ES2365800T3 - Secuencias de proteína del núcleo de vhc. - Google Patents

Secuencias de proteína del núcleo de vhc. Download PDF

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ES2365800T3 ES02257656T ES02257656T ES2365800T3 ES 2365800 T3 ES2365800 T3 ES 2365800T3 ES 02257656 T ES02257656 T ES 02257656T ES 02257656 T ES02257656 T ES 02257656T ES 2365800 T3 ES2365800 T3 ES 2365800T3
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Ortho Clinical Diagnostics Inc
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Abstract

Un kit para la detección de VHC que comprende A) una fase sólida revestida con proteína del núcleo de VHC modificada, proteína que no es del núcleo de VHC y al menos un anticuerpo monoclonal anti-núcleo de VHC, y B) un anticuerpo monoclonal anti-núcleo de VHC marcado, en el que la proteína del núcleo modificada de la parte A) se ha modificado por sustitución de uno o más aminoácidos o deleción de uno o más aminoácidos en al menos dos de las siguientes regiones de la proteína del núcleo de VHC: i) restos 1-10; ii) restos 30-37; iii) restos 43-50; y iv) restos 77-130, retirándose de esta manera los sitios de unión de los anticuerpos monoclonales anti-núcleo de la parte A) y parte B), y en el que no están alterados los restos de aminoácidos 11-29, 38-42 y 51-76 de la proteína del núcleo de VHC.

Description

5
10
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Antecedentes de la Invención
Un numero estimado de 170 millones de personas en todo el mundo se han infectado con el virus de LA hepatitis C (VHC). En los próximos años, el número de muertes en los Estados Unidos por cáncer y enfermedad hepática producida por VHC puede superar a las muertes producidas por el Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA).
La transmisión del VHC parece requerir un contacto sangre -sangre. Al llevar una sola cadena de acido ribonucleico (ARN), el VHC contiene un solo gen, que codifica una poliproteína que posteriormente se escinde en al menos 10 proteínas funcionales. Claramente, la capacidad de ensayar en el torrente sanguíneo el VHC tiene una gran importancia. Seria útil un ensayo sensible que pudiera detectar la infección en una fase temprana.
Los ensayos de detección del VHC típicamente detectan anticuerpos contra el virus VHC. Estos anticuerpos se detectan en inmunoensayos usando proteínas y péptidos recombinantes que contienen secuencias de las proteínas de VHC. La mayoría de los ensayos anti-VHC comerciales usan proteínas de las siguientes regiones: proteína del núcleo, y secuencias de proteínas NS3, NS4 y NS5.
Los anticuerpos anti-núcleo de VHC son uno de los anticuerpos anti-VHC mas extendidos detectados en los individuos infectados con VHC de forma crónica. La proteína del núcleo de VHC contiene múltiples epítopos. Usando péptidos sintéticos de la región del núcleo de VHC, se ha demostrado que la mayoría de estos epítopos están en el extremo amino terminal de esta proteína. Por ejemplo, usando péptidos solapantes, cada uno de aproximadamente 15 aminoácidos de longitud, se creó un ELISA para explorar anticuerpos anti-VHC en individuos infectados con VHC de forma crónica. La Tabla 1 presentada a continuación muestra las secuencias peptídicas. Como se muestra en la Tabla 2 presentada más adelante, los individuos infectados con VHC tienen anticuerpos contra dos o más de esos péptidos del núcleo. De esta manera, se ha mostrado que no se necesita el péptido del núcleo completo para detectar anticuerpos anti-núcleo.
Tabla 1
0 MSTNPKPQKKNKRNT 1-15 SEC ID Nº: 1 1 KNKRNTNRRPQDVKF 10-24 SEC ID Nº: 2 2 QDVKFPGGGQIVGGV 20-34 SEC ID Nº: 3 3 QIVGGVYLLPRRGPR 29-43 SEC ID Nº: 4 4 RRGPRLGVRATRKTS 39-53 SEC ID Nº: 5 5 ATRKTSERSQPRGRR 48-62 SEC ID Nº: 6 6 PRGRRQPIPKARRPE 58-72 SEC ID Nº: 7 7 KARRPEGRTWAQPGY 67-81 SEC ID Nº: 8 8 AQPGYPWPLYGNEGC 77-91 SEC ID Nº: 9 9 YGNEGCGWAGWLLSP 86-100 SEC ID Nº: 10 10 WLLSPRGSRPSWGPT 96-110 SEC ID Nº: 11 11 SWGPTDPRRRSRLNG 106-120 SEC ID Nº: 12 12 SRLNGKVIDTLTCGF 116-130 SEC ID Nº: 3 13 LTCGFADLMGYIPLV 126-140 SEC ID Nº: 14 14 YIPLVGAPLGGAARA 136-150 SEC ID Nº: 15 15 GAARALAHGVRVLED 146-160 SEC ID Nº: 16 16 RVLEDGVNYATGNLP 156-170 SEC ID Nº: 17 17 TGNLPGCSFSIFLLA 166-180 SEC ID Nº: 8
Tabla 2 (continuación) (continuación) (continuación) (continuación) (continuación)
Péptido
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg
0,04 4 0,04 5 0,05 0 0,01 4 0,01 5 0,01 3 0,01 6 0,00 4 0,06 5 0,00 3 0,04 3 0,03 9 0,03 6 0,00 4 0,02 1 0,01 7 0,01 4 0,13 4 0,11 9 0,12 6 0,10 4 0,075 0,081 0,075 0,023 0,021 0,027 0,020 0,059 0,051 0,087 0,034 0,033 0,053 0,039 0,069 0,081 0,079 0,039 0,030 0,032 0,034 0,076 0,103 0,094 0,034 0,030 0,037 0,003 0,103 0,111 0,102 0,039 0,034 0,042 0,041 0,020 0,033 0,025 0,012 0,013 0,013 0,019 0,034 0,035 0,034 0,018 0,019 0,016 0,019 0,002 0,002 0,002 -0,001 0,000 0,001 0,000 0,088 0,085 0,071 0,025 0,026 0,037 0,041 0,051 0,038 0,038 0,009 0,011 0,013 0,011 0,028 0,030 0,033 0,009 0,010 0,009 0,017 0,023 0,023 0,021 0,008 0,005 0,009 0,006 0,034 0,030 0,031 0,013 0,012 0,012 0,010 0,041 0,038 0,039 0,010 0,010 0,009 0,008 0,042 0,052 0,047 0,020 0,016 0,017 0,021
9 11 15
0,25 6 0,41 3 0,04 4 2,50 0 2,50 0 0,66 1 2,50 0 2,50 0 2,50 0 0,425 0,917 0,067 1,443 0,229 0,577 0,106 0,647 0,057 0,218 0,114 0,110 0,248 0,262 0,072 0,062 0,166 0,061 0,015 0,159 0,032 0,025 0,002 -0,003 0,049 0,055 0,045 0,030 0,022 0,018 0,013 0,027 0,031 0,012 0,021 0,020 0,021 0,042 0,039 0,012 0,247 0,035 0,028 0,088 0,080
Péptido 18 20 21 27 30 35
0 1,64 3 0,02 1 2,50 0 0,03 2 2,50 0 0,02 2 1 0,88 7 0,11 1 2,50 0 2,50 0 2,50 0 0,27 8 2 2,50 0 2,50 0 2,50 0 2,50 0 2,50 0 0,91 2 3 0,641 2,500 2,262 0,089 2,500 0,031 4 0,100 0,482 2,500 2,500 0,183 0,036 5 0,052 0,032 0,516 1,652 0,044 0,116 6 0,032 0,029 2,259 1,349 0,075 0,079 7 0,576 0,045 0,080 0,043 0,993 0,049 8 0,037 0,028 0,378 0,039 0,078 0,062 9 0,022 0,015 0,018 0,034 0,035 0,010 10 -0,001 0,011 0,022 0,033 0,028 0,005 11 0,040 0,035 0,064 0,026 0,190 0,026 12 0,006 0,009 0,013 0,012 0,023 0,005 13 0,010 0,014 0,024 0,018 0,025 0,006 14 0,009 0,009 0,017 0,013 0,022 0,009 15 0,025 0,017 0,024 0,028 0,028 0,020 16 0,036 0,019 0,135 0,287 0,042 0,007 17 0,039 0,059 0,035 0,008 0,043 0,020
36 37 39
0,05 9 2,50 0 0,16 5 0,12 9 2,50 0 2,50 0 2,50 0 2,50 0 2,50 0 0,090 0,219 2,500 0,131 0,130 0,124 0,060 0,090 1,217 0,093 0,169 2,351 0,148 0,223 2,500 0,090 0,147 0,397 0,037 0,040 0,056 0,003 0,018 0,015 0,050 0,065 1,319 0,018 0,016 0,017 0,060 0,051 0,050 0,077 0,051 0,056 0,062 0,025 0,041 0,129 0,080 0,200 0,079 0,110 0,190
Péptido 40 42 43 44 45 46 47 48 49
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 0,05 8 2,50 0 2,50 0 2,500 0,098 0,066 0,060 0,755 0,093 0,024 0,000 0,059 0,013 0,028 0,017 0,032 0,068 0,101 0,02 2 0,04 3 2,50 0 0,031 0,023 0,150 0,018 0,036 0,023 0,011 -0,001 0,032 0,005 0,014 0,006 0,010 0,012 0,031 0,15 8 0,61 2 0,36 8 0,033 0,065 0,103 0,069 0,075 0,053 0,051 0,001 0,055 0,025 0,022 0,015 0,023 0,029 0,035 0,04 2 2,24 0 2,50 0 0,511 0,070 0,060 0,086 0,301 0,108 0,066 -0,002 0,143 0,028 0,041 0,028 0,047 0,061 0,076 1,00 2 2,50 0 2,50 0 0,174 0,713 0,055 0,129 1,722 1,896 0,029 -0,003 0,069 0,038 0,038 0,055 0,022 0,136 0,039 0,01 6 0,03 1 2,50 0 0,022 0,021 0,021 0,038 0,035 0,031 0,027 -0,002 0,027 0,016 0,015 0,013 0,026 0,019 0,037 2,48 4 2,50 0 2,50 0 0,449 0,750 0,593 0,102 2,006 0,331 0,017 -0,004 0,034 0,012 0,014 0,007 0,026 0,014 0,032 0,42 7 0,20 1 2,50 0 0,364 0,356 0,038 0,049 0,070 0,027 0,029 -0,001 0,040 0,018 0,011 0,013 0,025 0,014 0,095 0,01 9 0,48 3 2,50 0 0,044 0,045 0,047 0,050 0,246 0,039 0,025 -0,005 0,033 0,019 0,014 0,013 0,030 0,016 0,085
Péptido 50 52 53 54 55
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 0,66 8 2,50 0 2,50 0 0,568 1,233 0,277 0,154 2,500 0,882 0,024 -0,001 0,035 0,014 0,012 0,007 0,017 0,044 0,055 2,50 0 2,50 0 2,50 0 0,948 1,116 1,619 0,026 0,267 0,112 0,019 0,026 0,042 0,012 0,007 0,009 0,019 0,008 0,044 0,82 3 2,50 0 2,50 0 0,428 2,500 0,780 0,086 2,500 1,566 0,025 0,001 0,050 0,014 0,020 0,011 0,022 0,019 0,028 1,57 7 2,50 0 2,50 0 2,500 2,500 2,500 2,500 2,500 2,500 0,020 0,032 0,053 0,021 0,012 0,012 0,020 0,017 0,038 0,01 7 0,08 3 2,50 0 0,047 0,018 0,023 0,071 0,042 0,019 0,017 -0,002 0,026 0,015 0,015 0,012 0,026 0,014 0,030
58 59 60 62
2,50 0 2,50 0 2,50 0 2,283 2,500 2,500 2,500 2,500 0,810 0,037 0,073 0,067 0,018 0,019 0,021 0,025 0,159 0,059 0,01 5 1,80 5 2,50 0 0,023 2,500 0,019 0,180 0,038 0,070 0,039 0,027 0,017 0,012 0,015 0,018 0,015 0,023 0,049 0,05 3 2,50 0 2,50 0 0,255 2,500 0,102 1,266 0,666 2,500 0,034 -0,003 0,153 0,026 0,019 0,022 0,039 0,097 0,063 0,01 8 0,05 3 2,50 0 1,178 0,025 0,031 0,041 0,060 0,028 0,017 -0,002 0,039 0,013 0,012 0,010 0,017 0,010 0,048
Péptido 63 65 66 67 68 70 73 75 78
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 0,00 9 0,01 6 0,02 7 0,012 0,017 0,013 1,225 0,028 0,012 0,017 -0,004 0,026 0,007 0,007 0,006 0,010 0,057 0,020 1,44 0 0,04 1 0,02 6 0,040 0,032 0,056 0,052 0,062 0,020 0,040 0,023 0,051 0,018 0,023 0,023 0,019 0,020 0,035 2,06 0 2,50 0 2,50 0 1,030 2,500 0,508 0,144 2,500 2,500 0,013 0,009 0,060 0,007 0,009 0,009 0,014 0,025 0,018 2,50 0 2,50 0 2,50 0 2,500 2,500 1,338 0,406 2,500 0,135 0,031 0,003 0,091 0,021 0,027 0,028 0,032 0,042 0,077 2,50 0 2,50 0 2,50 0 1,105 0,415 0,358 1,025 2,500 0,263 0,028 0,006 0,039 0,023 0,025 0,022 0,024 0,034 0,037 0,74 5 2,50 0 2,50 0 0,342 2,500 0,200 0,049 0,075 1,730 0,030 0,009 0,119 0,015 0,025 0,022 0,027 0,056 0,050 0,03 1 2,39 2 2,50 0 0,049 0,629 0,935 0,596 1,119 0,081 0,040 0,009 0,052 0,028 0,036 0,031 0,038 0,043 0,059 0,03 7 2,50 0 2,50 0 1,435 1,342 0,107 0,287 0,094 0,080 0,049 0,012 0,031 0,013 0,030 0,017 0,021 0,058 0,050 2,50 0 2,50 0 2,50 0 0,269 2,500 0,298 0,051 2,500 0,040 0,057 0,006 0,084 0,013 0,022 0,014 0,021 0,022 0,030
Péptido 80 84 90
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 0,28 0 2,50 0 2,50 0 0,674 0,318 0,972 0,048 2,118 0,040 0,021 0,022 0,024 0,015 0,010 0,008 0,014 0,066 0,031 0,01 2 0,07 5 2,50 0 0,025 0,190 0,145 0,106 0,099 0,019 0,028 0,050 0,018 0,009 0,010 0,009 0,013 0,009 0,026 0,01 9 0,30 6 2,50 0 0,039 2,500 0,689 0,033 0,301 0,195 0,021 0,005 0,033 0,011 0,017 0,010 0,013 0,014 0,018
5
10
15
20
25
30
35
40
Un informe reciente indica que la proteína del núcleo de VHC puede detectarse en individuos infectados con VHC antes de la aparición de anticuerpos anti-VHC. (S. Lee y col., Vox Sanguinis, 2001; 80: 19-23). Por lo tanto, los presentes solicitantes sugieren que una forma más eficaz de detección precoz de infección por VHC seria un ensayo de combinación capaz de detectar la proteína del núcleo de VHC y anticuerpos anti-VHC que incluyen anticuerpos anti-núcleo.
Sumario de la invención
La presente invención describe péptidos y proteínas recombinantes que contienen la secuencia de la proteína del núcleo del virus de la Hepatitis C en la que uno o más de los aminoácidos se han modificado o delecionado para eliminar la capacidad de estas proteínas de unirse a anticuerpos monoclonales murinos anti-VHC específicos. Estas modificaciones se realizaron en las regiones subrayadas mostradas en la Tabla 3 presentada más adelante. Las deleciones y modificaciones se diseñan para mantener la capacidad de esta proteína de usarse en inmunoensayos usados para la detección de anticuerpos anti-VHC en individuos infectados con VHC. Estas proteínas del núcleo modificadas pueden usarse en un ensayo de combinación para la detección simultánea de proteína del núcleo de VHC y anticuerpos anti-VHC. En el ensayo de combinación podrá detectar VHC antes que los ensayos de anticuerpo usados actualmente.
Descripción detallada de la invención
Un objeto de la invención es desarrollar secuencias peptídicas que puedan detectar anticuerpos anti-VHC en presencia de anticuerpos monoclonales anti-núcleo para detectar antígeno del núcleo de VHC. Por lo tanto, un uso de estos antígenos del núcleo modificados será usarlos en un ensayo de anti-VHC/núcleo de VHC, o un “ensayo de combinación”.
Para este fin, dos o más anticuerpos monoclonales de la Tabla 4 pueden aplicarse conjuntamente como un revestimiento con una o más proteínas del núcleo de VHC modificadas en una fase sólida, permitiendo de esta manera que la fase sólida capture anticuerpos anti-núcleo de VHC y antígeno del núcleo. La modificación se realiza eliminando el epítopo para el anticuerpo que se usa para la detección o captura del núcleo de VHC. La eliminación de epítopos puede conseguirse por medios conocidos en la técnica tales como la deleción de partes de la secuencia del núcleo o la alteración de aminoácidos en la secuencia del epítopo. Esto puede conseguirse, por ejemplo, sintetizando estos péptidos por síntesis química usando sintetizadores de péptidos disponibles en el mercado o modificando clones recombinantes que expresan la proteína del núcleo de VHC. Las secuencias recombinantes pueden modificarse por mutagénesis de un solo o de múltiples sitios dependiente de cebador o deleciones dependientes de cebador. (B. Tao y K.C. Lee, PCR Technology Current Innovations, 1994 por CRC Press, Inc., Capítulo 10, Mutagenesis by PCR).
Otro objeto de la invención es identificar regiones inmunodominantes de proteína del núcleo de VHC.
Otro objeto de la presente invención es determinar el patrón de reactividad con péptidos del núcleo entre individuos infectados con VHC que presentan anticuerpos anti-núcleo.
Los péptidos de la invención se generaron manteniendo las partes altamente reactivas de la proteína del núcleo y realizando modificaciones en las partes restantes de la secuencia de tal forma que el péptido no se detectara por un anticuerpo usado para detectar la proteína del núcleo en un ensayo.
En una realización preferida, el péptido se modificaría por sustitución de aminoácidos o deleción de aminoácidos en las regiones subrayadas en la Tabla 3. El resto de la secuencia mostrada en la Tabla 3 no debería alterarse.
En otra realización preferida, los péptidos se usarían en un ensayo de combinación. Éste es uno que es capaz de detectar simultáneamente tanto antígenos de VHC como anticuerpos contra VHC.
Tabla 3
Secuencia de proteína del núcleo de VHC:
SEC ID Nº: 19
imagen1
La eficacia y ventajas de la invención se ilustran adicionalmente por los siguientes ejemplos.
Ejemplo 1
Péptidos sintéticos
Se usaron péptidos sintéticos que incluían la secuencia entera de la secuencia de la proteína del núcleo de VHC. Se
5 sintetizaron químicamente dieciocho péptidos solapantes mostrados en la Tabla 1 por síntesis de péptidos en fase sólida usando un sintetizador de péptidos. Todos los péptidos se sintetizaron con un resto de cisteína amida C-terminal. Los péptidos se escindieron de la resina y se purificaron por cromatografía líquida de fase inversa. La pureza de cada uno de estos péptidos, basada en el análisis de HPLC de fase inversa, fue mayor del noventa y cinco por ciento (95%). La secuencia de cada péptido se confirmó por análisis de aminoácidos del hidrolizado ácido
10 del péptido. Las identidades estructurales de los péptidos se confirmaron por espectrometría de masas. Todos los péptidos tenían el peso molecular esperado.
Ejemplo 2
Se aplicaron péptidos sintéticos como un revestimiento sobre micropocillos Immulon 2 (fabricados por Dyanatech) en tampón borato 50 Mm a una concentración de 1 ug/ml. A cada micropocillo se le añadieron 200 ul de solución de 15 péptido y los micropocillos se incubaron a 25 grados centígrados durante 16-20 horas. Los micropocillos se aspiraron y se lavaron una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía TWEEN 20 para retirar todo el péptido no unido. Los micropocillos después se revistieron con 300 ul de PBS que contenía albúmina de suero bovino (BSA) al uno por ciento (1%) y sacarosa al tres por ciento (3%) para bloquear todos los sitios de unión de proteína disponibles. Después de 2-4 horas, las placas se aspiraron, se secaron con Turbo Dryer y se
20 almacenaron en bolsas selladas a 2-8 grados centígrados.
Ejemplo 3
ELISA de péptido sintético
La muestra, 10 ul en 200 ul de diluyente, que se sospechaba que estaba infectada con VHC, se añadió al micropocillo revestido con péptido. Después de la incubación durante aproximadamente una hora, los micropocillos
25 se lavaron. A los micropocillos lavados se les añadió IgG anti-humana marcada con peroxidada de rábano picante. Después de una incubación durante treinta minutos, los micropocillos se lavaron y se añadió a cada pocillo una solución de tampón orto-fenilenediamina y peróxido de hidrogeno. Después de aproximadamente 30 minutos, se añadió ácido sulfúrico a cada pocillo para detener la reacción. Un color naranja o amarillo indicó la presencia de anticuerpos anti-VHC en la muestra.
30 Tabla 4
Anticuerpos Monoclonales
La tabla mostrada a continuación identifica 15 anticuerpos. Los anticuerpos se exploraron en cada etapa de desarrollo de anticuerpo con placas de pocillos de microtitulación revestidas con inmunógeno. El inmunógeno usado para inmunizar los ratones que producían cada cepa de anticuerpo monoclonal se identifica como uno de los siguientes: péptido ODS 243, un péptido grande definido adicionalmente en el Ejemplo 1; "FLC" significa antígeno del núcleo de longitud completa, definido en el Ejemplo 1; o péptido del núcleo nº 8 conjugado con KLH, un péptido corto, definido adicionalmente en la presente memoria. Se muestra la especificidad de cada uno por un péptido numerado y las secuencias de aminoácidos de cada péptido numerado se identifican en la presente memoria. Además, en la última columna se incluye el epítopo al que se une específicamente el anticuerpo, definido por los aminoácidos que codifican el epítopo.
ATCC nº
FUSIÓN-AG nº, clon IMMUNÓGENO ISOTIPO ESPECIFICIDAD AA
PTA-3811
ODS243,7B4F11 Péptido ODS 243 IgG 2b Péptido número 8 del núcleo de VHC 77-91
PTA-3803
ODS243,1E3D12 Péptido ODS 243 IgG2a Péptido número 9 del núcleo de VHC 86-100
PTA-3802
ODS243,7C12C4 Péptido ODS 243 IgG2b Péptido número 8 del núcleo de VHC 77-91
PTA-3813
core#3, 2A11C6 FLC IgG1 Péptido número 11 del núcleo de VHC 106120
PTA-3809
Core#12, 1B7A1 FLC IgG1 Péptido número 3 del núcleo de VHC 29-43
PTA-3805
Core#13, 5A12G12 FLC IgG1 Péptido número 4 del núcleo de VHC 39-53
PTA-3812
Core#13, 4H7E7 FLC IgG1 Péptido número 5 del núcleo de VHC 48-62
(continuación)
PTA-3806
Core#13, 12F4A11 FLC IgG1 Péptido número 6 del núcleo de VHC 58-72
PTA-3804
Core#13, 14D12A12 FLC IgG1 Péptido número 7 del núcleo de VHC 67-81
PTA-3807
c22-8#4, 6D8E8 Péptido número 8 del núcleo conjugado con KLH IgG1 Péptido número 8 del núcleo de VHC 77-91
PTA-3800
Core#12, 4G10G6 FLC IgG2b Péptido número 10 del núcleo de VHC 96-110
PTA-3801
Core#13, 6E7E1 FLC IgG2a Péptido número 11 del núcleo de VHC 106120
PTA-3810
Core#13, 11D12A6 FLC IgG2b Péptido número 11 del núcleo de VHC 106120
PTA-3808
Core#13, 14B7C3 FLC IgG3 Péptido número 11 del núcleo de VHC 106120
PTA-3799
Core#12, 4A6H3 FLC IgG1 Péptido número 16 del núcleo de VHC 156170
Ejemplo 4
Uso de péptidos del núcleo modificados en una ELISA anti-VHC
5 Se sintetizó químicamente un péptido que consistía en los aminoácidos 1-43 de la región inmunodominante del núcleo de VHC. También se sintetizó otro péptido con ciertas deleciones en esta región, particularmente se delecionaron los aminoácidos 1-8 y 31-33. Estos péptidos se usaron para ensayar muestras de suero de 40 pacientes crónicos de VHC con respecto al estado de anticuerpo anti-VHC. Los resultados indicaron que 39 de los 40 pacientes no estaban afectados por la deleción de esas secuencias. Los péptidos de deleción pueden usarse en
10 combinación con anticuerpos monoclonales anti-VHC, tales como los mostrados en la Tabla 4, en un ensayo de combinación. Pueden usarse péptidos con deleciones de aminoácidos 31-33 con cualquiera de los anticuerpos monoclonales mostrados en la Tabla 4.
Tabla 5
Péptido/Espécimen ID
265-2 266-2 271-2 272-2
11
2.500 2.500 2.500 2.500
15
2.500 2.500 2.500 2.500
18
2.500 2.500 2.500 2.500
20
2.500 2.500 2.500 2.500
21
2.500 2.500 2.500 2.500
27
2.500 2.500 2.500 2.500
30
2.500 2.500 2.500 2.500
35
0.762 0.911 0.507 0.611
36
2.500 2.500 2.500 2.500
37
2.500 2.500 2.500 2.500
39
2.500 2.500 2.500 2.500
40
2.500 2.500 2.500 2.500
42
2.500 2.500 2.500 2.500
43
1.621 1.255 1.382 1.443
44
2.500 2.500 2.500 2.500
45
2.500 2.500 2.500 2.500
(continuación)
Tabla 5
Péptido/Espécimen ID
265-2 266-2 271-2 272-2
46
2.003 1.863 1.058 1.829
47
2.500 2.500 2.500 2.500
48
2.500 2.500 2.500 2.500
49
2.500 2.500 2.500 2.500
50
2.500 2.500 2.500 2.500
52
2.500 2.500 2.500 2.500
53
2.500 2.500 2.500 2.500
54
2.500 2.500 2.500 2.500
55
2.500 2.500 2.500 2.500
58
2.500 2.500 2.500 2.500
59
2.500 2.500 2.500 2.500
60
2.500 2.500 2.500 2.500
62
2.500 2.500 2.500 2.500
65
0.056 0.045 2.237 1.704
66
2.500 2.500 2.500 2.500
67
2.500 2.500 2.500 2.500
68
2.500 2.500 2.500 2.500
70
2.500 2.500 2.500 2.500
73
2.500 2.500 2.500 2.500
75
2.500 2.500 2.500 2.500
78
2.500 2.500 2.500 2.500
80
2.500 2.500 2.500 2.500
84
2.500 2.500 2.170 2.500
90
2.500 2.500 2.500 2.500
Péptido 265 Secuencia de Aminoácidos de Poliproteína de VHC 10-43
Péptido 266 Secuencia de Aminoácidos de Poliproteína de VHC 8-43
Péptido 271 Secuencia de Aminoácidos de Poliproteína de VHC 1-43 con AA 31, 32 y 33 delecionados
Péptido 272 Secuencia Consenso de la Secuencia de Aminoácidos de Poliproteína de VHC 1-43
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. 5 <120> Secuencias de proteína del núcleo de VHC
<130> CDS-0288
<150> 60/347.303
<151> 11-11-2001
<160> 19 15 <170> PatentIn versión 3.1
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213>
Virus de la hepatitis C 25 <400> 1
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> Virus de la hepatitis C
<400> 2
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> Virus de la hepatitis C
<400> 3
<210> 4
<211> 15
<212> PRT
<213> Virus de la hepatitis C
<400> 4
<210> 5
<211> 15
<212> PRT
<213>
Virus de la hepatitis C 20 <400> 5
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15
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<210> 6
25
<211> 15
<212> PRT 30 <213> Virus de la hepatitis C
<400> 6
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35
<210> 7
<211> 15
40
<212> PRT
<213> Virus de la hepatitis C
45
<400> 7
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<210> 8
<211> 15
<212> PRT
<213> Virus de la hepatitis C
<400> 8
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<210> 9
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<212> PRT
<213> Virus de la hepatitis C
<400> 9
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<210> 10
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<400> 10
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<212> PRT
<213> Virus de la hepatitis C
45
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<210> 12
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<213> Virus de la hepatitis C
<400> 12
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<210> 13
<211> 15
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<210> 14
<211> 15
<212> PRT
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<400> 14
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<210> 15
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<400> 15
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<210> 16
<211> 15
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<400> 16
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<210> 17 10 <211> 15
<212> PRT
<213> Virus de la hepatitis C
15
<400> 17
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20 <210> 18
<211> 15
<212> PRT
25
<213> Virus de la hepatitis C
<400> 18
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30
<210> 19
<211> 130 35 <212> PRT
<213> Virus de la hepatitis C
<400> 19
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Claims (6)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un kit para la detección de VHC que comprende
    A) una fase sólida revestida con proteína del núcleo de VHC modificada, proteína que no es del núcleo de VHC y al menos un anticuerpo monoclonal anti-núcleo de VHC, y B) un anticuerpo monoclonal anti-núcleo de VHC marcado,
    en el que la proteína del núcleo modificada de la parte A) se ha modificado por sustitución de uno o más aminoácidos o deleción de uno o más aminoácidos en al menos dos de las siguientes regiones de la proteína del núcleo de VHC:
    i) restos 1-10; ii) restos 30-37; iii) restos 43-50; y iv) restos 77-130,
    retirándose de esta manera los sitios de unión de los anticuerpos monoclonales anti-núcleo de la parte A) y parte B), y en el que no están alterados los restos de aminoácidos 11-29, 38-42 y 51-76 de la proteína del núcleo de VHC.
  2. 2.
    El kit de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la proteína que no es del núcleo de VHC se selecciona entre c200-3 y NS5.
  3. 3.
    El kit de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el anticuerpo monoclonal anti-VHC marcado está marcado con una enzima, un fluoróforo o un marcador radiactivo.
  4. 4.
    El kit de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la fase sólida es un pocillo de microtitulación, perla de poliestireno, perla magnética o membrana.
  5. 5.
    Una proteína del núcleo de VHC modificada, en la que la proteína del núcleo se ha modificado por sustitución de uno o más aminoácidos o deleción de uno o más aminoácidos en al menos dos de las siguientes regiones de la proteína del núcleo de VHC:
    i) restos 1-10; ii) restos 30-37; iii) restos 43-50; y iv) restos 77-130,
    y en el que los restos de aminoácidos 11-29, 38-42 y 51-76 de la proteína del núcleo de VHC no están alterados.
  6. 6. La proteína del núcleo de VHC modificada de la reivindicación 5, en la que se han delecionado los aminoácidos MSTNPKPQ (restos 1-8) y los aminoácidos VGG (restos 31-33) de la proteína del núcleo de VHC.
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