ES2304957T3 - Citoquina modificada para su estabilizacion. - Google Patents

Abstract

Un método de estabilización de citoquina que comprende los siguientes pasos: a) mutar la secuencia de aminoácido de la citoquina de tal modo que se eliminen los residuos hidrofóbicos expuestos al disolvente mediante sustitución de aminoácido; y b) mutar la secuencia de aminoácido de la citoquina para que se introduzcan residuos estabilizadores de hélice; de tal modo que durante el pliegue de la citoquina, un intermediario formado durante el pliegue de la citoquina se desestabilice con relación a la citoquina en sus estado plegado.

Description

Citoquina modificada para su estabilización.

La invención hace referencia a métodos para la estabilización de citoquinas y para citoquinas generadas mediante tales métodos. En particular, los métodos de la invención incluyen los pasos que desestabilizan intermediarios que se forman durante el pliegue de la citoquina, en relación a la estabilidad de la citoquina en su estado natural plegado. Esto tiene el efecto de aumentar la producción de la citoquina tal y como se produce in vitro.

Las citoquinas son pequeñas proteínas de entre aproximadamente 8 y 80 kDa que tiene un papel central en la regulación tanto positiva como negativa de reacciones inmunes, así como en la integración de estas reacciones con otros campos fisiológicos como el sistema endocrino o el sistema hematopoyético.

Hasta el momento se han identificado más de cien citoquinas humanas diferentes, que poseen una amplia variedad de diferentes funcione. Estas moléculas actúan enlazándose con receptores específicos en la membrana celular, iniciando de este modo una cascada señalizadota que lleva a la inducción, aumento o inhibición de un número de genes regulados mediante citoquinas. Existen varios tipos de citoquinas, incluyendo las interleuquinas, interferones, los factores estimulantes de colonias, factores necróticos de tumores, factores de crecimiento y quimioquinas. Estas citoquinas funcionan juntas en una compleja red en la cual la producción de una citoquina generalmente influye en la producción de, o responde a, varias otras citoquinas.

Clínicamente, las citoquinas tienen papeles muy importantes en varias áreas de la medicina, incluyendo su uso como anti- inflamatorios, y como agentes empleados para tratar un número de cánceres, incluyendo el linfoma no-Hodgkin, mieloma múltiple, melanoma y cáncer de ovario. Las citoquinas también tienen aplicaciones en el tratamiento de VIH, esclerosis múltiple, asma y enfermedades alérgicas.

La actividad de las citoquinas puede inhibirse previniendo la interacción de la citoquina específica con su sistema receptor, suprimiendo de este modo las señales intracelulares que son las responsables de los efectos biológicos de la citoquina. Las estrategias que están disponibles para bloquear las interacciones citoquina-receptor generalmente implican el uso de anticuerpos monoclonales contra la citoquina o contra su receptor. Además, pueden emplearse los receptores solubles y los antagonistas del receptor de citoquina (ver Finkelman et al. 1993; Rose-John Heinrich, 1994). Los antagonistas del receptor son mutantes de citoquina de tipo salvaje que son capaces de enlazarse con los receptores de citoquina con elevada afinidad, pero que no son capaces de inducir señal de trasducción y que por lo tanto no generan una respuesta biológica. En el caso de IL-4, se ha demostrado que dos antagonistas eficientes que se enlazan con el receptor alfa IL-4 con un K_{\delta} similar al de la proteína de tipo salvaje, pero que son incapaces de buscar un segundo componente receptor.

Sin embargo, el potencial terapéutico de receptores solubles y de anticuerpos monoclonales ha resultado ser bastante limitado, debido a las altas dosis que son necesarias, y la posible inmunogenicidad de estas proteínas (Finkelman et al 1993); Maliszewski et al 1994).

Por estos motivos, se ha prestado una gran atención a la posible utilización de antagonistas derivados de citoquina como moléculas terapéuticas. Se espera que esta nueva generación de biofármacos sea de baja toxicidad en comparación con otras sustancias (Buckel, 1996).

Existen varias razones prácticas por la que hay un interés en optimizar la producción de citoquinas (y antagonistas de citoquina) en bacterias tales como E. coli. A pesar de que varios sistemas de expresión eucariótica, incluyendo las líneas celulares de los insectos, hongos, levaduras y mamíferos, se han desarrollado en los últimos años, la relativa simpleza de las bacterias hace de estos organismos unos huéspedes ventajosos en la mayoría de los casos. E. coli, por ejemplo, tiene una rápida velocidad de crecimiento (normalmente doblando el tiempo de 20 minutos), es fácil de manipular y de analizar la expresión de proteínas y mutaciones, y crece en un medio relativamente barato. Como resultado de estas ventajas, la mayor parte de los fármacos con proteína que hoy en día están presentes en el mercado se producen por medio de la fermentación a gran escala de E. coli llevando el gen de interés (Steven et al 1998). Aunque estos sistemas de cultivo celular en gran densidad están bastante bien establecidos para E. coli, se conoce muy poco sobre su eficiencia y viabilidad con otros organismos huéspedes.

Desventajas relacionadas con la utilización de E. coli y otros sistemas de expresión procariótica en general incluyen la tendencia de este organismo a producir proteína heteróloga en cuerpos de inclusión, la ausencia de modificaciones pos-traslacionales, la traslación ineficiente de mARN humano por medio de ribozimas bacterianos, un uso de codón característico y la inhabilidad para formar enlaces de disulfuro en el citoplasma. Estos hechos condicionan el pliegue y la estabilidad de la proteína expresada y pueden causar un conglomerado.

Los factores que influyen en la formación de cuerpos de inclusión en E. coli incluyen la temperatura de crecimiento celular, la coexpresión con proteínas chaperonas, el uso de proteínas de fusión, la segregación de proteína en el periplasma, el uso de diferentes corrientes de expresión y la expresión de proteínas incluyendo su pro-secuencia. Sin embargo, la manipulación de estos métodos es sólo parcialmente efectiva a la hora de resolver este problema.

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Debe apreciarse que la formación de cuerpos de inclusión no es un fenómeno anómalo que se limita a E. coli. También se ha observado para sistemas de expresión eucariótica, como Saccharomyces cerevisiae e incluso para células mamíferas, tanto con proteínas inherentes como heterólogas (Borden and Georgiou, 1990).

Un paso obligatorio en la recuperación de una proteína a partir de cuerpos de inclusión implica el uso de agentes desnaturalizantes y caotrópicos, tales como urea o detergentes de GudmHCl (cloruro de guanidina) o extremos de pH, para desolubilizar los agregados. Desafortunadamente, los protocolos de renaturalización son rara vez simples y purificando una proteína de cuerpos de inclusión en una producción razonable representa un reto importante. A menudo, la proteína de interés se precipita durante el pliegue o puede sufrir modificaciones químicas irreversibles debido a la presencia del desnaturalizante.

Cuando se contempla una estrategia para la producción comercial de una proteína debe tenerse en cuenta que las condiciones encontradas en pruebas de crecimiento a pequeña escala deberían ser también efectivas cuando el proceso se amplía a fermentaciones a gran escala. Por ejemplo, el hecho de que la sobre expresión de un objetivo dado con proteínas chaperonas aumente su solubilidad en un frasco de un litro no garantiza que se observará lo mismo durante una fermentación de 100.000 litros. Por lo tanto, es deseable encontrar soluciones simples para el problema complejo de cuerpo de inclusión.

En el caso de proteínas enlazadas con disulfuro tales como citoquinas, se ha demostrado que la conversión de proteína reducida a oxidada se lleva a cabo a través de una serie de especies intermedias caracterizadas por puentes disulfuro intramolecular no-nativo (Creighton, 1997; De Felippis et al., 1993; Youngman et al., 1995). Están disponibles varios agentes para la catálisis de la formación y la remezcla de enlaces disulfuro con sus parejas nativas, a pesar de que rara vez se encuentran las condiciones óptimas para un pliegue óptimo y correcto. Por consiguiente, durante el pliegue in vitro de la mayoría de los disulfuros que contienen proteínas tales como citoquinas, se obtienen una serie de isoformas. Algunas de estas isoformas se precipitan y la isoforma nativa, que a menudo es una especie menor, debe separarse de las otras mediante HPLC. Con frecuencia, a pesar de que la proteína acumulada en los cuerpos de inclusión parece suficiente como para obtener la cantidad deseada de proteína pura, la pérdida incurrida durante la preparación de cuerpos de inclusión y el replegamiento de la proteína es tan grande que solamente se puede recuperar una cantidad insignificante de proteína activa.

El potencial terapéutico de antagonistas derivados de citoquina disminuye por lo tanto en virtud del hecho de que estas proteínas son difíciles de producir en grandes cantidades de un modo económico. Esto se debe a que tienden a formar cuerpos de inclusión cuando se sobre expresan en E. coli y se repliegan in vitro en producciones muy bajas.

Por lo tanto, es de crucial importancia crear estrategias que permitan una producción más eficiente de antagonistas de citoquina, y modos alternativos de bloquear la interacción entre citoquinas y sus receptores. Idealmente, sería deseable diseñar pequeñas moléculas que sean capaces de competir con la citoquina para enlazarse con su receptor.

Por consiguiente, el objeto de la presente invención es diseñar citoquinas mutantes que se produzcan bien como proteínas solubles en bacterias o como proteínas que se plegarán eficientemente in vitro. Tal estrategia haría que la producción industrial de antagonistas de citoquina fuera más económica y menos laboriosa.

Resumen de la invención

De acuerdo con la presente invención se proporciona un método para estabilizar un citoquina comprendiendo dicho método los siguientes pasos:

a)

mutar la secuencia de aminoácido de la citoquina de modo que se retiren los residuos expuestos al disolvente mediante la sustitución de aminoácido; y

b)

mutar la secuencia de aminoácido de la citoquina de modo que se introduzcan residuos establecedores de hélice;

de tal modo que durante el pliegue de la citoquina, un intermediario formado durante el pliegue de la citoquina se desestabilice en relación con la citoquina en su estado doblado. Esto tiene el efecto de mejorar la producción plegada in vitro de la citoquina.

El método de la invención ha demostrado permitir la estabilización de citoquinas de tal modo que pueden producirse a bajo coste y en gran volumen. Por lo tanto, este método traza el camino para la producción económica de estas moléculas, llevando el uso de estas moléculas a una terapia dominante para un número de enfermedades importantes.

Cualquier citoquina puede estabilizarse de acuerdo con la presente invención, incluyendo las interleuquinas, interferones, los factores estimulantes de colonias, factores necróticos de tumores, factores de crecimiento y quimioquinas.

Las citoquinas preferentes para la estabilización de acuerdo con la invención son las citoquinas "conjunto de cuatro hélices" que pertenecen a la superfamilia citoquina clase 1 o hematopoyética. La estructura tridimensional de estas proteínas consiste en un conjunto con cuatro hélices con una topología "superior-superior-inferior-inferior", incluyendo tres puentes disulfuro.

En base a la longitud de la cadena de polipéptido y a las características estructurales, se pueden identificar dos principales subfamilias en esta superfamilia. Además, con frecuencia se considera que los interferones constituyen una tercera subfamilia de las citoquinas conjunto de cuatro hélices.

Los miembros de esta superfamilia incluyen la hormona de crecimiento (HGH), el factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófago (GM-CSF), factor estimulante de colonia granulocito (G-CSF), factor inhibidor de leucemia (LIF), eritropoyetina (EPO). IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-13, factor neurotrófico ciliar (CNTF), oncostatina (OSM) y los interferones, entre otros. Algunos de los miembros conocidos de estas superfamilias que tienen estructuras similares a IL-4 están listados en la Tabla 1 a continuación.

Una característica sorprendente de la superfamilia citoquina es que, a pesar de su forma común, los miembros familiares tienen muy poca homología secuencial o incluso carecen de ella. Sin embrago, el hecho de que estas proteínas son todas moléculas señalizadoras extracelulares, comparte la misma única topología conjunto de cuatro hélices tiene una organización genética similar, lo que sugiere que están todas relacionadas mediante el proceso de evolución divergente.

Las citoquinas conjunto de cuatro hélices se enlazan a una clase de receptores conocidos como la superfamilia de receptores de hematopoyetina o superfamilia de receptores de citoquina clase 1. Estos receptores comprenden un dominio de enlace con citoquina extracelular que es elevadamente homólogo dentro de la familia, un único dominio de la transmembrana, y un dominio intracelular que carece de actividad intrínseca tirosina quinasa. El dominio extracelular tiene cuatro cisteínas conservadas y un motivo característico triptófano-serina-X-triptófano-serina (la llamada caja triptófano) que se cree que es importante para el eficiente pliegue del receptor (para más detalles ver Bazan, 1990 y Gullberg et al 1995).

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TABLA 1 Enlace receptor con la familia hematopoyética

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El sistema citoquina-receptor más característico es el de la hormona de crecimiento humano. Una determinación de la estructura tridimensional de esta proteína enlazada con dos cadenas del mismo receptor (Vos et al 1992) ha establecido las bases para entender los principios que se implican en el reconocimiento molecular y la transducción de señal mediante citoquinas conjunto cuatro hélices y sus receptores. A partir de los datos disponibles en la bibliografía sobre otros sistemas citoquina-receptor, está claro que la homo o hetero-oligomerización del receptor inducido por el ligando es un estrategia general que se emplea por parte de los miembros de la familia citoquina hematopoyética.

Con el fin de entender por completo la invención, es importante apreciar algunos de los principios que gobiernan el pliegue de proteínas. La teoría actual sobre esta área dicta que los intermediarios del pliegue existen en la fase de pliegue para la mayoría de las proteínas que se dan de manera natural. Algunos de estos intermediarios definen el paso de pliegue productivo para la proteína nativa, mientras que otras representan especies fuera del paso que pueden formar agregados, dirigiendo la proteína irreversiblemente a una confirmación no nativa (ver Baldwin, 1996). Algunos de estos intermediarios de pliegue son estables, conteniendo una pequeña cantidad de estructura secundaria similar a la nativa, a pesar de que carecen de interacciones terciarias que son características de la conformación nativa. El estado nativo sólo emerge tras el "ajuste" de las interacciones específicas en estos intermediarios. A la luz de esto, se ve la ocurrencia de agregado como una función de las propiedades de solubilidad y estabilidad de los intermediarios de pliegue con respecto al medio ambiente en el cual la reacción de pliegue tiene lugar.

Ha quedado claro a partir de trabajos en los que se han introducido mutaciones que tienen el efecto de aliviar defectos de pliegue asociados con sustituciones sensibles a la temperatura, que es posible optimizar las rutas de pliegue sin alterar la actividad y estabilidad de la proteína madura. Una descripción detallada de la bibliografía relevante con el problema de pliegue de proteína se puede encontrar en la tesis doctoral de Helena Domíngues (1999 "Rational design strategies to improve cytokine foldability and minimisation of a functional motif: the IL-4 case" University of Utrech, ISBN 90-393-20-81-0).

A partir de la bibliografía sobre esta área, la suma tanto in vitro como in vivo resultante principalmente de la acumulación de intermediarios que tienen alta tendencia a asociarse (Fink, A.L. 1998) y establecen interacciones no nativas que dirigen proteínas a conformaciones inactivas (Booth et al., 1997). El pliegue de una proteína a una única estructura 3D se ilustra en la Figura 1. Los intermediarios del pliegue pueden acumularse porque existe una barrera de elevada energía entre ellos y el estado de transición, y/o porque la barrera de energía y el estado de transición es bajo. En el primer caso mostrado en esta figura, el pliegue es lento y la concentración de intermediarios es elevada. En el segundo caso, el estado plegado se despliega con frecuencia bajo condiciones fisiológicas y, como resultado, puede estar presente una concentración significante de intermediarios de pliegue. Por lo tanto, la relativa desestabilización de intermediarios de pliegue y/o la estabilización del estado plegado, con respecto al estado de transición de pliegue, podría ayudar a la proteína a plegarse más eficientemente (Muñoz et al 1994a).

La invención hace referencia a métodos que incorporan la ingeniería de sustituciones de aminoácido que de manera selectiva desestabilizan cualquier intermediario apreciativo en la ruta de pliegue para las citoquinas. Por lo tanto, los mutantes obtenidos quedan solubles durante la expresión y/o se vuelven a plegar de modo más eficiente in vitro. Al mismo tiempo, estos mutantes son de actividad similar a la proteína de tipo salvaje.

Un primer aspecto del método de la invención implica la mutación de secuencia de aminoácido de la citoquina de modo que se retiren los residuos hidrofóbicos expuestos a disolvente. Las sustituciones de aminoácido realizadas incluyen sustituciones de residuos hidrofóbicos (como Valina, Leucina, Isoleucina, Fenilalanina, Triptófano, Metionina, prolina) a residuos más polares (como Lisina, Arginina, Histidina, Aspartato, Aspargina, Glutamato, Glutamina, Serina, Treonina, Tirosina).

Este aspecto del método se basa en la observación de que los intermediarios del pliegue a menudo se caracterizan por la presencia de una cantidad insignificante de estructura secundaria y estructura terciaria mal definida que se establecen mediante interacciones hidrofóbicas. Por consiguiente, resulta verosímil que los residuos hidrofóbicos que están expuestos en el estado plegado (como resultado de un pliegue terciario) ser enterrarán en un intermediario plegador. La mutación de tales residuos a un aminoácido más polar tiene el efecto de desestabilizar el intermediario con respecto al estado plegado del llamado efecto hidrofóbico inverso. Una representación esquemática del efecto hidrofóbico inverso se muestra en la Figura 2. El reemplazo de residuos hidrofóbicos por residuos más hidrofílicos debería desestabilizar tanto el conjunto desnaturalizado como al intermediario con respecto al estado nativo. Esto aumentará la
velocidad de pliegue y reducirá los procesos de agregación cinética que resultan de la acumulación de intermediarios.

Existen varios métodos disponibles para la identificación de residuos expuestos a disolvente, incluyendo el uso de programas de ordenador estándar con gráficos moleculares, como RasMol (disponible en http://www.umass.edu/
microbio/rasmol/getras.htm). QUANTA^{TM} (Molecular Simulations Inc. 9685 Scranton Road San Diego, CA 92121) y Civil ^{TM} (Tripos Inc. 1699 South Hanley Rd., St. Louis. Missouri. 63144, USA). Además, no es estrictamente necesario que se conozca la estructura tridimensional de una proteína. Existen un número de programas de ordenador sofisticados y plataformas bioinformáticas disponibles que permiten predecir con cierta precisión la secuencia de aminoácido. También es posible inferir la posición de los residuos expuestos a disolvente para una citoquina de estructura desconocida a partir de un ortólogo homólogo o de citoquina muy relacionada para la cual se dispone de estructura, usando modelado por homología o mediante métodos de enroscado (ver Jones, D.T. 1997). Cuando se eligen residuos para mutar en este paso del método, los residuos hidrofóbicos expuestos a disolvente deberían elegirse idealmente de manera que no se conservasen entre la citoquina de interés y otras citoquinas homólogas o muy relacionadas.

Por ejemplo, en el caso de IL-4, triptófano 23 y leucina 91 son residuos expuestos a disolvente en la secuencia humana: en la mayoría de los miembros de la familia IL-4, se encuentra un residuo de serina (hidrofólico) en esta posición. Como consecuencia uno o preferiblemente dos de estos residuos proporcionan buenas opciones de mutación. En este caso, la serina es una opción aconsejable como un residuo sustitutivo, ya que no sólo este residuo es hidrofólico, sino que su presencia en esta posición muy relacionada con las proteínas IL-4 provoca soporte para la interferencia y su presencia en este punto probablemente no es dañina y puede ser incluso ventajosa.

El segundo aspecto del método implica la mutación de la secuencia aminoácido de la citoquina con el fin de estabilizar uno o más elementos secundarios estructurales en la citoquina. En un aspecto preferente de esta realización de la invención, los residuos estabilizadores de la hélice se introducen en la secuencia de la proteína. Este elemento del método se basa en la observación de que los elementos secundarios estructurales se estabilizan mediante un conjunto de interacciones locales entre residuos vecinos. Elementos secundarios estructurales significan hélices \alpha y capas \beta, curvas y giros \beta, preferiblemente hélices \alpha.

Los residuos aminoácidos que producen alpha hélices incluyen Alanina, Asparagina, Cisterna, Glutamina, Glutamato, Leucina, Metionina, Fenilalanina, Triptófano o Tirosina. Los residuos que rompen la hélice y que deterioran la estructura, como Prolina y Glicina, deben evitarse.

Existen un número de técnicas disponibles que permiten el diseño racional de proteínas que contienen elementos secundarios estructurales estabilizados. Los principios que están por debajo de la formación y estabilidad de estructuras capa (3 están sólo emergiendo en la actualidad. Sin embargo, en el caso de hélices alpha, estos principios son bastante comprensibles (ver Chakrabartty y Baldwin 1995). Este conocimiento es el resultado de estudios con péptidos sintéticos modélicos, y también del análisis de propiedades termodinámicas y cinéticas de proteínas mutantes que llevan sustituciones de aminoácido en sus hélices alpha.

Una importante contribución ha sido la aportada por los intentos por diseñar proteínas de novo con uno o más segmentos de estructura helicoidal, el llamado conjunto hélice (ver Kohn y Hodges 1998). Con bastante frecuencia, las proteínas diseñadas carecen de interacciones específicas terciarias que son características de proteínas plegadas, pero los segmentos helicoidales normalmente están bien definidos.

La información reunida a partir de estos tipos diferentes de estudios se ha empleado para desarrollar y optimizar algoritmos que pueden predecir el contenido helicoidal de péptidos en solución acuosa. Un algoritmo acuñado AGADIR es uno de estos métodos (Muñoz et al. 1994 b,c,c; Muñoz et al. 1997; Lacroix et al. 1998), y ha probado ser una herramienta útil en el diseño de péptidos con alto contenido de estructura helicoidal.

En este elemento del método, cuando se identifican residuos que pueden mutarse con el fin de aumentar la propensión helicoidal de la secuencia de aminoácido constituyente, las interacciones de gran alcance deberían quedar idealmente intactas. Los residuos objetivos deberían exponerse idealmente al disolvente, hacer solamente contactos locales dentro de la hélice alpha, y no deberían incluirse en interacciones extensas con el resto de la molécula.

El efecto de interacciones locales mejoradas sobre la cinética de pliegue y sobre la estabilidad de una proteína determinada dependerá de las características termodinámicas y estructurales de posibles intermediarios en la ruta de pliegue, así como aquellos del estado nativo y desnaturalizado. Si un elemento de la estructura secundaria se pliega en el estado de transición pero no en un intermediario del pliegue, su estabilización a través de la introducción de interacciones favorables similares a las nativas debería hacer descender la barrera de energía del estado de transición de pliegue, acelerando de este modo la reacción plegadora (ver Figura 3). También pueden introducirse parejas electroestáticas favorables.

Al seleccionar la hélice apropiada para mutar en una citoquina, deben considerarse varios criterios. En primer lugar, es ventajoso elegir una hélice que no se conserve entre miembros muy relacionados de la familia de la citoquina. En segundo lugar, los residuos deberían elegirse de tal modo que no estén implicadas en el enlace con el receptor, como por ejemplo, en el caso de IL-4, residuos en el término N de la hélice C de la citoquina. En tercer lugar, puede resultar desventajoso elegir una hélice que tenga estructura sensible. Sin embargo, éste no es necesariamente el caso y a menudo no se conoce si un hélice determinado es flexible o no. Si se conoce que una hélice determinada, o partes de la misma, son muy flexibles, entonces, particularmente cuando la parte flexible no corresponde con un punto funcional, este punto es obviamente un buen objetivo para la estabilización mediante mutagénesis. Esto puede predecirse a partir de relajación 15N de residencia magnética nuclear y estudios sobre intercambio de hidrógeno de la citoquina en cuestión.

En zonas de la proteína que tienen un promedio bajo de contendido helicoidal, las mutaciones pueden introducirse de modo que aumenten el promedio de contenido helicoidal de esta región. Estas mutaciones incluyen residuos que son mejores formadores de hélice que los resididos que reemplazan (ver Chakrabartty 1995; Muñoz y Serrano, 1994e). Las mutaciones también pueden introducirse de modo que permitan la formación de parejas electroestáticas favorables.

Cuando se diseña una sustitución de aminoácido que forme una hélice para incorporarse en una citoquina con el fin de mejorar su estabilidad, debería tenerse en cuenta que si, además de estar presente en la proteína plegada naturalmente, la hélice \alpha también está presente en el intermediario que provoca el problema de pliegue, por lo que su estabilización afectará del mismo modo al estado plegado y al intermedio, y por lo tanto no habrá un efecto significante en el replegamiento, al menos bajo concentraciones desnaturalizadoras. En concentraciones con moderado o elevado desnaturalizador, el intermediario se desestabilizará con respecto al estado nativo, y el pliegue se realizará más rápido.

Si la hélice \alpha no está presente en el intermediario pero está presente en el estado de transición, su estabilización debería dar resultado en un barrera de energía inferior entre el intermediario y el estado de transición, y como consecuencia aumentará la velocidad de pliegue. Por lo tanto bajo concentraciones moderadas desnaturalizadotas, como aquellas empleadas en experimentos de replegamiento de proteínas, la estabilización de hélices \alpha siempre acelerará la reacción de pliegue, provocando que el proceso de pliegue sea más productivo.

Los inventores consideran a la hélice C como una hélice preferente para la estabilización de citoquina de acuerdo con la invención. Se cree que esta hélice actúa previniendo la agregación de proteína mediada por un intermediario del pliegue, probablemente debido a la aceleración de la reacción de pliegue y a un descenso concomitante en la concentración de un intermediario putativo de pliegue.

En el ejemplo específico de IL-4, la hélice C no se conserva entre los miembros de la familia IL-4. Además, se sabe que los primeros residuos en el terminal N no se ven implicados en el enlace con el receptor (Wang et al. 1997), y estudios sobre la relajación ^{15}N con Resonancia Magnética Nuclear e intercambios con hidrógeno sobre IL-4 han demostrado que esta región de la hélice C es muy flexible (Refield et al., 1992; Redfield et al., 1994a; Redfield et al., 1994b). Como soporte adicional a estas observaciones, el algoritmo AGADIRIs-2 predice un bajo contenido medio helicoidal (4%) para esta hélice.

Ejemplos de mutaciones estabilizadoras de hélice para IL-4 son la mutación de treorina 69 con serina; glutamina 71 con alanina; glutamina 72 con glutamato; fenilalanina 73 con alanina; histidina 74 con asparagina. La secuencia SAAEAN puede por lo tanto introducirse en posiciones 69-74 en la secuencia completa de aminoácido IL-4, sustituyendo a TAQQFH.

En el caso de mutar la hélice C de IL-4, al mismo tiempo que se introducen los residuos aminoácidos que son mejores para formar hélices, el motivo coronador de N en la proteína de tipo salvaje (T-X-X-Q) pueden sustituirse por una homólogo mejor (S-X-X-E) mientras que la mismo tiempo provocan la formación de una hélice. En esta realización de la invención, la secuencia de IL-4 de tipo salvaje:

ATAQQFHRHKQLIRFLKRLDRNLWGLAG

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Puede sustituirse por:

ASAAEANRI-IQLIRFLKRLDRNLWGLAG; los residuos en negrita con los mutados.

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El receptor funcional IL-4 ha demostrado ser heterodímero comprendiendo un componente de elevada afinidad, el IL-4R\alpha, y una subunidad de baja afinidad que puede ser bien la cadena común gama IL-2 (Russel et al., 1993) o IL-13R\alpha (Matthews et al., 1995), dependiendo de la célula objetivo. Los datos aportados por Matthew et al., 1995, sugieren que IL-4 puede enlazarse con un receptor distinto, llamado receptor tipo II IL-4, que está compuesto por la cadena IL-4R\alpha y el receptor de enlace de baja afinidad de IL- 13 (IL-13R\alpha). Estos datos explican por qué IL-2 e IL-3 pueden provocar respuestas biológicas similares a IL-4 en ciertos tipos de células. En el caso específico de IL-4, los inventores consecuentemente lo consideran ventajoso para mutarse con la citoquina para permitir el enlace de la citoquina con IL-4R\alpha pero para prevenir el enlace de la citoquina con IL-13R\alpha y/o la cadena \gamma_{c}. La posibilidad para inhibir las dos citoquinas de modo simultáneo puede probar unos medios eficientes para frenar los síntomas que se asocian con enfermedades alérgicas; por este motivo estos antagonistas IL-4 son de elevado interés terapéutico.

También puede resultar ventajoso introducir mutaciones diferentes a las empleadas para estabilizar el pliegue de la proteína natural al mismo tiempo que se produce la mutagénesis de acuerdo con la invención. Por ejemplo, ya se han descrito dos antagonistas eficientes de IL-4 en la bibliografía. Estos son IL-4Y124D (Y) (Kruse et al., 1992) e IL-4R121 DY124D (RY) (Kruse et al., 1993; Tony et al., 1994). Estos mutantes IL-4 enlazan IL-4R\alpha con un K_{d} similar al de la proteína de tipo salvaje, pero son incapaces de encontrar un segundo componente receptor (Duschl et al., 1995). Esto da como resultado la formación de un complejo improductivo con IL-4R\alpha, que no tiene actividad biológica detectable, y los antagonistas IL-4 también han demostrado inhibir IL-13 (Grunewald et al., 1998; Tony et al., 1994), porque el sistema receptor de esta citoquina requiere que IL-4R\alpha realice una transducción señalizadota (Smerz-Bertling et al., 1995; Tony et al., 1994). En un aspecto, la invención se refiere por lo tanto a la sustitución de un residuo aspartato en posición 121 y/o 124 en la secuencia de aminoácido IL-4 de completa longitud.

Los hechos que aquí se presentan apoyan la visión de que las secuencias helicoidales alpha en proteínas no necesariamente se optimizan para una máxima estabilidad de la proteína. Esto no presenta problemas cuando las proteínas están siendo sintetizadas y cuando se operan en su ambiente natural, cuando han evolucionado para cumplir su papel biológico. Sin embargo, la situación es diferente cuando las proteínas se sintetizan y manipulan en un medio heterólogo que puede condicionar la estabilidad de las proteínas nativas y de otras especies en la ruta de pliegue. En este caso, las mejoras en la estabilidad de hélices alpha pueden aumentar tanto la estabilidad del estado nativo como la velocidad en la velocidad de pliegue.

Además, ciertos algoritmos, tales como AGADIR, han demostrado ser excelentes herramientas para el diseño racional de secuencias helicoidales que poseen una mayor estabilidad. De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, el método comprende un aspecto adicional c) de incluir la pro-secuencia de la citoquina en su terminal N. Se sabe que la mayor parte de las proteínas, incluyendo una variedad de proteasas, factores de crecimiento, hormonas polipéptidos, neuropéptidos y proteínas de plasma, se sintetizan in vivo en la forma de pre-proteínas. La pre-secuencia va dirigida a la proteína para su transporte al retículo endoplásmico (ER) y para secreción extracelular. La pro-secuencia normalmente está unida a la terminal N, siguiendo la pre-secuencia, pero también puede encontrarse en la terminal C o en una combinación de ambas. Estudios con diferentes proteasas (para más detalles ver Shinde et al., 1993; Eder & Fersht, 1995) han sugerido un papel para las pro- secuencias en el pliegue de proteínas.

Los casos que se han estudiado con más detalle de pliegues mediados por pro-secuencia han sido aquellos de subtilisina (Eder et al., 1993), y proteasa \alpha-lítica (Baker et al., 1992). Ante la ausencia de propéptidos, estas proteínas se pliegan en un intermediario estable parcialmente plegado con características del estado glóbulo-fundido, pero sin actividad enzimática. La adición de pro-secuencia disminuye la barrera activadora de energía de la reacción de pliegue estabilizando el estado de transición para el pliegue o desestabilizando el intermediario no-nativo, dando como resultado la formación de la conformación nativa (ver Figura 4).

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, el método comprende un paso adicional de d) expresar la citoquina en la célula huésped junto con una foldasa y/o con una proteína chaperona.

En los últimos años, ha quedado claro que el pliegue de proteína en la célula es mediado por medio de dos clases diferentes de proteínas accesorio, conocidas como foldasas y chaperones. Las foldasas catalizan pasos tales como la formación e isomerización de puntes disulfuro, y la isomerización de enlaces péptidos precedentes a los residuos prolina. En un número de estudios, la co-expresión de foldasas ha demostrado aumentar el pliegue de proteínas segregadas en el periplasma de E. coli (para más detalles ver Georgiou & Valax 1996; Hockney, 1994).

Las dos familias de chaperones caracterizadas con más detalle con el Hsp70, que incluye DnaK y sus proteínas ayudantes. DnaJ y GrpE, y el Hsp6O. Éste también es conocido como la familia chaperonina, y comprende el sistema bacteriano GroEL/GroES, varios análogos encontrados en mitocondria y cloroplastos (para más detalles ver Hartl et al., 1994; Martin & Hartl, 1994). El sistema GroEL/GroES se ha investigado con mucho esfuerzo tanto estructuralmente (Braig et al., 1994; Mande et al., 1996) y mecánicamente (Corrales & Fersht, 1996). GroEL está compuesto por dos anillos heptaméricos uno sobre otro formando una rosquilla doble con una tapa en la parte superior (GroES). La evidencia experimental señala a un modelo para pliegue proteico en el citoplasma de E. coli en el cual Hsp70 y Hsp60 se ven secuencialmente implicados (Langer et al., 1992). Los miembros de la familia Hsp70 se enlazan con proteínas de manera transnacional, a medida que se van sintetizando, y las guía a través de los primeros pasos de pliegue hasta que se alcanza un estado de glóbulo fundido. Los parches hidrofóbicos expuestos en la superficie de estos intermediarios se reconocen a continuación por parte del sistema GroEL/GroES que los mantiene en un estado competente para el pliegue. El pliegue de la cadena polipéptido tiene lugar en el interior de la estructura hueca de GroEL y la proteína se libera tras la hidrólisis ATP. Si un ciclo no resulta suficiente para un pliegue correcto, el procedimiento se repetirá hasta que se consiga un estado correctamente plegado (Heyrovska et al., 1998).

Con el fin de llevar la expresión proteica asistida por chaperones, las bacterias deberían transformarse con dos plásmidos distintos, uno conteniendo el gen codificador de la proteína de interés y el otro gen codificando el chaperón. Los plásmidos deberían tener diferentes orígenes de réplica, de modo oque pueden mantenerse establemente en la misma célula bacteriana. Además, deberían transportar diferentes marcadores antibióticos de resistencia, con el fin de permitir la selección para la presencia simultánea de ambos plásmidos. Los promotores normalmente son los mismos para ambos plásmidos, de modo que la expresión de la proteína objetivo la chaperonina puedan inducirse concomitantemente. En algunos casos, puede resultar útil usar diferentes promotores de modo que la chaperonina pueda inducirse antes. La expresión de la proteína objetivo es por lo tanto inducida en un momento más tardío, cuando los niveles de chaperonina ya son lo suficientemente altos como para mediar el pliegue de manera eficiente (Cole,
1996).

Existen varios casos bien documentados en la bibliografía en los cuales la co-expresión de GroEL/GroES o DnaK/J ha demostrado aumentar la cantidad de proteína soluble. Dihidrofolato reductasa (DHFR) es una de las proteínas que se producen como cuerpos de inclusión ante la ausencia de GroEL/S. Cuando el sistema se coexpresa con la proteína, la cantidad de proteína presente en la fracción soluble aumenta drásticamente, permitiendo la purificación de 3-5 mg de enzima activa por litro de cultivo bacteriano (Dale et al., 1994). Se ha observado un efecto similar para la coexpresión de GroEL/S o DnaK con varias tirosina quinasas (Amrein et al., 1995). La coproducción de DnaK también ha demostrado que aumenta la solubilidad de hG-CSF (Pérez-Pérez et al., 1995), y hGH (Blum et al., 1992), dos citoquinas de la familia IL-4.

Preferiblemente, la chaporina empleada en el paso d) es el sistema GroEL/ES o tioredoxina. Sin embargo, no existe una regla general que establezca qué chaporina hay que elegir con el fin de mejorar la propiedades de pliegue in vivo de una proteína específica. La chaperona que es capaz de enlazarse con un intermediario agregación-decúbito prono será el más adecuado, pero esta respuesta tan sólo puede encontrarse haciendo el experimento. Además, para algunas proteínas, la expresión de la chaperona no es suficiente para obtener proteína soluble, y la opción de combinar varios de los factores citados puede ser más adecuada. Cuando se emplea la subunidad catalítica de piruvato deshidrogenasa fosfatasa bovina ha sido necesario descender la temperatura de crecimiento a 30°C con el fin de obtener proteína activa soluble (Lawson et al., 1993). Otro factor que debería tenerse en cuenta es que la coexpresión con chaperones puede disminuir los niveles de expresión de la proteína objetivo. Este efecto probablemente aparece por una competición entre la chaperona y la proteína por componentes necesarios para la síntesis proteica, como ribosomas, aminoácidos o t-RNAs (Dale, et al., 1994). Además, elevados niveles de expresión de chaperón puede ser perjudicial para E. coli (Blum et al., 1992) y se conoce muy poco sobre el comportamiento de células que sobreexpresan chaperones en los fermentadores usados para la producción a gran escala de biofármacos (Georgiou & Valax, 1996).

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona IL-4 humano mutado en la posición 23, posición 91 o en ambas posiciones 23 y 91 en la secuencia de completa longitud por sustitución de aminoácido de residuos hidrofóbicos expuestos a disolvente, y para introducir residuos estabilizadores de hélice, de tal modo que durante el pliegue de la citoquina, un intermediario formado durante el pliegue de la citoquina se desestabilice con relación a la citoquina en sus estado plegado. Una citoquina establecida de acuerdo con la invención es una citoquina "conjunto de cuatro hélices" como aquellas pertenecientes a la superfamilia hematopéyica o clase 1 de citoquinas, incluyendo HGM, GM-CSF, G-CFC, LIF, EPO, IL-2, IL-4, IL-5 e IL-6. Debido al aumento del valor comercial de fármacos para mamíferos, las citoquinas que se derivan de mamíferos, en particular de humanos, son objetivos preferentes para la estabilización de acuerdo con la presente invención.

Mediante el término "funcionalmente equivalente" se entiende que las proteínas citoquinas mutantes retienen una o más de las funciones biológicas como la del control del crecimiento y diferenciación de células inmunes, defensa contra macroparásitos helmínticos, el rechazo de ciertos tumores y la introducción específica de anticuerpos IgE. Las funciones biológicas de otras citoquinas quedarán claras para aquellos expertos en la técnica. El término "variantes" incluye, por ejemplo, mutantes que contiene sustituciones de aminoácido, inserciones o eliminaciones de la secuencia de citoquina de tipo salvaje, así como variantes biológicas naturales (por ejemplo, variantes alélicas o variaciones geográficas dentro de la especie de la cual se deriva la molécula de citoquina). Las variantes con función mejorada como las de la secuencia de tipo salvaje pueden diseñarse a través de mutación sistemática o directa de residuos específicos en la secuencia proteica. Este término también se refiere a moléculas que son estructuralmente similares a la citoquina de tipo salvaje, o que contienen estructura terciaria similar o idéntica.

Los derivados de las moléculas, variantes y equivalentes funcionales descritos anteriormente también son aquí descritos. Tales derivados incluyen uno o más péptidos o polipéptidos adicionales fusionados en la terminal amino o carboxi de las citoquinas modificadas. El propósito del péptido o polipéptido adicional puede ser prestar ayuda en la detección, expresión, separación o purificación de la proteína o puede proporcionar a la proteína las propiedades adicionales deseadas. Ejemplos de parejas potenciales para la fusión incluyen beta-galactosidasa, glutationa-S-transferasa, luciferasa, un etiquetea polihistidina, un fragmento polimerasa T7, un péptido de señal de secrección u otra citoquina o receptor de citoquina. Tales derivados pueden prepararse fusionando los péptidos bien genéticamente o químicamente.

Preferentemente, las citoquinas mutantes producidas mediante el método de la presente invención muestran un aumento en la producción de repliegues de al menos dos pliegues, preferiblemente cinco pliegues o más, o más preferiblemente diez pliegues o más.

En una realización preferente de la invención, la citoquina es IL-4 o un derivado del mismo. IL-4 es una citoquina inmunoreguladora muy importante que controla el crecimiento y la diferenciación de varios tipos de células inmunes, y que se ve implicada en la defensa contra los macroparásitos helmínticos, y en el rechazo de ciertos tumores. Quizás, el papel clínico más importante de IL-4 es la inducción específica de anticuerpos IgE que son responsables del desarrollo de los síntomas que típicamente se asocian con reacciones alérgicas. Ahora, resulta evidente que IL-4 juega un papel dominante en la respuesta alérgica, ya que esta proteína determina si células-B incrementan a IgE o a otros tipos de anticuerpos. Como consecuencia, los fármacos que son capaces de interferir con la actividad de IL-4 ayudarán a reducir los niveles de IgE y provocarán que las reacciones alérgicas se puedan controlar farmacéuticamente. Un prerrequisito para diseñar tales fármacos es la comprensión detallada de los principios que gobiernan el enlace IL-4 con su sistema receptor. El IL-4 humano mutado en posición 23, en posición 91 o en ambas posiciones 23 y 91 en la secuencia de completa longitud, y fragmentos funcionalmente equivalentes o variantes de los mismos de un aspecto particularmente preferente de la invención. De manera ventajosa, cualquier mutación introducida en estas posiciones puede ser un residuo de serina. De manera alternativa, o adicionalmente, la proteína IL-4 puede contener una o más de las siguientes mutaciones: treorina 69 a serina; glutamina 71 a alanina; glutamina 72 a glutamato, fenilalanina 73 a alanina; histidina 74 a asparagina. Por lo tanto, la secuencia SAAEAN puede introducirse en posiciones 69-74 en la secuencia completa IL-4 de aminoácido, sustituyendo a TAQQFH. De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona IL-4 humano mutado en posición 23, posición 91, o en ambas posiciones 23 y 91, incluyendo en posiciones 68-95 en la secuencia de aminoácido de completa longitud, la secuencia ASAAEANRHKQLIRFLKRLDRNLWGLAG, y fragmentos funcionalmente equivalentes o variantes de los mismos.

Las proteínas IL-4 y derivados de las mismas generados mediante el método de la invención pueden emplearse para purificación de la proteína II-4R\alpha que comprenden pasar una composición que contiene IL-4R\alpha a través de una columna de afinidad a la cual se le añade una proteína mutante IL-4, lavar la columna, y eluir IL-4R\alpha de la columna. Preferentemente, la proteína mutante IL-4 se muta en posición 23, en posición 91 o en ambas posiciones 23 y 91 en la secuencia de completa longitud, más preferentemente se muta con serina en cualquiera de estas posiciones o en ambas. De manera alternativa, o adicionalmente, la proteína IL-4 puede contener una o más de las siguientes mutaciones: treonina 69 con serina; glutamina 71 con alanina; glutamina 72 con glutamato, fenilalanina 73 con alanina; histidina 74 con asparagina.

En el presente IL-4R\alpha se purifica mediante cromatografía por afinidad en columnas purificadoras extremadamente caras que se empaquetan con IL-4WT. Las proteínas mutantes estabilizadas IL-4 producidas mediante métodos descritos anteriormente serán mucho menos caras para producir grandes cantidades y por lo tanto permitirán que se produzcan columnas purificadoras a bajo coste, reduciendo los costes de preparación de proteína IL-4R\alpha para uso terapéutico.

La presente invención también describe el uso de una citoquina mutada de acuerdo con los aspectos de la invención descritos anteriormente para producir anticuerpos contra la citoquina. En particular, en este aspecto de la invención puede emplearse una proteína mutante IL-4 como la descrita. Los anticuerpos generados por medio de este método tienen importante usos como herramientas de diagnóstico y herramientas terapéuticas.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención se proporciona un péptido que comprende un fragmento de una citoquina mutante tal y como se ha descrito anteriormente.

Tales péptidos pueden derivarse de citoquinas de tipo salvaje o pueden prepararse sintéticamente o empleando técnicas de ingeniería genética. En particular, las moléculas sintéticas que se diseñan para estructuras mímicas y terciarias o puntos activos de una citoquina se consideran ventajosas. A pesar de que los péptidos no son fármacos terapéuticos ideales, el hecho es que pueden obtenerse fácilmente mediante métodos sintéticos químicos que permiten la incorporación de aminoácidos no naturales, enlaces péptidos modificados, o grupos químicos que pueden aumentar la estabilidad intrínseca de los péptidos y su resistencia a la degradación proteolítica. Además, pueden emplearse péptidos activos para liderar compuestos que pueden optimizarse por medio de análisis combinatorios, y que pueden emularse por medio de pequeños armazones orgánicos que ofrecen la bioestabilidad y biodisponibilidad requerida para fármacos terapéuticos (ver Emmos et al., 1997).

Una pregunta importante es cómo se encuentra el mejor péptido candidato posible que sea capaz de mediar el efecto biológico deseado de la forma más eficiente. Las estimulaciones moleculares dinámicas (MD) proporcionan un método que puede ayudar al diseño racional seleccionando los candidatos más prometedores en términos de plegabilidad (ver Cregut et al., 1999). Por lo tanto, a menudo resulta conveniente combinar estrategias racionales con técnicas irracionales en la cuales se seleccionan los mejores ligandos péptidos analizando bibliotecas de compuestos con diversas características funcionales. La tecnología relativa a la expresión en fago ha sido de ayuda en la creación y análisis de vastas bibliotecas péptidas (Cwirla et al, 1990; Smith et al., 1985). Esta metodología se ha empleado con éxito para miméticos péptidos aislados de eritropoyetina (EPO) (Wrighton et al., 1996). Uno de estos péptidos es capaz de enlazarse con el receptor EPO con un aparente K_{d} de 0.2 \muM, y también se ha determinado la estructura tridimensional de este péptido junto con el receptor EPO (Liban et al., 1996). El pequeño péptido (20 residuos) se dimeriza formando una capa \beta de cuatro trenzas y anti-paralelo que es capaz de enlazarse con dos moléculas receptoras EPO, y se ha demostrado que estimula la proliferación celular in vivo y la eritropoyesis en ratones (Wrighton et al., 1996).

El principal inconveniente de métodos analíticos es el largo periodo de tiempo que es necesario para cribar las bibliotecas para enlazar con el objetivo. Por lo tanto, es necesario caracterizar el mejor blanco y comenzar otra ronda de selección consumidora de tiempo. Por lo tanto, es importante crear estrategias racionales que integren datos estructurales y de mutagénesis. Los miméticos moleculares diseñaos de este modo tienen bastantes posibilidades de proporcionar puntos iniciales fiables con afinidades comparables con aquellas encontradas en las primeras rondas de estudios de análisis combinatorios (normalmente en el rango alto \muM). Una técnica que combina expresión en fago y diseño racional ha sido empleada previamente para mejorar la estabilidad y afinidad de un derivado con dos hélices del dominio Z de tres hélices de la proteína A. Este conjunto con tres hélices residuo 59 se enlaza con la parte Fc de inmunoglobulina G (IgG) con un K_{d} de 10 \muM. El dominio de enlace se ha reducido a un péptido residuo 33 que es capaz de enlazar IgG con la misma afinidad virtual que la proteína de tipo salvaje (Braisted et al., 1996).

La invención también describe una molécula de ácido nucleido que codifica una citoquina mutante o un péptido de acuerdo con uno de los aspectos de la invención anteriormente descritos. La invención también describe métodos para la producción de citoquinas y péptidos tal y como se ha descrito anteriormente, comprendiendo la introducción de ácido nucleico que codifica la citoquina o péptido en una células huésped, como una bacteria E. coli.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona una citoquina mutante o un péptido de acuerdo con uno de los aspectos anteriormente descritos de la invención, para uso como un fármaco. Un aspecto adicional de la invención proporciona el uso de tales citoquinas o péptidos en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una enfermedad en un mamífero, preferentemente un humano. De manera ventajosa, la enfermedad puede estar en condiciones relacionadas con una alergia. La invención también proporciona un método para prevenir o tratar una alergia que comprenda la administración a un paciente de una citoquina mutante o péptido tal y como los descritos anteriormente.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona una composición farmacéutica que está formada por una citoquina mutante o péptido de acuerdo con uno de los aspectos anteriormente descritos, opcionalmente como una sal farmacéuticamente aceptable, en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable. La invención también proporciona un proceso para la preparación de tal composición farmacéutica, en la cual tal citoquina mutante o péptido se encuentra en asociación con un portador farmacéuticamente aceptable.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un kit de diagnóstico que comprende una citoquina o mutante de acuerdo con uno de los aspectos descritos de la invención.

La invención también proporciona un mamífero no humano transgénico, que lleva un transgen codificando una citoquina o mutante de acuerdo con uno de los aspectos de la invención. Un aspecto adicional de la invención proporciona un proceso para producir tal animal transgénico, comprendiendo el paso de introducir una molécula de ácido nucleico codificadora de citoquina mutante o péptido en un embrión de un mamífero no humano, preferiblemente un ratón.

Varios aspectos y realizaciones de la presente invención se describirán a continuación con más detalle como modo de ejemplo, con referencia particular a métodos para la estabilización de IL-4. Se apreciará que se pueden realizar modificaciones de los detalles sin salir del alcance de la invención.

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Breve descripción de las figuras

Figura 1: Representación Esquemática del pliegue de una proteína con un única estructura tridimensional (estado doblado - F) de una secuencia lineal de aminoácidos (el estado no plegado - U). Este complejo proceso normalmente implica la formación de intermediarios de pliegue estables (I) que se separan mediante una barrera de energía (\ddagger) de estado no plegado y plegado. Estos intermediarios pueden acumularse en elevadas concentraciones durante la reacción de pliegue llevando a la agregación proteica. La acumulación de intermediarios puede deberse a la barrera de alta energía entre el intermediario y el estado de transición para el pliegue (\ddagger*) o a la barrera de baja energía entre el estado doblado y el estado de transición. Por lo tanto, la desestabilización selectiva de intermediarios de pliegue (I') y/o estabilización del estado plegado (F') pueden ayudar a las proteínas a doblarse más eficientemente.

Figura 2: Representación Esquemática del efecto hidrofóbico inverso. U y U_{m} representan el conjunto conformacional no plegado, en la proteína de tipo salvaje y en la mutante. I y F, I_{m}, y F_{m}, representan, respectivamente, el estado intermedio y doblado en el tipo salvaje y la mutante. K_{u} y K_{r} son las constantes de velocidad de pliegue y despliegue, y + simboliza el estado de transición. La sustitución de residuos hidrofóbicos por residuos más hidrofílicos debería, en principio, desestabilizar tanteo el conjunto desnaturalizado como el intermedio con respecto al estado nativo. Esto aumentará la velocidad de pliegue y reducirá los procesos de agregación cinética que resultan de la acumulación de intermedios.

Figura 3: Aceleración de la reacción de pliegue a través de optimización de interacciones locales. U representa el conjunto conformacional no plegado. I y F, I_{m}, y F_{m}, representan, respectivamente, el estado intermedio y doblado en el tipo salvaje y la mutante. K_{u} y K_{r} son las constantes de velocidad de pliegue y despliegue, y + simboliza el estado de transición.

Figura 4: Posible ruta por la cual los chaperones intramoleculares median el pliegue proteico. Cuando la proteína se pliega en ausencia de su pro-secuencia, adquiere una conformación de estado consistente en un glóbulo fundido, lo que posee una estructura secundaria similar a la nativa pero carece de interacciones terciarias requeridas para la actividad biológica. El glóbulo fundido es estable y es incapaz de superar la barrera de energía que la separa del estado plegado. La adición del propéptido desciende la barrera de energía entre el estado glóbulo fundido y el estado de transición, permitiendo que el pliegue se realice al estado nativo.

Figura 5: Espectros Far-UVA CD del tipo salvaje, (\bullet) y péptidos mutante (\blacklozenge) de hélice C de IL-4en 25 mM Na2HPO4, pH 6.5, a 5°C. Se insertan los valores predichos por AGADIRS-2 para el contenido helicoidal de los péptidos y los valores experimentalmente determinados.

Figura 6: Comparación de los espectros 2D NOESY del tipo salvaje (IL4Ch_wt) y péptido mutante (IL4BCh). Los espectros se adquirieron con un tiempo de mezcla de 140 ms. El grosor de la barra por debajo de la secuencia de péptidos representa la organización de la hélice en IL4BCh en base a los datos NOE.

Figura 7: La diferencia entre los valores de mutación químicas de los protones H\alpha del péptido mutante y los valores de vueltas arbitrarias (Merutka et al., 1995). Los valores negativos indican la formación de estructura helicoidal. Los residuos cuyo Ha no se pudo asignar de manera no ambigua, están marcados mediante un asterisco (*).

Figura 8: Las fracciones celulares derivadas de E. coli AD494 que expresan IL-4 WT y las proteínas mutantes. Ruta 1: fracción insoluble de IL-4L23SW91S, ruta 2: fracción soluble de IL-4L23SW91S, ruta 3: fracción soluble de IL-4L23S, ruta 4: fracción soluble de IL-4W91S, ruta 5: fracción soluble de IL-4BChélice, ruta 6: fracción soluble de proteína de tipo salvaje. Solamente una fracción muy pequeña de la proteína de tipo salvaje (menos del 10%) se encuentra en el sobrenadante celular, a diferencia del 50%-60% de la proteína mutante, tal y como se determina por los análisis densiotométricos del gel SDS.

Figura 9: HPLC de proteínas de tipo salvaje IL-4 (panel A) y mutante IL-4Bchélice (panel B).

Figura 10: Espectros monodimensionales NMR de IL-4 WT, IL-4W91S e IL-4BChélice. La buena dispersión de las señales NMR muestra que las proteínas están plegadas.

Figura 11: a Perfil de desnaturalización de temperatura de IL-4WT (\bullet) y los mutantes diseñados, IL-4W91S (\blacklozenge) e IL-4BChélice (o), seguido de CD. El proceso de denaturalización es reversible tanto para IL-4WT como para las dos proteínas mutantes. b Perfil de desnaturalización química de IL-4WT (+), y las dos variantes IL-4W91S (\blacklozenge) e IL-4BChélice (o) seguido de CD. Los datos experimentales se representan asumiendo un modelo de transición con dos estados, de acuerdo con la ecuación 6. Los parámetros termodinámicos obtenidos a partir del ajuste, junto con los datos de desnaturalización de temperatura, se resumen en la Tabla 4.

Ejemplo 1

Mutagénesis diseñada racionalmente para evitar la agregación de hlL-4. Interleuquina-4 forma cuerpos de inclusión sobre la sobreexpresión en E. coli y el replegamiento in vitro de la proteína es muy ineficiente, produciendo solamente una pequeña cantidad de proteína activa. La agregación tanto in vitro como in vivo resulta principalmente de la acumulación de intermediarios de pliegue que tienen una alta tendencia a asociarse (Filimonov et al., 1993) y establecen interacciones no nativas que dirigen la proteína a conformaciones inactivas (Booth et al., 1997).

Hemos empleado dos estrategias diferentes con el fin de desestabilizar de modo selectivo cualquier intermediario putativo en la ruta de pliegue IL-4.

1.1. Método

Clonación: El gen IL-4 se ha obtenido mediante PCR de un plásmido anteriormente descrito, R1sprC109/IL4 (Kruse et al., 1991). NcoI and BamH1 se introducieron en los extremos 5' y 3', repectivamente, usando los siguientes oligonucleotidos: Oligo 5': CTG GAG ACT GCC ATG GAT CAC AAG TGC GAT: Oligo 3': A CGC GGA TCC TTA TCA GCT CGA ACA. El gen que codifica el tipo salvaje IL-4 y las proteínas mutantes se insertó en PBAT4 (Peränen et al., 1996) entre los puntos de clonación NcoI y BamHI. Debido a la introducción de un punto Ncol en el extremo 5', las proteínas mutantes IL-4 de tipo salvaje e IL-4 mutante se expresan con un aminoácido adicional (Asp) en la terminal N.

Mutagénesis dirigida al Punto: Los mutantes IL-4W91S e IL-4BChélice se obtuvieron mediante PCR (Ho et al., 1989) usando oligo 5' y oligo 3' como secuencias flanqueadoras, y las siguientes cebos mutagénicos (5' a 13'): IL-4L23Sa: CAG AGC AGA AGA CTA GTT GCA CCG AGT TGA CCG: IL-4L23Sb: CGG TCA ACT CGG TGC AAC TAG TCT TCT GCT CTG. I L-4W91 Sa: AGG AAC CTC AGT GGC CTG GCG GGC TTG; I L-4W91 Sb: CAA GCC CGC CAG GCC ACT GAG GTT CCT. IL-4BChélicea: CTG GGT GCG AGT GCA GCA GAA GCA AAC AGG CAC AAG C. IL-4BChéliceb: G CTT GTG CCT GTT TGC TTC TGC ACT CGC ACC CAG. El doble mutante IL-4W91S se generó usando IL-4L23S como muestra para la reacción PCR y los cebos IL-4W91S listados anteriormente.

Síntesis de péptidos: Los péptidos se sintetizaron en resina de injerto de polioxietileno-poliestireno en un instrumento de flujo continuo. El montaje de cadena péptida se llevó a cabo utilizando química Fmoc (Carpino et al., 1972) y la activación in situ de aminoácido constructor de bloques se realizó por PyPOB (Coste et al., 1990). El péptido se purificó mediante fase inversa HPLC y se caracterizó mediante espectrometría de masas con ionización/desorción por láser (MALDI).

1.2. Sustitución de residuos hidrofóbicos expuestos en el estado plegado por polares

Los intermediarios de pliegue a menudo se caracterizan por la presencia de una cantidad significativa de estructura secundaria y estructura terciaria mal definida, estando estabilizadas por interacciones hidrofóbicas. Por lo tanto, es bastante posible que los residuos hidrofóbicos que están expuestos en el estado plegado como resultado del pliegue terciario, queden enterrados en un intermediario de pliegue. La mutación de estos residuos a un aminoácido polar debería desestabilizar el intermediario con respecto al estado plegado, por medio del llamado efecto hidrofóbico inverso (Pakula & Sauer., 1990).

Los dos residuos aminoácidos expuestos a disolvente no conservados se identificaron en IL-4: Trp 91 y Leu L23. En la mayoría del resto de los miembros de la familia IL-4 se encontró una serina en las posiciones correspondientes, y por lo tanto se eligió este aminoácido para sustituir a W91 y L23 en la proteína humana. Como consecuencia, los dos mutantes punto se designan IL-4W91S e IL-4L23S, y un mutante que transporta ambas mutaciones, IL-4L23SW91S.

1.3. Estabilización de elementos estructurales secundarios

Los elementos estructurales secundarios se estabilizan mediante un conjunto de interacciones entre los residuos vecinos.

1.3.1. Estabilización de hélices \alpha usando AGADIR

AGADIR se basa en datos empíricos derivados de estudios conformacionales de péptidos monoméricos en solución. El algoritmo emplea esta información para calcular la energía libre de un segmento helicoidal determinado (\DeltaG_{hélice}), basado en la teoría de transición hélice-vuelta. Esta energía libre refleja la contribución de diferentes interacciones dentro de la hélice, y corresponde con la diferencia en energía libre entre la vuelta arbitraria y los estados helicoidales. En la versión más reciente del algoritmo (AGADIRIS-2, Lacroix et al., 1998), la libre energía de un segmento helicoidal se describe de acuerdo con lo siguiente:

2

donde \DeltaG_{int} es la tendencia intrínseca de un aminoácido determinado a estar en la conformación helicoidal (Muñoz et al., 1994e) y representa la pérdida de entropía conformacional que se da tras la fijación de un aminoácido en los productores helicoidales dihedrales. \DeltaGH_{enlace} es la contribución entálpica del i.i + 4 enlaces de hidrógeno principal-cadena-principal-cadena.; \DeltaG_{SD} representa la contribución de la interacciones no cargadas lateral-cadena-lateral-cadena en posiciones i,i +3 e i,i + 4 en el segmento helicoidal. Para los residuos de aminoácidos con cadenas laterales ionizables, se tiene en cuenta la dependencia pH de este tipo de interacciones. \DeltaG_{dipolo} refleja la interacción de grupos cargados, dentro o fuera del segmento helicoidal, con la hélice macrodipolo. Otro tipo de interacción que es independiente de la presencia de grupos cargados tiene que ver con el aumento de estabilidad de hélices \alpha observadas tras el aumento de fuerza iónica (Scholtz et al., 1991). Debido a que las hélices \alpha tiene un momento dipolo mucho más grande que la vuelta arbitraria, el aumento de fuerza iónica preferiblemente estabiliza la hélice \alpha, cambiando el equilibrio hacia esta conformación. Este efecto también se tiene en cuenta por AGDIRS-2 considerando la diferencia en la energía libre de pliegue de una hélice \alpha particular en una solución con una fuerza iónica determinada y en agua pura. \DeltaG_{elegido} incluye todas las interacciones electroestáticas entre dos residuos cargados dentro y fuera (Ncap y residuo precedente a Ncap, y Ccap y residuo posterior a Ccap) del segmento helicoidal con el macrodipolo helicoidal y residuos en el interior de la hélice. Las interacciones electroestáticas se calculan teniendo en cuenta el efecto de análisis de carga tras el aumento de fuerza iónica, y la distancia media entre dos grupos cargados que interactúan se ha derivado de un análisis estadístico de la base de datos. Las cargas de los aminoácidos individuales en la vuelta arbitraria y conformación helicoidal se determinan calculando su pKa y tomando en consideración la dependencia pH. AGADIRs-2 también considera el efecto de terminal N y C que bloquean los grupos. Los residuos que siguen al grupo acetil en la terminal N o que preceden al grupo amino en la terminal C pueden adoptar ángulos helicoidales con los grupos acetil y amida que juegan el papel del residuo taponador.

1.3.2 Estabilización de hélice C de IL-4

La hélice \alpha de IL-4 se seleccionó como el objetivo por varias razones. Esta hélice no se conserva mucho entre los miembros de la familia IL-4; se conoce que los primeros residuos en la terminal N no están implicados en el enlace con el receptor (Wang et al., 1997); y estudios sobre la relajación ^{15}N con Resonancia Magnética Nuclear e intercambios con hidrógeno sobre IL-4 han demostrado que esta región de la hélice C es muy flexible (Refield et al., 1992; Redfield et al., 1994a; Redfield et al., 1994b). De hecho AGADIRIs-2 predice un bajo contenido medio helicoidal (4%) para esta hélice.

Empleando AGADIRIs-2, hemos diseñado tres tipos diferentes de mutaciones que aumentan el contenido medio helicoidal superior al 20% y aumentan la estabilidad de la hélice \alpha aproximadamente 1.8 Kcal/mol. Esencialmente, hemos sustituido el motivo de caja taponadora N presente en la proteína de tipo salvaje (T-X-X-Q) mediante un homólogo mejor (S-X-X-E). Se han introducido mejores formadores de hélice (Chakrabartty et al., 1995; Muñoz et al., 1994e) en la secuencia de la hélice: Q71 y F73, se mutaron con alanina, y H74 se sustituyó por una asparagina. La razón por la que se prefirió la asparagaina sobre la alanina para sustituir a H74 fue que, la introducción de otra alanina en esta posición podría resultar en un grupo hidrofóbico en la teminal N comprendiendo cinco residuos de alanina, que podrían reducir la solubilidad de la proteína y producir agregación. Finalmente, hemos introducido dos parejas electroestáticas favorables (E-X-X-R y E-X-X-X-H).

No se diseñaron mutaciones en la terminal C de la hélice porque contiene parte del epítope funcional IL-4 (Wang et al., 1997). Además, un motivo Schellman (Schellman et al., 1980) entre un residuo leucina en posición 93 y la arginina en posición 88 se encuentra presente en la secuencia de tipo salvaje. Este motivo debería implicar la formación de dos enlaces de hidrógeno principal-cadena/principal-cadena entre estos dos residuos y se espera que contribuya aproximadamente 1 Kcal/mol a la estabilidad helicoidal (Viguera et al., 1995). El mutante que soporta la hélice estabilizada C aquí se designará IL-4BChélice.

El dicroísmo circular muestra un claro aumento en el contenido helicoidal del péptido mutante. Los valores predichos por AGADIRs-2 para el contenido helicoidal del tipo salvaje y del péptido mutante están en completo acuerdo con los determinados experimentalmente a partir del valor de elipticidad a 222 nm (ver Figura 5).

Se han llevado a cabo estudios sobre resonancia magnética nuclear del tipo salvaje (IL4Ch_wt) y péptidos mutantes (IL4BCh) (Ver Figura 6). Para IL4Ch_wt no se ha podido encontrar ninguno de los NOE indicativos de la formación de una estructura helicoidal, mientras que en el caso de IL4BCh, hemos sido capaces de asignar de manera clara un largo alcance (daI3(i,i+3) NOEs (Wütrich et al., 1996) a través de la secuencia completa del péptido. Los datos NOE revelan la formación de un motivo caja tapadora en la terminal N de IL4BCh, entre S2 y E5, y una región helicoidal bien definida que hace girar los residuos S2-F15. La región entre los residuos F15-D20 no está tan bien definido, yen la terminal C se observan dos NOEs de largo alcance que conectan R21 y W24 con A27.

Los cambios o mutaciones conformacionales de los protones Ha (Figura 7) proporcionan además más pruebas para la formación de la hélice \alpha en el péptido mutante. Los residuos 113, L16, R18 y L19 no pudieron asignarse de manera clara ya que coincidieron con otras resonancias en el espectro. L23 muestra una gran desviación de la mutación química del protón alpha a un campo más elevado debido a la proximidad con el residuo triptófano.

Ejemplo 2 Pliegue in vivo de las variantes IL-4

Los mutante diseñados y la proteína de tipo salvaje se sobreexpresaron en tres variedades diferentes de E. coli, en un número de diferentes condiciones.

Solamente las variedades DE3 se emplearon para permitir la expresión con plásmidos de expresión basados en T7. Estas variedades contienen una copia de cromosoma del gen de polimerasa T7 RNA bajo control lacUV5. La adición de IPTG al medio de crecimiento provoca la trascripción de polimerasa T7 RNA que puede entonces mediar la trascripción al gen objetivo bajo el control del promotor T7 en el plásmido de expresión (Furlong et al., 1992).

Tanto la proteína de tipo salvaje como los mutantes se expresaron en elevados niveles en las diferentes variedades, completando hasta el 60% de la proteína celular total. IL-4WT invariablemente formó cuerpos de inclusión en las tres variedades, bajo todas las condiciones testadas. Sin embargo, cuando los mutantes (IL-4L23S, IL-4W91 S, IL-4L23S W91 S, e IL-4BChélice) se sobreexpresaron en AD494, se encontró un variedad deficiente de tiorredoxina reductasa (trxB'), alrededor del 50% de la proteína producida en el sobrenadante (Figura 8).

Debido a que AD494 carece de una de las principales rutas reductoras, en principio deben permitirse que se formen enlaces disulfuro en el citoplasma E. coli (Derman et al., 1993). De hecho, esta variedad ya se ha empleado para mejorar la solubilidad de varias proteínas que forman cuerpos de inclusión cuando se producción en las variedades de expresión más convencional como BL21. La expresión de los mutantes IL-4 en BL21 también dio como resultado la agregación proteica. Además, la solubilidad de las proteínas no aumentó tras la coexpresíon con el sistema chaperonin GroEL/ES, o tiorredoxina, a pesar de que el nivel de expresión se redujo considerablemente.

La expresión de las proteínas en cualquiera de las variedades a bajas temperaturas (15°C - 30°C) resultó no tener ningún efecto sobre la cantidad de producto soluble, y la concentración de agente no se empleó para iniciar la expresión.

Los resultados descritos anteriormente se resumen en la Tabla 2 a continuación.

La Tabla 2 resume las estrategias empleadas para reducir la formación de cuerpos de inclusión IL-4 (IB). La densidad óptica de las células en 600 nm se denota mediante IOD y se representa la expresión con o sin la pro-secuencia, respectivamente, mediante +pro/-pro.

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Ejemplo 3 Caracterización de los mutantes solubles IL-4 3.1. Métodos

Pruebas de solubilidad. Escherichia coli AD494 (DE3), BL21 (DE3) y W3110 (DE3) se transformaron con los plásmidos codificando IL-4WT y las proteínas mutantes. En cada caso, se inocularon matraces con medio LB con una única colonia y se incubaron en un agitador a temperaturas que oscilaban entre 15°C y 37°C, en la presencia de 100 mg/l de ampicilina. Se indujo la expresión proteica a OD_{600} 0.4-1.0, a diferentes temperaturas, empleando concentraciones IPTG entre 0.1 y 1 mM. En caso de BL21 (DE3) y W3110 (DE3) el cultivo se incubó durante 3 horas tras la inducción, y las células se recolectaron mediante centrifugación. En caso de AD494 (DE3) la expresión proteica se indujo durante la noche. En todos los casos, las células recolectadas se volvieron a suspender en 25 mM Tris-HCl pH 8.0. La disrupción celular se inició incubando las células con 1 mM MgCl_{2}, 20 ug/ml linsozima y 10 ug/ml DNAsa y a continuación se completó usando una Prensa Francesa para Células. La fracción soluble se separó de los restos mediante ultra-centrifugación a 40000 rpm, durante 1 hora. Se recogieron muestras de la fracción soluble e insoluble y se analizaron mediante SDS-PAGE en un gel 12% poliacrilamida. La cuantificación de los productos solubles e insolubles se realizó mediante análisis densiotrométrico del gel.

Coexpresión con GroEL/S y tiorredoxina. Con el fin de sobreexpresar las proteínas con las chaperoninas GroEL/ES y tiorredoxina, las células competentes de BL12 que transportan PT-groE o PT-Trx se transformaron con el plásmido codificador de cada uno de los mutantes y de tipo salvaje IL-4. Las bacterias crecieron de una única colonia en matraces agitadores de 1 litro que contenían LB, a temperaturas que oscilaban entre 30°C y 37°C, en la presencia de 100 mg/l de ampicilina y 50 mg/l de cloranfenicol. La expresión de las variantes IL-4 y los chaperones se indujo de modo simultáneo tras la adición de IPTG al medio de crecimiento a la concentración final de 0.16 mM una vez que se alcanzó un OD600_{mm} de 0.7.

Expresión de proteína soluble en AD494. Escerichia coli AD494 (DE3) se transformó con plásmidos codificadores de IL-4WT y las proteínas mutantes. Los matraces de 1 L con medio LB se inocularon con una única colonia y se incubaron en un agitador a 37°C. Después de que se alcanzara un OD600_{mm} de 0.7-0.8, se añadió IPTG dando como resultado una concentración final de 0.16 nM. El cultivo se incubó durante la noche y las células se recolectaron mediante centrifugación.

Purificación de proteína soluble. Las células recolectadas se volvieron a suspender en 25 mM NaH_{2}PO_{4}, pH 6.5 y se incubaron en hielo durante una hora, con 1 mM MgCl_{2}, 20 ug/ml lisozima y 10 ug/ml DNAsa y a continuación se lisaron usando una Prensa Francesa para Células. La fracción soluble se separó de los restos celulares mediante ultra-centrifugación a 40000 rpm, durante 1 hora. Las muestras de la fracción soluble e insoluble se analizaron mediante SDS-PAGE en un gel 12% poliacrilamida. La cuantificación de los productos solubles e insolubles se realizó mediante análisis densiotrométrico del gel.

La purificación proteica se llevó a cabo en un sistema FPLC de Pharmacia. El sobrenadante celular se pasó en primer lugar a través de una columna Sefarosa S (Pharmacia) pre-equilibrada con 25 nM NaH_{2}PO_{4}, pH 6.5. La elución se llevó a cabo haciendo circular una sal lineal gradiente entre 0 y 0.5 NaCl. Los cuatro variantes IL-4 se eluyeron a 120 mM NaCl. Las fracciones recolectadas se enviaron a continuación a cromatografía de exclusión de tamaño y las proteínas se purificaron hasta un 90% de homogeneidad. La producción del proceso de purificación fue tal que se obtuvo 1 mg de IL-4L23S, IL-4W91S, IL-4L23S W91S por litro de cultivo celular, y aproximadamente 2 mg de IL-4BChélice.

Expresión proteica como cuerpos de inclusión en AD494

Se llevó a cabo tal y como se ha descrito anteriormente para la producción de proteína soluble, con la excepción de que esta esa expresión proteica se indujo a OD_{600} de 0.5.

Fermentación en la escala 10 a 100 L. Con el fin de producir grandes cantidades de proteína, la fermentación se realizó en un birreactor 10 1. Para estas fermentaciones los plásmidos se transformaron en E. coli W3110 (DE3). Las células crecieron mediante fermentación por tandas o lotes a 37°C en un medio complejo (30 g/L peptona de soja, 20 g/L extracto de levadura, 20 g/L glicerol, 5 g/L KH_{2}PO_{4}, 1 g/L MgSO_{4}, 100 mg/l ampicilina) a un OD_{600} de 3.0. En este paso, la expresión de la proteína recombinante se indujo mediante la adición de 0.4 nM IPTG. Tras una fase de inducción de 4 horas, las células se recolectaron mediante centrifugación.

Purificación proteica de cuerpos de inclusión. Las células recolectadas se volvieron a suspender en 25 mM Tris-HCl pH 8.0. La disrupción celular se llevó a cabo mediante la adición de lisozima (1 mg por g de peso celular en seco) y la incubación a temperatura ambiente durante 30 minutos. Los cuerpos de inclusión liberados se recolectaron mediante centrifugación a 8000 g (30 minutos). Las bolas se lavaron cuatro veces mediante resuspensión en 0.1 M Tris-HCl/1 mM EDTA/0.1% zwittergent 3-14 búfer pH 8 y centrifugación (8000 g. 15 min.). Los cuerpos de inclusión lavados se solubilizaron en 8 M GdnHCl/0.1 M Tris-HCl, pH 9. Los grupos SH se modificaron a S-SO_{3} mediante la adición de sulfato y tetrationato en exceso, tal y como se describe por Kella et al., 1988; Kella et al., 1985).

El replegamiento se llevó a cabo en una concentración proteica de 200-300 mg/L, mediante ultrafiltración de flujo cruzado contra cinco volúmenes de 50 mM NH_{2}PO_{4} pH.7, 1 mM EDTA, 0.4 Mm L-cisteína, 0.6 mM arginina, durante 5 horas (un volumen intercambio/hora). El análisis en-proceso se realizó por medio de RP-HPLC en una resina Vydac C4, aplicando un gradiente lineal de ácido trifluoracético-Acetonitrilo. Las producciones de pliegue se obtuvieron com-
parando el radio del porcentaje del área pico de isoformas correctamente plegadas con el área total pico (proteína total).

Dicroísmo circular. Se grabaron los espectros lejanos UV CD en un instrumento Jasco-710, en una cubeta con un recorrido de 2 mm. Las medidas se realizaron cada 0.1 nm, con un tierno de respuesta de 2s y un ancho de banda de l nm, a una velocidad de escáner de 50 nm/min. Los espectros mostrados en el texto representan un promedio superior a 20 escáneres. La concentración de proteína, calculada a partir de la absorbancia a 280 nm (Pace et al., 1995), fue 10 \muM. Los experimentos se llevaron a cabo en 25 mM NaH_{2}PO_{4}, pH 6.5 a 5°C.

Desnaturalización térmica. La desnaturalización térmica se midió controlando el cambio en la señal a 222 nm sobre un rango de temperatura 6-99°C, en una cubeta con un recorrido de 2 mm. Las mediciones se realizaron en incrementos de 0-5 grados, con un tiempo de respuesta de 2 s y un ancho de banda de 1 nm, a una pendiente de temperatura de 50°C/h. La concentración de proteína calculada a partir de la absorbancia a 280 nm fue 10 \muM (Pace et al., 1995) y las mediciones se llevaron a cabo en 25 NaH_{2}PO_{4} mM, pH 6.5. Las curvas se ajustaron con un modelo de dos estados usando la temperatura a medio punto (T_{m}), el cambio de entalpía en la temperatura en punto medio (\DeltaH_{m}) y el
cambio de capacidad de exceso de calor (\DeltaC_{p}) como parámetros de ajuste, de acuerdo con la ecuación a continuación:

4

Donde F_{unf} representa la fracción de proteína no plegada como función de temperatura (T), y F_{N} y F_{U} representan, respectivamente, la fracción de proteína completamente nativa y completamente no plegada obtenida mediante el ajuste lineal de las líneas base precedentes y posteriores a la región de transición.

Estabilidad Química. Los experimentos de desnaturalización y renaturalización química se llevaron a cabo a 25°C en 50 mM NaH_{2}PO_{4}, pH 6.5. La concentración de proteína empleada fue 7 \muM para IL-4 tipo salvaje y para IL-4W91S, y 5 pM para IL-4BChélice. Se empleó el sistema de titración automática jasco par mezclar el desnaturalizante y la proteína. La concentración GdnHCl se calculó midiendo el índice refractivo de la solución, tal y como describe Pace et al. (1990). La falta de plegamiento y el replegamiento se controlaron siguiendo el cambio en la señal CD a 222 nm. Las lecturas de elipticidad se normalizaron a fracciones no plegadas usando la ecuación estándar:

5

Donde \theta es el valor de elipticidad en una cierta concentración de desnaturalizante, y \theta_{N} y \theta_{D} significan las elipticidades de las especies completamente nativas y completamente no plegadas en cada concentración desnaturalizante, y se calcularon a partir de la regresión lineal de las líneas base pre y post pliegue. Asumiendo un modelo de dos estados, el constante equilibrio para la desnaturalización, en cada concetración desnaturalizante, puede calcularse empleando la siguiente ecuación.

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Donde F_{N} y F_{U} representan, respectivamente, la fracción de proteína completamente nativa y completamente no plegada obtenida mediante el ajuste lineal de las líneas base precedentes y posteriores a la región de transición. Se ha comprobado experimentalmente que la energía libre del no pliegue en la presencia de GdnHCl está linealmente relacionada con la concentración de desnaturalizante (Pace, 1986).

7

El valor m de \DeltaG_{d}^{H2O}, la aparente energía libre del no plegamiento ante la ausencia de desnaturalizante, puede calcularse a partir de

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La proporcionalmente constante m refleja la cooperatividad de la transición y se cree que guarda relación con la diferencia en la superficie hidrofóbica expuesta al disolvente entre los estados nativos y desnaturalizados. Cuando se toman en consideración todas estas dependencias, el cambio en la elipticidad como función de la concentración de desnaturalizadotes puede ajustarse a la siguiente ecuación:

9

En la cual la dependencia de la elipticidad intrínseca tras la concentración desnaturalizante, tanto en el estado nativo como en el estado desnaturalizado, se toma en cuenta en términos de a (GdnHCl) y b (GdnHCl), respectivamente (aproximación lineal Santero & Bolen, 1988).

Espectroscopia NMR. Las muestras NMR de IL-4 y las proteínas mutantes se prepararon disolviendo la proteína liofilizada en 45 mM acetato sódico desnaturalizado (NaOAcd_{4}), pH 5.3 10% D_{2}O, 0.1 M TSP, 0.2% NaN_{3} para dar una concentración proteica de 500 \muM. Los espectros se grabaron a 303 K empleando secuencias de pulso estándar y ciclos de fase.

Ensayo de enlace de receptor. Las afinidades de enlace se midieron mediante resonancia de plasman superficial usando un BiAcore 2000 (Pharmacia Biosensor). Se inmovilizó un dominio extracelular recombinante del receptor cadena \alpha ([CI82A, Q206C] IL4-BP) en un biosensor CM5 a una densidad de 1500 a 2000 pg/mm^{2}, tal y como lo describe Shen et al. (1996). El enlace se analizó a 25°C mediante prefusión con búfer HBS (10 mM Hepes, psH 7.4/ 150 Mm NaCl/ 3.4 M EDTA/ 0.005% surfactante P20) más 0.5 NaCl a una velocidad de flujo de 50 \mul/min.

3.2. Resultados

El producto presente en la fracción celular soluble se purificó mediante cromatografía de intercambio de acción, tomando ventaja del elevado PI de IL-4 (9.2), y le siguió el paso de filtración con gel. Se obtuvo alrededor de 1 mg de IL-4L23S, IL-4W91S y el doble mutante, IL-4L23SW91S a partir de 1 ml de cultivo celular.

La producción fue ligeramente superior para el mutante hélice C, IL-4BChélice, con 1.6 mg purificado por litro de cultivo. IL-4L23S, y en menor extensión, IL-4L23SW91S, se degradaron extensivamente durante la purificación y se precipitaron cuando se concentraron a 1 mg/ml. Sin embargo, IL-4W91S e IL-4BChélice se comportaron mejor y no se precipitaron cuando se concentraron en 1 mg/ml.

Con el fin de investigar si estas dos proteínas se plegaron, los espectros lejanos UV CD se grabaron en muestras purificadas y se compararon con los espectros de la proteína de tipo salvaje (datos no mostrados). Los espectros CD de ambos IL-4W91S e IL-4BChélice mostraron la forma esperada para una proteína con elevado contenido de hélice \alpha, pero deferente del espectro de IL-4WT, en particular en el alcance de la longitud de onda entre 210 y 225 nm. Ambos mutantes mostraron un mínimo bien definido en 208 nm como la proteína de tipo salvaje, pero en el caso de - 4BChélice la señal en 222 nm fue menos negativa de lo que se esperaba. Este efecto no es muy probable que surja de una contribución más fuerte de la señal de giro arbitrario porque esta proteína muestra una temperatura cooperativa de transición de replegamiento con un T_{m} de 54°C. El descenso observado en elipticidad a 222 nm probablemente refleja la contribución de algunas partes de la proteína que pueden estar menos estructuradas.

Una transición inducida por temperatura cooperativa se observó para IL-4W91S (datos no mostrados), sugiriendo la presencia de interacciones terciarias en ambos mutantes. En este caso, los valores de elipticidad entre 208-220 nm son más negativos que en la proteína de tipo salvaje, y el mínimo 222 nm se cambia a 218 nm. Estas diferencias son difíciles de interpretar debido a la retirada del residuo triptófano. Los residuos aromáticos contribuyen a la señal lejana UV CD pero esta contribución depende del medio ambiente en el que el residuo esté localizado y es difícil de predecir.

En cambio, la transición indicada por temperatura no fue completamente reversible para ambos mutantes, con sólo el 50% de la señal recuperada tras el enfriamiento de muestras de vuelta desde 90 a 5°C, y parte de las muestras se precipitaron en la cubeta durante el experimento. Además, las muestras fueron inestables y se precipitaron tras la descongelación. La Espectrometría de Masa y el análisis SDS-PAGE identificaron varias especies de bajo peso molecular, indicativo de degradación en ambas muestras. Ni IL-4W91S ni IL-4BChélice fueron capaces de enlazarse con IL-4R\alpha, tal y como se determinó en un experimento de resonancia de plasmón.

3.2.1. Caracterización in vitro de IL-4W91S e IL-4BChélice

El hecho que los mutantes solubles IL-4 que se producen en E. coli no eran capaces de enlazarse con el receptor IL-4 sugiere que estas proteínas no están propiamente plegadas. Sin embargo, nosotros pensamos que sería interesante observar el comportamiento de replegamiento in vitro de estos mutantes. Nuestra idea fue que a pesar de que la proteína presente en el sobrenadante no estaba activa, la fracción en los cuerpos de inclusión podía aún replegarse in vitro más eficientemente que la proteína de tipo salvaje.

IL-4WT y los dos mutantes IL-4W91S e IL-4BChélice, fueron sobreexpresados en AD494. En esta ocasión, las condiciones de expresión se optimizaron para una maximización de la producción proteica en lugar de la solubilidad. Se obtuvieron elevados niveles de expresión cuando las células se indujeron en una densidad óptica de 0.4-0.5 con 0.16 mM IPTG. La purificación proteica de los cuerpos de inclusión y el replegamiento in vitro se llevó a cabo de acuerdo con los procedimientos anteriormente descritos (Kato et al., 1985; Weigel et al., 1989).

3.2.2 Producción de replegamiento y ensayos de actividad

Hemos medido las constantes de enlace de IL-4W91S e IL-4BChélice renaturalizados desde la fracción celular insoluble con rel receptor IL-4R\alpha (ver Tabla 3).

TABLA 3 Producción de replegamiento in vitro y k_{d} de tipo salvaje IL-4 y los Mutantes designados

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Las producciones de replegamiento de IL-4WT y las proteínas mutantes se muestran en la Tabla 4. Estos valores representan la cantidad de proteína correctamente plegada y son una media sobre los datos obtenidos en cuatro experimentos independientes. En dos de estos experimentos, las proteínas se sobreexpresaron en frascos agitadores de 1 L, tal y como se describen en los métodos. En otros dos experimentos, IL-4WT y las dos proteínas mutantes se aislaron de las células obtenidas tras la fermentación de baja densidad celular en la escala de 10 L y 100 L (ver métodos). En los cuatro experimentos IL-4BChélice ser repliega con una producción aproximadamente del doble con respecto a IL-4WT, mientras que K_{d} para IL-4R\alpha permanece idéntica a la de la proteína de tipo salvaje. Los datos preliminares del replegamiento por oxidación de IL-4 sugieren que el aumento observado en la producción de replegamiento de IL-4BChélice resulta de la desestabilización de una isoforma no nativa que se acumular durante el replegamiento de la proteína de tipo salvaje (ver Figura 9). Por otro lado, la sustitución de W91 por serina no mejora el replegamiento de la proteína. Además, esta mutación da lugar a un descenso de la mitad en afinidad de enlace con IL-4R\alpha, que está en perfecto acuerdo con los estudios previos, sugiriendo que W91 tiene un pequeño papel en el enlace con el receptor (Wang et al., 1997).

3.2.3. Caracterización termodinámica y estructural de las proteínas

Las muestras purificadas de IL-4W91S e IL-4BChélice muestran unos espectros NMR que son similares a los de tipo salvaje (Figura 10).

Con el fin de investigar el efecto de las mutaciones designadas sobre la estabilidad de la proteína, hemos llevado a cabo estudios de desnaturalización térmica por equilibrio (Figura 11a) y desnaturalización química (Figura 11 b). IL-4 es una proteína demasiado estable para ser desnaturalizada mediante temperatura en el rango 0° a 100°C. Por lo tanto, para observar una completa transición de desplegamiento, los experimentos de desnaturalización térmica se llevaron a cabo en la presencia de 2 M GdmHCl. Bajo estas condiciones, se puede observar toda la transición. De modo interesante, la desnaturalización fría puede observarse para la proteína WT por debajo de 20°C. En concentraciones más altas de GdmHCl, las proteínas se desnaturalizan completamente a elevada temperatura, pero no se pliegan completamente a bajas temperaturas. Como resultado, no es posible obtener datos termodinámicos precisos a partir de curvas generadas, a pesar de que la temperatura a al cual la mitad de la proteína se desnaturaliza. Tm, puede determinarse con razonable precisión (Tabla 4).

TABLA 4 Cambios de Energía Libre para Desplegamiento mediante GdmHCL y Temperatura de Transición a medio punto, Tm, de tipo salvaje IL-4 y mutantes estabilizados

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La estabilidad de los dos mutantes en su forma oxidada se determinó y comparó con la proteína de tipo salvaje. Se obtuvo una energía libre para desplegamiento de 4.3 kcal/mol para IL-4WT. Este valor es 1.6 kcal/mol más inferior que la encontrada en el estudio previamente publicado (Windsor et al, 1991). Sin embargo, el ajuste de los datos en éste trabajo no es preciso y no se proporcionan errores. Una inspección más cercana de los datos aquí presentes sugiere una energía libre para desplegamiento para IL-4WT de aproximadamente 4.5 kcal/mol, de acuerdo con nuestros resultados.

La retirada de residuos hidrofóbicos expuestos a disolvente debería estabilizar la proteína objetivo a través del "efecto hidrofóbico inverso" (Pakula & Saber, 1990). En nuestro caso, la sustitución de W91 por serina estabiliza la proteína de tipo salvaje en 1.4 kcal/mol y provoca un cambio de 8°C en el valor Tm. La estabilización observada aumenta a partir de un aumento en los pasos del proceso de desplegamiento, que se refleja en un aumento del valor m. Este aumento en los pasos puede estar debida a la desestabilización de un intermediario de pliegue, al estado desnaturalizado o a ambos (para más información consultar Shortle D. 1996). Un efecto similar (aumento en \DeltaG de 1.4 kcal/mol y aumento en el valor m de 1.6 a 1.9) se descubrió en la proteína quimiotáctica, CheY, cuando un residuo Phe expuesto a disolvente (F14) fue sustituido por Asn (Muñoz et al, 1994a; Lopez-Hernandez et al., 1997). En este caso, el cambio en la pendiente se debió a la relativa desestabilización de un intermediario de pliegue, que tan sólo se podía detectar cinéticamente. Hemos intentado ajustar las curvas de desnaturalización y renaturalización de equilibrio de IL-4 asumiendo el modelo de tres estados. Como para Che Y, no pudimos detectar ninguna mejora significativa en el ajuste de las curvas. Por lo tanto, en el presente no podemos asignar un cambio en m para una desestabilización de un intermediario de pliegue en equilibrio presente en el pliegue de la proteína oxidada.

En lo que a la estabilización de la hélice se refiere, se ha demostrado que siempre dará como resultado un aumento en la estabilidad proteica y en algunos casos podría producir proteínas termoestables (Villegas et al., 1996, ver capítulo 2), pero el aumento en la estabilidad es siempre inferior que el esperado de la predicción teorética. Esto se debe a la estabilización simultánea del estado desnaturalizado bajo condiciones nativas. Las mutaciones introducidas en la hélice C estabilizan la proteína hasta cierto punto (0.5 kcal/mol) e provocan un pequeño cambio (6°C) en la Tm de IL-4WT. En este caso, el efecto estabilización surge por una combinación de un aumento en los pasos de la transición (valor m) y un ligero aumento en la concentración GdnHCl necesario para desnaturalizar la mitad de la proteína, [GdnHCl]_{1/2}. A pesar de que el aumento en el valor m observado para este mutante no es grande, se observó de manera consistente en dos experimentos independientes de desnaturalización y renaturalización.

Es importante resaltar que los valores m obtenidos en este estudio (tabla 1) son bastante pequeños para una proteína del tamaño de IL-4 (15 kDa). Esto se puede deber al hecho de que los experimentos de desplegamiento y replegamiento se llevaron a cabo en la ausencia de agente reductores. Por lo tanto, los tres puentes disulfuro se forman en el estado desnaturalizado, que puede dar lugar a la presencia de algunas estructuras residuales.

Referencias

Alber, T (1992). Estructura del cierre de leucina. Curr. Opin. Genet. Dev. 2, 205-210.

Amrein, K. E., Takacs, B., Stieger, M., Molnos, J., Flint, N. A. & Burn, P. (1995). Purificación y caracterización de proteína tirosina quinasa humana p50csk de un sistema expresivo Escherichia coli que sobreproduce los chaperones bacterianos GroES y GroEL. Proc Natl Acad Sci USA 92. 1048-52.

Baker, D., Silen, J. L. & Agard, D. A. (1992). La proteasa pro región requerida es un potente inhibidor de la enzima madura. Proteins 12, 339-44.

Baldwin, R. L. (1996). Intermediarios en ruta contra los de fuera de ruta. Folding & Design 1 R1-R8.

Bazan, J. F. (1990). Diseño estructural y evolución molecular de una superfamilia de receptores de citoquina. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87. 6934-6938.

Blum, P., Velligan, M., Lin, N., Martin, A. (1992). Alteraciones mediadas por DnaK en cuerpos de inclusión de proteínas en hormonas de crecimiento humano. Bio/technol. 10, 301-304.

Booth, D. R., Sunde, M., Belloti, V., Robinson, C. V., Hutchinson, W. L., Fraser, P. E., Hawkins, P. N., Dobson, C. M., Radford, S., Blake, C. C. F., Pepys, M. B. (1997). Inestabilidad, desplegamiento y agregación de variantes de linsozima humanos que se encuentran por debajo de fibrilogénesis amiloide. Nature 385(27), 787-793.

Bowden, G., Georgiou, G. (1990). En Recombinant DNA technology and applications Prokop, A., Bajapi. K. R., Ho,C. (eds.), McGraw-Hill.

Braig, K., Otwinowski, Z., Hegde, R., Boisvert, D. C., Joachimiak, A., Horwich, A. L. & Sigler, P. B. (1994). La estructura cristalina de los chaperoninos bacterianos GroEL at 2.8 A [ver comentarios]. Nature 371, 578-86.

Braisted, A. C., Wells, J. (1996). Minimizar un dominio de enlace a partir de una proteína A. Proc. Natl. Acad Sci. USA 93,5688-5692.

Buckel, P. (1996). Proteínas recombinants para terapia. Trends in Protein Science, 17, 450-456.

Carpino, L. A., Han, G. Y. (1972). El grupo 9-Fluorenilmetoxicarbonil amino-protector. Journal of Organ, Chem, 37. 3404-3409.

Chakrabartty, B. A., Baldwin, R. L. (1995). Estabilidad de helices-a. Adv. in Protein Chemistry 46, 141-176.

Clackson, T., Wells, J. (1995). Un enfoque de energía de enlace en un a interfaz receptora de hormona. Science 267, 383-386.

Cole, P. A. (1996). Expresión proteica asistida por chaperona. Structure 4(3), 239-42.

Cornell, W. D., Cieplak, P., Bayly, C. I., Gould, I. R., Merz Jr., K. M., Fergusson, D. M., Spellmeyer, D. C., Fox, T., Caldwell, J. W., y Kollman, P. A. (1995). Un campo de fuerza de segunda generación para la estimulación de proteínas y ácidos nucleicos. JACS 117, 5179-5197.

Corrales, F. J. & Fersht, A. R. (1996). Hacia un mecanismo de la actividad de chaperones GroEL/GroES: una armadura de templado y plegamiento por pulso y guiado por ATP. Proc Natl Acad Sci USA 93, 4509-12.

Coste, J., Le-Neuyen, D. y Castro, B. (1990). PyBOP: Un nuevo reagente de enlace péptido que carece de productos tóxicos. Tetrahedron Letters 31, 205-208.

Cregut, D., Serrano, L. (1999). Dinámicas moleculares como una herramienta para detector plegamiento proteico. Un mutante de dominio B I de proteína G con propensión a estructura nativa secundaria. Protein Science 8, 271-282.

Creighton, T. E. (1997). Plegamiento proteico enlazado con la formación de enlace disulfuro. Biol Chem 378, 731-44.

Cwirla, S. E., Balasubramanian, P., Duffin, D. J., Wagstrom, C. R., Gates, C. M., Singer, S. C., Davis, A. M., Tansik, R. L., Mattheakis, L. C., Boytos, C. M., Schatz, P. J., Baccanari, D. P., Wrighton, N. C., Barrett, R. W. & Dower, W. J. (1997). Agonista péptido del receptor trombopoyetina tan potente como la citoquina natural. Science 276(5319), 1696-9.

Dale, G. E., Broger, C., Langen, H., D'Arcy, A., Stüber, D. (1994). Mejorar la solubilidad proteica a través de sustituciones de aminoácido racionalmente diseñados: solubilización de dihidrofolato reductasa tipo S1 resistente a trimetoprim. Protein Engineering 7, 933-939.

Dale, G. E., Schönfeld, H.-J., Langen, H., Stieger, M. (1994). Aumentar la solubilidad e DHFR tipo S1 resistente a trimetoprim a partir de Staphylococcus aureus en células de Escherichia coli que sobreproducen las chaperoninas GroEL y GroES. Protein Engineering 7, 925-931.

De Felippis, M. R., Alter, L. A. Pekar, A. H., Havel, H. A., Brems, D. N. (1993). Evidencia para un intermediario que se autoasocia durante el pliegue de hormona humana de crecimiento. Biochemistry 32, 1555-62.

de Vos, A. M., Ultsch, M., Kossiakoff, A. A. (1992). Hormona de Crecimiento Humano y Dominio Extracelular de su Receptor. Estructura Cristalina del Complejo. Science 255, 306-312.

Derman, A. I., Prinz, W. A., Belin, D., Beckwith, J. (1993). Mutaciones que permiten la formación de enlace disulfuro en el citoplasma de Escherichia coll. Science 262. 1744-1747.

Doig, A. J., Williams, D. H. (1991). Es el efecto hidrofóbico estabilizador y desestabilizador? La contribución de enlaces disulfuro a la estabilidad proteica. J. Mol. Biol. 217, 389-398.

Duschl, A. (1995). Un mutante antagonista de interleuquina-4 falla al recolectar yc en el complejo receptor. Eur. J. Biochm. 228, 305.

Eder, J. & Fersht, A. R. (1995). Plegamiento de proteína asistido por pro-secuencia. Mol Microbiol 16, 609-14.

Eder, J., Rheinnecker, M. & Fersht, A. R. (1993). Plegamiento de subtilisina BPN': papel de la pro-secuencia. J Mol Biol 233, 293-304.

Emmos, T.-K., Murali, R., Greene, M. (1997). Péptidos terapéuticos y peptidomiméticos. Current Opinion in Bio-technology 8, 435-441.

Filimonov, V. V., Prieto, J., Mateo, P.L. & Serrano, L. (1993). Análisis termodinámico de la proteína quimiotáctica a partir de E. coli, CheY. Biochemistry 32, 12906-12921.

Fink, A. L. (1998). Agregación proteica: Agregados de plegamiento, cuerpos de indusión y Plegamiento y Diseño de amiloide 3, R9-23.

Finkelman, F. D., Madden, K. B., Morris, S. C., Holmes, J. M., Boiani, N., Katona, I. M., Maliszewski, C. R. (1993). Cuerpos anti-citoquina como proteínas portadoras: prolongación de efectos in vivo de citoquinas exógenas mediante la inyección de complejos de anticuerpos anti-citoquina. J. Immunol. 151, 1235.

Furlong, J., Meighan, M., Conner, J., Murray, J. & Clements, J. B. (1992). Métodos para expresión proteica mejorada usando vectores pET. Nucleic Acids Res 20, 4668.

Georgiou, G., Valax, P. (1996). Expresión de proteínas plegadas en Expression Escherichia coli. Curr. Opin. Biotechnol. 7, 190-197.

Grunewald, S. M., Werthmann, A., Schnarr, B., Klein, C. E., Bröcker, E. B., Mohrs, M., Brombacher, F., Sebald, W., Duschl, A. (1998). Un mutante antagonista IL-4 previene la alergia de tipo 1 en el ratón: inhibición del sistema receptor IL-4/1 L-13 deroga completamente la respuesta hormonal e inmune a los alérgenos y al desarrollo de síntomas alérgicos in vivo. J. Immunol. 160, 4004-4009.

Harbury, P. B., Zhang, T., Kim, P. S., Alber, T. (1993). Un cambio entre espirales de dos, tres y cuatro bobinas de trenzado en mutantes de leucina de cierre GCN4. Science 262, 1401-1407.

Hartl, F. U., Hlodan, R. & Langer, T. (1994). Chaperones moleculares en plegamiento de proteínas: el arte de evitar situaciones difíciles. Trends Biochem Sci 19, 20-5.

Heyrovska, N., Frydman, J., Hohfeld, J. & Hartl, F. U. (1998). Direccionalidad de transerencia polipéptida en la ruta mitocondrial de plegamiento de proteína mediado por chaperones. Biol Chem 379, 301-9.

\global\parskip0.950000\baselineskip

Ho, S. N., Hunt, H. D., Horton, R. M., Pullen, J. K., Pease, L. R. (1989). Mutagénesis dirigida mediante extensión de sobreposición usando la reacción en cadena de polimerasa. Gene 77, 51-59.

Hockney, R. C. (1994). Desarrollos recientes en producción proteica heteróloga en E. coli. Trends Biotechnol. 12, 456-463.

Jones, D. T. (1997) Progreso en la Predicción de Estructura Proteica. Curr Opin Struct Biol 7, 377-87.

Kato, K., Yamada, T., Kawahara, K., Onda, H., Asano, T., Sugino, H., Kakinuma, A. (1985). Purificación y caracterización de interleuquina-2 humana recombinante. Biochem and Biophys Res Comm 130, 692-699.

Kella, N. K. D., Kinsella, J. E. (1985). Método para la división controlada de enlaces disulfuro en proteínas ante la asuencia de desnaturalizadores. J. Biochem. Biophys. Methods 11, 152-263.

Kenar, K. T., Garcia-Moreno, B., Freire, E. (1995). Una caracterización calorimétrica de la dependencia de sal de la estabilidad del cierre de leucina GCN4. Protein Science 4, 1934-1938.

Kohn, W. D., Hodges, R., S. (1998), diseño de novo de bobinas y fajos enrollados helicoidales: modelos para el desarrollo de principios de diseño de proteínas. Trends in Biotechnol 16, 379-389.

Kouzarides, T., Ziff, E. (1989). Cierres de lucina de dimerización dictada fos, jun y GCN4 y por lo tanto enlace de control de ADN. Nature 340, 568-571.

Kruse, N., Lehrnbecher, T., Sebald, W. (1991). Mutagénesis dirigida en el sitio revela la importancia de puentes disulfuro y residuos aromáticos para la estructura y actividad proliferante de interleuquina-4 humana. FEBS 286(1,2), 58-60.

Kruse, N., Shen, B-J., Arnold, S., Tony, H-P., Muller, T., Sebaid, W. (1993). Dos puntos distintos funcionales de interleuquina-4 humana se identifican mediante variantes dañadas bien en el enlace receptor o en la activación receptora. EMBO J 21(13), 5121-5129.

Kruse, N., Tony, H-P., Sebald, W. (1992). Conversión de IL-4 humana a antagonista de elevada afinidad mediante un único reemplazo de aminoácido. EMBO Journal 11(9), 3237-3244.

Lacroix, E., Viguera, A. R., Serrano, L. (1998). Aclaración de las propiedades de pliegue de alpha-hélices: motives locales, electroestáticos longitud-rango, dependencia fónica-fuerza y predicción de parámetros NMR. J. Mol. Biol. 284, 173-191.

Langer, T., Lu, C., Echols, H., Flanagan, J., Hayer, M. K. & Hartl, F. U. (1992). Acción sucesiva de DnaK, DnaJ y GroEL a lo largo de la ruta de pliegue de proteína mediado por chaperón. Nature 356, 683-9.

Lawson, J. E., Niu, X. D., Browning, K. S., Trong, H. L., Yang, J., Reed, L. J. 1993, Clonación molecular y expresión de la subunidad catalítica de piruverato dehidrogenasas fosfatasa y similitud secuencial con proteína fosfatasa 2C. Biochemistry 32, 8987-93.

Livnah, O., Stura, E. A., Johnson, D. L., Middleton, S. A., Mulcahy, L. S., Wrighton, N. C., Dover, W. J., Jollife, L. K., Wilson, I. A. (1996). Mimetismo funcional de una hormona proteica por un agonista péptido: Complejo receptor EPO en 2.8 \ring{A}. Science 273, 464-471.

Maliszewski, C. R., Sato, T. A., Davison, B., Jacobs, C. A., Finkelman, F. D., Fanslow, W. C. (1994). Efectos biológicos in vivo de receptor solubles interlequina-4. Proc. Soc. Exp. Biol. Med 206, 233.

Mande, S. C., Mehra, V., Bloom, B. R. & Hol, W. G. (1996). Estructura de la chaperonina-10 de impacto de calor de Mycobacterium leprae [ver comentarios] [la errata publicada aparece en Science 1996 Mar 22; 271(5256):1655]. Science 271, 203-7.

Martin, J. & Hartl, F. U. (1994). Chaperones moleculares en pliegue proteico cellular. Bioessays 16, 689-92.

Matthews, D. J., Clark, P. A., Herbert, J., Morgan, G., Armitage, R. J., Kinnon, C., Minty A., Grabstein, K. H., Caput, D., Ferrara, P., Callard, R. (1995). Función de la cadena gamma receptora interlequina-2(IL-2) en respuestas biológicas de células B inmunodeficientes combinadas y se severo cruce X a IL-2, IL-4, IL-13 y IL-15. Blood 85, 38.

Mott, H. R., Campbell, I. D. (1995). Factores decrecimiento de conjuntos de cuatro hélices y sus receptoers: interacciones proteína-proteína. Current Opinion in Structural Biology 5, 114-121.

Müller, T., Dieckmann, T., Sebald, W., Oschkinat, H. (1994). Aspectos de enlace receptor y señalización de interleuquina-4 investigados mediante mutagénesis dirigida en el sitio y espectroscopia NMR. J. Mol. Biol. 237, 423-436.

\global\parskip1.000000\baselineskip

Muñoz, V., Lopez, E. & Serrano, L. (1994a). Caracterización cinética de la protéina quimiotáctica de E. coli CheY. Análisis cinético del efecto hidrofóbico inverso. Biochemistry 33, 5858-5866.

Muñoz, V., Serrano, L. (1994b). Aclaración del problema de pliegue de péptidos helicoidales-a empleando parámetros empíricos. Nat. Struc. Biol. 1, 399-409.

Muñoz, V., Serrano, L. (1994c). Aclaración del problema de pliegue de péptidos helicoidales-a empleando parámetros empíricos II. Efectos macrodipolares y modificación racional del contenido helicoidal de péptidos naturales. J. Mol. Biol. 245, 275-296.

Muñoz, V., Serrano, L. (1994d). Aclaración del problema de pliegue de péptidos helicoidales-a empleando parámetros empíricos III: Temperatura y dependencia pH. J. Mol. Biol. 245, 297-308.

Muñoz, V., Serrano, L. (1994e). Propensión a estructura secundaria intrínseca de los aminoácidos, utilizando matrices estadísticas phi-psi. Comparación con escalas experimentales. Protein Struct. Funct and Genetics 20, 4.

Muñoz, V., Serrano, L. (1997). Desarrollo de aproximación de secuencia múltiple en el modelo AGADIR de formación a-hélice: comparación con Formalismos Zimm-Bragg y Lifson-Roig. Biolpoly. 41, 495-509.

O'Shea, E. K., Klemm, J. D., Kim, P. S., Alber, T. (1991). Estructrura de rayos x del cierre de leucina GCN4, una bobina enrollada de doble trenzado en paralelo. Science 25, 539-544.

Ohgushi, M. & Wada, A. (1983). "Estado glóbulo-fundido": una forma compacta de proteínas globulares con cadenas secundarias móviles. FEBS Lett 164(1), 21-4.

O'Shea, E., K., Rutkowski, R., Stafford III, W. F., Kim, P. S. (1989). Formación de heterodímero preferencial mediante cierres de leucina aislados a partir de Fos y Jun. Science 245, 646-648.

Pace, C. N. (1986). Methods Enzymol. 131, 236.

Pace, C. N., Bret, A., Thomson, S., Thomson, J. A. (1990). Medida de la estabilidad conformacional de una proteína. En Protein Structure - A Practical Approach. Creighton, T. (ed.), 311-321. Oxford University Press, New York.

Pace, C., N., Vajdos, F., Fee, L., Grimsley, G., Gray, T. (1995). Cómo medir y predecir el coeficiente de absorción molar de una proteína. Protein Science 4, 2411-2423.

Pakula, A., Sauer, R. (1990). Efectos hidrofóbicos inversos liberados por las sustituciones de aminoácido en una superficie proteica. Nature 344, 363-364.

Pearlman, D. A., Case, D. A., Caldwell, J. C., Ross, W. S., Cheatham, T. E., Fereusson, D. M., Seibel, G. L., Chancra Singh. U., Weiner, P., Koliman, P. A. (1995). AMBER 4.1. UCSF, University of California. San Francisco. USA Peranen, J., Rikkonen, M., Hyvönen, M., Kääriä inen. L. (1996). Vectores T7 Vectors con un impulsor modificado T71ac para su expresión en proteínas en Escherichia coli. Analytical Biochemistry 236. 371-373.

Pérez-Pérez, J., Martinez-Caja, C., Barbero, J. L., Gutiérrez, J. (1995). La complementación de DNAKIDNAJ mejora la producción periplástica de factor estimulador de colonia humana de granulocitos en E. coli. Biochem. and Biophys. Res. Comm. 210, 524-529.

Ramanathan, L., Ingram, R., Sullivan, L., Greenberg, R., Reim, R., Trotta, P. P., Le, H. V. (1993). Mapeo inmunoquímico de dominios en interlequina 4 reconocida por los anticuerpos monoclonales neutralizadores. Biochemistry 32, 3549-3556.

Redfield, C., Boyd, J., Smith, L. J., Smith, R. A. G., Dobson, C. M. (1992) Movilidad de giro en una proteína con un conjunto de cuatro hélices: Medidas de relajación 15N NMR en interleuquina-4 humana. Biochemistry 31(43), 10431-10437.

Redfield, C., Smith, L. J., Boyd, J., Lawrence, G. M. P., Edwards, R. G., Gershater, C. J., Smith, R. A. G., Dobson, C. M. (1994a). Análisis de la estructura de la solución de interleuquina-4 humana determinado por técnicas de resonancia magnética nuclear tridimensionales heteronucleares. J. Mol. Biol. 238, 23-41.

Redfield, C., Smith, R. A. G., Dobson, C. M. (1994b). Caracterización de un "glóbulo fundido" con pH bajo. Structural biology 1 (1), 23-29.

Reusch, P., Arnold, S., Heusser, C., Wagner, K., Weston, B., Sebald, W. (1994). Anticuerpos monodonales neutralizadores definenen dos puntos diferentes funcionales en interleuquina-4 humana. Eur. J. Biochem. 222, 491-499.

Rose-John, S., Heinrich, P. C. (1994). Receptores solubles para citoquinas y factores del crecimiento: generación y función biológica. Biochem. J. 300, 281-290.

Santoro, M. M., Bolen, D. W. (1988). Cambios de energía libre de despliegue determinados por el método de explotación lineal. 1. Desplegamiento de fenilmetanesulfonil \alpha-quimotripsina usando diferentes desnaturalizantes. Biochemistry 27, 8063-8068.

Schellman, C. (1980). En Protein Folding. Jaenicke. R. (ed.), 53-61. Etsevier/North Holland, New York.

Scholtz J. M., York, E. J., Stewart, J. M., Baldwin, R. L. (1991). Un péptido soluble en agua alpha-helicoidal: el efecto de fuerza fónica en el equilibrio hélice-bobina. J. Am. Chem. Soc. 113, 5102-5104.

Shen, B.-J., Hage, T., Sebald, W. (1996). Determinantes globales y locales para la cinética de interacción receptor interleuquina-4/interleuquina-4. Un estudio biosensor que emplea proteína de enlace interleuquina-4 recombinante. Eur. J. Biochem. 240, 252-261.

Shinde, U., Li, Y., Chatterjee, S. & Inouye, M. (1993). Ruta de pliegue mediada por un chaperón intramolecular. Proc Natl Acad Sci U S A 90, 6924-8.

Shortie D. (1996). El estado desnaturalizado (la otra mitad de la ecuación y su papel en la estabilidad proteica). FABES J 10, 27-34.

Smerz-Bertling, C., Duschl, A. (1995). Tanto la interleuquina 4 como la interleuquina 13 provocan fosforilación de tirosina de la subunidad 140-kDa del receptor interleuquina 4. J. Biol. Chem. 270, 966.

Smith, G. (1985). Fago de fusión filamentosa: vectores de nueva expresión que expresan antígenos clonados en la superficie del virión. Science 228, 1315-1317.

Steven, G., Williams, D. E. (1998). Terapia con citoquina: lecciones aprendidas y futuros retos. Curr. Opini. in Immunol. 10, 501-503.

Thompson, K. S., Vinson, C. R., Freire, E. (1993). Caracterización termodinámica de la estabilidad estructura de la región enrollada del factor de trascripción GCN4 bZIP. Biochemistry 32(21), 5491-5496.

Tony, H.-P., Shen, B.-J., Reusch, P., Sebald, W. (1994). Diseño de antagonistas humanos de interleuquina 4 inhibidores de respuestas dependientes de interleuquina-4 e interleuquina-13 en células T con elevada eficiencia. Eur. J. Biochem. 225, 659-665.

Tuffery, P., Etchebest, C., Hazout, S., Lavery, R. (1991). Una nueva visión a la rápida determinación de conformación de cadena secundaria proteica. Journal of Biomolecular structure and dynamics 8(6), 1267-1289.

Turner, R., Tjan, R. (1989). La leucina se repite y el enlace adyacente AND media la formación de heterodímeros funcionales c-Fos-c- Jun. Science 1989(243), 1689-1694.

van Gunsteren, W. F., Berendsen, H. J. C. (1977). Algoritmos para dinámica macromolecular y dinámica de repesión. Mol. Phys. 34, 1311-1327.

Viguera, A. R., Serrano, L. (1995). Análisis experimental del motivo Schellman. J. Mol. Biol. 251, 150-160.

Wang, Y., Shen, B-J., Sebaid, W. (1997). Un par de carga mezclada en interleuquina-4 domina interacción de elevada afinidad con la cadena del receptor. Proc. Natl. Acad Sci. USA 94, 1657-1662.

Weigel, U., Meyer, M., Sebald, W. (1989). Proteínas mutantes de interleuquina 2 humana. Eur. J. Biochem. 180, 295-300.

Wrighton, N. C., Farrell, F. X., Chang, R., Kashyap, A. K., Barbone, F. P., Mulcahy, L. S., Johnson, D. L., Barrett, R. W., Jolliffe, L. K., Dower, W. J. (1996). Péptidos pequeños como elementos miméticos potentes de la Hormona Proteica Eritropoyetina. Science 273, 458-463.

Wütrich, K. (1996). NMR de Proteínas y Ácidos nucleicos. Wiley New York.

Youngman, K. M., Spencer, D. B., Brems, D. N., De Felippis, M. R. (1995). Análisis cinético del pliegue de la hormona humana del crecimiento. Influencia de puentes disulfuro. J. Biol Chem 270, 19816-22).

Zhou, N. E., Kay, C. M., Hodges, R. S. (1993). Contribución del enlace disulfuro a la estabilidad proteica: efectos posicionales de la sustitución en el núcleo de la bobina enrollada alpha de doble trenzado. Biochemistry 32, 3178-3187.

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<110> Laboratorio de Biología Molecular Europeo

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<110> Bayer AG

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<120> Citoquina modificada

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<130> P021802WO

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<140> PCT/IB00/00764

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<141> 23-05-2000

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<150> GB9912350.7

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<151> 26-05-1999

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<160> 12

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<170> SeqWin99

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<210> 1

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Secuencia mutada IL-4 en posiciones 69-74

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Secuencia de tipo salvaje IL-4 en posiciones 69-74

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Secuencia de hélice IL-4 de tipo salvaje

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<400> 3

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<211> 28

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Secuencia de hélice IL-4 mutada

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<400> 4

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\hskip1cm15

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<210> 5

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<211> 30

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> oligonucleótido para introducir NcoI

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<400> 5

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\hskip-.1em\dddseqskip

ctggagactg ccatggatca caagtgcga

\hfill

30

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<210> 6

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<211> 25

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> oligonucleótido para introducir BamHI

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

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\hskip-.1em\dddseqskip

acgcggatcc ttatcagctc gaaca

\hfill

25

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

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<211> 33

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> imprimador mutagénico (IL-4W91Sa)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

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\hskip-.1em\dddseqskip

cagagcagaa gactagttgc accgagttga ccg

\hfill

33

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

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<211> 33

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Imprimador mutagénico (IL-4L23Sb)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cggtcaactc ggtgcaacta gtcttctgct ctg

\hfill

33

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

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<211> 27

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> imprimador mutagénico (IL-4W91Sa)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

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\hskip-.1em\dddseqskip

aggaacctca gtggcctggc gggcttg

\hfill

27

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

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<211> 27

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> imprimador mutagénico (IL-4W91Sb)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caagcccgcc aggccactga ggttcct

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Imprimador mutagénico (IL4BChélicea)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

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\hskip-.1em\dddseqskip

ctgggtgcga gtgcagcaga agcaaacagg cacaagc

\hfill

37

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

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<211> 37

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Imprimador mutagénico (IL4BChéliceb)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcttgtgcct gtttgcttct gctgcactcg cacccag

\hfill

37

Claims (28)

1. Un método de estabilización de citoquina que comprende los siguientes pasos:

a)

mutar la secuencia de aminoácido de la citoquina de tal modo que se eliminen los residuos hidrofóbicos expuestos al disolvente mediante sustitución de aminoácido; y

b)

mutar la secuencia de aminoácido de la citoquina para que se introduzcan residuos estabilizadores de hélice;

de tal modo que durante el pliegue de la citoquina, un intermediario formado durante el pliegue de la citoquina se desestabilice con relación a la citoquina en sus estado plegado.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde dichos pasos de mutación se aplican a la hélice C de la citoquina.

3. Un método de acuerdo con las reivindicaciones precedentes, donde dicha citoquina es IL-4.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 3, donde dicha IL-4 es humana.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 4 donde el paso a) comprende la introducción de un residuo de serina en la posición 23 y/o 91 en la secuencia de aminoácido IL-4 de completa longitud.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 4 que comprende la introducción de un residuo de serina en la posición 69, y la secuencia Ala-Glu-Ala-Asn en la posición 71-74 en la secuencia de aminoácido IL-4 de completa longitud.

7. Un método de acuerdo con la reivindicación 4 que comprende la introducción de una o más de las siguientes mutaciones: treorina 69 a serina; glutamina 71 a alanina; glutamina 72 a glutamato, fenilalanina 73 a alanina; histidina 74 a asparagina.

8. Un método de acuerdo con la reivindicación 4 que comprende codificar la secuencia ASAAEANRHKQLIR
FLKRLDRNLWGLAG en posiciones 68-95 en la secuencia de aminoácido de longitud completa.

9. Un método de acuerdo con las reivindicaciones precedentes que comprende el paso de:

c) incluir la pro-secuencia de citoquina en su terminal N.

10. Un método de acuerdo con las reivindicaciones precedentes donde la citoquina además se muta para permitir el enlace de la citoquina con IL-4R\alpha para evitar el enlace de la citoquina con IL-13R\alpha y/o la cadena \gamma_{c}.

11. Un método de acuerdo con la reivindicación 10, que comprende la sustitución de un residuo de aspartato en la posición 121 y/o 124 en la secuencia de aminoácido IL-4 de completa longitud.

12. IL-4 humano mutado en residuos hidrofóbicos expuestos a disolvente en posición 23, en posición 91 o en ambas posiciones 23 y 91 en la secuencia de completa longitud por la sustitución de aminoácido y mutado por haber introducido residuos estabilizadores de hélice, de tal modo que durante el pliegue de la citoquina, un intermediario formado durante el pliegue de la citoquina se desestabilice en relación con la citoquina en su estado plegado.

13. IL-4 humano de acuerdo con la reivindicación 12, donde dicha mutación en posición 223, en posición 91 o en ambas posiciones 23 y 91 en la secuencia de completa longitud es a un residuo de serina.

14. IL-4 humano de acuerdo con la reivindicación 12 o 13 que contiene una o más de las siguientes mutaciones estabilizadoras de hélice: treorina 69 a serina; glutamina 71 a alanina; glutamina 72 a glutamato, fenilalanina 73 a alanina; histidina 74 a asparagina.

15. IL-4 humano de acuerdo con la reivindicación 12 o reivindicación 13 que codifica la secuencia ASAAEANRHK
QLIRFLKRLDRNLWGLAG y fragmentos funcionalmente equivalentes de la misma en posiciones 68-95 en la secuencia de aminoácido de longitud completa.

16. Un péptido que comprende el fragmento funcionalmente equivalente de una citoquina mutante de acuerdo con la reivindicación 15.

17. Un método para la producción de citoquina de acuerdo con las reivindicaciones 12-15 o un péptido de acuerdo con la reivindicación 16, que comprende la introducción de ácido nucleico que codifica la citoquina o péptido en una célula huésped.

18. El método de la reivindicación 17 donde dicha células huésped es una bacteria E. coli.

19. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17 o 18, que de manera adicional comprende la pro-secuencia de la citoquina en la terminal N de dicha citoquina.

20. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17-19 que de manera adicional comprende el paso de expresar la citoquina en la célula huésped junto con una proteína chaperona.

21. Un método de acuerdo con la reivindicación 20, donde dicha chaperonina es el sistema GroEL/ES o tioredoxina.

22. Una citoquina de acuerdo con las reivindicaciones 12-15 o un péptido de acuerdo con la reivindicación 16, para uso como un fármaco.

23. Uso de una citoquina de acuerdo con las reivindicaciones 12-15 o un péptido de acuerdo con las reivindicación 16 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de alergias en un mamífero, preferentemente un humano.

24. Una composición farmacéutica que comprende una citoquina de acuerdo con las reivindicaciones 12-15 o un péptido de acuerdo con la reivindicación 16, opcionalmente como una sal farmacéuticamente aceptable, en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable.

25. Un proceso para la preparación de una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 24 en la cual una citoquina de acuerdo con las reivindicaciones 12-15 o un péptido de acuerdo con la reivindicación 16 entra en asociación con un portador farmacéuticamente aceptable.

26. Un kit de diagnóstico que comprende una citoquina de acuerdo con las reivindicaciones 12-15 o un péptido de acuerdo con la reivindicación 16.

27. Un mamífero transgénico no humano, que porta un transgen codificador de una citoquina de acuerdo con las reivindicaciones 12-15 o un péptido de acuerdo con la reivindicación 16.

28. Un proceso para producir un animal transgénico no humano que comprende el paso de introducir un ADN que codifica una citoquina de acuerdo con las reivindicaciones 12-15 o un péptido de acuerdo con la reivindicación 16 en un embrión de un mamífero no humano, preferiblemente un ratón.