JP3408529B2 - コレラトキシンの免疫原性無毒化変異体およびトキシンｌｔの免疫原性無毒化変異体、それらの調製、ならびにワクチンの調製のためのそれらの使用 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】発明の分野 本発明は、Ｖａｌ−５３、Ｓｅｒ−６３、Ｖａｌ−９
７、Ｔｙｒ−１０４、またはＰｒｏ−１０６の１つ以上
のアミノ酸の置換を有する、コレラトキシン（ＣＴ）の
免疫原性無毒化タンパク質、あるいは、Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の毒素原性株によ
り産生された非耐熱性トキシン（ＬＴ）の免疫原性無毒
化タンパク質、ならびに、コレラまたは毒素原性Ｅ．ｃ
ｏｌｉの感染の予防あるいは治療に有用なワクチンでの
それらの使用に関する。これらのタンパク質は、野生型
トキシンをコードするＤＮＡの部位特異的変異誘発によ
る組換えＤＮＡ技術を用いて、適切に産生され得る。

【０００２】

【従来の技術】発明の背景 コレラは、広く世界中、特に第三世界に蔓延する伝染病
であり、ある地域では、それは風土病である。腸系に生
じるこの重い病気は、この疾患の記録されているケース
の高い割合で致命的であることが示される。

【０００３】コレラの病因は、グラム陰性微生物 Ｖｉ
ｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）
である。これは、汚染された食物あるいは水の摂取を介
して接触した個体の腸管にコロニー化し、そして非常に
高密度に繁殖する。基本的な症状は、激しい下痢であ
り、その結果被検体は、ふん便によって一日あたり１０
〜１５リットルもの液体を損失し得る。この激しい脱水
および電解質の損失の結果、被検体は、この感染の５０
〜６０％のケースにおいて耐えられず、死亡する。Ｖ．
ｃｈｏｌｅｒａｅにより起きた下痢は、アデニレートシ
クラーゼ酵素の活性化を刺激することにより作用して細
胞レベルで障害を引き起こす、コレラトキシンＣＴの分
泌による。コレラは、制御された強烈な水分再吸収（ｒ
ｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ）再水和により効果的に治癒され
得るが、この疾患の完全な制御および将来的な絶滅に
は、ワクチンの普及が望まれる。

【０００４】現在、死滅細菌の非経口投与からなる、コ
レラに対するワクチン接種が存在する。いくつかの国で
は、この疾患に対するワクチン接種が要求されている
が、現在の細胞性ワクチンは、感染の５０％のケースに
おいてのみ予防し、そしてその予防はまた６ヶ月未満の
持続に極度に制限されるので、その真の有用性が非常に
疑わしい。

【０００５】バングラデシュでは、高度な免疫原性であ
ることが知られる、コレラトキシンのサブユニットＢを
付加した死滅細菌からなる経口ワクチンの、実験的な試
みが進行中である（１９９０−９２）。この産物は、特
別な副作用も伴わず、永続的な予防を持続する（Ｈｏｌ
ｍｇｒｅｎ Ｊ．， Ｃｌｅｍｅｎｓ Ｊ．， Ｓａｃ
ｋ ＤＡ．， Ｓａｎｃｈｅｚ Ｊ．およびＳｖｅｎｎ
ｅｒｈｏｌｍ ＡＭ；「コレラに対する経口免疫処置」
Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．（１９８８）， １４６， １９７−２０
４）。

【０００６】コレラトキシンは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉの毒素原性株の非耐熱性トキシンに、アミ
ノ酸配列、構造、および作用様式において、類似する。

【０００７】Ｅ．ｃｏｌｉの毒素原性株の感染の結果
は、コレラに類似しており（コレラよりも激しくない
が）、激しい下痢および腸の疾患からなる。

【０００８】ＣＴおよびＬＴトキシンはすべて、トキシ
ンの酵素活性の原因である１つのＡサブユニット（ある
いはプロトマーＡ）（本明細書中ではＣＴ−Ａあるいは
ＬＴ−Ａ）、および、トキシンと腸上皮細胞との結合に
関連する、５つの同一の（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）Ｂサブ
ユニット（あるいはプロトマーＢ）（本明細書ではＣＴ
−ＢあるいはＬＴ−Ｂ）を含有する。

【０００９】このＡサブユニットは、細胞膜を通過し
て、酵素活性を制御するＧＴＰ結合タンパク質のＮＡＤ
依存ＡＤＰリボシル化により、アデニレートシクラーゼ
の活性化を引き起こす。これの臨床的な影響は、腸での
大量の液体の損失を引き起こすことである。

【００１０】かなりの研究が、コレラトキシンおよび
Ｅ．ｃｏｌｉ非耐熱性トキシンについて行われてきた。

【００１１】ＣＴの配列は公知であり、記載されている
（Ｍｅｋａｌａｎｏｓ Ｊ．Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３
０６，５５１ページ （１９８３））。

【００１２】Ｅ．ｃｏｌｉの毒素原性株由来のＬＴの配
列は、掲載されているように、ＣＴに８０％相同であ
り、これもまた周知で科学文献に記載されている。Ｓｐ
ｉｃｅｒ Ｅ．Ｋ．ら（Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２５７
ｐ．５７１６−５７２１（１９８２））には、ブタに
認められるＥ．ｃｏｌｉの毒素原性株由来の非耐熱性ト
キシンのＡサブユニットのアミノ酸配列が記載されてい
る。

【００１３】ＬＴの細菌染色体型が、Ｐｉｃｋｅｔｔ
Ｃ．Ｌ．ら（Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９，５１
８０−５１８７，（１９８７））により、同定され、そ
して配列決定された。

【００１４】ヒトに感染することが周知である、Ｅ．ｃ
ｏｌｉの株由来のＬＴのＡサブユニットの配列もまた、
配列決定された（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｊ． Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．， ２５９， ５０３７−５０４４（１
９８４））。

【００１５】コレラおよび毒素原性細菌に対するワクチ
ンの可能な臨床上の重要性の観点から、コレラおよび毒
素原性細菌に対して免疫し得る、無毒化トキシンを生産
する、継続的かつ偉大な目的が存在する。遺伝子工学の
技術は、このトキシンをコードする遺伝子への特定の変
異株の導入、ならびに、遺伝子発現およびタンパク質精
製の従来の技術による、変異トキシンの生産を可能にす
る。

【００１６】多くのグループが、コードされたタンパク
質の毒性特性の損失に関連する、遺伝子変異の同定を試
みてきた。これらの研究は、主としてＥ．ｃｏｌｉ由来
のトキシンＬＴの遺伝子に関して実施されている。

【００１７】Ｈａｒｆｏｒｄ，Ｓら（Ｅｕｒ． Ｊ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ． １８３， ３１１ページ（１９８
９））には、ブタに対して病原性のＥ．ｃｏｌｉ由来の
ＬＴ−Ａ遺伝子のインビトロ変異誘発による、トキソイ
ドの生産が記載されている。得られた成功例の変異は、
Ｓｅｒ−６１−Ｐｈｅ置換およびＧｌｙ−７９−Ｌｙｓ
置換を包含する。前者はより重要と考えられる。Ｈａｒ
ｆｏｒｄらは、ヒトおよびブタに病原性であるＥ．ｃｏ
ｌｉ中のＬＴ−Ａ遺伝子と、ＣＴ−Ａ遺伝子との間の類
似性、ならびに、このトキシンは共通の機構により作動
すると考えられることから、Ｓｅｒ−６１−Ｐｈｅ変異
をＣＴ−Ａ遺伝子に導入することにより、コレラのハロ
トキソイドを生産する可能性があり得ることを示唆して
いる。

【００１８】Ｔｓｕｊｉ， Ｔ．ら（Ｊ． Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２６５，ｐ． ２２５２０（１９９０））
には、変異ＬＴの毒性に影響するが、そのタンパク質の
免疫原性は変化させない、１つの置換Ｇｌｕ−１１２−
Ｌｙｓを産生するプラスミドＥＷＤ２９９由来のＬＴ−
Ａ遺伝子の変異が記載されている。

【００１９】Ｇｒａｎｔ， Ｃ．Ｃ．Ｒ．ら（第９２回
Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇｏｆ Ｔｈｅ Ａｍ
ｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙの要旨集 Ｂ２８９，１９９２年５月２６
−３０日）には、酵素活性を著しく低下させる、ＬＴ−
Ａ中の、４４位および７０位のヒスチジンならびに１２
７位のトリプトファンの同類置換が記載されている。

【００２０】いくつかの研究が、ＣＴに対する変異につ
いてなされてきた。

【００２１】Ｋａｓｌｏｗ，Ｈ．Ｒ．ら（第９２回 Ｇ
ｅｎｅｒａｌ Ｍｅｅｉｎｇ ｏｆｔｈｅ Ａｍｅｒｉ
ｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｙの要旨集 Ｂ２９１， １９９２年５月２６−３
０日）には、本質的に全ての活性を排除する、ＣＴ−Ａ
中の、Ａｓｐ−９およびＨｉｓ−４４の変異、ならび
に、アミノ酸１８０位以降の切断（ｔｒｕｎｃａｔｉｎ
ｇ）が記載されている。Ａｒｇ−９変異は著しく活性を
弱めると言われている。その他のアミノ酸部位の変異
は、毒性に対してほとんど影響はなかった。

【００２２】Ｂｕｒｎｅｔｔｅ， Ｗ．Ｎ．ら（Ｉｎ
ｆ． ａｎｄ Ｉｍｍｕｎ． ５９（１１），４２６６
−４２７０，（１９９１）には、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ
ｐｅｒｔｕｓｓｉｓトキシンのＡサブユニットの公知
の無毒化変異と平行する、Ａｒｇ−７−Ｌｙｓ変異を産
生するＣＴ−Ａの部位特異的変異誘発が記載されてい
る。変異は、検出可能なＡＤＰリボシルトランスフェラ
ーゼ活性を完全に撤廃させた。

【００２３】国際特許出願ＷＯ９２／１９２６５（Ｂｕ
ｒｎｅｔｔｅ， Ｋａｓｌｏｗ ａｎｄ Ａｍｇｅｎ
Ｉｎｃ．）には、Ａｒｇ−７、Ａｓｐ−９、Ａｒｇ−１
１、Ｈｉｓ−４４、Ｈｉｓ−７０、およびＧｌｕ−１１
２でのＣＴ−Ａの変異が記載されている。

【００２４】Ｇｌｕ−１１０（ＬＴおよびＣＴ）ならび
にＡｒｇ−１４６（ＬＴ）での変異もまた、文献に記載
されている（Ｌｏｂｅｔ， Ｉｎｆ． Ｉｍｍｕｎ．，
２８７０， １９９１； Ｌａｉ， Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． ３４１
１９８３； Ｏｋａｍｏｔｏ Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ． ２２０８， １９８８）。

【００２５】ＬＴの結晶構造が、Ｓｉｘｍａら（Ｎａｔ
ｕｒｅ， ３５１， ３７１−３７７， １９９１年５
月）により決定され、変異誘発が以前の文献に記載され
た結果生じることが確認された。このことは、Ａサブユ
ニットの活性に、Ｇｌｕ−１１２およびＳｅｒ−６１の
構造的な重要性を説明し、そして、非常にすぐ近位のＨ
ｉｓ−４４、Ｓｅｒ−１１４、およびＡｒｇ−５４が、
触媒作用および認識に重要であり得ることを示唆する。

【００２６】

【発明が解決しようとする課題】発明の要旨 トキシンの構造のさらなる詳細な分析により、ＣＴ−Ａ
およびＬＴ−Ａの配列中のかなり遠くのアミノ酸が、適
切に、個別に、あるいはその他の変異と結合するように
変異した際に、ＣＴおよびＬＴの酵素活性を減少し得る
位置に存在することが、発見された。

【００２７】本発明の目的は、遺伝子的に無毒化され
た、ＣＴあるいはＬＴ由来のトキソイドである１つの抗
原からなる、二次発生産物による、コレラあるいは毒素
原性Ｅ．ｃｏｌｉに対する完全な予防を与えるワクチン
の提供である。

【００２８】ＣＴあるいはＬＴの遺伝子的無毒化は、毒
性を著しく低下させ、そして、好ましくはなくするが、
トキソイドの免疫原性特性は維持している。

【００２９】

【課題を解決するための手段】本発明の第一局面に従っ
て、コレラトキシン（ＣＴ−Ａ）のサブユニットＡのア
ミノ酸配列またはそのフラグメント、あるいは、Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ非耐熱性トキシン（ＬＴ−
Ａ）のサブユニットＡのアミノ酸配列あるいはそのフラ
グメントを含有する、免疫原性無毒化タンパク質が提供
される。ここでＶａｌ−５３、Ｓｅｒ−６３、Ｖａｌ−
９７、Ｔｒｙ−１０４、またはＰｒｏ−１０６のいずれ
かの位置またはこれらに対応する位置にある、１つ以上
のアミノ酸が、他のアミノ酸と置換される。

【００３０】置換されたアミノ酸は、ＣＴ−Ａあるいは
ＬＴ−Ａの配列中に位置している。これはアミノ酸配列
中および構造的に保存されており、従って、ＣＴおよび
種々のＬＴ類に共通である。

【００３１】本発明の免疫原性無毒化タンパク質は、天
然に存在する野生型トキシンと、本質的に同じ構造のコ
ンフォメーションを有する。これは、免疫学的に活性で
あり、野生型トキシンに対する抗体と交差反応する。

【００３２】本明細書中では、ＣＴおよびＬＴには、種
々の天然に存在する変異株、さらに、構築された毒素の
免疫原性に影響しない、本明細書で開示されている配列
由来の変化を包含するその他の変異株が、包含される。

【００３３】本明細書中では、「Ｖａｌ−９７」のよう
なアミノ酸等価物とは、成熟コレラトキシンサブユニッ
トＡ（ＣＴ−Ａ）の配列中のその位置のアミノ酸のこと
を示し、これにはシグナル配列がない（図１を参照のこ
と）。

【００３４】本明細書でＬＴ−Ａと言うところは、アミ
ノ酸等価物が、図１に示されるような、ＣＴ−Ａ中の対
応する位置をさしている。

【００３５】例えば、ＣＴ中のＶａｌ−５３はＬＴ１サ
ブユニットのＶａｌ−５２に対応し、そして、ＣＴ中の
Ｓｅｒ−６３はＬＴ１のＳｅｒ−６２に対応するので、
ＬＴ１配列の番号をつけたアミノ酸８９位までに１つの
アミノ酸の異なりが存在する。ＣＴ配列中のＶａｌ−９
７は、配列中のその位置で４つのアミノ酸の異なりがあ
るので、ＬＴ１配列中のＶａｌ−９３に対応する。

【００３６】さらに、本発明の免疫原性無毒化タンパク
質は、例えば、Ａｒｇ−７、Ａｓｐ−９、Ａｒｇ−１
１、Ｈｉｓ−４４、Ａｒｇ−５４、Ｓｅｒ−６１、Ｈｉ
ｓ−７０、Ｈｉｓ−１０７、Ｇｌｕ−１１０、Ｇｌｕ−
１１２、Ｓｅｒ−１１４、Ｔｒｐ−１２７、Ａｒｇ−１
４６、あるいはＡｒｇ−１９２での１つ以上の置換のよ
うな、その他の変異を含み得る。

【００３７】野生型アミノ酸に対して置換されたアミノ
酸は、天然に存在するアミノ酸であり得る、あるいは、
改変または合成アミノ酸であり得る。置換には、アミノ
酸全体の欠損が含まれ得る。ここで、変異は、必要な免
疫原性特性を維持し、実質的に毒性の低下を示す。

【００３８】できる限り置換されたアミノ酸の立体効果
は維持しているが、両電解質性および親水性を変化させ
る置換が、一般的には好ましい。

【００３９】好ましい置換には、Ｖａｌ−５３−Ａｓ
ｐ、Ｖａｌ−５３−Ｇｌｕ、Ｖａｌ−５３−Ｔｙｒ、Ｓ
ｅｒ−６３−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−９７−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−
９７−Ｔｙｒ、Ｈｉｓ−１０７−Ｇｌｕ、Ｔｙｒ−１０
４−Ｌｙｓ、Ｔｙｒ−１０４−Ａｓｐ、Ｔｙｒ−１０４
−Ｓｅｒ、Ｐｒｏ−１０６−Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−１１４−
Ｇｌｕ、Ｓｅｒ−１１４−Ｌｙｓが含まれる。

【００４０】本明細書中に用いられる用語「無毒化され
た」とは、免疫原性組成物が、それに対応の天然に存在
するトキシンに比較して、実質的により低い毒性を示す
ことを意味する。実質的により低い毒性は、著しい副作
用の引き起こしを伴なうワクチンとして、免疫学的に有
効な量で免疫原性組成物に使用されるタンパク質に関し
て、十分に低くあるべきである。例えば、免疫原性無毒
化タンパク質は、それに対応の天然に存在するトキシン
に０．０１％未満の毒性を有するべきである。毒性は、
マウスＣＨＯ細胞で、あるいは、好ましくはＹ１細胞に
誘導された形態学的変化の評価により測定され得る。用
語「トキソイド」とは、遺伝子的に無毒化されたトキシ
ンを意味する。

【００４１】免疫原性タンパク質は、ＣＴあるいはＬＴ
サブユニットＡトキソイドであり得るが、好ましくは、
１つの変異ＣＴ−ＡあるいはＬＴーＡサブユニットおよ
びＣＴあるいはＬＴの５つのＢサブユニットを含有す
る、構築された（ａｓｓｅｍｂｌｅｄ）トキシンであ
る。Ｂサブユニットは、天然に存在するサブユニットで
あり得るか、あるいはそれ自身変異され得る。

【００４２】免疫原性タンパク質は、好ましくは、上記
のように適切に改変された、天然に存在するＣＴ−Ａあ
るいはＬＴ−Ａである。しかし、保守的アミノ酸変化
は、免疫原性タンパク質の免疫原性あるいは毒性には影
響せず、好ましくは、Ｂサブユニットタンパク質を有す
る完全なトキシンを形成する免疫原性タンパク質の活性
には影響しないようになされ得る。さらに、免疫原性タ
ンパク質は、ＣＴ−ＡあるいはＬＴ−Ａのフラグメント
であり得る。ここで、フラグメントは、免疫原性かつ非
毒性であり、本発明に従う変異の１つを含有する、少な
くとも１つの保存領域を含有する。

【００４３】本発明の第二の局面に従って、本発明の第
一の局面の免疫原性無毒化タンパク質および薬学的に受
容可能なキャリアを含有するワクチンとしての使用のた
めの、免疫原性組成物が提供される。

【００４４】免疫原性組成物はさらに、１つ以上のアジ
ュバントおよび／または薬学的に受容可能な希釈剤を含
有し得る。

【００４５】本発明はさらに、本発明の第一の局面に従
う免疫原性無毒化タンパク質および薬学的に受容可能な
キャリアを含有するワクチン組成物を提供する。このワ
クチン組成物はさらにアジュバントを含有し得る。

【００４６】本発明の第三の局面に従って、哺乳類に、
Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅあるいはＥｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの毒素原性株に対するワクチン接
種の方法を提供する。この方法には、本発明の第一の局
面に従う免疫原性無毒化タンパク質を免疫学的に有効な
量で投与する工程が包含される。

【００４７】本発明の免疫原性無毒化タンパク質は、従
来のペプチド合成技術を用いて化学的に合成され得る
が、好ましくは、組換えＤＮＡ技術により生産される。

【００４８】本発明の第四の局面に従って、本発明の第
一の局面に従う免疫原性無毒化タンパク質をコードする
ＤＮＡ配列が提供される。

【００４９】好ましくは、このＤＮＡ配列は、ポリシス
トロン性ユニット中に、無毒化サブユニットＡおよびサ
ブユニットＢの両方をコードするＤＮＡを包含する、完
全なＣＴまたはＬＴをコードするＤＮＡ配列を含む。あ
るいは、このＤＮＡは無毒化サブユニットＡのみをコー
ドし得る。

【００５０】本発明の第五の局面に従って、本発明の第
四の局面に従うＤＮＡを輸送するベクターを提供する。

【００５１】本発明の第六の局面に従って、本発明の第
五の局面に従うベクターで形質転換された宿主細胞系を
提供する。

【００５２】宿主細胞は、ＣＴあるいはＬＴを産生し得
る任意の宿主であり得るが、所望する免疫原性無毒化タ
ンパク質を産生するように好適に設計された、好ましく
は細菌、最も好ましくはＥ．ｃｏｌｉあるいはＶ．ｃｈ
ｏｌｅｒａｅである。

【００５３】本発明の第六の局面のさらなる実施態様で
は、宿主細胞はそれ自身、防御種（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖ
ｅ ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えば、野生型ＬＴあるいはＣ
Ｔを欠き、そして本発明の第一局面の免疫原性無毒化タ
ンパク質を運搬して発現する表現型に変異されたＥ．ｃ
ｏｌｉあるいはＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ株を提供し得る。

【００５４】本発明の第六の局面のさらなる実施態様で
は、宿主細胞は、本発明の第一の局面に従う染色体ＬＴ
−Ａ遺伝子を発現し得る。

【００５５】本発明の第七の局面に従って、本発明の第
一の局面に従う免疫原性無毒化タンパク質の製造方法を
提供する。この方法には、本発明の第六の局面に従う宿
主細胞を培養する工程が包含される。

【００５６】本発明の第八の局面に従って、本発明の第
四の局面に従うＤＮＡの製造方法を提供する。この方法
には、ＣＴ−ＡまたはＬＴ−ＡをコードするＤＮＡある
いはそれらのフラグメントを、部位特異的変異誘発に供
する工程を包含する。

【００５７】本発明の第九の局面に従って、本発明の第
一の局面に従う免疫原性無毒化タンパク質を、薬学的に
受容可能なキャリア、および、必要に応じてアジュバン
トと合わせる工程を包含する、ワクチンの調製方法を提
供する。

【００５８】本願発明はまた、以下の項１〜１４を提供
する。 １．コレラトキシン（CT-A）のサブユニットAまたはそ
のフラグメントのアミノ酸配列、あるいは、Escherichi
a coli非耐熱性トキシン（LT-A）またはそのフラグメン
トのアミノ酸配列を含有する免疫原性無毒化タンパク質
であって、Val-53、Ser-63、Val-97、Tyr-104、またはP
ro-106のいずれかの位置またはこれらに対応する位置に
ある、１つまたはそれより多いアミノ酸が他のアミノ酸
と置換されている、免疫原性無毒化タンパク質。 ２．項１に記載の免疫原性無毒化タンパク質であって、
Arg-7、Asp-9、Arg-11、His-44、Arg-54、Ser-61、His-
70、His-107、Glu-110、Glu-112、Ser-114、Trp-127、A
rg-146、またはArg-192のいずれかの位置またはこれら
に対応する位置にある、１つまたはそれより多いアミノ
酸がさらに置換されている、免疫原性無毒化タンパク
質。 ３．１つまたはそれより多い、次のアミノ酸置換：Val-
53-Asp、Val-53-Glu、Val-53-Tyr、Ser-63-Lys、Val-97
-Lys、Val-97-Tyr、His-107-Glu、Tyr-104-Lys、Tyr-10
4-Asp、Tyr-104-Ser、Pro-106-Ser、Ser-114-GluSer-11
4-Lysを含有する、項１または２に記載の免疫原性無毒
化タンパク質。 ４．前記項のいずれかに記載の免疫原性タンパク質およ
び薬学的に受容可能なキャリアを含有するワクチンに用
いられる、免疫原性組成物。 ５．項１〜３のいずれかに記載の免疫原性無毒化タンパ
ク質および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、ワ
クチン組成物。 ６．アジュバントをさらに含有する、項５に記載のワク
チン組成物。 ７．項１〜３のいずれかに記載の免疫原性無毒化タンパ
ク質をコードする、DNA配列。 ８．項７に記載のDNAを輸送する、ベクター。 ９．項８に記載のベクターで形質転換される、宿主細胞
系。 １０．項９に記載の宿主細胞を培養する工程を包含す
る、項１〜３のいずれかに記載の免疫原性無毒化タンパ
ク質の製造法。 １１．CT-AまたはLT-AをコードするDNAあるいはそれら
のフラグメントを部分特異的突然変異誘発に供する工程
を包含する、項７に記載のDNAの製造方法。 １２．免疫学的に有効な量の項１〜３のいずれかに記載
の免疫原性無毒化タンパク質を投与する工程を包含す
る、Vibrio choleraeまたはEscherichia coliの毒素原
性株に対するワクチン接種を哺乳類にする方法。 １３．項１〜３のいずれかに記載の免疫原性無毒化タン
パク質を薬学的に受容可能なキャリアとあわせる工程を
包含する、項５に記載のワクチンの調製方法。 １４．項１〜３のいずれかに記載の免疫原性無毒化タン
パク質をアジュバントと合わせる工程を包含する、項６
に記載のワクチンの調製方法。 工業的適用性 本発明の免疫原性無毒化タンパク質は、コレラ感染ある
いはＥ．ｃｏｌｉトキシン原性株による感染の予防およ
び治療に有用なワクチン組成物の活性成分を構成する。
従って、この組成物は製薬業での使用に適用し得る。

【００５９】

【発明の実施の形態】（発明の実施様態の詳細な説明）
本発明の実施は、他に示されていなければ、当該分野内
の、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫
学の従来の技術を使用する。このような技術は、文献に
十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、
ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ； Ａ ＬＡＢＯ
ＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， 第２版（１９８９）；
ＤＮＡ ＣＬＯＮＩＮＧ，Ｉ巻 および ＩＩ巻
（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ 編 １９８５）；ＯＬＩＧＯ
ＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ（Ｍ．Ｊ．
Ｇａｉｔ編、１９８４）；ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ
ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ（Ｂ．Ｄ． Ｈａｍｅｓ
および Ｓ．Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ 編 １９８
４）；ＴＲＡＮＳＣＲＩＰＴＩＯＮ ＡＮＤ ＴＲＡＳ
ＬＡＴＩＯＮ（Ｂ．Ｄ． Ｈａｍｅｓ および Ｓ．
Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ 編 １９８４）； ＡＮＩＭＡ
Ｌ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎ
ｅｙ 編 １９８６）；ＩＭＭＯＢＩＬＩＺＥＤ ＣＥ
ＬＬＳ ＡＮＤ ＥＮＺＹＭＥＳ （ＩＲＬ Ｐｒｅｓ
ｓ， １９８６）；Ｂ． Ｐｅｒｂａｌ， ＡＰＲＡＣ
ＴＩＣＡＬ ＧＵＩＤＥ ＴＯ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ
ＣＬＯＮＩＮＧ（１９８４）；シリーズのＭＥＴＨＯＤ
Ｓ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ，）；ＧＥＮＥ ＴＲＡＮＳＦＥＲ
ＶＥＣＴＯＲＳ ＦＯＲ ＭＡＭＭＡＬＩＡＮ ＣＥ
ＬＬＳ（Ｊ．Ｈ． ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌ
ｏｓ 編 １９８７， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ），Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ． １５４ およ
び Ｖｏｌ． １５５（それぞれ、ＷｕおよびＧｒｏｓ
ｓｍａｎ，およびＷｕ， 編），Ｍａｙｅｒ および
Ｗａｌｋｅｒ， 編（１９８７）， ＩＭＭＵＮＯＣＨ
ＥＭＩＣＡＬ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＣＥＬＬ ＡＮ
Ｄ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ （Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎ） Ｓｃｏｐｅ
ｓ， （１９８７），ＰＲＯＴＥＩＮＰＵＲＩＦＩＣＡ
ＴＩＯＮ： ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＰＲＡＣ
ＴＩＣＥ， 第２版 （Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａ
ｇ，Ｎ．Ｙ．）、およびＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＥＸ
ＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，Ｉ−Ｉ
Ｖ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ． Ｂｌａｃｋｗ
ｅｌｌ 編 １９８６）を、参照のこと。ヌクレオチド
およびアミノ酸の標準的な略号が、本明細書で使用され
ている。本明細書に引用された全ての出版物、特許、お
よび特許出願は、参考として援用されている。

【００６０】特に、以下のアミノ酸の略号が使用され
る：

【００６１】

【化１】 本発明に使用され得る免疫原性無毒化タンパク質の実施
例に挙げた例には、特に掲載した変異の部位以外で、タ
ンパク質の天然アミノ酸配列から比較的少ないアミノ酸
の変異を有するポリペプチドが包含される。

【００６２】天然源からタンパク質を単離および精製す
るよりも、組換えＤＮＡ技術により免疫原性無毒化タン
パク質を生産する重大な利点は、天然源からタンパク質
を単離するのに必要とされる量よりも少量の開始物質を
使用して、同量のタンパク質が生産され得ることであ
る。組換え技術によるタンパク質の生産はまた、細胞内
に通常存在するある種の分子の非存在下での、タンパク
質の単離を可能にする。事実、どのようなヒトタンパク
質夾雑物（ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔｓ）も完全に含まな
いタンパク質組成物が、容易に製造され得る。なぜな
ら、組換え非ヒト宿主により生産されたヒトタンパク質
のみが、問題の組換えタンパク質である。ヒトに対して
病原性の、天然源からの潜在的ウイルス因子およびウイ
ルス成分もまた、排除される。さらに、遺伝子的に無毒
化されたトキシンは、従来の化学的に無毒化されたトキ
シンほど毒性が戻らないようである。

【００６３】薬学的に受容可能なキヤリアには、それ自
身、その組成物が与えられる個体に有害な抗体の産生を
誘導しない、任意のキャリアが包含される。適切なキャ
リアは、典型的には大きく、徐々に代謝される高分子、
例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール
酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝
集体（例えば、油滴またはリボソーム）、および不活性
化ウイルス粒子である。このようなキャリアは、当業者
に周知である。さらに、これらのキヤリアは、免疫刺激
物質（アジュバント）として機能し得る。

【００６４】組成物の有効性を増強する好ましいアジュ
バントには、以下が包含されるが、限定はされない：水
酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニ
ウムなどのようなアルミニウム塩（ａｌｕｍ）、ムラミ
ルペプチドまたは細菌細胞壁成分のような他の特定の免
疫刺激物質を伴うかまたは伴わない、オイルエマルジョ
ン調製物、例えば、（１）ＭＦ５９（公開国際特許出願
第ＷＯ−Ａ−９０／１４８３７号、５％ スタアレン、
０．５％ Ｔｗｅｅｎ^Ｒ８０、０．５％Ｓｐａｎ^Ｒ ８
５を含有する（必要ではないが、場合に応じて、種々の
量のＭＴＰ−ＰＥ（以下を参照のこと）を含有する）；
ここでＭＦ５９は、Ｍｏｄｅｌ １１０Ｙマイクロフル
イダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）（Ｍｉｃ
ｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ， Ｎｅｗｔｏｎ， ＭＡ ０２
１６４）のようなマイクロフルイダイザーを用いて、サ
ブミクロン粒子に調製されている、（２）ＳＡＦ、すな
わち１０％スタアレン、０．４％ Ｔｗｅｅｎ ８０、
５％ プルロニックブロックポリマー Ｌ１２１（Ｐｌ
ｕｒｏｎｉｃ−ｂｌｏｃｋｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒＬ１２
１）、およびｔｈｒ−ＭＤＰ（以下を参照のこと）を含
有する；ここでＳＡＦは、マイクロフルイダイザーでサ
ブミクロンエマルジョンにするか、または、ボルテック
スにかけてより大きな粒子サイズのエマルジョンにす
る、および、（３）ＲＩＢＩ^ＴＭアジュバンド系（ＲＡ
Ｓ）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ， Ｈａｍｉｌ
ｔｏｎ， ＭＴ）；２％スタアレン、０、２％ Ｔｗｅ
ｅｎ^Ｒ８０、および、以下からなる群の１つ以上の細胞
壁成分を含有する：モノホスホリルリピドＡ（ＭＰ
Ｌ）、トレハロースジマイコレート（ＴＤＭ）、および
細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄ
ｅｔｏｘ^ＴＭ）、ムラミルペプチド（例えば、Ｎ−アセ
チル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン
（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルウラミル−Ｌ
−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、
Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタ
ミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２'−ジパルミト
イル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキ
シ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）など）、およびサ
イトカイン（インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２な
ど）マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など）。さらに、Ｓｔｉｍｕｌ
ｏｎ^ＴＭ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃ
ｅ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ， ＭＡ）のようなサポニンア
ジュバントが使用され得るか、または、それからＩＳＣ
ＯＭＳ（免疫刺激複合体）のような粒子がつくられ得
る。さらに、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）お
よび不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）が、使用
され得る。ＡｌｕｍおよびＭＦ５９が好ましい。

【００６５】免疫原性組成物（例えば、抗原、薬学的に
受容可能なキャリアおよびアジュバント）は、典型的に
は、水、生理食塩水、グリセロール、エタノールなどの
希釈剤を含有し得る。さらに、湿潤剤または乳化剤、ｐ
Ｈ緩衝物質などの補助物質が、このような賦形剤に存在
し得る。

【００６６】典型的には、免疫原性組成物は、注射し得
るように、溶液または懸濁液のいずれかに調製される；
それはまた、注射の前に液体賦形剤中で、溶液あるいは
懸濁液とするのに適した固形として、調製され得る。調
製物もまた、上記のように、薬学的に受容可能なキャリ
ア中で、アジュバント効果を増強するために、乳化され
るか、あるいはリポソームにカプセル化され得る。

【００６７】ワクチンとして使用される免疫原性組成物
は、免疫学的に有効な量の抗原ポリペプチドに加えて、
必要に応じて、他の上記した成分を含有し得る。「免疫
学的に有効な量」により、個体への投与量が、単回投与
において、または一連の一部として、治療または予防に
有効であることを意味する。この量は、治療されるべき
個体の健康状態または生理的状態、治療されるべき個体
の分類群（例えば、ヒト以外の霊長類、霊長類など）、
抗体合成に対する個体の免疫系の許容量、所望の予防の
程度、ワクチン調製物、医学上の治療医の見解、および
その他の関連因子に依存して変化する。その量は、日常
試験により決定され得るが、比較的広範囲であることが
予測される。

【００６８】免疫原性組成物は、非経口的に、例えば、
皮下注射または筋肉内注射のいずれかで、従来より投与
されている。その他の投与形態に適した調製物には、経
口および肺用の調製物、坐薬および経皮塗布が包含され
る。投与治療は、単回投与スケジュールあるいは複数回
投与スケジュールであり得る。ワクチンは、その他の免
疫調節剤と組み合わせて投与され得る。

【００６９】本明細書に使用されている用語「組換えポ
リヌクレオチド」とは、ゲノム、ｃＤＮＡ、半合成、ま
たは合成起源の、以下の起源または操作による、ポリヌ
クレオチドのことを意味する： （１）天然に結合され
ているポリヌクレオチドの全体または部分に結合しな
い、（２）天然に連結されているその他のポリヌクレオ
チドに結合する、あるいは（３）天然に存在しない。

【００７０】本明細書に使用されている用語「ポリヌク
レオチド」とは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボ
ヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのポリマー型の
ヌクレオチドのことである。この用語は、分子の一次構
造のみを呼ぶ。従って、この用語には、二本鎖および一
本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡが包含される。さらに、この用
語には、周知の改変型、例えば、当該分野で公知の標
識、メチル化、「キャップ」、天然に存在するヌクレオ
チドのアナログとの１つ以上の置換、ヌクレオチド内の
改変（例えば、非帯電結合（例えば、メチルホスフェー
ト、トリエステルホスフェート、ホスホアミデート、カ
ルバメートなど）および帯電結合（例えば、ホスホロチ
オエート、ホスホロジチオエートなど）での改変（この
場合、ペンダント部分として、例えば、タンパク質（ヌ
クレアーゼ、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ
−Ｌ−レリジンなどを包含する）を有する）、挿入剤
（例えば、アクリジン、ソラレンなど）での改変、キレ
一夕ー（例えば、金属、放射活性金属、ボロン、酸化金
属など）を含む改変、アルキル化剤を含む改変、改変結
合（例えば、α−アノマー核酸など）での改変）、およ
び、ポリヌクレオチドの非改変型が、包含される。

【００７１】「レプリコン」は、細胞内のポリヌクレオ
チド複製の自律ユニットとして挙動する、すなわち、そ
れ自身の制御下で複製し得る、遺伝要素（例えば、プラ
スミド、染色体、ウイルス、コスミドなど）である。こ
れには、選択可能なマーカーが含まれる。

【００７２】「ベクター」は、接続されたセグメントの
複製および／または発現をもたらすように、他のポリヌ
クレオチドセグメントが接続されたレプリコンである。

【００７３】「制御配列」とは、連結されるコード配列
の発現をもたらすのに必要なポリヌクレオチドのことで
ある。このような制御配列の特性は、宿主生物に依存し
て異なる；原核生物では、このような制御配列は一般的
に、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終
結配列を含む；原核生物において、このような制御配列
は一般に、プロモーターおよび転写終結配列を含む。用
語「制御配列」は、最少限で、発現に必要な全ての成分
を含み、さらに、例えば、リーダー配列および融合パー
トナー配列のような、存在すれぱ好都合である成分も含
む。

【００７４】「作動可能に連結された」とは、記載の成
分が意図した様式で機能し得る関係にある並置のことで
ある。コード配列に「作動可能に結合された」制御配列
は、制御配列と適合する条件下で、コード配列の発現が
達成されるように連結される。

【００７５】「オープンリーディングフレーム」（ＯＲ
Ｆ）は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配
列の領域である；この領域は、コード配列の一部分また
は全コード配列を表し得る。

【００７６】「コード配列」は、適切な調節配列の制御
の下におかれると、通常ｍＲＮＡを介してポリペプチド
に翻訳され得るポリヌクレオチド配列である。コード配
列の境界は、５’−末端の翻訳開始コドンおよび３’−
末端の終止コドンにより決定される。コード配列には、
ｃＤＮＡおよび組換えポリヌクレオチド配列が含まれ得
るが、限定はされない。

【００７７】「ＰＣＲ」とは、Ｓａｉｋｉら、Ｎａｔｕ
ｒｅ ３２４：１６３（１９８６）；およびＳｃｈａｒ
ｆら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８６）２３３：１０７６−
１０７８；および米国特許第４，６８３，１９５号；
および米国特許第４，６８３，２０２号に記載されてい
るポリメラーゼ連鎖反応の技術のことである。

【００７８】本明細書に使用されているように、ｘが本
質的に同一様式でｙと関連しない場合、ｘはｙに関して
「異種」である；すなわち、ｘが事実上ｙに関連しない
か、あるいはｘが実際に認められるのと同じ様式でｙに
関連しない場合である。

【００７９】「相同」とは、ｘとｙとの間の類似性の程
度のことである。１つの型とその他の型との配列間の相
関は、当該分野に公知の方法により決定される。例え
ば、これらは、ポリヌクレオチドの配列情報の直接比較
により決定され得る。あるいは、相同領域間で安定な二
重鎖を形成する条件下で、ポリヌクレオチドをハイブリ
ダイズさせ（例えば、ハイブリダイゼーションはＳ_１消
化に先だって用いられる）、その後、一本鎖特異的ヌク
レアーゼにより消化し、次に、消化フラグメントのサイ
ズを測定することにより、相同が決定され得る。

【００８０】本明細書に使用されている用語「ポリペプ
チド」とは、アミノ酸ポリマーのことであり、特定の長
さの産物のことではない；従って、ポリペプチドの定義
には、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質が
包含される。この用語はまた、ポリペプチドの発現後の
改変、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化な
どを意味するのではなく、すなわち除外する。定義に含
まれるものは、例えば、１つ以上のアミノ酸アナログ
（例えば、非天然のアミノ酸を含む）を有するポリペプ
チド、置換連結（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ｌｉｎｋａ
ｇｅｓ）、および、当該分野に公知の他の天然に存在な
らびに天然に非存在の両方の、改変を有するポリペプチ
ドである。

【００８１】指定の核酸配列「由来の」ポリペプチドあ
るいはアミノ酸配列は、その配列中にコードされたポリ
ペプチドのアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有するポ
リペプチド、あるいはその部分のことであり、ここでそ
の部分は、少なくとも３−５のアミノ酸からなり、さら
に好ましくは、少なくとも８−１０のアミノ酸、さらに
好ましくは少なくとも１１−１５のアミノ酸からなる
か、または、そのペプチドは配列中にコードされたポリ
ペプチドと免疫学的に同一であると見なし得る。この用
語にはまた、指定の核酸配列から発現されるポリペプチ
ドが包含される。

【００８２】タンパク質は、そのタンパク質に特異的
な、モノクローナルあるいはポリクローナルのいずれか
の抗体を産生するのに使用され得る。これらの抗体を産
生する方法は、当該分野に公知である。

【００８３】「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細
胞」、「細胞培養物」および、その他のこのような用語
は、例えば、組換えベクターあるいはその他のトランス
ファーＤＮＡ用の受容体として使用され得るか、または
使用された微生物、昆虫細胞、および哺乳類細胞を意味
し、そして、形質転換された初代細胞の子孫を包含す
る。単一の親細胞の子孫は、自然的、偶発的あるいは意
図的変異により、形態学あるいはゲノムＤＮＡまたは全
ＤＮＡ相補鎖において、初代の親のようには必ずしも完
全に同一であり得ないことは理解される。哺乳類宿主細
胞の例としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨ
Ｏ）細胞およびサル腎（ＣＯＳ）細胞が挙げられる。

【００８４】特に、本明細書に使用されている「細胞
系」は、インビトロにおいて増殖および分化を継続ある
いは延長し得る細胞群のことである。しばしば、細胞系
は、単一の先祖細胞に由来するクローン群である。この
ようなクローン群の貯蔵あるいは移動の間に、自発変化
あるいは誘発変化が核型において生じ得ることがさらに
当該分野では知られている。従って、引用の細胞系由来
の細胞は、先祖細胞あるいは培養物と正確には同一であ
り得ず、そして引用の細胞系は、そのような変種を含
む。用語「細胞系」はまた、不死化細胞を包含する。好
ましくは、細胞系は、非ハイブリッド細胞系あるいはハ
イブリドーマの２つの細胞型のみを含む。

【００８５】本明細書に使用されている用語「微生物」
には、細菌および細菌のような原核および真核の微生物
種が包含され、細菌には、酵母および糸状菌が包含され
る。

【００８６】本明細書に使用されている「形質転換」と
は、例えば、直接取り込み（ｄｉｒｅｃｔ ｕｐｔａｋ
ｅ）、トランスダクション、ｆ−メーティング、あるい
はエレクトロポレーションのような、挿入に使用される
方法に関係なく、宿主細胞への外因性ポリヌクレオチド
の挿入のことである。外因性ポリヌクレオチドは、プラ
スミドのような非組込みベクターとして維持され得る
か、あるいは宿主ゲノムに組込まれ得る。

【００８７】「ゲノムの」により、ベクターにクローニ
ングされた制限フラグメントに由来するＤＮＡ分子のコ
レクションあるいはライブラリーを意味する。これは、
生物の遺伝子物質の全てあるいは部分を包含し得る。

【００８８】「ｃＤＮＡ」により、ＤＮＡの相補鎖にハ
イブリダイズする、相補ＤＮＡ鎖を意味する。

【００８９】「精製された」および「単離された」によ
り、ポリペプチドあるいはヌクレオチド配列に関する場
合には、指示される分子が、それと同じタイプの生物学
的高分子が他に実質的に存在していない状態で、存在す
ることを意味する。本明細書に使用されている用語「精
製された」は、同じタイプの生物学的高分子が、少なく
とも７５重量％、好ましくは、少なくとも８５重量％、
さらに好ましくは、少なくとも９５重量％、そして最も
好ましくは９８重量％存在することを意味する（しか
し、水、緩衝液、およびその他の低分子、特に、分子量
が１０００未満の分子は、存在し得る）。

【００９０】一旦、適切なコード配列が単離されると、
それは種々の異なった発現系において発現され得る；例
えば、それは、哺乳類細胞、バキュロウイルス、細菌、
および酵母と共に使用される。

【００９１】ｉ．哺乳類系 哺乳類発現系は当該分野で公知である。哺乳類プロモー
ターは、哺乳類ＲＮＡポリメラーゼを結合し、そしてコ
ード配列（例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流
（３’）転写を開始し得るあらゆるＤＮＡ配列である。
プロモーターは、コード配列の５’末端近傍に通常位置
する転写開始領域、および転写開始部位の２５〜３０塩
基対（ｂｐ）上流に通常位置するＴＡＴＡボックスを有
する。ＴＡＴＡボックスは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩを
方向づけ、正しい部位でＲＮＡ合成を開始すると考えら
れている。哺乳類プロモーターはまた、ＴＡＴＡボック
スの１００から２００ｂｐ上流内に通常位置する上流プ
ロモーター要素も含む。上流プロモーター要素は、転写
が開始される速度を決定し、いずれかの方向に作用し得
る［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版中のＳａｍｂｒ
ｏｏｋら、（１９８９）「哺乳類細胞におけるクローン
化遺伝子の発現」］。哺乳類ウイルス遺伝子は、しばし
ば、非常高度に発現され、そして広い宿主の範囲を有す
る。従って、哺乳類ウイルス遺伝子をコードする配列
は、特に有用なプロモーター配列を提供する。その例と
して、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳ガンウイル
スＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主後期（ｍａｊ
ｏｒ ｌａｔｅ）プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）および
単純性疱疹ウイルスプロモーターが挙げられる。さら
に、マウスメタロチオネイン遺伝子などの非ウイルス遺
伝子由来の配列もまた、有用なプロモーター配列を提供
する。発現は、プロモーターがホルモン応答性細胞内の
グルココルチコイドで誘導され得るか否かによって、構
成的であり得るか、または調節され得る（誘導可能）。

【００９２】エンハンサー要素（エンハンサー）が存在
すると、これは上記のプロモーター要素と組合わさっ
て、通常、発現レベルを増加させる。エンハンサーは、
相同または異種のプロモーターと連結すると、正常なＲ
ＮＡ開始部位での合成開始と共に転写を１０００倍にま
で増加し得る調節ＤＮＡ配列である。エンハンサーはま
た、転写開始部位から上流または下流に位置しても、正
常な方向もしくは逆方向のいずれの方向でも、またはプ
ロモーターから１０００ヌクレオチドより遠く離れた位
置にあっても機能する。［Ｍａｎｉａｔｉｓら、（１９
８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：１２３７；Ａｌｂｅｒ
ｔｓら、（１９８９）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇ
ｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ，第２版］。ウイルス由来
のエンハンサー要素は特に有用であり得る。なぜなら、
これらは通常、より広い宿主の範囲を有するためであ
る。その例としては、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー
［Ｄｉｊｋｅｍａら、（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．
４：７６１］、ならびにラウス肉腫ウイルスの長末端反
復（ＬＴＲ）［Ｇｏｒｍａｎら、（１９８２ｂ）Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７９：６７７７］お
よびヒトサイトメガロウイルス［Ｂｏｓｈａｒｔら、
（１９８５）Ｃｅｌｌ ４１：５２１］由来のエンハン
サー／プロモーターが挙げられる。さらに、エンハンサ
ーの中には調節可能で、ホルモンまたは金属イオンなど
の誘導物質の存在下でのみ活性となるものがある［Ｓａ
ｓｓｏｎｅ−ＣｏｒｓｉおよびＢｏｒｅｌｌｉ、（１９
８６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．２：２１５，Ｍａｎ
ｉａｔｉｓら、（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：
１２３７］。

【００９３】哺乳類細胞中では、ＤＮＡ分子は細胞内で
発現し得る。プロモーター配列はＤＮＡ分子と直接連結
し得、その場合、組換えタンパク質のＮ末端の第１アミ
ノ酸は、常にＡＴＧ開始コドンによってコードされるメ
チオニンである。所望なら、臭化シアンを用いてインビ
トロでインキュベートすることによって、Ｎ末端はタン
パク質から切断され得る。

【００９４】あるいは、哺乳類細胞内で異種タンパク質
の分泌を促すリーダー配列フラグメントから構成され、
そして融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を
形成することによって、異種タンパク質もまた、細胞か
ら増殖培地へ分泌され得る。リーダーフラグメントと異
種遺伝子との間でコードされ、そしてインビボまたはイ
ンビトロで切断され得るプロセシング部位があることが
好ましい。リーダー配列フラグメントは、通常、細胞か
らタンパク質を分泌させる疎水性アミノ酸で構成される
シグナルペプチドをコードする。アデノウイルス３分節
系（ｔｒｉｐａｒｉｔｅ）リーダーは、哺乳類細胞内で
異種タンパク質を分泌するリーダー配列の一例である。

【００９５】通常、哺乳類細胞で認められる翻訳終結配
列およびポリアデニル化配列は、翻訳終止コドンから
３’側に位置する調節領域であるため、プロモーター要
素と共にコード配列に隣接する。成熟ｍＲＮＡの３’末
端は、部位特異的転写後切断およびポリアデニル化によ
って形成される［Ｂｉｒｎｓｔｉｅｌら、（１９８５）
Ｃｅｌｌ ４１：３４９；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ
ａｎｄ ｓｐｌｉｃｉｎｇ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓおよ
びＤ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編）中のＰｒｏｕｄｆｏｏｔお
よびＷｈｉｔｅｌａｗ、（１９８８）「真核生物のＲＮ
Ａの終結および３’末端プロセシング」；Ｐｒｏｕｄｆ
ｏｏｔ、（１９８９）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｓｃｉ．１４：１０５］。これらの配列は、ＤＮＡによ
ってコードされるポリペプチドに翻訳され得るｍＲＮＡ
の転写をもたらす。転写ターミネ一夕ー／ポリアデニル
化シグナルの例としては、ＳＶ４０由来のものが挙げら
れる［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ１ｌのＳａｍｂｒｏｏ
ｋら、（１９８９）「培養哺乳類細胞におけるクローン
化遺伝子の発現」］。イントロン（介在配列とも呼ばれ
る）が存在すると、いくらかの遺伝子はより効率的に発
現され得る。しかし、いくつかのｃＤＮＡは、スプライ
シングシグナル（スプライス供与およびスプライス受容
部位とも呼ばれる）を欠失するベクターから効率的に発
現された［例えば、ＧｏｔｈｉｎｇおよびＳａｍｂｒｏ
ｏｋ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９３：６２０を参照
のこと］。イントロンは、スプライス供与部位およびス
プライス受容部位を含むコード配列内の介在非コード配
列である。これらは、一次転写産物のポリアデニル化に
続く「スプライシング」と呼ばれる過程によって除去さ
れる。［Ｎｅｖｉｎｓ（１９８３）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．５２：４４１；Ｇｒｅｅｎ（１９８
６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２０：６７１；Ｐ
ａｄｇｅｔｔら（１９８６）ＡｎｎｕＲｅｖＢｌｏｃｈ
ｅｍ５５：１１１９，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａ
ｎｄ ｓｐｉｌｉｃｉｎｇ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓおよび
Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編）中のＫｒａｉｎｅｒおよびＭ
ａｎｉａｔｉｓ（１９８８）による「ＲＮＡスプライシ
ング」］。

【００９６】通常、上記構成要素は、プロモーター、ポ
リアデニル化シグナル、および転写終結配列を包含し、
共に発現構築物を形成する。エンハンサー、機能的スプ
ライス供与部位および受容部位を有するイントロン、お
よびリーダー配列もまた、所望であれば、発現構築物中
に含まれ得る。発現構築物は、しばしば、哺乳類細胞ま
たは細菌のような宿主中で安定に維持され得る染色体外
要素（例えば、プラスミド）のようなレプリコン中に維
持され得る。哺乳類の複製系は、複製にトランス作用因
子を必要とする動物ウイルス由来の複製系を含む。例え
ば、ＳＶ４０［Ｇｌｕｚｍａｎ（１９８１）Ｃｅｌｌ
２３：１７５］またはポリオーマウイルスのようなパポ
ーバウイルスの複製系を有するプラスミドは、適切なウ
イルス性Ｔ抗原の存在下で、極端に多いコピー数に至る
まで複製する。哺乳類のレプリコンのさらなる例とし
て、ウシパピローマウイルスおよびエプスタイン−バー
ルウイルス由来のレプリコンが挙げられる。さらに、こ
のレプリコンは、２種の複製系を有し得るため、レプリ
コンは、例えば、哺乳類細胞中には発現のために、そし
て原核宿主中にはクローニングおよび増幅のために維持
され得る。このような哺乳動物−細菌シャトルベクター
の例として、ｐＭＴ２［Ｋａｕｆｍａｎら、（１９８
９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：９４６］および
ｐＨＥＢＯ［Ｓｈｉｍｉｚｕら、（１９８６）Ｍｏｌ．
Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６１０７４］が挙げられる。

【００９７】使用する形質転換の手順は、形質転換され
る宿主に依存する。異種ポリヌクレオチドを哺乳類細胞
中へ導入するための方法は、当業者に周知であり、デキ
ストラン介在トランスフェクション、リン酸カルシウム
沈降法、ポリブレン介在トランスフェクション、プロト
プラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム中
へのポリヌクレオチドのカプセル化、および核中へのＤ
ＮＡの直接的なマイクロインジェクションを包含する。

【００９８】発現用の宿主として利用可能な哺乳類細胞
系は、当業者に周知であり、そしてアメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能
な多くの不死化細胞系を含み、これらとして、チャイニ
ーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒーラ細胞、シリ
アンハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、コス細胞（ＣＯ
Ｓ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、お
よび他の多くの細胞系を挙げることができるが、それら
に限定されない。

【００９９】ｉｉ．バキュロウイルス系 タンパク質をコードするポリヌクレオチドもまた、適切
な昆虫発現ベクター中に挿入され得、そしてそのベクタ
ー内の制御要素に、作動可能に連結される。ベクター構
築は、当業者に周知の技術を用いる。

【０１００】一般に、発現系の構成要素は、バキュロウ
イルスゲノムのフラグメントと異種遺伝子または発現さ
れるべき遺伝子の挿入に都合のよい制限部位との両方を
含み、そして通常は細菌のプラスミドである転移ベクタ
ー；転移ベクター中のバキュロウイルスに特異的なフラ
グメントと相同の配列を有する野生型バキュロウイルス
（これは、異種遺伝子のバキュロウイルスゲノム中への
相同的組換えを考慮に入れる）；および適切な昆虫宿主
細胞および増殖培地を有する。

【０１０１】タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、転
移ベクター中に挿入した後、そのベクターとウイルスゲ
ノムとが再結合することが可能な昆虫宿主細胞中に、そ
のベクターおよび野生型ウイルスゲノムをトランスフェ
クトする。パッケージされた組換えウイルスを発現し、
組換えプラークを同定し、そして精製する。バキュロウ
イルス／昆虫細胞発現系の材料および方法は、キットの
形状で、特に、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅ
ｇｏ ＣＡ（「マックスバック（Ｍａｘ Ｂａｃ）」キ
ット）から、市販されている。これらの技術は、一般に
当業者に周知であり、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔ
ｈ、Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅ
ｒｉｍｅｎｔ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ １
５５５号（１９８７）（以後、「Ｓｕｍｍｅｒｓおよび
Ｓｍｉｔｈ」と記載）中に完全に記載されている。

【０１０２】バキュロウイルスゲノム中にタンパク質を
コードするＤＮＡ配列を挿入する前に、プロモーター、
（所望ならば）リーダー、目的とするコード配列、およ
び転写終結配列を含む上記構成要素を、通常、中間転位
（ｔｒａｎｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）構築物（転移ベクタ
ー）に組み立てる。この構築物は、単一の遺伝子、およ
び作動可能な連結された調節要素；それぞれが作動可能
に連結された一連の調節要素を有する同義遺伝子；また
は、それと同じ一連の調節要素により調節される同義遺
伝子を含み得る。中間転位構築物は、しばしば、細菌の
ような宿主中で安定に維持され得る染色体外要素（例え
ば、プラスミド）のようなレプリコン中に維持される。
このレプリコンは、複製系を有するため、レプリコン
が、クローニングおよび増幅のために適切な宿主中に維
持され得る。

【０１０３】現在、外来遺伝子をＡｃＮＰＶ中に導入す
るために、最も一般的に使用される転移ベクターはｐＡ
ｃ３７３である。当業者に周知の多くの他のベクターも
また、設計された。これらには、例えば、（ポリヘドリ
ン開始コドンをＡＴＧからＡＴＴに変換し、そのＡＴＴ
から３２塩基対下流にＢａｍＨＩクローニング部位を導
入する）ｐＶＬ９８５が包含される；Ｌｕｃｋｏｗおよ
びＳｕｍｍｅｒｓ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８９）１
７：３１を参照のこと。

【０１０４】通常、このプラスミドはまた、ポリヘドリ
ンポリアデニル化シグナル（Ｍｉｌｌｅｒら、（１９８
８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４２：１
７７）、および、Ｅ． ｃｏｌｉ．中の選択およひ増殖
のための原核生物のアンピリシン耐性（ａｍｐ）遺伝子
および複製起点をも含有する。

【０１０５】バキュロウイルス転移ベクターは、通常バ
キュロウイルスプロモ一夕ーを含有する。バキュロウイ
ルスプロモ一夕ーは、バキュロウイルスＲＮＡポリメラ
ーゼを結合し、そしてコード配列（例えば、構造遺伝
子）のｍＲＮＡへの下流（５’から３’）転写を開始し
得る、あらゆるＤＮＡ配列である。プロモーターは、コ
ード配列の５’末端の付近に通常位置する転写開始領域
を有する。この転写開始領域は、ＲＮＡポリメラーゼ結
合部位および転写開始部位を通常含有する。バキュロウ
イルス転写ベクターはまた、エンハンサーと呼ばれる第
２ドメインを有し得、これが存在する場合、通常、この
エンハンサーは構造遺伝子に対して遠位にある。発現
は、調節されるかあるいは構成的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔ
ｉｖｅ）である。ウイルス感染サイクルの終期に大量に
転写される構造遺伝子は、特に有用なプロモーター配列
を提供する。例として、ウイルスポリヘドロンタンパク
質をコードする遺伝子から得られる配列、Ｔｈｅ Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙｏｆ Ｂａｃｕｌｏｖ
ｉｒｕｓｅｓ（Ｗａｌｔｅｒ Ｄｏｅｒｆｌｅｒ編）中
のＦｒｉｅｓｅｎら、（１９８６）「バキュロウイルス
遺伝子発現の調節」；欧州特許公開第１２７８３９号お
よび第１５５４７６号；およびｐ１０タンパク質をコー
ドする遺伝子、Ｖｌａｋら、（１９８８）、Ｊ Ｇｅ
ｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：７６５が挙げられる。

【０１０６】適切なシグナル配列をコードするＤＮＡ
は、バキュロウイルスポリヘドリン遺伝子（Ｃａｒｂｏ
ｎｅｌｌら（１９８８）Ｇｅｎｅ、７３：４０９）のよ
うな、分泌された昆虫あるいはバキュロウイルスタンパ
ク質の遺伝子から得られ得る。あるいは、哺乳類細胞の
翻訳後の（シグナルペプチド切断、タンパク質分解性切
断、およびリン酸化のような）改変に対するシグナルが
昆虫細胞に認識されるらしく、また分泌および核蓄積に
必要なシグナルも、無脊椎動物細胞と脊椎動物細胞との
間で保存されるらしいので、ヒトα−インターフェロ
ン、Ｍａｅｄａら、（１９８５）、Ｎａｔｕｒｅ ３１
５：５９２；ヒトガストリン放出ペプチド、Ｌｅｂａｃ
ｑ−Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎら、（１９８８）、Ｍｏｌｅ
ｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３１２９；ヒトＩＬ−
２、Ｓｍｉｔｈら、（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：８４０４；マウス
ＩＬ−３、（Ｍｉｙａｊｉｍａら、（１９８７）Ｇｅｎ
ｅ ５８：２７３；およびヒトグルコセレブロシダー
ゼ、Ｍａｒｔｉｎら、（１９８８）ＤＮＡ、７：９９を
コードする遺伝子から得られるリーダーのような非昆虫
起源のリ一ダーも、昆虫での分泌を促すために用い得
る。

【０１０７】組換えポリペプチドまたはポリタンパク質
は、細胞内で発現され得るか、または適当な調節配列に
より発現される場合に分泌され得る。非融合外来タンパ
ク質の良好な細胞内発現は、通常、ＡＴＧ開始シグナル
の前に、適切な翻訳開始シグナルを含有する短いリーダ
ー配列を理想的に有する異種遺伝子を必要とする。所望
であれば、Ｎ末端のメチオニンを、成熟したタンパク質
から、臭化シアンを用いるインビトロのインキュベーシ
ョンで切断し得る。

【０１０８】あるいは、天然には分泌されない組換えポ
リタンパク質またはタンパク質は、昆虫内で、外来タン
パク質の分泌を可能にするリーダー配列フラグメントを
含む融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を作
製することで、昆虫細胞から分泌され得る。このリーダ
ー配列フラグメントは、通常、タンパク質を小胞体中に
輸送する疎水性アミノ酸を含むシグナルペプチドをコー
ドする。

【０１０９】タンパク質の発現産物前駆体をコードする
ＤＮＡ配列および／または遺伝子の挿入の後、昆虫細胞
宿主を、転移ベクターの異種ＤＮＡおよび野生型バキュ
ロウイルスのゲノムＤＮＡを用いて、同時形質転換する
−−通常は、同時トランスフェクションによる。構築物
のプロモーターおよび転写終結配列は、通常バキュロウ
イルスゲノムの２〜５ｋｂのセグメントを含む。異種Ｄ
ＮＡをバキュロウイルス中の所望の部位に導入する方法
は、当業者に周知である。（ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍ
ｉｔｈ，上記；Ｊｕら（１９８７）；Ｓｍｉｔｈら、Ｍ
ｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．（１９８３） ３：２
１５６；およびＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１
９８９）を参照のこと）。例えば、挿入は、相同的二重
交差組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｄｏｕｂｌｅ ｃ
ｒｏｓｓｏｖｅｒ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）によ
り、ポリヘドリン遺伝子のような遺伝子中に行われ得
る；挿入は、所望のバキュロウイルス遺伝子中に設計さ
れる制限酵素部位中にも行われ得る。Ｍｉｌｌｅｒら、
（１９８９）、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ ４：９１。このＤ
ＮＡ配列は、発現ベクター中のポリへドリン遺伝子の場
所にクローニングされた場合、５’および３’の両方が
ポリヘドリン特異的配列により隣接され、ポリヘドリン
プロモーターの下流に位置する。

【０１１０】新しく形成されたバキュロウイルス発現ベ
クターを、続いて、感染性の組換えバキュロウイルス中
にパッケージする。相同的組換えは、低い頻度（約１％
と約５％との間）で発生する；そのため、同時トランス
フェクションの後に生産されるウイルスの大半は、まだ
野生型ウイルスである。従って、組換えウイルスを同定
する方法が必要である。この発現系の利点は、組換えウ
イルスの識別を可能にする視覚スクリーンである。天然
のウイルスにより生産されるポリヘドリン遺伝子は、感
染細胞の核中で、ウイルス感染の後遅い時期に、非常に
高いレベルで生産される。蓄積されたポリヘドリンタン
パク質は、包埋された粒子もまた含有する閉塞体（ｏｃ
ｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｉｅｓ）を形成する。これらの
閉塞体は、サイズが１５μｍまでであり、屈折率が高い
ので、光学顕微鏡下で容易に可視化される、明るい光沢
のある外観を与えられる。組換えウイルスに感染された
細胞は、閉塞体を欠く。野生型ウイルスから組換えウイ
ルスを識別するために、トランスフェクション上清液
を、当業者に周知の技術を用いて、昆虫細胞の単層上に
プラークを形成させる。すなわち、プラークを、光学顕
微鏡下で閉塞体の存在（野生型ウイルスを示す）または
非存在（組換えウイルスを示す）についてスクリーニン
グする。「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」第２巻（Ａｕｓｕｂｅｌ
ら編）の１６．８（１０、１９９０増補）；Ｓｕｍｍｅ
ｒｓおよびＳｍｉｔｈ、上記；Ｍｉｌｌｅｒら（１９８
９）。

【０１１１】組換えバキュロウイルス発現ベクターが、
いくつかの昆虫細胞中へ感染させるために開発されてい
る。例えば、組換えバキュロウイルスが、とりわけ以下
の種のために開発されている：Ａｄｅｓ ａｅｇｙｐｔ
ｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂ
ｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌ
ａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇ
ｉｐｅｒｄａ、およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ
（ＰＣＴ公開ＷＯ ８９／０４６６９９号；Ｃａｒｂｏ
ｎｅｌｌら、（１９８５）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ５６：
１５３；Ｗｒｉｇｈｔ（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２
１：７１８；Ｓｍｉｔｈら、（１９８３）Ｍｏｌ． Ｃ
ｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．３：２１５６；および一般的には
Ｆｒａｓｅｒら（１９８９）Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌ
ｌ． Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ．２５：２２５を参照のこ
と）。

【０１１２】細胞および細胞培地は、バキュロウイルス
／発現系での、異種ポリペプチドの直接発現および融合
発現の両方のために、市販され入手可能である；細胞培
養技術は、通常、当業者に周知である。例えば、Ｓｕｍ
ｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ，上記を参照のこと。

【０１１３】次いで、改変された昆虫細胞を、適切な栄
養培地中で増殖させ得、改変された昆虫宿主中に存在す
るプラスミドを安定して維持させる。発現産物の遺伝子
が、誘導可能な制御下におかれている場合、宿主は高密
度に増殖し得、そして発現を誘導し得る。または、発現
が構成性である場合、生産物は培地中に継続的に発現さ
せ、そして、目的の生産物を除去して消耗した栄養分を
増加させる間、栄養培地は継続して一部取り換えなけれ
ばならない。産物は、クロマトグラフィー、例えば、Ｈ
ＰＬＣ、アフィニィティークロマトグラフィー、イオン
交換クロマトグラフィーなど；電気泳動；密度勾配遠心
分離；溶媒抽出などのような技術により精製され得る。
好適には、この生産物は、必要であれば、培地中に分泌
されるか、または昆虫細胞の溶解から生じるいかなる昆
虫タンパク質をも実質的に除去するために、宿主のデブ
リ（例えば、タンパク質、脂質および多糖類）を少なく
とも実質的に含まない産物を提供するために、さらに精
製され得る。

【０１１４】タンパク質発現を得るために、形質転換体
に由来する組換え宿主細胞を、組換えタンパク質コード
配列を発現させる条件下でインキュベートする。これら
の条件は、選択される宿主に依存して変化し得る。しか
しながら、この条件は、当該分野で周知の技術に基づい
て、当業者が容易に確定し得る。

【０１１５】ｉｉｉ．細菌系 細菌発現技術は、当該分野で周知である。細菌プロモー
ターは、細菌ＲＮＡポリメラーゼを結合し得、コード配
列（例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの順方向
（３’’）転写を開始させ得る、いずれものＤＮＡ配列
である。プロモーターは、通常コード配列の５’末端の
近位に位置する転写開始領域を有する。この転写開始領
域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開
始部位を含む。細菌プロモーターは、オペレーターと呼
ばれる第２のドメインもまた含み、これはＲＮＡ合成が
始まる、隣接するＲＮＡポリメラーゼ結合部位に重複し
得る。遺伝子リプレッサータンパク質がオペレーターに
結合し得、それにより特定の遺伝子の転写を阻害するの
で、オペレーターは、負に調節された（誘導可能）転写
を可能にする。構成性発現は、オペレーターのような負
の調節要素の非存在下で起こり得る。さらに、正の調節
は、遺伝子アクチベータータンパク質結合配列により達
成され得る。この遺伝子アクチベータータンパク質結合
配列は、存在する場合、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合
配列の近位（５’）にある。遺伝子アクチベータータン
パク質の例には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
（Ｅ． ｃｏｌｉ）のｌａｃオペロンの転写の開始を助
けるカタボライト活性化タンパク質（ＣＡＰ）［Ｒａｉ
ｂａｕｄら（１９８４） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｇｅ
ｎｅｔ．１８：１７３］がある。従って、調節発現は、
正または負のいずれかであり得、それにより、転写を増
大または低下させる。

【０１１６】代謝経路酵素をコードする配列は、特に有
用なプロモーター配列を提供する。例には、ガラクトー
ス、ラクトース（ｌａｃ）［Ｃｈａｎｇら（１９７７）
Ｎａｔｕｒｅ １９８：１０５６］およびマルトースの
ような糖類を代謝する酵素に由来するプロモーター配列
が包含される。さらに、例として、トリプトファン（ｔ
ｒｐ）［Ｇｏｅｄｄｅｌら（１９８０）Ｎｕｃ． Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ． ８：４０５７；Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎ
ら（１９８１）Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．
９：７３１；米国特許第４，７３８，９２１号；欧州特
許公開第０３６７７６号および第１２１ ７７５号］の
ような生合成酵素に由来するプロモーター配列が挙げら
れる。ｇ−ラオタマーゼ（ｂｌａ）プロモーター系［Ｉ
ｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ３（Ｉ． Ｇｒｅｓｓｅｒ編）中
のＷｅｉｓｓｍａｎｎ（１９８１）「インターフェロン
および他の誤り（ｍｉｓｔａｋｅｓ）のクローニン
グ」］、バクテリオファージラムダＰＬ［Ｓｈｉｍａｔ
ａｋｅら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１２８］
およびＴ５［米国特許第４，６８９，４０６号］プロモ
ーター系もまた、有用なプロモーター配列を提供する。

【０１１７】さらに、天然には存在しない合成プロモー
ターもまた、細菌プロモーターとして機能する。例え
ば、ある細菌またはバクテリオファージプロモーターの
転写活性化配列を、他の細菌またはバクテリオファージ
プロモーターのオペロン配列と連結し得、合成ハイブリ
ッドプロモーターを生成する［米国特許第４，５５１，
４３３号］。例えば、ｔａｃプロモーターは、ｌａｃリ
プレッサーにより調節されるｔｒｐプロモーターおよび
ｌａｃオペロン配列の両方を含むハイブリッドｔｒｐ−
ｌａｃプロモーターである［Ａｍａｎｎら（１９８３）
Ｇｅｎｅ ２５：１６７；ｄｅ Ｂｏｅｒら（１９８
３）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８
０：２１］。さらに、細菌プロモーターは、細菌ＲＮＡ
ポリメラーゼを結合し、転写を開始する能力を有する、
非細菌起源の天然に存在するプロモーターを含み得る。
非細胞起源の天然に存在するプロモーターはまた、適合
するＲＮＡポリメラーゼと結合し得、原核細胞におい
て、いくつかの遺伝子の高い発現レベルを生じさせる。
バクテリオファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼ／プロモ
ーター系は、結合されたプロモーター系の例である［Ｓ
ｔｕｄｉｅｒら（１９８６）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏ
ｌ． １８９：１１３；Ｔａｂｏｒら（１９８５）Ｐｒ
ｏｃ Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８２：１０
７４］。さらに、ハイブリッドプロモーターはまた、バ
クテリオファージプロモーターおよびＥ．ｃｏｌｉオペ
レーターから構成され得る（欧州特許公開第２６７ ８
５１号）。

【０１１８】機能しているプロモーター配列に加えて、
効果的なリボソーム結合部位もまた、原核細胞での外来
遺伝子の発現に有用である。Ｅ． ｃｏｌｉでは、リボ
ソーム結合部位は、シャイン−ダルガルノ配列（ＳＤ）
と呼ばれ、開始コドン（ＡＴＧ）および開始コドンの３
〜１１ヌクレオチド上流に位置する３〜９ヌクレオチド
長の配列を含む［Ｓｈｉｎｅら（１９７５）Ｎａｔｕｒ
ｅ ２５４：３４］。ＳＤ配列は、ＳＤ配列とＥ． ｃ
ｏｌｉ １６Ｓ ｒＲＮＡの３’末端との間の塩基の対
合により、リボソームヘのｍＲＮＡの結合を促進すると
考えられる［Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉ
ｏｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ｇｅｎｅ Ｅ
ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｒ． Ｆ． Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅ
ｒ編）中のＳｔｅｉｔｚら（１９７９）「メッセンジャ
ーＲＮＡ中の遺伝シグナルおよびヌクレオチド配
列」］。弱いリボソーム結合部位で真核遺伝子および原
核遺伝子を発現させること［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ
中のＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）「Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉ．中でのクローニングされた遺伝子
の発現」］。

【０１１９】ＤＮＡ分子は、細胞内で発現され得る。プ
ロモーター配列は、ＤＮＡ分子と直接連結され得、この
場合Ｎ末端の最初のアミノ酸は、常にメチオニンであり
このメチオニンは、ＡＴＧ開始コドンでコードされる。
所望であれば、Ｎ−末端のメチオニンは、臭化シアンを
用いるインビトロのインキュベーションにより、また
は、細菌Ｎ末端ペプチダーゼを用いるインビボまたはイ
ンビトロでのいずれかのインキュベーションによりタン
パク質から切断し得る（欧州特許公開第２１９２３
７）。

【０１２０】融合タンパク質は、直接発現の代わりに用
い得る。通常、内在性細菌タンパク質のＮ末端部分また
は他の安定なタンパク質ををコードするＤＮＡ配列を、
異種コード配列の５’末端に融合する。発現の際に、こ
の構築物は、２種のアミノ酸配列の融合を提供する。例
えば、バクテリオファージラムダ細胞遺伝子は、外来遺
伝子の５’末端に連結され、細菌中で発現され得る。得
られる融合タンパク質は、好適には、プロセシング酵素
（因子Ｘａ）に対する部位を保持し、外来遺伝子からの
バクテリオファージタンパク質を切断する［Ｎａｇａｉ
ら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ３０９：８１０］。融合タ
ンパク質はまた、ｌａｃＺ［Ｊｉａら（１９８７）Ｇｅ
ｎｅ ６０：１９７］、ｔｒｐＥ［Ａｌｌｅｎら（１９
８７）Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ５：９３；Ｍａ
ｋｏｆｆら（１９８９）Ｊ． Ｇｅｎ． Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ． １３５：１１］、およびＣｈｅｙ［欧州特許
公開第３２４ ６４７号］の遺伝子由来の配列を用いて
も作製され得る。２つのアミノ酸配列の連結部のＤＮＡ
配列は、切断部位をコードしても、しなくてもよい。他
の例は、ユビキチン融合タンパク質である。このような
融合タンパク質は、好適には、外来タンパク質からユビ
キチンを切断するプロセシング酵素（例えば、ユビキチ
ン特異的プロセシングプロテアーゼ）に対する部位を保
持するユビキチン領域で作られる。この方法により、天
然の外来タンパク質が単離され得る［Ｍｉｌｌｅｒら
（１９８９）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：６９
８］。

【０１２１】あるいは、外来タンパク質を、細菌中で外
来タンパク質を分泌させるシグナルペプチド配列フラグ
メントを含む融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ
分子を作製することにより細胞から分泌させ得る［米国
特許第４，３３６，３３６号］。シグナル配列フラグメ
ントは、通常、細胞からのタンパク質の分泌を支配する
疎水性アミノ酸を含むシグナルペプチドをコードする。
タンパク質は、増殖培地（グラム陽性菌）中、または細
胞の内膜と外膜との間に位置する細胞周辺腔（グラム陰
性菌）中のいずれかに分泌される。好適には、シグナル
ペプチドフラグメントと外来遺伝子との間でコードされ
た、インビボまたはインビトロで切断され得るプロセシ
ング部位がある。

【０１２２】適切なソグナル配列をコードするＤＮＡ
は、Ｅ． ｃｏｌｉ外膜タンパク質遺伝子（ｏｍｐＡ）
［Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉ
ｏｎｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ中のＭａｓ
ｕｉら（１９８３）；Ｇｈｒａｙｅｂら（１９８４）Ｅ
ＭＢＯ Ｊ． ３：２４３７］およびＥ．ｃｏｌｉアル
カリホスファターゼシグナル配列（ｐｈｏＡ）［Ｏｋａ
ら（１９８５）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ． ８２：７２１２］のような、分泌された細菌
タンパク質に対する遺伝子に由来する。追加の例とし
て、種々のＢａｃｉｌｌｕｓ株由来のα−アミラーゼ遺
伝子のシグナル配列を、Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来の
異種タンパク質を分泌するために使用し得る［Ｐａｌｖ
ａら（１９８２）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７９：５５８２；欧州特許公開第
２４４ ０４２号］。

【０１２３】通常、細菌により認識される転写終結配列
は、翻訳停止コドンの３’に位置する調節領域であり、
そのため、プロモーターと共に、コード配列の側面に位
置する。これらの配列は、ＤＮＡによりコードされるポ
リペプチドに翻訳され得るｍＲＮＡの転写を支配する。
転写終結配列は、しばしば、転写の終了を助けるステム
ループ構造（ｓｔｅｍ ｌｏｏｐ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
ｓ）を形成し得る約５０ヌクレオチドのＤＮＡ配列を含
む。例としては、Ｅ． ｃｏｌｉのｔｒｐ遺伝子および
他の生合成遺伝子のような、強力なプロモーターを有す
る遺伝子由来の転写終結配列が挙げられる。

【０１２４】通常、プロモーター、シグナル配列（所望
の場合）、目的のコード配列、および転写終結配列を包
含する上記構成要素を組立てて、発現構築物を生成す
る。発現構築物は、しばしば、細菌のような宿主中に安
定して維持され得る染色体外要素（例えばプラスミド）
のようなレプリコン中に維持される。レプリコンは複製
系を有し、そのため、発現またはクローニングおよび増
幅のいずれかのために、原核生物宿主中で維持されるこ
とが可能になる。さらに、レプリコンは、高コピー数ま
たは低コピー数のいずれのプラスミドでもあり得る。高
コピー数のプラスミドは、一般的に約５〜約２００、通
常は約１０〜約１５０に及ぶコピー数を有する。高コピ
ー数のプラスミドを含む宿主は、好適には、少なくとも
約１０、より好適には少なくとも約２０のプラスミドを
含有する。高コピー数または低コピー数のいずれかのベ
クターを、宿主におけるベクターおよび外来タンパク質
の効果に依存して、選択し得る。

【０１２５】あるいは、発現構築物を、組込みベクター
を用いて、細菌ゲノム中に組込み得る。組込みベクター
は、通常、ベクターヘの組込みを可能にする細菌染色体
に相同である少なくとも１つの配列を含む。組込みは、
ベクター中の相同ＤＮＡと細菌染色体との間の組換えの
結果生じると思われる。例えば、種々のＢａｃｉｌｌｕ
ｓ株由来のＤＮＡを用いて構築される組込みベクター
は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ染色体中に組込む（欧州特許公開
第１２７ ３２８号）。組込みベクターはまた、バクテ
リオファージまたはトランスポゾン配列を含み得る。

【０１２６】通常、染色体外の組込み発現構築物は、選
択可能なマーカーを含み得、形質転換された細菌株の選
別を可能にする。選択可能なマーカーは、細菌宿主中で
発現され得、アンピリシン、クロラムフェニコール、エ
リスロマイシン、カナマイシン（ネオマイシン）、およ
びテトラサイクリンのような薬剤に対する抵抗性を細菌
に与える遺伝子を含み得る［Ｄａｖｉｅｓら（１９７
８）Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３
２：４６９］。選択可能なマーカーはまた、ヒスチジ
ン、トリプトファン、およびロイシンの生合成経路にお
ける遺伝子のような、生合成遺伝子を含み得る。

【０１２７】あるいは、上記構成要素のいくつかを、形
質転換ベクター中に組み立て得る。形質転換ベクター
は、通常、上記のように、レプリコン中で維持される
か、または組込みベクターに発展される選択可能なマー
カー（ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｍａｒｋｅｔ）を含む。

【０１２８】染色体外レプリコンまたは組込みベクター
の発現および形質転換ベクターが、多数の細菌への形質
転換のために開発されている。例えば、発現ベクター
が、とりわけ以下の細菌用に開発されている：Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ［Ｐａｌｖａら（１９８
２）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ７９：５５８２；欧州特許公開第０３６ ２５
９号および第０６３ ９５３号；ＰＣＴ公開ＷＯ ８４
／０４５４１号］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
［Ｓｈｉｍａｔａｋｅら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２
９２：１２８；Ａｍａｎｎら（１９８５）Ｇｅｎｅ ４
０：１８３；Ｓｔｕｄｉｅｒら（１９８６）Ｊ． Ｍｏ
ｌ． Ｂｉｏｌ． １８９：１１３；欧州特許公開第０
３６ ７７６号、第１３６ ８２９号および第１３６
９０７号］、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏ
ｒｉｓ［Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌ． Ｅｎ
ｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５４：６５
５］；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｌｉｖｉｄａｎｓ
［Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒ
ｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５４：６５５］、Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ［米国特許第
４，７４５，０５６号］。

【０１２９】細菌宿主に外因性ＤＮＡを導入する方法
は、当該分野で周知であり、通常、ＣａＣｌ_２処理した
細菌の形質転換、または二価のカチオンおよびＤＭＳＯ
のような他の薬剤のいずれかを包含する。ＤＮＡはま
た、細菌細胞中にエレクトロポーレーションによっても
導入され得る。形質転換手順は、通常、形質転換される
細菌の種により異なる。例えば、以下を参照のこと：
［Ｍａｓｓｏｎら（１９８９）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ． Ｌｅｔｔ． ６０：２７３；Ｐａｌｖａら
（１９８２）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓ
ｃｉ． ＵＳＡ ７９：５５８２；欧州特許公開第０３
６ ２５９号および第０６３ ９５３号；ＰＣＴ公開Ｗ
Ｏ ８４／０４５４１号、Ｂａｃｉｌｌｕｓ］、［Ｍｉ
ｌｌｅｒら（１９８８）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃ
ａｄ． Ｓｃｉ． ８５：８５６；Ｗａｎｇら（１９９
０）Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７２：９４９、Ｃ
ａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ］、［Ｃｏｈｅｎら（１９７
３）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．
６９：２１１０；Ｄｏｗｅｒら（１９８８）Ｎｕｃｌｅ
ｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：６１２７；Ｇｅｎｅ
ｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎ
ｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＳｙ
ｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅ
ｅｒｉｎｇ（Ｈ．Ｗ． ＢｏｙｅｒおよびＳ． Ｎｉｃ
ｏｓｉａ編）中のＫｕｓｈｎｅｒ（１９７８）「Ｃｏｌ
Ｅ１−誘導プラスミドを用いるＥｓｃｈｅｒｃｈｉａ
ｃｏｌｉの形質転換の改良法」；Ｍａｎｄｅｌら（１９
７０）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．５３：１５９；Ｔａ
ｋｅｔｏ（１９８８）Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ． Ａｃｔａ ９４９：３１８；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ］、［Ｃｈａｓｓｙら（１９８７）ＦＥＭＳ Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ． ４４：１７３ Ｌａｃ
ｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ］；［Ｆｉｅｄｌｅｒら（１９８
８）Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ １７０：３８、Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ］；［Ａｕｇｕｓｔｉｎら（１９９
０）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ． ６
６：２０３、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ］、［Ｂａ
ｒａｎｙら（１９８０）Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．
１４４：６９８； Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ（Ｊ． ＦｅｒｒｅｔｔｉおよびＲ． Ｃ
ｕｒｔｉｓｓ ＩＩＩ編）中のＨａｒｌａｎｄｅｒ（１
９８７）「エレクトロポーレーションによるＳｔｒｅｐ
ｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓの形質転換」；Ｐｅｒ
ｒｙら（１９８１）Ｉｎｆｅｃ． Ｉｍｍｕｎ． ３
２：１２９５；Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌ．
Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５４：６
５５；Ｓｏｍｋｕｔｉら（１９８７）Ｐｒｏｃ． ４ｔ
ｈ Ｅｖｒ． Ｃｏｎｇ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ １：４１２、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ］。

【０１３０】ｉｖ．酵母発現 酵母発現系はまた、当業者には公知である。酵母プロモ
ーターは、酵母ＲＮＡポリメラーゼを結合し、そしてコ
ード配列（例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流
（３’）の転写を開始し得るあらゆるＤＮＡ配列であ
る。プロモーターは、通常、コード配列の５’末端の近
くに位置する転写開始領域を有する。この転写開始領域
は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位（「ＴＡＴＡボ
ックス」）および転写開始部位を含む。酵母プロモータ
ーはまた、上流アクチベーター配列（ＵＡＳ）と呼ばれ
る第２ドメインを有し得、この上流アクチベーター配列
は、もし存在するならば、構造遺伝子の遠方にある。Ｕ
ＡＳは、調節された（誘導可能な）発現が可能である。
構成性発現は、ＵＡＳが存在しない場合に起こる。調節
された発現は正または負のいずれかであり得、それによ
り転写を促進するか、または減退するかのいずれかであ
り得る。

【０１３１】酵母は、活性な代謝経路を有する発酵生物
であり、従って、代謝経路中の酵素をコードする配列
は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例として
は、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）（欧州特許
公開第２８４０４４号）、エノラーゼ、グルコキナー
ゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、グリセルア
ルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰまたは
ＧＡＰＤＨ）、ヘキソキナーゼ、ホスホフラクトキナー
ゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、およびピルビン
酸キナーゼ（ＰｙＫ）（欧州特許公開第３２９２０３
号）が挙げられる。酵母ＰＨ０５遺伝子はまた、酸性ホ
スファターゼをコードし、有用なプロモーター配列を提
供する（Ｍｙａｎｏｈａｒａら（１９８３）Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０：
１）。

【０１３２】さらに、天然に存在しない合成プロモータ
ーもまた酵母プロモーターとして作用する。例えば、あ
る酵母プロモーターのＵＡＳ配列は、別の酵母プロモー
ターの転写活性化領域と連結して、合成ハイブリッドプ
ロモーターを創り得る。このようなハイブリッドプロモ
ーターの例としては、ＧＡＰ転写活性化領域に連結した
ＡＤＨ調節配列が挙げられる（米国特許第４，８７６，
１９７号および第４，８８０，７３４号）。ハイブリッ
ドプロモーターの他の例としては、ＡＤＨ２、ＧＡＬ
４、ＧＡＬ１０またはＰＨ０５遺伝子のいずれかの調節
配列からなるプロモーターが挙げられ、これらは、ＧＡ
ＰまたはＰｙＫのような解糖酵素遺伝子の転写活性化領
域と結合している（欧州特許公開第１６４５５６号）。
さらに、酵母プロモーターは、酵母ＲＮＡポリメラーゼ
と結合して転写を開始する能力を有する、非酵母起源の
天然に存在するプロモーターを包含し得る。このような
プロモーターの例としては、特に、（Ｃｏｈｅｎら（１
９８０）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃ
ｉ． ＵＳＡ ７７：１０７８；Ｈｅｎｉｋｏｆｆら
（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２８３：８３５；Ｈｏｌｌ
ｅｎｂｅｒｇら（１９８１）Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐｉｃｓ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９６：１
１９；Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇら（１９７９）Ｐｌａｓｍ
ｉｄｓ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅ
ｎｔａｌ ａｎｄ ＣｏｍｍｅｒｃｉａｌＩｍｐｏｒｔ
ａｎｃｅ（Ｋ＞Ｎ＞ ＴｉｍｍｉｓおよびＡ． Ｐｕｈ
ｌｅｒ編）の「酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ中での細菌抗生物質耐性遺伝子の発
現」；Ｍｅｒｃｅｒａｕ−Ｐｕｉｇａｌｏｎら（１９８
０）Ｇｅｎｅ １１：１６３；Ｐａｎｔｈｉｅｒら（１
９８０）Ｃｕｒｒ． Ｇｅｎｅｔ． ２：１０９；）が
挙げられる。

【０１３３】ＤＮＡ分子は、酵母の細胞内で発現され得
る。プロモーター配列は、ＤＮＡ分子と直接連結し得、
その場合には、組換えタンパク質のＮ末端の最初のアミ
ノ酸は常にメチオニンであり、そのメチオニンは、ＡＴ
Ｇ開始コドンによりコードされる。所望ならば、Ｎ末端
のメチオニンは、インビトロで臭化シアンとインキュベ
ーションすることによりタンパク質から切り放され得
る。

【０１３４】融合タンパク質は、酵母発現系に対して、
および哺乳動物、バキュロウイルスおよび細菌の発現系
において、代替物を提供する。通常、内在性酵母タンパ
ク質、または他の安定タンパク質のＮ末端部分をコード
するＤＮＡ配列は、異種コード配列の５’末端に融合す
る。発現すると、この構築物は２つのアミノ酸配列の融
合を提供する。例えば、酵母またはヒトのスーパーオキ
シドジスムターゼ（ＳＯＤ）遺伝子は、外来遺伝子の
５’末端で連結され得、そして酵母中で発現し得る。２
つのアミノ酸配列との連結部でのＤＮＡ配列は、切断可
能な部位をコードし得るか、またはし得ない。例えば、
欧州特許公開第１９６０５６号を参照のこと。別の例は
ユビキチン融合タンパク質である。そのような融合タン
パク質は、外来タンパク質からユビキチンを切断するた
めのプロセシング酵素（例えば、ユビキチン特異的プロ
セシングプロテアーゼ）に対する部位を好ましくは保持
するユビキチン領域を用いて作られる。従って、この方
法により、天然外来タンパク質が単離され得る（例え
ば、ＰＣＴ公開公報ＷＯ８８／０２４０６６号を参照の
こと）。

【０１３５】あるいは、外来タンパク質はまた、外来タ
ンパク質を酵母中で分泌するリーダー配列フラグメント
を含有する融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分
子を創り出すことにより細胞から増殖培地内へ分泌され
得る。好ましくは、インビボまたはインビトロのいずれ
かで切り離され得る、リーダーフラグメントと外来遺伝
子との間でコードされるプロセシング部位が存在する。
リーダー配列フラグメントは、通常、細胞からのタンパ
ク質の分泌を命令する疎水性アミノ酸を含有するシグナ
ルペプチドをコードする。

【０１３６】適切なシグナル配列をコードするＤＮＡ
は、分泌された酵母タンパク質の遺伝子、例えば、酵母
インベルターゼ遺伝子（欧州特許公開第０１２８７３
号；ＪＰＯ公告公報第６２，０９６，０８６号）および
Ａ因子遺伝子（米国特許第４，５８８，６８４号）から
誘導され得る。あるいは、酵母中でも分泌する、インタ
ーフェロンリーダーのような非酵母起源のリーダーが存
在する（欧州特許公開第０６００５７号）。

【０１３７】好ましいクラスの分泌リーダーは、「プ
レ」シグナル配列および「プロ」領域の両方を含む、酵
母アルファ因子遺伝子のフラグメントを用いるリーダー
である。用いられ得るアルファ因子フラグメントのタイ
プは、全長のプレープロアルファ因子リーダー（約８３
個のアミノ酸残基）、および切形型アルファ因子リーダ
ー（通常、約２５〜約５０個のアミノ酸残基）を包含す
る（米国特許第４，５４６，０８３号および４，８７
０，００８号；欧州特許公開第３２４２７４号）。分泌
を行うアルファ因子リーダーフラグメントを用いる付加
的リーダーは、２番目の酵母アルファ因子からのプロ領
域ではなくて、１番目の酵母のプレ配列で作られるハイ
ブリッドアルファ因子リーダーを含有する（例えば、Ｐ
ＣＴ公開公報ＷＯ ８９／０２４６３号を参照のこ
と）。

【０１３８】通常、酵母により認識される転写終結配列
は、翻訳停止コドンの３’側に位置する調節領域であ
り、従って、プロモーターと共にコード配列の側面に位
置する。これらの配列は、ＤＮＡによりコードされる、
ポリペプチドへ翻訳され得るｍＲＮＡの転写を命令す
る。転写終結配列、および酵母に認識される他の終結配
列の例としては、解糖酵素をコードする配列などがあ
る。

【０１３９】通常、上記の成分は、プロモーター、リー
ダー（所望ならば）、関連したコード配列、および転写
終結配列を含み、発現構築物へ共に入れられる。発現構
築物は、しばしば、レプリコン、（例えば、酵母または
細菌のような宿主内で安定した維持が可能な染色体外要
素（例えば、プラスミド）内に維持される。レプリコン
は、２つの複製系を有し得ることにより、例えば、発現
のための酵母内で、そしてクローニングおよび増幅のた
めの原核生物宿主内で維持され得る。そのような酵母−
細菌シャトルベクターの例としては、ＹＥｐ２４（Ｂｏ
ｔｓｔｅｉｎら（１９７９）Ｇｅｎｅ８：１７−２
４）、ｐＣｌ／１（Ｂｒａｋｅら（１９８４）Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８１：４６
４２〜４６４６）、およびＹＲｐ１７（Ｓｔｉｎｃｈｃ
ｏｍｂら（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ １５８：
１５７）が挙げられる。さらに、レプリコンは、高また
は低コピー数のプラスミドのいずれでもあり得る。高コ
ピー数のプラスミドは、一般に、約５〜約２００、そし
て通常は約１０〜約１５０の範囲のコピー数を有する。
高コピー数のプラスミドを含有する宿主は、好ましく
は、少なくとも約１０、そしてさらに好ましくは少なく
とも約２０を有する。高または低コピー数のベクターを
入れることが、宿主上のベクターおよび外来タンパク質
の効果に依存して、選択され得る。例えば、Ｂｒａｋｅ
ら上述を参照のこと。

【０１４０】あるいは、発現構築物は、組み込みベクタ
ーを用いて酵母ゲノム内へ組み込まれ得る。組み込みベ
クターは、通常、ベクターが組み込ませる酵母染色体と
相同な、少なくとも１つの配列を含有し、そして好まし
くは、発現構築物の側面に位置する２つの相同な配列を
含有する。ベクター内の相同ＤＮＡと酵母染色体との間
の組換えにより、組み込みが生じると考えられる（Ｏｒ
ｒ−Ｗｅａｖｅｒら（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌ． １０１：２２８〜２４５）。組み
込みベクターは、ベクター内に含有される適切な相同配
列を選択することにより、酵母内の特異的遺伝子座へ導
かれ得る。Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら上述を参照のこと。
１つまたはそれ以上の発現構築物が組み込み得、あるい
は産生する組換えタンパク質のレベルに影響する（Ｒｉ
ｎｅら（１９８３）のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：６７５０）。ベクター内に含有
される染色体配列は、ベクター内の１つのセグメント
（ベクター全体の組み込みが生じる）として存在し得る
か、または染色体内の隣接するセグメントと相同であ
り、ベクター内の発現構築物の側面に位置する２つのセ
グメント（発現構築物のみの安定な組み込みが生じ得
る）として存在し得るかのいずれかである。

【０１４１】通常、染色体外および組み込み発現構造物
は、形質転換された酵母の菌株の選択を可能にする選択
可能なマーカーを含有し得る。選択可能なマーカーは、
酵母宿主内で、例えば、酵母細胞内でツニカマイシンお
よびＧ４１８に対して耐性をそれぞれ与える、ＡＤＥ
２、ＨＩＳ４、ＬＥＵ、ＴＲＰ１、およびＡＬＧ７、な
らびにＧ４１８耐性遺伝子）内で発現され得る生合成遺
伝子を含有し得る。さらに、適切な選択可能なマーカー
はまた、金属のような毒性化合物が存在しても増殖する
能力を有する酵母を提供し得る。例えば、ＣＵＰ１が存
在すると、酵母は銅イオンが存在しても増殖し得る（Ｂ
ｕｔｔら（１９８７）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５
１：３５１）。

【０１４２】あるいは、上記成分のあるものは、形質転
換ベクター内に共に入れられ得る。形質転換ベクター
は、通常、上記のように、レプリコン内で維持される
か、または組込みベクターヘと開発される、選択可能な
マーカーを含有し得る。

【０１４３】発現および形質転換ベクターは、染色体外
レプリコンまたは組み込みベクターのいずれかであり、
多くの酵母への形質転換に対して開発された。例えば、
発現ベクターは、特に以下の酵母に対して開発された：
Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ（Ｋｕｒｔｚら（１
９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１４２）、
Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓｅ（Ｋｕｎｚｅら（１９
８５）Ｊ．Ｂａｓｉｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１
４１）、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ
（Ｇｌｅｅｓｏｎら（１９８６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．１３２：３４５９；Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐ
ら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０２：
３０２）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌ
ｌｓ（Ｄａｓら（１９８４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．
１５８：１１６５）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌ
ａｃｔｉｓ（Ｄｅ Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら（１９８
３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：７３７；Ｖａｎ
ｄｅｎ Ｂｅｒｇら（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ ８：１３５）、Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｉｌｌ
ｅｒｉｍｏｎｄｉｉ（Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ．Ｂ
ａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１）、Ｐｉ
ｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｃｒｅｇｇら（１９８
５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３３７６；米国
特許第４，８３７，１４８号および第４，９２９，５５
５号）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ（Ｈｌｎｎｅｎら（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１９２９；Ｉｔ
ｏら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１
６３）、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐ
ｏｍｂｅ（ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ（１９８１）Ｎ
ａｔｕｒｅ ３００：７０６）、およびＹａｒｒｏｗｉ
ａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（Ｄａｖｉｄｏｗら（１９８
５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３８０４７１；Ｇａ
ｉｌｌａｒｄｉｎら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ
ｔ．１０：４９）。

【０１４４】外因性ＤＮＡを酵母宿主へ導入する方法
は、当該分野では周知であり、そして通常は、スフェロ
プラストまたはアルカリカチオンで処理した無傷の酵母
細胞の形質変換のいずれかを含有する。形質転換の手法
は、通常、形質転換される酵母の種によりさまざまであ
る。例えば、（Ｋｕｒｔｚら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅ
ｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１４２；Ｋｕｎｚｅら（１９８
５）Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４
１；Ｃａｎｄｉｄａ）；（Ｇｌｅｅｓｏｎら（１９８
６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｌ．１３２：３４
５９；Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｇ
ｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０２：３０２；Ｈａｎｓｅｎｕｌ
ａ）；（Ｄａｓら（１９８４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．１５８：１１６５；Ｄｅ Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔ
ら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：１１
６５；Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇら（１９９０）Ｂｉｏ
／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：１３５；Ｋｌｕｙｖｅｒ
ｏｍｙｃｅｓ）；（Ｃｒｅｇｇら（１９８５）Ｍｏｌ．
Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３３７６；Ｋｕｎｚｅら（１
９８５）Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：
１４１；米国特許第４，８３７，１４８号および４，９
２９，５５５号，Ｐｉｃｈｉａ）；（Ｈｉｎｎｅｎら
（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ７５：１９２９；Ｉｔｏら（１９８３）Ｊ．Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３；Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ）；（ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ（１９８
１）Ｎａｔｕｒｅ３００：７０６；Ｓｃｈｉｚｏｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）；（Ｄａｖｉｄｏｗら（１９８
５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３９；Ｇａｉｌｌａ
ｒｄｉｎら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：
４９；Ｙａｒｒｏｗｉａ）を参照、のこと。

【０１４５】

【実施例】実施例１−無毒化ＬＴ 制限酵素ＳｍａＩおよびＥｃｏＲＩで消化することによ
り、ＬＴの遺伝子のフラグメントをプラスミドＥＷＤ２
９９（Ｄａｌｌａｓ Ｗ．Ｓ．、Ｇｉｌｌ Ｄ．Ｍ．お
よびＦａｌｋｏｗ Ｓ．，１９７９，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ．，１３９，８５０−８５８）から抽出し、そし
てＤＮＡの一本鎖を生成するのに適切なベクターＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ内で再クローン化した（Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋＪ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ Ｅ．およびＭａｎｉａ
ｔｉｓ，Ｔ．の「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ」Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）。

【０１４６】このようにして得られたクローンによりＢ
Ｗ３１３細胞を形質転換し、そして１μｇ／ｍｌのウリ
ジンを添加したルリアブロス（Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔ
ｈ）からなる培養培地中で、その細胞を１４時間増殖さ
せた。

【０１４７】一連の合成オリゴヌクレオチド（下記の表
１に示す）は、突然変異、または天然塩基の代わりに所
望の塩基、および、天然塩基と同一である、同様の突然
変異の１０塩基上流および１０塩基下流の配列を含有
し、まず最初に化学的に合成され、次いでその１．５ｐ
ｍｏｌを３７℃で、キナーゼ５単位を用いてリン酸化し
た。

【０１４８】１００ｍＭのＥＤＴＡ溶液で反応を停止さ
せた後、７０℃で５分間加熱し、そして氷中で約１時間
ゆっくりと冷却することにより、そのオリゴヌクレオチ
ドをＬＴ遺伝子を含有する一本鎖にアニールした。

【０１４９】その段階で、この冷溶液（２５μｌ）に遊
離ヌクレオチド、酵素ＤＮＡリガーゼおよび酵素ＤＮＡ
ポリメラーゼからなる溶液を加えて、最終容量が１００
μｌになるようにした。

【０１５０】このようにして得られた溶液を、氷中で５
分間、周囲温度で５分間、そして３７℃で２時間保っ
た。

【０１５１】通常の技術に従って、適切なＥ．ｃｏｌｉ
の細胞を反応混合物で形質転換し（Ｓａｍｂｒｏｏｋ
Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ Ｅ．およびＭａｎｉａｔｉｓ
Ｔ．の「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、そして得られたク
ローンの配列決定により部位特異的変異誘発を検討し
た。

【０１５２】種々の突然変異体を含有するＳｍａＩ−Ｅ
ｃｏＲＩフラグメントを、プラスミドＥＷＤ２９９中の
元のＳｍａＩ−ＥｃｏＲＩ挿入片に対して置換した。

【０１５３】次いで、突然変異したトキシンをコードす
る株を３７℃で１２時間、１０ｍｌのルリアブロス中で
増殖させた。

【０１５４】培養物を遠心分離し、そして細胞を含有す
る沈澱物を、２５％ショ糖およびｐＨ８の５０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ緩衝液を含有する溶液３００ｍｌ中に再懸濁さ
せ、そしてこの混合物を周囲温度で１時間、１ｍｇ／ｍ
ｌのポリミキシン（ｐｏｌｙｍｉｘｉｎ）Ｂ溶液で処理
した。

【０１５５】周辺細胞質の上清液中にトキソイドが存在
することが、ウェスタンプロットより実証され、そして
その毒性を、Ｙ１細胞内の形態変化の誘発、または誘発
の欠如により評価した（表１を参照のこと）。

【０１５６】Ｙ１細胞は、ＣＴまたはＬＴを含有する溶
液で処理すると、さらに著しく丸くなる副腎腫瘍上皮細
胞である（Ｙａｓａｍｕｒｅ Ｙ．、Ｂｕｏｎａｓｓｉ
ｓｉＶ．およびＳａｔｏ Ｇ．の「動物細胞培養におけ
る分化機能のクローン解析」Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，
１９６６，２６，５２９−５３５）。ＣＴおよびＬＴの
毒性は、この形態トランジションと相関している。周辺
細胞質の上清液を、Ｆ１０培地、ウマ血清１．５％、で
きるだけ低濃度のグルタミンおよびゲンタマイシンの溶
液で希釈し、そしてＹ１細胞（２５００００個細胞／ｍ
ｌ）を、ＣＯ _２雰囲気下３７℃で４８時間、上記で得ら
れた溶液でインキュベートする。細胞の形態を評価す
る。

【０１５７】すべての場合において、完全トキソイドの
正確な集合体により、およびトキソイドと野生型ＬＴに
対する抗体との交差反応により、免疫原性が示された。

【０１５８】結果を以下の表Ｉに示す。

【０１５９】この表（および以下の表ＩＩ）では、毒性
の記号は以下を意味する：

【０１６０】

【表１】 セリンの２種の突然変異体（Ｓｅｒ−１１４−Ｇｌｕ：
４７７−ＧＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＴＴＡＧＧ−４９４
およびＳｅｒ−１１４−Ｌｙｓ：４７７−ＧＧＡＧＧＴ
ＴＡＡＡＧＣＧＴＴＡＧＧ−４９４）もまた実質的に毒
性の減少を示した。

【０１６１】

【化２】 （ＮＡとは、「集合しない」ことを意味し、すなわち、
ホロトキシン（ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）ＡＢ_５は全く形成
されない。） 実施例２−無毒化ＣＴ トキシンＣＴの遺伝子の場合における手法は、上記と同
様である。

【０１６２】ＣＴの遺伝子を含有するフラグメントを、
プラスミドｐＣＴ３２２からポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ
ＣＲ）技術により増幅させた。ＣＴ遺伝子の代わりとな
り、かつ同等の遺伝子源（ｓｏｕｒｃｅ）はプラスミド
ｐＪＭ１７である（Ｐｅａｒｓｏｎら、ＰＮＡＳ ＵＳ
Ａ，７９，（１９８２），２９７６−２９８０）。

【０１６３】以下の２種の合成プライマーを用いた： １）ＧＧＣＡＧＡＴＴＣＴＡＧＡＣＣＴＣＣＴＧＡＴＧ
ＡＡＡＴＡＡＡ ２）ＴＧＡＡＧＴＴＴＧＧＣＧＡＡＧＣＴＴＣＴＴＡＡ
ＴＴＴＧＣＣＡＴＡＣＴＡＡＴＴＧＣＧＧＣＡＡＴＣＧ
ＣＡＴ それぞれ、ＸｂａＩ部位および人工的に作ったＨｉｎｄ
ＩＩＩ部位（下線で示す）を含有する。

【０１６４】得られた増幅フラグメント、ＸｂａＩ−Ｈ
ｉｎｄＩＩＩは１０７４塩基対の長さを有し、２つのサ
ブユニットであるＡおよびＢのコドンを含有するが、Ａ
サブユニットのリーダーペプチドをコードする配列を含
有しない。このフラグメントをＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫ
Ｓベクター内で再クローン化させ、そしてＬＴに対して
上記の手法に従って処理することにより、部位特異的変
異誘発を起こす。

【０１６５】

【表２】 以下の突然変異体もまた、毒性をなくすことが証明され
た：１０７−Ａｓｎ（ＴＡＣＡＧＴＣＣＴＡＡＣＣＣＡ
ＧＡＴＧＡＡ）、Ｇｌｕ−１１０−Ｓｅｒ（ＴＣＡＴＣ
ＣＡＧＡＴＴＣＧＣＡＡＧＡＡＧＴ）、Ｇｌｕ−１１２
−Ａｌａ（ＣＡＧＡＴＧＡＡＣＡＡＧＣＴＧＴＴＴＣＴ
Ｇ）およびＳｅｒ−１１４−Ｇｌｕ（ＣＡＡＧＡＡＧＴ
ＴＧＡＡＧＣＴＴＴＡＧＧＴ）。

【０１６６】本発明は実施例のみによって上記のように
説明され、そして詳細な改変が、本発明の範囲および意
図内で行われ得ることが理解される。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、以下の野生型サブユニットＡのアミ
ノ酸配列を示す： ｉ）コレラトキシン（ＣＴ−Ｍｅｋａｌａｎｏｓら、前
掲） ｉｉ）ヒトに認められるＥ．ｃｏｌｉ株由来の非耐熱性
トキシン（ＬＴ１−１−Ｙａｍａｍｏｔｏら、前掲） ｉｉｉ）ブタに認められるＥ．ｃｏｌｉ株由来の非耐熱
性トキシン（ＬＴ１−Ｓｐｉｃｅｒら、前掲）、および ｉｖ）染色体源由来の非耐熱性トキシン（ＬＴ−１−Ｐ
ｉｃｋｅｔｔら、前掲） シグナル配列は示していない。図１では、従来の１文字
アミノ酸コードが使用される。記号「．」は、アミノ酸
がないことを示し、印刷上のスペースで、比較が容易と
なるように配列を整列させた。記号「−」は、ＣＴ中の
対応アミノ酸と一致するＬＴ１およびＬＴ２配列中のア
ミノ酸を示す。各列に対する番号は、その列の最初のア
ミノ酸のアミノ酸番号である。図１では、本発明の変異
の位置には、下線を付けて示す。

【図２ａ】 図２ａおよび２ｂは、ＬＴ１およびＣＴの
Ａサブユニットのアミノ酸およびＤＮＡ配列の比較であ
る。

【図２ｂ】 図２ａおよび２ｂは、ＬＴ１およびＣＴの
Ａサブユニットのアミノ酸およびＤＮＡ配列の比較であ
る。

【図３】 図３は、ＬＴ−Ａ遺伝子を有する、プラスミ
ドＥＷＤ２９９（Ｄａｌｌａｓら）の制限マップであ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 14/245 Ｃ１２Ｎ 1/15 14/28 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 5/00 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 マリアグラツィア ピザ イタリア国 53100 シエナ，ビア コ ロンビーニ 30 (72)発明者 ウィム ホル アメリカ合衆国 ワシントン 98155, シアトル，フィフティーセブンス アベ ニュー エヌイー 18332 (56)参考文献 国際公開92／19265（ＷＯ，Ａ１)

Claims (18)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 コレラトキシンのサブユニットA（CT-A)
   またはそのフラグメントのアミノ酸配列、あるいは、Es
   cherichiacoli非耐熱性トキシンのサブユニットA（LT-
   A)またはそのフラグメントのアミノ酸配列を含有する免
   疫原性無毒化タンパク質であって、ここで、Val-53、Va
   l-97、Tyr-104、またはSer-63またはこれに対応する位
   置にあるアミノ酸が他のアミノ酸と置換されている、免
   疫原性無毒化タンパク質。
2. 【請求項２】 Ser-63-Lysの置換を包含する、請求項１
   に記載の免疫原性無毒化タンパク質。
3. 【請求項３】 請求項１または請求項２に記載の免疫原
   性無毒化タンパク質であって、ここで、Arg-7、Asp-9、
   Arg-11、His-44、Val-53、Arg-54、Ser-61、His-70、Va
   l-97、Tyr-104、Pro-106、His-107、Glu-110、Glu-11
   2、Ser-114、Trp-127、Arg-146、またはArg-192または
   これらに対応する位置にある、１つまたはそれより多い
   アミノ酸がさらに置換されている、免疫原性無毒化タン
   パク質。
4. 【請求項４】 １つまたはそれより多い、次のアミノ酸
   置換：Val-53-Asp、Val-53-Glu、Val-53-Tyr、Val-97-L
   ys、Val-97-Tyr、His-107-Glu、Tyr-104-Lys、Tyr-104-
   Asp、Tyr-104-Ser、Pro-106-Ser、Ser-114-Glu、Ser-11
   4-Lysを含有する、請求項３に記載の免疫原性無毒化タ
   ンパク質。
5. 【請求項５】 請求項１から４のいずれか１項に記載の
   免疫原性無毒化タンパク質および薬学的に受容可能なキ
   ャリアを含有するワクチンとして用いられる、免疫原性
   組成物。
6. 【請求項６】 請求項１から４のいずれか１項に記載の
   免疫原性無毒化タンパク質および薬学的に受容可能なキ
   ャリアを含有する、ワクチン組成物。
7. 【請求項７】 アジュバントをさらに含有する、請求項
   ６に記載のワクチン組成物。
8. 【請求項８】 請求項１から４のいずれか１項に記載の
   免疫原性無毒化タンパク質をコードする、DNA配列。
9. 【請求項９】 請求項８に記載のDNA配列を保有するベ
   クター。
10. 【請求項１０】 請求項９に記載のベクターで形質転換
    される、宿主細胞株。
11. 【請求項１１】 請求項１０に記載の宿主細胞を培養す
    る工程を包含する、請求項１から４のいずれか１項に記
    載の免疫原性無毒化タンパク質の製造方法。
12. 【請求項１２】 CT-AまたはLT-AをコードするDNAある
    いはそれらのフラグメントを部位特異的変異誘発に供す
    る工程を包含する、請求項８に記載のDNAの製造方法。
13. 【請求項１３】 請求項１から４のいずれか１項に記載
    の免疫原性無毒化タンパク質を薬学的に受容可能なキャ
    リアと結合させる工程を包含する、請求項６に記載のワ
    クチン組成物の処方の方法。
14. 【請求項１４】 請求項１から４のいずれか１項に記載
    の免疫原性無毒化タンパク質をアジュバントと結合させ
    る工程を包含する、請求項７に記載のワクチン組成物の
    処方の方法。
15. 【請求項１５】 ワクチンとして使用するための請求項
    １〜４のいずれか１項に記載の免疫原性無毒化タンパク
    質。
16. 【請求項１６】 Vibrio choleraeまたはEscherichia c
    oliの腸内毒素原性株に対して哺乳動物をワクチン接種
    するための医薬の調製のために、請求項１〜４のいずれ
    かに記載の免疫原性無毒化タンパク質を使用する方法。
17. 【請求項１７】 経皮投与のために適切な形態の請求項
    ５または請求項６に記載の組成物。
18. 【請求項１８】 前記使用が経皮投与のための使用であ
    る、請求項１５に記載の免疫原性無毒化タンパク質。