DE69233667T2

DE69233667T2 - Immunogene, nichtgiftige Mutanten des Choleratoxins und des Toxins-LT, ihre Herstellung und ihre Verwendung zur Herstellung von Impfstoffen

Info

Publication number: DE69233667T2
Application number: DE69233667T
Authority: DE
Inventors: Mario Domenighini; Rino Rappuoli; Mariagrazia Pizza; Wim Seattle Hol
Original assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics SRL
Current assignee: GSK Vaccines SRL
Priority date: 1991-12-31
Filing date: 1992-12-30
Publication date: 2007-09-27
Anticipated expiration: 2012-12-31
Also published as: GR3029556T3; MX9207685A; TW239146B; MY108154A; ES2127808T3; DE69228563D1; SA93130462B1; ES2227762T3; DK0620850T3; WO1993013202A1; DE69233417T2; EP0869181B1; SG93200A1; ATE177145T1; JP3394774B2; EP0620850B1; EP0869181A1; DE69228563T2; CA2127091C; EP1484404B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf immunogene entgiftete Proteine von Choleratoxinen (CT) oder von hitzelabilen Toxinen (LT), die durch enterotoxigene Stämme von Escherichia coli (E. coli) erzeugt werden, bei denen eine oder mehrere der Aminosäuren Val-53, Val-97 und Tyr-104 durch Substitution ersetzt sind, sowie ihre Verwendung in Impfstoffen, die zur Vorbeugung oder zur Behandlung von Cholerainfektionen oder Infektionen durch enterotoxigene E. coli-Stämme geeignet sind. Die Proteine können geeigneterweise durch Anwendung von DNA-Rekombinationsverfahren durch punktgerichtete Mutagenese der DNA erzeugt werden, welche die Wildtyp-Toxine codiert.
Hintergrund der Erfindung
Cholera ist eine ansteckende Krankheit, die weltweit, insbesondere in der Dritten Welt, verbreitet ist, wobei sie in bestimmten Gebieten endemisch ist. Die schwerwiegenden Erkrankungen, die sich im Darmsystem entwickeln, erweisen sich bei einem hohen Prozentsatz der registrierten Krankheitsfälle als tödlich.
Der ätiologische Erreger der Cholera ist der Gram-negative Mikroorganismus Vibrio cholerae (V. cholerae). Dieser besiedelt den Darmtrakt von Individuen, die durch Aufnahme von kontaminierter Nahrung oder kontaminiertem Wasser damit in Kontakt kamen, und vermehrt sich zu sehr hohen Konzentrationen. Das Hauptsymptom ist starker Durchfall, als dessen Folge der Patient bis zu 10 bis 15 Liter Flüssigkeit pro Tag über die Faeces verlieren kann. Als Folge der starken Dehydrierung und des Verlustes an Elektrolyten übersteht der Patient in 50 bis 60 % der Fälle die Infektion nicht und stirbt. Der von V. cholerae verursachte Durchfall ist auf die Sekretion von Choleratoxin, CT, zurückzuführen, das durch Stimulierung der Aktivität des Enzyms Adenylatcyclase wirkt, wodurch Störungen auf cellulärer Ebene induziert werden. Obwohl Cholera durch kontrollierte und intensive Rehydrierung in wirksamer Weise geheilt werden kann, ist die Verteilung eines Impfstoffs im Hinblick auf die vollständige Kontrolle und die zukünftige Ausrottung der Krankheit wünschenswert.
Derzeit gibt es eine Impfung gegen Cholera, die in der parenteralen Verabreichung von abgetöteten Bakterien besteht. Obwohl einige Länder auf der Impfung gegen die Krankheit bestehen, gibt es ernsthafte Zweifel an ihrer wirklichen Nützlichkeit angesichts der Tatsache, dass der derzeitige, auf Zellen beruhende Impfstoff nur in 50 % der Fälle vor den Folgen der Infektion schützt und der Schutz ferner hinsichtlich der Dauer auf weniger als 6 Monate extrem begrenzt ist.
In Bangladesch wird eine klinische Studie (1990–1992) an einem oral zu verabreichenden Impfstoff durchgeführt, der aus abgetöteten Bakterien mit Zusatz der Untereinheit B des Choleratoxins besteht, die als hoch immunogen bekannt ist. Dieses Produkt ist bei der Induzierung eines dauerhaften Schutzes erfolgreich, ohne dass besondere Nebenwirkungen auftreten (Holmgren J., Clemens J., Sack D.A., Sanchez J., und Svennerholm A.M, "Oral Immunization against cholera", Curr. Top. Microbiol. Immunol. (1988) 146, 197–204).
Das Choleratoxin ähnelt in seiner Aminosäuresequenz, seiner Struktur und der Wirkungsweise den hitzelabilen Toxinen von enterotoxigenen Stämmen von Escherichia coli.
Die Folgen der Infektion mit einem enterotoxigenen Stamm von E. coli ähneln denjenigen der Cholera, auch wenn sie im Vergleich dazu weniger schwerwiegend sind, und bestehen aus starkem Durchfall und Darmstörungen.
Die Toxine CT und LT weisen alle eine einzige Untereinheit A (oder ein Protomer A) auf, die für die Enzymaktivität des Toxins (hier als CT-A oder LT-A bezeichnet) verantwortlich ist, sowie fünf identische Untereinheiten B (oder Protomere B) auf, die an der Bindung des Toxins an den Darmepithelzellen beteiligt sind (hier als CT-B oder LT-B bezeichnet).
Die Untereinheit A durchdringt die Zellmembran und verursacht die Aktivierung von Adenylatcyclase durch NAD-abhängige ADP-Ribosylierung eines GTP-bindenden Proteins, das die Aktivität des Enzyms kontrolliert. Die klinische Wirkung besteht hierbei darin, dass ein massiver Flüssigkeitsverlust im Darm verursacht wird.
Über das Choleratoxin und die hitzelabilen Toxine von E. coli wurden umfangreiche Forschungen durchgeführt.
Die Sequenz von CT ist bekannt und wurde beschrieben (Mekalanos J.J. et al., Nature 306 (1983), Seite 551).
Die Sequenz von LT aus enterotoxigenen Stämmen von E. coli weist, wie erwähnt wurde, eine Homologie von 80 % zu CT auf und ist ferner in der wissenschaftlichen Literatur bekannt und beschrieben. Spicer E.K. et al. (Biol. Chem. 257 (19982), Seiten 5716–5721) beschreiben die Aminosäuresequenz der Untereinheit A des hitzelabilen Toxins eines enterotoxigenen Stamms von E. coli, der bei Schweinen gefunden wurde.
Von Pickett C.L. et al. (J. Bacteriol. 169 (1987), 5180–5187) wurde eine bakterielle chromosomale Form von LT identifiziert.
Die Sequenz der Untereinheit A von LT aus einem Stamm von E. coli, von dem bekannt ist, dass er auf Menschen wirkt, wurde ebenfalls sequenziert (Yamamoto et al., J. Biol. Chem. 259 (1984), 5037–5044).
Im Hinblick auf die potentielle klinische Bedeutung eines Impfstoffs gegen Cholera und enterotoxigene Bakterien besteht nach wie vor ein großes Interesse daran, ein entgiftetes Toxin herzustellen, das zu einer Immunisierung gegen Cholera und enterotoxigene Bakterien befähigt ist. Die Verfahren der Gentechnik erlauben die Einführung spezifischer Mutationen in die Gene, welche die Toxine codieren, und die Herstellung des mutierten Toxins, wobei nunmehr herkömmliche Verfahren der Genexpression und der Proteinreinigung angewandt werden können.
Von verschiedenen Forschergruppen wurde der Versuch unternommen, Mutationen der Gene zu identifizieren, die mit dem Verlust der Toxizitätsmerkmale der codierten Proteine verknüpft sind. Die Studien werden hauptsächlich im Hinblick auf das Gen für das Toxin LT aus E. coli durchgeführt.
Harford S. et al. (Eur. J. Biochem. 183 (1989), Seite 311) beschreiben die Herstellung eines Toxoids durch Mutagenese des LT-A-Gens aus E. coli in vitro, das für Schweine pathogen ist. Die resultierende erfolgreiche Mutation enthielt eine Ser-61-Phe-Substitution und eine Gly-79-Lys-Substitution, von denen die erstere als wichtiger angesehen wurde. Harford et al. vermuteten, dass es aufgrund der Ähnlichkeiten zwischen den LT-A-Genen in E. coli, der für Menschen und Schweine pathogen ist, und dem CT-A-Gen sowie aufgrund der Annahme, dass die Toxine aufgrund eines gemeinsamen Mechanismus wirken, möglich sein kann, ein Cholera-Holotoxoid durch Einführung der Ser-61-Phe-Mutation in das CT-A-Gen zu erzeugen.
Tsuji T. et al. (J. Biol. Chem. 265, 1990, Seite 22520) beschreiben die Mutation des LT-A-Gens aus dem Plasmid EWD299 zur Erzeugung einer einzigen Glu-112-Lys-Substitution, die sich auf die Toxizität der LT-Mutante auswirkt, jedoch die Immunogenität des Proteins nicht ändert.
Grant C.C.R. et al. (Abstract B289 des 92nd General Meeting of the American Society for Microbiology, 26.–30. Mai, 1992), beschreiben konservative Substitutionen der Histidine in den Positionen 44 und 70 und von Tryptophan in Position 127 in LT-A, die zu einer bedeutenden Verringerung der Enzymaktivität führen.
Einige Forschungsarbeiten wurden an CT-Mutationen durchgeführt.
Kaslow H.R. et al. (Abstract B291 des 92nd General Meeting of the American Society for Microbiology, 26.–30. Mai, 1992), beschreiben die Mutation von Asp-9 und His-44 und die Trunkierung nach der Aminosäure 180 in CT-A, wodurch die Aktivität jeweils im Wesentlichen eliminiert wird. Die Mutation bei Arg-9 soll die Aktivität deutlich abschwächen. Die Mutation an anderen Aminosäurepositionen hatte wenig Wirkung auf die Toxizität.
Burnette W.N. et al. (Inf. and Immun. 59 11 (1991) 4266–4270) beschreiben die punktgerichtete Mutagenese von CT-A zur Erzeugung einer Arg-7-Lys-Mutation, die der einer bekannten entgiftenden Mutation in der Untereinheit A des Toxins von Bordetella pertussis gleicht. Die Mutation führte zur vollständigen Aufhebung der nachweisbaren Aktivität der ADP-Ribosyltransferase.
Die internationale Patentanmeldung WO 92/19265 (Burnette, Kaslow und Amgen Inc.) beschreibt Mutationen von CT-A an den Positionen Arg-7, Asp-9, Arg-11, His-44, His-70 und Glu-112.
Mutationen an Glu-110 (LT und CT) und Arg-146 (LT) wurden ebenfalls in der Literatur beschrieben (Lobet, Inf. Immun. (1991) 2870; Lai, Biochem. Biophys. Res. Comm. 341, 1983; Okamoto, J., Bacteriol. 2208, 1988).
Die Kristallstruktur von LT wurde von Sixma et al. bestimmt (Nature 351, 371–377, Mai 1991), und die zuvor in der Literatur beschriebenen Mutagenese-Ergebnisse wurden bestätigt, welche die Bedeutung von Glu-112 und Ser-61 bei der Aktivität der Untereinheit A strukturell erklären und nahelegen, dass His-44, Ser-114 und Arg-54, die in der unmittelbaren Nachbarschaft liegen, für die Katalyse oder die Erkennung von Bedeutung sein können.
Zusammenfassung der Erfindung
Es wurde durch weitere und detailliertere Analyse der Struktur der Toxine gefunden, dass sich bestimmte weitere Aminosäuren in den Sequenzen von CT-A und LT-A in Positionen befinden, welche die enzymatische Aktivität von CT und LT bei geeigneter Mutation individuell oder in Verbindung mit anderen Mutationen herabsetzen können.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, einen Impfstoff bereitzustellen, der einen vollständigen Schutz gegen Cholera oder enterotoxigene E. coli mittels eines Produkts der zweiten Generation bietet, das aus einem einzelnen Antigen, einem von CT oder LT abgeleiteten Toxoid, besteht, das genetisch detoxifiziert wurde.
Bei der genetischen Entgiftung von CT oder LT werden die immunogenen Eigenschaften des Toxoids beibehalten, während eine signifikant verringerte und vorzugsweise fehlende Toxizität erzielt wird.
Nach einem ersten Aspekt der Erfindung wird ein immunogenes entgiftetes Protein bereitgestellt, das die Aminosäuresequenz der Untereinheit A eines Choleratoxins (CT-A) oder ein Fragment davon oder die Aminosäuresequenz der Untereinheit A eines hitzelabilen Toxins (LT-A) von Escherichia coli oder ein Fragment davon enthält, wobei eine oder mehrere der Aminosäuren Val-53, Val-97 und Tyr-104 oder die Aminosäure in der Val-53, Val-97 oder Tyr-104 entsprechenden Position durch eine andere Aminosäure ersetzt sind.
Die ersetzten Aminsäuren befinden sich an Stellen in der Sequenz von CT-A oder eines LT-A, die sowohl in der Aminosäuresequenz als auch strukturell konserviert sind und daher CT und den verschiedenen LTs gemeinsam sind.
Das immunogene entgiftete Protein der Erfindung weist im Wesentlichen die gleiche strukturelle Konformation wie die natürlich vorkommenden Wildtyp-Toxine auf. Es ist immunologisch wirksam und zeigt Kreuzreaktion mit Antikörpern gegen die Wildtyp-Toxine. In der vorliegenden Beschreibung umfassen die Bezugnahmen auf CT und LT die verschiedenen natürlich auftretenden Stammvarianten sowie andere Varianten, die Änderungen der hier offenbarten Sequenzen umfassen, die sich auf die Immunogenität des zusammengebauten Toxins nicht auswirken.
In der vorliegenden Beschreibung bezeichnet die Bezugnahme auf Aminosäurekoordinaten wie "Val-97" die Aminosäure in der Position in der Sequenz der reifen Choleratoxin-Untereinheit A (CT-A), und zwar ohne die Signalsequenz (vgl. 1).
Wo sich die Beschreibung auf ein LT-A bezieht, beziehen sich die Aminosäurekoordinaten auf die entsprechende Position in CT-A, wie in 1 dargestellt.
Daher entspricht beispielsweise Val-53 in CT Val-52 in der Untereinheit LT1, und Ser-63 in CT entspricht Ser-62 in LT1, wobei es einen zählungsmäßigen Unterschied von einer einzigen Aminosäure bis Aminosäure 89 der Sequenz von LT1 gibt. Val-97 in der CT-Sequenz entspricht Val-93 in der LT1-Sequenz aufgrund des Unterschieds von 4 Aminosäuren an dieser Stelle der Sequenz.
Zusätzlich kann das immunogene entgiftete Protein der Erfindung weitere Mutationen, wie beispielsweise Substitutionen an einer oder mehreren Positionen von Arg-7, Asp-9, Arg-11, His-44, Arg-54, Ser-61, His-70, His-107, Glu-110, Glu-112, Ser-114, Trp-127, Arg-146 oder Arg-192, aufweisen.
Die anstelle der Wildtyp-Aminosäure durch Substitution eingeführte Aminosäure kann eine natürlich vorkommende Aminosäure oder eine modifizierte oder synthetische Aminosäure sein. Die Substitution kann die Deletion einer Aminosäure beinhalten, wobei insgesamt vorausgesetzt ist, dass die Mutante die notwendigen immunogenen Eigenschaften behält und eine wesentlich verringerte Toxizität zeigt.
Substitutionen, welche die amphoteren und hydrophilen Eigenschaften ändern, während der sterische Effekt der durch Substitution eingeführten Aminosäure so weit wie möglich beibehalten ist, sind allgemein bevorzugt.
Bevorzugte Substitutionen schließen ein: Val-53-Asp, Val-53-Glu, Val-53-Tyr, Ser-63-Lys, Val-97-Lys, Val-97-Tyr, His-107-Glu, Tyr-104-Lys, Tyr-104-Asp, Tyr-104-Ser, Pro-106-Ser, Ser-114-Glu, Ser-114-Lys.
Der hier verwendete Ausdruck "entgiftet" bedeutet, dass die immunogene Zusammensetzung im Vergleich zu dem natürlich auftretenden Toxin als Referenzobjekt eine wesentlich niedrigere Toxizität besitzt. Die wesentliche niedrigere Toxizität sollte genügend niedrig sein, damit das Protein in einer immunogenen Zusammensetzung in einer immunologisch wirksamen Menge als Impfstoff verwendet werden kann, ohne dass signifikante Nebenwirkungen hervorgerufen werden. So sollte zum Beispiel das immunogene entgiftete Protein eine Toxizität von weniger als 0,01 %, bezogen auf das natürlich vorliegende Toxin als Vergleichsprodukt, aufweisen. Die Toxizität kann in Maus-CHO-Zellen oder bevorzugt durch Ermittlung der morphologischen Änderungen, die in Y1-Zellen induziert werden, gemessen werden. Der Ausdruck "Toxoid" bedeutet ein genetisch entgiftetes Toxin.
Das immunogene Protein kann ein Toxoid mit einer CT- oder einer LT-Untereinheit A sein, ist jedoch vorzugsweise ein zusammengefügtes Toxinmolekül, das eine mutierte CT-A- oder LT-A-Untereinheit und fünf Untereinheiten B von CT oder LT umfasst. Die Untereinheit B kann eine natürlich auftretende Untereinheit sein oder kann selbst mutiert sein.
Das immunogene Protein ist vorzugsweise ein natürlich auftretendes CT-A oder ein LT-A, das in geeigneter Weise modifiziert wurde, wie oben beschrieben wurde. Es können jedoch auch konservative Aminosäureaustauschvorgänge durchgeführt werden, die sich nicht auf die Immunogenität oder die Toxizität des immunogenen Proteins auswirken und vorzugsweise die Fähigkeit des immunogenen Proteins, ein vollständiges Toxin mit dem Untereinheitprotein B zu bilden, nicht beeinflussen. Das immunogene Protein kann ferner auch ein Fragment von CT-A oder eines LT-A sein, sofern das Fragment immunogen und nichttoxisch ist und mindestens einen der konservativen Bereiche enthält, der eine der erfindungsgemäßen Mutationen enthält.
Nach einem zweiten Aspekt der Erfindung wird eine immunogene Zusammensetzung zur Verwendung als Impfstoff angegeben, die ein immunogenes entgiftetes Protein nach dem ersten Aspekt der Erfindung sowie einen pharmazeutisch akzeptablen Träger enthält.
Die immunogene Zusammensetzung kann zusätzlich ein oder mehrere Adjuvantien und/oder pharmazeutisch akzeptable Verdünnungsmittel enthalten.
Die Erfindung gibt ferner eine Impfstoffzusammensetzung an, die ein immunogenes entgiftetes Protein gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger enthält. Die Impfstoffzusammensetzung kann ferner ein Adjuvans enthalten.
Nach einem dritten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Impfung eines Säugers gegen Vibrio cholerae oder einen enterotoxigenen Stamm von Escherichia coli angegeben, das die Verabreichung einer immunologisch wirksamen Menge eines immunogenen entgifteten Proteins gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung umfasst.
Die immunogenen entgifteten Proteine der Erfindung können chemisch unter Anwendung herkömmlichen Peptidsyntheseverfahren synthetisiert werden, werden jedoch vorzugsweise durch DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt.
Gemäß einem vierten Aspekt der Erfindung wird eine DNA-Sequenz angegeben, die ein immunogenes entgiftetes Protein gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung codiert.
Die DNA-Sequenz enthält vorzugsweise eine DNA-Sequenz, die ein vollständiges CT oder LT codiert, die eine DNA umfasst, die sowohl die entgiftete Untereinheit A als auch die Untereinheit B in einer polycistronischen Einheit codiert. Alternativ dazu kann die DNA auch nur die entgiftete Untereinheit A codieren.
Nach einem fünften Aspekt der Erfindung wird ein Vektor angegeben, der eine DNA nach dem vierten Aspekt der Erfindung trägt.
Nach einem sechsten Aspekt der Erfindung wird eine Wirtzelllinie bereitgestellt, die mit dem Vektor nach dem fünften Aspekt der Erfindung transformiert ist.
Die Wirtzelle kann eine beliebige Wirtzelle sein, die CT oder LT erzeugen kann; sie ist jedoch bevorzugt ein Bakterium, am günstigsten E. coli oder V. cholerae, das in geeigneter Weise gentechnisch so verändert wurde, dass das gewünschte immunogene entgiftete Protein erzeugt wird.
Bei einer weiteren Ausführungsform des sechsten Aspekts der Erfindung kann die Wirtzelle selbst eine Schutzspecies, beispielsweise einen E.-coli- oder V.-cholerae-Stamm, bereitstellen, die zu einem Phänotyp mutiert wurde, dem das Wildtyp-LT oder Wildtyp-CT fehlt und der ein immunogenes entgiftetes Protein des ersten Aspekts der Erfindung exprimiert.
Bei einer weiteren Ausführungsform des sechsten Aspekts der Erfindung ist die Wirtzelle befähigt, ein chromosomales LT-A-Gen nach dem ersten Aspekt der Erfindung zu exprimieren.
Nach einem siebten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines immunogenen entgifteten Proteins gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung angegeben, das die Kultivierung einer Wirtzelle gemäß dem sechsten Aspekt der Erfindung umfasst.
Nach einem achten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer DNA nach dem vierten Aspekt der Erfindung bereitgestellt, das die Schritte der punktgerichteten Mutagenese einer DNA umfasst, die ein CT-A oder ein LT-A oder ein Fragment davon codiert.
Nach einem neunten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Formulierung eines Impfstoffs bereitgestellt, das die Kombination eines immunogenen entgifteten Proteins gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger und wahlweise mit einem Adjuvans umfasst.
Gewerbliche Anwendbarkeit
Das immunogene entgiftete Protein der Erfindung stellt den wirksamen Bestandteil einer Impfstoffzusammensetzung dar, die zur Vorbeugung und zur Behandlung von Cholerainfektionen oder Infektionen durch enterotoxigene Stämme von E. coli geeignet ist. Die Zusammensetzungen sind somit zur Verwendung in der pharmazeutischen Industrie anwendbar.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
1 zeigt die Aminosäuresequenzen der Wildtyp-Untereinheit A von:

i) Choleratoxin (CT – Mekalanos et al., op. cit.),
ii) hitzelabilem Toxin von einem beim Menschen gefundenen E.-coli-Stamm (LT1_1 – Yamamoto et al., op. cit.),
iii) hitzelabilem Toxin aus einem E.-coli-Stamm, der bei Schweinen gefunden wurde (LT1 – Spicer et al., op. cit), und
iv) hitzelabilem Toxin aus einer chromosomalen Quelle (LT1_1 – Picket et al., op. cit.).

Die Signalsequenzen sind nicht dargestellt.
In 1 ist der übliche Einbuchstaben-Aminosäurecode verwendet. Das Zeichen "." bezeichnet eine fehlende Aminosäure und dient als typographischer Platzhalter, um sicherzustellen, dass die Sequenzen zur Erleichterung des Vergleichs zueinander ausgerichtet bleiben. Das Zeichen "-" bezeichnet eine Aminosäure in der Sequenz von LT1 und LT2, die mit der entsprechenden Aminosäure in CT identisch ist. Die Zahlen neben jeder Zeile stellen die Aminosäurenummer der ersten Aminosäure in dieser Zeile dar.
In 1 sind die Positionen der Mutationen der vorliegenden Erfindung unterstrichen dargestellt.
Die 2a und 2b stellen Vergleiche der Aminsäuresequenzen und der DNA-Sequenzen der Untereinheiten A von LT1 und CT dar.
3 ist eine Restriktionskarte des Plasmids EWD299 (Dallas et al.), welches das LT-A-Gen trägt.
Detaillierte Beschreibung von Ausführungsformen der Erfindung
Bei der Praktizierung der vorliegenden Erfindung werden, wenn nichts anderes angegeben ist, herkömmliche Verfahren der Molekularbiologie, der Mikrobiologie, der DNA-Rekombination und der Immunologie angewandt, die Fachleuten geläufig sind. Solche Verfahren sind in der Literatur ausführlich erläutert, vgl. z.B.: Sambrook et al., MOLECULAR CLONING; A LABORATORY MANUAL, zweite Auflage (1989); DNA CLONING, Bände I und II (Herausgeber D.N. Glover, 1985); OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (Herausgeber M.J. Gait, 1984); NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION (Herausgeber B.D. Hames und S.J. Higgins, 1984); TRANSCRIPTION AND TRANSLATION (Herausgeber B.D. Hames und S.J. Higgins, 1984); ANIMAL CELL CULTURE (Herausgeber R.I. Freshney, 1986); IMMOBILIZED CELLS AND ENZYMES (IRL Press, 1986); B. Perbal, A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING (1984); Reihe METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.); GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS (Herausgeber J.H. Miller und M.P. Calos, 1987, Cold Spring Harbor Laboratory), Methods in Enzymology, Band 154 und Band 155 (Herausgeber Wu und Grossman bzw. Wu), Herausgeber Mayer und Walker (1987), IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY (Academic Press, London), Scopes (1987), PROTEIN PURIFICATION: PRINCIPLES AND PRACTICE, zweite Auflage (Springer-Verlag, N.Y.), sowie HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY; Bände I–IV (Herausgeber D.M. Weir und C.C. Blackwell, 1986).
In der vorliegenden Beschreibung werden für Nucleotide und Aminosäuren die Standard-Abkürzungen verwendet. Alle hier zitierten Veröffentlichungen, Patente und Patentanmeldungen werden durch Bezugnahme einbezogen.
Im Einzelnen werden folgende Aminosäureabkürzungen verwendet:
Wie oben erwähnt, umfassen Beispiele für das immunogene entgiftete Protein, das im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, Polypeptide mit kleineren Variationen bei den Aminosäuren gegenüber der natürlichen Aminosäuresequenz des Proteins, die von den Mutationen an den speziell angegeben Stellen verschieden sind.
Ein signifikanter Vorteil, das immunogene entgiftete Protein durch DNA-Rekombinationsverfahren und nicht durch Isolierung und Reinigung eines Proteins aus natürlichen Quellen herzustellen, besteht darin, dass äquivalente Mengen des Proteins durch Einsatz von weniger Ausgangsmaterial hergestellt werden können, als für die Isolierung des Proteins aus einer natürlichen Quelle erforderlich wäre. Die Herstellung des Proteins durch Rekombinationsverfahren erlaubt ferner, dass das Protein in Abwesenheit von einigen Molekülen isoliert werden kann, die gewöhnlich in Zellen vorliegen. So können Proteinzusammensetzungen, die völlig frei von Spuren von Verunreinigungen durch menschliche Proteine sind, leicht hergestellt werden, da das einzige menschliche Protein, das durch den rekombinanten nicht-menschlichen Wirt erzeugt wird, das betreffende rekombinante Protein ist. Potentielle virale Agentien aus natürlichen Quellen und virale Bestandteile, die für Menschen pathogen sind, werden ebenfalls vermieden. Es ist auch weniger wahrscheinlich, dass das genetisch entgiftete Toxin wieder eine toxische Form annimmt, als dies bei herkömmlichen, chemisch entgifteten Toxinen der Fall ist.
Pharmazeutisch verträgliche Träger schließen alle Träger ein, die nicht selbst die Produktion von Antikörpern induzieren, die für das Individuum schädlich sind, das die Zusammensetzung erhält. Geeignete Träger sind typischerweise große, langsam metabolisierte Makromoleküle, wie Proteine, Polysaccharide, Polymilchsäuren, Polyglycolsäuren, polymere Aminosäuren, Aminosäure-Copolymere, Lipidaggregate (wie Öltröpfchen oder Liposomen) und inaktive Viruspartikel. Derartige Träger sind Fachleuten gut bekannt. Zusätzlich können diese Träger als immunstimulierende Agentien (Adjuvantien) fungieren.
Bevorzugte Adjuvantien zur Erhöhung der Wirksamkeit der Zusammensetzung schließen ein, ohne aber darauf beschränkt zu sein: Aluminiumsalze (Tonerde), wie Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat, Aluminiumsulfat, etc., Ölemulsionsformulierungen mit oder ohne weitere spezifische immunstimulierende Agentien, wie Muramylpeptide oder bakterielle Zellwandbestandteile, wie beispielsweise (1) MF59 (veröffentlichte internationale Patentanmeldung WO-A-90/14837, enthaltend 5 % Squalen, 0,5 % Tween^® 80, 0,5 % Span^® 85 (fakultativ noch verschiedene Mengen von MTP-PE (vgl. nachstehend), obwohl nicht erforderlich), formuliert als Submikronpartikel unter Verwendung eines Mikrofluidisationsgeräts wie das Mikrofluidisationsgerät Modell 110Y (Microfluidics, Newton, MA 02164), (2) SAF, enthaltend 10 % Squalen, 0,4 % Tween 80, 5 % Pluronic-blockiertes Polymer L121 und thr-MDP (vgl. nachstehend), entweder einer Mikrofluidisation zu einer Submikronemulsion unterzogen oder geschüttelt, um eine Emulsion mit größeren Partikeln zu erzeugen, und (3) RIBITM-Adjuvanssystem (RAS) (Ribi Immunochem, Hamilton, MT), enthaltend 2 % Squalen, 0,2 % Tween^® 80 und eine oder mehrere bakterielle Zellwandkomponenten aus der Gruppe, die besteht aus Monophosphoryllipid A (MPL), Trehalosedimycolat (TDM) und Zellwandskelett (ZWS), vorzugsweise MPL + ZWS (Detox^TM), Muramylpeptide, wie N-Acetyl-muramyl-L-threonyl-D-isoglutamin (thr-MDP), N-Acetyl-normuramyl-L-alanyl-D-iso-glutamin (nor-MDP), N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(1'-2'-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxy-phosphoryloxy)-ethylamin (MTP-PE), etc., und Cytokine, wie Interleukine (IL-1, IL-2, etc.), Makrophagen-koloniestimulierenden Faktor (M-CSF), Tumornekrosefaktor (TNF), etc. Zusätzlich können Saponin-Adjuvantien wie Stimulon^TM (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) oder daraus erzeugte Partikel, wie ISCOMS (immunstimulierende Komplexe), verwendet werden. Ferner können Komplettes Freundsches Adjuvans (KFA) und Inkomplettes Freundsches Adjuvans (IFA) verwendet werden. Tonerde und MF59 werden bevorzugt.
Die immunogenen Zusammensetzungen (z. B. das Antigen, der pharmazeutisch akzeptable Träger und das Adjuvans) enthalten typischerweise Verdünnungsmittel, wie Wasser, Kochsalzlösung, Glycerin, Ethanol, etc. Zusätzlich können Hilfsstoffe, wie Netzmittel oder Emulgatoren, pH-Puffersubstanzen und dergleichen in solchen Trägern vorliegen.
Typischerweise werden die immunogenen Zusammensetzungen als Zusammensetzungen zur Injektion, entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen, hergestellt; feste Formen, die zum Lösen oder Suspendieren in flüssigen Trägern vor der Injektion geeignet sind, können ebenfalls hergestellt werden. Die Zubereitung kann auch emulgiert oder in Liposomen verkapselt werden, um eine erhöhte Adjuvanswirkung zu erzielen, wie vorstehend bei den pharmazeutisch akzeptablen Trägern diskutiert wurde.
Immunogene Zusammensetzungen, die als Impfstoff verwendet werden, enthalten eine immunologisch wirksame Menge der antigenen Polypeptide sowie bei Bedarf beliebige der vorstehend erwähnten Bestandteile. Mit "immunologisch wirksamer Menge" ist gemeint, dass die Verabreichung jener Menge an ein Individuum, entweder als Einzeldosis oder als Teil einer Reihe, zur Behandlung oder Vorbeugung wirksam ist. Diese Menge variiert abhängig von der Gesundheit und dem körperlichen Zustand des zu behandelnden Individuums, der taxonomischen Gruppe des zu behandelnden Individuums (z. B. nicht-menschlicher Primat, Primat, etc.), der Fähigkeit des Immunsystems des Individuums, Antikörper zu synthetisieren, dem erwünschten Schutzgrad, der Formulierung des Impfstoffes, der Beurteilung der medizinischen Situation durch den behandelnden Arzt und anderen relevanten Faktoren. Es wird erwartet, dass die Menge in einen relativ breiten Bereich fällt, der durch Routineversuche bestimmt werden kann Die immunogenen Zusammensetzungen werden herkömmlicherweise parenteral verabreicht, z. B. durch Injektion entweder subkutan oder intramuskulär. Zusätzliche Formulierungen, die für andere Verabreichungsarten geeignet sind, schließen orale und pulmonäre Formulierungen, Suppositorien und transdermale Anwendungen ein. Das Dosisregime kann ein Einzeldosisplan oder ein Mehrfachdosisplan sein. Der Impfstoff kann zusammen mit anderen immunregulatorischen Mitteln verabreicht werden.
Mit dem Begriff "rekombinantes Polynucleotid", wie er hier verwendet ist, soll ein Polynucleotid von genomischem, cDNA-, semisynthetischem oder synthetischem Ursprung gemeint sein, das aufgrund seines Ursprungs oder seiner Bearbeitung (1) nicht mit einem gesamten oder einem Teil eines Polynucleotids, mit dem es in der Natur kombiniert ist, assoziiert ist, (2) mit einem Polynucleotid verbunden ist, das anders ist als das, mit dem es in der Natur verbunden ist, oder (3) nicht in der Natur auftritt.
Der Begriff "Polynucleotid", wie er hier verwendet ist, betrifft eine polymere Form von Nucleotiden beliebiger Länge, entweder Ribonucleotide oder Desoxyribonucleotide. Dieser Begriff betrifft nur die Primärstruktur des Moleküls. Daher schließt dieser Begriff doppel- und einzelsträngige DNA und RNA ein. Er schließt auch bekannte Modifizierungsarten ein, beispielsweise auf diesem Gebiet bekannte Markierungen, Methylierungen, "Cap-Strukturen", Substitution von einem oder mehreren der natürlich auftretenden Nucleotide mit einem Analogon, Modifizierungen zwischen Nucleotiden, wie beispielsweise solche mit ungeladenen Bindungen (z. B. Methylphosphonate, Phosphotriester, Phosphoamidate, Carbamate, etc.) und mit geladenen Bindungen (z. B. Phosphorthioate, Phosphordithioate, etc.), solche, die angehängte Einheiten wie beispielsweise Proteine enthalten (einschließlich z. B. Nucleasen, Toxinen, Antikörpern, Signalpeptiden, Poly-L-lysin, etc.), solche mit Interkalatoren (z. B. Acridin, Psoralen, etc.), solche, die Komplexbildner (z. B. Metalle, radioaktive Metalle, Bor, oxidative Metalle, etc.) enthalten, solche, die Alkylatoren enthalten, solche mit modifizierten Verknüpfungen (z. B. alphaanomere Nucleinsäuren, etc.) sowie nichtmodifizierte Formen des Polynucleotids.
Ein "Replikon" ist ein beliebiges genetisches Element, z. B. ein Plasmid, ein Chromosom, ein Virus, ein Cosmid, etc., das sich als autonome Einheit der Polynucleotidreplikation in einer Zelle verhält, das also befähigt ist, sich unter seiner eigenen Kontrolle zu replizieren. Dies kann wählbare Marker einschließen.
Ein "Vektor" ist ein Replikon, an das ein anderer Polynucleotidabschnitt gebunden ist, so dass die Replikation und/oder Expression des gebundenen Abschnitts herbeigeführt wird.
"Kontrollsequenz" bezieht sich auf Polynucleotidsequenzen, die notwendig sind, um die Expression der codierenden Sequenzen herbeizuführen, an denen sie ligasiert sind. Die Natur derartiger Kontrollsequenzen unterscheidet sich abhängig vom Wirtsorganismus; bei Prokaryonten schließen derartige Kontrollsequenzen im Allgemeinen einen Promotor, die ribosomale Bindungsstelle und die Transkriptionsterminationssequenz ein; bei Eukaryonten schließen derartige Kontrollsequenzen im Allgemeinen Promotoren und die Transkriptionsterminationssequenz ein. Der Begriff "Kontrollsequenzen" soll mindestens alle Bestandteile einschließen, deren Vorliegen für die Expression notwendig ist, und kann auch zusätzliche Bestandteile einschließen, deren Vorliegen vorteilhaft ist, beispielsweise Leader-Sequenzen und Fusionspartnersequenzen.
"Operativ verknüpft" bezieht sich auf eine Nebeneinanderstellung, wobei die so beschriebenen Bestandteile in einer Beziehung stehen, die es ihnen erlaubt, auf ihre vorgesehene Weise zu funktionieren. Eine Kontrollsequenz, die mit einer codierenden Sequenz "operativ verknüpft" ist, ist so ligasiert, dass die Expression der codierenden Sequenz unter Bedingungen erreicht wird, die mit den Kontrollsequenzen kompatibel sind.
Ein "offener Leserahmen" (ORF) ist ein Bereich einer Polynucleotidsequenz, die ein Polypeptid codiert; dieser Bereich kann einen Teil einer codierenden Sequenz oder eine vollständige codierende Sequenz ausmachen.
Eine "codierende Sequenz" ist eine Polynucleotidsequenz, die gewöhnlich über eine mRNA in ein Polypeptid translatiert wird, wenn sie unter die Kontrolle geeigneter regulatorischer Sequenzen gebracht wird. Die Grenzen der codierenden Sequenz werden durch ein Translationsstartcodon am 5'-Ende und ein Translationsstoppcodon am 3'-Ende bestimmt. Eine codierende Sequenz kann cDNA und rekombinante Polynucleotidsequenzen einschließen, ist jedoch nicht darauf beschränkt.
"PCR" bezieht sich auf das Verfahren der Polymerasekettenreaktion, wie bei Saiki et al., Nature 324: 163 (1986) und Scharf et al., Science (1986) 233: 1076–1078 sowie in US 4 683 195 und US 4 683 202 beschrieben.
Wie hier verwendet, ist x im Hinblick auf y "heterolog", falls x nicht natürlich mit y auf identische Weise assoziiert ist; d. h. x ist in der Natur nicht mit y assoziiert, oder x ist nicht auf dieselbe Weise mit y assoziiert, wie man es in der Natur findet.
"Homologie" bezieht sich auf den Ähnlichkeitsgrad zwischen x und y. Die Übereinstimmung zwischen der Sequenz einer Form mit der einer anderen kann durch auf diesem Fachgebiet bekannte Verfahren bestimmt werden. Sie können beispielsweise durch einen direkten Vergleich der Sequenzinformation des Polynucleotids bestimmt werden. Alternativ kann die Homologie durch Hybridisierung der Polynucleotide unter Bedingungen bestimmt werden, die stabile Doppelstrangmoleküle zwischen homologen Bereichen (beispielsweise diejenigen, die vor der S₁-Spaltung verwendet werden würden) bilden, worauf ein Verdau mit einzelstrangspezifischen Nucleasen/einer einzelstrangspezifischen Nuclease folgt und sich eine Größenbestimmung der gespaltenen Fragmente anschließt.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "Polypeptid" auf ein Polymer von Aminosäuren und bezieht sich nicht auf eine spezielle Länge des Produkts; deshalb umfasst die Definition des Polypeptids Peptide, Oligopeptide und Proteine. Dieser Begriff bezieht sich auch nicht auf Modifizierungen des Polypeptids nach der Expression, beispielsweise Glykosylierungen, Acetylierungen, Phosphorylierungen und dergleichen, oder schließt sie nicht aus. Die Definition umfasst beispielsweise Polypeptide, die ein oder mehrere Analoga einer Aminosäure enthalten (einschließlich beispielsweise nicht natürliche Aminosäuren, etc.), Polypeptide mit substituierten Bindungen sowie andere auf diesem Fachgebiet bekannte Modifizierungen, die sowohl natürlich als auch nicht natürlich auftreten.
Ein Polypeptid oder eine Aminosäuresequenz, "stammend von" einer bestimmten Nucleinsäuresequenz, bezieht sich auf ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die mit derjenigen eines Polypeptids identisch ist, das in der Sequenz oder einem Teil davon codiert ist, wobei der Teil aus mindestens 3-5 Aminosäuren, stärker bevorzugt aus mindestens 8-10 Aminosäuren und noch stärker bevorzugt aus mindestens 11-15 Aminosäuren besteht, oder das immunologisch mit einem Polypeptid identifizierbar ist, das in der Sequenz codiert ist. Diese Terminologie schließt auch ein Polypeptid ein, das von einer bestimmten Nucleinsäuresequenz exprimiert wird.
Das Protein kann verwendet werden, um monoklonale oder polyklonale Antikörper zu produzieren, die für das Protein spezifisch sind. Die Verfahren zur Herstellung dieser Antikörper sind im Stand der Technik bekannt.
"Rekombinante Wirtzellen", "Wirtzellen", "Zellen", "Zellkulturen" und andere derartige Begriffe bezeichnen beispielsweise Mikroorganismen, Insektenzellen und Säugerzellen, die als Empfänger für rekombinante Vektoren oder andere Transfer-DNA verwendet werden können oder verwendet wurden, und schließen die Nachkommen schaft der ursprünglichen transformierten Zelle ein. Es sollte klar sein, dass die Nachkommenschaft einer einzelnen Elternzelle in der Morphologie oder im genomischen oder Gesamt-DNA-Komplement mit dem ursprünglichen Elternteil aufgrund natürlicher, zufälliger oder absichtlicher Mutation nicht unbedingt vollkommen identisch sein muss. Beispiele für Säuger-Wirtzellen schließen Chinesische-Hamster-Ovarien(CHO)-Zellen und Affennieren(COS)-Zellen ein.
Wie hier spezifisch verwendet, bezieht sich "Zelllinie" auf eine Population von Zellen, die in vitro kontinuierlich oder verlängert wachsen und sich teilen können. Häufig sind Zelllinien Klonpopulationen, die von einer einzelnen Vorläuferzelle stammen. Es ist ferner im Stand der Technik bekannt, dass spontane oder induzierte Änderungen im Karyotyp während der Lagerung oder des Transfers derartiger Klonpopulationen auftreten können. Deshalb können Zellen, die von der Zelllinie stammen, auf die Bezug genommen wird, nicht ganz genau identisch mit den Vorläuferzellen oder -kulturen sein, und die Zelllinie, auf die Bezug genommen wird, schließt derartige Varianten ein. Der Begriff "Zelllinien" schließt auch immortalisierte Zellen ein. Vorzugsweise schließen Zelllinien nichthybride Zelllinien oder Hybridome von lediglich zwei Zelltypen ein.
Wie hier verwendet, schließt der Begriff "Mikroorganismus" prokaryontische und eukaryontische Mikrobenspecies wie Bakterien und Pilze ein, wobei die Letzteren Hefen und filamentöse Pilze einschließen.
"Transformation", wie hier verwendet, bezieht sich auf den Einbau eines exogenen Polynucleotids in eine Wirtzelle, unabhängig vom für den Einbau angewandten Verfahren, beispielsweise direkte Aufnahme, Transduktion, f-Paarung oder Elektroporation. Das exogene Polynucleotid kann als nicht integrierter Vektor, beispielsweise als Plasmid, beibehalten oder alternativ in das Wirtsgenom integriert werden.
Mit "genomisch" ist eine Sammlung oder Genbank von DNA-Molekülen gemeint, die von Restriktionsfragmenten stammen, die in Vektoren kloniert wurden. Dies kann das gesamte genetische Material eines Organismus oder einen Teil davon einschließen.
Mit "cDNA" ist eine komplementäre DNA-Sequenz gemeint, die mit einem komplementären DNA-Strang hybridisiert.
Mit "gereinigt" und "isoliert" ist gemeint, dass bei Bezugnahme auf eine Polypeptid- oder Nucleotidsequenz das angegebene Molekül vorliegt und andere biologische Makromoleküle derselben Art im Wesentlichen nicht vorliegen. Der Begriff "gereinigt", wie hier verwendet, bedeutet, dass vorzugsweise mindestens 75 Gew.-%, bevorzugter mindestens 85 Gew.-%, noch mehr bevorzugt mindestens 95 Gew.-% und am meisten bevorzugt mindestens 98 Gew.-% der biologischen Makromoleküle der gleichen Art vorliegen (es können jedoch Wasser, Puffer und andere kleine Moleküle, insbesondere Moleküle mit einem Molekulargewicht von weniger als 1000, vorliegen).
Wenn die geeignete codierende Sequenz einmal isoliert ist, kann sie in eine Vielzahl verschiedener Expressionssysteme exprimiert werden, beispielsweise solchen, bei denen Säugerzellen, Baculoviren, Bakterien und Hefen verwendet werden.
i. Säugersysteme
Säugerexpressionssysteme sind im Stand der Technik bekannt. Ein Säuger-Promotor ist eine beliebige DNA-Sequenz, die Säuger-RNA-Polymerase binden und die Transkription stromabwärts (3') von einer codierenden Sequenz (z. B. Strukturgen) in mRNA initiieren kann. Ein Promotor besitzt einen Transkriptionsinitiationsbereich, der sich gewöhnlich proximal zum 5'-Ende der codierenden Sequenz befindet, und eine TATA-Box, die sich gewöhnlich 25–30 Basenpaare (bp) stromaufwärts der Transkriptionsinitiationsstelle befindet. Es wird angenommen, dass die TATA-Box die RNA-Polymerase II steuert, damit die RNA-Synthese an der richtigen Stelle beginnt. Ein Säuger-Promotor enthält ferner ein stromaufwärts gelegenes Promotorelement, das sich gewöhnlich 100 bis 200 bp stromaufwärts der TATA-Box befindet. Ein stromaufwärts gelegenes Promotorelement bestimmt die Rate, mit der die Transkription initiiert wird, und kann in eine der beiden Orientierungen wirken [Sambrook at al. (1989) "Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells", in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl.]
Gene von Säugerviren werden häufig in hohem Ausmaß exprimiert und haben ein breites Wirtsspektrum; deshalb stellen Sequenzen, die Gene von Säugerviren codieren, besonders nützliche Promotorsequenzen dar. Beispiele schließen den frühen SV40-Promotor, den Maus-Mamma-Tumorvirus-LTR-Promotor, den späten Adenovirus-Hauptpromotor (Ad MLP) und den Herpes-simplex-Virus-Promotor ein. Zusätzlich stellen die Sequenzen, die von nicht viralen Genen stammen, wie das Maus-Metallothionein-Gen ebenfalls nützliche Promotorsequenzen dar. Die Expression kann entweder konstitutiv oder reguliert (induzierbar) sein und kann abhängig vom Promotor mit Glucocorticoid in hormonreaktiven Zellen induziert werden.
Das Vorliegen eines Enhancer- bzw. Verstärkerelements (Enhancer bzw. Verstärker) in Kombination mit den vorstehend beschriebenen Promotorelementen erhöht gewöhnlich die Expressionsniveaus. Ein Verstärker ist eine regulatorische DNA-Sequenz, welche die Transkription bis zu 1000-fach stimulieren kann, wenn sie mit homologen oder heterologen Promotoren verknüpft ist, wobei die Synthese an der normalen RNA-Startstelle beginnt. Verstärker sind auch aktiv, wenn sie sich stromaufwärts oder stromabwärts von der Transkriptionsinitiationsstelle, entweder in normaler oder umgedrehter Orientierung, oder in einer Entfernung von mehr als 1000 Nucleotiden vom Promotor befinden [Maniatis et al. (1987) Science 236: 1237; Alberts et al. (1989) Molecular Biology of the Cell. 2. Aufl.]. Von Viren stammende Verstärkerelemente können besonders nützlich sein, da sie gewöhnlich über ein breiteres Wirtsspektrum verfügen. Beispiele schließen den frühen SV40-Genverstärker [Dijkema et al. (1985) EMBO J. 4: 761] und die Verstärker/Promotoren ein, die von der langen endständigen Wiederholung (LTR) des Rous-Sarcom-Virus [Gorman et al. (1982b) Proc. Natl. Acad. Sci. 79: 6777] sowie vom menschlichen Cytomegalievirus [Boshart et al. (1985) Cell 41: 521] stammen. Zusätzlich sind einige Verstärker regulierbar und werden nur in Gegenwart eines Inducers wie eines Hormons oder eines Metallions aktiv [Sassone-Corsi und Borelli (1986) Trends Genet. 2: 215; Maniatis et al. (1987) Science 236: 1237].
Ein DNA-Molekül kann intracellulär in Säugerzellen exprimiert werden. Eine Promotorsequenz kann direkt mit dem DNA-Molekül verbunden sein, wobei in diesem Fall die erste Aminosäure am N-Terminus des rekombinanten Proteins immer ein Methionin ist, das durch das ATG-Start-Codon codiert wird. Falls gewünscht, kann der N-Terminus durch In-vitro-Inkubation mit Bromcyan vom Protein abgespalten werden.
Alternativ können Fremdproteine auch aus der Zelle in das Wachstumsmedium sezerniert werden, indem chimäre, ein Fusionsprotein codierende DNA-Moleküle erzeugt werden, die aus einem Leadersequenzfragment bestehen, das für die Sekretion des Fremdproteins in Säugerzellen sorgt. Vorzugsweise gibt es Angriffsstellen, die zwischen dem Leaderfragment und dem Fremdproteingen codiert sind und entweder in vivo oder in vitro gespalten werden können. Das Leadersequenzfragment codiert gewöhnlich ein Signalpeptid, das aus hydrophoben Aminosäuren besteht, welche die Sekretion des Proteins aus der Zelle lenken. Der Adenovirus-Tripartite-Leader ist ein Beispiel für eine Leadersequenz, die für die Sekretion eines Fremdproteins in Säugerzellen sorgt.
Die Transkriptionsterminations- und Polyadenylierungssequenzen, die von Säugerzellen erkannt werden, sind gewöhnlich regulatorische Bereiche, die sich 3'-ständig zum Translationsstoppcodon befinden und daher zusammen mit den Promotorelementen die codierende Sequenz flankieren. Das 3'-Ende der reifen mRNA wird durch ortsspezifische posttransskriptionale Spaltung und Polyadenylierung erzeugt [Birnstiel et al. (1985) Cell 41: 349; Proudfoot und Whitelaw (1988) "Termination and 3' end processing of eukaryotic RNA", in Transcription and splicing (Herausg. B. D. Hames und D. M. Glover); Proudfoot (1989) Trends Biochem. Sci. 14: 105]. Diese Sequenzen steuern die Transkription einer mRNA, die in das Polypeptid translatiert werden kann, das von der DNA codiert wird. Beispiele für Transkriptionterminations/Polyadenylierungssignale schließen diejenigen ein, die von SV40 stammen [Sambrook et al. (1989) "Expression of cloned genes in cultured mammalian cells", in Molecular Cloning: A Laboratary Manual].
Einige Gene können effizienter exprimiert werden, wenn Introns (auch als intervenierende Sequenzen bezeichnet) vorliegen. Einige cDNAs wurden jedoch effizient von Vektoren exprimiert, denen Spleiß-Signale (auch als Spleißdonor- und -akzeptorstellen bezeichnet) fehlen [vgl. z. B., Gothing und Sambrook (1981) Nature 293: 620). Introns sind intervenierende, nichtcodierende Sequenzen innerhalb einer codierenden Sequenz, die Spleißdonor- und -akzeptorstellen enthalten. Sie werden durch ein Verfahren entfernt, das als "Spleißen" bezeichnet wird, worauf die Polyadenylierung des primären Transkripts folgt [Nevins (1983) Annu. Rev. Biochem. 52: 441; Green (1986) Annu. Rev. Genet. 20: 671; Padgett et al. (1986) Annu. Rev. Biochem. 55: 1119; Krainer und Maniatis (1988) "RNA splicing", in Transcription and splicing (Herausg. B. D. Hames und D. M. Glover)].
Die vorstehend beschriebenen Bestandteile, die einen Promotor, ein Polyadenylierungssignal und eine Transkriptionsterminationssequenz umfassen, werden gewöhnlich zu Expressionskonstrukten zusammengesetzt. Verstärker, Introns mit funktionalen Spleißdonor- und -akzeptorstellen und Leadersequenzen können ebenfalls in ein Expressionskonstrukt eingeschlossen werden, falls gewünscht. Die Expressionskonstrukte werden häufig in einem Replikon wie einem extrachromosomalen Element (z. B. Plasmiden) gehalten, das zu einer stabilen Erhaltung in einem Wirt wie Säugerzellen oder Bakterien fähig ist. Säugerreplikationssysteme schließen solche ein, die von tierischen Viren stammen, die zur Replikation transagierende Faktoren benötigen. Plasmide, welche die Replikationssysteme von Papovaviren wie SV40 [Gluzman (1981) Cell 23: 175] oder Polyomavirus enthalten, replizieren beispielsweise zu einer extrem hohen Kopienzahl in Gegenwart des geeigneten viralen T-Antigens. Zusätzliche Beispiele für Säugerreplikons schließen solche ein, die vom Rinder-Papillomavirus und vom Epstein-Barr-Virus stammen. Zusätzlich kann das Replikon zwei Replikationssysteme besitzen, die folglich zulassen, dass es beispielsweise in Säugerzellen zur Expression sowie in einem prokaryontischen Wirt zur Klonierung und Amplifizierung gehalten wird. Beispiele derartiger Säuger-Bakterien-Shuttlevektoren schließen pMT2 [Kaufman et al. (1989) Mol. Cell. Biol. 9: 946] und pHEBO [Shimizu et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 1074] ein.
Das angewandte Transformationsverfahren hängt vom zu transformierenden Wirt ab. Verfahren zur Einführung heterologer Polynucleotide in Säugerzellen sind im Stand der Technik bekannt und schließen Dextran-vermittelte Transfektion, Calciumphosphat-präzipitation, Polybren-vermittelte Transfektion, Protoplastenfusion, Elektroporation, Verkapselung der Polynucleotide/des Polynucleotids in Liposomen und die direkte Mikroinjektion der DNA in Zellkerne ein.
Säugerzelllinien, die als Wirte zur Expression zur Verfügung stehen, sind im Stand der Technik bekannt und schließen zahlreiche immortalisierte Zelllinien ein, die von der American Type Culture Collection (ATCC) zur Verfügung stehen, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf Chinesische-Hamster-Ovarien(CHO)-Zellen, HeLa-Zellen, Babyhamsternieren(BHK)-Zellen, Affennierenzellen (COS), menschliche hepatocelluläre Carcinomzellen (z. B. Hep G2) und eine Anzahl anderer Zelllinien.
ii. Baculovirussysteme
Das das Protein codierende Polynucleotid kann auch in einen geeigneten Insektenexpressionsvektor eingebaut werden und ist mit den Kontrollelementen in diesem Vektor operativ verknüpft. Bei der Vektorkonstruktion werden Verfahren eingesetzt, die im Stand der Technik bekannt sind.
Allgemein umfassen die Expressionssystemkomponenten einen Transfervektor, gewöhnlich ein Bakterienplasmid, das sowohl ein Fragment des Baculovirusgenoms als auch eine geeignete Restriktionsstelle zum Einbau des/der zu exprimierenden heterologen Gens oder Gene enthält, einen Wildtyp-Baculovirus mit einer Sequenz, die zum Baculovirus-spezifischen Fragment im Transfervektor homolog ist, (dies erlaubt die homologe Rekombination des heterologen Gens in das Baculovirusgenom), und geeignete Insektenwirtzellen und Wachstumsmedien.
Nach dem Einbau der das Protein codierenden DNA-Sequenz in den Transfervektor werden der Vektor und das Wildtypvirusgenom in eine Insektenwirtzelle transfiziert, in der man den Vektor und das Virusgenom rekombinieren lässt. Das verpackte rekombinante Virus wird exprimiert, und die rekombinanten Plaques werden identifiziert und gereinigt. Materialien und Methoden für die Baculovirus/Insektenzellexpressionssysteme sind im Handel in Form eines Kits erhältlich, unter anderem von Invitrogen, San Diego CA ("Max-Bac"-Kit). Diese Verfahren sind Fachleuten allgemein bekannt und sind bei Summers und Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin Nr. 1555 (1987) (hier nachstehend "Summers und Smith") umfassend beschrieben.
Vor dem Einbau der das Protein codierenden DNA-Sequenz in das Baculovirusgenom werden die vorstehend beschriebenen Bestandteile, umfassend einen Promotor, einen Leader (falls gewünscht), die interessierende codierende Sequenz und die Transkriptionsterminationssequenz gewöhnlich zu einem Transplacement-Zwischenproduktkonstrukt (Transfervektor) zusammengefügt. Dieses Konstrukt kann ein Einzelgen und operativ verknüpfte regulatorische Elemente, multiple Gene, jedes mit seinem eigenen Satz operativ verknüpfter regulatorischer Elemente, oder multiple Gene enthalten, die von demselben Satz regulatorischer Elemente reguliert werden. Transplacement-Zwischenproduktkonstrukte werden häufig in einem Replikon wie einem extrachromosomalen Element (z. B. Plasmiden) erhalten, das zu einer stabilen Erhaltung in einem Wirt wie einem Bakterium befähigt ist. Das Replikon besitzt ein Replikationssystem, das folglich in einem geeigneten Wirt zur Klonierung und Amplifizierung gehalten werden kann.
Derzeit ist der am häufigsten verwendete Transfervektor zur Einführung von Fremdgenen in AcNPV der Vektor pAc373. Zahlreiche andere Vektoren, die den Fachleuten bekannt sind, wurden ebenfalls konstruiert. Hierzu gehören beispielsweise pVL985 (der das Polyhedrin-Startcodon von ATG in ATT ändert und der eine BamHI-Klonierungsstelle 32 Basenpaare stromabwärts von AU einführt, vgl. Luckow und Summers, Virology (1989) 17: 31.
Das Plasmid enthält gewöhnlich auch das Polyhedrin-Polyadenylierungssignal (Miller et al. (1988) Ann. Rev. Microbiol., 42: 177) und ein prokaryontisches Ampicillinresistenz (amp)-Gen sowie einen Replikationsursprung zur Selektion und Vermehrung in E. coli.
Baculovirus-Transfervektoren enthalten gewöhnlich einen Baculovirus-Promotor. Ein Baculovirus-Promotor ist eine beliebige DNA-Sequenz, die eine Baculovirus-RNA-Polymerase binden und die Transkription einer codierenden Sequenz (z. B. Strukturgen) stromabwärts (5' bis 3') in eine mRNA initiieren kann. Ein Promotor besitzt einen Transkriptionsinitiationsbereich, der sich gewöhnlich proximal zum 5'-Ende der codierenden Sequenz befindet. Dieser Transkriptionsinitiationsbereich schließt gewöhnlich eine RNA-Polymerasebindungsstelle und eine Transkriptionsinitiationsstelle ein. Ein Baculovirus-Transfervektor kann auch eine zweite Domäne besitzen, die als Verstärker bezeichnet wird, der sich, falls vorhanden, gewöhnlich distal zum Strukturgen befindet. Die Expression kann entweder reguliert oder konstitutiv sein.
Strukturgene, die spät in einem Virusinfektionszyklus in hohem Ausmaß transkribiert werden, stellen besonders nützliche Promotorsequenzen dar. Beispiele hierfür umfassen Sequenzen, die von dem Gen stammen, welches das virale Polyhedrin-Protein codiert, Friesen et al., (1986). "The Regulation of Baculovirus Gene Expression", in: The Molecular Biology of Baculoviruses (Herausg. Walter Doerfler), EPA-Publ. Nr. 127 839 und 155 476, und dem Gen, welches das p10-Protein codiert, Vlak et al., (1988), J. Gen. Virol. 69: 765.
Geeignete Signalsequenzen codierende DNA kann von Genen für sezernierte Insekten- oder Baculovirusproteine wie das Baculovirus-Polyhedrin-Gen stammen (Carbonell et al. (1988) Gene, 73: 409). Da die Signale für posttranslationale Modifizierungen von Säugerzellen (wie Signalpeptidspaltung, proteolytische Spaltung und Phosphorylierung) von Insektenzellen erkannt zu werden scheinen und die Signale, die für die Sekretion und Kernakkumulation erforderlich sind, auch zwischen Invertebratenzellen und Vertebratenzellen konserviert zu sein scheinen, können alternativ Leader, die nicht von Insekten stammen, wie diejenigen, die von Genen stammen, die menschliches α-Interferon, Maeda. et al., (1985), Nature 315: 592, menschliches Gastrin-freisetzendes Peptid, Lebacq-Verheyden et al., (1988), Molec. Cell. Biol. 8: 3129, menschliches IL-2, Smith et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 8404; Maus-IL-3, Miyajima et al., (1987) Gene 58: 273, und menschliche Glucocerebrosidase codieren, Martin et al. (1988) DNA, 7: 99, ebenfalls verwendet werden, um für die Sekretion in Insekten zu sorgen.
Ein rekombinantes Polypeptid oder Polyprotein kann intracellulär exprimiert werden oder, falls es mit den geeigneten regulatorischen Sequenzen exprimiert wird, sezerniert werden. Eine gute intracelluläre Expression von nichtfusionierten Fremdproteinen erfordert gewöhnlich heterologe Gene, die idealerweise eine kurze Leadersequenz besitzen, die geeignete Translationsinitiationssignale enthält, die sich vor einem ATG-Start-Signal befinden. Falls gewünscht, kann Methionin am N-Terminus durch In-vitro-Inkubation mit Bromcyan vom reifen Protein abgespalten werden.
Alternativ können rekombinante Polyproteine oder Proteine, die nicht natürlich sezerniert werden, aus der Insektenzelle sezerniert werden, indem chimäre DNA-Moleküle erzeugt werden, die ein Fusionsprotein codieren, das ein Fragment mit Leadersequenz enthält, das zur Sekretion des Fremdproteins in Insekten führt. Das Leadersequenzfragment codiert gewöhnlich ein Signalpeptid, das aus hydrophoben Aminosäuren besteht, welche die Translokation des Proteins in das endoplasmatische Reticulum steuern.
Nach der Einführung der DNA-Sequenz und/oder des Gens, das den Expressionsproduktvorläufer des Proteins codiert, wird ein Insektenzellenwirt mit der heterologen DNA des Transfervektors und der genomischen DNA des Wildtyp-Baculovirus – gewöhnlich durch Cotransfektion – cotransformiert. Die Promotor- und Transkriptionsterminationssequenz des Konstrukts enthält gewöhnlich einen Abschnitt des Baculovirusgenoms von 2–5 kb.
Verfahren zur Einführung heterologer DNA in die gewünschte Stelle im Baculovirus sind im Stand der Technik bekannt (vgl. Summers und Smith a. a. O.; Ju et al. (1987); Smith et al., Mol. Cell. Biol. (1983) 3: 2156 und Luckow und Summers (1989)). Der Einbau kann beispielsweise in ein Gen wie das Polyhedrin-Gen durch homologe doppelte Crossoverrekombination erfolgen; der Einbau kann auch in eine Restriktionsenzymschnittstelle erfolgen, die im gewünschten Baculovirusgen konstruiert wurde, Miller et al., (1989), Bioessays 4: 91. Die DNA-Sequenz wird, wenn sie anstatt des Polyhedrin-Gens in den Expressionsvektor kloniert wurde, sowohl 5'-seitig als auch 3'-seitig von Polyhedrin-spezifischen Sequenzen flankiert und befindet sich stromabwärts des Polyhedrinpromotors.
Der neu erzeugte Baculovirus-Expressionsvektor wird anschließend in ein infektiöses rekombinantes Baculovirus verpackt. Homologe Rekombination tritt mit geringer Häufigkeit auf (zwischen 1 % und etwa 5 %); daher ist die Mehrheit des nach der Cotransfektion produzierten Virus immer noch das Wildtypvirus. Deshalb ist ein Verfahren notwendig, um rekombinante Viren zu identifizieren. Ein Vorteil des Expressionssystems ist eine visuelle Durchmusterung, die es erlaubt, rekombinante Viren zu erkennen. Das Polyhedrinprotein, das vom nativen Virus produziert wird, wird in sehr hohen Niveaus im Kern infizierter Zellen zu einem späten Zeitpunkt nach der Virusinfektion produziert. Akkumuliertes Polyhedrinprotein bildet Einschlusskörper, die ebenfalls eingebettete Partikel enthalten. Diese Einschlusskörper, die bis 15 μm groß sind, sind stark lichtbrechend, was ihnen ein hell glänzendes Aussehen verleiht, das leicht unter dem Lichtmikroskop sichtbar gemacht werden kann. Mit rekombinanten Viren infizierten Zellen fehlen Einschlusskörper. Um rekombinante Viren vom Wildtypvirus zu unterscheiden, wird zur Plaquebildung der Transfektionsüberstand nach Verfahren, die den Fachleuten bekannt sind, auf eine Monoschicht von Insektenzellen gegeben. Die Plaques werden nämlich unter dem Lichtmikroskop auf das Vorliegen (zeigt ein Wildtyp-Virus an) oder das Fehlen (zeigt ein rekombinantes Virus an) von Einschluusskörpern durchmustert, "Current Protocols in Microbiology" Bd. 2 (Ausubel et al. Herausg.) bei 16.8 (Ergänz. 10, 1990); Summers und Smith, a. a. O.; Miller et al. (1989).
Rekombinante Baculovirus-Expressionsvektoren wurden zur Infektion in mehreren Insektenzellen entwickelt. Rekombinante Baculoviren wurden unter anderem beispielsweise entwickelt für Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda und Trichoplusia ni (PCT-Veröffentl., Nr. WO 89/046699; Carbonell et al., (1985) J. Virol. 56: 153; Wright (1986) Nature 321: 718; Smith et al., (1983) Mol. Cell. Biol. 3: 2156 und vgl. allgemein Fraser et al. (1989) In Vitro Cell. Dev. Biol. 25: 225).
Zellen und Zellkulturmedien sind sowohl für die direkte Expression als auch für die Fusionsexpression von heterologen Polypeptiden in einem Baculovirus-Expressionssystem im Handel erhältlich; die Zellkulturtechnologie ist Fachleuten allgemein bekannt, vgl. z. B. Summers und Smith a. a. O.
Die modifizierten Insektenzellen können dann in einem geeigneten Nährmedium gezüchtet werden, das die stabile Erhaltung des Plasmids/der Plasmide ermöglicht, das/die in dem modifizierten Insektenwirt vorliegt/vorliegen. Wenn das Expressionsproduktgen unter induzierbarer Kontrolle ist, kann der Wirt zu einer hohen Dichte gezüchtet und die Expression induziert werden. Wenn die Expression konstitutiv ist, wird das Produkt alternativ kontinuierlich in das Medium exprimiert, und das Nährmedium muss kontinuierlich zirkuliert werden, während das interessierende Produkt entfernt wird und verbrauchte Nährstoffe ergänzt werden. Das Produkt kann durch Verfahren wie Chromatographie, z. B. HPLC, Affinitätschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, etc., Elektrophorese, Dichtegradientenzentrifugation, Lösungsmittelextraktion oder dergleichen gereinigt werden. Das Produkt kann gegebenenfalls auf geeignete Weise weiter gereinigt werden, damit im Wesentlichen alle Insektenproteine entfernt werden, die auch in das Medium sezerniert werden oder auf die Lyse von Insektenzellen zurückzuführen sind, so dass ein Produkt bereitgestellt wird, das zumindest im Wesentlichen von Wirtzelltrümmern, z. B. Proteinen, Lipiden und Polysacchariden, frei ist.
Um Proteinexpression zu erhalten, werden die rekombinanten, von den Transformanten stammenden Wirtzellen unter Bedingungen inkubiert, welche die Expression der das rekombinante Protein codierenden Sequenz zulassen. Diese Bedingungen variieren abhängig von der gewählten Wirtzelle. Diese Bedingungen sind jedoch aufgrund ihres Fachwissens für Fachleute leicht zu ermitteln.
iii. Bakterielle Systeme
Bakterielle Expressionsverfahren sind im Stand der Technik bekannt. Ein bakterieller Promotor ist eine beliebige DNA-Sequenz, die bakterielle RNA-Polymerase binden und die Transkription einer codierenden Sequenz (z.B. eines Strukturgens) in mRNA stromabwärts (3') initiieren kann. Ein Promotor besitzt einen Transkriptionsinitiationsbereich, der sich gewöhnlich proximal zum 5'-Ende der codierenden Sequenz befindet. Dieser Transkriptionsinitiationsbereich enthält gewöhnlich eine RNA-Polymerasebindungsstelle und eine Transkriptionsinitiationsstelle. Ein bakterieller Promotor kann auch eine zweite Domäne besitzen, die als Operator bezeichnet wird und eine benachbarte RNA-Polymerasebindungsstelle überlappen kann, an der die RNA-Synthese beginnt. Der Operator lässt negativ regulierte (induzierbare) Transkription zu, da ein Genrepressorprotein den Operator binden kann und daher die Transkription eines spezifischen Gens hemmt. Die konstitutive Expression kann in Abwesenheit von negativen regulatorischen Elementen wie dem Operator auftreten. Zusätzlich kann die positive Regulation durch eine genaktivierende proteinbindende Sequenz erreicht werden, die sich, falls vorhanden, gewöhnlich proximal (5') zur RNA-Polymerasebindungsstelle befindet. Ein Beispiel für ein genaktivierendes Protein ist das Catabolite-Activator-Protein (CAP), das die Initiation der Transkription des lac-Operons in Escherichia coli (E. coli) unterstützt [Raibaud et al. (1984) Annu. Rev. Genet. 18: 173]. Die regulierte Expression kann deshalb entweder positiv oder negativ sein, wobei die Transkription entweder verstärkt oder verringert wird.
Sequenzen, die Enzyme des Stoffwechselweges codieren, stellen besonders nützliche Promotorsequenzen dar. Beispiele hierfür sind Promotorsequenzen, die von Zucker metabolisierenden Enzymen wie Galactose, Lactose (lac) (Chang et al. (1977) Nature 198: 1056] und Maltose stammen. Weitere Beispiele sind Promotorsequenzen, die von biosynthetischen Enzymen wie Tryptophan (trp) stammen [Goeddel et al. (1980) Nuc. Acids Res. 8: 4057; Yelverton et al. (1981) Nucl. Acids Res. 9: 731; US-Patent Nr. 4 738 921; EPA-Veröffentl. Nr. 036 776 und 121 775]. Das β-Lactamase(bla)-Promotorsystem [Weissmann (1981) "The cloning of interferon and other mistakes"; in Interferon 3 (Herausg. I. Gresser)], und die Bakteriophage-Lambda-PL-[Shimatake et al. (1981) Nature 292: 128] und T5- (US-Patent Nr. 4 689 406] Promotorsysteme stellen ebenfalls nützliche Promotersequenzen dar.
Zusätzlich fungieren synthetische Promotoren, die nicht in der Natur auftreten, ebenfalls als bakterielle Promotoren. Beispielsweise können Transkriptionsaktivierungssequenzen von einem bakteriellen Promotor oder einem Bakteriophagenpromotor mit den Operonsequenzen eines anderen bakteriellen Promotors oder Bakteriophagenpromotors zusammengefügt werden, wodurch ein synthetischer hybrider Promotor erzeugt wird [US-Patent Nr. 4 551 433). Der tac-Promotor ist beispielsweise ein hybrider trp-lac-Promotor, der sowohl aus einem trp-Promotor als auch aus lac-Operonsequenzen besteht und vom lac-Repressor reguliert wird [Amann et al. (1983) Gene 25: 167; de Boer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 21 ]. Ferner kann ein bakterieller Promotor natürlich auftretende Promotoren nichtbakteriellen Ursprungs einschließen, welche die Fähigkeit besitzen, bakterielle RNA-Polymerase zu binden und die Transkription zu initiieren. Ein natürlich auftretender Promotor nichtbakteriellen Ursprungs kann auch mit einer kompatiblen RNA-Polymerase gekoppelt werden, um hohe Expressionsniveaus einiger Gene in Prokaryonten zu erzeugen. Das Bakteriophagen-T7-RNA-Polymerase/Promotersystem ist ein Beispiel eines gekoppelten Promotorsystems [Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189: 113; Tabor et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 1074]. Ferner kann ein hybrider Promotor auch aus einem Bakteriophagenpromotor und einem E. coli-Operatorbereich bestehen (EPA-Veröffentl. Nr. 267 851).
Zusätzlich zu einer funktionierenden Promotorsequenz ist auch eine effiziente ribosomale Bindungsstelle für die Expression von Fremdgenen in Prokaryonten nützlich. Bei E. coli wird die ribosomale Bindungsstelle als Shine-Dalgarno(SD)-Sequenz bezeichnet und umfasst ein Initiationscodon (ATG) und eine Sequenz einer Länge von 3-9 Nucleotiden, die sich 3-11 Nucleotide stromaufwärts des Initiationscodons befinden [Shine et al. (1975) Nature 254: 34]. Es wird angenommen, dass die SD-Sequenz die Bindung von mRNA an das Ribosom durch die Paarung von Basen zwischen der SD-Sequenz und dem 3'-Ende der E. coli-16S-rRNA fördert [Steitz et al. (1979) "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA", in Biological Regulation and Development: Gene Expression (Herausg. R. F. Goldberger)]. Zur Expression eukaryontischer Gene und prokaryontischer Gene mit einer schwachen ribosomalen Bindungsstelle, vgl. Sambrook et al. (1989) "Expression of cloned genes in Escherichia coli", in Molecular Cloning: A Laboratory manual.
Ein DNA-Molekül kann intracellulär exprimiert werden. Eine Promotorsequenz kann direkt mit dem DNA-Molekül verknüpft sein, wobei in diesem Fall die erste Aminosäure am N-Terminus immer ein vom ATG-Startcodon codiertes Methionin ist. Falls gewünscht, kann das Methionin am N-Terminus durch In-vitro-Inkubation mit Bromcyan oder durch In-vivo- oder In-vitro-Inkubation mit einer bakteriellen N-terminalen Methioninpeptidase vom Protein abgespalten werden (EPA-Veröffentl. Nr. 219 237).
Fusionsproteine stellen eine Alternative zur direkten Expression dar. Eine DNA-Sequenz, die den N-terminalen Teil eines endogenen bakteriellen Proteins oder eines anderen stabilen Proteins codiert, wird gewöhnlich an das 5'-Ende von heterologen codierenden Sequenzen fusioniert. Bei der Expression ergibt dieses Konstrukt eine Fusion der beiden Aminosäuresequenzen. So kann beispielsweise das Bakteriophage-Lambda-Zellgen mit dem 5'-Terminus eines Fremdgens verbunden sein und in Bakterien exprimiert werden. Das sich ergebende Fusionsprotein behält vorzugsweise eine Stelle für ein angreifendes Enzym (Faktor Xa) bei, um das Bakteriophagenprotein vom Fremdgen abzuspalten [Nagai et al. (1984) Nature 309: 810]. Fusionsproteine können auch mit Sequenzen aus den Genen lacZ [Jia et al. (1987) Gene 60: 197], trpE [Allen et al. (1987) J. Biotechnol. 5: 93; Makoff et al. (1989) J. Gen. Microbiol. 135: 11] und Chey [EPA-Veröffentl. Nr. 324 647] hergestellt werden. Die DNA-Sequenz an der Verbindungsstelle der beiden Aminosäuresequenzen kann eine spaltbare Stelle codieren oder nicht. Ein weiteres Beispiel ist ein Ubiquitinfusionsprotein. Ein derartiges Fusionsprotein wird mit dem Ubiquitinbereich hergestellt, der vorzugsweise noch eine Stelle für ein angreifendes Enzym aufweist (z.B. Ubiquitin-spezifische umsetzende Protease), um das Ubiquitin vom Fremdprotein abzuspalten. Durch dieses Verfahren kann das native Fremdprotein isoliert werden [Miller et al. (1989) Bio/Technology 7: 698].
Alternativ können Fremdproteine auch aus der Zelle sezerniert werden, indem chimäre DNA-Moleküle erzeugt werden, die ein Fusionsprotein codieren, das ein Signalpeptidsequenzfragment enthält, das für die Sekretion des Fremdproteins in Bakterien sorgt [US-Patent Nr. 4 336 336]. Das Signalsequenzfragment codiert gewöhnlich ein Signalpeptid, das hydrophobe Aminosäuren enthält, welche die Sekretion des Proteins aus der Zelle steuern. Das Protein wird entweder in das Wachstumsmedium (Gram-positive Bakterien) oder in den periplasmatischen Raum sezerniert, der sich zwischen der inneren und der äußeren Membran der Zelle (Gram-negative Bakterien) befindet. Vorzugsweise gibt es Angriffsstellen, die entweder in vivo oder in vitro gespalten werden können und die zwischen dem Signalpeptidfragment und dem Fremdgen codiert sind.
DNA, die geeignete Signalsequenzen codiert, kann von Genen für sezernierte bakterielle Proteine wie dem äußeren Membranproteingen (ompA) von E. coli [Masui et al. (1983), in: Experimental Manipulation of Gene Expression; Ghrayeb et al. (1984) EMBO J. 3 2437] und der alkalischen Phosphatase-Signalsequenz (phoA) von E. coli [Oka et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 7212] stammen. Als weiteres Beispiel kann die Signalsequenz des Alpha-Amylasegens aus verschiedenen Bacillus-Stämmen verwendet werden, um heterologe Proteine aus B. subtilis zu sezernieren [Palva et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5582; EPA-Veröffentl. Nr. 244 042].
Transkriptionsterminationssequenzen, die von Bakterien erkannt werden, sind gewöhnlich regulatorische Bereiche, die sich 3'-ständig zum Translationsstoppcodon befinden und daher zusammen mit dem Promotor die codierende Sequenz flankieren. Diese Sequenzen steuern die Transkription einer mRNA, die in das Polypeptid translatiert wird, das von der DNA codiert wird. Die Transkriptionsterminationssequenzen schließen häufig DNA-Sequenzen mit etwa 50 Nucleotiden ein, die Stamm-Schleifen-Strukturen bilden können, die bei der Termination der Transkription helfen. Beispiele schließen Transkriptionsterminationssequenzen ein, die von Genen mit starken Promotoren wie dem trp-Gen in E. coli sowie anderen biosynthetischen Genen stammen.
Die vorstehend beschriebenen Bestandteile, die einen Promotor, eine Signalsequenz (falls erwünscht), eine interessierende codierende Sequenz und eine Transkriptionsterminationssequenz umfassen, werden gewöhnlich zu Expressionskonstrukten zusammengesetzt. Expressionskonstrukte werden häufig in einem Replikon wie einem extrachromosomalen Element (z.B. Plasmide) erhalten, das zu einer stabilen Erhaltung in einem Wirt, wie Bakterien, befähigt ist. Das Replikon besitzt ein Replikationssystem, das folglich zulässt, dass es entweder zur Expression oder zur Klonierung und Amplifizierung in einem prokaryontischen Wirt beibehalten wird. Zusätzlich kann ein Replikon entweder ein Plasmid mit einer hohen Kopienzahl oder mit einer niedrigen Kopienzahl sein. Ein Plasmid mit einer hohen Kopienzahl besitzt im Allgemeinen eine Kopienzahl in einem Bereich von etwa 5 bis etwa 200 und gewöhnlich von etwa 10 bis etwa 150. Ein Wirt, der ein Plasmid mit einer hohen Kopienzahl enthält, enthält vorzugsweise mindestens etwa 10 Plasmide und mehr bevorzugt mindestens etwa 20 Plasmide. Abhängig von der Wirkung des Vektors und des Fremdproteins auf den Wirt kann entweder ein Vektor mit einer hohen Kopienzahl oder ein Vektor mit einer niedrigen Kopienzahl gewählt werden.
Alternativ können die Expressionskonstrukte mit einem Integrationsvektor in das Bakteriengenom integriert werden. Integrationsvektoren enthalten gewöhnlich mindestens eine Sequenz, die zum bakteriellen Chromosom homolog ist, was die Integration des Vektors zulässt. Die Integrationen scheinen auf Rekombinationen zwischen homologer DNA im Vektor und im bakteriellen Chromosom zurückzuführen zu sein. Beispielswiese integrieren Integrationsvektoren, die mit DNA aus verschiedenen Bacillus-Stämmen konstruiert wurden, in das Bacillus-Chromosom (EPA-Veröffentl. Nr. 127 328). Integrierende Vektoren können auch Bakteriophagen- oder Transposonsequenzen umfassen.
Extrachromosomale und integrierende Expressionskonstrukte können gewöhnlich Selektionsmarker enthalten, so dass die Selektion von Bakterienstämmen ermöglicht wird, die transformiert wurden. Selektionsmarker können im bakteriellen Wirt exprimiert werden und können Gene einschließen, die Bakterien resistent gegenüber Wirkstoffen wie Ampicillin, Chloramphenicol, Erythromycin, Kanamycin (Neomycin) und Tetracyclin machen [Davies et al. (1978) Annu. Rev. Microbiol. 32: 469]. Selektionsmarker können ferner auch biosynthetische Gene wie diejenigen in den Histidin-, Tryptophan- und Leucin-Biosynthesewegen umfassen.
Alternativ können einige der vorstehend beschriebenen Bestandteile zu Transformationsvektoren zusammengesetzt werden. Die Transformationsvektoren umfassen gewöhnlich einen Selektionsmarker, der entweder in einem Replikon erhalten wird oder zu einem Intergrationsvektor entwickelt wird, wie vorstehend beschrieben.
Expressions- und Transformationsvektoren, entweder extrachromosomale Replikons oder Integrationsvektoren, wurden für die Transformation in viele Bakterien entwickelt. So wurden beispielsweise Expressionsvektoren unter anderem für folgende Bakterien entwickelt: Bacillus subtilis [Palva et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5582; EPA-Veröffentl. Nr. 036 259 und 063 953; PCT-Veröffentl. Nr. WO 84/04541], Escherichia coli [Shimatake et al. (1981) Nature 292: 128; Amann et al. (1985) Gene 40: 183; Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189: 113; EPA-Veröffentl. Nr. 036 776, 136 829 und 136 907], Streptococcus cremoris [Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54: 655]; Streptococcus lividans [Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54: 655], Streptomyces lividans [US-Patent Nr. 4 745 056].
Verfahren zur Einführung exogener DNA in bakterielle Wirte sind im Stand der Technik gut bekannt und umfassen gewöhnlich entweder die Transformation von Bakterien, die mit CaCl₂ oder anderen Agentien wie zweiwertigen Kationen und DMSO behandelt wurden. DNA kann auch durch Elektroporation in Bakterienzellen eingeführt werden. Die Transformationsverfahren variieren gewöhnlich je nach den zu transformierenden Bakterienspecies, vgl. z.B. [Masson et al (1989) FEMS Microbiol. Lett 60: 273; Palva et al (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5582; EPA-Veröffentl. Nr. 036 259 und 063 953; PCT-Veröffentl. Nr. WO 84/04541, Bacillus], [Miller et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 856; Wang et al. (1990) J. Bacteriol. 172: 949, Campylobacter], [Cohen et al. (1973) Proc. Natl. Acad. Sci. 69: 2110; Dower et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16: 6127; Kushner (1978) "An improved method for transformation of Escherichia coli with ColEl- derived plasmids", in Genetic Engineering: Proceedings of the International Symposium on Genetic Engineering (Herausg. H. W. Boyer und S. Nicosia); Mandel et al. (1970) J. Mol. Biol. 53: 159; Taketo (1988) Biochim. Biophys. Acta 949: 318; Escherichia], [Chassy et al. (1987) FEMS Microbiol. Lett. 44: 173 Lactobacillus]; [Fiedler et al. (1988) Anal. Biochem 170: 38, Pseudomonas]; [Augustin et al. (1990) FEMS Microbiol. Lett. 66: 203, Staphylococcus], [Barany et al. (1980) J. Bacteriol. 144: 698; Harlander (1987) "Transformation of Streptococcus lactis by electroporation" in: Streptococcal Genetics (Herausg. J. Ferretti und R. Curtiss III); Perry et al. (1981) Infec. Immun. 32: 1295; Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54: 655; Somkuti et al. (1987) Proc. 4^th Evr. Cong. Biotechnology 1: 412, Streptococcus].
iv. Hefe-Expression
Hefe-Expressionsysteme sind Fachleuten ebenfalls bekannt. Ein Hefepromotor ist eine beliebige DNA-Sequenz, die Hefe-RNA-Polymerase binden und die Transkription stromabwärts (3') von einer codierenden Sequenz (z. B. Strukturgen) in mRNA initiieren kann. Ein Promotor besitzt einen Transkriptionsinitiationsbereich, der sich gewöhnlich proximal zum 5'-Ende der codierenden Sequenz befindet. Dieser Transkriptionsinitiationsbereich schließt gewöhnlich eine RNA-Polymerasebindungsstelle (die "TATA-Box") und eine Transkriptionsinitiationsstelle ein. Ein Hefepromotor kann auch eine zweite Domäne besitzen, die als Upstream-Aktivatorsequenz (UAS) bezeichnet wird, die sich, falls vorhanden, gewöhnlich distal zum Strukturgen befindet. Die UAS erlaubt eine regulierte (induzierbare) Expression. Die konstitutive Expression erfolgt bei Abwesenheit einer UAS. Die regulierte Expression kann entweder positiv oder negativ sein, wobei die Transkription entweder verstärkt oder verringert wird.
Hefe ist ein fermentierender Organismus mit einem aktiven Stoffwechselweg, weshalb Sequenzen, die Enzyme im Stoffwechselweg codieren, besonders nützliche Promotorsequenzen darstellen. Beispiele hierfür sind Alkoholdehydrogenase (ADH) (EPA-Veröffentl. Nr. 284 044), Enolase, Glucokinase, Glucose-6-phosphat-isomerase, Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAP oder GAPDH), Hexokinase, Phosphofructokinase, 3-Phosphoglyceratmutase und Pyruvatkinase (PyK) (EPA-Veröffentl. Nr. 329 203). Das Hefe-PHO5-Gen, das saure Phosphatase codiert, ergibt ebenfalls nützliche Promotorsequenzen [Myanohara et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci: USA 80: 1].
Ferner fungieren synthetische Promotoren, die nicht in der Natur vorkommen, ebenfalls als Hefepromotoren. Beispielsweise können UAS-Sequenzen eines Hefepromotors mit dem Transkriptionsaktivierungsbereich eines anderen Hefepromotors verbunden werden, wobei ein synthetischer hybrider Promotor erzeugt wird. Zu den Beispielen für solche hybride Promotoren gehört die regulatorische ADH-Sequenz, die mit dem GAP-Transkriptionsaktivierungsbereich verbunden ist (US-Patente Nr. 4 876 197 und 4 880 734). Andere Beispiele für hybride Promotoren schließen Promotoren ein, die aus den regulatorischen Sequenzen von einem der ADH2-, GAL4-, GAL10- oder PHO5-Gene bestehen, die mit dem Transkriptionsaktivierungsbereich eines Gens eines glycolytischen Enzyms, wie GAP oder PyK (EPA-Veröffentl. Nr. 164 556), kombiniert sind. Ferner kann ein Hefe-Promotor natürlich vorkommende Promotoren einschließen, die keinen Hefeursprung aufweisen und Hefe-RNA-Polymerase binden sowie die Transkription initiieren können. Beispiele für solche Promotoren finden sich unter anderem bei Cohen et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 1078; Henikoff et al. (1981) Nature 283: 835; Hollenberg et al. (1981) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 96: 119; Hollenberg et al. (1979) "The Expression of Bacterial Antibiotic Resistance Genes in the Yeast Saccharomyces cerevisiae", in: Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance (Herausg. K. N. Timmis und A. Puhler); Mercerau-Pulgalon et al. (1980) Gene 11: 163; Panthier et al. (1980) Curr. Genet. 2: 109.
Ein DNA-Molekül kann intracellulär in Hefe exprimiert werden. Eine Promotorsequenz kann direkt mit dem DNA-Molekül verbunden sein, wobei in diesem Fall die erste Aminosäure am N-Terminus des rekombinanten Proteins immer ein Methionin ist, das vom ATG-Start-Codon codiert wird. Falls gewünscht, kann das Methionin am N-Terminus durch In-vitro-Inkubation mit Bromcyan vom Protein abgespalten werden.
Fusionsproteine stellen eine Alternative zu Hefeexpressionssystemen sowohl in Säuger- und Baculovirus- als auch in bakteriellen Expressionssystemen dar. Gewöhnlich ist eine DNA-Sequenz, die den N-terminalen Teil eines endogenen Hefeproteins oder eines anderen stabilen Proteins codiert, an das 5'-Ende von heterologen codierenden Sequenzen fusioniert. Bei der Expression ergibt dieses Konstrukt eine Fusion der beiden Aminosäuresequenzen. Beispielsweise kann das Hefe- oder menschliche Superoxiddismutase(SOD)-Gen mit dem 5'-Terminus eines Fremdgens verbunden sein und in Hefe exprimiert werden. Die DNA-Sequenz an der Verbindung der beiden Amino säuresequenzen kann eine spaltbare Stelle codieren oder nicht, vgl. z.B. die EPA-Veröffentl. Nr. 196 056. Ein weiteres Beispiel ist ein Ubiquitinfusionsprotein. Ein derartiges Fusionsprotein wird mit dem Ubiquitinbereich hergestellt, der vorzugsweise eine Stelle für ein angreifendes Enzym (z.B. eine Ubiquitin-spezifische angreifende Protease) bereitstellt, um das Ubiquitin vom Fremdprotein abzuspalten. Durch dieses Verfahren können deshalb native Fremdproteine isoliert werden (vgl. z.B. die PCT-Veröffentl. Nr. WO 88/024066).
Alternativ können Fremdproteine auch aus der Zelle in das Wachstumsmedium sezerniert werden, indem chimäre DNA-Moleküle erzeugt werden, die ein Fusionsprotein codieren, das ein Leadersequenzfragment umfasst, das für die Sekretion des Fremdproteins in der Hefe sorgt. Vorzugsweise gibt es Angriffsstellen, die zwischen dem Leaderfragment und dem Fremdgen codiert sind und entweder in vivo oder in vitro gespalten werden können. Das Leadersequenzfragment codiert gewöhnlich ein Signalpeptid, das hydrophobe Aminosäuren umfasst, welche die Sekretion des Proteins aus der Zelle lenken.
Geeignete DNA codierende Signalsequenzen können von Genen für sezernierte Hefeproteine wie dem Hefe-Invertasegen (EPA-Veröffentl. Nr. 012 873; JPA-Veröffentl. Nr. 62 096 086) und dem A-Faktorgen (US-Patent Nr. 4 588 684) stammen. Alternativ gibt es Leadersequenzen, die keinen Hefeursprung aufweisen, wie einen Interferon-Leader, der ebenfalls für die Sekretion in der Hefe sorgt (EPA-Veröffentl. Nr. 060 057).
Eine bevorzugte Klasse von Sekretionsleadern sind diejenigen, die ein Fragment des Hefe-alpha-Faktorgens verwenden, das sowohl eine "prä"-Signalsequenz als auch einen "pro"-Bereich enthält. Zu den Arten der Alpha-Faktorfragmente, die eingesetzt werden können, gehören sowohl der prä-pro-Alpha-Faktorleader mit der gesamten Länge (etwa 83 Aminosäurereste) als auch verkürzte Alpha-Faktorleader (gewöhnlich etwa 25 bis etwa 50 Aminosäurereste) (US-Patente Nr. 4 546 083 und 4 870 008; EPA-Veröffentl. Nr. 324 274). Weitere Beispiele für Leader, bei denen ein Alpha-Faktorleaderfragment verwendet ist, das für die Sekretion sorgt, sind hybride Alpha-Faktorleader, die mit einer Präsequenz von einer ersten Hefe, aber mit einem Probereich eines zweiten Hefe-Alpha-Faktors hergestellt sind (vgl. z.B. die PCT-Veröffentl. Nr. WO 89/02463.) Transkriptionsterminationssequenzen, die von Hefe erkannt werden, sind gewöhnlich regulatorische Bereiche, die sich 3'-ständig zum Translationsstoppcodon befinden und daher zusammen mit dem Promotor die codierende Sequenz flankieren. Diese Sequenzen lenken die Transkription einer mRNA, die in das durch die DNA codierte Polypeptid translatiert werden. Beispiele für Transkriptionsterminationssequenzen und andere von Hefe erkannte Terminationssequenzen sind solche, die gycolytische Enzyme codieren.
Die vorstehend beschriebenen Bestandteile, die einen Promotor, einen Leader (falls erwünscht), eine interessierende codierende Sequenz und eine Transkriptionsterminationssequenz umfassen, werden gewöhnlich zu Expressionskonstrukten zusammengesetzt. Die Expressionskonstrukte werden häufig in einem Replikon wie einem extrachromosomalen Element (z.B. Plasmide) gehalten, das zu einer stabilen Erhaltung in einem Wirt wie Hefe oder Bakterien befähigt ist. Das Replikon kann zwei Replikationssysteme besitzen, die folglich zulassen, dass es beispielsweise in Hefe zur Expression und in einem prokaryontischen Wirt zur Klonierung und Amplifizierung gehalten werden kann. Zu den Beispielen für derartige Hete-Bakterien-Shuttlevektoren gehören YEp24 [Botstein et al. (1979), Gene 8: 17–24], pC1/1 [Brake et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci USA 81: 4642–4646] und YRp17 [Stinchcomb et al. (1982) J. Mol. Biol. 158: 157]. Zusätzlich kann ein Replikon entweder ein Plasmid mit einer hohen Kopienzahl oder mit einer niedrigen Kopienzahl sein. Ein Plasmid mit einer hohen Kopienzahl besitzt im Allgemeinen eine Kopienzahl in einem Bereich von etwa 5 bis etwa 200 und gewöhnlich. von etwa 10 bis etwa 150. Ein Wirt, der ein Plasmid mit einer hohen Kopienzahl enthält, enthält vorzugsweise mindestens etwa 10 Plasmide und mehr bevorzugt mindestens etwa 20 Plasmide. Abhängig von der Wirkung des Vektors und des Fremdproteins auf den Wirt kann entweder ein Vektor mit einer hohen oder einer niedrigen Kopienzahl gewählt werden, vgl. z.B. Brake et al., a. a. O.
Alternativ können die Expressionskonstrukte mit einem Integrationsvektor in das Hefegenom integriert werden. Integrationsvektoren enthalten gewöhnlich mindestens eine Sequenz, die zu einem Hefechromosom homolog ist, was die Integration des Vektors zulässt, und enthalten vorzugsweise zwei homologe Sequenzen, die das Expressionsprodukt flankieren. Die Integrationen scheinen auf Rekombinationen zwischen homologer DNA im Vektor und im Hefechromosom zurückzuführen zu sein [Orr-Weaver et al. (1983) Methods in Enzymol. 101: 228–245]. Ein Integrationsvektor kann zu einem spezifischen Ort in der Hefe gelenkt werden, indem die geeignete homologe Sequenz zum Einschluss in den Vektor gewählt wird, vgl. Orr-Weaver et al., a. a. O. Ein oder mehrere Expressionskonstrukte können integrieren, wobei möglicherweise die Mengen des produzierten rekombinanten Proteins beeinflusst werden [Rine et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 6750]. Die im Vektor eingeschlossenen chromosomalen Sequenzen können entweder als einzelner Abschnitt im Vektor auftreten, was zur Integration des gesamten Vektors führt, oder als zwei Abschnitte, die zu benachbarten Abschnitten im Chromosom homolog sind und das Expressionskonstrukt im Vektor flankieren, was zur stabilen Integration lediglich des Expressionskonstrukts führen kann.
Gewöhnlich können extrachromosomale und integrierende Expressionskonstrukte Selektionsmarker enthalten, um die Selektion von Bakterienstämmen zu ermöglichen, die transformiert wurden. Selektionsmarker können biosynthetische Gene, die im Hefewirt exprimiert werden, wie ADE2, HIS4, LEU2, TRP1 und ALG7, sowie das G418-Resistenzgen einschließen, die Hefezellen Resistenz gegen Tunicamycin bzw. G418 verleihen. Zusätzlich kann ein geeigneter Selektionsmarker auch Hefe die Fähigkeit verleihen, in Gegenwart von toxischen Verbindungen wie Metallverbindungen zu wachsen. Beispielsweise lässt das Vorhandensein von CUP1 zu, dass Hefe in Gegenwart von Kupferionen wächst (Butt et al. (1987) Microbiol. Rev. 51: 351].
Alternativ können einige der vorstehend beschriebenen Bestandteile zu Transformationsvektoren zusammengesetzt werden. Die Transformationsvektoren umfassen gewöhnlich einen Selektionsmarker, der entweder in einem Replikon erhalten wird oder zu einem Integrationsvektor entwickelt wird, wie vorstehend beschrieben.
Expressions- und Transformationsvektoren, entweder extrachromosomale Replikons oder Integrationsvektoren, wurden für die Transformation in viele Hefen entwickelt. So wurden beispielsweise unter anderem Expressionsvektoren für folgende Hefen entwickelt: Candida albicans [Kurtz et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 142], Candida maltose [Kunze et al. (1985) J. Basic Microbiol. 25: 141]. Hansenula polymorpha [Gleeson, et al. (1986) J. Gen. Microbiol. 132: 3459; Roggenkamp et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 202: 302], Kluyveromyces fragilis [Das et al. (1984) J. Bacteriol. 158: 1165], Kluyveromyces lactis [De Louvencourt et al. (1983) J. Bacteriol. 154: 737; Van den Berg et al. (1990) Bio/Technology 8: 135], Pichia guillerimondii [Kunze et al. (1985) J. Basic Microbiol. 25: 141], Pichia pastoris [Cregg et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 3376; US-Patente Nr. 4 837 148 und 4 929 555], Saccharomyces cerevisiae [Hinnen et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929; Ito et al. (1983) J. Bacteriol. 153: 163], Schizosaccharomyces pombe [Beach und Nurse (1981) Nature 300: 706] und Yarrowia lipolytica [Davidow et al. (1985) Curr. Genet. 10: 380471; Gaillardin et al. (1985) Curr. Genet. 10: 49].
Verfahren zur Einführung von exogener DNA in Hefewirte sind im Stand der Technik gut bekannt und umfassen gewöhnlich entweder die Transformation von Sphäroblasten oder mit Alkalikationen behandelten intakten Hefezellen. Die Transformationsverfahren variieren gewöhnlich je nach der zu transformierenden Species, vgl. z. B. Kurtz et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 142; Kunze et al. (1985) J. Basic Microbiol. 25: 141; Candida]; [Gleeson et al. (1986) J. Gen. Microbiol. 132: 3459; Roggenkamp et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 202: 302; Hansenula]; [Das et al. (1984) J. Bacteriol. 158: 1165; De Louvencourt et al. (1983) J. Bacteriol. 154: 1165; Van den Berg et al. (1990) Bio/Technology 8: 135; Kluyveromyces]; (Cregg et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 3376; Kunze et al. (1985) J. Basic Microbiol. 25: 141; U.S.-Patente Nr. 4 837 148 und 4 929 555; Pichia]; [Hinnen et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75; 1929; Ito et al. (1983) J. Bacteriol. 153: 163; Saccharomyces]; [Beach und Nurse (1981) Nature 300: 706; Schizosaccharomyces); [Davidow et al. (1985) Curr. Genet. 10: 39; Gaillardin et al. (1985) Curr Genet. 10: 49; Yarrowia].
Beispiel 1 – Entgiftetes LT
Ein Fragment des Gens für LT wurde aus dem Plasmid EWD299 [Dallas W. S., Gill D. M. und Falkow S., 1979, J. Bacteriol., 139, 850–858] durch Spaltung mit den Restriktionsenzymen SmaI and EcoRI extrahiert und erneut in den Bluescript KS-Vektor kloniert, der zur Herstellung von DNA-Einzelsträngen geeignet ist [Sambrook J., Fritsch E. und Maniatis, T. "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor].
BW313-Zellen wurden mit den so erhaltenen Klonen transformiert und 14 Stunden in einem Kulturmedium wachsen gelassen, das aus Luria Broth mit Zusatz von 1 μg/ml Uridin bestand.
Eine Reihe synthetischer Oligonucleotide (nachstehend aufgeführt in Tabelle 1), welche die Mutation oder die gewünschten Basen anstelle der natürlichen Basen enthalten, sowie eine Sequenz mit 10 Basen stromaufwärts und 10 stromabwärts derselben Mutation, die mit den natürlichen Basen identisch waren, wurden zuerst chemisch synthetisiert und dann phosphoryliert, wobei 1,5 pMol davon bei 37 °C mit 5 Einheiten Kinase behandelt wurden.
Nach Abstoppen der Reaktion mit einer 100 mM EDTA-Lösung wurden die Oligonucleotide an den Einzelstrang angelagert, der das LT-Gen enthielt, indem 5 Minuten bei 70°C erhitzt wurde und langsam etwa 1 Stunde in Eis abgekühlt wurde.
In diesem Stadium wurde zu dieser kalten Lösung (25 μl) eine Lösung mit freien Nucleotiden, das Enzym DNA-Ligase und das Enzym DNA-Polymerase in einem Endvolumen von 100 μl zugegeben.
Die so erhaltene Lösung wurde fünf Minuten auf Eis, 5 Minuten bei Raumtemperatur und zwei Stunden auf 37 °C gehalten.
Geeignete E. coli-Zellen wurden mit dem Reaktionsgemisch nach den herkömmlichen Verfahren transformiert [Sambrook J., Fritsch E. und Maniatis T., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor], und die stellengerichtete Mutagenese wurde durch Sequenzierung der erhaltenen Klone überprüft.
Das ursprüngliche SmaI-EcoRI-Insert im Plasmid EWD299 wurde durch das die verschiedenen Mutationen enthaltende SmaI-EcoRI-Fragment ersetzt.
Die Stämme, die das mutierte Toxin codieren, wurden dann bei 37 °C 12 Stunden in 10 ml Luria Broth gezüchtet.
Die Kulturen wurden zentrifugiert; das die Zellen enthaltende Präzipitat wurde in 300 ml Lösung, die 25 % Saccharose und 50 mM Tris-Puffer bei einem pH-Wert von 8 enthielt, resuspendiert, und das Gemisch wurde eine Stunde bei Raumtemperatur mit 1 mg/ml Polymixin B-Lösung behandelt.
Das Vorliegen des Toxoids in der periplasmatischen Überstandsflüssigkeit wurde mittels Western-Blot bestätigt, und seine Toxizität wurde durch die Induktion oder fehlende Induktion morphologischer Änderungen bei Y1-Zellen bewertet (vgl. Tabelle 1).
Y1-Zellen sind adrenale Tumorepithelzellen, die bei Behandlung mit einer CT oder LT enthaltenden Lösung merklich runder werden [Yasamure Y., Buonassisi V. und Sato G., "Clonal analysis of differentiated function in animal cell cultures", Cancer Res., 1966, 26, 529–535]. Die Toxizität von CT und LT ist mit diesem morphologischen Übergang korreliert. Der periplasmatische Überstand wird mit einer Lösung mit F10-Medium, Pferdeserum 1,5 %, Glutamin und Gentamycin zu immer niedrigeren Konzentrationen verdünnt, und die Y1-Zellen (250.000 Zellen/ml) werden mit den sich ergebenden Lösungen bei 37 °C unter CO₂-Atmosphäre 48 Stunden inkubiert. Die Morphologie der Zellen wird beurteilt.
In allen Fällen wurde die Immunogenität durch den richtigen Zusammenbau des vollständigen Toxoids und durch Kreuzreaktion des Toxoids mit Antikörper gegen das Wildtyp-LT nachgewiesen.
Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle I dargestellt.
In dieser Tabelle (und in der nachstehenden Tabelle II) haben die Toxizitätssymbole folgende Bedeutung:

+++ toxisch nach Verdünnung 1: 2000 (Toxizität des Wildtyps)
++ toxisch bis zu einer Verdünnung von 1: 250
+ toxisch bis zu einer Verdünnung von 1: 64
– nicht toxisch, auch unverdünnt

Von zwei Serinmutationen (Ser-114-Glu: 477-GGAGGTGAAGCGTTAGG-494 und Ser-114-Lys:477-GGAGGTTAAAGCGTTAGG-494) wurde ferner nachgewiesen, dass sie eine wesentliche verringerte Toxizität zeigen. Vergleichsbeispiele

Nz bedeutet "nicht zusammengefügt", d.h. das Holotoxin AB₅ wird überhaupt nicht gebildet.

Beispiel 2 – Entgiftetes CT
Das Verfahren, nach dem im Falle des Gens für das CT-Toxin gearbeitet wird, ist dem vorstehend beschriebenen Verfahren analog.
Ein Fragment, welches das Gen für ein CT enthält, wurde mittels des Polymerasekettenreaktions(PCR)-Verfahrens aus dem Plasmid pCT322 amplifiziert. Eine alternative und äquivalente Quelle für das CT-Gen ist das Plasmid pJM 17 (Pearson et al., PNAS USA, 79 (1982) 2976–2980).
Die folgenden beiden synthetischen Primer wurden verwendet:

1) GGCAGATTCTAGACCTCCTGATGAAATAAA
2) TGAAGTTTGGCGAAGCTTCTTAATTTGCCATACTAATTGCGGCAATCGCAT, die eine XbaI-Schnittstelle bzw. eine künstliche HindIII-Schnittstelle (unterstrichen dargestellt) enthalten.

Das sich ergebende amplifizierte Fragment, XbaI-HindIII, das eine Länge von 1074 Basenpaaren aufweist, enthält die Codons der beiden Untereinheiten A und B, jedoch nicht die Sequenz, die das Leaderpeptid der A-Untereinheit codiert. Dieses Fragment wurde erneut in den Bluescript KS-Vektor kloniert und nach dem vorstehend für LT beschriebenen Verfahren behandelt, um die stellengerichtete Mutagenese zu bewirken. TABELLE II
Vergleichsbeispiele
Bei den folgenden Mutationen ergab sich ebenfalls, dass die Toxizität aufgehoben wurde:
His-107-Asn (TACAGTCCTAACCCAGATGAA), Glu-110-Ser (TCATCCAGATTCGCAAGAAGT), Glu-112-Ala (CAGATGAACAAGCTGTTTCTG) und Ser-114-Glu (CAAGAAGTTGAAGCTTTAGGT).
Es sollte klar sein, dass die Erfindung vorstehend lediglich beispielhaft beschrieben ist und Modifizierungen im Detail im erfindungsgemäßen Rahmen und Konzept erfolgen können.

Claims

Immunogenes entgiftetes Protein, das die Aminosäuresequenz der Untereinheit A eines Choleratoxins (CT-A) oder ein Fragment davon oder die Aminosäuresequenz der Untereinheit A eines hitzelabilen Toxins (LT-A) von Escherichia coli oder ein Fragment davon enthält, wobei die Aminosäure Val-53, Val-97 oder Tyr-104 oder die Aminosäure in der Val-53, Val-97 oder Tyr-104 entsprechenden Position durch eine andere Aminosäure ersetzt ist.
Immunogenes entgiftetes Protein nach Anspruch 1, das eine Ersetzung Val-53-Asp, Val-53-Glu oder Val-53-Tyr aufweist.
Immunogenes entgiftetes Protein nach Anspruch 1, das eine Ersetzung Val-97-Lys oder Val-97-Tyr aufweist.
Immunogenes entgiftetes Protein nach Anspruch 1, das eine Ersetzung Tyr-104-Lys, Tyr-104-Asp oder Tyr-104-Ser aufweist.
Immunogenes entgiftetes Protein nach Anspruch 1 oder 2, bei dem zusätzlich eine oder mehrere der Aminosäuren Arg-7, Asp-9, Arg-11, His-44, Arg-54, Ser-61, Ser-63, His-70, Pro-106, His-107, Glu-110, Glu-112, Ser-114, Trp-127, Arg-146 oder Arg-192 oder eine oder mehrere der diesen Positionen entsprechenden Aminosäuren ersetzt sind.
Immunogenes entgiftetes Protein nach Anspruch 5, bei dem eine oder mehrere der folgenden Aminosäureersetzungen vorliegt: Ser-63-Lys, Pro-106-Ser, His-107-Glu, Ser-114-Glu, Ser-114-Lys.
Immunogene Zusammensetzung zur Verwendung als Impfstoff, die ein immunogenes entgiftetes Protein nach einem der vorhergehenden Ansprüche und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger enthält.
Impfstoffzusammensetzung, die ein immunogenes entgiftetes Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 6 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger enthält.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 8, die ferner ein Adjuvans enthält.
DNA-Sequenz, die ein immunogenes entgiftetes Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 6 codiert.
Vektor, der eine Sequenz nach Anspruch 10 enthält.
Wirtzelle, die mit einem Vektor nach Anspruch 11 transformiert ist.
Verfahren zur Herstellung eines immunogenen entgifteten Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 6, das die Kultivierung einer Wirtzelle nach Anspruch 9 umfasst.
Verfahren zur Herstellung einer DNA nach Anspruch 10, das die Schritte der Durchführung einer punktgerichteten Mutagenese an einer DNA, die CT-A oder LT-A oder ein Fragment davon codiert, umfasst.
Verfahren zur Formulierung eines Impfstoffs nach Anspruch 8, welches das Zusammenbringen eines immunogenen entgifteten Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 6 mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.
Verfahren zur Formulierung eines Impfstoffs nach Anspruch 9, welches das Zusammenbringen eines immunogenen entgifteten Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 6 mit einem Adjuvans umfasst.
Immunogenes entgiftetes Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Verwendung als pharmazeutisches Mittel.
Immunogenes entgiftetes Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Verwendung als Impfstoff.
Verwendung eines immunogenen entgifteten Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung eines Arzneimittels zum Impfen von Säugern gegen Vibrio cholerae oder einen enterotoxigenen Stamm von Escherichia coli.