JP2005323554A - 樹状突起スパイン移行配列 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 ドレブリンの結合タンパク質であるDrap1の部分配列や変異配列をCOS7細胞又は初代培養海馬神経細胞に導入し、Drap1のアミノ酸配列のうち、1番目から89番目のアミノ酸配列が核移行配列、43番目から47番目のアミノ酸配列が核移行シグナル、940番目から1041番目のアミノ酸配列が核外移行配列、820番目から1041番目のアミノ酸配列がスパイン移行配列であることを見い出した。
Description
配列番号2に示されるドレブリンのアミノ酸配列のうち1番目から233番目のアミノ酸配列(aa1〜233)をコードするDNAを、pAS404(Clontech社製pAS1を改変したもの。Sekiguchi etal, J. Biol. Chem. 276:7246-7257.)
に組み入れ、得られたプラスミドを酵母ツーハイブリッドシステムのスクリーニング用のベイト(bait)として使用した。まず、得られたプラスミドを酵母(Y190株)にトランスフォームし、これを用いてラット神経細胞のcDNAライブラリー(Clontech社製)をスクリーニングした。上記酵母を選択培地(a3-aminotriazole (25 mM) plus SD-Trp, Leu, and His plate)上で培養し、生長してきた酵母コロニーを採取した。その結果、89個の独立したクローンが得られた。これらクローンからプラスミドを採取しシィークエンスを行ったところ、そのうち64個が同じタンパク質をコードしていることがわかった。このクローンを用いて、より長いクローンを得るため、ラット神経細胞のcDNAライブラリーをスクリーニングした。さらに5′/3′RACEキット(TAKARA社製)に提示されたプロトコールに基づき、指定のプライマーを使用し、5′RACE (Rapid Amplification of cDNA ends)(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8998-9002, 1988)反応を行い、不足部分の配列を取得して全長配列を得た。この遺伝子がコードするドレブリン結合タンパク質をDrap1(Drebrin-associated protein 1)と命名した。
Drap1の全長配列(aa1〜1208)と部分配列(aa1〜88,aa88〜1208,aa522〜596,aa383〜488,aa820〜1041,aa940〜1041,Δ940〜1041)及びDrap1の全長配列の45,46番目のリシンをトレオニンに置換した変異配列(mutNSL-aa1〜1208)をコードするDNAをそれぞれ調製し、EGFP-C1ベクター(Clontech社製)のマルチクローニングサイトにサブクローニングした(図1参照)。これら組換えベクターを、リン酸カルシウム法を用いて、COS7細胞又は初代培養海馬神経細胞に導入し、次いで免疫化染色を行い蛍光顕微鏡で観察した。
Claims (7)
- 以下の(A)〜(F)の何れかの塩基配列からなるDNA。
(A)配列番号10に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列;
(B)配列番号10に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ神経細胞の樹状突起のスパインへの移行活性を有するペプチドをコードする塩基配列;
(C)配列番号10に示されるアミノ酸配列と少なくとも60%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ神経細胞の樹状突起のスパインへの移行活性を有するペプチドをコードする塩基配列;
(D)配列番号9に示される塩基配列;
(E)配列番号9に示される塩基配列において、1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ神経細胞の樹状突起のスパインへの移行活性を有するペプチドをコードする塩基配列;
(F)配列番号9に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ神経細胞の樹状突起のスパインへの移行活性を有するペプチドをコードする塩基配列; - 以下の(A)〜(C)の何れかのアミノ酸配列からなるペプチド。
(A)配列番号10に示されるアミノ酸配列;
(B)配列番号10に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるペプチドが神経細胞の樹状突起のスパインへの移行活性を有するアミノ酸配列;
(C)配列番号10に示されるアミノ酸配列と少なくとも60%以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるペプチドが神経細胞の樹状突起のスパインへの移行活性を有するアミノ酸配列; - 請求項2記載のペプチドとマーカータンパク質及び/又はペプチドタグとが結合している融合ペプチド。
- 請求項1記載のDNAと所望のペプチドをコードするDNAとをインフレームで連結し、請求項2記載のペプチドと所望のペプチドとの融合ペプチドを発現することができる組換えベクター。
- 請求項4記載の組換えベクターを細胞内に導入することを特徴とする細胞内小器官へ所望のペプチドをデリバリーする方法。
- 請求項2記載のペプチドと所望のペプチドとの結合ペプチドを細胞内に導入することを特徴とする細胞内小器官へ所望のペプチドをデリバリーする方法。
- 細胞内小器官が神経細胞の樹状突起のスパインであることを特徴とする請求項5又は6記載の細胞内小器官へ所望のペプチドをデリバリーする方法。
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JPN6010047078, 山崎博幸、白尾智明, "ドレブリン結合タンパク質Drap1の解析", 第25回日本神経科学大会プログラム・抄録集, 20020707, p. 190, II−B−065 * |
JPN6010047080, Hiroyuki Yamazaki et al, "Domain analysis od Drebrin−associated protein1, Drap1", 神経科学, 20030820, Vol. 42, No. 2, 3, p. 320 * |
JPN6010047087, Yamazaki, H. et al, "Molecular cloning of a novel Drebrin binding protein, Drap1", Jpn. J. Physiol., 2002, Vol. 52, Suppl., S134 * |
JPN6010047090, Hiroyuki Yamazaki et al., Neuroscience Research, 2004, Vol. 46, Suppl. 1, S122, P2−A−039 * |
JPN6010047092, Hiroyuki Yamazaki et al., "Identification and characterization of drebrin binding protein, Drap1", 神経化学, 2002, Vol. 41, No. 3, p. 394, P02−E−49 * |
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