BRPI0413728B1 - muteína da lipocalina da lágrima humana, métodos para geração e para produção de muteína, composição farmacêutica e uso de muteína - Google Patents

Abstract

"muteínas de lipocalina da lágrima". a presente invenção refere-se às novas muteínas derivadas de lipocalina da lágrima ou um homólogo da mesma. especificamente, a invenção refere-se a uma muteína da lágrima humana. a invenção também se refere a uma molécula de ácido nucléico correspondente codificando tal muteína e a um processo para sua geração. a invenção se refere, adicionalmente, a um método para produzir tal muteína. finalmente, a invenção é dirigida a uma composição farmacêutica compreendendo tal muteína de lipocalina, bem como aos vários usos da muteína.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MUTEÍNA DA LIPOCALINA DA LÁGRIMA HUMANA, MÉTODOS PARA GERAÇÃO E PARA PRODUÇÃO DE MUTEÍNA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E USO DE MUTEÍNA". A presente invenção refere-se às novas muteínas derivadas de lipo-calina da lágrima ou um homólogo da mesma. Especificamente, a invenção refere-se a uma muteína da lágrima humana. A invenção também refere-se a uma molécula de ácido nucléico correspondente codificando tal muteína e a um processo para sua geração. A invenção refere-se, adicionalmente, a um método para produzir tal muteína. Finalmente, a invenção é dirigida a uma composição farmacêutica compreendendo tal muteína de lipocalina, bem como aos vários usos da muteína.

Os elementos da família da proteína de lipocalina (Pervaiz, S., e Brew, K. (1987) FASEB J. 1, 209-214) são tipicamente proteínas secretadas pequenas, que são caracterizadas por uma faixa de propriedades de reconhecimento molecular diferentes: sua capacidade de se ligar às várias moléculas, principalmente hi-drófobas (tais como, retinóides, ácidos graxos, colesteróis, prostaglandinas, biliver-dinas, feromonas, aromatizantes e odorizantes), sua ligação aos receptores de superfície de célula específicos e sua formação de complexos macromoleculares. Embora elas tenham sido, no passado, classificadas primariamente como proteínas de transporte, fica claro agora que as lipocalinas preenchem uma variedade de funções fisiológicas. Essas incluem papéis no transporte de retinol, olfativo, sinalização de feromônio, e a síntese das prostaglandinas. As lipocalinas também estiveram implicadas na regulação da resposta imune e na mediação de homeos-tase da célula (revisto, por exemplo, em Flower, D.R. (1996) Biochem. J. 318,1-14 e Flower, D.R. e outros, (2000) Biochim. Biophys. Acta 1482,9-24).

As lipocalinas compartilham de forma não usual, baixos níveis de conservação de seqüência total, freqüentemente com identidades de seqüência inferiores a 20%. Em contraste forte, seu padrão de dobra total é altamente conservado. A parte central da estrutura da lipocalina consiste em uma folha β antiparalela de oito filamentos simples fechada sobre si mesma para formar um corpo β ligado continuamente ao hidrogênio. Uma extremidade do corpo é bloqueada estericamente pelo segmento de peptídeo de término N que corre atra- vés de sua parte inferior, bem como três alças de peptídeo conectando os filamentos β. A outra extremidade do corpo β é aberta para o solvente e engloba um sítio de ligação alvo, que é formado por quatro alças de peptídeo. É essa diversidade das alças na armação de lipocalina de outra forma rígida que deriva uma variedade de modos de ligação diferentes, cada um capaz de acomodar alvos de tamanho, forma e caráter químico diferentes (revisto, por exemplo, em Flower, D.R. (1996), supra\ Flower, D.R. e outros, (2000), supra, ou Skerra, A. (2000) Biochim. Biophys. Acta 1482, 337-350). A pré-albumina da lágrima humana, agora denominada lipocalina da lágrima (TLPC), foi originalmente descrita como uma proteína principal do fluido da lágrima humana (aproximadamente um terço do teor de proteína total), porém recentemente também foi identificada em vários outros tecidos secretores, incluindo próstata, mucosa nasal e mucosatraqueana. As proteínas homólogas foram encontradas em ratos, porcos, cachorros e cavalos. A lipocalina da lágrima é um elemento de lipocalina incomum, em razão de sua alta promiscuidade para lipídeos relativamente insolúveis e características de ligação que diferem de outros elementos dessa família de proteína (revisto em Redl, B. (2000) Biochim. Biophys. Acta 1482,241 -248). Um número notável de compostos lipófilos de diferentes classes químicas, tais como, ácidos graxos, álcoois graxos, fosfo-lipídeos, glicolipídeos e colesterol são ligantes endógenos dessa proteína. De modo interessantes, em contraste com outras lipocalinas, a resistência de ligação do ligante (alvo) correlaciona-se ao comprimento da cauda de hidrocarbo-neto, ambos para alquilamidas e ácidos graxos. Assim, a lipocalina da lágrima se liga mais fortemente aos últimos lipídeos solúveis (Glasgow, B.J. e outros, (1995) Curr. Eye Res. 14, 363-372; Gasymov, O.K. e outros, (1999) Biochim. Biophys. Acta 1433, 307-320). A função biológica precisa da lipocalina da lágrima humana não foi completamente elucidada e ainda é uma matéria de controvérsia. No fluido da lágrima, ela parece ser a mais importante para a integridade da película da lágrima por remoção dos lipídeos da superfície da mucosa dos olhos para a fase líquida (revisto em Gasymov, O.K. e outros, (1999), supra). Contudo, ela revela atividades adicionais in vitro que são muito incomuns entre as lipocalinas, a sa- ber, inibição das cisteina proteinases, bem como atividade não específica da endonuclease {van't Hof, W. e outros, (1997) J. Biol. Chem. 272, 1837-1841; Yusifov, T.N. e outros, (2000) Biochem. J. 347, 815-819). Recentemente, foi demonstrado que a lipocalina da lágrima é capaz de se ligar aos vários produtos de peroxidação de lipídeo in vitro, resultando na hipótese de que ela pode funcionar como um limpador induzido por tensão oxidativa fisiológica de moléculas lipófilas potencíalmente prejudiciais (Lechner, M. e outros, (2001) Biochem. I 356,129-135).

As proteínas, que seletivamente se ligam aos seus alvos correspondentes por meio de uma interação não covalente, desempenham um papel importante como reagentes na biotecnologia, medicina, bioanalítica, bem como na biologia e ciências da vida em geral. Anticorpos, isto é, imunoglobulinas, são um exemplo dessa classe de proteínas. A despeito das necessidades de tais proteínas em conjunto com reconhecimento, ligação e/ou separação de ligan-tes/alvos, as imunoglobulinas são usadas comumente, quase que exclusivamente. A aplicação de outras proteínas com características de ligação de ligan-te definidas, por exemplo, as lecitinas, permaneceu restrita aos casos especiais.

Recentemente, os elementos da família da lipocalina tornaram-se alvo de pesquisa relacionada às proteínas possuindo propriedades de ligação de ligante definidas. A Publicação PCT WO 99/16873 revela a classe das assim chamadas Anticalins®; isto é, polipeptídeos da família da lipocalina com posições de aminoácido mutadas na região das quatro alças de peptídeo, que são dispostas no final da estrutura de corpo β cilíndrica englobando o bolsa de ligação e que correspondem àqueles segmentos na seqüência de polipeptídeo linear compreendendo as posições de aminoácido 28 a 45, 58 a 69,86 a 99, e 114 a 129 da proteína de ligação de bilina da Pieris brassicae. A Publicação PCT WO 00/75308 revela muteínas da proteína de ligação de bilina, que especificamente se liga a digoxigenina, considerando-se que os Pedidos de Patente Internacionais WO 03/029463 e WO 03/029471 referem-se às muteínas da lipocalina associada à gelatinase de neutrófilo humano e à polipoprotéina D, respectivamente. A fim de adicionalmente aperfeiçoar e obter a afinidade de ligan- te de sintonia fina, especificidade, bem como estabilidade de dobra de uma variante da lipocalina, foram propostas várias abordagens usando elementos diferentes da família da lipocalina (Skerra, A. (2001) Rev. Mol. Bíotechnol. 74,257275; Schlehuber, S., e Skerra, A. (2002) Biophys. Chem. 96,213-228), tais como, a substituição dos resíduos de aminoácido adicionais, Contudo, para várias aplicações, pode também ser vantajoso ter-se mais de um sítio de ligação por molécula disponível, tanto na bolsa de ligação natural mais um sítio de ligação (proteina) adicional transformado ou dois sítios de ligação transformados diferentes. Por exemplo, seria considerado o uso de muteínas de lipocalina como moléculas de ligante ou adaptadoras que podem ser anexadas a um parceiro de ligação fornecido através do sítio de ligação I, considerando-se que o sítio de ligação II é usado para fins de classifica-ção/seleção ou semelhantes. Uma possibilidade de se obter esse objetivo é o uso de proteínas de fusão compreendendo duas muteínas de lipocalina da mesma especificidade de ligação ou diferente, que são acopladas uma a outra por um ligante de peptídeo. Tais proteínas de fusão, também chamadas "duo-calinas" são descritas no WO 99/16873 e também por Schlehuber, S., e Skerra, A. (2001), Βίοι Chem, 382,1335-1342, por exemplo.

Recentemente, proteínas de ligação de histamina de alta afinidade foram identificadas na saliva de carrapatos Rhipícephalus appendiculatus (Pae-sen, G.C. e outros, (1999) Mol. Cell 3, 661-671). Essas proteínas seqüestram histamina no sítio enrolado, competindo por fora com os receptores de histamina para o ligante, a fim de suprimir a inflamação durante alimentação do sangue. A estrutura de cristal dessas proteínas de ligação de histamina revelou uma nova dobra de lipocalina, contendo dois sítios de ligação para histamina possuindo afinidades de ligação diferentes. Os sítios, um dos quais é um sítio de ligação de lipocalina típico, são ortogonalmente dispostos e altamente rígidos, formando uma superfície interna polar incomum que complementa especificamente as propriedades moleculares da histamina. Uma proteína correlata denominada SHBP, que é secretada por um carrapato que se alimenta de roedores e gado, liga ambas histamina e serotonina em dois sítios de ligação diferentes (Sangamnatdej, S. e outros, (2002) insect Mol. Biol. 11, 79-86). O sítio de ligação de alta afinidade repousa perpendicular ao eixo longo do corpo β conduzindo à distorções na estrutura da proteína, em comparação as outras lipocalinas, Assim, parece que, tal sítio de ligação não pode ser transformado em qualquer dada lipocalina. Por outro lado, uma vez que os sítios de ligação estão enterrados no núcleo do corpo β, parecem haver limitações estéricas com relação ao tamanho do ligante.

Assim, permanece a necessidade de geração de proteínas de ligação que utilizam sítios de ligação diferentes e/ou armações de lipocalina alternativas, simplesmente pela razão de se termais opções para realização prática.

Conseqüentemente, é um objetivo da invenção prover muteínasde lipocalina alternativas possuindo afinidade de ligação com um dado alvo.

Esse objetivo é realizado por uma muteína de lipocalina possuindo aspectos das reivindicações independentes, bem como o método para sua geração.

Em uma concretização, tal muteína de lipocalina é uma muteína derivada de um polipeptídeo da lipocalina da lágrima ou um homólogo da mesma, onde a muteína compreende pelo menos dois resíduos de aminoácido mutados em qualquer posição da sequência no estiramento do peptídeo de terminal N e as três alças de peptídeo BC, DE e FG (de acordo com a figura 2) dispostas ao final da estrutura de corpo β que está localizada oposta à bolsa de ligação de lipocalina natural, onde a lipocalina da lágrima ou homólogo da mesma possui pelo menos 60% de homologia com a lipocalina da lágrima humana e onde a muteína se liga a um dado alvo com afinidade detectável.

Em termos mais ilustrativos, essa concretização se baseia na verificação dos inventores de que os aminoácidos nas três alças na extremidade fechada do sítio de ligação de ligante interno de uma lipocalina da lágrima e/ou estiramento de peptídeo de término N da lipocalina da lágrima (conforme figura 1) podem ser mutadas a fim de obter muteínas de lipocalina que se ligam a um dado alvo com afinidade determinável. Assim, a invenção provê uma classe estruturalmente nova de muteínas de lipocalina com propriedades de ligação semelhantes as do anticorpo. Isso significa que essas muteínas podem ser usadas da mesma forma para a geração de novas proteínas de ligação com uma especificidade predeterminada como a classe das Anticaiins® assim denominadas acima (muteínas de lipocalina que são derivadas de proteínas da família da lipocalina, tais como, a proteína de ligação de bilina da Pieris brassicae, na qual as posições de aminoácido nas quatro alças do peptídeo posicionadas na extremidade aberta do sítio de ligação de ligante são mutadas). Por essa razão, essas novas muteínas de lipocalina da presente invenção também são consideradas como pertencendo a essas muteínas de lipocalina designadas Antica-íins®.

Em outra concretização, uma muteína da invenção é também uma muteína derivada de um polipeptídeo da lipocalina da lágrima ou um homólogo da mesma, onde a muteína compreende pelo menos dois resíduos de aminoácido mutados, em qualquer posição de seqüência nas quatro alças de peptídeo AB, CD, EF, e GH (conforme figura 2) englobando a bolsa de ligação de lipocalina natural, onde a lipocalina da lágrima ou homólogo da mesma possui pelo menos 60% de homologia de seqüência com a lipocalina da lágrima humana e onde a muteína se liga a um dado alvo com afinidade detectável. Consequentemente, essa concretização provê uma nova classe de armação onde os ami-noácidos nas quatro alças na extremidade aberta do sítio de ligação de ligante das lipocalinas podem ser mutados para a geração de moléculas de ligação contra um alvo desejado.

Ainda em outra concretização, a invenção refere-se a um derivado de muteína de um polipeptídeo da lipocalina da lágrima ou a homólogo da mesma, onde a muteína compreende pelo menos dois resíduos de aminoácido mutados em qualquer posição de seqüência na região de término N e as três alças de peptídeo BC, DE, e FG dispostas no final da estrutura de corpo β que está localizada oposta à bolsa de ligação de lipocalina natural, onde a muteína compreende pelo menos dois resíduos de aminoácido mutados em qualquer posição de seqüência nas quatro alças de peptídeo AB, CD, EF, e GH englobando a bolsa de ligação de lipocalina natural, onde a lipocalina da lágrima ou homólogo da mesma possui pelo menos 60% de homologia de seqüência com a lipocalina da lágrima humana, e onde a muteína se liga a pelo menos um dado alvo com afinidade detecta vel.

Assim, a invenção também provê, pela primeira vez, uma muteína de lipocalina monomérica (Anticalin®) que, devido à presença de dois sítios de ligação, pode ter especificidade de ligação para dois dados ligantes. Tal molécula biespecífica pode ser considerada como sendo funcionalmente equivalente a uma molécula de anticorpo biespecífica, tal como um diacorpo bíespecífico. Contudo, em comparação ao diacorpo bíespecífico (ou fragmento de anticorpo em geral), essa nova classe de muteínas de lipocalina biespecíficas (Antica-lins®) possui a vantagem de que é composta unicamente de uma cadeia de polipeptídeo considerando-se que um diacorpo consiste em duas cadeias de polipeptídeo que não são covalentemente associadas uma a outra.

Uma muteína de lipocalina biespecífica dessa nova classe de proteínas de ligação pode ser usada como uma molécula adaptadora. Por exemplo, quando se tem afinidade de ligação a dois receptores diferentes, tal molécula de lipocalina biespecífica pode reticular esses receptores. Um exemplo de tal muteína de lipocalina (Anticalin®) seria uma muteína, onde o primeiro sítio de ligação se liga a um receptor de apoptose, tal como o CD95 (também conhecido como receptor Faz ou Apo 1) e o segundo sítio de ligação pode se ligar a um receptor de superfície de célula, que é expresso na mesma célula. A ligação de tal muteína biespecífica em um modo bicelular pode resultar em reticulação mútua do receptor de apoptose CD95 e o segundo antígeno alvo de receptor de superfície de célula, que pode induzir efetivamente a apoptose das células (de acordo com Jung, G. e outros, (2001) Câncer Res. 61,1846-1848). Contudo, tal muteína biespecífica pode também possuir afinidade de ligação a um dado alvo. Tal muteína pode ser útil como um armazenamento molecular para medicamentos que devem ser liberados lentamente na corrente sangüínea. O termo "mutagênese" conforme usado aqui, significa que as condições experimentais são escolhidas, tal que, o aminoácido que ocorre naturalmente em uma dada posição de sequência da lipocalina usada pode ser substituído por pelo menos um aminoácido que não está presente nessa posição específica na respectiva seqüência de polipeptídeo natural. O termo "mutagêne- se" também inclui a modificação (adicional) do comprimento dos segmentos da seqüência por deleção ou inserção de um ou mais aminoácidos. Assim, está dentro do escopo da invenção que, por exemplo, um aminoácido na posição de seqüência escolhida seja substituído por um estiramento de três mutações aleatórias, conduzindo à inserção de dois resíduos de aminoácido, em comparação ao comprimento da proteína do tipo selvagem (o respectivo segmento). Tal inserção de deleção pode ser introduzida independentemente uma da outra em qualquer um dos segmentos de peptídeo que podem ser submetidos à mutagê-nese na invenção. Em uma concretização exemplar da invenção, uma inserção de várias mutações é introduzida na alça AB da armação de lipocalina selecionada (conforme exemplos 2 e 28, respectivamente). O termo "mutagênese aleatória" significa que nenhum aminoácido simples predeterminado (mutação) está presente em uma determinada posição da seqüência, porém que pelo menos dois aminoácidos podem ser incorporados a uma posição de seqüência selecionada durante a mutagênese com uma determinada probabilidade.

Tais condições experimentais podem serobtidas, por exemplo, por incorporação de códons com uma composição de base degenerada em um ácido de nucleotídeo codificando a respectiva lipocalina empregada. Por exemplo, o uso do códon NNK ou NNS (onde N = adenina, guanina ou citosina ou timina; K = guanina ou timina; S = adenina ou citosina) permite incorporação de todos os 20 aminoácidos mais o códon de parada âmbar durante a mutagênese, considerando-se que o códon WS limita o número de aminoácidos incorporados possíveis a 12, uma vez que exclui os aminoácidos Cys, ile, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr, Vai de serem incorporados à posição selecionada da seqüência de polipep-tídeo; uso do códon NMS (onde M = adenina ou citosina), por exemplo, restringe o número de aminoácidos possíveis a 11 em uma posição de seqüência selecionada, uma vez que exclui os aminoácidos Arg, Cys, Gly, lie, Leu, Met, Phe, Trp, Vai de serem incorporados em uma posição de seqüência selecionada. Com relação a isso, é observado que os códons para outros aminoácidos (que os 20 aminoácidos normais ocorrendo naturalmente) tal como, selenocisteína ou pirrolisina podem também ser incorporados a um ácido nucléico de uma mu-teína. É também possível, conforme descrito por Wang, L., e outros, (2001) Science 292,498-500, ou Wang, L, e Schulíz, P.G. (2002) Chem, Comm. 1,111, usar códons ''artificiais" tais como UAG que são geralmente reconhecidos como códons de parada, a fim de inserir outros aminoácidos incomuns, por exemplo, o-metil-L-tirosina ou p-aminofenilalanina. O termo "lipocalina da lágrima" conforme usado aqui, não está limitado à lipocalina da lágrima humana (SWISS-PROT Data Bank, número de acesso M90424), porém pretende incluir todos os polipeptídeos que possuem a dobra da lipocalina estruturalmente invertida, bem como homologia de sequência ou uma identidade de seqüência com relação à sequência de aminoácido da lipocalina da lágrima humana de pelo menos 60%. O termo dobra da lipocalina é usado em seu significado normal, por exemplo, em Flower, D.R. (1996), supra, para descrever a estrutura de lipocalina tridimensional típica com um corpo β conformacionalmente invertido como um motivo central feito de uma folha β ciíindricamente fechada de oito filamentos antiparalelos, onde na extremidade aberta do corpo, os filamentos β são conectados por quatro alças em um modo de paridade, de modo que a bolsa de ligação é formada (vide também figura 2). A definição das alças de peptídeo conforme usada na presente invenção também está de acordo com o significado normal do termo dobra da lipocalina e é como se segue e também ilustrado na figura 2: A alça do peptídeo (segmento) AB se conecta aos filamentos β A e B da folha β ciíindricamente fechada, a alça de peptídeo CD se conecta aos filamentos β C e D, a alça de peptídeo EF se conecta aos filamentos β E e F, a alça de peptídeo GH se conecta aos filamentos β G e H, a alça de peptídeo BC se conecta aos filamentos β B e C, a alça DE se conecta aos filamentos β D e E, e a alça FG se conecta aos filamentos β F e G. Conforme pode ser visto da figura 2, as alças AB, CD, EF e GH formam o sítio de ligação conhecido das lipocalinas (que foi portanto denominado a extremidade aberta), considerando-se que, conforme verificado na presente invenção, as alças BC, DE e FG podem ser usadas em conjunto com o estiramento do peptídeo de término N para formar um segundo sítio de ligação que está localizado na extremidade fechada do corpo β.

De acordo com o acima, o termo "lipocalina da lágrima" incluí homólogos estruturais, já identificados ou ainda a serem isolados, de outras espécies que possuem uma homologia de sequência de amínoácido ou identidade de seqüência de mais de cerca de 60%. O termo "homologia" conforme usado aqui tem seu significado comum e inclui aminoácidos idênticos, bem como aminoá-cidos que estão relacionados às substituições conservadoras (por exemplo, troca de um resíduo de glutamato por um resíduo de aspartato) em posições equivalentes na seqüência de amínoácido linear de duas proteínas que são comparadas uma a outra. O termo "identidade da seqüência" ou "identidade" conforme usado na presente invenção significa a porcentagem de resíduos í-dênticos em paridade - seguindo o alinhamento da homologia de uma seqüência de um poiipeptídeo da presente invenção com uma seqüência em questão -com relação ao número de resíduos na mais longa dessas duas seqüências. A porcentagem de homologia de seqüência ou identidade de seqüência é determinada aqui usando o programa BLASTP, versão blastp 2.2.5 (16 de novembro de 2002; de acordo com Altschul, S. F. e outros, (1997) Nud, Adds Res. 25,3389-3402). A porcentagem de homologia se baseia no alimento de todas as seqüências de poiipeptídeo (matriz: BLOSUM 62; custos de gap: 11.1; valor de corte ajustado para 10'3) incluindo as seqüências de pró-peptídeo usando a lipocalina da lágrima humana como referência em uma comparação emparelhada. Ela é calculada como a porcentagem de números de "positivos" (aminoácidos homólogos) indicados como resultado na saída do programa BLASTP dividido pelo número total de aminoácidos selecionados pelo programa para o alinhamento. Deve ser observado nessa conexão que esse número total de aminoácidos selecionados pode diferir do comprimento da lipocalina da lágrima (176 aminoácidos incluindo o pró-peptídeo) como é visto a seguir.

Exemplos de proteínas homólogas são proteína 1 giandularde Von Ebners de Rattus norvegicus (proteína VEGP; SWISS-PROT Data Bank, número de acesso P20289) com uma homologia de seqüência de cerca de 70% (125 positivos/178 posições incluindo o pró-peptídeo; quando os pró-peptídeosde 18 resíduos de comprimento contendo 13 "positivos" não são levados em consideração: 112 positivos/160, resultando também em uma homologia de cerca de 70%), a proteína 2 glandular Von Ebners de Rattus norvegicus {proteína VEG 2; SWISS-PROT Data Bank, número de acesso P41244) com uma homologia de seqüência de cerca de 71 % (127 positivos/178 incluindo o pró-peptídeo; quando os pró-peptídeos de 18 resíduos de comprimento não são ievados em consideração: 114 positivos/160, a homologia é determinada como sendo também de cerca de 71%), proteína 2 glandular de Von Ebners de Sus scrofra (pig) (LCN1; SWISS-PROT Data Bank, Número de acesso P53715) com uma homologia de seqüência de cerca de 74% (131 positivos/176 posições incluindo o pró-peptídeo; quando os propetídeos de 18 resíduos de comprimento contendo 16 "positivos" não são levados em consideração: 115 positivos/158, resultando em uma homologia de cerca de 73%), ou um precursor de alergeno Can f1 maior de cães (ALL1, SWISS-PROT Data Bank Número de acesso 018873) com uma homologia de seqüência de cerca de 70%, (122 positivos/174 posições, ou 110 positivos/156 = cerca de 70% de homologia, quando os pró-peptídeos com 12 positivos são excluídos) conforme determinado pelo programa BLASTP conforme explicado acima. Tal homólogo estrutural da lipocalina da lágrima pode ser derivado de quaisquer espécies, isto é, de organismos pro-carióticos bem como eucarióticos. No caso dos organismos eucarióticos, o homólogo estrutural pode ser derivado dos invertebrados, bem como dos vertebrados tais como mamíferos (por exemplo, humanos, macacos, cães, ratos ou camundongos) ou pássaros e répteis.

No caso de uma proteína, que não a lipocalina da lágrima ser usada na presente invenção, a definição de posição mutada das seqüências fornecida para lipocalina da lágrima pode ser cedida à outra lipocalina com a ajuda dos alinhamentos de seqüência publicados ou métodos de alinhamento que encontram-se disponíveis aos versados na técnica. O alinhamento da seqüência, por exemplo, pode ser realizado conforme explicado no WO 99/16873 (de acordo com a figura 3 aqui), usando um alinhamento publicado, tal como um na figura 1 de Redl, B. (2000) Biochim. Biophys, Acta 1482,241-248. Se a estrutura tridimensional das lipocalinas estiverdisponível, as superposições estruturais podem ser usadas para a determinação dessas posições de seqüência que devem ser submetidas à mutagênese na presente invenção. Outros métodos de análise estrutural, tais como, espectroscopia de ressonância magnética nuclear multidimensional podem também ser empregados para essa finalidade. 0 homólogo da lipocalina da lágrima pode também ser uma proteína muteína da lipocalina da lágrima propriamente, onde as substituições de a-minoácido são introduzidas em posições que não as posições selecionadas na presente invenção. Porexemplo, tal muteína pode ser uma proteína na qual as posições na superfície exposta de solvente do corpo β são mutadas em comparação à seqüência do tipo selvagem da lipocalina da lágrima, a fim de aumentar a solubilidade ou estabilidade da proteína.

Em geral, o termo "lipocalina da lágrima" inclui todas as proteínas que possuem uma homologia de seqüência ou identidade de seqüência superior a 60%, 70% 80%, 85%, 90%, ou 95% em relação à lipocalina da lágrima humana (SWISS-PROT Data Bank, Número de acesso M90424).

Em uma concretização preferida da invenção a muteína, conforme revelada aqui, é derivada da lipocalina da lágrima humana. Em outras concretizações preferidas, a muteína é derivada da proteína VEGP, proteína VEG 2, LCN 1, ou proteína ALL 1.

Se o sítio de ligação na extremidade fechada do corpo β for usado, a muteína, de acordo com a invenção, compreende tipicamente mutações em quaisquer duas ou mais das posições de seqüência nos segmentos de peptídeo correspondendo às posições de seqüências 7-14,41-49,69-77, e 87-98 da seqüência de polipeptídeo linear da lipocalina da lágrima humana. As posições 714 fazem parte do estiramento de peptídeo de término N, as posições 41-49 estão compreendidas na alça BC, as posições 60-77 estão compreendidas na alça DE e as posições 87-98 estão compreendidas na alça FG.

Nas concretizações mais específicas daquelas muteínas, as mutações são introduzidas naquelas seqüências de posição, que correspondem às posições 8,9,10,11,12,13,43,45,47, 70,72,74,75,90,92,94, e 97 da lipocalina da lágrima humana. Geralmente, tal muteína compreende mutações nas seqüências de posição 5-10 ou 12-16 ou todas 17 das seqüências de posição.

No caso do sítio de ligação na extremidade aberta do corpo β ser submetido à mutagênese, uma muteína de lipocalina de acordo com a presente invenção compreende mutações em quaisquer duas ou mais das seqüências de posição nos segmentos de peptídeo correspondendo às seqüências de po- sição 24-36, 53-66, 79-84, e 103-110 da seqüência de polipeptídeo linear da lipocalina da lágrima humana. As posições 24-36 estão compreendidas na alça AB, as posições 53-66 estão compreendidas na alça CD, as posições 69-77 estão compreendidas na alça EF e as posições 103-110 estão compreendidas na alça GH. Em uma concretização da invenção, uma inserção de 1 a 6 resíduos de aminoácido, preferivelmente de 2 a 4 resíduos de aminoácido, é introduzida no segmento de peptídeo que é formado pelas seqüências de posição correspondendo às seqüências de posição 24-36 da lipocalina da lágrima humana. Essa inserção pode ser incluída em qualquer posição dentro desse segmento. Em uma concretização exemplar, essa inserção é introduzida entre as seqüências de posição 24 e 25 da lipocalina da lágrima humana. Contudo, também é observado novamente que a introdução de um estiramento de pelo menos dois aminoácidos dentro do segmento de peptídeo que faz parte dos sítios de ligação usados aqui, não está limitada ao segmento compreendendo os resíduos 24-26, porém pode estar incluída em qualquer segmento que participa da formação de um ou dois sítios de ligação escolhidos aqui.

Conseqüentemente, a muteína que possui dois sítios de ligação compreende mutações em uma ou mais das seqüências de posição nos segmentos de peptídeo correspondendo às seqüências de posição 7-14,41-49,6977, e 87-97 da seqüência de polipeptídeo linear da lipocalina da lágrima humana e mutações adicionais em qualquer duas ou mais das seqüências de posição nos segmentos de peptídeo correspondendo às seqüências de posição 2436, 53-66, 79-84, e 103-110 da seqüência de polipeptídeo linear da lipocalina da lágrima humana.

Com relação a isto, é observado que o número de segmentos (alças) definidos acima que são usados para mutagênse pode variar (o estiramen-to de peptídeo de término N está incluído no significado do termo segmento ou alça). Não é necessário mutar todos os quatro desses segmentos em conjunto de cada um dos dois sítios de ligação, por exemplo, em uma mutagênese concertada. Porém também é possível introduzir mutações apenas em um, dois ou três segmentos de cada sítio de ligação, a fim de gerar uma muteína possuindo afinidade detectável a um dado alvo. Portanto, é possível submeter, por exem- pio, apenas dois ou três segmentos na extremidade fechada do corpo β à mu-tagênese, se uma molécula de ligação com apenas um sítio de ligação transformado for desejada. Se for desejado que essa molécula tenha afinidade de ligação em relação a um segundo alvo, sequências de posição em cada uma das quatro alças do segundo sítio de ligação podem então ser mutadas. Também é possível, contudo, mutar as alças de peptídeo de ambos os sítios de ligação, esmo se um dado alvo for ligado por um dos sítios de ligação apenas.

As muteínas de lipocalina da invenção podem compreender a se-qüência de aminoácido do tipo selvagem (natural) fora dos segmentos mutados. Por outro lado, as muteínas de lipocalina reveladas aqui podem também conter mutações de aminoácido fora das seqüências de posição submetidas à muta-gênse, à medida que aquelas mutações não interfiram com a atividade de ligação e dobra da muteína. Tais mutações podem ser realizadas muito facilmente no nível de DNA usando métodos padrão estabelecidos (Sambrook, J. e outros, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Alterações possíveis da sequência de aminoácido são inserções ou deleções, bem como substituições de aminoácido. Tais substituições podem ser conservadoras, isto é, um resíduo de aminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido quimicamente semelhante. Exemplos de substituições conservadoras são as substituições entre os elementos dos seguintes grupos: 1) alanina, serina, e treonina; 2) ácido aspártico e ácido glutâmico; 3) asparagina e glutamina; 4) arginina e lisina; 5) isoleucina, leucina, metionina e valina; e 6) fenilalanina, tirosina e triptofano. Poroutro lado, também é possível introduzir alterações não conservadoras na sequência de aminoácido.

Tais modificações de uma seqüência de aminoácido incluem muta-gênese direta das posições de aminoácido simples a fim de simplificar a sub-clonagem do gene mutado da lipocalina ou suas partes por incorporação de sítios de divagem a determinadas enzimas de restrição. Além disso, essas mutações também podem ser incorporadas para aperfeiçoar adicionalmente a afinidade de uma muteína de lipocalina para um dado alvo (conforme os Exemplos 17-19 e 24). Em uma concretização, a mutação é introduzida em pelo me- nos uma das seqüências de posição (da estrutura da lipocalina) que corresponde às seqüências de posição 21,50,51 e 83 da sequência de polipeptídeo linear da lipocalina da lágrima humana. Adicionalmente, mutações podem ser introduzidas a fim de modular determinadas características da muteína, tais como, aperfeiçoara estabilidade da dobra ou solubilidade em água ou para reduzir tendência de agregação, caso necessário.

As muteínas de lipocalina da invenção são capazes de se ligar ao alvo desejado com afinidade detectável, isto é, com uma constante de afinidade preferivelmente de pelo menos 105 M'1. Afinidades menores geralmente não são mais mensuráveis com métodos comuns tais como ELISA e, portanto, de importância secundária. As muteínas de lipocalina são especifica mente preferidas, as quais se ligam ao alvo desejado com uma afinidade de pelo menos 106 M'1, correspondendo à constante de dissociação do complexo de 1 μΜ. A afinidade de ligação de uma muteína ao alvo desejado pode ser medida por vários métodos, tais como, titulação fluorescente, ELISA de competição ou ressonância de piasmônio de superfície.

Fica claro ao versado na técnica que a formação do complexo depende de muitos fatores, tais como, concentração dos parceiros de ligação, a presença de competidores, resistência iônica do sistema tampão, etc. A seleção e enriquecimento são geralmente realizados sob condições que permitem o isolamento das muteínas de lipocalina possuindo uma constante de afinidade de pelo menos 105 M'1 para o alvo. Contudo, as etapas de lavagem e eluição podem ser realizadas sob estringência variada. Uma seleção com relação às características cinéticas é possível. Por exemplo, a seleção pode ser realizada sob condições que favoreçam a formação do complexo do alvo com muteínas que mostrem uma dissociação lenta a partir do alvo, ou em outras palavras, uma razão k0ff baixa.

Uma muteína de lipocalina da lágrima da invenção pode ser usada para formação do complexo com um dado alvo. O alvo pode ser um alvo não natural/ligante. O alvo (ligante) pode ser qualquer composto químico na forma livre ou conjugada que exiba aspectos de um hapteno imunológico, um hormônio, tal como, hormônios esteróides ou qualquer biopolímero ou fragmento do mesmo, por exemplo, uma proteína ou domínio de proteína, um peptídeo, um oligodesoxinudeotídeo, um ácido nucléico, um oligo ou polissacarídeo ou conjugados dos mesmos. Em uma concretização preferida da invenção, o alvo é uma proteína. A proteína pode ser qualquer proteína globular solúvel ou uma proteína receptora, por exemplo, uma proteína de transmembrana envolvida na sinalização celular, um componente dos sistemas imunes, tal como uma molécula MHC ou receptor de superfície de célula que é indicativo de uma doença específica. A muteína também é capaz de ligar apenas fragmentos de uma proteína. Por exemplo, uma muteína pode se ligara um domínio de um receptorde superfície de célula, quando fizer parte do receptor ancorado na membrana celular, bem como ao mesmo domínio na solução, se esse domínio puder se produzido como uma proteína solúvel. Contudo, a invenção não está limitada às muteínas que apenas ligam tais alvos macromoleculares. Porém, é também possível a obtenção de muteínas da lipocalina da lágrima por meio de mutagê-nese, que mostra afinidade de ligação específica aos ligantes de peso molecular baixo ou inferior, tal como, biotina, fluoresceína ou digoxigenina.

Uma muteína de lipocalina da lágrima da invenção existe tipicamente como uma proteína monomérica. Contudo, é também possível que uma muteína de lipocalina da invenção seja capaz de dimerizar ou oliogmerizar espontaneamente. Embora o uso das muteínas de lipocalina que formam monômeros estáveis seja geralmente preferido devido ao manuseio simplificado da proteína, por exemplo, o uso de muteínas de lipocalina que formam homodímeros ou multímeros estáveis pode mesmo ser preferido aqui, uma vezquetais multíme-ros podem prover uma afinidade e/ou avidez aumentada (adicional) a um dado alvo. Adicionalmente, as formas oligoméricas da muteína da lipocalina podem ter meia-vida de soro prolongada.

Para algumas aplicações, é útil empregar as muteínas da invenção em uma forma marcada. Conseqüentemente, a invenção também é dirigida às muteínas de lipocalina que são conjugadas a um marcador selecionado do grupo consistindo em marcadores de enzima, marcadores radioativos, marcadores coloridos, marcadores fluorescentes, marcadores cromogênicos, marcadores luminescentes, haptenos, digoxigenina, biotina, complexos de metal, metais e ouro coloidal. A muteína pode também ser conjugada em uma molécula orgânica. O termo "molécula orgânica" conforme usado aqui preferivelmente indica uma molécula orgânica compreendendo pelo menos dois átomos de carbono, porém preferivelmente não mais que sete ligações de carbono giratórias, possuindo um peso molecular na faixa entre 100 e 2000 Dáltons, preferivelmente 1000 Dáltons, e opcionalmente incluindo um ou dois átomos de metal.

Em geral, é possível marcar a muteína de lipocalina com qualquer substância química apropriada ou enzima, que direta ou indiretamente gera um composto detectável ou sinal em uma reação química, física ou enzimática. Um exemplo para a reação física é a emissão de fluorescência mediante radiação ou emissão de raios x quando se usa um marcador radioativo. Alcalina fosfata-se, rábano silvestre peroxidase ou β-galactosidase são exemplos de marcadores de enzima que catalisam a formação dos produtos de reação cromogênica. Em geral, todos os marcadores comumente usados para anticorpos (exceto aqueles usados exclusivamente com a fração de açúcar na parte Fc das imu-noglobulinas) também podem ser usados para conjugação nas muteínas da presente invenção. As muteínas da invenção também podem ser conjugadas com qualquer agente terapeuticamente ativo apropriado, por exemplo, para a liberação alvejada de tais agentes para uma determinada célula, tecido ou órgão ou para o alvejamento seletivo de células, por exemplo, células de tumor sem afetar as células normais circundantes. Exemplos de tais agentes terapeuticamente ativos incluem radionuclídeos, toxinas, moléculas orgânicas pequenas e peptídeos terapêuticos (tais como peptídeos atuando como agonis-tas/antagonistas de um receptor de superfície de célula ou peptídeos competindo para um sítio de ligação de proteína em um dado alvo celular). As muteínas de lipocalina da invenção podem, contudo, também ser conjugadas com ácidos nucléicos terapeuticamente ativos, tais como, moléculas de ácido nucléico de anti-sentido, RNAs de interferência pequenos, micro-RNAs ou ribozimas. Tais conjugados podem ser produzidos por métodos bem conhecidos na técnica.

Para várias aplicações das muteínas reveladas aqui, pode ser vantajoso usar as mesmas na forma de proteínas de fusão. Nas concretizações preferidas, a muteína de lipocalina da invenção é fundida em seu término N ou seu término C a uma proteína, um domínio de proteína ou um peptídeo, tai como uma seqüência de sinal e/ou um marcador de afinidade. O parceiro de fusão pode conferir novas características à muteína de lipocaíina da invenção, tais como, atividade enzimática ou afinidade de ligação a outras moléculas. Exemplos de proteínas de fusão apropriadas são alcalina fosfatase, rábano silvestre peroxidase, glutação-S-transferase, o domínio de ligação de albumina da proteína G, proteína A, fragmentos de anticorpo, domínios de oligomerização, muteínas de lipocaíina da mesma ou de especificidade diferente (o que resulta na formação de "duocalinas", conforme Schle-huber, S., e Skerra, A. (2001), Biol. Chem. 382,1335-1342), ou toxinas. Especificamente, pode ser possível fundir uma muteína de lipocaíina da invenção com um sítio ativo de enzima em separado, tal que, ambos os "componentes" da proteína de fusão resultante atuam em conjunto em um dado alvo terapêutico. O domínio de ligação da muteína de lipocaíina anexa-se ao alvo causador de doença, permitindo que o domínio da enzima possa abolir a função biológica do alvo. Se duas muteínas de lipocaíina biespecíficas da invenção (isto é, cada uma delas possui dois sítios de ligação) forem combinadas em uma "duocali-na", uma molécula tetravelente será formada. Se, por exemplo, a duocalina for gerada apenas de uma muteína possuindo dois sítios de ligação que se ligam especificamente à biotina, uma molécula tetravalente(homodímero) comparável à estreptavidina (que é um homotetrâmero, onde cada monômero se liga a uma molécula de biotina) pode ser obtida. Devido aos efeitos de avidez esperados, tal muteína pode ser uma ferramenta analítica útil nos métodos que fazem uso da detecção dos grupos de biotina. Uma muteína de lipocaíina que forma ho-modímeros ou multímeros espontaneamente pode, naturalmente, também ser usada para tal finalidade.

Marcadores de afinidade, tais como o Strep-tag® ou Strep-tag® II (Schmidt, T.G.M. e outros, (1996) J. Mol. Biol. 255, 753-766), o myc-tag, o FLAG-tag, o Hisg-tag ou o HA-tag ou proteínas, tais como, glutationa-S- tarnsferase também permitem detecção e/ou purificação das proteínas recom-binantes são exemplos adicionais dos parceiros de fusão preferidos. Finaimente, as proteínas com propriedades cromogênicas ou fluorescentes, tais como, a proteína fluorescente verde (GFP) ou a proteína fluorescente amarela (YFP) são parceiros de fusão apropriados para uma muteína de lipocalina da invenção. O termo "proteína de fusão" conforme usado aqui também compreende muteínas de lipocalina de acordo com a invenção contendo uma seqüên-cia de sinal. As seqüências de sinal no término N de um polipeptídeo direcionam esse polipeptídeo a um compartimento celular específico, por exemplo, o periplasma de E coli ou o retículo endoplasmático de células eucarióticas. Um grande número de seqüências de sinal é conhecido na técnica. Uma sequência de sinal preferida para a secreção de um polipeptídeo no periplasma de E.colié a sequência de sinal OmpA. A presente invenção também refere-se às moléculas de ácido nu-cléico (DNA e RNA) compreendendo seqüências de nucleotídeo codificando muteínas conforme descritas aqui. Uma vez que a degeneração do código genético permite substituições de determinados códons por outros códons especificando o mesmo aminoácido, a invenção não está limitada a uma molécula de ácido nucléico específica codificando uma proteína de fusão da invenção, porém inclui todas as moléculas de ácido nucléico compreende seqüências de nucleotídeo codificando uma proteína de fusão funcional.

Em uma concretização preferida da molécula de ácido nucléico da invenção, sua seqüência é derivada da seqüência de codificação da lipocalina da lágrima humana. Nas outras concretizações preferidas, o ácido nucléico é derivado da proteína VEGP, a proteína VEG 2, LCN 1 ou proteína ALL 1.

Em outra concretização preferida, a seqüência de ácido nucléico codificando uma muteína de acordo com a invenção compreende mutações em quaisquer duas ou mais seqüências de posição nos segmentos de peptídeo correspondendo às seqüências de posição 7-14,43-49,70-77, e 87-97 da seqüência de polipeptídeo linear da lipocalina da lágrima humana com as seqüências de posição correspondendo às posições 8,9, 10,11,12,13,43,45,47,70, 72,74,75,90,92,94, e 97 da lipocalina da lágrima humana sendo particularmente preferidas.

Em uma concretização adicional preferida, a seqüência de ácido nucléico codificando uma muteina de acordo com a invenção compreende mutações em quaisquer duas ou mais das seqüências de posição nos segmentos de peptídeo correspondendo às seqüências de posição 24-36,53-66,79-84, e 103-110 da sequência de polipeptídeo linear da lipocalina da lágrima humana.

Também preferidas são as moléculas de ácido nucléico codificando uma muteina da invenção compreendendo mutações em quaisquer duas ou mais das seqüências de posição nos segmentos de peptídeo correspondendo às seqüências de posição 7-14,43-49,70-77, e 87-97 da seqüência de polipeptídeo linear das mutações de lipocalina da lágrima humana e mutações adicionais em quaisquer duas ou mais das seqüências de posição nos segmentos de peptídeo correspondendo às seqüências de posição 24-36, 53-66, 79-84, e 103-110 da seqüência de polipeptídeo linear da lipocalina da lágrima humana. A invenção, conforme revelada aqui, também inclui moléculas de ácido nucléico codificando muteínas TLPC, que compreendem mutações adicionais fora dos segmentos da mutagênese experimental. Tais mutações são freqüentemente toleradas ou podem mesmo provar serem vantajosas, por exemplo, se elas contribuem para uma eficiência da dobra aperfeiçoada, estabilidade de proteína ou afinidade de ligação de ligante da muteina.

Uma molécula de ácido nucléico revelada nesse pedido pode ser "operavelmente ligada" a uma seqüência reguladora (ou seqüências reguladoras) para permitir expressão dessa molécula de ácido nucléico.

Uma molécula de ácido nucléico, tal como DNA, é referida como "capaz de expressar uma molécula de ácido nucléico" ou capaz "de permitir expressão de uma seqüência de nucleotídeo" se ela compreende elementos de seqüência que contêm informações relacionadas à regulação da transcrição e/ou tradução e tais seqüências são "operavelmente ligadas" à seqüência de nucleotídeo codificando o polipeptídeo. Uma ligação operávelé uma ligação na qual os elementos de seqüência reguladora e a seqüência a ser expressa são conectados de um modo que permite a expressão genética. Uma ligação ope-rável é uma ligação na qual os elementos da seqüência reguladora e a seqüência a ser expressa são conectados de modo que permitam a expressão genética. A natureza precisa das regiões reguladoras necessárias para expressão genética pode variar entre as espécies, porém em geral, essas regiões compreendem um promotor que, nos procariotes, contém ambos o promotor propriamente, isto é, elementos de DNA dirigindo a iniciação da transcrição, bem como elementos de DNA que, quando transcritos para o RNA, sinalizarão o início da tradução. Tais regiões promotoras normalmente incluem seqüências de não codificação 5' envolvidas na iniciação da transcrição e tradução, tais como, as caixas -35/-10 e o elemento Shine-Dalgarno nos procariotes ou a caixa TAXA, seqüências CAAT e elementos de capeamento 5' nos eucariotes. Essas regiões podem também incluir aperfeiçoadores ou elementos repressores bem como o sinal traduzido e seqüências líder para alvejar o polipeptídeo nativo a um compartimento específico de uma céluia hospedeira.

Além disso, as seqüências de não codificação 3’ podem conter elementos reguladores envolvidos na terminação de transcrição, poliadenilação ou semelhantes. Se, contudo, essas seqüências de terminação não forem satisfatoriamente funcionais na célula hospedeira específica, então elas podem ser substituídas com sinais funcionais naquela célula.

Portanto, uma molécula de ácido nucléico da invenção pode incluir uma seqüência reguladora, preferivelmente uma seqüência promotora. Em outra concretização preferida, uma molécula de ácido nucléico da invenção compreende uma seqüência promotora e uma seqüência de terminação de transcrição. Promotores procarióticos apropriados são, por exemplo, o promotor tet, o promotor /acUV5 ou o promotor T7. Exemplos de promotores úteis para expressão nas células eucariótícas são o promotor SV40 ou o promotor CMV.

As moléculas de ácido nucléico da invenção também podem ser compreendidas em um vetor ou quaisquer outros veículos de clonagem, tais como, plasmídeos, fagomids, fagos, baculovírus, cosmídeosou cromossomas artificiais. Em uma concretização preferida, a molécula de ácido nucléico é compreendida em um plasmídeo. Um vetorde plasmídeo indica um vetor codificando a região intergênica de um fago misturador, tal como, M13 ou f1 ou uma parte funcional do mesmo, fundida ao cDNA de interesse. Após a superinfecção das células hospedeiras bacterianas com tal vetor fagomid e um fago apropriado auxiliar (por exemplo, Μ13K07, VCS-M13 ou R408), partículas de fago intac- tas são produzidas, pelo que, permitindo acoplamento físico do cDNA heterólo-go codificado ao seu polipeptídeo correspondente revelado na superfície do fago (revisto, por exemplo, em Kay, B.K. e outros, (1996) Phase Display ofPep-tides and Proteins - A Laboratory Manual, 1 st Ed., Academic Press, New York NY; Lowman, H.B. (1997) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26,401-424, ou Rodi, D.J., e Makowski, L. (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 10,87-93).

Tais veículos de clonagem podem incluir, fora as sequências reguladoras descritas acima e uma seqüência de ácido nucléico codificando uma muteína de lipocalina da invenção, seqüências de replicação e controle derivadas de uma espécie compatível com a célula hospedeira que é usada para expressão, bem como, marcadores de seleção que conferem umfenótípo selecio-nável nas células transformadas ou transfectadas. Inúmeros vetores de clonagem apropriados são conhecidos na técnica e são comercialmente disponíveis. A molécula de DNA codificando as muteínas de lipocalina da invenção e especificamente um vetor de clonagem contendo a seqüência de codificação de tal muteína de lipocalina podem ser transformados em uma célula hospedeira capaz de expressar o gene. A transformação pode ser realizada usando técnicas padrão (Sambrook, J. e outros, (1989), supra). Assim, a invenção também é dirigida a uma célula hospedeira contendo uma molécula de ácido nucléico conforme revelado aqui.

As células hospedeiras transformadas são cultivadas sob determinadas condições para expressão da seqüência de nucleotídeo codificando uma proteína de fusão da invenção. Células hospedeiras apropriadas podem ser procarióticas, tais como, Escheríchia coli (E colí) ou Bacilfus subtilis, ou eucari-óticas, tais como, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, SF9 ou células de inseto HighS, linhagens de células imortalizadas de mamíferos (por exemplo, células HeLa ou células CHO) ou células primárias de mamíferos. A invenção também refere-se a um método para geração de uma muteína de acordo com a invenção ou uma proteína de fusão da mesma, compreendendo: (a) sujeição de uma molécula de ácido nucléico codificando uma lipocalina da lágrima ou um homólogo da mesma, onde a lipocalina da lágrima ou homólogo da mesma possui pelo menos 60% de homologia de seqüência com a lipocalina da lágrima humana, em relação à mutagênese em pelo menos dois códons diferentes, resultando em uma ou mais molécula(s) de ácido nu-cléico; (b) expressando uma ou mais molécula(s) de ácido nucléico de mu-teína obtidas em (a) em um sistema de expressão apropriado, e (c) enriquecendo pelo menos uma muteína possuindo uma afinidade de ligação detectável par um dado alvo, por meio de seleção e/ou isolamento.

Nas concretizações adicionais desse método, a molécula de ácido nucléico pode ser submetida individualmente à mutagênese em dois ou mais códons diferentes (isto é, geralmente tripletos de nucíeotídeo) em qualquer um, dois, três ou quatro segmentos de peptídeo mencionados acima, dispostos em cada extremidade da estrutura β do corpo β. Conseqüentemente, isto é suficiente para alterar apenas uma base em um códon, se essa alteração resultar em uma alteração do aminoácido codificado, No método de geração, uma muteína ou uma proteína de fusão da mesma é obtida começando do ácido nucléico codificando a lipocalina da lágrima ou um homólogo da mesma, que é submetido à mutagênese e introduzido em um organismo hospedeiro bacteriano ou eucariótico apropriado, por meio da tecnologia de DNA recombinante (conforme já ressalto acima). A seqüência de codificação por exemplo, da lipocalina da lágrima humana (Redl, B. e outros, (1992) J. Biol. Chem. 267,20282-20287) pode servir como um ponto de partida para mutagênese dos segmentos de peptídeo selecionados na presente invenção. Para a mutagênese dos aminoácidos no esti-ramento de peptídeo de término N e as três alças de peptídeo BC, DE, e FG ao final da estrutura β do corpo β que está localizada oposta à bolsa de ligação de lipocalina natural, bem como as quatro alças de peptídeo AB, CD, EF, e GH englobando a bolsa de ligação, o versado na técnica tem à sua disposição os vários métodos padrão estabelecidos para mutagênese direcionada ao sítio (Sambrook, J. e outros, (1989), supra). Uma técnica geralmente usada é a introdução de mutações por meio de PCR (reação da cadeia da polimerase) u- sando misturas de oligonucleotídeos sintéticos, que portam uma composição de base degenerada nas seqüências de posição desejadas. O uso dos blocos de construção de nucleotídeo com especificidade de par de base reduzida, como por exemplo, inosina, é outra opção para a introdução de mutações em um segmento de seqüência escolhido. Uma possibilidade adicional é a assim chamada mutagênese tripleto. Esse método usa misturas de diferentes tripletos de nucleotídeo cada uma codificando um aminoácido para a incorporação na seqüência de codificação.

Uma estratégia possível para introdução de mutações nas regiões selecionadas dos respectivos polipeptídeos tem como base o uso de quatro oligonucleotídeos, cada um dos quais é especialmente derivado de um dos segmentos de seqüência correspondentes a serem mutados (como na figura 3). Quando da sintetização desses oligonucleotídeos, um versado na técnica pode empregar misturas de blocos de construção de ácido nucléico para a síntese desses tripletos de nucleotídeo que correspondem às posições de aminoácido a serem mutadas, de modo que os códons codificando todos aminoácidos naturais surgem aleatoriamente, o que pelo menos, resulta na geração de uma biblioteca de peptídeo de lipocalina. Por exemplo, o primeiro oligonucleotideo corresponde em sua seqüência, fora as posições mutadas, ao filamento de codificação para o segmento de peptídeo a ser mutado na posição de mais término N do polipeptídeo de lipocalina. Conseqüentemente, o segundo oligonucleo-tídeo corresponde ao filamento de não codificação para o segundo segmento de seqüência, seguindo na seqüência de polipeptídeo. O terceiro oligonucleotí-deo corresponde, por sua vez, ao filamento de codificação para o terceiro segmento de seqüência. Finalmente, o quarto oligonucleotideo corresponde ao filamento de não codificação para o quarto segmento de seqüência. A reação da cadeia da polimerase pode ser realizada com os respectivos primeiro e segundo oligonucleotídeos e separadamente, se necessário, com os respectivos terceiro e quarto oligonucleotídeos.

Os produtos de ampliação de ambas as reações podem ser combinados por vários métodos conhecidos em um ácido nucléico simples compreendendo a seqüência do primeiro ao quarto segmento, onde as mutações foram introduzidas nas posições selecionadas. Para esse fim, ambos os produtos podem, por exemplo, ser submetidos a uma nova reação da cadeia da polimerase usando oligonucleotídeos de flanqueamento, bem como uma ou mais moléculas de ácido nucléico mediadoras, que contribuem para a seqüência entre o segundo e o terceiro segmento de seqüência. Esse procedimento é reproduzido esquematicamente na figura 3. Na escolha do número e disposição dentro da seqüência de oligonucleotídeos usados para a mutagênse, o versado na técnica possui várias alternativas a sua disposição.

As moléculas de ácido nucléico definidas acima podem ser conectadas por ligação com as sequências 5' e 3' faltantes de um ácido nucléico codificando um polipeptídeo de lipocalina e/ou o vetor e podem ser clonados em um organismo hospedeiro conhecido. Vários procedimentos estabelecidos estão disponíveis para ligação e clonagem (Sambrook, J. e outros, (1989), supra). Por exemplo, seqüências de reconhecimento para endonucleases de restrição também presentes na seqüência do vetor de clonagem podem ser transformadas na seqüência de oliognucleotídeos sintéticos. Assim, após ampliação do respectivo produto PCR e divagem enzimática, o fragmento resultante pode ser facilmente clonado usando as seqüências de reconhecimento correspondentes.

Segmentos de seqüência mais longos dentro do gene codificando a proteína selecionada para mutagênese também podem ser submetidos à muta-gênese aleatória através dos métodos conhecidos, por exemplo, por uso da reação da cadeia da polimerase sob condições de razão de erro aumentado, por mutagênese química ou por uso de cepas bacterianas de mutação. Tais métodos também podem ser usados para otimização adicional da afinidade ou especificidade alvo de uma muteína de lipocalina. As mutações possíveis que ocorrem fora dos segmentos de mutagênese experimental são freqüentemente tolerados ou podem mesmo provar ser vantajosos, por exemplo, se eles contribuem para uma eficiência da dobra aperfeiçoada ou estabilidade da dobra da muteína de lipocalina.

Após expressão das seqüências de ácido nucléico que foram submetidas à mutagênese em um hospedeiro apropriado, os clones portando as informações genéticas para as várias e respectivas muteínas de lipocalina, que se ligam a um dado alvo podem ser selecionados da biblioteca obtida. Técnicas bem conhecidas podem ser empregadas para a seleção desses clones, tais como mostra de fago (revisto em Kay, B.K. e outros, (1996) supra; Lowman, H.B. (1997) supra ou Rodi, D.J., e Makowski, L. (1999) supra), classificação de colônia (revisto em Pini, A. e outros, (2002) Comb. Chem. High Throughput Screen. 5, 503-510), mostra de ribossoma (revisto em Amstutz, P. e outros, (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12,400-405) ou mostra de mRNA, conforme reportado em Wilson, D.S. e outros, (2001) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 98,37503755.

Uma concretização da técnica de mostra de fago (revista em Kay, B.K. e outros, (1996), supra; Lowman, Η. B. (1997) supra ou Rodi, D. J., e Makowski, L. (1999), supra) usando fago misturador M13 é fornecida como um exemplo de um método de seleção de acordo com a invenção. Contudo, é observado que outros fagos temperent, tais como, fago f1 ou lítico, tais como T7 podem ser também empregados. Para o método de seleção exemplar, os fa-gomids M13 (conforme acima) são produzidos, os quais permitem a expressão da seqüência de ácido nucléico de lipocalina mutada como uma proteína de fusão com uma seqüência de sinal no término N, preferivelmente, a seqüência de sinal OmpA e com a proteína de capsídeo plll do fago M13 ou fragmentos da mesma capazes de ser incorporados no capsídeo de fago no término C. O fragmento do término C ΔρΙΙΙ da proteína de capsídeo de fago compreendendo os aminoácidos 217 a 406 da seqüência do tipo selvagem é preferivelmente usado para produzir as proteínas de fusão. É especialmente preferido o fragmento de término C de plll, onde o resíduo de cisteína na posição 201 está faltando ou é substituído por outro aminoácido. A proteína de fusão pode compreender componentes adicionais, tais como, um marcador de afinidade, que permitem a imobilização e/ou purificação da proteína de fusão ou suas partes. Adicionalmente, um códon de parada pode estar localizado entre as regiões de seqüência codificando a lipocalina ou suas muteínas e o gene do capsídeo de fago ou fragmentos do mesmo, onde o códon de parada, preferivelmente um códon de parada âmbar, é pelo menos parcialmente traduzido em um aminoácido durante a tradução em uma ce- pa supressora apropriada.

Por exemplo, o vetor de fagomid pTLPC7 (figura 4) pode ser usado para a construção de uma biblioteca de fago codificando muteínas humanas lacrimais. As moléculas de ácido nucléico da invenção codificando os segmentos de peptídeo mutados são inseridos no vetor usando os sítios de restrição BsfXI. Vetores recombinantes são então transformados em uma cepa hospedeira apropriada, tal como, E. coli XL1-Blue. A biblioteca resultante é subseqüen-temente superinfectada na cultura líquida com um fago auxiliar M13 apropriado, a fim de produzir fago funcional. O fagomid recombinante revela a muteína de lipocalina em sua superfície como uma fusão com a proteína de revestimento plll ou um fragmento da mesma, enquanto a seqüência de sinal de término N da proteína de fusão é normalmente clivada. Por outro lado, ele também porta uma ou mais cópias da proteína plll de capsídeo nativa fornecida pelo fago auxiliar e é assim capaz de infectar um recipiente, em geral uma cepa bacteriana portando um plasmídeo F ou F'. Durante ou após a infecção a expressão genética da proteína de fusão compreendida da muteína de lipocalina e da proteína plll de capsídeo pode ser induzida, por exemplo, por adição de anidrotetracicli-na. As condições de indução são escolhidas, tal que, uma fração substancial do fago obtida revela pelo menos uma muteína de lipocalina em sua superfície. São conhecidos vários métodos para isolar o fago, tais como, precipitação com polietileno glicol. O isolamento ocorre tipicamente após um período de incubação de 6-8 horas.

Os fagos isolados são então submetidos a um processo de seleção por incubação dos mesmos com um dado alvo, onde o alvo está presente em uma forma que permite pelo menos uma imobilização temporária dessas mostras de muteínas de fago com a atividade de ligação desejada. Vários métodos de imobilização são conhecidos na técnica. Por exemplo, o alvo pode ser conjugado com uma proteína veículo, tal como, uma albumina de soro e ser ligado através desse veículo a uma superfície de ligação de proteína, tal como poliestireno. As placas de microtitulação apropriadas para as técnicas ELISA ou assim chamadas "imunovaretas" são preferidas. Alternativamente, os conjugados do alvo também podem ser implementados com outros grupos de ligação, tais co- mo, biotina. O alvo pode então ser imobilizado nas superfícies, o que ligará seletivamente esse grupo, tais como, placas de microtitulação ou partículas para-magnéticas revestidas com avidina ou estreptavidina.

Por exemplo, as partículas de fago são capturadas por íigação ao respectivo alvo imobilizado na superfície. As partículas de fago não ligadas são subsequentemente removidas por lavagem interativa. Para a eluição do fago ligado, moléculas alvo livres (ligante) podem ser adicionadas às amostras como um competidor. Alternativamente, a eluição também pode ser obtida por adição de proteases ou sob condições de desnaturação moderada, por exemplo, em presença de ácidos, bases, detergentes ou sais caotrópicos. Um método preferido é a eluição usando tampões possuindo pH 2,2, seguido por neutralização da solução. O fago eluído pode então ser submetido a outro ciclo de seleção. Preferivelmente, a seleção continua até pelo menos 0,1% dos clones compreenderem muteínas de lipocalina com afinidade detectável para o respectivo alvo. Dependendo da complexidade das bibliotecas empregadas 2-8 ciclos são necessários para esse fim.

Para a análise funcional das muteínas de lipocalina selecionadas, uma cepa hospedeira de E.coli é infectada com os fagomids obtidos e o DNA de fagomid é isolado usando técnicas padrão (Sambrook, J. e outros, (1989), supra). O fragmento de sequência mutada ou toda a seqüência de ácido nucléi-co de muteína de lipocalina pode ser subclonada em qualquer vetor de expressão apropriado. As muteínas de lipocalina recombinantes obtidas podem ser purificadas de seu organismo hospedeiro ou de um lisado de célula por vários métodos conhecidos na técnica, tais como, filtração por gel ou cromatografia de afinidade.

Contudo, a seleção das muteínas de lipocalina também pode ser realizada usando outros métodos bem conhecidos na técnica. Adicionalmente, é possível combinar procedimentos diferentes. Por exemplo, os clones selecionados ou pelo menos enriquecidos por mostra de fago podem subsequentemente ser submetidos a um ensaio de classificação de colônia, a fim de isolar diretamente uma muteína de lipocalina específica com afinidade de ligação detectável para um dado alvo. Adicionalmente, ao invés de gerar uma biblioteca de fago simples, os métodos comparáveis podem ser aplicados a fim de otimizar a muteína com relação à sua afinidade ou especificidade para o alvo desejado por mutagênese repetida, opcionalmente limitada de sua sequência de ácido nucléico de codificação.

Uma vez que uma muteína com afinidade a um dado alvo tenha sido selecionada, é adicionalmente possível submeter tal muteína a mutagênese adicional, a fim de selecionar variantes de afinidade mesmo maior a partir da nova biblioteca assim obtida. A maturação por afinidade pode ser obtida por mutação específica para sítio com base em um projeto racional ou uma mutação aleatória. Uma abordagem possível para a maturação por afinidade é o uso de PCR propensa a erro, que resulta em mutações de ponto em relação a uma faixa selecionada de seqüências de posição da muteína de lipocalina (conforme Exemplo 17). A PCR propensa a erro pode ser realizada de acordo com qualquer protocolo conhecido, tal como, o descrito por Zaccolo e outros, (1996) J. Mol. Biol. 255, 589-603. Outros métodos de mutagênese aleatória que são apropriados para maturação por afinidade incluem mutagênese de inser-ção/deíeção aleatória (RID) conforme descrito por Murakami, H e outros, (2002) Nat. Bíotechnol. 20,76-81 ou recombinação aleatória não homóloga (NRR) conforme descrito por Bittker, J.A e outros, (2002) Nat. Bíotechnol. 20,1024-1029. A maturação por afinidade também pode ser realizada de acordo com o procedimento descrito em WO 00/75308 ou Schlehuber, S. e outros, (2000) J. Mol. Biol. 297,1105-1120, onde as muteínas da proteína de ligação bilina que possuem alta afinidade com a digoxigenina são obtidas. A invenção também refere-se ao método para a produção de uma muteína da invenção, onde a muteína, um fragmento da muteína ou uma proteína de fusão da muteína e outro polipeptídeo é produzido partindo da codificação de ácido nucléico para uma muteína, por meio de métodos de engenharia genética. O método pode ser realizado in vivo, a muteína pode ser produzida, por exemplo, em um organismo hospedeiro bacteriano ou eucariótico e então isolada desse organismo hospedeiro ou em sua cultura. É também possível produzir uma proteína in vitro, por exemplo, por uso de um sistema de tradução in vitro.

Quando se produz uma muteína in vivo, um ácido nucléico codificando uma muteína da invenção é introduzido em um organismo hospedeiro bacteriano ou eucariótico apropriado, por meio de tecnologia de DNA recombi-nante (conforme já ressaltado acima). Para essa finalidade, a célula hospedeira é primeiro transformada com um vetor de clonagem compreendendo uma molécula de ácido nucléico codificando uma muteína da invenção usando métodos padrão estabelecidos (Sambrook, J. e outros, (1989), supra). A célula hospedeira é então cultivada sob condições, que permitem a expressão do DNA heteró-logo e assim a síntese do polipeptídeo correspondente. Subseqüentemente, o polipeptídeo é recuperado tanto da célula quanto do meio de cultivo. Uma vez que muitas lipocalinas compreendem ligações de dissulfeto intramoleculares, pode ser preferido direcionar o polipeptídeo para um compartimento da célula possuindo um meio redox de oxidação usando uma seqüência de sinal apropriada. Tal ambiente de oxidação é provido no periplasma das bactérias Gram-negativas, tais como E. coliou no lúmen do retículo endoplasmático das células eucarióticas e geralmente favorece a formação correta das ligações de dissulfeto. Também, contudo, é possível gerar uma muteína da invenção no citosol de uma célula hospedeira, preferivelmente E.coli. Nesse caso, o polipeptídeo pode, por exemplo, ser produzido na forma de corpos de inclusão, seguido por renaturação in vitro. Uma opção adicional é empregar cepas hospedeiras específicas possuindo um meio intracelular, que assim permite a produção da proteína nativa no citosol.

Contudo, a muteína da invenção pode não ser necessariamente gerada ou produzidas apenas por uso de engenharia genética. Ao invés disso, a muteína da lipocalina também pode ser obtida por síntese química, tal como, síntese de polipeptídeo de fase sólida e Merrifield. É possível por exemplo, que as mutações promissoras sejam identificadas usando modelagem molecular e então para sintetizar o polipeptídeo desejado (projetado) in vitro e investigara atividade de ligação para um dado alvo. Os métodos para a síntese de fase sólida e/ou fase de solução das proteínas são bem conhecidos na técnica (revisto, por exemplo, em Lloyd-Williams, P. e outros, (1997) Chemical Approaches to the SynthesisofPeptidesandProteins. CRC Press, Boca Raton, Fieíds, G.B., e Colowick, S.P. (1997) Solid-Phase Peptide Synthesis. Academic Press, San Diego, or Bruckdorfer, T. e outros, (2004) Curr. Pharm. Biotechnol. 5, 29-43), A invenção também refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos uma muteína da invenção ou uma proteína de fusão da mesma e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

As muteínas da lipocalina de acordo com a invenção podem ser administradas através de qualquer via parenteral ou não parenteral (enteral) que seja terapeuticamente eficaz para medicamentos proteináceos. Métodos de aplicação parenteral compreendem, por exemplo, injeção intracutânea, subcu-tânea, intramuscularou intravenosa e técnicas de infusão, por exemplo, na forma de soluções de injeção, soluções de infusão ou tinturas, bem como instalação e inalação em aerossol, por exemplo, na forma de misturas aerossóis, as-persões ou pós. Os modos de distribuição não parenteral são, por exemplo, oral, por exemplo, na forma de pílulas, comprimidos, cápsulas, soluções ou suspensões ou retal, por exemplo, na forma de supositórios. As muteínas da invenção podem ser administradas sistêmica ou topicamente nas formulações contendo excipientes não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis ou veículos e aditivos, conforme desejado.

Em uma concretização preferida da presente invenção, a substância farmacêutica é administrada parenteralmente a um mamífero e especificamente aos seres humanos, com a instalação em aerossol sendo um dos muitos métodos de aplicação preferidos, beneficiando-se do baixo peso molecular das muteínas.

Conseqüentemente, as muteínas da presente invenção podem ser formuladas em composições empregando ingredientes farmaceuticamente aceitáveis, bem como métodos de preparação estabelecidos (Gennaro, A.L. e Gen-naro, A.R. (2000) Remington: The Science and Practice ofPharmacy, 20th Ed., Lippincott Williams &Wilkins, Philadelphia, PA). Para prepararas composições farmacêuticas, excipientes orgânicos ou inorgânicos farmaceuticamente inertes podem ser usados. Por exemplo, para preparar pílulas, pós, cápsulas de gelatina ou supositórios, podem ser usados lactose, talco, ácido esteárico e seus sais, gorduras, ceras, polióis sólidos ou líquidos, óleos naturais ou endurecidos.

Excipientes apropriados para a produção de soluções, suspensões, emulsões, misturas em aerossol ou pós para reconstituição de soluções ou misturas em aerossol antes do uso incluem água, álcoois, glicerol, polióis e misturas apropriadas dos mesmos bem como óleos vegetais. A composição farmacêutica pode conter também aditivos, tais como, por exemplo, cargas, ligantes, agentes umectantes, deslizantes, estabilizadores, conservantes, emulsionantes e adicionalmente solventes ou solubilizado-res ou agentes para obter um efeito de depósito. O último significa que proteínas de fusão podem ser incorporadas em liberação lenta ou prolongada ou sistemas de liberação alvo, tais como, lipossomas e microcápsulas.

As formulações podem ser esterilizadas por vários meios, incluindo filtração através de um filtro de retenção de bactérias ou por incorporação de agentes de esterilização na forma de composições sólidas estéreis que podem ser dissolvidas ou dispersas em água estéril ou outro meio estéril imediatamente antes do uso.

Como é evidente da revelação acima, uma muteína da presente invenção ou uma proteína de fusão ou um conjugado da mesma podem ser empregados em muitas aplicações. Em geral, tal muteína pode ser usada em todas as aplicações que os anticorpos são usados, exceto aquelas que se fiam especificamente na glicosilação da parte Fc.

Uma muteína da invenção também pode ser usada para alvejar um composto para um sítio pré-selecionado. Para tal finalidade, a muteína é contatada com o composto de interesse afim de permitir formação de complexo. Então, o complexo compreendendo a muteína e o composto de interesse é distribuído ao sítio pré-selecionado. Esse uso é especificamente apropriado, porém não restrito para distribuir uma droga (seletivamente) para o sítio, tal como uma parte de corpo infectada ou órgão que supõe-se ser tratado com o medicamento.

Outro uso das muteínas da invenção é a ligação/detecção de um dado alvo ou molécula alvo, compreendendo contato da muteína com uma amostra de teste que se supõe contenha o alvo e detecção de um complexo de muteína/alvo por um sinal apropriado. A muteína também pode ser usada para a separação de um dado alvo compreendendo contato da muteína com uma amostra que se supõe contenha o alvo a fim de permitir formação de complexo e separação do composto de muteína/alvo da amostra. Em tais usos, o complexo compreendendo uma muteína e o alvo podem ser imobilizados em qualquer fase sólida. O sinal detectável pode ser causado por um marcador, conforme explicado acima, ou por uma alteração das propriedades físicas devido à ligação, isto é, a formação do complexo propriamente. Um exemplo é a ressonância de superfície de plasmônio, o valor da mesma sendo alterado durante a ligação dos parceiros de ligação a partir do que um é imobilizado sobre a superfície, tal como uma folha de ouro.

As muteínas reveladas aqui e seus derivados podem assim ser usadas em muitos campos semelhantes aos anticorpos ou fragmentos dos mesmos. Além do seu uso para ligação a um suporte, permitindo que o alvo de uma dada muteína ou conjugado ou uma proteína de fusão desse alvo seja imobilizado ou separado, as muteínas podem ser usadas para marcação com uma enzima, um anticorpo, uma substância radioativa ou qualquer outro grupo possuindo atividade bioquímica ou características de ligação definidas. Agindo assim, seus respectivos alvos ou conjugados ou proteínas de fusão podem ser detectados ou colocados em contato com as mesmas. Por exemplo, as muteínas da invenção podem servir para detectar estruturas químicas por meio de métodos analíticos estabelecidos {por exemplo, ELISA ou Western Blot) ou por microscopia ou imunosensóricas. Aqui, o sinal de detecção pode ser gerado diretamente por uso de um conjugado de muteína apropriado ou proteína de fusão ou indiretamente pordetecção imunoquímica da muteína de ligação através de um anticorpo. Várias aplicações possíveis para as muteínas da invenção também existem na medicina. Além de seu uso nos diagnósticos e liberação de medicamentos, um polipeptídeo mutante da invenção, que se liga, por exemplo, moléculas de superfície celular específicas de tumor ou tecido podem ser geradas. Tal muteína pode, por exemplo, ser empregada na forma conjugada ou como uma proteína de fusão para "imageamento de tumor” ou diretamente para tera- pia do câncer.

Outro uso preferido ou relacionado de uma muteína descrita aqui é a validação do alvo, isto é, a análise se um poiipeptídeo presumido como estando envolvido no desenvolvimento ou progresso de uma doença ou distúrbio é na realidade a causa daquela doença ou distúrbio. Esse uso para validação da proteína como um medicamento farmacológico alvo tira vantagem da capacidade da muteína da presente invenção de reconhecer, especificamente uma área de superfície da proteína em sua conformação nativa, isto é, de se ligar a um epítopo nativo. Com relação a isso, deve ser observado que essa capacidade foi reportada apenas para um número limitado de anticorpos recombinantes. Contudo, o uso de uma muteína da invenção para validação de um medicamento alvo não está limitado à detecção das proteínas como alvos, porém também inclui a detecção dos domínios de proteínas, peptídeos, moléculas de ácido nucléico, moléculas orgânicas ou complexos de metal. A invenção é adicionalmente ilustrada pelas figuras e Exemplos que se seguem, onde: A figura 1 mostra a seqüência de poiipeptídeo da lipocalina da lágrima humana madura (SWISS-PROT Data Bank, Número de acesso M90424).

Afigura 2 ilustra esquematicamente a estruturada dobra da lipocalina. A figura 3 ilustra esquematicamente a geração da biblioteca de mu-teínas da lipocalina da lágrima aleatorizada na extremidade fechada do corpo β no nível do ácido nucléico. A figura 4 ilustra esquematicamente o vetor de fagomid pTLPC7. A figura 5 ilustra esquematicamente o vetor de fagomid pTLPC6. A figura 6 ilustra esquematicamente a geração da biblioteca das muteínas da lipocalina da lágrima aleatorizada na extremidade aberta do corpo β no nível do ácido nucléico. A figura 7 ilustra esquematicamente o vetor de fagomid pTLPCI 2. A figura 8 mostra um desenho esquemático do vetor de expressão PTLPC8. A figura 9 ilustra a ligação da muteína do TLPC S69.4 013 à rhu- VEGF165 em um ELISA.

Afigura 10 ilustra a ligação do MonômeroS76.1 HlOdamuteínado TLPC ao hCD22 em um ELISA. A figura 11 ilustra a ligação do Dímero S76.1 H10 da muteína do TLPC ao hCD22 em um ELISA. A figura 12 ilustra a ligação do S67.7 C6 da muteína do TLPC ao CD25 humano em um ELISA. A figura 13 ilustra esquematicamente o vetor de transfecção de mamífero CD25-pcDNA3.1Zeo(+), A figura 14 mostra a mancha das células CHO expressando CD25 humano com muteína do TLPC S67.7 C6 marcada com fluoresceína. A figura 15 ilustra esquematicamente o vetor de expressão pTLPC9. A figura 16 ilustra a ligação da fração monomérica da muteína do TLPC F92.8 M1.2 E15 ao CD25 humano em um ELISA. A figura 17 ilustra a ligação da fração dimérica da muteína do TLPC F92.8 M1.2 E15 ao CD25 humano em um ELISA. A figura 18 ilustra esquematicamente o vetor de transfecção de mamífero CD154-pcDNA3.1 Zeo(+). A figura 19 mostra a mancha de células CHO expressando CD25 humano com muteína do TLPC marcada com fluoresceína F92.8 M1.2 E15; A figura 20 ilustra a ligação da muteína dos TLPCs S99.3 H24, S99.3 C13 e S99.4 F15, respectivamente ao CD25 humano em um ELISA. A figura 21 ilustra esquematicamente o vetor de expressão p- TLPC14. A figura 22 ilustra a ligação do monômero e dímero da muteína do TLPC S 100.1 I08 ao hCD33-Fc em um ELISA. A figura 23 ilustra a ligação da muteína do TLPC S101.2 A20 ao hCD33-Fc em um ELISA. A figura 24 ilustra a ligação do monômero e dímeros da muteína do TLPC S101.2 008 ao hCD33-Fc em um ELISA. A figura 25 ilustra a ligação do dímero de muteína do TLPC S100.1 108 ao hCD33-Fc nos experimentos BIAcore. A figura 26 ilustra a ligação da muteína do TLPC S101.2 A20 ao hCD33-Fc nos experimentos BIAcore. A figura 27 ilustra a ligação da muteína do TLPC S101.2 008 ao hCD33-Fc no BIAcore.

Afigura 1 mostra a seqüência de polipeptídeo da lipocalina da lágrima humana madura (SWISS-PROT Data Bank, Número de acesso M90424, 158 aminoácidos, conforme também Redl B. (2000) Biochim. Biophys. Acta, supra). Com relação a isso, é observado que a proteína humana que foi modificada como se segue foi usada nos exemplos que se seguem para a geração de muteínas da lipocalina. Primeiro, os primeiros quatro resíduos de aminoácido de término N da seqüência depositada da lipocalina da lágrima humana (HHLL) foram deletados. Em segundo lugar, os últimos dois resíduos de aminoácido de término C (SD) foram também deletados. Em terceiro lugar, a seqüência do tipo selvagem nas seqüências de posição 5 a 7 (ASD)foi alterada para GGD. Essas alterações são refletidas nas listagens de seqüência anexadas, onde os aminoácidos GGD são indicados como primeiros três resíduos da lipocalina da lágrima usada. Os quatros segmentos (AB, CD, EF e GH) na extremidade aberta do barril β onde os aminoácidos são trocados, são marcados abaixo da seqüência de TLP por sublinhamento duplo. Os segmentos BC, DE e FG e o estiramento de peptídeo de término N onde mutações são introduzidas para criar um sítio de ligação na extremidade fechada do barrril β são marcados em negrito e sublinhamento simples. As posições das seqüências do TLPC que são mutadas nos exemplos são adicionalmente marcadas com asteriscos.

Afigura 2 ilustra esquematicamenteos aspectos característicos da dobra da lipocalina (de acordo com Flower, D.R. (1996), supra). Os oito filamentos β da folha β antiparalela que formam o barril β são mostrados como setas e marcados A a H (um novo filamento β, designado I que está adicionalmente presente em algumas lipocalinas, é também mostrado esquematicamente). A conexão ligada ao hidrogênio de dois filamentos é indicada por um par de linhas pontilhadas entre os mesmos. As alças de conexão são mostradas como linhas curvas sólidas. As duas extremidades do barril β são topologicamente distintas. Uma extremidade possui quatro pinos β (alças AB, CD, EF e GH), a abertura do sítio de ligação de ligante conhecido das lipocalinas está aqui e denominada a extremidade aberta. A outra extremidade do barril β possui três alças (BC, DE e FG), que em conjunto com a região de polipeptídeo de término N constroem a extremidade fechada e são usados na presente invenção para introduzir um sítio de ligação alternativo. As partes que formam as três regiões estruturalmente conservadas (SCRs) da dobra, SCR1, SCR2 e SCR3, são marcadas como caixas. A figura 3 mostra, esquematicamente, uma estratégica para a mu-tagênese combinada de 17 posições selecionadas de aminoácido no TLPC modificado por reação da cadeia da polimerase repetida (PCR). Para a seqüên-cia próxima ao término N e para cada uma das três alças de peptideo BC, DE e FG, respectivamente, onde os aminoácidos devem ser mutados, umoligodeso-xinucleotídeo foi sintetizado (SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, e SEQ ID NO: 6), portando nucleotídeos aleatórios conforme indicado na listagem de seqüência. Devido à composição escolhida, a partir dos três códons de parada possíveis em conjunto, apenas o códon de parada âmbar, TAG, foi permitido nos códons mutados, o que é traduzido como glutamina nas cepas E.coli SupE XL1-Blue (Bullock e outros, (1987) BioTechniques 5, 376-378) ou TG1 (Sambrook e outros, supra). Para determinadas aplicações, por exemplo, a expressão genética em outras cepas bacterianas ou organismos, tais como, um códon sem sentido pode ser substituída por códon codificando glutamina, por exemplo, por mutagênese direcionada para o sítio. Um fragmento de ácido nu-cléico com 159 pares de base foi ampliado (PCR No. 1, A) com os respectivos iniciadores SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4 usando o DNA de plasmídeo p-TLPC6 (SEQ ID NO: 2) como um gabarito. Em outra PCR, um fragmento de ácido nucléico com 123 pares de base foi ampliado (PCR no.1, B) com os iniciadores SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6, respectivamente, também usando p-TLPC6 como gabarito. A mistura de ambos produtos de PCR serviu como um gabarito em outra ampliação (PCR No. 2) com os dois iniciadores de PCR de flanqueamento biotinilados 5', denominados SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, e um iniciador de mediação SEQ ID NO: 9, resultando na ampliação de um frag- mento de DNA de 341 pares de base.

Esse fragmento compreendendo uma mistura de todos os 17 có-dons mutados foi subsequentemente clonado no vetor pTPLC7 usando os dois sítios de restrição BsíXi, a disposição especial do mesmo conduzindo às duas extremidades de DNA de sobressalto não compatíveis permitindo uma ligação específica eficiente. A eficiência da ligação seria aperfeiçoada por purificação do fragmento de PCR digerido por microesferas revestidas de estreptavidina paramagnética. A substituição do aminoácido Glu104Gln bem como as mutações silenciosas no códon para Ala-3 da seqüência de sinal ompA, no códon para Ala21 e His106 foram previamente realizadas durante a construção de pTLPC6, a fim de introduzir ambos os sítios de restrição SsfXI na seqüência de codificação do TLPC. A figura 4 mostra um desenho esquemático do vetor pTLPC7 codificando a proteína de fusão compreendida da seqüência de sinal OmpA (OmpA), um TLPC modificado com as substituições de aminoácido AlaSAsp, SerôGly, Asp7Gly, Cys101Ser, e Glu104Gln (para o cDNA do TLPC, vide Redl e outros, supra) e uma forma truncada da proteína plll de revestimento M13, compreendendo os aminoácidos 217 a 406 (plll). A expressão genética está sob controle do sistema promotor/operador de tetraciclina (tetP/°). A transcrição é terminada no terminador de transcrição da lipoproteína (t|pp). O vetor compreende, adicionalmente, uma origem de replicação (ori), a região intergênica dos fagos fila-mentosos f1 (f1-IG), o gene de resistência à ampicilina (bla) codificando a β-lactamase e o gene repressor da tetraciclina (tetR). Um códon de parada âmbar, que é parcialmente traduzido em Gin na cepa de hospedeiro supressora âmbar SupE, está localizado entre a região de codificação do TLPC e a região de codificação para proteína de revestimento de fago truncado plll. Ambos os sítios de restrição SsfXI usados para a clonagem do cassete genético mutado e os sítios de restrição flanqueando o gene estrutural são marcados. A seqüência de ácido nucléico de um segmento Xòal- HinúWl de pTLPC7 é mostrada em conjunto com a seqüência de aminoácido SEQID NO: 1. A seqüência de vetor fora dessa região é idêntica aquela de pASK75, a seqüência de nucleotídeo completa da mesma sendo fornecida na publicação de patente alemã DE 44 17 598 A1. A figura 5 mostra um desenho esquemático do vetor pTLPC6. p-TLPC6 codifica uma proteína de fusão compreendida da seqüência de sinal OmpA, um TLPC modificado de acordo com a figura 1, e o marcador de afinidade Strep-tag® II. De outro modo, o vetoré idêntico ao pTLPC7. A seqüência de ácido nucléico de um segmento Xòal-H/ndlll do pTLPC6 é mostrado em conjunto com a seqüência de aminoácido codificada na listagem de seqüência como SEQID NO: 2, A seqüência de vetor fora dessa região é idêntica àquela de pASK75, a seqüência de nucleotídeo completa da mesma sendo fornecida na publicação de patente alemã DE 4417 598 A1. A figura 6 mostra, esquematicamente, uma estratégia para a muta-gênese combinada de 17 ou 19 posições de aminoácido selecionadas no TLPC modificado por reação da cadeia da polimerase (PCR). Para a aleatorização da alça AB, três oligodesoxinucletídeos a frente foram sintetizados (SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, e SEQ ID NO: 28), o que difere em comprimento de codificação com uma alça AB aleatorizada, bem como uma extensão de dois e quatro aminoácidos, respectivamente) e um oligonucleotídeo inverso para a alça CD (SEQ ID NO: 29). Adicionalmente, um par de dois oligodesoxinucleotídeos foi sintetizado (SEQ ID NO: 30, e SEQ ID NO: 31) para as alças de peptídeo EF e GH, respectivamente. Esses oligonucleotídeos portando nucleotídeos aleatórios são indicados na listagem de seqüência, onde os aminoácidos devem ser mutados. Três fragmentos de ácido nucléico com 142,148, e 154 pares de base foram ampliados (PCR No. 1, A) com os respectivos iniciadores SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, e SEQ ID NO: 29 usando o DNA de pias-mídeo pTLPC12 (figura 7, SEQ ID NO: 23) como um gabarito. Em outra PCR, um fragmento de ácido nucléico com 119 pares de base foi ampliado (PCR No. 1, B) com os iniciadores SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NO: 31, respectivamente, também usando pTLPC12 como gabarito. A mistura do fragmento PCR resultante da PCR No.1 B com cada um dos três fragmentos de PCR resultantes de PCR No.1 A (variando no comprimento da alça AB) serviram como gabaritos em outra ampliação (PCR No. 2) empregando os dois iniciadores de PCR de flanqueamento biotinilados 5' fornecidos como SEQ ID NO: 33 e SEQID NO: 34 em conjunto com o iniciador de mediação SEQ ID NO:32. Esse PCR resultou em uma ampliação dos fragmentos de DNA consistindo em 336,342, e 348 pares de base de comprimento, o que compreende quase todo o gene estrutural da lipocalina da lágrima tanto com 17 códons mutados (para a alça AB e alça AB estendida em 4 aminoácidos) quanto com 19 códons mutados (para a alça AB estendida em 2 aminoácidos). Os fragmentos foram subseqüentemente clonados no vetor pTPLCI2 usando os dois sítios de restrição BstXI, a disposição especial dos mesmos conduzindo a duas extremidades de DNA de sobreposição não compatíveis permitindo uma ligação específica eficiente. A eficiência de ligação seria aperfeiçoada por purificação do fragmento de PCR digerido por microesferas revestidas com estreptavidina paramagnética. A substituição de aminoácido Ser14Pro e Lys114Gln, bem como as mutações silenciosas no códon para Met21, Val110, e no códon para Val116 foram anteriormente realizadas durante a construção do pTLPCI 2 a fim de introduzir ambos os sítios de restrição BstXI na sequência de codificação do TLPC. A figura 7 mostra um desenho esquemático do vetor pTLPCI 2 codificando uma proteína de fusão compreendida da sequência de sinal OmpA (OmpA), um marcador de detecção T7 (T7), um TLPC modificado com uma substituição dos aminoácidos SerHPro, Lys114Gln, Cys101Ser, e Glu104Gln (para o cDNA do TLPC, vide Redl e outros, supra) e uma forma truncada da proteína plll de revestimento M13, compreendendo os aminoácidos 217 a 406 (pi II). A expressão genética está sob controle do sistema promotor/operadorde tetraciclina (tetP/°). A transcrição é terminada no terminador de transcrição da lipoproteína (t|pp). O vetor compreende, adicionalmente, uma origem de repli- cação (ori), a região intergênica dos fagos filamentosos f1 (f1-IG), o gene de resistência à ampicilina (bla) codificando a β-lactamase e o gene repressorda tetraciclina (tetR). Um códon de parada âmbar, que é parcialmente traduzido em Gin na cepa de hospedeiro supressora âmbar SupE, está localizado entre a região de codificação do TLPC e a região de codificação para proteína de revestimento de fago truncado plll. Ambos os sítios de restrição BstX\ usados para a clonagem do cassete genético mutado e os sítios de restrição flanque- ando o gene estrutural são marcados. A sequência de ácido nucléico de um segmento Xbal- H/ndtll de pTLPCI 2 é mostrada em conjunto com a seqüência de aminoácido SEQID NO:23. A seqüência de vetorfora dessa região é idêntica aquela do pASK75, a seqüência de nucleotídeo completa da mesma sendo fornecida na publicação de patente alemã DE 44 17 598 A1. A figura 8 mostra um desenho esquemático do vetor de expressão pTLPC8. pTLPC8 codifica uma proteína de fusão de uma seqüência de sinal OmpA com uma lipocalina da lágrima modificada de acordo com a (figura 4) seguido pelo marcadorde detecção T7 (T7) e um término C Strep-tag® II. Um segmento relevante da seqüência de ácido nucléico de pTLPC8 é produzido em conjunto com a seqüência de aminoácido codificada na listagem de seqüência como a SEQ ID NO: 24. O segmento começa com o sítio de restrição Xbal e termina com o sítio de restrição Hind\\\. Os elementos de vetorfora dessa região são idênticos ao ve$or pASK75, a seqüência de nucleotídeo completa do mesmo sendo exibida na publicação de patente alemã DE 4417 598 A1. A figura 9 mostra uma representação gráfica dos dados do Exemplo 6, onde medições de ligação com a muteína do TLPC e o alvo prescrito rhu-VEGF165, bem como o alvo não relacionado BSA foram realizados por ELISA. A ligação da muteína do TLPC S59.4 013 (círculos cheios) ao rhuVEGF165 imobilizado na placa do ELISA foi comparada à interação de uma muteína com BSA (círculos abertos) como controle (também imobilizado na placa do ELISA). As muteínas do TLPC ligaram rhuVEGF165 em um modo dependente de concentração, considerando-se que nenhum sinal de ligação significativo para o alvo não relacionado (círculos abertos) foi detectado. A figura 10 mostra uma representação gráfica dos dados do Exemplo 10, onde medições de ligação do muteína do TLPC Monômero S76.1 H10 com o alvo prescrito hCD22, bem como os alvos não relacionados hlgG1, HSA e hCD33-Fc foram realizadas por ELISA. A ligação da muteína do TLPC imobilizada Monômero S76.1 H10 ao hCD22 (quadrados fechados) foi comparada com a interação da muteína com hlgG1 (triângulos abertos), HSA (círculos abertos) e hCD33-Fc (diamantes abertos). A muteína do TLPC se liga ao hCD22 em um modo dependente de concentração, considerando que nenhum sinal de ligação significativo foi detectado para os alvos não relacionados. A figura 11 mostra uma representação gráfica dos dados do Exemplo 10, onde medições de ligação da muteína do TLPC Dímero S76.1 H10 com o alvo prescrito hCD22 bem como os alvos não relacionados hlgG1, HSA e hCD33-Fc foram realizadas por ELISA. A ligação da muteína do TLPC imobilizada Dímero S76.1 H10 ao hCD22 (círculos fechados) foi comparada com a interação da muteína com hlgG1 (triângulos abertos), HSA (quadrados abertos) e hCD33-Fc (diamantes abertos). A muteína do TLPC se liga ao hCD22 em um modo dependente de concentração, considerando que nenhum sinal de ligação significativo foi detectado para os alvos não relacionados. A figura 12 mostra uma representação gráfica dos dados do Exemplo 14, onde medições de ligação com uma muteína do TLPC S67.7 C6 e o alvo prescrito CD25, bem como captura dos alvos não relacionados mAb, HSA, FCS e fragmento Fc de lgG humano capturado foram realizadas por ELISA. A ligação da muteína do TLPC S67.7 C6 (círculo fechado) ao CD25-Fc (também imobilizado na placa do ELISA através de um mAb de captura) foi comparada com a interação da muteína com mAb de captura (círculo aberto) como controle (também imobilizado na placa do ELISA). A muteína do TLPC S67.7 C6 se liga ao CD25 em um modo dependente de concentração, considerando que nenhum sinal de ligação significativo em relação ao mAb de captura alvo não relacionado (símbolo aberto) foi detectado. Uma curva de ligação controle é mostrada apenas para esse alvo não relacionado, porém resultados semelhantes foram obtidos para os outros alvos de controle testados. A figura 13 mostra um desenho esquemático do vetor de transfec-ção de mamífero CD25-pcDNA3.1Zeo(+). Esse vetor codifica a sequência de cDNA completa do CD25 humano de acordo com NCBI, número de acesso 000417 [gi:4557666]. Um segmento relevante da sequência de ácido nucléico do CD25 humano é reproduzida em conjunto com a seqüência de aminoácido codificada na listagem de seqüência como SEQID NO: 10.0 segmento começa com o sítio de restrição Hind\i\ e termina com o sítio de restrição Xho\. Os elementos do vetor fora dessa região eram idênticos àqueles do vetor pcD-NA3.1Zeo(+) (Invitrogen). A figura 14 mostra uma coloração das células CHO expressando CD25 humano na muteína do TLPC marcada com fluoresceína, células CHO S67.7 C6. transfectadas com o vetor de expressão CD25-pcDNA3.1Zeo(+) (CHO-CD25; painéis superiores) um vetor parente pcDNA3.1 Zeo(+) (CHO; painéis inferiores) foram incubados com uma muteína específica para CD25 S67.7 C6 rotulada com fluoresceína em uma razão equimolar (painéis esquerdos; his-togramas com linhas cheias) ou mAb específico para CD25 marcado com FITC (painéis direitos; histogramas com linhas cheias). Em paralelo, essas linhagens de células foram incubadas com o TLPC recombinante do tipo selvagem codificado com pTLPC8 marcado com fluoresceína em razão equimolar (painéis esquerdos; histogramas com linhas pontilhadas) ou lgG1 rotulado com FITC (painéis direitos; histogramas com linhas pontilhadas), ambos como controle. Ambos a muteína específica para CD25 S67.7 C6 e o mAb específico para CD25 mostram coloração significativa da linhagem das células CHO expressando CD25 humano, embora nenhuma coloração de imitação, significativa da linhagem da célula CHO transfectada ocorra. Os controles TLPC e lgG1 do tipo selvagem não mostram ligação significativa a ambas as linhagens de célula testadas. A figura 15 mostra um desenho esquemático de pTLPC9. Esse vetor codifica a proteína de fusão da seqüência de sinal OmpA, uma lipocalina da lágrima modificada de acordo com a figura 1, a Strep-tag® II e um domínio de ligação de albumina (abd) da proteína G de Streptococcus (Kraulis e outros, (1996) FEBS Lett. 378,190-194). Um códon de parada âmbar foi introduzido entre Strep-tag® II e o domínio de ligação de albumina de término C para permitir expressão solúvel da muteína do TLPC sem o ABD, quando se emprega uma cepa de E.coli não supressora. Um segmento relevante da seqüência do ácido nucléico de pTLPC9 é reproduzido em conjunto com a seqüência de ami-noácido codificada na listagem de seqüência como SEQID NO: 22.0 segmento começa com um sítio de restrição Xba e termina com um sítio de restrição Hind\\\. Os elementos do vetor fora dessa região são idênticos aos do vetor pASK75, a seqüência de nucleotídeo completa do mesmo sendo exibida na publicação de patente alemã DE 4417 598 A1. A figura 16 mostra uma representação gráfica dos dados do Exemplo 21, onde medições de ligação com a fração monomérica da muteína do TLPC F92.8 M1.2 E15 e o alvo prescrito CD25 bem como captura dos alvos não relacionados mAb, HSA, FCS e fragmento IgG Fc humano capturado foram realizadas por ELISA. A ligação da fração monomérica da muteína do TLPC F92.8 M1.2 E15 (círculo fechado) ao CD25-Fc (também imobilizado na placa do ELISA via um mAb de captura) foi comparada com a interação da muteína com mAb de captura (círculo aberto) como controle (também imobilizado na placa do ELISA). A fração monomérica da muteína do TLPC F92.8 M1.2 E15 se liga ao CD25 em um modo dependente de concentração, considerando que nenhum sinal de ligação significativo em relação ao mAb de captura alvo não relacionado (símbolo aberto) foi detectado. Uma curva de ligação controle é mostrada apenas para esse alvo não relacionado, porém resultados semelhantes foram obtidos para os outros alvos de controle testados. A figura 17 mostra uma representação gráfica dos dados do Exemplo 21, onde medições de ligação com a fração dimérica da muteína do TLPC F92.8 M1.2 E15 e o alvo prescrito CD25 bem como captura dos alvos não relacionados mAb, HSA, FCS e fragmento Fc de IgG humano capturado foram realizadas por ELISA. A ligação da fração dimérica da muteína do TLPC F92.8 M1.2 E15 (círculo fechado) ao CD25-Fc (também imobilizado na placa do ELISA via um mAb de captura) foi comparada com a interação da muteína com mAb de captura (círculo aberto) como controle (também imobilizado na placa do ELISA). A fração dimérica da muteína do TLPC F92.8 M1.2 E15 se liga ao CD25 em um modo dependente de concentração, considerando que nenhum sinal de ligação significativo em relação ao mAb de captura alvo não relacionado (símbolo aberto) foi detectado. Uma curva de ligação controle é mostrada apenas para esse alvo não relacionado, porém resultados semelhantes foram obtidos para os outros alvos de controle testados. A figura 18 mostra um desenho esquemático do vetor de transfec-ção de mamíferos CD154-pcDNA3.1Zeo(+). Esse vetor codifica a seqüência de cDNA completa do CD154 humano de acordo com o NCBI Acesso BC-074950 [gi:49902361]. Um segmento relevante da seqüência de ácido nucléico do CD154 humano é reproduzida em conjunto com a sequência de aminoácido codificada na listagem de seqüências como SEQ ID NO: 11,0 segmento começa com um sítio de restrição Xho\ e termina com o sítio de restrição Apal. Os elementos de vetor fora dessa região são idênticos aqueles do vetor pcD-NA3.1Zeo(+) (Invitrogen). A figura 19 mostra a coloração das células CHO expressando CD25 humano com muteína F92.8 M1.2 E15 TLPC marcada com fluoresceína. As células CHO transfectadas com o vetor de expressão CD25-pcDNA3.1Zeo(+) (CHO-CD25; painéis superiores) ou o vetor de expressão CD154-pcDNA3.1Zeo (+) (CHO-CD154; painéis inferiores) foram incubadas com muteína F92.8 M1.2 E15 específica de CD25 com afinidade aperfeiçoada, marcada com fluoresceína em uma razão molar de dois dobramentos (painéis esquerdos; histogramas com linhas cheias) ou mAb específico para CD25 marcado com FITC (painéis direitos; histogramas com linhas cheias). Em paralelo, essas linhagens de células foram incubadas com o TLPC recombinante do tipo selvagem codificado com pTLPC8 marcado com fluoresceína em uma razão molar de dois dobramentos (painéis esquerdos; histogramas com linhas pontilhadas) ou lgG1 rotulado com FITC (painéis direitos; histogramas com linhas pontilhadas), ambos como controle. Ambos a muteína F92.8 M1.2 E15 específica para CD25 com afinidade aperfeiçoada e o mAb específico para CD25 mostraram coloração significativa da linhagem de célula CHO espessando CD25 humano embora não ocorra nenhuma coloração significativa da linhagem da célula CHO expressando CD154 humano. Os controles do tipo selvagem TLPC e lgG1 não mostram ligação significativa a ambas as linhagens de célula testadas. A figura 20 mostra uma representação gráfica dos dados do Exemplo 26, onde medições de ligação com a muteína do TLPCs S99.3 H24, S99.3 C13 eS99.4 F15, respectivamente, e o alvo prescrito CD25, bem como captura dos alvos não relacionados mAb, HSA, FCS e fragmento IgG Fc humano capturado foram realizadas por ELISA. A ligação da muteína do TLPCs S99.3 H24 (círculo fechado), S99.3 C13 (quadrado fechado) e S99.4 F15 (triângulo fechado, respectivamente) ao CD25-Fc (também imobilizado na placa do ELISA através de um mAb de captura) foi comparada com a interação das respectivas mu- teínas com o mAb de captura (círculo aberto, quadrado aberto e triângulo aberto, respectivamente) como controle (também imobilizado na placa do ELISA). A muteína dos TLPCs S99.3 H24, S99.3 C13 e S99.4 F15 se liga ao CD25 em um modo dependente de concentração, considerando que nenhum sinal de ligação significativo em relação ao mAb de captura alvo não relacionado (símbolo abertos) foi detectado. As curvas de ligação de controle são mostradas apenas para esse alvo não relacionado, porém resultados semelhantes foram obtidos para os outros alvos de controle testados. A figura 21 mostra um desenho esquemático do vetor de expressão pTLPCI4. pTLPCI 4 codifica uma proteína de fusão da seqüêncía de sinal Om-pA, um marcador de detecção 17 (T7) com uma lipocalina da lágrima modificada de acordo com (a figura 7) seguido pelo Strep-tag® II de término C. Um segmento relevante da sequência de ácido nucléico de pTLPCI 4 é reproduzido em conjunto com a sequência de aminoácido codificada na listagem de sequência como SEQ ID NO: 25. O segmento começa com o sítio de restrição Xbal e termina com o sítio de restrição Hind\\\. Os elementos de vetor fora dessa região são idênticos ao vetor pASK75, a seqüência de nucleotídeo completa sendo exibida na publicação de patente alemã DE 4417 598 A1. A figura 22 mostra uma representação gráfica dos dados do Exemplo 30, onde medições de ligação monomérica do TLPC bem como fração di-mérica da muteína S100.1108 com o alvo prescrito hCD33-Fc, bem como o alvo não relacionado hCD22 foram realizadas por ELISA. A ligação da muteína do TLPC S100.1 I08 ao hCD33-Fc (círculos fechados; triângulo fechados) foi comparada com a interação com hCD22 (círculos abertos; triângulos abertos). A muteína do TLPC se liga ao hCD33-Fc em um modo dependente de concentração, considerando que nenhum sinal de ligação significativo foi detectável em relação ao alvo não relacionado. A figura 23 mostra uma representação gráfica dos dados do Exemplo 30, onde medições de ligação da muteína do TLPC S101.2 A20 com o alvo prescrito hCD33-Fc bem como os alvos não relacionados hCD22 e hlgG1 foram realizadas por ELISA. A ligação da muteína do TLPC S101.2 A20 ao hCD33-Fc (círculos fechados) foi comparada com a interação da muteína com hlgG1 (cír- culos abertos) e hCD22 (triângulos abertos). A muteína do TLPC se liga ao hCD33-Fc em um modo dependente de concentração, considerando que nenhum sinal de ligação significativo foi detectado para os alvos não relacionados. A figura 24 mostra uma representação gráfica dos dados do Exemplo 30, onde medições de ligação da fração monomérica, bem como dímérica da muteína do TLPC S101.2 008 com o alvo prescrito hCD33-Fc, bem como os alvos não relacionados hCD22 e hlgG1 foram realizadas por ELISA. A ligação da muteína do TLPC S1Q1.2 008 ao hCD33-Fc (círculos fechados; quadrados fechados) foi comparada com a interação da muteína com hlgG1 (triângulos abertos; diamantes abertos) e hCD22 (círculos abertos; quadrados abertos). A muteína do TLPC se liga ao hCD33-Fc em um modo dependente de concentração, considerando que nenhum sinal de ligação significativo foi detectado para os alvos não relacionados. A figura 25 mostra um sensograma das medições de ligação do Exemplo 31 onde o sinal de ligação medido em RU (= unidades de resposta) é colocado em gráfico contra o tempo. Durante a injeção, a muteína do TLPC S100.1108 se associa ao alvo prescrito hCD33-Fc. Após injeção, a superfície é lavada com tampão de operação e a muteína se dissocia de seu alvo. As constantes de razão de associação e dissociação (kor, e koff) foram determinadas usando o software BIAevaluation 3.1. A figura 26 mostra a sensograma das medições de ligação do Exemplo 31 onde o sinal de ligação medido em RU (= unidades de resposta) é colocado em gráfico contra o tempo. Durante a injeção, a muteína do TLPC S101.2 A20 se associa ao alvo prescrito hCD33-Fc. Após injeção, a superfície é lavada com tampão de operação e a muteína se dissocia de seu alvo. As constantes de razão de associação e dissociação (kon e koff) foram determinadas usando o software BIAevaluation 3.1. A figura 27 mostra a sensograma de medições de ligação do Exemplo 31 onde o sinal de ligação medido em RU (= unidades de resposta) é colocado em gráfico contra o tempo. Durante a injeção, a muteína do TLPC S100.2 I08 se associa ao alvo prescrito hCD33-Fc. Após injeção, a superfície é lavada com tampão de operação e a muteína se dissocia de seu alvo. As constantes de razão de associação e dissociação (kon e koff) foram determinadas usando o software BIAevaluation 3.1.

Exemplos Exemplo 1: Geração de uma biblioteca com 100 bilhões de mu-teínas do TLPC independentes A menos que de outra forma indicado, os métodos genéticos re-combinantes estabilizados foram usados, por exemplo conforme descrito em Sambrook e outros, (supra).

Uma biblioteca aleatória de TLPC com alta complexidade foi preparada por mutagênese combinada no total de 17 posições selecionadas de ami-noácido próximas ao término N e nas alças de peptideo BC, DE, e FG usando PCR nas múltiplas etapas de acordo com a figura 3. As reações de PCR foram realizadas em um volume de 100 pL em ambas das primeiras etapas de ampliação (PCR No. 1, A e B), onde 10 ng de DNA de plasmídeo pTLPC6 (figura 5, SEQID NO: 2) foram empregados como gabarito em conjunto com 50 pmoles de cada par de iniciadores (SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6, respectivamente), que foram sintetizados de acordo com o método de fosforamidita convencional. Adicionalmente, a mistura de reação continha 10 pl 10 X de tampão Taq (100 mM Tris/HCI pH 9,0,500 mM KCI, 15 mM MgCI2, 1% v/v Triton X-100) e 2 pl de Mistura-dNTP (10 mlVt dATP, dCTP, dGTP, dTTP). Após completar o volume com água, 5 U de polimerase DNA (5 U/μΙ, Promega) foram adicionados e 20 ciclos de 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 62°C e um minuto e meio a 72°C foram realizados em um ciclador térmico com uma tampa aquecida (Eppendorf), seguido por uma incubação por cinco minutos a 60°C para extensão final. Os produtos de ampliação desejados foram isolados por eletroforese de gel agarose de preparação da GTQ Agarose (Roth) usando o kit de extração de DNA Jetsorb DNA (Genomed).

Para a etapa de ampliação subsequente, uma mistura de 2.000 pL foi preparada, onde cerca de 1000 fmol de ambos os respectivos fragmentos foram usados como gabaritos, na presença de 1000 pmol de cada um dos iniciadores do conjunto SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 e 20 pmol do iniciador de mediação SEQ ID NO: 9. Ambos os iniciadores de conjunto tinham um grupo de biotina em suas extremidades 5’, permitindo a purificação do produto de PCR após divagem de BstXt através das microesferas paramagnéticas revestidas com estreptavidina. Adicionalmente, 200 pl 10 x de tampão Taq, 40 pl de mistura de dNTP (10 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 100 u de DNA polimeraseTaq (5 U/μΙ, Promega) e água foram adicionados para colocar a mistura no volume final de 2000 μΙ. A mistura foi dividida em alíquotas de 100 μι. e PCR foi realizada com 20 ciclos de 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 60°C, um minuto e meio a 72°C, seguido por uma incubação subsequente por cinco minutos a 60°C. O produto de PCR foi purificado usando kit E.Z.N.A. Cycle-Pure (PeqLab).

Para fins de clonagem, esse fragmento representando a biblioteca das muteínas do TPLC na forma de ácido nucléico foi primeiro cortado com a enzima de restrição BsfX! (Promega) de acordo com as instruções do fabricante e então purificado por eletroforese de gel agarose de preparação conforme descrito acima, resultando em um fragmento de DNA de filamento duplo de 303 nucleotídeos de comprimento. Os fragmentos de DNA não digeridos ou digeridos de modo incompleto foram removidos através de seus marcadores de biotina 5' usando microesferas paramagnéticas revestidas com estreptavidina (Merck).

Para esse fim, 200 μΙ_ da suspensão comercialmente disponível das partículas paramagnéticas em uma concentração de 10 mg/mL foram lavados três vezes com 100 μΙ_ de tampão TE. As partículas foram então drenadas e misturadas com 100 pmoles do fragmento de DNA em 100 μι do tampão TE por 15 minutos à temperatura ambiente. As partículas paramagnéticas foram coletadas na parede do recipiente Eppendorf com a ajuda de um magneto e o sobrenadante contendo o fragmento de DNA purificado foi recuperado para uso adicional na reação de ligação que se segue.

O DNA do vetor pTLPC7 (figura 4) foi cortado com BstXI conforme descrito acima e o maior dos dois fragmentos resultantes (3907 bp) foi purificado por eletroforese de gel agarose de preparação. Para a reação de ligação, 5,99 pg (30 pmoles) do fragmento da PCR e 77,3 pg (30 pmoles) do fragmento de vetor foram incubadas na presença de 833 Unidades Weiss da T4 DNA liga-se (Promega) em um volume total de 8330 pl (50 mM Tris/HCI pH 7,8,10 mM

MgCh, 10 mM DTT, 1 mM ATP, 50 pg/mL BSA) por 24 horas a 16°C. 0 DNA na mistura de ligação foi então precipitado por adição de 208 pl de tRNA de levedura (solução de 10 mg/mL em H20 (Roche)), 8330 pl 5 M de acetato de amô-nio e 33,3 mL de etanol. Incubação a temperatura ambiente por 1 hora foi seguida por centrifugação (30 minutos, 16.000 g, 4°C). O precipitado foi lavado com 5 mL de etanol (70% v/v, temperatura ambiente), centrifugado (10 minutos, 16.000 g, 4°C), e seco ao ar até a esfera de DNA ter aparência brilhante e incolor. Finalmente, o DNA foi dissolvido a uma concentração final de 200 pg/mL em um volume total de 416.5 μΙ de água. A preparação do E.coli XL1-Blue eletrocompetente (Bullock e outros, supra) foi realizada de acordo com os métodos descritos por Tung and Chow (Trends Genet. 11 (1995), 128-129) e por Hengen (Trencls Biochem. Sei. 21 (1996), 75-76). Um litro de meio LB foi ajustado para uma densidade óptica a 600 nm de Οϋθοο = 0,08 por adição da cultura de XL1 -Blue estacionária por toda a noite e foi incubado a 140 rpm e 26°C em um frasco Erlenmeyer de 2 litros. Após alcançar OD60o = 0,6, a cultura foi resfriada por 30 minutos sobre gelo e subsequentemente centrifugada por 15 minutos a 4.000 g e 4°C. As células foram lavadas duas vezes com 500 mL de glicerol resfriado em gelo, 10% peso/volume e finalmente ressuspensas em 2 mL de meio GYT resfriado em gelo (10% peso/volume de glicerol, 0,125% peso/volume de extrato de levedura, 0,25% peso/volume de triptona). As células foram então aliquotadas (200 pL), congeladas por choque em nitrogênio líquido e armazenadas a -80°C. O sistema Micro Pulser (Biorad) foi empregado em conjunto com cuvetas do mesmo fornecedor (separação de eletrodo de 2 mm) para eletropo-ração. Todas as etapas foram realizadas a uma temperatura ambiente empregando cuvetas pré-resfriadas a uma temperatura de -20°C. Cada 10 μΙ da solução de DNA (2 pg) foram misturados com 100 μΙ da suspensão de célula, incubados por 1 minuto em gelo e transferidos para a cuveta pré-resfriada. Eletro-poração foi realizada (5 ms, 12,5 kV/cm) e a suspensão foi imediatamente diluída em 2 mL de meio SOC, seguido por incubação por 60 minutos a 37°C e 140 rpm. Após isso, a cultura foi diluída em 4 litros de 2 x meio YT contendo 100 pg/mL de ampicilina (2 YT/Amp) resultando em OD55o de 0,26. Empregando-se um total de 78,61 pg de DNA ligado, cerca de 1,0 x 1010 transformantes foram obtidos em 42 operações de eletroporação. Os transformantes foram adicionalmente usados para preparação dos fagomids codificando a biblioteca de mu-teína dos TLPCs como proteínas de fusão, conforme descrito no Exemplo 7 do pedido PCT WO 03/029471 ou Exemplo 1 do pedido PCT WO 99/16873.

Exemplo 2: Geração de uma biblioteca com 10 bilhões de mute-ínas do TLPC independentes Uma segunda biblioteca aleatória de TLPC com alta complexidade foi preparada por mutagênese combinada das posições selecionadas de ami-noácido nas quatro alças de peptídeo AB, CD, EF bem como GH englobando a bolsa de ligação de lipocalina natural na extremidade aberta da lipocalina usando PCR em múltiplas etapas de acordo com a figura 6. Na alça AB, uma variação de comprimento foi introduzida por inserção de cada dois ou quatro amino-ácidos usando a mesma estratégia de PCR conforme descrito no Exemplo 1, porém empregando dois oligodesoxinucleotídeos diferentes (SEQID NO: 27 e SEQ ID NO: 28) para preparação dos fragmentos de PCR A, compreendendo seis ou doze nucleotídeos aleatórios adicionais para a inserção de dois ou quatro aminoácidos. A fim de estabilizar a alça AB portando a inserção de quatro aminoácídos, as posições de ancoramento de término N e término C foram fixadas por uma substituição de aminoácidos V24W, D25S e M31N, N32S codificados com o oligonucleotídeo SEQ ID NO; 28. As reações de PCR foram realizadas da mesma forma conforme descrito no Exemplo 1, exceto que em uma primeira etapa de ampliação (PCR No. 1), o DNA do plasmídeo pTLPCI 2 (figura 7, SEQ ID NO: 23) foi empregado como um gabarito em conjunto com os iniciadores SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 29 para ampliara alça não estendida AB, SEQ ID NO: 27 e SEQ ID NO: 29 para a extensão em dois aminoácidos ou SEQ ID NO: 28 e SEQ ID NO: 29 para a extensão em quatro aminoácidos. Essa PCR resultou em uma ampliação dos fragmentos de DNA consistindo em 336,342, e 348 pares de base de comprimento, que compreende quase todo o gene estrutural da lipocalina da lágrima com 17 (para a alça AB não estendida e alça AB estendida em 4 aminoácídos) ou 19 (para a alça AB estendida em 2 aminoácidos) códons mutados. Na PCR No.1 B os oligonucleo- tideos SEQID NO: 30 e SEQID NO: 31 foram empregados a fim de ampliar o fragmento B da PCR. Os produtos de ampliação desejados foram isolados por eletroforese de gel agarose de preparação da GTQ Agarose (Roth) usando o Wizard SV Gel e PCR Clean-Up System (Promega).

Para formar o conjunto dos fragmentos da PCR A e B em uma etapa de ampliação subsequente (PCR No. 2), cada um dos fragmentos A da PCR foi misturado com o fragmento B da PCR em uma mistura separada de 1.000 μι, onde cerca de 500 fmol de ambos os respectivos fragmentos foram usados como gabaritos, na presença de 500 pmoles de cada um dos iniciadores do conjunto SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 e 10 pmoles do iniciador de mediação SEQ ID NO: 32. Os produtos da PCR foram purificados usando Wizard SV Gel e PCR Clean-Up System (Promega).

Para fins de clonagem, esses fragmentos representando a biblioteca das muteínas do TPLC na forma de ácido nucléico foram primeiro cortados com a enzima de restrição BsíXí (Promega) de acordo com as instruções do fabricante e então purificados conforme descrito acima, resultando em fragmentos de DNA de filamento duplo de 299,305 e 311 nucleotideos de comprimento. Os fragmentos de DNA não digeridos ou digeridos de forma incompleta foram removidos através de marcadores de bíotina 5’ usando microesferas paramag-néticas revestidas com estreptavidina (Merck) conforme descrito no Exemplo 1.

Para ligação subseqüente da muteína dos TLPCs a partir do acima, um fragmento 3944 foi preparado e purificado do DNA do vetor pTLPC12 (figura 7) conforme descrito no Exemplo 1. Para a reação de ligação, 1,97 pg (10 pmoles) de cada fragmento de PCR e 84 pg (30 pmoles) do fragmento de vetor foram incubados na presença de 840 Unidades Weiss de T4 DNA ligase (Promega) em um volume total de 8400 pl (50 mM de Tris/HCi pH 7,8,10 mM de Mg-Cl2,10 mM de DTT, 1 mM de ATP, 50 pg/mL de BSA) por 38 horas a 16°C. O DNA na mistura de ligação foi então precipitado por adição de 210 pl de tRNA de levedura (solução de 10 mg/mL em H20 (Roche)), 8,400 pl 5 M de acetato de amônio e 33,6 mL de etanol. Processamento adicional foi realizado de acordo com Exemplo 1 e finalmente, o DNA foi dissolvido a uma concentração final de 200 pg/mL em um volume total de 420 pl de água. A preparação e transformação do E.colíXL1-Blue eletrocompetente (Bullock e outros, supra) foi realizada de acordo com Exemplo 1. Empregando-se um total de 85,97 pg de DNA ligado cerca de 0,6 x 1010 transformantes foram obtidos em 42 operações de eletroporação em conjunto. Os transformantes foram usados adicionalmente para preparação dos fagomids de acordo com a descrição no Exemplo 7 do pedido PCT WO 03/029471 ou Exemplo 1 do pedido PCTWO 99/16873.

Exemplo 3; Apresentação do fagomid e seleção da muteina dos TLPCs contra VEGF empregando placas de múltiplas cavidades de polies-tirol de alta ligação Para seleção da muteina dos TLPCs, 2 x 1012 a 1 x 10'13 fagomids da biblioteca obtida no Exemplo 1 foram usados. Em resumo, os fagomids foram centrifugados (21460 x g, 4°C, 20 minutos) e ressuspensos em 1 mL de PBS (4 mM de KH2P04,16 mM de Na2HP04,115 mM de NaCI, pH 7,4) contendo 50 mM de benzamidina. PBS contendo 6% peso/volume de albumina de soro bovino (BSA; Roth) e 0,3% de Tween 20 foi usado como tampão de bloqueio. Antes da incubação com a proteína alvo, os fagomids da biblioteca foram incubados em cavidades de poliestirol bloqueado com albumina de soro bovino, 2 vezes por 15 minutos para esgotar os fagomids representando a muteina de lipocalina desdobrada multirreativa. O fator do crescimento endotelial vascular humano recombinante (165 aminoácidos, rhuVEGF165) produzido nas células de insetos (R&D Sytems) foi revestido nas placas de poliestirol com uma concentração de 2,5 pg/rnL. Após incubação dos fagomids bloqueados nas cavidades revestidos e bloqueados, os fagomids absorvidos foram eluídos quimica-mente. Os fagomids absorvidos foram tratados com 300 μΙ de 0,1 M glicina/HCI pH 2,2 por respectiva cavidade por 10 minutos, seguido por neutralização imediata do pH de cada fração de eluição por mistura da mesma com uma quantidade apropriada de 0,5 M Tris. Começando com o segundo ciclo de enriquecimento, apenas metade das soluções de fagomid foi usada para ampliação do fagomid. Após cada ciclo de seleção, as titulações de entrada do fagomid, a fração da oitava lavagem e os fagomids eluídos foram impedidos por titulação de mancha. Em resumo, diluições em série da solução de fagomid foram mistu- radas com células de E.coli XL1-Blue e incubadas por 30 minutos a 37°C. Alíquotas das células infectadas foram "manchadas" em placas de ágar LB/Amp e incubadas por toda a noite a 37°C. No dia seguinte, as colônias por mancha foram contadas e as titulações das soluções de fagomid (cfu/mL) determinadas. A ampliação do fagomid foi realizada a 22°C.

Quatro seções de seleção adicionais contra rhuVEGF165 foram realizadas, desse modo empregando a preparação de fagomids ampliados do respectivo ciclo de enriquecimento anterior com a exceção de que apenas cerca de 1 x 1011 fagomids foram utilizados, começando com o segundo ciclo de enriquecimento.

Exemplo 4: Identificação das muteínas de TLPC de ligação ao VEGF, por uso de um método de classificação ELISA de alto rendimento Para a produção analítica da muteína dos TLPCs, o vetor pTLPC8 (figura 8, SEQID NO: 24) foi construído, equipado com um marcador de detecção T7 de término C (Novagen) seguido por um marcador de afinidade Strep-tag® II e sua caracterização por classificação de ELISA de alto rendimento. O cassete genético contendo a plataforma de TLPC entre os dois sítios de divagem BstXI foi clonado do vetor pTLPC7 (figura 4, SEQ ID NO: 1) no pTLPC8.

Para essa finalidade, o DNA de plasmídeo foi isolado de uma mistura de clones E.coli obtidos por infecção com os fagomids do Exemplo 3 eluídos como resultado do último ciclo de seleção, usando o kit Plasmid Miniprep Spin (Genomed). O DNA foi cortado com a enzima de restrição BsfXI e o menor dos dois fragmentos foi purificado por eletroforese de gel agarose de preparação. O DNA do vetor pTLPC8 foi da mesma forma cortado com BsfXI e o maior dos dois fragmentos (3.397 pares de base) foi isolado da mesma forma.

Para a ligação, cada 50 fmoles dos dois fragmentos de DNA foram misturados com 3 Unidades Weiss T4 DNA ligase (Promega) em um volume total de 20 pl (30 mM de Tris/HCI pH 7,8,10 mM de MgCI2,10 mM de DTT, 1 mM de ATP), seguido por incubação por 2 horas a 22°C. E. co//TG1-F (E. coli K12 TG1, que havia perdido seu epissoma) foi transformado com 5 pL dessa mistura de ligação, de acordo com o método CaÜ2 (Sambrook e outros, supra) e colocado sobre placas de ágar LB/Amp (diâmetro:14 cm).

Colônias de E.colisimples, obtidas após transformação abrigando os respectivos plasmídeos de TLPC codificando uma muteína dos TLPCs foram coletadas dessas placas de ágar em 70 pL por cavidade 2xYT/Amp em placas de 384 cavidades de fundo plano Greiner) por meio de um coletor de colônia automatizado (Genetix) e cresceram portoda a noite a 37°C a 700 rpm em um misturador de bancada (Bühler) em um incubador umidificado (MMM Medcen-ter) a 60% de umidade relativa (rH). As culturas foram diluídas 1:100 em 100 μί 2 x YT/Amp em placas de 96 cavidades de fundo redondo (Nunc) por meio de um cabeçote de replicação de 96 pinos (Genetix) e cresceram por cerca de 1 hora a 37°C e 60% de umidade relativa, seguido por uma incubação por 3 horas a 22°C e 60% de umidade relativa, ambas em 700 rpm, até o OD550 alcançar cerca de 0,6. As placas de 384 cavidades foram mantidas como placas "principais" a -80°C após adição de 25 pl 60% v/v de glicerol a cada cavidade.

Muteínas recombinantes do TLPC foram produzidas em placas de 96 cavidades por adição de 20 pL por cavidade de 1,2 pg/mL de anidrotetraci-clina em 2xYT (obtida por diluição de uma solução de estoque de 2 mg/mL 1:1667 em 2 x YT; concentração final de 0,2 pg/mL) às culturas bacterianas e incubação portoda a noite a 22°C e 700 rpm a 60% de umidade relativa. Após isso, 40 pL de tampão de lise (400 mM de borato de Na, pH 8,0, 320 mM de NaCI, 4 mM de EDTA, 0,3% peso/volume de lísozima) foi adicionado a cada cavidade e a placa foi incubada por 1 hora a 22°C e 700 rpm a 60% de umidade relativa. Para minimizar as interações de ligação não específicas no experimento de ELISA subsequente, os extratos de célula bruta obtidos foram suplementados com 40 pl/cavidade de PBS contendo 10% peso/volume de BSA e 0,05% v/v de Tween 20 (concentração final de 2% peso/volume de BSA) por 1 hora a 22°C e 700 rpm a 60% de umidade relativa.

Para a detecção de ligação, os extratos de célula brutos contendo uma muteína dos TLPCs foram testados quanto a sua reatividade com a proteína alvo prescrita rhuVEGF165 e a albumina de soro humano de proteína de controle não correlata (HSA, Sigma), respectivamente, nos experimentos ELISA. Portanto, as cavidades das placas de ELISA pretas Fluotrac 600 (Greiner; 384 cavidades) foram revestidas portoda a noite com 20 pL de uma solução de rhuVEGFI 65 a uma concentração de 2,5 pg/mL em PBS ou a proteína de controle a 4°C, 10 pg/mL em PBS. As placas foram lavadas cinco vezes com 100 μΙ_ de PBS contendo 0,05% v/v de Tween 20 (PBST/0,05) por cavidade com uma lavadora de placa ELISA automatizada (Molecular Devices) deixando um volume residual de 10 pL do tampão de lavagem em cada cavidade, após a última etapa de lavagem. Os sítios de ligação residual foram bloqueados por incubação com 100 pL PBST/0,05 contendo 2% peso/volume de BSA por2 horas a temperatura ambiente. Após isso, as placas foram novamente lavadas cinco vezes conforme descrito acima.

Para formação de complexo entre uma muteína dos TLPCs e as proteína imobilizadas, as cavidades foram incubados com 10 pL do extrato de célula acima por 1 hora a uma temperatura ambiente. Subsequentemente, as placas foram lavadas novamente cinco vezes e 10 pL de um conjugado-HRP-anticorpo monoclonal anti-T7 (Amersham), diluído 1:5000 em PBST/0,05 contendo 0,5% peso/voiume de leite em pó sem gordura (Vitalia), foram adicionados a cada cavidade e incubados por 1 hora a temperatura ambiente. As placas foram novamente lavadas cinco vezes e 10 pL de substrato-HRP fluorgênico QuantaBIu® (Pierce) foram adicionados para detectar muteínas de TPLC ligadas por meio do conjugado-HRP-anticorpo monocíonal anti-T7 anexado. Após 45 minutos a temperatura ambiente, a fluorescência foi excitada em um comprimento de onda de 320 nm (± 12,5 nm) e medida a 430 nm (± 17,5 nm) no leitor de placa GENiosPlus (Tecan).

Uma seleção de 183 muteínas de TLPC mostrou sinais de ligação significativamente maiores na proteína alvo prescrita (rhuVEGFI 65) em comparação à proteína de controle não correlata (HSA) e essas foram subseqüente-mente submetidas a um experimento de classificação ELISA de alto rendimento secundário. Portanto, esses clones foram transferidos das placas principais de 384 cavidades descritas acima em ágarLB/Amp, e crescimento portoda a noite a 37°C. 100 pL de 2 x YT/Amp em placas de 96 cavidades de fundo redondo (Nunc) foram inoculadas com colônias simples dessas placas de ágare crescimento portoda a noite a 37°C a 700 rpm e 60% de umidade relativa. As culturas foram diluídas 1:100 em 100 pl 2 x YT/Amp em placas de 96 cavidades de fundo redondo (Nunc) e produção das muteínas recombinantes de TLPC, bem como preparação dos lisados bacterianos foi realizada conforme descrito acima.

Para a detecção da especificidade alvo da muteína dos TLPCs, as cavidades das placas ELISA pretas Fluotrac 600 (Greiner; 384 cavidades) foram revestidos por toda a noite a 4°C com 20 pL de uma solução de rhu-VEGF165 (células de inseto, 1 pg/mL) ou, como controles rhuVEGFI 65 produzidos em E.coli (ReliaTech GmbH, 1 pg/mL), VEGF de camundongo recombi-nante (rmVEGF164) produzido nas células de inseto (ReliaTech GmbH, 1 pg/mL), HSA, 3% peso/volume de leite em pó desnatado, sem gordura e Strep-Tactina (IBA, 10 pg/mL), bem como um conjugado de RNaseA (Fluka, 10 pg/mL) e digoxigenina em PBS.

Esse conjugado foi preparado por reação de RNaseA em uma razão molar de dois dobramentos de éster N-hidróxi-succinimida do ácido digoxi-genin-3-0-metil-carbonil-s-amidocapróico (DIG-NHS; Roche) de acordo com as instruções do fabricante. Reagente em excesso foi removido do conjugado de RNAseA por meio de cromatografia por exclusão de tamanho usando uma coluna HiTrap (Amersham) de acordo com as instruções do fabricante empregando PBS como tampão de operação.

Após incubação portoda a noite, as placas foram lavadas conforme descrito acima e bloqueadas por adição de 100 pL/cavídadede PBST/0,05 contendo 2% peso/volume de BSA nas condições descritas acima, seguido novamente por lavagem das placas. 10 pL de lisados bacterianos bloqueados das muteínas de TLPC selecionadas, mencionadas acima foram transferidos a cada um das cavidades revestidos com rhuVEGFI 65 ou as proteínas de controle e incubados por 1 hora a temperatura ambiente. Muteínas ligadas do TPLC foram detectadas com conjugado-HRP-anticorpo monoclonal anti-T7 e o substrato-HRP fluorgênico QuantaBIu® conforme descrito acima.

Uma seleção de 36 muteínas do TLPC foi confirmada em rhu-VEGF165 (células de inseto) e adicionalmente mostrou sinais altos de rhu-VEGF165 (E.coli) e rmVEGFI 64(células de inseto), porém não mostrou ligação nas proteínas controle não relacionados (HSA ou leite em pó).

As muteínas de TLPC com os sinais de ligação mais altos no alvo prescrito rhuVEGF165 versus as proteínas de controle foram selecionadas para análise de seqüência. Portanto, 4 mL LB/Amp foram ínoculados com 40 μί de estoque de glicerol da respectiva cavidade da placa principal de 384 cavidades e cultivados por isolamento subseqüente do DNA de plasmídeo, conforme descrito no começo desse exemplo. A seqüência de DNA do cassete genético de TLPC foi elucidada por uso do oligodesoxinucleotídeo SEQID NO: 37 como um iniciador no sistema Analisador Genético automatizado (Applied Biosystems) de acordo com as instruções do fabricante empregando o kit Big Dye Terminator Cycle Sequencing (Applied Biosystems).

Seis sequências únicas de seis clones seqüênciados transportam uma inserção funcional. A seqüência com os melhores valores de ligação foi denominada S69.4 013. A seqüência de nucleotídeo desse clone foi traduzida em uma seqüência deaminoácido (SEQ ID NO: 12 na listagem de seqüência) e aqueles aminoácidos desviando do TLPC modificado codificado com pTLPC8 e o TLPC do tipo selvagem, respectivamente, são fornecidos na Tabela 1.0 clone S69.4 013 foi escolhido para a determinação de sua afinidade de ligação para rhuVEGF165 conforme descrito no Exemplo 6.

Tabela 1: Características de seqüência das muteínas de TLPC anti-rhuVEGF165 Pós Numeração de acor- Pós numeração de TLPC (4001) S69.4 013 do com TLPC do tipo acordo com o TLPC selvagem truncado usado se- qüencialmente 8 4 Glu Gly 9 5 Glu lie 10 6 lie Arg 11 7 Gin Arg 12 8 Asp Ser 13 9 Vai Met 43 39 Thr Leu 45 41 Glu Lys 47 43 Gly His 69 65° Glu Gly Pós Numeração de acor- Pós numeração de TLPC (4001) S69.4 013 do com TLPC do tipo acordo com o TLPC selvagem truncado usado se- qüencialmente 70 66 Lys Arg 72 68 Asp Lys 74 70 Pro Arg 75 71 Gly Lys 90 86 Arg Pro 92 88 His Ala 94 90 Lys Arg 97 93 Tyr Vai 0 Essa substituição de aminoácido surgiu da mutação acidental fora das posições aleatorizadas.

Exemplo 5: Produção da muteína do TLPC Para a produção de preparação de uma muteína S69.4 013 descrita no Exemplo 4, a cepa de £ coli K12, JM83 abrigando o vetor de expressão pTLPC8 {figura 8, SEQID NO: 24) codificando essa muteína foi usada para a produção periplasmática através da expressão do frasco de agitação em um volume de cultura apropriado do meio LB-amplicilina de acordo com o protocolo descrito em Schlehuber, S. e outros (J. Mol. Biol. (2000), 297,1105-1120).

Quando foram necessárias quantidades maiores de material a cepa E.coli K12, W3110 abrigando o vetor de expressão pTLPC8 codificando essa muteína foi usado para a produção periplasmática através do cultivo do fermen-tador em um bioreatorde 0,75 L ou 10 L com base no protocol descrito em S-chiweck, W., e Skerra, A. (Proteins (1995) 23,561-565). A fermentação foi realizada a 25°C. A concentração de oxigênio foi mantida a 30% de saturação. Em um biorreatorde 0,75 L, a saturação do oxigênio foi mantida a 30% através do controle da velocidade do agitador até 1.500 rpm. Em um reator de 10 litros, a velocidade do agitador foi mantida a 480 rpm, enquanto o fornecimento do ar e oxigênio puro foi automaticamente regulado. Na fase de batelada de alimentação, 50% peso/volume de glicose foi fornecido em escala, partindo de 17,5 mL/hora até 50 mL/hora em OD = 22,5. A muteína foi purificada da fração periplásmica em um protocolo cromatográfico de etapa simples com Strep-Tactin Superflow(IBA) usando uma coluna de volume de leito apropriado e equipamento adequado de acordo com as recomendações do fabricante. A filtração do gel foi realizada com material Superdex 75 (Amer-sham Pharmacia Biotech) usando uma coluna de volume de leito apropriado e equipamento adequado de acordo com as recomendações do fabricante. As frações monoméricas foram agrupadas e usadas para etapas de caracterização adicionais.

Exemplo 6: Medição da afinidade da muteína dos TLPCs para VEGF no ELISA A afinidade da muteína dos TLPCs para VEGF foi medida como se segue. Em resumo, uma diluição em série de uma muteína S69.4 013, obtida conforme descrito no Exemplo 1 foi testada em um ensaio ELISA para ligação ao rhuVEGF165 e proteína de controle BSA.

Para essa finalidade, as cavidades de uma placa de microtitulação preta Fluotrac 600 (Greiner; 384 cavidades) foram revestidos com 1 pg/mL rhu-VEGF165 (células de inseto) e 10 pg/mL BSA (Roth) O/N a 4°C e bloqueados com 2% peso/volume de BSA em PBST/0.1. Após a etapa de lavagem, uma etapa de bloqueio subseqüente com 3% em peso/volume de leite em pó em PBST e outra etapa de lavagem, uma diluição em série de uma muteína S69.4 013 em PBST cobrindo uma faixa de concentração apropriada foi incubada por 1 hora a temperatura ambiente nas cavidades revestidas e bloqueadas. A muteína ligada foi subseqüentemente detectada através do conjugado-HRP-anticorpo monoclonal anti-T7 e o substrato-HRP-fluorgênico QuantaBIu® conforme descrito acima. Após um tempo de incubação apropriado a temperatura ambiente, a fluorescência foi excitada em um comprimento de onda de 320 nm (± 12,5 nm) e medida a 430 nm (±17,5 nm) em um leitor de placa GENiosPlus. A curva foi ajustada por regressão de quadrados mínimos não linear com a ajuda do programa para computador Kaleidagraph (Synergy software) de acordo com a equação [P L]=([P]t[L]t)/(KD+[P]t). Pelo que [P]t é a concentração total de alvo imobilizado (em unidades de fluorescência relativas), [L]t é a concentração de muteína de TLPC aplicada, respectivamente, [P L] é a concentra- ção de complexo formado (nas unidades de fluorescência relativas, rFU), e KD é a constante de dissociação aparente.

As curvas de ligação resultantes versus rhuVEGFI 65 e BSA são ilustradas na figura 9. Os valores obtidos para as constantes de dissociação aparentes do complexo entre uma muteína do TLPC S69.4 013 e a proteína alvo prescrita rhuVEGFI 65 foram identificados como 109 ± 34 ηM (Tabela 2). Nenhuma atividade de ligação mensurável foi obtida para a proteína de controle BSA.

Tabela 2: Constantes de ligação por afinidade da muteína do TLPC e rhuVEGFI 65 Muteína do TLPC KnfnM] rhuVEGFI 65 KnínMIBSA VEGF S69.4-013 109 ±34 -* * Nenhuma atividade de ligação detectável.

Exemplo 7: Apresentação do fagomid e seleção das muteínas do TPLC contra o domínio extracelular de hCD22 humano empregando placas de múltiplas cavidades de poliestirol Para a seleção da muteína dos TLPCs, foi empregada a biblioteca de fagomid do Exemplo 1. A seleção da muteína dos TLPCs foi realizada conforme descrito no Exemplo 3. Os desvios do protocolo são descritos como se segue: antes da incubação com a proteína alvo, os fagomids da biblioteca foram incubados em cavidades de poliestirol bloqueados com BSA, duas vezes por 15 minutos cada, para o esgotamento dos fagomids apresentando muteínas de lipocalina desdobradas ou multireativas. O domínio extracelular de hCD22 (Peprotech EC LTD, UK) foi revestido nas placas de poliestirol com uma concentração de 5 pg/mL. Na primeira etapa de eluição os fagomids absorvidos foram tratados com 300 pL de 0,1 M de glicina/HC! pH 2,2 por respectiva cavidade por 10 minutos, seguido por neutralização imediata do pH de cada fração de eluição por adição de uma quantidade apropriada de 0,5M Tris. A etapa de eluição básica foi realizada com 300 pL de 70 mM de trietilamina por respectiva cavidade por 10 minutos seguido por neutralização imediata do pH de cada fração de eluição por adição de uma quantidade apropriada de 1M Tris/HCI, pH 7,4. Como uma etapa de eluição final, 300 pL desenvolveu exponencialmente XL1 blue (OD550 cerca de 5) foram transferidos em cada cavidade e incubados por 30 minutos a 37°C. Começando com 0 segundo ciclo de enriquecimento, apenas metade das soluções de fagomid combinadas foi usada para ampliação do fagomid, conforme descrito no Exemplo 3, Para a determinação da entrada do fagomid e do número de fagomids eluídos, uma titulação de mancha foi realizada após cada ciclo de seleção do fagomid usado para separação, a oitava fração de lavagem e os fagomids eluídos de acordo com Exemplo 3.

Três etapas de seleção adicional contra hCD22 foram realizadas desse modo, empregando a preparação dos fagomids ampliados a partir do respectivo ciclo de enriquecimento anterior, com a exceção de que apenas cerca de 1 x 1011 fagomids foram utilizados começando com 0 segundo ciclo de enriquecimento.

Exemplo 8: identificação das muteínas TLPC ligando hCD22 por uso de um método de classificação ELISA de alto rendimento Para a produção analítica das muteínas do TLPC ligando hCD22 equipada com marcador de detecção T7 de término C (Novagen) bem como um marcador de afinidade Strep-tag® II e sua caracterização por classificação ELISA de alto rendimento, 0 cassete genético contendo TLPC entre os dois sítios de divagem BsfXI foi subclonado do vetor pTLPC7 (figura 4) no vetor pTLPC8 (figura 8). As muteínas do TLPC ligando hCD22 foram identificadas por um método de classificação ELISA de alto rendimento descrito no Exemplo 4. As muteínas do TLPC que ligaram hCD22 especificamente em uma classificação primária foram selecionadas para análise de ligação mais detalhada em um experimento de classificação ELISA de alto rendimento secundário, conforme descrito no Exemplo 4.

Para a detecção da especificidade alvo da muteína dos TLPCs, as cavidades das placas de ELISA pretas Fluotrac 600 (Greiner; 384 cavidades) foram revestidas por toda a noite a 4°C com 20 pL de uma solução de hCD22 (5 pg/mL, Peprotech) ou como um controle, com hCD33-Fc(1 pg/mL, R&D Research), hlgG1 (10pg/nnL, Jackson ImmunoResearch), estreptactina (10 pg/mL, IBA), albumina de soro humano (HSA, 10 pg/mL, Sigma), bem como um conju- gado de RNase A (10pg/mL; RNase da Fluka) com digoxína.

Todas as muteínas do TLPC testadas especificamente ligaram hCD22 específico e a seqüência de nucleotídeo de seu cassete genético de TLPC foi determinada usando o oligodesoxinucleotídeo SEQ ID NO: 37 como um iniciador em um sistema automatizado Genetic Analyzer (Applied Biosystems) de acordo com as instruções do fabricante empregando o kit Big Dye Terminator Cycle Sequencing (Applied Biosystems). Todos os clones seqüên-ciados exibiram a mesma seqüência que o clone S76.1H10. A sequência de nucleotídeo desse clone, S76.1 H10, foi traduzida em seqüência de aminoácido e aqueles aminoácidos desviando-se do TLPC modificado codificado com TLPC 8 (figura 8) são fornecidos na Tabela 3. A seqüência de nucleotídeo do clone S76.1 h10 é também fornecida como SEQ ID NO: 13.

Tabela 3: Características de Seqüência da muteína antÍ-HCD22 selecionada Pós numeração de Pós numeração de acordo TLPC S76.1-H10 acordo com TLPC com TLPC truncado usado do tipo selvagem experimentalmente 8 4 Glu Arg 9 5 Glu Trp 10 6 lie Arg 11 7 Gin Vai 12 8 Asp Cys 13 9 Vai Trp 43 39 Thr Gin 45 41 Glu Asp 47 43 Gly Lys 70 66 Lys Leu 72 68 Asp Asn 74 70 Pro Gly 75 71 Gly Vai 90 86 Arg Pro 92 88 His Arg 94 90 Lys Ser 97 93 Tyr Phe Exemplo 9: Produção da muteína dos TLPCs Para a produção de preparação de uma muteína S76.1 H10, obtida do Exemplo 8, a região de codificação muíagenizada entre os dois sítios de divagem BstXI foi subclonada do vetor pTLPC7 (figura 4) no plasmídeo de expressão pTLPC8 (figura 8). O plasmídeo assim obtido codificou uma proteína de fusão da muteína com uma sequência de sinal OmpA e o marcador T7, bem como a Strep-tag® II no término C.

Colônias simples de E. co//'-JM83 e E. coí/-W3110, respectivamente, foram transformadas com o plasmídeo pTLPC8 codificando uma muteína do TLPC S76.1 H10. A expressão do frasco agitador, a fermentação de 1 litro, a cromatografia AS e a cromatografia de exclusão por tamanho foram realizadas conforme descrito no Exemplo 5. Foi verificado, que a muteína S76.1 H10 eíuiu da cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) em duas máximas distintas, contendo proteína monomérica e dimérica, respectivamente. A afinidade de ligação de ambas frações de proteína foi determinada em um ELISA.

Exemplo 10: Medição da afinidade da muteína dos TLPCs no ELISA

Uma diluição em série de uma muteína S76.1 H10, obtida conforme descrito no Exemplo 9, foi testada em um ensaio ELISA para ligação ao hCD22 revestido direto e as proteínas de controle hCD33-Fc, HAS, e hlgG1.

Para esse fim, as cavidades das placas ELISA pretas Fluotrac 600 ELISA (Greiner; 384 cavidades) foram revestidos com 20 pl de hCD22 (5 pg/mL, Peprotech) ou proteínas de controle hCD33-Fc (1 pg/mL, R&D Research), HSA (10 pg/mL, Sigma), hlgG1 (10 pg/mL, Jackson lmmunoResearch)0/N a4°C.

Após outra etapa de lavagem, a diluição em série da muteína S76.1 H10, obtida no Exemplo 9, em PBST cobrindo uma faixa de concentração apropriada foi adicionada ao hCD22 revestido e às proteínas de controle hCD33-Fc, HSA e hlgG1 e incubada por 1 hora a temperatura ambiente. A muteína ligada foi subsequentemente detectada através de um conjugado de Estreptactina-HRP (IBA) e o substrato de HRP fluorgênico QuantaBIu® (PIERCE) de acordo com as respectivas recomendações dos fabricantes. Após um tempo de incu- bação apropriado a temperatura ambiente, fluorescência foi excitada a um comprimento de onda de 320 nm (+ 12,e medida a 430 nm (± 17,5 nm) em um leitor de placa GENiosPlus. A curva foi ajustada por regressão de quadrados mínimos não linear com a ajuda do programa de computador Kaleidagraph (Synergy software) conforme descrito no Exemplo 6.

As curvas de ligação resultantes foram ilustradas na figura 10 e na figura 11. Os valores obtidos para as constantes de dissociação aparentes dos complexos entre uma muteína do TLPC e a proteína alvo hCD22 bem como complexos entre uma muteína dos TLPCs e as proteínas de controle hCD33-Fc (R&D Systems), lgG1 humano (Jackson lmmunoResearch)e uma albumina de soro humano (HSA, Sigma) são resumidos na tabela 4. Nenhuma atividade de ligação mensurável foi obtida para as proteínas de controle.

Tabela 4: Constantes de ligação por afinidade da muteína dos TLPCs Muteína do TLPC knínMlhCD22 kn [nM1hCD33-Fc kn fnMI hlqG1 kn [nMj HSA

Monômero CD22 101+3.3 -* -* -* 576.1 H10 DímeroCD22 1,4 ±0.13 -* -* -* 576.1 H10 * Nenhuma atividade de ligação detectável.

Exemplo 11: Apresentação do faqomid e seleção das muteínas do TPLC contra o domínio extracelular de CD25 humano empregando placas de múltiplas cavidades de poliestirol O alvo usado para a seleção das muteínas específicas de CD25 da biblioteca de fagomid conforme descrito no Exemplo 1 e a subseqüente caracterização dessas muteínas nos experimentos ELISA foi adquirido da R&D Systems (IL-2 R alfa / Fc quimera humana recombinante).

Para a seleção das muteínas do TLPC específicas para CD25 da biblioteca de fagomid conforme descrito no Exemplo 1, 5 etapas de seleção foram realizadas, onde o mAb de captura (IgG anti-humano de camundongo, Específico de Fragmento Fcgamai Jackson lmmunoResearch)foi revestido nas placas de poliestirol em uma concentração de 5 pg/mL. Após bloqueio com L 2,5% peso/volume de BSA em PBS, CD25-Fc em uma concentração de 5 pg/mL foi adicionado, incubado por uma hora a temperatura ambiente e usado para enriquecimento dos fagomids específicos para CD25. Os fagomids absorvidos foram eluídos sob condições de desnaturação com 0,1 M glicina/HCI pH 2,2, conforme descrito no Exemplo 3.

Exemplo 12: Identificação da muteína do TLPC ligando CD25 por uso de um método de classificação ELISA de alto rendimento Para a produção analítica da muteína dos TLPCs equipada com marcador de detecção T7 de término C (Novagen), bem como um marcador por afinidade de Strep-tag® II de término C e sua caracterização por classificação ELISA de alto rendimento, cassete genético entre os dois sítios de divagem SsfXI foi subclonado do vetor pTLPC7 (SEQ ID NO: 1; figura 4) no pTLPC8 (SEQ ID NO: 24; figura 8).

Para esse fim o DNA do plasmídeo foi isolado da mistura dos clones de E. coii obtidos por infecção com os fagomids do Exemplo 11 eluídos como um resultado do último ciclo de seleção. A classificação para muteínas especificas de CD25 foi realizada de acordo com o protocolo ELISA de alto rendimento descrito no Exemplo 4. Extratos de célula bruta foram testados quanto a ligação ao alvo específico CD25 (imobilizado para a placa de microti-tulação conforme descrito no Exemplo 11). Em paralelo, extratos de célula bruta foram testados quanto a ligação às proteínas não correlatas HSA, Globulina Gama Humana (Jackson ImmunoResearch) e mAb de captura, revestidas em concentrações de 10 pg/mL, 10 pg/mL e 5 pg/mL, respectivamente. Clones com propriedades de ligação específicas foram confirmados em um ensaio ELISA de alto rendimento secundário. Nesse ensaio, extratos brutos foram testados quanto a ligação às mesmas proteínas conforme usadas para a classificação primária e proteínas adicionais não correlatas (BSA, CD154 (Ligante sCD40 humano recombinante; Acris; Número do catálogo: PA151XC) e leite, revestidas em 10 pg/mL, 5 pg/mL e 3%, respectivamente). 12 clones com um sinal alto no alvo específico e sinais baixos nas proteínas não correlatas foram selecionados e a seqüência de nucleotídeo do cassete genético do TLPC foi determinada usando a oligodesoxinucleotídeo SEQID NO: 37 como iniciador em um sistema automatizado Genetic Analyzer (Applied Biosystems) de acordo com as instruções do fabricante empregando o Kit Big Dye Terminator Cycle Sequencing (Applied Biosystems). Foi verificado que uma muteína foi enriquecida durante o procedimento de seleção. A se-qüência de nucleotídeo desse clone, S67.7 C6, foi traduzida na seqüência de aminoácido e aqueles aminoácidos desviados do TLPC modificado codificado com pTLPC8 (SEQ ID NO: 24) são fornecidos na Tabela 5. A seqüência de nucleotídeo de S67.7 C6 é também fornecida como SEQ ID NO: 20.

Tabela 5: Características de seqüência da muteína do TLPC selecionada com especificidade para CD25 Pós numeração de Pós numeração de TLPC8 S67.7 C6 acordo com TLPC do acordo com o TLPC tipo selvagem truncado usado experimentalmente 8 4 Glu Vai 9 5 Glu Gly 10 6 lie Arg 11 7 Gin Arg 12 8 Asp Gly 13 9 Vai Leu 43 39 Thr Gly 45 41 Glu Ala 70 66 Lys Gly 72 68 Asp Asn 74 70 Pro Leu 75 71 Gly Asp 90 86 Arg His 94 90 Lys Thr 97 93 Tyr Leu Exemplo 13: Produção da muteína do TLPC

Para a produção de preparação da muteína S67.7 C6 descrito no Exemplo 12, a cepa K12 E. coli W3110 abriga o vetor de expressão pTLPC8 codificando essa muteína conforme usada para a produção periplasmática via cultivo do fermentador conforme descrito no Exemplo 5. A muteína foi purificada da fração periplásmica em um protocolo cromatográfico de etapa simples com material Strep-Tactin Superflow(IBA) usando uma coluna de volume de leito apropriado e equipamento apropriado de acordo com as recomendações do fabricante. A filtração com gel foi realizada com material Superdex 75 (Amer-sham Pharmacia Biotech) usando uma coluna de volume de leito apropriado e equipamento apropriado de acordo com as recomendações do fabricante. As frações monoméricas foram agrupadas e usadas para etapas de caracterização posteriores.

Exemplo 14: Medição da afinidade da muteína do TLPC para CD25 no ELISA A diluição em série da muteína S67.7 C6 obtida conforme descrito no Exemplo 13 foi testada em um ensaio ELISA para ligação ao CD25-Fc capturado e mAb de captura de proteínas de controle, HSA, FCS e fragmento IgG Fc humano capturado.

Para esse fim, as cavidades de uma placa de microtitulação preta Fluotrac 600 (Greiner; 384 cavidades) foram revestidos com o mAb de captura (IgG anti-humano de camundongo, Específico de Fragmento FCgama; Jackson ImmunoResearch) a uma concentração de 5 pg/mL por 1 hora a temperatura ambiente ou O/N a 4°C. Após uma etapa de lavagem e uma etapa de bloqueio subseqüente com 3% peso/volume de leite em pó em PBST, CD25-Fc a uma concentração de 5 pg/mL foi adicionado e incubado por uma hora a temperatura ambiente. Em paralelo, as proteínas de mAb de captura não correlatas, HSA e FCS (Soro bovino fetal; ínvitrogen) foram revestidas em concentrações de 5 pg/mL, 10 pg/mL e 10 pg/mL, respectivamente. Posteriormente, fragmento de IgG Fc (Accurate Chemical) foi capturado a uma concentração de 5 pg/mL via o mAb de captura revestido a 5 pg/mL.

Após outra etapa de lavagem, a diluição em série da muteína S67.7 C6 em PBST cobrindo uma faixa de concentração apropriada foi adicionada ao CD25-Fc capturado e o mAb de captura das proteínas de controle, HSA, FCS e fragmento IgG Fc humano capturado e incubada por 1 hora a temperatura am- biente. A muteína ligada foi subseqüentemente detectada via conjugado de Es-treptactina-HRP (IBA)e o substrato de HRP fluorgênico QuantaBIu® (PIERCE) de acordo com as respectivas instruções dos fabricantes. Após um tempo de incubação apropriado a temperatura ambiente, a fluorescência foi excitada em um comprimento de onda de 320 nm (± 12,5 nm) e medida a 430 nm (± 17,5 nm) em um leitor de placa GENiosPlus. A curva foi ajustada por regressão de quadrados mínimos não linear com a ajuda do programa de computador Kaleidagraph (Synergy software) conforme descrito no Exemplo 6.

As curvas de ligação resultantes versus CD25-Fc capturado e mAb de captura são ilustradas na figura 12.0 valor obtido para a constante de dissociação aparente do complexo entre a muteína do TLPC S67.7 C6 e a proteína alvo prescrita CD25-Fc é resumido na Tabela 6. Nenhuma atividade de ligação mensurável foi obtida para mAb de captura de proteínas de controle, HSA, FCS e fragmento IgG Fc humano capturado.

Tabela 6: Constante de ligação por afinidade entre a muteína do TLPC e CD25-Fc Muteína do TLPC Kn fnMI CD25-Fc S67.7C6 1178 ±228 Exemplo 15: Geração de uma linhagem de célula CHO expressando CD25 humano Para a geração da linhagem de célula estável expressando células CHO-K1 e CD25 humano (DSMZ, No. ACC 110) foram transfectadas com o vetor de expressão CD25-pcDNA3.1Zeo(+) (SEQ ID NO:10; figura 13) codificando CD25 humano (NCBI, Número de Acesso 000417 [gi:4557666]). O vetor de expressão CD25-pcDNA3.1Zeo(+) foi obtido conforme descrito a seguir. A seqüência de codificação completa do CD25 humano foi ampliada do cDNA de Linfócitos do Sangue Periférico humano por PCR usando o iniciador a frente SEQ ID NO:35 e iniciador reverso SEQ ID NO:36.0 produto PCR codificando a proteína de comprimento pleno incluindo o peptídeo de sinal foi ligado ao vetor de clonagem pCR-Bluntll-TOPO (Invitrogen) de acordo com as recomendações do fabricante. O cDNA de DC25 foi excisado do vetor resul- tante por digestão de restrição de Xho\IHind\\\ e isolado por eletroforese de gel agarose conforme descrito em Sambrook e outros, {supra). O fragmento foi purificado (Kit de Limpeza SV Wizard, Promega) e ligado ao vetor de expressão pcDNA3.1Zeo(+) (Invitrogen) que foi linearizado com as mesmas enzimas de restrição. E. coli XL1 -Blue foi transformado com o vetor de expressão resultante (CD25-pcDNA3.1Zeo(+)) e o DNA foi extraído e purificado usando o Kit Endo-Free Plasmid Maxi (Qiagen). 400.000 células CHO-K1 (DSMZ, número de acesso 110) cresceram a 37°C em um meio DMEM Glutamax I (Gibco) contendo 10% (v/v) FCS e 5% de CO2 foram colocados em placa em placas de 3,5 cm e foram transfecta-dos no dia seguinte usando 4 pg de DNA de plasmídeo e 10 pL de Lipofectami-na 2000 (Invitrogen) de acordo com as recomendações do fabricante. As células foram tanto transfectadas com CD25-pcDNA3.1Zeo(+) quanto com pcD-NA3.1Zeo(+) como controle. Um dia após, as células foram tripsinizadas e transferidas para cinco placas de 9,5 cm. No dia seguinte, a seleção iniciou por adição de 200 pg de Zeocina por mL de meio. Após uma semana, os clones resistentes a Zeocina foram transferidos para placas de 24 cavidades e subsequentemente cultivados em frascos de cultura T25 (Greiner). A expressão de CD25 dos vários clones foi analisada por análise FACS conforme descrito no Exemplo 16. Os clones exibindo a maior expressão foram mantidos, os estoques foram congelados e ensaios adicionais foram realizados com essas linhagens de células até a passagem número 30.

Exemplo 16: Teste da muteína do TLPC quanto a ligação específica a uma linhagem de célula CHO expressando CD25 humano A muteína S67.7 C6 foi testada quanto a ligação específica a uma linhagem de célula CHO expressando CD25 humano em um ensaio de citome-tria de fluxo. Para esse fim, as células CHO transfectadas CD25-pcDNA3.1Zeo(+)- ou pcDNA3.1Zeo(+)- descritas no Exemplo 15 foram destacadas dos frascos de cultura com 0,2% peso/volume de EDTA. Aproximadamente 200.000 células foram ressuspensas em 30 μΙ de PBS/2% v/v FCS e incubadas com 10 pg de S67.7 C6 obtidos conforme descrito no Exemplo 13 e marcados com fluoresceína (éster N-succinidilila do ácido fluorescein-5(6)- carboxamido capróico; Fluka) a uma razão equimolar com base no protocolo descrito em Schlehuber e Skerra {Βίοι Chem. (2001) 382,1335-1342). Como um controle negativo, 10 pg do recombinante de TLPC do tipo selvagem codificado com pTLPC8 e marcado com fíuoresceína em uma razão equimolar foram empregados. A expressão de CD25 foi confirmada com mAb anti-CD25 marcado com FITC (Acris, DM519F), usando lgG1 marcado com FITC (Acris, SM10F) como controle de isotipo. Após 30 minutos de incubação no gelo, as células foram lavadas duas vezes com PBS/2% v/v FCS, antes da análise por citome-tria de fluxo usando um FACSCalibur (Becton Dickinson).

Ambos a muteína específica para CD25, S67.7 C6 e mAb específico para CD25 mostram coloração significativa da linhagem de célula CHO expressando CD25 humano, enquanto nenhuma coloração significativa ocorre na linhagem de célula CHO transfectada de imitação. O TLPC do tipo selvagem e IGG1 de controle não mostram ligação significativa à ambas as linhagens de células testadas. Os histogramas obtidos são ilustrados na figura 14.

Exemplo 17: Geração de uma biblioteca de PCR propensa a erro para maturação por afinidade de uma muteína do TLPC específica para CD25 A muteína específica para CD25, S67.7-C06 descrita no Exemplo 12 foi empregada para um procedimento de maturação por afinidade. Portanto, uma segunda biblioteca de geração foi preparada, com base na muteína S67.7-C06, por emprego de um protocolo de PCR propenso a erro. Essa biblioteca, já tendo imprimido a informação de ligação para CD25, foi preparada empregando os análogos de nucleotídeo 8-oxodGTP e dPTP (TEBU-Bio) de acordo com o método descrito na literatura (Zaccolo e outros, (1996) J. Mol. Biol. 255,589603). Para a reação de ampliação propensa a erro, os oligonucleotideos biotini-lados 5'SEQ ID NO: 7 e SEQID NO: 8 foram usados em conjunto com os análogos de nucleotídeo. Uma vez que esses olígodesoxinucleotídeos estão flan-queando os sítios de restrição BsfXI, a ampliação resultou em mutações de i ponto distribuídas aleatoriamente sobre o cassete genético de SsfXI, que compreende a maior parte do gene estrutural da muteína do TLPC. O produto de PCR foi purificado usando o Gel SV Wizard e o Sistema de Limpeza de PCR (Promega) e para fins de clonagem, esse fragmento representando a biblioteca maturada por afinidade das muteínas do TLPC na forma de ácido nucléico foi primeiro cortado com a enzima de restrição BstXI (Promega) de acordo com as instruções do fabricante e então purificado conforme descrito acima, resultando em um fragmento de DNA de duplo filamento de 303 nucleotídeos de comprimento. Os fragmentos de DNA não digeridos ou incompletamente digeridos foram removidos através dos marcadores de biotina 5’ usando microesferas para magnéticas revestidas com estreptavidina (Merck) conforme descrito no Exemplo 1.

Para ligação subsequente das muteínas maturadas por afinidade a partir do acima, um fragmento 3907 foi preparado e purificado do DNA do vetor pTLPC7 (figura 4) conforme descrito no Exemplo 1. Para a reação de ligação, 3,32 pg (15 pmoles) do fragmento de PCR e 38,7 pg (15 pmoles) do fragmento de vetor foram incubados na presença de 420 Unidades Weiss de T4 DNA liga-se (Promega) em um volume total de 4200 pl (50 mM de Tris/HCI pH 7,8,10 mMde MgCI2,10mMde DTT, 1 mM deATP, 50 pg/mLde BSA)por48 horas a 16°C. O DNA na mistura de ligação foi então precipitado por adição de 105 pl de tRNA de levedura (10 mg/mL de solução em H2O (Roche)), 4200 pl 5 M de acetato de amônio e 16,8 mL de etanol. Processamento adicional foi realizado, de acordo com exemplo 1 e ao final 0 DNA foi dissolvido a uma concentração final de 200 pg/mL em um volume total de 210 pl de água. A preparação e transformação do £ co//XL1-Blue eletrocompetente (Bullock e outros, supra) foi realizada de acordo com Exemplo 1. Empregando-se um total de 42 pg de DNA ligados, cerca de 2,6 x 109 transformantes foram obtidos no total de 21 operações de eletroporação. Os transformantes foram usados adicionalmente para preparação dos fagomids conforme descrito no Exemplo 7 do pedido PCT WO 03/029471.

Exemplo 18: Apresentação do fapomid e seleção das muteínas do TPLC específicas para CD25 aperfeiçoadas por afinidade empregando 1 placas de múltiplas cavidades de poliestirol Para a seleção das muteínas do TPLC específicas para CD25 aperfeiçoadas por afinidade a partir da biblioteca descrita no Exemplo 17,3 etapas de seleção foram realizadas com 2 estratégias diferentes (seleção da estratégia A e B, respectivamente) de acordo com o método geral descrito no Exemplo 3. Os desvios do protocolo são descritos a seguir. Antes da incubação com a proteína alvo, os fagomids da biblioteca foram incubados nas cavidades de polies-tirol bloqueados com BSA, 2 vezes por 15 minutos cada, para esgotamento dos fagomids apresentando muteínas multireativas ou de lipocalina desdobrada. O mAb de captura (IgG Anti-Humano de Camundongo, Específico de Fragmento Fcgarra; Jackson ImmunoResearch) foi revestido nas placas de poliestirol a uma concentração de 5 pg/mL. Após bloqueio com 2,5% pe-so/volume de BSA em PBS, CD25-Fc a uma concentração de 0,063 pg/mL (estratégia de seleção A) ou 0,016 pg/mL (estratégia de seleção B) foi adicionado e incubado por uma hora a temperatura ambiente. Os fagomids absorvidos foram eluídos sob condições de desnaturação e por competição usando a cepa bacteriana XL1 blue conforme descrito no Exemplo 7. No primeiro, segundo e terceiro ciclos de seleção, cercade2x1011,1x1011 e 1 x 1010 fagomids foram usados como insumo para o processo de enriquecimento; e 8,10 e 12 ciclos de lavagem foram realizados, respectivamente. A ampliação dos fagomids foi realizada conforme descrito no Exemplo 3, exceto que os fagomids foram incubados a 22°C ao invés de 26°C.

Exemplo 19: Identificação das muteínas de TLPC específicas para CD25 aperfeiçoadas por afinidade por uso de método de classificação de colônia Para a produção analítica da muteína dos TLPCs, proteínas de fusão com o Strep-tag® II e um domínio de ligação de albumina (ABD) e sua caracterização por classificação de colônia, o cassete genético entre os dois sítios de divagem BsfXI foi subclonado do vetor de fagomid pTLPC7 (SEQID NO: 1; figura 4) no pTLPC9 (SEQ ID NO:22; figura 15).

Para esse fim o DNA do plasmídeo foi isolado da mistura dos clones de E. coli obtidos por infecção com os fagomids da estratégia de seleção do Exemplo 18 eluídos como um resultado do último ciclo de seleção. Após subcíonagem do cassete genético no vetor de classificação pTLPC9 e transformação das células E, coli K12 TG1-F', a classificação das muteínas específi- cas para CD25 aperfeiçoadas por afinidade foi realizada através do método de classificação de colônia intercalada no filtro, com base no protocolo descrito em Schlehuber, S. e outros, {supra).

Uma coleção de clones simples obtidos de culturas O/N em placas de microtitulação de 384 cavidades foi colorida em duplicadas em um padrão idêntico sobre 6 membranas de PVDF hidrófilas, depositadas sobre as placas de ágar LB/Amp, por meio de um cabeçote de 384 pinos (Genetix). Após crescimento por 4 horas a 37°C, seguido por outra etapa de incubação por 2 horas a 22°C, as membranas hidrófilas foram colocadas sobre a parte superior das placas de ágar LB/Amp contendo 200 pg/L de aTc. As placas de cultura foram incubadas com uma pilha de membranas O/N a 22°C. Durante essa fase, as respectivas muteínas do TLPC foram liberadas das colônias sobre as membranas superiores e foram imobilizadas através de seu domínio de ligação de al-bumina ao HSA sobre as membranas inferiores.

Para a identificação das muteínas específicas de CD25 aperfeiçoadas por afinidade, as membranas hidrófobas foram classificadas em paralelo com 5 concentrações diferentes de CD25-Fc (10 nM, 3 nM, 1 nM, 0,3 nM e 0,1 nM). Os complexos de muteína/CD25-Fc foram detectados através de conjugado de IgG anti-humano-Fc-HRP (IgG anti-humano de cabra conjugado com pe-roxidase, Específico de Fragmento FCgamal Jackson ImmunoResearch) e o kit de substrato de DAB cromogênico para peroxidase (Vector Laboratories) de acordo com as respectivas recomendações do fabricante. Em paralelo, a expressão da muteína foi monitorada através de conjugado de Estreptactina-HRP (IBA) e do kit de substrato DAB de acordo com as respectivas recomendações do fabricante.

Um total de 9 clones da estratégia de seleção B com o sinal mais alto na concentração mais baixa de CD25-Fc foi selecionado e a sequência de nucleotídeo do respectivo cassete genético de TLPC foi determinada usando um oligodesoxinucleotídeo SEQID NO: 37 como iniciadorem um sistema automatizado Genetic Analyzer (Applied Biosystems) de acordo com as instruções do fabricante empregando o Kit Big Dye Terminator Cycle Sequencing (Applied Biosystems). Oito muteínas únicas contendo a inserção funcional foram identifi- cadas. Dessas 1 clone foi selecionado para caracterização adicional. A sequência de nucleotídeo desse clone, F92.8 M1,2 E15, foi traduzida em uma sequência de aminoácido e aqueles aminoácidos desviados do TLPC modificado codificados com pTLPC9 (SEQID NO: 22) são fornecidos na Tabela 7. A seqüência de nucleotídeo do clone F92.8 M1.2 E15 é também fornecida como SEQ ID NO: 21.

Tabela 7: Características de seqüência da muteína do TLPC selecionada com afinidade aperfeiçoada para CD25 Pós numeração de Pós numeração de TLPC9 F92.8 M1.2 E15 acordo com TLPC do acordo com TLPC tipo selvagem truncado usado experimentalmente 8 4 Glu Vai 9 5 Glu Gly 10 6 lie Arg 11 7 Gin Arg 12 8 Asp Gly 13 9 Vai Leu 24 19 Thr Ala 43 39 Thr Gly 45 41 Glu Ala 50 46 Glu Gly 51 47 Ala Vai 70 66 Lys Gly 72 68 Asp Asn 74 70 Pro Leu 75 71 Gly Asp 90 86 Arg His 94 90 Lys Thr 97 93 Tyr Leu 99 95 Phe Leu Conforme pode ser visto da Tabela 7, a muteína de CD25 F92.8 M1.2 E15 porta mutações de aminoácido em comparação ao TLPC do tipo selvagem nas posições de estrutura 23,50, e 51.

Exemplo 20: Produção da muteína de TLPC aperfeiçoada por afinidade selecionada pelo método de classificação de colônia Para a produção de preparação da muteína F92.8 M1.2 E15 descrita no Exemplo 19, a cepa K12 de E. coli W3110 abriga o vetor de expressão pTLPC9 codificando essa muteína conforme usada para a produção periplas-mática através de cultivo do fermentador conforme descrito no Exemplo 5. A muteína foi purificada da fração periplásmica em um protocolo cromatográfico de etapa simples com material Strep-Tactin Superflow (IBA) usando uma coluna de volume de leito apropriado e equipamento apropriado de acordo com as recomendações do fabricante. A filtração com gel foi realizada com material Superdex 75 (Amer-sham Pharmacia Biotech) usando uma coluna de volume de leito apropriado e equipamento apropriado de acordo com as recomendações do fabricante. Foi verificado, que a muteína F92.8 M1.2 E15 eluiu da coluna de exclusão de tamanho em duas máximas distintas, contendo proteína monomértca e dimérica, respectivamente. As frações monomérica e dimérica foram agrupadas e usadas para as respectivas etapas de caracterização.

Exemplo 21: Medição da afinidade da muteína do TLPC de afinidade aperfeiçoada para CD25 no ELISA A diluição em série das frações monoméricas e diméricasda muteína F92.8 M1.2 E15 obtida conforme descrito no Exemplo 20 foi testada em um ensaio ELISA para ligação ao CD25-Fc capturado e o mAb de captura de proteínas de controle, HSA, FCS e fragmento IgG Fc humano capturado. O ensaio foi realizado conforme descrito no Exemplo 14, exceto que 2,5 pg/mL CD25-Fc e 2,5 pg/mL de fragmento IgG Fc humano foram usados para captura.

As curvas de ligação resultantes versus CD25-Fc capturado e mAb de captura são ilustradas na figura 16 e figura 17, respectivamente. Os valores obtidos para as constantes de dissociação aparentes do complexo entre o mo-nômero ou dímero da muteína do TLPC F92.8 M1.2 E15 e a proteína alvo prescrita CD25-Fc são resumidos na Tabela 8. Nenhuma atividade de ligação mensurável foi obtida para mAb de captura de proteínas de controle, HSA, FCS e fragmento IgG Fc humano capturado.

Tabela 8: Constantes de ligação por afinidade entre a muteína do TLPC aperfeiçoada por afinidade e CD25-Fc Muteína do TLPC Kn ínMl CD25-Fc Monômero F92.8 M1.2 E15 131+34 DimeroF92.8M1.2E15 6 + 1,8 Exemplo 22: Geração de uma linhagem de célula CHO expressando CD154 humano Para a geração de um CD154 humano expressando linhagem de célula estável, células CH0-K1 (DSMZ, número de acesso 110) foram transfec-tadas com o vetor de expressão CD154-pcDNA3.1 Zeo(+) (SEQID NO:11; figura 18) codificando CD154 humano (NCBI acesso número BC_074950 [gi:49902361]). O vetor de expressão CD154 pcDNA3.1 Zeo(+) foi obtido conforme descrito a seguir. Foi obtida a codificação de DNA para CD154 humano (NCBI, número de acesso BC_074950 [gi:49902361]) a partir de um vetor pLXSN (BD Biosciences Clontech) onde CD154 foi subclonado. A sequência correta para o cDNA completo foi confirmada porseqüênciamento do plasmídeo empregando os oligonucleotídeos SEQ ID NO: 38 e SEQ ID NO: 39. 0 fragmento de DNA codificando a sequência completa do CD154 humano foi excisado do vetor através de digestão de restrição com Xho\IApa\ e isolado por eletroforese de gel agarose conforme descrito em Sambrook e outros, {supra). O fragmento foi purificado (Wizard SV Clean Up Kit, Promega) e ligado ao vetor de expressão pcDNA3.1Zeo(+) (Invitrogen) que foi íinearizado com as mesmas enzimas de restrição. Bactérias XL1-Biue foram transformadas com vetor de expressão CD154- pcDNA3.1Zeo(+)resultante e o DNA foi extraído e purificado usando o Kit EndoFree Piasmid Maxi (Qiagen). O crescimento e transfecção das células CHO-K1 (DSMZ, No. ACC 110) com o vetor de expressão CD154-pcDNA3.1 Zeo(+) foi realizada com base no protocolo descrito no Exemplo 15. A expressão de CD154 de vários clones foi analisada por análise FACS conforme descrito no Exemplo 23. Os clones exibindo a expressão mais alta foram usados para todos os ensaios até a passagem de número 30.

Exemplo 23: Teste de muteína do TLPC aperfeiçoada por afinidade para ligação específica ao CD25 humano expressando linhagem de célula CHO A muteína F92.8 M1.2 E15 foi testada quanto a ligação específica a um CD25 humano expressando linhagem de célula CHO em um ensaio de ci-tometria. Para esse fim, as células CHOtransfectadas CD25-pcDNA3.1 Zeo(+)-ou CD154-pcDNA3.1 Zeo(+)- descritas nos Exemplos 15 e 22, respectivamente foram destacadas dos fracos de cultura com 0,2% peso/volume de EDTA. Cerca de 200.000 células foram ressuspensas em 30 μι. de PBS/2% v/v FCS e incubadas com 2,5 pg de fração F92.8 M1.2 E15 monomérica obtida conforme descrito no Exemplo 20 e marcadas em uma razão molar de dobramento duplo com fluoresceína (éster N-succinimidila do ácido fluorescein-5(6)-carboxamido capróico; Fluka) com base no protocolo descrito em Schlehuber e Skerra (supra). Como um controle negativo, 2,5 pg do recombinante de TLPC do tipo selvagem codificado com pTLPC8 e marcado com fluoresceína em uma razão molar de dobramento duplo foram empregados. A expressão de CD25 foi confirmada com mAb anti-CD25 marcado com FITC (Acris, DM519F), usando lgG1 marcado com FITC (Acris, SM10F) como controle de isotipo. Após 30 minutos de incubação no gelo, as células foram lavadas duas vezes com PBS/2% v/v FCS, antes da análise por citometria de fluxo usando um FACSCalibur (Becton Dickinson).

Ambos a muteína específica para CD25 aperfeiçoada por afinidade F92.8 M1.2. E15 e mAb específico para CD25 mostram coloração significativa da linhagem de célula CHO expressando CD25 humano, enquanto nenhuma coloração significativa ocorre na linhagem de célula CHO expressando CD154 humano. O TLPC do tipo selvagem e IGG1 de controle não mostram ligação significativa à ambas as linhagens de células testadas. Os histogramas obtidos são ilustrados na figura 19.

Exemplo 24: Identificação das muteínas do TLPC ligando CD25 aperfeiçoadas por afinidade por uso de um método de classificação ELISA de alto rendimento Para a produção analítica da muteína do TLPCs de afinidade aper- feiçoada, equipada com marcador de detecção T7 de término C (Novagen), bem como um marcador por afinidade de Strep-tag® II de término C e sua caracterização por classificação ELISA de alto rendimento, o cassete genético entre os dois sítios de divagem BstXI foi subclonado do vetor pTLPC7 (figura 4) no pTLPC8 (figura 8).

Para esse fim o DNA do plasmídeo foi isolado da mistura dos clones de E. coli obtidos por infecção com os fagomids do Exemplo 11 eluídos como um resultado do último ciclo de seleção. A classificação para muteínas especificas de CD25 foi realizada de acordo com o protocolo ELISA de alto rendimento descrito no Exemplo 4. Extratos de célula bruta foram testados quanto a ligação ao CD25-Fc capturado em concentrações diferentes (5 pg/mL, 1 pg/mL, 0,2 pg/mL, 0,04 pg/mL e 0,008 pg/mL, respectivamente), Em paralelo, extratos de célula bruta foram testados quanto a ligação ao fragmento IgG Fc humano (Accurate Chemical) capturado em uma concentração de 5 pg/mL através do mAb de captura que foi revestido a 5 pg/mL. Clones mostrando propriedades de ligação específicas e retendo sinais altos nas concentrações alvo mais baias foram confirmados em um ELISA de alto rendimento secundário. Nesse ensaio, os extratos brutos foram testados quanto a ligação ao CD25-Fc capturado em 1 pg/mL e 0,1 pg/mL. Posteriormente, extratos brutos foram testados quanto a ligação às proteínas não correlatas mAb de captura, HSA, CD154 e Globulina Gama Humana (Jackson ImmunoResearch), revestidas a 5 pg/mL, 10 pg/mL, 5 pg/mL e 10 pg/mL, respectivamente.

Um total de 13 clones de ambas estratégias de seleção que promovem um sinal alto nas concentrações mais baixas de CD25-Fc capturado e sinais baixos nas proteínas não correlatas foi selecionado e a sequência de nu-cleotídeo do respectivo cassete genético de TLPC foi determinada usando a oligodesoxinucleotídeo SEQID NO: 37 como iniciadorem um sistema automatizado Genetic Analyzer (Applied Biosystems) de acordo com as instruções do fabricante empregando o Kit Big Dye Terminator Cycle Sequencing (Applied Biosystems). Sete muteínas únicas contendo uma inserção funcional foram identificadas. Dessas 3 clones foram selecionados para caracterização adicional. A sequência de nucleotídeo desses clones, S99.3 H24 e S99.3 C13 deriva- dos da estratégia de seleção A e S99.4 F15 obtido da estratégia de seleção B, foi traduzida em uma sequência de aminoácido e aqueles amtnoácidos desviados do TLPC modificado codificados com pTLPC8 (SEQID NO: 24) são fornecidos na Tabela 9. A seqüência de nucleotídeo dos clones S99.3 H24, S99.3 C13 eS99.4F15 é também fornecida como SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 19, respectivamente.

Tabela 9: Características da seqüência das muteínas do TLPC selecionadas com afinidade aperfeiçoada para CD25 Pós numeração Pós numeração TLPC8 S99.3 H24 S99.3 C13 S99.4 F15 de acordo com de acordo com TLPC do tipo TLPC truncado selvagem usado experimentalmente 8 4 Glu Vai Vai Vai 9 5 Glu Gly Gly Gly 10 6 lie Lys Arg Arg 11 7 Gin Arg Arg Arg 12 8 Asp Gly Gly Gly 13 9 Vai Leu Leu Leu 28 24 Phe Phe Ser Ser 32 28 Asn Asp Asn Asn 43 39 Thr Gly Gly Gly 45 41 Glu Ala Ala Ala 67 63 Vai Vai Ala Vai 70 66 Lys Gly Gly Gly 72 68 Asp Asn Asn Asn 74 70 Pro Leu Leu Leu 75 71 Gly Asp Asp Asp 86 82 Ala Ala Vai Ala 90 86 Arg His His His 91 87 Ser Pro Pro Pro 94 90 Lys Thr Thr Thr 97 93 Tyr Leu Leu Leu Como pode ser visto da Tabela 9, a muteína dos TLPCs identificada da maturação por afinidade continha não apenas mutações no sítio de ligação na extremidade fechada da estrutura de corpo β, porém também mutações nos segmentos de peptídeo formando a bolsa de ligação de lipocalina natural (aqui resíduos 28,32 da alça de peptídeo AB) e nas posições da região de estrutura (posições 67 e 86 da sequência de TLPC, respectivamente).

Exemplo 25: Produção da muteína do TLPC aperfeiçoada por afinidade selecionada por método de classificação ELISA de alto rendimento Para a produção da preparação das muteínas S99.3 H24, S99.3 C13 e S99.4 F15 descritas no Exemplo 24, a cepa K12 de £ co/f W3110 abriga o vetor de expressão pTLPC8 codificando essas muteínas conforme usadas para a produção periplasmática através do cultivo do fermentador conforme descrito no Exemplo 5. A muteína foi purificada da fração periplásmica em um protocolo cromatográfico de etapa simples com material Strep-Tactin Superflow (IBA) usando uma coluna de volume de leito apropriado e equipamento apropriado de acordo com as recomendações do fabricante. A filtração com gel foi realizada com material Superdex 75 (Amer-sham Pharmacia Biotech) usando uma coluna de volume de leito apropriado e equipamento apropriado de acordo com as recomendações do fabricante. As frações monoméricas foram agrupadas e usadas para etapas de caracterização adicionais.

Exemplo 26: Medição da afinidade da muteína do TLPC aperfeiçoada por afinidade para CD25 no ELISA A diluição em série da muteínas S99.3 H24, S99.3 C13 e S99.4 F15 obtidas conforme descrito no Exemplo 25 foi testada em um ensaio ELISA para ligação ao CD25-Fc capturado e mAb de captura das proteínas de controle HSA, FCS e fragmento IgG Fc humano capturado. O ensaio foi realizado conforme descrito no Exemplo 14, exceto que 2,5 pg/mL de CD25-Fc e 2,5 pg/mL de fragmento IgG Fc humano foram usados para captura.

As curvas de ligação resultantes versus CD25-Fc capturado e mAb de captura são ilustradas na figura 20. Os valores obtidos para as constantes de dissociação aparentes do complexo entre a muteína dos TLPCs S99.3 H24, S99.3 C13 e S99.4 F15 e a proteína alvo prescrita CD25-Fc são resumidos na Tabela 10. Nenhuma atividade de íigação mensurável foi obtida para mAb de captura de proteínas de controle, HSA, FCS e fragmento IgG Fc humano capturado.

Tabela 10: Constantes de ligação por afinidade entre as muteínas do TLPC aperfeiçoadas por afinidade e CD25-Fc Muteína do TLPC Kn fnMI CD25-Fc S99.3 H24 302 + 46 S99.3C13 307 + 43 S99.4F15 22 ±2,4 Exemplo 27: Apresentação do fagomid e seleção das muteínas do TPLC contra o domínio extracelular de CD33-Fc humano empregando placas de múltiplas cavidades de poliestirol e microesferas magnéticas A de proteína.

Para a seleção da muteína dos TLPCs foi usada a biblioteca de fagomid, conforme descrito no Exemplo 2. A seieção da muteína dos TLPCs empregando placas de múltiplas cavidades de poliestirol foi realizada conforme descrito no Exemplo 3. Os desvios do protocolo são descritos no Exemplo 7.0 alvo hCD33-Fc (R&D Research) foi revestido diretamente nas placas de poliestirol com uma concentração de 1 pg/mL. A seleção da muteína dos TLPCs foi realizada empregando microesferas de proteína A (Dynabeads Protein A, Dynal) seguindo essencialmente as instruções do fabricante. BSA foi escolhido como agente de bloqueio para fagomids e alvo. Os fagomids foram eluídos sob condições ácidas (0,1 M glici-na/HCI pH 2,2; 10 minutos a temperatura ambiente; neutralização com 0.5 M Tris-base) e ou condições básicas (70 mM de trietilamina; 10 minutos a temperatura ambiente; neutralização com 1 M de Tris/HCI, pH 7,4) seguido por uma etapa de eluição bacteriana final, conforme descrito no Exemplo 7.

Os desvios do protocolo são descritos no Exemplo 7 com a exceção, que antes da incubação com a proteína alvo, os fagomids da biblioteca foram incubados com 100 μΙ de microesferas de proteína A bloqueadas com BSA, 2 vezes por 15 minutos cada, para o esgotamento dos fagomids apresentando muteínas multireativas ou muteínas de lipocalina desdobradas.

Quatro etapas para seleção contra hCD33~Fc foram realizadas desse modo empregando a preparação de fagomids ampliados do respectivo ciclo de enriquecimento anterior com a exceção de que apenas cerca de 1 1Q11 fagomids foram utilizados começando com o segundo ciclo.

Exemplo 28: Identificação das muteínas do TLPC ligando hCD33 por uso de um método de classificação ELISA de alto rendimento Para a produção analítica das muteínas do TLPC ligando hCD33 equipadas com marcador de detecção T7 de término N (Novagen) bem como um marcador de afinidade Strep-tag® II no término C e sua caracterização por classificação ELISA de alto rendimento, o cassete genético contendo o TLPC entre os dois sítios de divagem SsfXI foi subclonado do vetor pTLPC12 (figura 7) no vetor pTLPC14 (figura 12). As muteínas do TLPC ligando hCD33 foram identificadas por um método de classificação ELISA de alto rendimento descrito no Exemplo 4. As muteínas do TLPC que ligaram hCD33 especificamente em uma classificação primária foram selecionadas para análise de ligação mais detalhada em um experimento de classificação ELISA de alto rendimento secundário, conforme descrito no mesmo exemplo.

Para a detecção da especificidade alvo das muteínas do TLPC re-combinantes, as cavidades das placas de ELISA pretas Fluotrac 600 (Greiner; 384 cavidades) foram revestidos por toda a noite a 4°C com 20 pL de uma solução de AffiniPure IgG Anti-Humano de Camundongo Fc Gama anticorpo específico para fragmento (5 pg/mL, Jackson ImmonoResearch) e como um controle, com hCD22 (5 pg/mL, Peprotech), hlgG1 (10 pg/mL, Jackson ImmunoResear-ch), estreptactina (10 pg/mL, IBA), albumina de soro humano (HSA, 10 pg/mL, Sigma), bem como um conjugado de RNase A (10 pg/mL; RNase da Fluka) com digoxina. O alvo hCD33-Fc foi capturado através do anticorpo específico para fragmento FcGama de IgG anti-humano por 1 hora a temperatura ambiente.

Muteínas do TLPC múltiplas voltaram-se para fora para ligar hCD33-Fc específico e uma seqüência de nucleotídeo do cassete genético do TLPC foi determinada para vários clones usando um oligodesoxinucieotídeo SEQID NO: 37 como um iniciador no sistema automatizado Genetic Analyzer (Applied Biosystems) de acordo com as instruções do fabricante empregando o Kit Big Dye Terminator Cycle Sequencing (Applied Biosystems). O seqüênciamento dos clones revelado da classificação de múltiplas cavidades de poliestirol mostrou 4 muteínas de lipocalina diferentes. Duas delas foram analisadas adicionalmente. A sequência de nucleotídeo desses clones foi traduzida em uma sequência de aminoácido e aqueles aminoácidos desviados do TLPC modificado codificado com TLPC14 (figura 21) são fornecidos na Tabela 11. As sequências de nucleotídeo dessas muteínas de lipocalina, denominadas S101.2 008 e S101.2 A20, são fornecidas como SEQ ID NO 16, e SEQ ID NO 15, respectivamente, O seqüênciamento dos clones selecionados da classificação da mi-croesfera A de proteína revelou duas muteínas de lipocalina diferentes. A sequência de nucleotídeo do clone S100.1-108, escolhida para análise posterior, foi traduzida na seqüência de aminoácido e aqueles aminoácidos desviados do TLPC modificado codificado com TLPC14 (figura 21) são fornecidos na Tabela 11. A seqüência de nucleotídeo é também fornecida como SEQ ID NO: 25.

Tabela 11: Características de seqüência das muteínas de anti-hCD33-Fc selecionadas Pós numeração de TLPC S101.2-A20 S101.2-008 S100.1-I08 acordo com o TLPC do tipo selvagem 25 Asp Vai Pro Gly +4 ... +3 ... +2 - Asp - +1 - Leu - 26 Arg His Ser Ser 27 Glu Gly Leu Gly 28 Phe Vai Thr Ser 29 Pro His Leu lie 30 Glu Asp Gin Cys 31 Met Leu Ala Thr Pós numeração de TLPC S101.2-A20 S101.2-008 S100.1-I08 acordo com o TLPC do tipo selvagem 32 Asn Phe Thr Cys 33 Leu Leu Ala Ser 56 Leu Phe Phe Vai 57 lie Gly Gly Vai 58 Ser Asn Tyr Arg 65° Lys Asn Lys Lys 83 Lys Asn Asn Asn 105 Leu His Leu Vai 106 His Met Met Met 108 Lys Trp Vai Leu 109 Pro Thr Leu Pro 0 Essas substituições de aminoácido surgem de mutações acidentais fora das posições aleatorizadas. +2, +4 descrevem a inserção de dois ou quatro aminoácidos na alça I da biblioteca de TLPC descrita no Exemplo 2.

Exemplo 29: Produção da muteína dos TLPCs Para a produção de preparação das muteínas anti-hCD33, S100.1 I08, S101.2 A20 e S101.2 008 obtidas do Exemplo 28, a região de codificação mutagenizada entre os dois sítios de divagem SsfXI foi subclonada do vetor pTLPC12 (figura 7) no plasmídeo de expressão pTLPC14 (figura 21). O plasmídeo obtido assim codificou a proteína de fusão da muteína com uma sequência de sinal OmpA e o T7-tag no término C, bem como Strep-tag® II no término C.

Colônias simples de E.coli- W3110 (fermentação) ou E.co//-JM83 (expressão de frasco agitador) foram transformadas com plasmídeos pTLPCI 4 codificando a muteína dos TLPCs S100.1108, S101.2 A20 ou S101.2 008, respectivamente. A expressão do frasco agitador, a fermentação de 1 litro, a cro-matografia AS e a cromatografía de exclusão por tamanho (SE) foram realizadas conforme descrito no Exemplo 5. A SEC revelou uma fração de proteína dimérica e monomérica para os clones S100.1-I08 e S101.2 008. A afinidade de ligação da fração monomérica e dimérica foi determinada separadamente em um ELISA.

Exemplo 30; Medição da afinidade da muteína dos TLPCs no ELISA

Para a determinação da afinidade de ligação das muteínas do TLPC selecionadas do Exemplo 28 quanto ao hCD33-Fc alvo da proteína prescrita, bem como as proteínas de controle não correlatas em um ELISA, as cavidades das placas ELISA pretas Fluotrac 600 (Greiner; 384 cavidades) foram revestidos com 20 pl de hCD33-Fc (1 pg/mL), anticorpo específico para fragmento Fc-Gama de IgG Anti-Humano de Camundongo AffiniPure (5 pg/mL, Jackson Immu-noResearch) e como um controle, com hlgG1 (10 pg/mL, Jackson ImmunoRe-search) O/N a 4°C. Os alvos hCD33-Fc (1 pg/mL, R&D Research) e hCD22-Fc (1 pg/mL, Peprtoech) foram capturados através do anticorpo específico para fragmento FcGama de IgG Anti-Humano de Camundongo AffiniPure por 1 hora a temperatura ambiente. Após isso, o ELISA foi realizado com a muteína dos TLPCs do Exemplo 29 conforme descrito no Exemplo 10.

As curvas de ligação resultantes foram ajustadas conforme descrito no Exemplo 10 e são mostradas nas figuras 22-24. Os valores obtidos para as constantes de dissociação aparentes dos complexos entre uma muteína dos TLPCs e a proteína alvo hCD33-Fc, bem como complexos entre a muteína dos TLPCs e as proteínas de controle hCD22-Fc (R&D Systems) e HSA (Sigma) são resumidos na Tabela 12.

Tabela 12: Constantes de ligação por afinidade da muteína dos TLPCs Muteína do TLPC. monômero Kn[nM1hCD33- KnfnM1hCD2 KnfnM] hlqG1 Eç 2-Fc CD33 S101.2 A20 5,2 + 0,72 -* -* CD33S101.2 008 (monômero) 187 + 26,9 -* -* CD33S100.1 I08 (monômero) 131+38,8 -* ND CD33 S101.2 008 (dímero) 83 ±13,7 -* -* CD33S100.1 I08(dímero) 6,3 + 1,4 -* ND * Nenhuma atividade de ligação detectável; ND = não determinado Exemplo 31: Medição da afinidade da muteína dos TLPCs em BIAcore 14.000 unidades de resposta (RU) do anticorpo especifico para fragmento Fcoamade IgG anti-humano de camundongo AffiniPure (Jackson Im-munoResearch) foram ligadas por acoplamento de amina a um chtp sensor CM5 (Biacore) de acordo com as recomendações do fabricante. 3000RU hCD33-Fc (R&D research) foram capturadas para essa superfície por injeção de 10 pL de uma solução 0,2 mg/mL hCD33-Fc em uma razão de fluxo de 2 μΙ/min. HBS (10 mM de HEPES, 150 mM de NaCI, 2 mM de EDTA, 0,005% v/v de Tween pH 7,4) foi usado como tampão de operação. Todas as amostras foram diluídas nesse tampão de operação. A muteína dos TLPCs, obtida no Exemplo 29, foi adicionada à superfície capturada do hCD33-Fc por injeção de uma amostra de 40 pL com uma razão de fluxo de 20 pL/minuto. As soluções da muteína do TLPC adicionadas eram de 10 pM e 6,4 μΜ para S101.2 A20 e S101.2 008, respectivamente. A superfície do chip foi regenerada com 10 mM de HCI seguido porreacoplamento de hCD33-Fc antes da próxima muteína de lipocalina ser medida. Todas as medições foram realizadas em um aparelho BIAcoreX. Para determinar a afinidade de ligação de S100.1108,2.000 RUde hCD33-Fc foram capturadas para a superfície conforme descrito acima e a solução da muteína de lipocalina adicionada tinha uma concentração de 5 pM. As curvas de ligação obtidas foram ajustadas usando o software BIAevaluation 3.1 da Biacore e são mostradas nas figuras 25-27. As constantes de ligação por afinidade resultantes da muteína dos TLPCs são resumidas na Tabela 13.

Tabela 13: Constantes de ligação por afinidade da muteína dos TLPCs Muteína do TLPC knn K* ís 11 Kn fnMlhCD33-Fc CD33 S101.2 A20 2,3 x104 2,0 x10'3 87 CD33 S101.2 008 1,3 x104 1,9 x10'3 146 CD33S100.1 I08 1,5x104 8,5x10'4 57 REIVINDICAÇÕES

Claims (20)

1. Muteína da lipocalina da lágrima humana, caracterizada pelo fato de que compreende 2 a 17 resíduos de aminoácido mutados, com relação à sequência de aminoácido do tipo selvagem da lipocalina da lágrima humana nas posições da sequência 8, 9, 10, 11, 12, 13, 43, 45, 47, 70, 72, 74, 75, 90, 92, 94 e 97 da sequência de polipeptídeo linear da lipocalina da lágrima humana.

2. Muteína de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende mutações de aminoácido em 12-17 das posições de sequência 8, 9, 10, 11, 12, 13, 43, 45, 47, 70, 72, 74, 75, 90, 92, 94 e 97 da sequência de polipeptídeo linear da lipocalina da lágrima humana.

3. Muteína da lipocalina da lágrima humana, caracterizada pelo fato de que compreende 2 a 17 resíduos de aminoácido mutados, com relação à sequência de aminoácido do tipo selvagem da lipocalina da lágrima humana madura nasposições de sequência 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 56, 57, 58, 83, 105, 106, 108 e 109 da sequência de polipeptídeo linear da lipocalina da lágrima humana.

4. Muteína de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que compreende mutações de aminoácido em 12-17 das posições de sequência 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 56, 57, 58, 83, 105, 106, 108 e 109 da sequência de polipeptídeo linear da lipocalina da lágrima humana.

5. Muteína de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizada pelo fato de que compreende mutações de aminoácido em 12-17 das posições de sequência 8, 9, 10, 11, 12, 13, 43, 45, 47, 70, 72, 74, 75, 90, 92, 94 e 97 da sequência de polipeptídeo linear da lipocalina da lágrima humana.

6. Muteína da lipocalina da lágrima humana, caracterizada pelo fato de que compreende 2 a 17 resíduos de aminoácido mutados, com relação à sequência de aminoácido do tipo selvagem da lipocalina da lágrima humana madura nas posições de sequência 8, 9, 10, 11, 12, 13, 43, 45, 47, 70, 72, 75, 90, 92, 94 e 97 da sequência de polipeptídeo linear da lipocalina da lágrima humana, compreende 2 a 17 resíduos de aminoácido mutados, com relação à sequência de aminoácido do tipo selvagem da lipocalina da lágrima humana madura nasposições de sequência 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 56, 57, 58, 83, 105, 106, 108 e 109 da sequência de polipeptídeo linear da lipocalina da lágrima humana.

7. Muteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que é conjugada a um marcador selecionado do grupo consistindo em moléculas orgânicas, marcadores de enzima, marcadores radioativos, marcadores coloridos, marcadores fluorescentes, marcadores cromogênicos, marcadores luminescentes, haptenos, digoxigenina, biotina, complexos de metal, metais e ouro coloidal.

8. Muteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que é fundida em seu término N ou seu término C a uma proteína, um domínio de proteína ou um peptídeo.

9. Método para geração de uma muteína como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) sujeição de uma molécula de ácido nucléico codificando uma lipocalina da lágrima à mutagênese em 2 a 17 códons diferentes das posições de sequência 8, 9, 10, 11, 12, 13, 43, 45, 47, 70, 72, 74, 75, 90, 92, 94 e 97 da sequência de polipeptídeo linear da lipocalina da lágrima humana e/ou em 2 a 17 códons diferentes das posições de sequência 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 56, 57, 58, 83, 105, 106, 108 e 109 da sequência de polipeptídeo linear da lipocalina da lágrima humana, (b) expressão de pelo menos uma das moléculas de ácido nucléico da muteína obtidas em (a) em um sistema de expressão apropriado, e (c) enriquecimento de pelo menos uma muteína por meio de seleção e/ou isolamento.

10. Método para produção de uma muteína como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a muteína, um fragmento da muteína ou uma proteína de fusão da muteína e outro polipeptídeo é produzida partindo do ácido nucléico codificando a muteí- na por meio de métodos de engenharia genética.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a muteína é produzida em um organismo hospedeiro bacteriano ou eucariótico e é isolada desse organismo hospedeiro ou sua cultura.

12. Método para produção de uma muteína como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a muteína, um fragmento da muteína ou uma proteína de fusão da muteína e outro polipeptídeo é produzida por síntese de peptídeo.

13. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma muteína como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.

14. Uso de uma muteína como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que é na detecção de um dado alvo in vitro, compreendendo as etapas de: (a) contato da muteína com uma amostra de teste que se supõe contenha o alvo, e (b) detecção do complexo de muteína/alvo por um sinal apropriado.

15. Uso de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o dado alvo é uma proteína ou domínio de proteína, um peptídeo, uma molécula de ácido nucléico, uma molécula orgânica ou um complexo de metal.

16. Uso de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que a detecção é realizada para validação das proteínas como medicamento farmacológico alvo.

17. Uso de uma muteína como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que é na separação de um dado alvo in vitro, compreendendo: (a) contato da muteína com uma amostra que se supõe contenha o alvo, e (b) separação do complexo de muteína/alvo da amostra.

18. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 17, caracterizado pelo fato de que o complexo de muteína/alvo é ligado a uma fase sólida.

19. Uso de uma muteína como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que tem como alvo o composto para um sítio pré-selecionado in vitro, compreendendo: (a) contato da muteína com o composto, e (b) liberação do complexo de muteína/composto para o sítio pré-selecionado.

20. Uso de uma muteína como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que é na formação de complexo com um dado alvo in vitro.