエピトープが、同定の標的である場合、エンザイムイムノアッセー又はその他の免疫学的試験法により試験すると、ごくわずかな反応性しか示さない合成ペプチドについては、特に注意を払う必要がある。この点に関し、合成ペプチド、特に非天然アミノ酸のペプチドのバックグラウンド吸収値が小さいため、微弱な反応性でも、正確に検出することが可能である。ある場合では、バックグラウンド値に対して、５０mAの吸収でも、十分に有意であり、ペプチドのアミノ酸配列を、連続して精製することによって、重要なエピトープを同定することが可能である。優れた実験室実務により、２００〜３００mA以下の吸収範囲で作業を行っても、一貫した、信頼性のある結果を得ることができる。高度に免疫反応性であるＨＣＶＮＳ−３ペプチドを同定するためには、長さが１２〜１００以上の残基を有する１３５以上もの重複したペプチドが、デザインされ、合成され、ＨＣＶ感染の初期段階の血清を含む、ＰＴ−ＮＡＮＢＨ（輸血後ＮＡＮＢＨ）の患者由来の血清の特殊パネルによる試験を受けた。試験を行ったＮＳ−３ペプチドのうち、長いペプチド３種のみ、Ｌ１Ｄ、Ｌ２Ｄ及び置換類似体Ｃ１２、並びにそれらと関連する、より短いセグメント、詳細には、Ｌ１Ｂ及びＬ１Ｃと対応するセグメントが、有為なＨＣＶ免疫反応性を有することが認められた。例として、Ｌ１Ｄを用いた広範囲な血清学的解析により、Ｌ１ＤのＣ末端に位置する、ＹＴＧＤＦＤＳＶＩＤＣＮＴＣＶ（配列番号７のアミノ酸７９〜９３）の配列を有する１５のアミノ酸ストレッチが、ペプチド構造の残りの部分と、高次構造エピトープを形成するのに重要である配列を含む。Ｎ末端では、ＫＡＩＰＬＥＶＩＫＧ（配列番号７のアミノ酸１３〜２２）の配列を有する少なくとも１０のアミノ酸のストレッチが、本ペプチドの免疫反応性を増大させるが、次の９のアミノ酸（ＧＲＨＬＩＦＣＨＳ；配列番号７のアミノ酸２３〜３１）は、このような免疫反応性を、大きく増大させる。Ｎ末端に、ＡＬＳＴＴＧＥＩＰＦＹＧ（配列番号７のアミノ酸１〜１２）などのアミノ酸を付加するのが、高次構造エピトープの安定化をもたらすため、最適である。更に、ペプチドＣ１２で示されるように、この領域において、ある種のアミノ酸置換を行っても、免疫反応性が、必ずしも低下するわけではない。本発明のＮＳ−３ペプチドは、はるかに大きいＮＳ−３タンパク質の高次構造を保持し、そのため、ＮＳ−３の機能的ドメインを形成するタンパク質の枠組み構造を示す。例えば、実施例２に示すように、このドメインの中間地点が、裂開すると、構造が破壊され、ＨＣＶ免疫反応性が失われる。しかし、機能的ドメインの構造が、保持されていると、Ｎ又はＣ末端のいずれかにアミノ酸残基を付加しても、本発明のＮＳ−３由来ペプチドの本来の免疫反応性は、干渉を受けない。本発明のペプチドの免疫反応性に基づき、本発明ペプチドは、ＮＡＮＢＨ若しくはＨＣＶ感染症を治療又は予防するためのワクチン組成物においても、有用である。本ペプチドを、単独で、或いはシステイン酸化、ジスルフィド架橋結合誘発、又はホモ若しくはへテロ官能的多価架橋剤を用いて、担体に結合、或いはホモ若しくはヘテロ二量体又はより大きいオリゴマーに重合した場合、本ペプチドを、正常被験者に導入して、健康な哺乳類において、ＨＣＶに対する抗体の産生を刺激することができる。同様に、本発明ペプチドは、ワクチン組成物に日常使用される補助剤、薬剤学的に許容しうる担体、又はその他の成分を用いたワクチン組成物に、処方することができる。このような処方物は、当業界の技術者により、容易に決定され、即時放出性及び徐放性処方物、例えばマイクロカプセルが、含まれる。本発明ワクチンは、皮下、経口、筋肉内、静脈内若しくはその他の非経口、又は経腸経路を含む、通例使用されるいかなる経路によっても、投与することができる。同様に、本ワクチンは、一回投与、又は複数回投与に使用することができる。本発明のワクチン組成物は、ＮＡＮＢＨ若しくはＨＣＶ感染症を治療又は予防するために、免疫学的有効量の本発明ペプチドを含有する。投与単位剤型のこのような組成物は、体重１kg当り約０．１ μg 〜約１mgの本ペプチドを含有することができる。多数回に分けて投与する場合、投与単位剤型は、通常、投与量当り、適当な量に分ける。合成ペプチドを使用することの長所は、公知である。本ペプチドは、ウイルスから生物学的に誘導されるのではないため、ワクチンを接種される正常被験者を、疾患を惹起する病原に曝す危険がない。本ペプチドは、メリフィールド合成法[Merrifield (1963)J．Am．Chem．Soc．85:2149-2154 ] などの標準的な技術を用いて、容易に合成することができる。したがって、本試験試薬又はワクチンを製造する工程の間、いかなる時も、ＨＣＶが関与することがない。組換えにより発現されたタンパク質（又はペプチド）ではないペプチドを用いることによって、最小限にとどめることのできる別の問題は、ＨＣＶ融合タンパク質と共に精製した抗原性物質の存在により、偽陽性の結果が得られる割合の問題である。例えば、ある種の正常個体は、組換え体に基づく診断試験に用いられる発現系由来の抗原性物質と交差反応性であるEscherichia coli又は酵母タンパク質に対する抗体を有する。このような正常個体由来の血清は、このようなイムノアッセイにおいて、偽陽性の反応を示すが、このようなことが、本発明のイムノアッセイにおいては、排除される。更に、本発明のペプチド組成物は、合成的に調製されるため、その品質がコントロールされ、その結果、試験結果の再現性を確保することができる。また、各試験操作には、微量のペプチドしか必要とされないため、そしてペプチドを調製する費用が、比較的安いため、ＨＣＶに対する抗体についての体液スクリーニング、ＮＡＮＢＨ感染症の診断、及びワクチン調製のコストが、比較的低い。本発明により調製されるペプチド及びペプチド組成物は、これらを、酵素結合イムノアドソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素イムノドットアッセイ、受身赤血球凝集アッセイ（例えば、ＰＨＡ試験）又はその他の良く知られているイムノアッセイにおける試験試薬として使用することによって、ＨＣＶ感染症を検出及びＮＡＮＢＨを診断するために使用することができる。本発明により、いかなる適当なイムノアッセイも、本発明ペプチドと共に使用することができる。このような技術は、通常の当業者には良く知られれており、多くの標準的な免疫学のマニュアル及びテキストに記載されており、例えば、Harlow et al．(1988)によるAntibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press ,Cold Spring Harbor，NY，726 ppを参照。好ましい実施態様においては、イムノアッセイは、本発明のペプチド組成物により被覆された固相を用いたＥＬＩＳＡである。ＥＬＩＳＡ技術は、当業界においては、良く知られている。別の好ましい実施態様においては、イムノアッセイは、ＰＨＡアッセイである。本発明のイムノアッセイは、ＮＡＮＢＨ又はＨＣＶ感染症の診断において、ＮＡＮＢＨ又はＨＣＶの存在の有無について、体液及び組織をスクリーニングし、それによってこのような物質を検出し、医師を助けるために使用される。このようなスクリーニングに付すことのできる体液としては、ＨＣＶに対する抗体を含む血液及び血液分画（例えば、血清）、唾液、又はその他の液体が挙げられる。本発明の別の特徴は、哺乳類の体液（例えば、血清、組織抽出物、組織液）、 in vitroの細胞培養物の上清、及び細胞ライセートにおけるＮＡＮＢＨ又はＨＣＶ感染症の検出及び診断のためのキットに関する。本キットは、本発明の一つ又はそれ以上のペプチド（例えば、ペプチド組成物）を含有するようにした第一の容器を装備するために、コンパートメント化することができる。本発明のキットは、好ましくは、ＮＡＮＢＨ若しくはＨＣＶ感染症の検出又は診断のためのＥＬＩＳＡ或いはＰＨＡ試験キットである。ＥＬＩＳＡ試験キットとしては、本キットは、（ａ）本発明ペプチド組成物の一つにより被覆された固相を有する容器（例えば、９６穴プレート）；（ｂ）陰性コントロール試料；（ｃ）陽性コントロール試料；（ｄ）標本希釈剤、及び（ｅ）レポーター分子により標識された、ヒトＩｇＧに対する抗体を含む。レポーター分子が、酵素である場合、本キットは、該酵素の基質もまた含む。本発明キットの例示された用途においては、試験を行う試料を、必要であれば、試料希釈剤により希釈した哺乳類の体液と、存在するのであれば、いかなる抗体にも適した時間及び条件下で接触させて、容器に含まれるペプチドと結合させる。未結合物質の除去後（例えば、滅菌リン酸緩衝食塩水によって洗浄することによって）、第二の複合体を、標識された、ヒトＩｇＧに対する抗体と接触させる。これらの抗体は、第二の複合体と結合して、第三の複合体を形成する。二番目の抗体は、レポーター分子により標識されているため、これを検出手段に付すと第三の複合体が、検出される。レポーター分子は、酵素、ラジオアイソトープ、発蛍光団、生物発光分子、化学発光分子、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンなどであることができる。ＥＬＩＳＡにおいては、レポーターは、好ましくは、酵素である。実施例は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するために用いるものではない。実施例１ＥＬＩＳＡアッセイ法９６穴プレートのウエルを、特にそうでないと記載しない限り、pH９．５の１０mMＮａＨＣＯ₃ 緩衝液中５μg/mlのペプチドにより、１ウエル当り１００μＬを用いて、３７℃で１時間、被覆した。ペプチドにより被覆したウエルを、ＰＢＳ中３重量％ゼラチン２５０μL と共に、３７℃で１時間インキュベートして、非特異的タンパク質結合部位を阻害し、０．０５体積％のTWEEN 20を含むＰＢＳにより３回洗浄し、乾燥した。ＨＣＶ抗体陽性患者の血清を含む試験標本を、２０体積％の正常ヤギ血清、１重量％のゼラチン、及び０．０５体積％のTWEEN 20を含有するＰＢＳにより、体積：体積比１：２０で希釈した。希釈標本２００μL を、それぞれのウエルに加え、３７ ℃で１５分間反応させた。次に、未結合抗体を除去するために、ウエルを、ＰＢＳ中０．０５体積％のTW EEN 20により６回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させたヤギの抗ヒトＩｇＧを、陽性のウエル中に形成されるＨＣＶ抗体−ペプチド抗原複合体と結合させるための第二の抗体トレーサーとして用いた。ＰＢＳ中、１体積％の正常ヤギ血清、０．０５体積％のTWEEN 20により、１：１８００の割合で希釈した、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ１００μL を、それぞれのウエルに加え、３７℃で更に１５分間、インキュベートした。ウエルを、ＰＢＳ中、０．０５体積％のTWEEN 20により６回洗浄して、未結合抗体を除去し、pH５．０のクエン酸ナトリウム緩衝液中、０．０４重量％のオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）及び０．１２体積％の過酸化水素を含む基質混合物１００μL と反応させた。この基質混合物を用い、着色生成物を形成させることによって、ペルオキシダーゼ標識を検出した。反応は、１．０ＭＨ₂ ＳＯ₄ １００μL を加えて、停止させ、Ａ₄₉₂nm を測定した。実施例２ＮＳ−３エピトープのマッピング広範囲な血清学的解析を行って、ＮＳ−３における有用なエピトープの位置を確認した。ＮＳ−３エピトープの長さの重要性を確立するための一例を、ペプチドＬＩＣ、Ｔ５シリーズ、Ｔ６シリーズ、Ｔ７及びＴ８について、説明する。ＬＩＣは、反応性エピトープを含む８１量体である。ＨＣＶ血清とは非反応性であるＴ５及びＴ６シリーズのペプチドは、それぞれ、ＬＩＣの最大３９のアミノ末端残基及び４５のカルボキシ末端残基からなる。これもまた非反応性であるペプチドＴ７及びＴ８は、それぞれ、ＬＩＣの中央の４７及び２５のアミノ酸を含む。ＬＩＣの配列を、表１に示す。残りの配列は、以下のとおりである：これらのペプチドの免疫反応性を、組換えイムノブロッティング解析（ＲＩＢＡ、商標）により当初測定されたように、ＮＳ−３タンパク質に対して反応性を有することのわかっているＨＣＶ患者由来の市販の血清パネルに対して、実施例１に記載したように、試験した。表３に示した結果により、Ｔ５、Ｔ６、Ｔ７又はＴ８ペプチドのいずれも、このような血清とは反応性でないが、その領域に広がるＬＩＣは、高度に反応性であることが示されている。ＨＣＶ患者由来の多数の血清についても、同様の結果が得られている。実施例３セロコンバージョンパネルにおいてＬＩＣにより検出されるＮＳ−３エピトープＮＳ−３と免疫反応性であることが知られており、ＨＣＶ陽性ドナーからＮＡＮＢＨを感染させられた輸血レシピエント由来の二つのセロコンバージョンパネルについて、ペプチドＬＩＣを用いて、ＨＣＶ抗体の検出能を評価した。製造業者の指示に従い、ＲＩＢＡＨＣＶ試験システム、第二世代(Chiron Corporatio n)を用いたアッセイを行い、ＬＩＣペプチドアッセイは、実施例１に記載したとおりに行った。セロコンバージョンパネルは、両者とも、ＲＩＢＡにより測定され、表４に示したように、ＨＣＶＮＳ−３タンパク質に対する特異的抗体を有することが認められた試料を、含む。ＬＩＣペプチドは、輸血後１０５日及び１８１日において、ＮＳ−３抗体を、特異的に検出した（表４）。これらの結果は、レシピエントが、急性又は慢性ＮＡＮＢＨであったかどうかには依存していない。したがって、ＬＩＣは、ＰＴ−ＮＡＮＢＨ患者におけるＮＳ−３抗体の検出に対して感受性のあるプローブを提供する。実施例４ＰｅｐＢ−及びＰｅｐＣ−誘導ペプチドの血清学的解析ＮＳ−３に反応性であることの知られている患者の血清のパネルとの相対的免疫反応性を評価するために、表１に記載したＮＳ−３ペプチドについて（つまり、ペプチドＣ６Ｃ、３ＫＣ１０Ｃ、Ｃ１１及び３ＫＨ８は、除く）、実施例１に記載したように、ＥＬＩＳＡアッセイを行った。表５に示した結果により、試験したペプチドの全てが、かなりの免疫反応性を呈したことが示されている。実施例５分枝鎖ハイブリッド及びクラスターペプチド分枝鎖ペプチド３ＫＨ８、Ｃ６Ｃ、３ＫＣ１０Ｃ及びＣ１１（表１）の免疫反応性を、実施例１に記載したように、ＥＬＩＳＡアッセイフォーマットを用い、ＨＣＶ反応性であることが知られている４１種類の試料を含むパネル３により、試験した。表６には、これらのペプチドの結果を示す。ペプチド３ＫＨ８は、ＨＣＶコアタンパク質由来であり、Ｃ６Ｃ及びＣ１１は、ＮＳ−５タンパク質由来であり、３ＫＣ１０Ｃは、ＮＳ−４及びコアタンパク質由来である。それぞれの試料（６及び１０を除く）は、分枝鎖ペプチドの一つ又はそれ以上に反応性であった。実施例６ペプチド混合物を用いた、処方に関する研究及びＮＡＮＢＨ−関連抗体の検出ペプチド３ＫＣ１０Ｃ、３ＫＨ８、Ｃ１１及びＣ１２の混合物を、９６穴プレートのウエルに被覆し、実施例１に記載したＥＬＩＳＡ操作法を用いて、ＨＣＶ抗体に対する試験を行った。各ペプチドの配列は、表１に示し、処方は、表７に示す。これらの処方物の三つ（１、７及び８）より得た結果を、表８に報告する。最も高い感受性を示した処方物は、３ＫＣ１０Ｃ：３ＫＨ８：Ｃ１１：Ｃ１２について重量比が１：２：１：３であるものより得られた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＧ０１Ｎ 33/53 0276−2ＪＧ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/576 0276−2Ｊ 33/576 Ｚ

Claims

【特許請求の範囲】１．式：（ペプチド）−Ｙ（ペプチド）₂ Ｘ（ペプチド）₄ Ｘ₂ Ｘ（ペプチド）₈ Ｘ₄ Ｘ₂ Ｘ（ペプチド）₁₆Ｘ₈ Ｘ₄ Ｘ₂ Ｘ（式中、Ｙは、（ペプチド）のＣ末端アミノ酸のカルボキシル基上のＯＨ又はＮＨ₂ 基であり、Ｘは、それぞれの基が、ペプチド結合を形成し得る二つのアミノ基及び一つのカルボキシル基を有するアミノ酸又はアミノ酸類似体であり、そして該ペプチド部分、（ペプチド）は、ＮＡＮＢＨ関連抗体と特異的に免疫反応性である少なくとも一つのエピトープを含み、ここで該ペプチド部分は、（ａ）ＰｅｐＢ若しくはＰｅｐＣ由来のアミノ酸配列、類似体又はセグメント、或いは（ｂ）ＰｅｐＢ若しくはＰｅｐＣ、又はその類似体若しくはセグメントの約３〜約２０の連続するアミノ酸の、少なくとも一つのクラスターを含み、ここで、ＰｅｐＢ及びＰｅｐＣは、それぞれ以下のアミノ酸配列：又は該配列の一つに対応する配列であって、ＨＣＶの株若しくは単離株における対応する領域由来の配列を有し；該ペプチド部分が、二つ又はそれ以上のクラスターを含む場合、該クラスターは、結合基により結合しており、該結合基は、少なくとも一つの天然アミノ酸、非天然アミノ酸又はアミノ酸類似体であり、該二つ又はそれ以上のクラスターが、上記の配列の異なる一つ由来の配列を有する場合、該クラスターは、直接、又は該結合基により結合することができ；そして更に、該ペプチド部分は、約５０〜約１００のアミノ酸を含む）で示される少なくとも一つの直鎖又は分枝鎖ペプチドを含むペプチド組成物。２．二つ又はそれ以上の該ペプチドの混合物を含む請求の範囲第１項のペプチド組成物。３．該ペプチドが、担体と複合体を形成している請求の範囲第１項のペプチド組成物。４．該クラスターが、５〜９の連続するアミノ酸を含む請求の範囲第１項のペプチド組成物。５．該ペプチド部分が、更に、該配列の一つのセグメントを含む請求の範囲第１項のペプチド組成物。６．該ペプチドが、直鎖状である請求の範囲第１項のペプチド組成物。７．該配列が、ＰｅｐＢと表示される配列である請求の範囲第６項のペプチド組成物。８．該ペプチドが、Ｌ１Ａ、Ｌ１Ｂ、Ｌ１Ｃ、Ｌ１Ｄ、３ＫＬ１Ｃ、Ｌ４Ａ、Ｌ４Ｂ、Ｌ４Ｃ、３ＫＬ４Ｃ、Ｃ１２、Ｃ１３又はＣ１４Ａである請求の範囲第７項のペプチド組成物。９．該配列が、ＰｅｐＣと表示される配列である請求の範囲第６項のペプチド組成物。１０．該ペプチドが、Ｌ２Ａ、Ｌ２Ｂ、Ｌ２Ｃ、Ｌ２Ｄ、Ｌ３Ａ、Ｌ３Ｂ又はＬ３Ｃである請求の範囲第９項のペプチド組成物。１１．該ペプチドが、分枝鎖二量体である請求の範囲第１項のペプチド組成物。１２．該ペプチドが、３ＫＣ１４Ｂである請求の範囲第１１項のペプチド組成物。１３．ペプチドＬ１Ｃ、３ＫＬ１Ｃ、Ｌ２Ｃ、Ｌ３Ａ、３ＫＬ４Ｃ又はＣ１２を含むペプチド組成物。１４．式：（ペプチド）−Ｙ（ペプチド）₂ ｘ（ペプチド）₄ Ｘ₂ Ｘ（ペプチド）₈ Ｘ₄ Ｘ₂ Ｘ（ペプチド）₁₆Ｘ₈ Ｘ₄ Ｘ₂ Ｘ（式中、Ｙは、（ペプチド）のＣ末端アミノ酸のカルボキシル基上のＯＨ又はＮＨ₂ 基であり、Ｘは、それぞれの基が、ペプチド結合を形成し得る二つのアミノ基及び一つのカルボキシル基を有するアミノ酸又はアミノ酸類似体であり、そして該ペプチド部分、（ペプチド）は、ＨＣＶに対する抗体と特異的に免疫反応性である少なくとも一つのエピトープを含み、ここで該ペプチド部分は、以下の配列の一つ由来の第一の配列及び一つ又はそれ以上の付加配列を含み、ここでそれぞれは、該配列の異なる一つ由来であり、ここで該配列は、以下よりなる配列：該配列の一つに対応する配列であって、ＨＣＶの株若しくは単離株における対応する領域由来の配列、該配列の一つの類似体、そして該配列の一つのセグメントからなる配列群より選択され；そして更に、該ペプチド部分は、約１０〜約１００のアミノ酸を含む）で示される少なくとも一つの直鎖又は分枝鎖ハイブリッドペプチドを含むペプチド組成物。１５．該配列が、ＩＩＨ及びＶＩＩＩＥと表示される配列である請求の範囲第１４項のペプチド組成物。１６．該ペプチドが、３ＫＨ８である請求の範囲第１５項のペプチド組成物。１７．ペプチドＣ６Ｃ、３ＫＣ１０Ｃ、Ｃ１１又は３ＫＨ８を含むペプチド組成物。１８．ペプチド３ＫＣ１０Ｃ、Ｃ１１、Ｃ１２及び３ＫＨ８を含むペプチド組成物。１９．ＮＡＮＢＨ関連抗体を検出する方法であって、請求の範囲第１、８、１０、１２、１３、１４、１６、１７、１８又は２９項のいずれか１項記載のペプチド組成物の有効量を、イムノアッセイ操作に用いることを含む方法。２０．ＮＡＮＢＨ又はＨＣＶ感染症を検出する方法であって、イムノアッセイ操作において、請求の範囲第１、８、１０、１２、１３、１４、１６、１７、１８又は２９項のいずれか１項のペプチド組成物の有効量を、体液、組織又は組織抽出物と、該ペプチド組成物及び該液、該組織若しくは該組織抽出物中の抗体との間に複合体を形成させるのに十分な時間、接触させ、そして該複合体を、検出手段に付すことを含む方法。２１．該イムノアッセイ操作が、ＥＬＩＳＡ又はＰＨＡ操作である請求の範囲第１９項の方法。２２．哺乳類におけるＮＡＮＢＨ若しくはＨＣＶ感染症を治療又は予防するためのワクチン組成物であって、請求の範囲第１、１４又は２９項記載のペプチド組成物の免疫有効量及び薬剤学的に許容しうる担体を含むワクチン組成物。２３．該ペプチド組成物の該免疫有効量が、投与単位剤型において体重１kg当り約０．１μg 〜約１mgである請求の範囲第２２項のワクチン組成物。２４．ＮＡＮＢＨ若しくはＨＣＶ感染症を治療又は予防する方法であって、請求の範囲第２２項のワクチン組成物の有効量を、哺乳類に投与して、ＮＡＮＢＨ若しくはＨＣＶ感染症に対して、治療を行う、又は免疫防御抗体を誘導することを含む方法。２５．ＮＡＮＢＨ若しくはＨＣＶ感染症の検出又は診断のためのキットであって、請求の範囲第１、８、１０、１２、１３、１４、１６、１７、１８又は２９項のいずれか１項のペプチド組成物を含有するようにした第一の容器を含むキット。２６．該キットが、ＥＬＩＳＡ又はＰＨＡ試験キットである請求の範囲第２５項のキット。２７．ＮＡＮＢＨ又はＨＣＶ感染症の検出及び診断のためのＥＬＩＳＡ試験キットであって、（ａ）請求の範囲第１、８、１０、１２、１３、１４、１６、１７、１８又は２９項のいずれか１項のペプチド組成物により被覆された固相を有する容器；（ｂ）陰性コントロール試料；（ｃ）陽性コントロール試料；（ｄ）標本希釈剤；及び（ｅ）ヒトＩｇＧに対する抗体であって、該抗体が、レポーター分子により標識されている抗体を含むＥＬＩＳＡ試験キット。２８．請求の範囲第１、８、１０、１２、１３、１４、１６、１７又は１８項のいずれか１項のペプチドを含むペプチド。２９．配列番号７のアミノ酸３２〜８９のアミノ酸配列、配列番号１２のアミノ酸配列又はその類似体を含む約６０〜約１００のアミノ酸の単離された直鎖又は分枝鎖ペプチドであって、該ペプチドが、ＮＡＮＢＨ関連抗体と特異的に免疫反応性であるペプチド。３０．該ペプチドが、約７０〜約１００のアミノ酸であり、該アミノ酸配列が、配列番号７のアミノ酸２３〜９３の配列又は配列番号１２の配列である請求の範囲第２９項のペプチド。