KR0158434B1

KR0158434B1 - C형 간염 바이러스에 대한 항체 검출 및 면역원으로 유용한 합성 펩타이드

Info

Publication number: KR0158434B1
Application number: KR1019950034372A
Authority: KR
Inventors: 박해준; 변시명; 하영주; 안종성; 도현주; 이승찬; 문홍모
Original assignee: 허영섭; 재단법인목암생명공학연구소
Priority date: 1995-10-06
Filing date: 1995-10-06
Publication date: 1998-11-16
Also published as: KR970021095A

Abstract

본 발명은 C형 간염 바이러스에 대한 항체 검출 및 면역원으로 유용한 합성 펩타이드에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 C형 간염 바이러스의 유전자 구조 중 핵(core), 비구조4(NS4) 또는 비구조5(NS5) 부위에서 항원성 및 면역원성이 확인된 특정 아미노산 배열에 대한 합성 펩타이드 및 그의 C형 간염 바이러스 감염에 대한 진단시약, 항체생산 유도용 항원과 예방용 백신으로서의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 합성 펩타이드는 화학적으로 용이하게 합성될 수 있으므로, 시험시약의 제조과정 중 HCV 감염의 위험성이 없고, 우수한 감도와 특이도를 가지고 HCV에 대한 항체를 검출하며, 매우 적은 양의 펩타이드만으로도 우수한 효과를 나타내므로 펩타이드의 제조비용이 절감되며, 그 결과로서 HCV에 대한 항체의 검출 또는 백신 제조에 소요되는 비용이 절감된다.

Description

C형 간염 바이러스에 대한 항체 검출 및 면역원으로 유용한 합성 펩타이드

제1도는 C형 간염 바이러스-J 유전자의 핵(core), 외피1(E1), 외피 2/비구조1(E2/NS1), 비구조2(NS2), 비구조3(NS3), 비구조4(NS4) 및 비구조5(NS5) 부위의 아미노산 배열을 나타낸다.

제2도는 C형 간염 바이러스의 핵 부위를 구성하는 아미노산의 친수성을 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.

제3도는 C형 간염 바이러스의 비구조4 부위를 구성하는 아미노산의 친수성을 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.

제4도는 C형 간염 바이러스의 비구조5 부위를 구성하는 아미노산의 친수성을 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.

본 발명은 C형 간염 바이러스에 대한 항체 검출 및 면역원으로 유용한 합성 펩타이드에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 C형 간염 바이러스의 유전자 구조 중 핵(cord), 비구조4(NS4) 또는 비구조5(NS5) 부위에서 항원성 및 면역원성이 확인된 특정 아미노산 배열에 대한 합성 펩타이드 및 그의 C형 간염 바이러스 감염에 대한 진단시약, 항체생산 유도용 항원과 예방용 백신으로서의 용도에 관한 것이다.

알터(Alter) 등은 혈액내에 B형 간염 바이러스의 표면 항원(HBsAg)을 가지고 있다고 판명된 자의 헌혈을 배제하면, 수혈 후의 간염 발병빈도를 크게 감소시킬 수 있다고 보고하고 있지만(참조: Alter H.J. et al., Lancet, 2:838(1975)), 매년 수혈을 받는 사람 중에서 여전히 간염에 걸리는 비율은 높은 것으로 확인되었다. 수혈 후의 간염 발병사례의 90%는 A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스와 관계없는 특정 바이러스, 예를 들면, 엡스타인-바 바이러스(Epstein-Barr virus), 사이토메갈로 바이러스(Cytomegalovirus) 또는 간질병을 유발하는 다른 바이러스가 병원학적 인자인 것으로 판명되었으며, 이를 A형도 B형도 아닌 간염(non-A, non-B Hepatitis, 이하, 'NA NBH'라 함)이라고 명명하였다. NANBH에 걸린 사람들의 2/3 이상은 평생 남에게 그 병을 전염시킬 수 있는 만성적인 형태로 발전하며, 그중 일부는 간경변증과 간암으로 진전되기도 한다.

츄(Choo) 등은 NANBH 발병 바이러스가 포함된 인간 혈장을 침팬지에 감염시키고, 이 침팬지 혈장으로 부터 cDNA 라이브러리를 제조한 다음, NANBH로 진단된 환자의 혈청을 이용하여 NANBH에만 있는 항원을 암호화하는 cDNA 클론을 분리하였다. 이 클론은 토가바이러스과(Togaviridae)나 플라비바이러스과(Flaviviridae)에 속하는 바이러스와 유사한 바이러스의 유전자로 부터 제조된 것으로 밝혀졌으며, 전기 클론의 바이러스를 C형 간염 바이러스(Hepatitis C virus, 이하, 'HCV'라 함)라 명명하였다(참조: Choo Q.-L. et al., Science, 244:359(1989)).

HCV는 몇개의 구조 및 비구조 단백질로 이루어진 하나의 폴리펩타이드를 암호화하고 있는 약 1 × 10³개의 염기로 구성된 RNA 바이러스이다(참조: Okamoto H. et al., J. Exp. Med., 60:167(1990); Choo et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88: 2451(1991); Kato N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87:9524(1990)). HCV의 유전자 구조는 플라비바이러스(Flavivirus)나 페스티바이러스(Pestivirus)와 유사성을 가지며, 이들 유연관계로 부터 HCV의 폴리펩타이드는 아미노 말단으로 부터 핵(core) - 외피1(E1) - 외피2/비구조1(E2/NS1) - 비구조2(NS2) - 비구조3(NS3) - 비구조4(NS4) - 비구조5(NS5) 순으로 구성되어 있는 것으로 추정하고 있다(참조: Choo et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88:2451(1991); Kato N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87:9524(1990)). HCV 유전자의 전체 아미노산 배열은 여러 연구자들에 의해서 밝혀졌는데, 각 연구자가 분리한 HCV 클론에 따라 아미노산 배열에 약간의 차이가 있으나, 각 HCV 클론은 70% 내지 90% 정도의 아미노산 유사성을 나타내고 있다(참조: Kato N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87:9524(1990)).

전기 HCV 유전자 구조 중에서 핵 영역(아미노산 배열 1번부터 120번까지)은 길이가 같은 두개의 서로 다른 펩타이드 즉, 아미노산 배열 1번부터 61번까지의 펩타이드 및 62번부터 120번까지의 펩타이드로 구성되어 있으며, HCV 감염을 진단하는데 있어서 높은 감도와 면역활성을 나타내는 보존된 항원 결정기(epitope)를 포함하고 있는 것으로 알려져 있다(참조: Hosein B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88:3647(1991); Okamoto H. et al., J. Exp. Med., 60:223(1990)).

아울러, 비구조4 영역은 지금까지 가장 널리 연구된 영역으로서, 휴톤(Houghton) 등은 이 비구조4 영역 중에서 면역 반응성이 높은 C100 영역을 발견하였으며(참조: Houghton M. et al., 유럽특허공개 제 0318216호), 그 후 제조합 기술을 이용하여 제조된 C100-3 단백항원이 초기의 HCV 진단에 사용되었다. 즉, HCV의 C100 영역에 해당하는 363개 아미노산에 인체 과산화물 디스무타제(superoxide dismutase: SOD)를 융합(fusion)시켜 제조한 SOD-HCV C100-3이라는 재조합 융합단백질을 이용하여 혈액에 존재하는 HCV를 검정하였다(참조: Kuo G. et al., Science, 244:362(1989)). 그러나, C100-3 단백항원을 사용하는 HCV 진단은 감도와 특이도 모두에서 결점이 있는 것으로 보고되고 있다.

또한, 비구조5 영역은 폴리머라제(polymerase) 활성부위인 것으로 알려져 있는데, 마에노(Maaeno) 등은 NANBH의 만성기 환자로 부터 채취한 혈청에 특이적으로 반응하여 면역 반응성을 나타내는, 비구조5 영역의 폴리머라제 부위 상부 배열에 해당하는 클론을 분리하였다(참조: Maaeno M. et al., Nucleic Acids Res., 18:2685(1990)).

한편, 단백질의 항원 결정기 또는 면역 우성 영역은 단백질 표면의 특정부위에 집중되어 있으며 크게 2종류로 나눌 수 있다: 첫째는 단백질 표면에 노출된 연속적인 특정 아미노산 배열을 가지는 선형 항원 결정기(continuous epitope)이고, 둘째는 아미노산 배열상으로는 서로 떨어져 있지만 단백질 표면의 특정구조에 의해 인접하게 노출된 아미노산 배열군의 비선형 항원 결정기(discontinuous epitope)이다. 최근에 단백질의 아미노산 배열로 부터 선형 항원 결정기를 예측할 수 있는 방법들이 개발되었는데, 이들 방법은 친수성(참조: Hopp, T.P. and Wood, K.R., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78:3824(1981); Parker, J.M.R. et al., Biochemistry, 25:5425(1986)), 소수성(참조: Kyte, J. and Doolittle, R.F., J. Mol. Biol., 157:105(1982); Eisenberg, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81:140(1984)), 유연성(참조: Karplus, P.A. et al., 72:712(1985)), 크기 및 항원성 변수(참조: Thornton, J.M. et al., EMBO J., 5:409(1986); Novotny, J, and Harber, E., Biochemistry, 25:6748(1986); Bittle, J.L. et al., Nature, 298:30(1982)) 등을 이용하고 있다. 전기 방법을 통하여 예측된 항원 결정기의 아미노산 배열에 대한 합성 펩타이드는 전기 항원에 대한 항체를 검출하기 위한 면역학적 분석법에 사용되고 있다. 예를 들면, 유나이티드 바이오메디칼사(United Biomedical Co., USA)에서는 HIV의 외피 부분에 있는 항원성이 높은 항원 결정기를 확인 및 선별하고, 그 부위에 대한 합성 펩타이드를 사용하여 HIV에 대한 항체 검출을 위한 감도 높고 특이적인 면역학적 분석법을 개발하였다(참조: Wang, J.G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 83:6159(1986)).

합성 펩타이드를 사용한 면역분석법은 우수한 감도와 특이도 때문에 밀접하게 관련된 두 바이러스간의 감염을 구분하는데도 유용하며, 바이러스 용해물이나 재조합 단백질을 사용한 면역학적 분석법에서 유발되는 많은 문제점을 해결할 수 있는 것으로 알려져 있다.

이에, 본 발명의 발명자들은 HCV 감염의 진단에 이용될 수 있는 합성 펩타이드를 제조하고자 노력한 결과, HCV 유전자 구조 중 핵, 비구조4(NS4) 또는 비구조5(NS5) 부위의 특정 아미노산 배열이 항원성 및 면역원성을 가지고 있음을 확인하고, 그 부위에 대한 펩타이드를 합성하여, HCV 감염의 진단과 HCV 관련 질환을 예방하기 위한 백신의 제조에 이용될 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 HCV 유전자 구조 중에서 핵, 비구조4(NS4) 또는 비구조5(NS5) 부위의 항원성 및 면역원성이 확인된 특정 아미노산 배열에 대한 합성 펩타이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 전기 합성 펩타이드를 이용하여 HCV에 대한 항체를 검출함으로써, HCV 감염을 판별할 수 있는 진단시약을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 전기 합성 펩타이드를 이용하여 제조된 단일클론항체와 다클론항체, 및 전기 합성 펩타이드를 사람을 포함한 건강한 포유동물에 투여하여 HCV에 대한 항체의 생성을 자극함으로써, HCV 관련 질환을 예방할 수 있는 백신을 제공하는 것이다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

본 발명에서는 HCV 유전자 구조 중에서 핵, 비구조4(NS4) 또는 비구조5(NS5) 부위의 아미노산 배열이 항원 결정기 또는 면역 우성 영역을 포함한다는 보고를 근거로 하여, HCV-J의 핵, 비구조4, 비구조5 부위의 아미노산 배열에 대한 친수성, 소수성, 유연성, 크기 및 항원성 변수 등을 종합적으로 분석하고, HCV 단백질의 항원 결정기 또는 면역 우성 영역을 예측하였다. HCV-J의 핵, 외피1, 외피2/비구조1(E2/N1), 비구조2(NS2), 비구조3(NS3), 비구조4(NS4) 및 비구조5(NS5) 부위에 대한 아미노산 배열을 제1도에 나타내었다.

전기 분석결과를 토대로, 항원 결정기 또는 면역 우성 영역으로 예상되는 부분의 아미노산 배열을 고체상 펩타이드 합성법으로 합성하여, HCV 항체 양성인 혈청으로 효소 면역 흡착 분석법(ELISA)을 수행하였다. 이어, 양성의 면역 반응성을 나타내는 특정 아미노산 배열의 펩타이드를 선별하였다. 이렇게 합성 및 선별된 펩타이드는 혈청내 및 체액내에 존재하는 HCV에 대한 항체의 조기 검출과, NANBH의 진단을 위한 민감도 및 특이도가 높은 면역분석법에 유용하게 사용될 수 있다. 이때, 본 발명에서 제조된 합성 펩타이드를 ELISA, 효소 면역 우성(immunodot) 시험, 응집(agglutination) 시험 또는 당해 기술분야에서 공지된 다른 면역 분석법에 사용함으로써, HCV 감염을 진단할 수도 있다. 아울러, 전기 합성 펩타이드는 높은 면역 반응성으로 인하여, Balb/c 마우스 등의 건강한 포유동물 체내에서 HCV에 대한 항체를 생산하는 면역원 및 HCV 관련 질환 예방을 위한 백신으로도 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에 의하면, HCV에 대한 항체 검출과 NANBH의 진단에 유용한 전기 합성 펩타이드는 HCV-J의 핵, 비구조4, 비구조5 영역 유래인 하기 배열로 표시된다:

상기에서, X는 -OH 또는 -NH₂이다.

본 발명의 목적에 부합하는 펩타이드의 범주에는 전기 합성 펩타이드의 유사체(analogue), 조합체(complex), 분체(fragment), 중합체(polymer), 결합체(conjugate) 및 혼합체(mixture)도 포함된다. 유사체는 전기 합성 펩타이드의 내부에 아미노산 치환, 삽입 또는 삭제의 변형이 초래되었으나, HCV에 대한 항체에 의해 인식 가능한 펩타이드의 면역 반응성이 보전되는 펩타이드를 의미하고; 조합체는 전기 합성 펩타이드의 말단에 아미노산이 부가되어 길이가 길어진 펩타이드를 의미하며; 분체는 전기 합성 펩타이드의 말단으로 부터 아미노산이 제거되어 길이가 짧아진 펩타이드를 의미하고; 중합체는 측쇄를 갖는 폴리-L-리신 수지 등과 같은 중합체 수지를 이용하여 중합체 수지를 이용하여 중합된 전기 합성 펩타이드의 이량체, 사량체, 팔량체 또는 이들의 중합체를 의미하는데, 측쇄를 갖는 폴리-L-리신 수지는 Lys₈Lys₄Lys₂Lys-Y(여기서, Y는 -OH, -NH₂또는 β-알라닌 등과 같은 측쇄기능기를 갖지 않는 아미노산 또는 시스테인과 같은 이황화 결합이 가능한 아미노산이다) 형태의 측쇄가 4-알콕시벤질알콜 수지에 결합된 형태를 의미하며, 전기 폴리-L-리신 수지중에서 이황화 결합이 가능한 폴리-L-리신-시스테인 수지에서 합성된 펩타이드는 합성 후의 이황화 결합을 통하여 결합체 및 중합체의 형성도 가능하다; 한편, 결합체는 전기 합성 펩타이드의 N-말단에 부가된 또는 배열 중간의 시스테인을 이용하여 소혈청 알부민(BSA), KLH(keyhole limpet hemocyanin), 테타누스 톡소이드(Tetanus toxoid), 오발부민(ovalbumin) 등과 같은 담체 단백질이 결합된 펩타이드를 의미한다. 상기에서, 전기 합성 펩타이드의 N-말단에 시스테인이 부가된 펩타이드를 각각 C2A, C22A, C42A, C50A, C75A, C100A, C116A, C143A, NS4-1694A, NS4-1719A, NS4-1738A, NS4-1924A, NS5-2282A, NS5-2363A 및 NS5-2469A로 명명하였다.

전기 결합체에서 BSA와 결합된 펩타이드 결합체는 HCV에 대한 항체의 검출 및 진단에 유용하며, 테타누스 톡소이드, KLH 및 오발부민이 결합된 펩타이드 결합체는 포유동물내에서 HCV에 대한 항체의 생산 유도에 사용한다. 전기 N-말단에 시스테인이 부가된 펩타이드의 유사체, 조합체, 분체, 중합체, 결합체 및 혼합체도 본 발명의 범주에 속한다.

아울러, 최근에 ELISA 방법을 위한 고체상 플레이트의 제조방법으로, 항원의 보다 안정되고 균일한 흡착을 위하여, 바이오틴(biotin)이 결합된 항원과 스트렙토아비딘과의 복합체를 제조하여 항원을 흡착시키는 방법이 사용되고 있으므로, 본 발명에서도 이 방법을 사용하여 ELISA를 수행한 결과, 매우 우수한 민감도와 특이도를 나타냄을 확인하였다. 이때, 바이오틴-펩타이드는 전기 합성 펩타이드 즉 C2, C22, C42, C50, C75, C100, C116, C143, NS4-1694, NS4-1719, NS4-1738, NS4-1924, NS5-2282, NS5-2363 및 NS5-2469의 N-말단에 Ser-Gly-Ser-Gly를 첨가시켜 제조된 펩타이드(각각 C2B, C22B, C42B, C50B, C75B, C100B, C116B, C143B, NS4-1694B, NS4-1719B, NS4-1738B, NS4-1924B, NS5-2282B, NS5-2363B 및 NS5-2469B로 명명)를 바이오틴에 결합시킴으로써 제조하였다. 전기 N-말단에 Ser-Gly-Ser-Gly이 부가된 펩타이드의 유사체, 조합체, 분체, 중합체, 결합체 및 혼합체도 본 발명의 범주에 속한다.

본 발명에 따르면, 전기 합성 펩타이드 즉, C2, C22, C42, C50, C75, C100, C116, C143, NS4-1694, NS4-1719, NS4-1738, NS4-1924, NS5-2282, NS5-2363 및 NS5-2469는 그 자체로서, 또는 동형이나 이형기능이 있는 다가 교차 결합 시약(functional multivalent cross linking agent)을 사용하여 단백질, 동형이나 이형의 이량체 혹은 올리고머의 중합담체와 결합되었을 때, 또는 직접 합성되어 측쇄 결합된 다가의 리신 수지에 결합되었을 때, 사람을 포함한 건강한 포유동물내에서 HCV에 대한 항체의 생산을 유도할 수 있다. 이때, 본 발명에서는 전기 각 합성 펩타이드의 유사체, 조합체, 분체, 중합체, 결합체 또는 혼합체를 포함하는 펩타이드 조성물을 효과적인 양으로 건강한 포유동물의 복강내 또는 피하주사로 주입하는 것을 포함한다.

한편, HCV 감염의 진단 및 예방에 본 발명의 합성 펩타이드를 사용하면 다음과 같은 장점이 있다: ① 본 발명의 펩타이드는 생바이러스로 부터 직접 제조되는 것이 아니기 때문에, 건강체를 HCV에 노출시킬 필요가 없다. ② 펩타이드는 화학적으로 용이하게 합성될 수 있으므로, 시험시약의 제조과정 중 HCV 감염의 위험성이 없다. ③ 본 발명의 합성 펩타이드를 ELISA 방법에 사용할 경우, HCV 재조합 융합 단백질을 사용할 경우에 나타내는 위양성(false positive)의 결과를 방지할 수 있다. 어떤 정상 개체는 대장균이나 효모 단백질로 부터 유래한 항원 물질과 교차 반응을 나타내는 항체를 가지고 있는데, 숙주세포인 대장균이나 효모로 부터 HCV 재조합 융합 단백질을 정제할 때 전기 항원 물질이 함께 정제됨으로써, 정상 개체의 혈청을 면역 분석법에서 양성 반응을 나타낼 수 있다. ④ 본 발명의 합성 펩타이드는 적합한 아미노산 배열의 변형이나 치환으로 여러 가지 펩타이드 유사체를 제조할 수 있으므로, 종래의 펩타이드보다 더 낮은 배경치를 나타내거나 HCV 항체 검출에 더욱 유용한 펩타이드를 손쉽게 제조할 수 있다. ⑤ 본 발명의 펩타이드는 화학적으로 합성되기 때문에, 질이 조절될 수 있고, 그 결과로서 시험결과의 재현성이 보장된다. ⑥ 각 시험 방법에서 매우 적은 양의 펩타이드만이 필요하므로, 펩타이드의 제조 비용이 절감되며, 그 결과로서 HCV에 대한 항체의 검출 또는 백신 제조에 소요되는 비용이 절감된다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

[실시예 1: 펩타이드 합성]

HCV의 항원 결정기 또는 면역 우성 영역을 예측하기 위하여, HCV-J의 핵, 비구조4 및 비구조5 부위의 아미노산 배열에 대한 친수성, 소수성, 유연성, 크기 및 항원성 변수 등을 종합적으로 분석하였으며, 그 중에서 친수성에 대한 결과를 제2도, 제3도 및 제4도에 각각 나타내었다. 제2도, 제3도 및 제4도에서, ()는 친수성 및 전기 항원 예측요소를 고려하여 선정한 합성 펩타이드의 해당 아미노산 배열을 표시한다. 이때, HCV-J 핵 단백질의 N-말단부터 순차적으로 시작되는 아미노산의 출발번호를 인용하여 각 펩타이드를 'C2', 'C22', 'C42', 'C50', 'C75', 'C100', 'C116', 'C132', 'C143', 'C169'라 명명하였다. 또한, HCV 비구조4 유래의 합성 펩타이드는 시작되는 아미노산의 출발번호를 인용하여 각 펩타이드를 'NS4-1529', 'NS4-1569', 'NS4-1694', 'NS4-1719', 'NS4-1738', 'NS4-1903', 'NS4-1924'라 명명하였다. HCV 비구조5 유래의 합성 펩타이드는 시작되는 아미노산의 출발번호를 인용하여 각 펩타이드를 'NS5-2184', 'NS5-2282', 'NS5-2363', 'NS5-2469', 'NS5-2628', 'NS5-2666'라 명명하였다.

아울러, 하기 실시예 2에서와 같아 담체 단백질을 부가시킨 결합체의 제조에 이용되는 펩타이드는 전기 합성 펩타이드의 N-말단에 시스테인을 부가시킨 펩타이드로서, 핵 단백질 유래인 경우는 각각 'C2A', 'C22A', 'C42A', 'C50A', 'C75A', 'C100A', 'C116A', 'C132A', 'C143A', 'C169A'라 명명하였고; 비구조4 유래인 경우는 'NS4-1529A', 'NS4-1569A', 'NS4-1694A', 'NS4-1719A', 'NS4-1738A', 'NS4-1903A', 'NS4-1924A'라 명명하였으며; 비구조5 유래인 경우는 'NS5-2184A', 'NS5-2282A', 'NS5-2363A', 'NS5-2469A', 'NS5-2628A', 'NS5-2666A'라 명명하였다.

또한, 하기 실시예 3에서와 같이 바이오틴을 부가시킨 결합체의 제조에 이용되는 펩타이드는 전기 합성 펩타이드의 N-말단에 Ser-Gly-Ser-Gly을 부가시킨 펩타이드로서, 핵 단백질 유래인 경우는 각각 'C2B', 'C22B', 'C42B', 'C50B', 'C75B', 'C100B', 'C116B', 'C132B', 'C143B', 'C169B'라 명명하였고; 비구조4 유래인 경우는 'NS4-1529B', 'NS4-1569B', 'NS4-1694B', 'NS4-1719B', 'NS4-1738B', 'NS4-1903B', 'NS4-1924B'라 명명하였으며; 비구조5 유래인 경우는 'NS5-2184B', 'NS5-2282B', 'NS5-2363B', 'NS5-2469B', 'NS5-2628B', 'NS5-2666B'라 명명하였다.

상기 펩타이드들은 고체상 펩타이드 합성법을 이용하여 아미노산 자동 합성기(ABI사, 모델 431A, USA)로 합성되었다. 합성에 사용된 고체상의 수지는 펩타이드의 C-말단이 아마이드기로 절단될 수 있는 5-(4-아미노메칠-3,5-디메톡시페녹시)발레르산(PAL) 수지이었다. 또한, 합성에 사용된 아미노산은 α-아미노기가 9-플루오레닐메틸옥시카보닐기로 보호되고, 기능성 측쇄 보호기로는 Asp, Glu의 경우 t-부틸에스테르; Ser, Thr, Tyr의 경우 t-부틸에테르; Lys 경우의 t-부틸옥시카보닐; His, Cys의 경우 트리페닐메칠; Arg의 경우2,2,5,7,8-펜타메칠크로만-6-설포닐기가 부착된 Fmoc-아미노산이며, 자동 합성기에서 DCC/HOBt 방법으로 활성화시켜 사용하였다.

상기에서 합성된 펩타이드를 상온에서 TFA(trifluoroacetic acid) 함유 용액(TFA:페놀:티오아니솔(thioanisol):에탄디티올(ethanedithiol):증류수 = 80:7.5:5:2. 5:5(부피비)로 혼합된 용액)에 3시간 처리하여 기능성 측쇄 보호기를 탈리시킨 다음, 수지로 부터 합성 펩타이드를 분리하였다.

이어, 질소 가스를 이용하여 분리된 펩타이드로 부터 TFA를 증발시키고, 냉각 에테르로 침전시켜 건조시켰다. 건조된 펩타이드 분말을 다시 DMSO에 용해시켜, 역상 C₁₈컬럼에 주입하고, 용출용액으로는 증류수에 용해된 0.1% TFA : MeCN에 용해된 0.1% TFA = 95:5 내지 40:60(v/v)까지의 농도구배를 이용하는 정제용 HPLC(pre parative HPLC)을 수행하여 합성 펩타이드를 정제한 다음, 농축하고 동결건조시켰다.

[실시예 2: BSA-펩타이드의 합성]

BSA 결합 펩타이드는 실시예 1의 방법으로 합성된 펩타이드 중에서 N-말단이나 배열 중간에 시스테인을 포함하는 펩타이드를 2-이미노티오레인(2-iminothiolane)을 이용한 하기와 같은 방법으로, BSA에 결합시킴으로써 합성하였다.

실온에서 0.3 내지 0.5㎖의 BSA 용액(25mM 붕산 완충용액(pH 9.0) 1㎖당 1㎎의 BSA 함유)에 0.1㎖의 4.4’-디티오디피리딘 용액(아세토니트릴 1㎖당 2.2㎎의 디티오디피리딘 함유)과 0.45㎖의 2-이미노티오레인 용액(25mM 붕산 완충용액(pH 9.0) 1㎖당 2.75㎎의 2-이미노티오레인 함유)을 첨가하여, 2시간 동안 충분히 혼합하였다. 그런 다음, 실시에 1에서 합성된 N-말단에 시스테인이 부가된 펩타이드를 약 2㎎(펩타이드:담체 담백질 = 30:1(몰수비)) 첨가하고, 4mM EDTA가 포함된 100mM 인산나트륨 완충용액(pH 8.0) 0.5㎖을 가하여 질소 가스하에서 반응시켰다. 반응이 종결된 후, 분자량 10,000 이하를 투석할 수 있는 투석막을 이용하여, 4℃에서 PBS로 하룻밤 동안 투석시킨 다음, 아미노산 분석하여 BSA에 대한 펩타이드의 비를 확인하였다.

[실시예 3: 바이오틴-펩타이드의 합성]

바이오틴 결합 펩타이드를 제조하기 위하여, 실시예 1의 방법으로 펩타이드를 합성한 다음, Fmoc-아미노산을 활성화시키는 방법과 동일한 방법으로 활성화시킨 바이오틴을, 활성 Fmoc-아미노산을 결합시키는 방법과 동일한 방법으로 펩타이드의 N-말단에 결합시켰다. 이렇게 합성된 바이오틴-펩타이드를 실시예 1과 동일한 방법으로 수지로 부터 분리하고 정제하였다.

[실시예 4: 팔량체 펩타이드의 합성]

하기의 구조를 갖는 팔량체 리신 수지를 이용하여, 실시예 1과 동일한 방법으로 팔량체 펩타이드를 제조하였다.

[실시예 5: HCV 핵 단백질 유래의 합성 펩타이드, BSA-펩타이드 및 바이오틴-펩타이드의 면역 반응성 측정]

HCV 핵 단백질로 부터 유래한 합성 펩타이드, BSA-펩타이드 및 바이오틴-펩타이드의 HCV에 대한 면역 반응성을 확인하고 비교하기 위하여, ELISA 방법으로 전기 펩타이드들의 면역 반응성을 측정하였다.

[실시예 5-1: 합성 펩타이드 및 BSA-펩타이드의 면역 반응성 측정]

카보네이트 완충용액(pH 9.6)에 2.5㎍/㎖의 농도로 용해된 합성 펩타이드(C2, C22, C42, C50, C75, C100, C116, C132, C169) 또는 BSA-펩타이드(BSA-C2A, BSA-C22A, BSA-C42A, BSA-C50A, BSA-C75A, BSA-C100A, BSA-C116A, BSA-C132A, BSA-C143A, BSA-C169A) 함유용액 200μl을 96-공(well) 플레이트의 각 공에 주입하고, 37℃에서 2시간 동안 흡착시켰다. 비특이적 단백질 결합 부위를 차단하기 위하여, 펩타이드가 흡착된 공을 BSA가 1.0 중량% 함유된 인산염 완충 생리 식염수 봉쇄액 300μl로 채우고, 25℃에서 2시간 배양하였다. 이어, 봉쇄액을 흡입해 내고, 90분 동안 진공 건조시켰다.

그런 다음, ALT 검사, PCR 검사 및 현재 시판되고 있는 2종의 HCV 항체 검출 EIA 검사를 통하여, HCV 항체 양성으로 확인된 혈청 189개를 검체로 사용하여 다음과 같이 ELISA을 수행하였다: 0.5 중량% 카제인, 10 부피% 소 태아 혈청, 0.1 부피% 트윈 20이 함유된 인산염 완충 생리 식염수 검체 희석액을 200μl씩 플레이트의 각 공에 주입하고, 검체, 양성 대조액 및 음성 대조액 각각을 10μl씩 공에 넣어, 1:21(부피비)으로 희석하였다. 96-공 플레이트를 잘 혼합하고, 37℃에서 1시간 반응시킨 다음, 결합하지 않은 항체를 제거하기 위하여 0.1 부피% 트윈 20을 함유하는 인산염 완충 생리 식염수로 각 공을 5회 세척하였다. 이어, HCV 양성인 각 공에서 형성된 HCV 항체-펩타이드 및 HCV 항체-BSA-펩타이드의 2차 항체 추적자로, 염소의 항-사람 IgG와 결합된 양고추냉이 퍼록시다제(horseradish peroxidase)를 사용하기 위하여, 염소의 항-사람 IgG로 표지된 퍼록시다제를 20 부피% 정상 염소의 혈청 및 0.1 부피% 트윈 20을 함유하는 인산염 완충 생리 식염수로 1:10000으로 희석한 액 200μl를 각 공에 주입하고, 37℃에서 1시간 배양하였다. 결합하지 않는 항체를 제거하기 위하여, 0.1 부피% 트윈 20을 함유한 인산염 완충 생리 식염수로 각 공을 5회 세척한 다음, 3.3', 5.5'-테트라메칠벤지딘(TMB) 및 과산화수소수를 함유하는 기질 완충용액 200μl을 첨가하여 상온에서 30분간 반응시켰다. 이어, 4N 황상 50μl를 가하여 반응을 중지시키고, 450㎜에서 흡광도를 측정하였다.

전기 합성 펩타이드 및 BSA-펩타이드의 면역 반응성 측정 결과는 하기 표 1에 나타내었다.

[실시예 5-2: 바이오틴-펩타이드의 면역 반응성 측정]

카보네이트 완충용액(pH 9.6)에 2.5㎍/㎖의 농도로 용해된 스트랩토아비딘(Pierce, USA) 함유용액 200μl을 96-공 플레이트의 각 공에 주입하고, 4℃에서 하룻밤 흡착시켰다. 스트렙토아비딘 흡착이 종결된 다음, 용액을 흡입해 내고, 실시예 3에서 합성된 바이오틴-펩타이드(바이오틴-C2B, 바이오틴-C22B, 바이오틴-C42B, 바이오틴-C50B, 바이오틴-C75B, 바이오틴-C100B, 바이오틴-C116B, 바이오틴-C132B, 바이오틴-C143B, 바이오틴-C169B)가 카보네이트 완충용액(pH 9.6)에 1㎍/㎖의 농도로 용해된 용액을 200μl씩 다시 각 공에 주입하여, 4℃에서 하룻밤 흡착시켰다.

비특이적 단백질 결합 부위를 차단하기 위하여, 펩타이드가 흡착된 공을 BSA가 1.0 중량% 함유된 인산염 완충 생리 식염수 봉쇄액 300μl로 채우고, 25℃에서 2시간 배양하였다. 이어, 봉쇄액을 흡입해 내고, 90분 동안 진공 건조시켰다.

면역 반응성은 상기 실시예 5-1에서와 동일한 ELISA 방법으로 측정하였다. 전기 바이오틴-펩타이드의 면역 반응성 측정 결과는 하기 표 1에 나타내었다. 이때, 각 합성 펩타이드의 면역 반응성은 189개 HCV 항체 양성 혈청 중에서 전기 합성 펩타이드를 이용한 ELISA 방법으로 양성 혈청을 검출하는 비율을 백분율로 나타낸 것이다.

상기 표1에서 보듯이, ① 합성 펩타이드의 경우, C2의 면역 반응성이 70.4%로 가장 높았고, C42, C50, C75, C100가 각각 16.4%, 21.2%, 49.2%, 22.2%의 면역 반응성을 나타내었으며, C22, C116, C143은 각각 10.6%, 4.8%, 1.6%로 낮은 면역 반응성을 나타내었고; ② BSA-펩타이드의 경우, 전기 합성 펩타이드의 결과와는 달리, C2의 면역 반응성이 낮게 나타났고, C22의 면역 반응성이 높게 나타나 BSA-C2A는 5.3%, BSA-C22A는 89.4%의 면역 반응성을 나타내었으며, BSA-C42A, BSA-C50A, BSA-C75A, BSA-C100A는 각각 17.5%, 25.4%, 50.3%, 23.3%의 면역 반응성을 나타내어, 합성 펩타이드와 비슷하거나 약간 높게 나타났고, BSA-C116A, BSA-C143A는 4.8%, 1.6%의 낮은 면역 반응성을 나타내었으며; ③ 바이오틴-펩타이드의 경우, 합성 펩타이드나 BSA-펩타이드에 비해서 전반적인 면역 반응성 상승효과를 나타내며, 특히 바이오틴-C2B, 비이오틴-C22B는 74.6%, 92.6%의 높은 면역반응성을 나타내고, 바이오틴-C42B, 비이오틴-C50B, 바이오틴-C75B, 바이오틴-C100B은 18.6%, 28.0%, 52.4%, 26.5%의 면역 반응성을 나타내며, 바이오틴-C116B, 바이오틴-C143B는 합성 펩타이드나 BSA-펩타이드와 마찬가지로 5.3%, 1.6%의 낮은 면역 반응성을 나타냄을 알 수 있었다.

따라서, 합성 펩타이드(C2, C22, C42, C50, C75, C100, C116, C143), BSA-펩타이드(BSA-C2A, BSA-C22A, BSA-C42A, BSA-C50A, BSA-C75A, BSA-C100A, BSA-C116A, BSA-C143A) 및 바이오틴-펩타이드(바이오틴-C2B, 바이오틴-C22B, 바이오틴-C42B, 바이오틴-C50B, 바이오틴-C75B, 바이오틴-C100B, 바이오틴-C116B, 바이오틴-C143B)는 HCV 항체와의 반응 면역성 측정에 매우 유용함을 알 수 있었다.

[실시예 6: HCV 비구조4 단백질 유래의 합성 펩타이드, BSA-펩타이드 및 바이오틴-펩타이드의 면역 반응성 측정]

HCV 비구조4 단백질로 부터 유래한 합성 펩타이드, BSA-펩타이드 및 바이오틴-펩타이드의 HCV에 대한 면역 반응성을 확인하고 비교하기 위하여, 상기 실시예 5와 동일한 ELISA 방법으로 전기 펩타이드들의 면역 반응성을 측정하였다.

이때, 핵 단백질 유래의 합성 펩타이드, BSA-펩타이드 및 바이오틴-펩타이드 대신에 HCV 비구조4 유래의 합성 펩타이드 7종(NS4-1529, NS4-1569, NS4-1694, NS4-1719, NS4-1738, NS4-1903, NS4-1924), BSA-펩타이드 7종(BSA-NS4-1529A, BSA-NS4-1569A, BSA-NS4-1694A, BSA-NS4-1719A, BSA -NS4-1738A, BSA-NS5-1903A, BSA-NS4-1924A) 및 바이오틴-펩타이드 7종(바이오틴-NS4-1529B, 바이오틴-NS4-1569B, 바이오틴-NS4-1694B, 바이오틴-NS4-1719B, 바이오틴-NS4-1738B, 바이오틴-NS4-1903B, 바이오틴-NS4-1924B)을 사용한다는 점을 제외하고는, 실시예 5-1 및 실시예 5-2와 동일한 방법으로, 면역 반응성을 측정하였다. 그 결과는 하기 표 2에 나타내었다.

상기 표 2에서 보듯이, ① 합성 펩타이드의 경우, NS4-1694, NS4-1924가 각각 39.7%, 79.4%로 높은 면역 반응성을 나타내었으며, NS4-1719, NS4-1738은 21.2%, 11.6%의 낮은 면역 반응성을 나타내었고; ② BSA-펩타이드의 경우, BSA-NS4-1694A, BSA-NS4-1719A, BSA-NS4-1924A,는 50.3%, 38.1%, 83.6%로 전기 합성 펩타이드보다 증가된 면역 반응성을 나타내었으며, BSA-NS4-1738A는 15.9%의 낮은 면역 반응성을 나타내고; ③ 바이오틴-펩타이드의 경우, 대체적으로 합성 펩타이드보다 증가된 면역 반응성을 나타내어, 바이오틴-NS4-1694B, 바이오틴-NS4-1719B, 바이오틴-NS4-1924B는 52.4%, 40.2%, 84.1%의 면역 반응성을 나타내었고, 바이오틴-NS4-1738B는 16.3%를 나타내었다.

따라서, 합성 펩타이드(NS4-1694, NS4-1719, NS4-1738, NS4-1924), BSA-펩타이드(BSA-NS4-1694A, BSA-NS4-1719A, BSA-NS4-1738A, BSA-NS5-1924A) 및 바이오틴-펩타이드(바이오틴-NS4-1694B, 바이오틴-NS4-1719B, 바이오틴-NS4-1738B, 바이오틴-NS4-1924B)는 HCV 항체와의 반응 면역성 측정에 매우 유용함을 알 수 있었다.

[실시예 7: HCV 비구조5 단백질 유래의 합성 펩타이드, BSA-펩타이드 및 바이오틴-펩타이드의 면역 반응성 측정]

HCV 비구조5 단백질로 부터 유래한 합성 펩타이드, BSA-펩타이드 및 바이오틴-펩타이드의 HCV에 대한 면역 반응성을 확인하고 비교하기 위하여, 상기 실시예5와 동일한 ELISA 방법으로 전기 펩타이들의 면역 반응성을 측정하였다.

이때, 핵 단백질 유래의 합성 펩타이드, BSA-펩타이드 및 바이오틴-펩타이드 대신에 HCV 비구조5 유래의 합성 펩타이드 6종(NS5-2184, NS5-2282, NS5-2363, NS5-2469, NS5-2628, NS5-2666), BSA-펩타이드 6종(BSA-NS5-2184A, BSA-NS5-2282A, BSA-NS5-2363A, BSA-NS5-2469A, BSA-NS5-2628A, BSA-NS5-2666A) 및 바이오틴-펩타이드 6종(바이오틴-NS5-2184B, 바이오틴-NS5-2282B, 바이오틴-NS5-2363B, 바이오틴-NS5-2469B, 바이오틴-NS5-2628B, 바이오틴-NS5-2666B)을 사용한다는 점을 제외하고는, 실시예 5-1 및 실시예 5-2와 동일한 방법으로, 면역 반응성을 측정하였다. 그 결과는 하기 표 3에 나타내었다.

상기 표 3에서 보듯이, 바이오틴-NS5-2282B는 BSA-NS5-2282A, 합성 펩타이드 NS5-2282와 함께 각각 46.6%, 45.0%, 40.7%의 높은 면적 반응성을 나타내었으며; 합성 펩타이드 NS5-2363 및 NS5-2469, BSA-NS5-2363A 및 BSA-NS5-2469A, 바이오틴-NS5-2363B 및 바이오틴-NS5-2469B는 낮지만 5 내지 8%의 면역 반응성을 나타내었다.

따라서, 합성 펩타이드(NS5-2282, NS5-2363, NS5-2469,), BSA-펩타이드(BSA-NS5-2282A, BSA-NS5-2363A, BSA-NS5-2469A) 및 바이오틴-펩타이드(바이오틴-NS5-2282B, 바이오틴-NS5-2363B, 바이오틴-NS5-2469B)는 HCV 항체와의 반응 면역성 측정에 매우 유용함을 알 수 있었다.

한편, 상기 실시예 5, 6 및 7에서, 여러 바이오틴-펩타이드 중 바이오틴-C2B, 바이오틴-C22B, 바이오틴-C50B, 바이오틴-C75B, 바이오틴-NS4-1694B, 바이오틴-NS4-1719B, 바이오틴-NS4-1924B, 바이오틴-NS5-2282B에 대한 HCV 양성 혈청 189개 검체의 ELISA 결과를 더욱 자세히 살펴보면, 전체 189개 HCV 항체 양성 혈청 중 157개 검체는 핵, 비구조4 또는 비구조5 부위 펩타이드 중의 어느 한 펩타이드에 의해 양성으로 검출되었으나, 32개의 검체는 핵 또는 비구조4 펩타이드에 의해서만 양성으로 검출되었는데, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

상기 표 4에서 보듯이, 핵 단백질 유래의 펩타이드에 의해서만 면역 반응성을 나타내는 검체는 24개(12.7%)로, 6가지 타잎의 각기 다른 면역 반응성을 나타내고 있다. 그 중에서 바이오틴-C22B에만 면역 반응성을 나타내는 검체가 10개(5.3%)로 가장 많았으며, 바이오틴-C2B에 대해서는 3개의 검체가, 나머지 11검체는 바이오틴-C2B, 바이오틴-C22B, 바이오틴-C50B, 바이오틴-C75B 중 2가지 이상의 펩타이드에 대해 면역 반응성을 나타내었다.

아울러, 비구조4 단백질 유래의 펩타이드에 의해서만 면역 반응성을 나타내는 검체는 8개로, 5가지 타잎의 각기 다른 면역 반응성을 나타내고 있다. 그 중에서 바이오틴-NS4-1719B, 바이오틴-NS4-1924B 각각에만 면역 반응성을 나타내는 검체가 각각 1개 있었으며, 나머지 3가지 타잎의 6개 검체는 바이오틴-NS4-1694B, 바이오틴-NS4-1719B, 바이오틴-NS4-1924B 중 2가지 이상의 펩타이드에 대해 면역 반응성을 나타내었다.

따라서, 핵에 대한 항체와 비구조4 부분에 대한 항체는 그 발현시기나 양에 있어서 차이가 있는 것을 알 수 있으며, 이와 관련하여 HCV 감염의 진단에 있어서 핵과 비구조4 유래의 향원 사용은 필수적임을 알 수 있었다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 HCV 유전자 구조중 핵(core), 비구조4(NS4) 또는 비구조5(NS5) 부위에서 향원성 및 면역원성이 확인된 특정 아미노산 배열에 대한 합성 펩타이드 및 그의 C형 간염 바이러스 감염에 대한 진단시약, 항체생산 유도용 항원과 예방용 백신으로서의 용도를 제공한다. 본 발명의 합성 펩타이드는 화학적으로 용이하게 합성될 수 있으므로, 시험시약의 제조과정 중 HCV 감염의 위험성이 없고, 우수한 감도와 특이도를 가지고 HCV에 대한 항체를 검출하며, 매우 적은 양의 펩타이드만으로도 우수한 효과를 나타내므로 펩타이드의 제조 비용이 절감되며, 그 결과로서 HCV에 대한 항체의 검출 또는 백신 제조에 소요되는 비용이 절감된다.

Claims

C형 간염 바이러스(HCV)의 항원 결정기 또는 면역 우성 영역을 포함하는 하기와 같은 아미노산 배열을 갖는 펩타이드, 그의 중합체 및 그의 결합체:

상기에서, X는 -OH 또는 -NH₂이다.
제1항에 있어서, 펩타이드는 제1항의 각 펩타이드 N-말단에 시스테인이 부가된 형태를 포함하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제1항에 있어서, 펩타이드는 제1항의 각 펩타이드 N-말단에 Ser-Gly-Ser-Gly이 부가된 형태를 포함하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제1항에 있어서, 결합체는 이황화 결합을 통하여 담체 단백질과 제1항 또는 제3항의 펩타이드와 결합된 담체 단백질 결합 펩타이드인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제1항에 있어서, 결합체는 바이오틴과 제4항의 펩타이드가 결합된 바이오틴 결합 펩타이드인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제4항에 있어서, 담체 단백질은 소혈청알부민(BSA), 테타누스 톡소이드(Tetanus toxoid), KLH(keyhole limpet hemocyanin) 및 오발부민으로 구성된 그룹으로 부터 선택되는 단백질인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제1항에 있어서, 중합체는 측쇄를 갖는 하기와 같은 폴리-L-리신 수지를 이용하여 중합되는 것을 특징으로 하는 펩타이드: Lys₈Lys₄Lys₂Lys-Y 상기에서, Y는 -OH, -NH₂, 측쇄기능기를 갖지 않는 아미노산 또는 시스테인이다.
제1항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 HCV에 대한 진단시약.