JP2007531503A - 涙リポカリンの突然変異タンパク質 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)涙リポカリンまたはそのホモログをコードする核酸分子に(ここで、涙リポカリンまたはそのホモログがヒト涙リポカリンと少なくとも60%の配列相同性を有する)、2つ以上の異なるコドンでの突然変異誘発を受けさせ、その結果、1つ以上の突然変異タンパク質核酸分子を生じること、
(b)(a)で得られた1つ以上の突然変異タンパク質核酸分子を適切な発現系で発現させること、および、
(c)特定の標的に対して検出可能な結合親和性を有する少なくとも1つの突然変異タンパク質を、選択および/または単離によって濃縮することを含む。
100億の独立したTLPC突然変異タンパク質を含むライブラリーの作製
他に示されない限り、例えばSambrookら(上述)に記載されるような、確立された組換え遺伝子法を使用した。
100億の独立したTLPC突然変異タンパク質を含むライブラリーの作製
高い複雑性を有する第二のTLPCのランダムライブラリーは、図6に従い多段階のPCRを用いて、リポカリンの開放末端において天然のリポカリン結合ポケットを包囲する4つのペプチドループAB、CD、EFならびにGH内の選択されたアミノ酸位置の協調的な突然変異誘発によって作製された。実施例1に記載されているのと同様のPCR戦略を用いるが、PCR A由来の断片の調製のために、2または4アミノ酸の挿入のための6または12の更なるランダムヌクレオチドを含む2つの異なるオリゴデオキシヌクレオチド(配列番号27および配列番号28)を用いて、ループABには、2または4アミノ酸のいずれかの挿入による長さの変異が導入された。4アミノ酸の挿入を有するループABを安定化するために、N末端およびC末端のアンカー位置を、配列番号28のオリゴヌクレオチドによってコードされるアミノ酸置換V24W、D25SおよびM31N、N32Sによって固定した。第一増幅段階(PCR番号1)において、伸長されないループABの増幅のために配列番号26および配列番号29、2アミノ酸による伸長のために配列番号27および配列番号29、4アミノ酸による伸長のために配列番号28および配列番号29のプライマーとともに、pTLPC12プラスミドDNA(図7、配列番号23)を鋳型として使用する以外、実施例1に記載されたものと同一の方法で、PCR反応を行った。このPCRは、(伸長されないループABおよび4アミノ酸によって伸長されたループABについて)17個または(2アミノ酸によって伸長されたループABについて)19個のいずれかの突然変異コドンを有する涙リポカリンのほぼ完全な構造遺伝子を含む、336、342、および348塩基対のサイズからなるDNA断片の増幅を引き起こした。PCR番号1、Bでは、PCR断片Bを増幅するために、配列番号30および配列番号31のオリゴヌクレオチドを用いた。所望の増幅産物を、GTQアガロース(Roth)を用いた分取用アガロースゲル電気泳動によって、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega)を用いて単離した。
ファージミド提示および高結合能ポリスチロールマルチウェルプレートを用いたVEGFに対するTLPC突然変異タンパク質の選択
TLPC突然変異タンパク質の選択のために、実施例1で得られたライブラリーの2 x 1012〜1 x 1013のファージミドを用いた。簡潔には、ファージミドを遠心分離(21460 x g、4℃、20分間)し、50 mMベンズアミジンを含む1 mlのPBS(4 mM KH2PO4、16 mM Na2HPO4、115 mM NaCl, pH 7.4)に再懸濁した。6% w/vウシ血清アルブミン(BSA; Roth)および0.3%Tween 20を含むPBSをブロッキングバッファーとして用いた。標的タンパク質とのインキュベーションの前に、多重反応性または異常な折りたたみのリポカリン突然変異タンパク質を提示するファージミドの除去のために、ライブラリー由来のファージミドをウシ血清アルブミンでブロッキングしたポリスチロールウェル中で15分間、2回インキュベーションした。昆虫細胞において産生された組換えヒト血管内皮増殖因子(165アミノ酸、rhuVEGF165)(R&D Sytems)を2.5μg/mlの濃度で、ポリスチロールプレート上に被覆した。被覆されブロッキングされたウェル中で、ブロッキングされたファージミドをインキュベーションした後、吸着したファージミドを化学的に溶出した。吸着したファージミドを各ウェル当たり300μlの0.1 M グリシン/HCl pH 2.2で10分間処理し、続いて、それを適当量の0.5 M Trisと混合することにより、各溶出画分のpHの速やかな中和を行った。第二濃縮サイクルからは、混合したファージミド溶液の半分だけをファージミド増幅に用いた。選択の各サイクルの後、投入したファージミド、8回目の洗浄画分および溶出されたファージミドの力価をスポット滴定によって測定した。簡潔には、ファージミドの段階希釈物をE. coli XL1-Blue細胞と混合し、37℃で30分間インキュベーションした。感染細胞の一部をLB/Amp寒天プレート上に「スポット」し、37℃で一晩インキュベーションした。翌日、スポット当たりのコロニーを数え、ファージミド溶液の力価(cfu/ml)を測定した。ファージミド増幅は22℃で行われた。
ハイスループットELISAスクリーニング法の使用によるVEGF結合TLPC突然変異タンパク質の同定
C末端T7検出タグ(Novagen)に続くStrep-tag(登録商標)II親和性タグを備えたTLPC突然変異タンパク質の分析的産生およびハイスループットELISAスクリーニングによるそれらの解析のために、ベクターpTLPC8(図8、配列番号24)を構築した。2つのBstXI切断部位の間にTLPC骨格を含む遺伝子カセットはベクターpTLPC7(図4、配列番号1)からpTLPC8にサブクローニングされた。
TLPC突然変異タンパク質の産生
実施例4において記載された突然変異タンパク質S69.4 O13の調製的産生については、Schlehuber, S.ら(J. Mol. Biol. (2000), 297, 1105-1120)に記載された方法に従った適切な培養容量のLBアンピシリン培地での振盪フラスコ発現によるペリプラズムでの産生のために、この突然変異タンパク質をコードする発現ベクターpTLPC8(図8、配列番号24)を有するE. coli K12株JM83を使用した。
ELISAにおけるTLPC突然変異タンパク質のVEGFに対する親和性の測定
TLPC突然変異タンパク質のVEGFに対する親和性を以下のように測定した。簡潔には、実施例5に記載されたように得られた突然変異タンパク質S69.4 O13の希釈系列を、rhuVEGF165および対照タンパク質BSAに対する結合についてELISAアッセイにおいて検査した。
ファージミド提示およびポリスチロールマルチウェルプレートを用いたヒトhCD22の細胞外ドメインに対するTLPC突然変異タンパク質の選択
TLPC突然変異タンパク質の選択のために、実施例1からのファージミドライブラリーを用いた。TLPC突然変異タンパク質の選択は実施例3に記載されたように行われた。その方法との違いは以下に記載される。すなわち、標的タンパク質とのインキュベーションの前に、多重反応性または異常な折りたたみのリポカリン突然変異タンパク質を提示するファージミドの除去のために、ライブラリーからのファージミドをBSAでブロッキングしたポリスチロールウェル中で2回、各15分間インキュベーションした。hCD22の細胞外ドメイン(Peprotech EC LTD, UK)を5μg/mlの濃度でポリスチロールプレート上に被覆した。最初の溶出ステップでは、吸着したファージミドを各ウェル当たり300μlの0.1 M グリシン/HCl pH2.2で10分間処理し、続いて適当量の0.5 M Trisの添加によって各溶出画分のpHを直ちに中和した。塩基性溶出ステップは、各ウェル当たり300μlの70 mMトリエチルアミンで10分間行われ、続いて適当量の1 M Tris/HCl, pH 7.4の添加によって各溶出画分のpHは直ちに中和された。最後の溶出ステップとして、各ウェルに300μlの対数増殖しているXL1 blue(OD550は約0.5)を移し、30分間37℃でインキュベーションした。第二濃縮サイクルからは、混合したファージミド溶液の半分だけを、実施例3に記載されたようなファージミド増幅に用いた。投入したファージミドおよび溶出されたファージミドの数を測定するために、選択の各サイクルの後、実施例3に従って、選択(panning)に用いられたファージミド、8回目の洗浄画分および溶出されたファージミドのスポット滴定が行われた。
ハイスループットELISAスクリーニング法の使用によるhCD22結合TLPC突然変異タンパク質の同定
C末端T7検出タグ(Novagen)ならびにStrep-tag(登録商標)II親和性タグを備えたhCD22結合TLPC突然変異タンパク質の分析的産生およびハイスループットELISAスクリーニングによるそれらの解析のために、2つのBstXI切断部位の間にTLPCを含む遺伝子カセットをベクターpTLPC7(図4)からベクターpTLPC8(図8)にサブクローニングした。実施例4に記載されたハイスループットELISAスクリーニング法によって、hCD22結合TLPC突然変異タンパク質を同定した。一次スクリーニングにおいてhCD22に特異的に結合したTLPC突然変異タンパク質は、同様に実施例4において記載されたような二次ハイスループットELISAスクリーニング実験において更に詳細な結合解析のために選択された。
TLPC突然変異タンパク質の産生
実施例8から得られた突然変異タンパク質S76.1 H10の調製的産生のために、2つのBstXI切断部位の間の突然変異されたコード領域を、ベクターpTLPC7(図4)から発現プラスミドpTLPC8(図8)にサブクローニングした。従って、得られたプラスミドは、突然変異タンパク質とOmpAシグナル配列およびC末端でのT7タグならびにStrep-tag(登録商標)IIとの融合タンパク質をコードした。
ELISAにおけるTLPC突然変異タンパク質の親和性の測定
実施例9に記載されたように得られた突然変異タンパク質S76.1 H10の希釈系列を、直接被覆されたhCD22および対照タンパク質hCD33-Fc、HSA、hIgG1に対する結合についてELISAアッセイにおいて検査した。
ファージミド提示およびポリスチロールマルチウェルプレートを用いたヒトCD25の細胞外ドメインに対するTLPC突然変異タンパク質の選択
実施例1に記載されたファージミドライブラリーからのCD25特異的突然変異タンパク質の選択、およびELISA実験におけるこれらの突然変異タンパク質のその後の解析のために使用される標的は、R&D systemsから購入された(組換えヒトIL-2 Rアルファ/Fc キメラ)。
ハイスループットELISAスクリーニング法の使用によるCD25結合TLPC突然変異タンパク質の同定
C末端T7検出タグ(Novagen)ならびにC末端Strep-tag(登録商標)II親和性タグを備えたTLPC突然変異タンパク質の分析的産生、およびハイスループットELISAスクリーニングによるそれらの解析のために、2つのBstXI切断部位の間の遺伝子カセットをベクターpTLPC7(配列番号1; 図4)からpTLPC8(配列番号24;図8)にサブクローニングした。
TLPC突然変異タンパク質の産生
実施例12において記載された突然変異タンパク質S67.7 C6の調製的産生については、この突然変異タンパク質をコードする発現ベクターpTLPC8を有するE. coli K12株W3110を、実施例5に記載されたような発酵槽培養によるペリプラズムでの産生のために使用した。
ELISAにおけるTLPC突然変異タンパク質のCD25に対する親和性の測定
実施例13に記載されたように得られた突然変異タンパク質S67.7 C6の希釈系列を、捕捉されたCD25-Fcならびに対照タンパク質である捕捉 mAb、HSA、FCSおよび捕捉されたヒトIgG Fc断片に対する結合についてELISAアッセイで検査した。
ヒトCD25を発現しているCHO細胞株の作製
ヒトCD25を発現している安定な細胞株の作製のために、CHO-K1細胞(DSMZ, No. ACC 110)を、ヒトCD25(NCBI受入番号NM_000417 [gi:4557666])をコードしている発現ベクターCD25-pcDNA3.1Zeo(+)(配列番号10; 図13)で形質転換した。
TLPC突然変異タンパク質のヒトCD25を発現しているCHO細胞株への特異的結合に関する検査
ヒトCD25を発現しているCHO細胞株への特異的結合について、フローサイトメトリーアッセイにおいて、突然変異タンパク質S67.7 C6を検査した。この目的のために、実施例15において記載されたCD25-pcDNA3.1Zeo(+)またはpcDNA3.1Zeo(+)でトランスフェクトしたCHO細胞を、0.2% w/v EDTAを用いて培養フラスコからはがした。約200.000個の細胞を、30μl PBS/2% v/v FCSに再懸濁し、実施例13に記載されたように得られた10μg S67.7 C6とともにインキュベーションし、SchlehuberおよびSkerra(Biol. Chem. (2001) 382, 1335-1342)に記載された方法に基づき等モル比のフルオレセイン(フルオレセイン-5(6)-カルボキシアミドカプロン酸N-スクシンイミジルエステル; Fluka)で標識された。陰性対照として、pTLPC8によってコードされ、等モル比のフルオレセインで標識された10μgの組換え野生型TLPCを用いた。CD25発現はFITC標識抗CD25 mAb(Acris, DM519F)によって、アイソタイプ対照としてFITC標識IgG1(Acris, SM10F)を用いて確認された。氷上で30分間のインキュベーション後、FACS Calibur(BectonDickinson)を用いたフローサイトメトリーによる解析の前に、細胞をPBS/2% v/v FCSで2回洗浄した。
CD25特異的TLPC突然変異タンパク質の親和性成熟のためのエラープローンPCRライブラリーの作製
実施例12において記載されたCD25特異的突然変異タンパク質S67.7-C06を親和性成熟法のために使用した。そのために、突然変異タンパク質S67.7-C06に基づいてエラープローンPCR法を用いることにより、第二世代ライブラリーを作製した。CD25に関する結合情報を既に刷り込まれているこのライブラリーは、ヌクレオチド類似体8-オキソdGTPおよびdPTP(TEBU-Bio)を用いて、文献(Zaccoloら(1996) J. Mol. Biol. 255,589-603)に記載される方法に従って作製された。エラープローン増幅反応のために、5'ビオチン化オリゴヌクレオチドである配列番号7および配列番号8をヌクレオチド類似体とともに用いた。これらのオリゴデオキシヌクレオチドはBstXI制限酵素認識部位に隣接しているため、増幅は、TLPC突然変異タンパク質の構造遺伝子の大部分を含むBstXI遺伝子カセットの全体に無作為に分布する点突然変異を引き起こす。Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega)を用いてPCR産物を精製し、クローニングの目的のために、TPLC突然変異タンパク質の核酸の形での親和性成熟ライブラリーに相当するこの断片を、まず、製造業者の説明書に従って制限酵素BstXI(Promega)で切断し、その後、上述のように精製し、303ヌクレオチドのサイズの二本鎖DNA断片を得た。消化されなかったか、または不完全に消化されたDNA断片は、実施例1に記載されたように、ストレプトアビジン被覆常磁性ビーズ(Merck)を用いて、それらの5'ビオチンタグによって除去された。
ファージミド提示およびポリスチロールマルチウェルプレートを用いた親和性改善CD25特異的TLPC突然変異タンパク質の選択
実施例17に記載されたエラープローンPCRライブラリーから、親和性改善されたCD25特異的TLPC突然変異タンパク質を選択するために、実施例3に記載された一般方法に従って2つの異なる戦略(それぞれ選択戦略AおよびB)を用いて3回の選択を行った。その方法との違いは以下に記載される。標的タンパク質とのインキュベーションの前に、多重反応性または異常な折りたたみのリポカリン突然変異タンパク質を提示するファージミドの除去のために、ライブラリー由来のファージミドをBSAでブロッキングしたポリスチロールウェル中で各15分間、2回インキュベーションした。
コロニースクリーニング法の使用による親和性改善CD25特異的TLPC突然変異タンパク質の同定
Strep-tag(登録商標)IIおよびアルブミン結合ドメイン(ABD)を含む融合タンパク質としてのTLPC突然変異タンパク質の分析的産生およびコロニースクリーニングによるそれらの解析のために、2つのBstXI切断部位の間の遺伝子カセットをファージミドベクターpTLPC7(配列番号1; 図4)からpTLPC9(配列番号22; 図15)にサブクローニングした。
コロニースクリーニング法によって選択された親和性改善TLPC突然変異タンパク質の産生
実施例19において記載された突然変異タンパク質F92.8 M1.2 E15の調製的産生については、この突然変異タンパク質をコードする発現ベクターpTLPC9を有するE. coli K12株W3110を、実施例5に記載されたような発酵槽培養によるペリプラズムでの産生のために使用した。
ELISAにおける親和性改善TLPC突然変異タンパク質のCD25に対する親和性の測定
実施例20に記載されたように得られた突然変異タンパク質F92.8 M1.2 E15の単量体および二量体画分の希釈系列を、捕捉されたCD25-Fcならびに対照タンパク質である捕捉 mAb、HSA、FCSおよび捕捉されたヒトIgG Fc断片に対する結合についてELISAアッセイで検査した。
ヒトCD154を発現しているCHO細胞株の作製
ヒトCD154を発現している安定な細胞株の作製のために、CHO-K1細胞(DSMZ, No. ACC 110)を、ヒトCD154(NCBI受入番号BC_074950 [gi:49902361])をコードしている発現ベクターCD154-pcDNA3.1Zeo(+)(配列番号11; 図18)でトランスフェクションした。
親和性改善TLPC突然変異タンパク質の、ヒトCD25を発現しているCHO細胞株への特異的結合に関する検査
ヒトCD25を発現しているCHO細胞株への特異的結合について、フローサイトメトリーアッセイにおいて、突然変異タンパク質F92.8 M1.2 E15を検査した。この目的のために、それぞれ実施例15および22において記載されたCD25-pcDNA3.1Zeo(+)またはCD154-pcDNA3.1Zeo(+)でトランスフェクトしたCHO細胞を、0.2% w/v EDTAを用いて培養フラスコからはがした。約200.000個の細胞を、30μl PBS/2% v/v FCSに再懸濁し、実施例20に記載されたように得られた2.5μgの単量体F92.8 M1.2 E15とともにインキュベーションし、SchlehuberおよびSkerra(上述)に記載された方法に基づき2倍のモル比のフルオレセイン(フルオレセイン-5(6)-カルボキシアミドカプロン酸N-スクシンイミジルエステル; Fluka)で標識された。陰性対照として、pTLPC8によってコードされ、2倍のモル比のフルオレセインで標識された2.5μgの組換え野生型TLPCを用いた。CD25発現はFITC標識抗CD25 mAb(Acris, DM519F)によって、アイソタイプ対照としてFITC標識IgG1(Acris, SM10F)を用いて確認された。氷上で30分間のインキュベーション後、FACS Calibur(Becton Dickinson)を用いたフローサイトメトリーによる解析の前に、細胞をPBS/2% v/v FCSで2回洗浄した。
ハイスループットELISAスクリーニング法の使用による親和性改善CD25結合TLPC突然変異タンパク質の同定
C末端T7検出タグ(Novagen)ならびにC末端Strep-tag(登録商標)II親和性タグを備えた親和性改善TLPC突然変異タンパク質の分析的産生およびハイスループットELISAスクリーニングによるそれらの解析のために、2つのBstXI切断部位の間の遺伝子カセットをベクターpTLPC7(図4)からpTLPC8(図8)にサブクローニングした。
ハイスループットELISAスクリーニング法によって選択された親和性改善TLPC突然変異タンパク質の産生
実施例24において記載された突然変異タンパク質S99.3 H24、S99.3 C13およびS99.4 F15の調製的産生については、これらの突然変異タンパク質をコードする発現ベクターpTLPC8を有するE. coli K12株W3110を、実施例5に記載されたような発酵槽培養によるペリプラズムでの産生のために使用した。
ELISAにおける親和性改善TLPC突然変異タンパク質のCD25に対する親和性の測定
実施例25に記載されたように得られた突然変異タンパク質S99.3 H24、S99.3 C13およびS99.4 F15の希釈系列を、捕捉されたCD25-Fcならびに対照タンパク質である捕捉 mAb、HSA、FCSおよび捕捉されたヒトIgG Fc断片に対する結合についてELISAアッセイで検査した。
ファージミド提示、ならびにポリスチロールマルチウェルプレートおよびプロテインA磁気ビーズを用いたヒトCD33-Fcの細胞外ドメインに対するTLPC突然変異タンパク質の選択
TLPC突然変異タンパク質の選択のために、実施例2に記載されたようなファージミドライブラリーを使用した。ポリスチロールマルチウェルプレートを用いたTLPC突然変異タンパク質の選択は実施例3に記載されたように行われた。その方法との違いは実施例7に記載される。標的hCD33-Fc(R&D Research)を1μg/mlの濃度で、直接ポリスチロールプレートに被覆した。
ハイスループットELISAスクリーニング法の使用によるhCD33結合TLPC突然変異タンパク質の同定
N末端T7検出タグ(Novagen)ならびにC末端にStrep-tag(登録商標)II親和性タグを備えたhCD33結合TLPC突然変異タンパク質の分析的産生およびハイスループットELISAスクリーニングによるそれらの解析のために、2つのBstXI切断部位の間にTLPCを含む遺伝子カセットをベクターpTLPC12(図7)からベクターpTLPC14(図21)にサブクローニングした。実施例4に記載されたように、ハイスループットELISAスクリーニング法によって、hCD33結合TLPC突然変異タンパク質を同定した。一次スクリーニングにおいてhCD33に特異的に結合したTLPC突然変異タンパク質は、同じ実施例において記載されたように、二次ハイスループットELISAスクリーニング実験において更に詳細な結合解析のために選択された。
TLPC突然変異タンパク質の産生
実施例28から得られた抗hCD33突然変異タンパク質S100.1 I08、S101.2 A20およびS101.2 O08の調製的産生のために、2つのBstXI切断部位の間の突然変異されたコード領域を、ベクターpTLPC12(図7)から発現プラスミドpTLPC14(図21)にサブクローニングした。従って、得られたプラスミドは、突然変異タンパク質とOmpAシグナル配列およびN末端でのT7タグならびにC末端でのStrep-tag(登録商標)IIとの融合タンパク質をコードした。
ELISAにおけるTLPC突然変異タンパク質の親和性の測定
ELISAにおいて、実施例28から選択されたTLPC突然変異タンパク質の、規定されたタンパク質標的hCD33-Fcならびに関係のない対照タンパク質への結合親和性を測定するために、黒色のFluotrac 600 ELISAプレート(Greiner; 384ウェル)のウェルを、20μlのhCD33-Fc(1μg/ml)、AffiniPureマウス抗ヒトIgG Fcγ断片特異的抗体(5μg/ml, Jackson ImmonoResearch)および、対照として、hIgG1(10μg/ml, Jackson ImmunoResearch)によって一晩4℃で被覆した。標的hCD33-Fc(1μg/ml, R&D Research)およびhCD22-Fc(1μg/ml, Peprotech)は、AffiniPureマウス抗ヒトIgG Fcγ断片特異的抗体によって1時間室温で捕捉された。その後、実施例29からのTLPC突然変異タンパク質を用いて、実施例10において記載されたように、ELISAを行った。
BIAcoreにおけるTLPC突然変異タンパク質の親和性の測定
14000応答単位(RU)のAffiniPureマウス抗ヒトIgG Fcγ断片特異的抗体(Jackson ImmunoResearch)を、製造業者の推奨に従ってCM5センサーチップ(Biacore)にアミン結合によって結合させた。10μlの0.2 mg/ml hCD33-Fc溶液を2μl/minの流速で注入することにより、3000 RUのhCD33-Fc(R&D research)をこの表面に捕捉させた。HBS(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0.005% v/v Tween pH7.4)を泳動バッファーとして用いた。すべてのサンプルをこの泳動バッファー中に希釈した。40μl のサンプルを20μl/minの流速で注入することにより、実施例29において得られたTLPC突然変異タンパク質を、hCD33-Fcが捕捉された表面に添加した。添加したTLPC突然変異タンパク質の溶液は、S101.2 A20およびS101.2 O08についてそれぞれ、10μMおよび6.4μMであった。チップの表面を10 mM HClで再生し、続けて、次のリポカリン突然変異タンパク質を測定する前に、hCD33-Fcを再結合させた。すべての測定はBIAcore X装置で行われた。S100.1 I08の結合親和性を測定するために、2000 RUのhCD33-Fcが上述の表面に捕捉され、添加されたリポカリン突然変異タンパク質溶液は5μMの濃度であった。得られた結合曲線はBiacoreからのBIAevaluation software 3.1を用いて近似され、図25〜27に示される。その結果得られるTLPC突然変異タンパク質の親和性結合定数を表13に要約する。
Claims (29)
- 涙リポカリンまたはそのホモログのポリペプチドに由来する突然変異タンパク質であって、ここで、突然変異タンパク質は、天然のリポカリン結合ポケットの反対に位置するβバレル構造の末端に配置されるN末端ペプチド伸長部ならびに3つのペプチドループBC、DE、およびFG中の任意の配列位置に少なくとも2つの突然変異したアミノ酸残基を含み、前記涙リポカリンまたはそのホモログがヒト涙リポカリンと少なくとも60%の配列相同性を有し、前記突然変異タンパク質が検出可能な親和性で特定の標的に結合する、突然変異タンパク質。
- 突然変異タンパク質がヒト涙リポカリンに由来する、請求項1に記載の突然変異タンパク質。
- 突然変異タンパク質がヒト涙リポカリンの直鎖状ポリペプチド配列の配列位置7〜14、43〜49、70〜77、および87〜97に相当するペプチドセグメント中の任意の2つ以上の配列位置にアミノ酸突然変異を含む、請求項1または2に記載の突然変異タンパク質。
- 突然変異タンパク質がヒト涙リポカリンの直鎖状ポリペプチド配列の配列位置8、9、10、11、12、13、43、45、47、70、72、74、75、90、92、94、および97に相当する任意の2つ以上の配列位置にアミノ酸突然変異を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の突然変異タンパク質。
- 涙リポカリンまたはそのホモログのポリペプチドに由来する突然変異タンパク質であって、ここで、突然変異タンパク質は、天然のリポカリン結合ポケットを包囲する4つのペプチドループAB、CD、EF、およびGH中の任意の配列位置に少なくとも2つの突然変異したアミノ酸残基を含み、前記涙リポカリンまたはそのホモログがヒト涙リポカリンと少なくとも60%の配列相同性を有し、前記突然変異タンパク質が検出可能な親和性で特定の標的に結合する、突然変異タンパク質。
- 突然変異タンパク質がヒト涙リポカリンに由来する、請求項5に記載の突然変異タンパク質。
- 突然変異タンパク質がヒト涙リポカリンの直鎖状ポリペプチド配列の配列位置24〜36、53〜66、79〜84、および103〜110に相当するペプチドセグメント中の任意の2つ以上の配列位置にアミノ酸突然変異を含む、請求項5または6に記載の突然変異タンパク質。
- 更に、天然のリポカリン結合ポケットの反対に位置するβバレル構造の末端に配置されるN末端ペプチド伸長部ならびに3つのペプチドループBC、DE、およびFG中の任意の配列位置に少なくとも2つの突然変異したアミノ酸残基を含む、請求項5〜7のいずれか1項に記載の突然変異タンパク質。
- ヒト涙リポカリンの直鎖状ポリペプチド配列の配列位置7〜14、43〜49、70〜77、および87〜97に相当するペプチドセグメント中の任意の2つ以上の配列位置にアミノ酸突然変異を含む、請求項8に記載の突然変異タンパク質。
- ヒト涙リポカリンの直鎖状ポリペプチド配列の配列位置8、9、10、11、12、13、43、45、47、70、72、74、75、90、92、94、および97に相当する任意の2つ以上の配列位置にアミノ酸突然変異を含む、請求項8または9に記載の突然変異タンパク質。
- 涙リポカリンまたはそのホモログのポリペプチドに由来する突然変異タンパク質であって、
ここで、突然変異タンパク質は、天然のリポカリン結合ポケットの反対に位置するβバレル構造の末端に配置されるN末端領域ならびに3つのペプチドループBC、DE、およびFG中の任意の配列位置に少なくとも2つの突然変異したアミノ酸残基を含み、
突然変異タンパク質は、天然のリポカリン結合ポケットを包囲する4つのペプチドループAB、CD、EF、およびGH中の任意の配列位置に少なくとも2つの突然変異したアミノ酸残基を含み、
前記涙リポカリンまたはそのホモログはヒト涙リポカリンと少なくとも60%の配列相同性を有し、
前記突然変異タンパク質が検出可能な親和性で少なくとも1つの特定の標的に結合する、突然変異タンパク質。 - 突然変異タンパク質が、有機分子、酵素標識、放射性標識、着色標識、蛍光標識、発色標識、発光標識、ハプテン、ジゴキシゲニン、ビオチン、金属錯体、金属、および金コロイドからなる群より選択される標識とコンジュゲートされる、請求項1〜11のいずれか1項に記載の突然変異タンパク質。
- 突然変異タンパク質がそのN末端またはそのC末端でタンパク質、タンパク質ドメインまたはペプチドと融合される、請求項1〜12のいずれか1項に記載の突然変異タンパク質。
- 請求項1〜13のいずれか1項に記載の突然変異タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
- ベクター中に含まれる請求項14に記載の核酸分子。
- ファージミドベクター中に含まれる請求項14に記載の核酸分子。
- 請求項14〜16のいずれか1項に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
- 請求項1〜13のいずれか1項に記載の突然変異タンパク質の作製方法であって、
(a)涙リポカリンまたはそのホモログがヒト涙リポカリンと少なくとも60%の配列相同性を有する前記涙リポカリンまたはそのホモログをコードする核酸分子に、2つ以上の異なるコドンでの突然変異誘発を受けさせること、
(b)(a)で得られた少なくとも1つの突然変異タンパク質核酸分子を適切な発現系で発現させること、および、
(c)特定の標的に対して検出可能な結合親和性を有する少なくとも1つの突然変異タンパク質を、選択および/または単離によって濃縮すること、
を含む方法。 - 請求項1〜13のいずれか1項に記載の突然変異タンパク質の産生方法であって、突然変異タンパク質、突然変異タンパク質の断片、または突然変異タンパク質と別のポリペプチドとの融合タンパク質を、突然変異タンパク質をコードする核酸から遺伝子組換え法を用いて産生する方法。
- 突然変異タンパク質が細菌性または真核性宿主生物で産生され、この宿主生物またはその培養物から単離される、請求項19に記載の方法。
- 突然変異タンパク質、突然変異タンパク質の断片、または突然変異タンパク質と別のポリペプチドとの融合タンパク質がペプチド合成によって産生される、請求項1〜13のいずれか1項に記載の突然変異タンパク質の産生方法。
- 請求項1〜13のいずれか1項に記載の突然変異タンパク質の少なくとも1つを含む医薬組成物。
- 請求項1〜13のいずれか1項に記載の突然変異タンパク質の、特定の標的の検出についての使用であって、
(a)前記標的を含むと考えられる検査サンプルと突然変異タンパク質を接触させるステップ、および、
(b)適切なシグナルによって突然変異タンパク質/標的複合体を検出するステップ、
を含む使用。 - 特定の標的がタンパク質もしくはタンパク質ドメイン、ペプチド、核酸分子、有機分子、または金属錯体である、請求項23に記載の使用。
- 検出が薬理学的な薬物標的としてのタンパク質の検証のために行われる、請求項23または24に記載の使用。
- 請求項1〜13のいずれか1項に記載の突然変異タンパク質の、特定の標的の分離についての使用であって、
(a)前記標的を含むと考えられるサンプルと突然変異タンパク質を接触させること、および、
(b)サンプルから突然変異タンパク質/標的複合体を分離すること、
を含む使用。 - 突然変異タンパク質/標的複合体が固相上に結合される、請求項23〜26のいずれか1項に記載の使用。
- 請求項1〜13のいずれか1項に記載の突然変異タンパク質の、事前に選択した部位への化合物の標的化のための使用であって、
(a)前記化合物と突然変異タンパク質を接触させること、および、
(b)突然変異タンパク質/化合物複合体を事前に選択した部位へ送達すること、
を含む使用。 - 特定の標的との複合体形成のための、請求項1〜13のいずれか1項に記載の突然変異タンパク質の使用。
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