JP2010172277A

JP2010172277A - 高リガンド親和性アルブミン変異体の製造方法

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Publication number: JP2010172277A
Application number: JP2009019238A
Authority: JP
Inventors: Ai Minoge; 藍蓑毛; Masaru Ishima; 優異島; Toru Maruyama; 徹丸山; Hiroshi Morioka; 弘志森岡; Masaki Odagiri; 優樹小田切
Original assignee: Nipro Corp
Current assignee: Nipro Corp
Priority date: 2009-01-30
Filing date: 2009-01-30
Publication date: 2010-08-12

Abstract

【課題】ビリルビン（ＢＲ）などのアルブミン結合性毒素（ＡＢＴ）がより効率的に除去されたアルブミン透析液を調製するために用い得る高ＢＲ親和性アルブミン変異体を提供すること。
【解決手段】本発明の高リガンド親和性アルブミン変異体のスクリーニング方法は、ヒト血清アルブミン変異体をファージ表面に提示するファージライブラリーを作製する工程；該ファージライブラリーをリガンドと接触させて、該ファージへの該リガンドの結合量を測定する工程；および該リガンドの結合量が多いファージを選択する工程；を含み、該ヒト血清アルブミン変異体が、配列表の配列番号２の１位から５８５位までのアミノ酸配列を有するヒト血清アルブミンにおいて、１９５位および１９９位のアミノ酸がリジンまたはアルギニンであり、そして２４０位のアミノ酸がリジンであるアミノ酸配列を有する。
【選択図】図５

Description

本発明は、高リガンド親和性アルブミン変異体を製造する方法に関する。より詳細には、高リガンド親和性アルブミン変異体のハイスループットスクリーニング方法に関する。

近年、アルブミン結合性毒素（ＡＢＴ）を効率的に除去するアルブミン透析という新しい血液浄化療法が開発された。アルブミン透析とは、多分子結合能を有する血清タンパク質であるアルブミンを吸着剤として応用して、血中のＡＢＴを除去する方法である。具体的には、高性能血液透析膜を介して血中のＡＢＴを透析液内のアルブミンに吸着させる。これまでに開発されたアルブミン透析の臨床システムの１つに、Molecular Absorbent Recirculating System（ＭＡＲＳ（登録商標））があり、すでにＭＡＲＳ（登録商標）の施行によるＡＢＴの除去効果、３０日生存率の改善、中枢神経系の機能や循環動態の改善作用などの臨床効果が報告されている（非特許文献１）。しかしながら、ＭＡＲＳ（登録商標）の有用性に関しては、現在もなお賛否が問われている。その原因として、ＡＢＴの１つでありかつ核黄疸などを引き起こす原因物質であるビリルビン（ＢＲ）の劇的な除去効果が得られていないことが挙げられる。

ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）におけるリガンド結合領域は、ＨＳＡ−リガンド複合体のＸ線結晶構造解析、これにより得られた分子模型にアミノ酸置換を導入する部位特異的変異法、化学修飾法などの種々の手法を用いて検討が行われてきた。ＢＲに関しては、薬物の置換実験によってサイトＩ（ドメインＩＩ）が高親和性結合サイトであることが報告されている。しかし、ＢＲが光分解を受けやすい物質であるためＨＳＡ−ＢＲ複合体のＸ線結晶構造解析は困難であり、結合に関与するＨＳＡのアミノ酸については未だに解明されていない。

一方、リガンドライブラリーをファージに提示させてアルブミンに対する結合能をスクリーニングすることにより、アルブミンに対して高い結合性を有するリガンドを検討する方法が開示されている（特許文献１）。この方法では、アルブミンに対して特異的に結合するリガンドが見出されるのみであって、アルブミン中のリガンド結合領域についての情報を容易に得ることはできない。

このように、従来の方法では、高ＢＲ親和性アルブミン変異体を作製するには困難を要する。

特表２００６−５１２０５０号公報

Camus C.ら、Intensive Care Med.，2006年，32巻，1817-1825頁 Brodersen R.ら、J. Clin. Invest.，1974年，54巻，1353-1364頁 Diaz N Z.ら、J. Med. Chem.，2001年，44巻，250-260頁 Watanabe H.ら、Pharm. Res.，2001年，18巻，1775-1781頁

本発明は、ＢＲなどのアルブミン結合性毒素（ＡＢＴ）がより効率的に除去されたアルブミン透析液を調製するために用い得る高ＢＲ親和性アルブミン変異体を提供することを課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）変異体をファージ表面に提示させたファージライブラリーを作製し、これを用いたランダムスクリーニングによって、高ＢＲ親和性を発揮するために必須なアミノ酸残基を同定し、高ＢＲ親和性アルブミン変異体を得て、本発明を完成した。

本発明は、高リガンド親和性アルブミン変異体のスクリーニング方法を提供し、該方法は、
ヒト血清アルブミン変異体をファージ表面に提示するファージライブラリーを作製する工程；
該ファージライブラリーをリガンドと接触させて、該ファージへの該リガンドの結合量を測定する工程；および
該リガンドの結合量が多いファージを選択する工程；
を含み、
該ヒト血清アルブミン変異体が、配列表の配列番号２の１位から５８５位までのアミノ酸配列を有するヒト血清アルブミンにおいて、１９５位および１９９位のアミノ酸がリジンまたはアルギニンであり、そして２４０位のアミノ酸がリジンであるアミノ酸配列を有する。

１つの実施態様では、上記リガンドはビリルビンである。

本発明はまた、高リガンド親和性アルブミン変異体の製造方法を提供し、該方法は、
ヒト血清アルブミン変異体をファージ表面に提示するファージライブラリーを作製する工程；
該ファージライブラリーをリガンドと接触させて、該ファージへの該リガンドの結合量を測定する工程；
該リガンドの結合量が多いファージを選択する工程；
該選択したファージを有するクローンから抽出した高リガンド親和性アルブミン変異体をコードするＤＮＡを、宿主細胞に導入して、該宿主細胞を増殖させる工程；
該増殖させた宿主細胞から、該高リガンド親和性アルブミン変異体を回収する工程；
を含み、
該ヒト血清アルブミン変異体が、配列表の配列番号２の１位から５８５位までのアミノ酸配列を有するヒト血清アルブミンにおいて、１９５位および１９９位のアミノ酸がリジンまたはアルギニンであり、そして２４０位のアミノ酸がリジンであるアミノ酸配列を有する。

１つの実施態様では、上記リガンドはビリルビンである。

１つの実施態様では、上記宿主細胞はピキア属酵母である。

本発明によれば、生体内毒素または疾患に関与する特定の分子（例えば、ビリルビン）に対して、ランダムなアルブミン変異体についてスクリーニングする場合と比較して、特異性および親和性の高いアルブミン変異体をハイスループットにスクリーニングすることができる。したがって、特定の分子に対して特異的結合能を有するアルブミン変異体を容易に製造するために有用である。

オリゴヌクレオチドからの２本鎖ＤＮＡ（それぞれフラグメント１、２、および３）の合成を示す模式図である。実施例１−４で調製したフラグメント１、２、および３のアニーリングを示す模式図である。種々の濃度のｒａｎＨＳＡｄＩＩディスプレイファージおよびＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージと、抗ファージ抗体または抗ＨＳＡポリクローナル抗体との結合量（吸光度）の関係を示すグラフである。ランダムに選択した各クローンのビリルビン（ＢＲ）結合活性を示すグラフである。遊離ＢＲ濃度が低いほど、ＢＲ結合活性が高いことを示す。高ＢＲ結合ファージクローンのシーケンス解析結果を示す図である。塩基性アミノ酸（ＬｙｓおよびＡｒｇ）は黒色の背景に白抜き文字で表し、酸性アミノ酸（Ｇｌｕ）は灰色の背景に黒字で表す。精製したアルブミン変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動写真である。クローン７（野生型）およびクローン１０７のビリルビン結合活性を示すグラフである。

アルブミンとしては、血清アルブミン、卵白アルブミンなどが挙げられるが、本発明において、好ましくは血清アルブミンである。アルブミンの由来は、例えば、ヒトまたは他の温血動物（例えば、ウシ、サル、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ニワトリ、ウズラ）由来であり得る。医薬への利用を考慮すると、ヒトアルブミン、特にヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）が好ましい。以下、本発明においては、アルブミンという場合は、特に言及がなければ、ＨＳＡを意図する。

本発明において、ＨＳＡとは、野生型成熟ＨＳＡをいい、これは配列表の配列番号２の１位から５８５位までのアミノ酸配列を有する。

本発明において、アルブミン変異体とは、配列番号２の１位から５８５位までのアミノ酸配列（ＨＳＡのアミノ酸配列）とは異なる配列であるが、実質的に同一のアミノ酸配列を有し、かつＨＳＡと実質的に同質の活性を有するタンパク質をいう。以下で詳述する本発明の高リガンド親和性アルブミン変異体のスクリーニング方法およびその製造方法において、ファージ表面に提示するアルブミン変異体は、少なくとも配列番号２の１９５位および１９９位のアミノ酸がリジンまたはアルギニンであり、そして２４０位のアミノ酸がリジンである。

本発明において、ＨＳＡと実質的に同一のアミノ酸配列とは、ＨＳＡと好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列である。

ここで「相同性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合（％）を意味する。「類似アミノ酸」とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ）、脂肪族アミノ酸（Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ）、極性アミノ酸（Ｇｌｎ、Ａｓｎ）、塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）、酸性アミノ酸（Ｇｌｕ、Ａｓｐ）、水酸基を有するアミノ酸（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）、側鎖の小さいアミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ）などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換はタンパク質の表現型に変化をもたらさない（すなわち、保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は、当該技術分野で周知であり、種々の文献に記載されている（例えば、Bowieら，Science, 247: 1306-1310 (1990)を参照）。

本明細書におけるアミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；マトリクス=BLOSUM62；フィルタリング=OFF）にて計算することができる。アミノ酸配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、例えば、Karlinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877 (1993)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはNBLASTおよびXBLASTプログラム（version 2.0）に組み込まれている（Altschulら, Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402 (1997)）］、Needlemanら, J. Mol. Biol., 48: 444-453 (1970)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラムに組み込まれている］、MyersおよびMiller, CABIOS, 4: 11-17 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはCGC配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム（version 2.0）に組み込まれている］、Pearsonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のFASTAプログラムに組み込まれている］などが挙げられ、これらも同様に好ましく用いられ得る。

本発明において、実質的に同質の活性とは、ＨＳＡの生理機能（例えば、血清分子のキャリアとしての機能、血漿コロイド浸透圧の維持機能）などを有することをいう。「実質的に同質」とは、それらの機能が定性的に同じであることを意味する。したがって、血清分子のキャリアとしての機能などは同等であることが好ましいが、その程度やタンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。

本発明において、高リガンド親和性アルブミン変異体とは、配列番号２の１位から５８５位までのアミノ酸配列を有する野生型のＨＳＡよりも、任意のリガンドに対してより高い結合活性を有するアルブミン変異体をいう。高リガンド親和性アルブミン変異体は、配列番号２の１位から５８５位までのアミノ酸配列のうち、任意の１以上のアミノ酸が置換、欠失、または挿入されているアミノ酸配列であって、１９５位および１９９位のアミノ酸がリジンまたはアルギニンであり、そして２４０位のアミノ酸がリジンである。野生型ＨＳＡにおいては、配列番号２の１９５位および１９９位のアミノ酸はリジンである。一方、高リガンド親和性アルブミン変異体では、１９５位および１９９位のアミノ酸は塩基性アミノ酸（リジンまたはアルギニン）に保持されており、２４０位のリジンも保持されている。

本発明において、リガンドとは、上記高リガンド親和性アルブミン変異体と結合可能な標的分子をいう。このようなリガンドとしては、生体内毒素、疾患に関与する特定の分子（例えば、ビリルビン）、脂肪酸、無機イオン、あるいは薬剤（例えば、ジルチアゼム、フェニトイン、テオフィリン）などが挙げられる。本発明では、リガンドとして、好ましくはビリルビンが標的とされる。

本発明の高リガンド親和性アルブミン変異体のスクリーニング方法は、ファージディスプレイ法に基づくものであり、
ヒト血清アルブミン変異体をファージ表面に提示するファージライブラリーを作製する工程；
該ファージライブラリーをリガンドと接触させて、該ファージへの該リガンドの結合量を測定する工程；および
該リガンドの結合量が多いファージを選択する工程；
を含む。

本発明に用いられるファージとしては、ファージディスプレイ法に一般的に用いられる繊維状ファージ（ｆ１、ｆｄ、およびＭ１３ファージ）、他のバクテリオファージ（例えば、Ｔ７バクテリオファージとラムドイドファージ）などが挙げられる。繊維状ファージディスプレイ系は、典型的には、ＩＩＩ遺伝子タンパク質のようなマイナーコートタンパク質と、ＶＩＩＩ遺伝子タンパク質、メジャーコートタンパク質への融合を使用するが、ＶＩ遺伝子タンパク質、ＶＩＩ遺伝子タンパク質、ＩＸ遺伝子タンパク質、またはそれらのドメインのような他のコートタンパク質への融合も使用してよい。例えば、Ｍ１３ファージの場合は目的のタンパク質をコードするＤＮＡをコートタンパク質遺伝子に連結する。このファージの遺伝子を大腸菌に形質転換し発現させて、ファージライブラリーを作製する。

また、ファージミド系を利用してもよい。この系では、ＩＩＩ遺伝子へ融合するポリペプチド成分をコードする核酸が、代表的には長さ７００未満のヌクレオチドのプラスミド上に提供される。このプラスミドにはファージの複製起点が含まれるので、このプラスミドを担う細菌細胞がヘルパーファージ、例えば、Ｍ１３Ｋ０１ファージで感染されるときに、このプラスミドはバクテリオファージ粒子へ組み込まれる。ヘルパーファージは、ファージの複製および構築に必要とされるＩＩＩ遺伝子や他のファージ遺伝子のインタクトなコピーを提供する。ヘルパーファージは欠損起点を有するので、ヘルパーファージゲノムは、野生型起点を有するプラスミドに比べて、ファージ粒子へ効率的には組み込まれない。

上記のようなファージに提示されるヒト血清アルブミン変異体（ＨＳＡ変異体）は、配列番号２の１位から５８５位までのアミノ酸配列（ＨＳＡのアミノ酸配列）のうち、任意の１以上のアミノ酸が置換、欠失、または挿入されているアミノ酸配列であって、１９５位および１９９位のアミノ酸がリジンまたはアルギニンであり、そして２４０位のアミノ酸がリジンであるアミノ酸配列を有する。このヒト血清アルブミン変異体をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号２の１位から５８５位までのアミノ酸配列（ＨＳＡ）をコードする塩基配列と実質的に同一の塩基配列であって、配列番号２の１９５位および１９９位がリジンまたはアルギニン、そして２４０位がリジンをコードする塩基配列を含有するＤＮＡなどが挙げられ、例えば、ＨＳＡをコードするＤＮＡに、任意の手段で変異を導入することによって得られる。

ＨＳＡをコードするＤＮＡとしては、ヒトのゲノムＤＮＡ、アルブミン産生細胞（例えば、肝細胞など）由来のｃＤＮＡ、合成ＤＮＡなどが挙げられる。ＨＳＡをコードするゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡは、その産生細胞もしくは組織（例えば、肝臓など）より調製したゲノムＤＮＡ画分および全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡ画分をそれぞれ鋳型として用い、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によって直接増幅することもできる。あるいは、ＨＳＡをコードするゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡは、上記した細胞・組織より調製したゲノムＤＮＡおよび全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡの断片を適切なベクター中に挿入して調製されるゲノムＤＮＡライブラリーおよびｃＤＮＡライブラリーから、コロニーもしくはプラークハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ法などにより、それぞれクローニングすることもできる。

ＨＳＡをコードするＤＮＡは、配列番号１の７３位から１８２７位までの塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号１の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、上記の配列番号２の１位から５８５位までのアミノ酸配列を含むタンパク質と実質的に同質の活性（例えば、血清分子のキャリア機能など）を有するタンパク質をコードするＤＮＡなどが挙げられる。配列番号１の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号１の７３位から１８２７位までの塩基配列とオーバーラップする領域において、約８０％以上、好ましくは約９０％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。

本明細書における塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；フィルタリング=ON；マッチスコア=1；ミスマッチスコア=-3）にて計算することができる。塩基配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、上記したアミノ酸配列の相同性計算アルゴリズムが同様に好ましく例示される。

ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）第２版（J. Sambrookら, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989年）に記載の方法などに従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。ハイブリダイゼーションは、好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行うことができる。

ハイストリンジェントな条件としては、例えば、６×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中４５℃でのハイブリダイゼーション反応の後、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中６５℃での１回以上の洗浄などが挙げられる。当業者は、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、ハイブリダゼーション反応の温度、プローブ濃度、プローブの長さ、ミスマッチの数、ハイブリダイゼーション反応の時間、洗浄液の塩濃度、洗浄の温度などを適宜変更することにより、所望のストリンジェンシーに容易に調節することができる。

塩基配列への変異の導入は、特定のＤＮＡ領域に変異を導入するために当業者が通常用いる手段によって行われる。上記ＨＳＡをコードするＤＮＡに対して、例えば、縮重コドンを用いたＰＣＲ（特定のコドンにヌクレオチドの混合物を含むようなオリゴヌクレオチドを用いてＤＮＡ領域を増幅する）、エラープローンＰＣＲ（複製ミスが起こりやすい酵素や反応条件を選択して行うＰＣＲ）などを行うことによって、ランダム変異が導入される。

ランダム変異を導入したＨＳＡ変異体をコードする遺伝子は、当業者が通常用いる手段によって、上記ファージに導入される。例えば、ファージミドベクターにランダム変異を導入したＨＳＡ遺伝子を挿入し、このベクターを用いてエレクトロポレーションなどの公知の形質転換技術を用いて大腸菌を形質転換する。次いで、形質転換された大腸菌に、ヘルパーファージを感染させた後、当業者が通常用いる手段によってランダム変異ＨＳＡ変異体ディスプレイファージを回収する。回収されたファージは、それぞれが種々の変異を有するＨＳＡを提示しており、ファージライブラリーを構成する。なお、ファージ表面へのＨＳＡ変異体の提示は、抗ＨＳＡ抗体を用いるＥＬＩＳＡなどによって確認することができる。

ファージライブラリーとリガンドとの接触では、リガンドを、予めマイクロタイタープレートの表面やゲルなどの支持体に固定化しておき、そこにファージを含む液を加えて反応させる。反応後、支持体を緩衝液で洗浄することにより、リガンドに結合したファージは支持体に残り、非結合ファージは洗い流される。結合したファージは、緩衝液を相対的に強い酸性または塩基性のｐＨ（例えばｐＨ２またはｐＨ１０）へ変えること、緩衝液のイオン強度を変えること、変性剤を加えること、または他の既知の手段などの任意の手段により、リガンドより遊離させることができる。

また、リガンドから遊離させたファージは、回収後、これをパンニングによって、すなわち、ヘルパーファージとともに大腸菌に感染させて増幅し、上記の操作を繰り返すことによって、次第に強く結合するファージを濃縮することができる。

ファージへのリガンドの結合量を測定するには、まず、回収したファージをマルチウェルアッセイプレート中のウェルのプラスチック表面のような固体支持体表面へ（受動免疫化によって）吸着させる。ここに、ＨＳＡ変異体およびファージの構造を維持する適切な条件下で、リガンドを含む液を添加して反応させる。結合したリガンドの量は、添加した溶液中の非結合リガンド量を測定することによって、あるいは支持体を洗浄した後に支持体に残ったリガンド量を測定することによって求めることができる。

このようにして、リガンドの結合量が多いファージを選択することができる。選択したファージは、上記パンニングによってさらに増幅させることができる。選択されたファージが提示しているＨＳＡ変異体の遺伝子配列を決定することにより、リガンドとの親和性の高い（結合活性が高い）ＨＳＡ変異体のペプチド配列がわかる。この配列に基づき、さらに２次ライブラリーを設計することが可能である。例えば、配列表の配列番号２の１９５位および１９９位のアミノ酸がリジンまたはアルギニンであり、そして２４０位のアミノ酸がリジンであるだけでなく、他の位置のアミノ酸が任意のアミノ酸に特定したライブラリーが設計され得る。したがって、高リガンド親和性アルブミン変異体のよりハイスループットなスクリーニングが可能となる。

スクリーニングによって見出された高リガンド親和性アルブミン変異体（高リガンド親和性ＨＳＡ変異体）は、これを提示するファージを有するクローンから抽出したＤＮＡを宿主細胞に導入し、この宿主細胞を増殖させる工程；次いで、増殖させた宿主細胞から、高リガンド親和性ＨＳＡ変異体を回収することによって、製造することができる。

高リガンド親和性ＨＳＡ変異体をコードするＤＮＡは、制限酵素およびＤＮＡリガーゼを用いて、適切な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより、このＤＮＡを含む発現ベクターを製造することができる。

発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例えば、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例えば、ＳＨ１９、ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどの動物（昆虫）ウイルス、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。

プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。本発明において宿主細胞として用いることができるものとしては、特に制限はなく、哺乳動物をはじめとする動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞、真菌細胞などの各種真核細胞、あるいはトランスジェニック動植物もしくは昆虫などが挙げられる。

例えば、宿主が酵母である場合、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。

宿主が動物細胞である場合、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来プロモーター（例えば、ＣＭＶ前初期プロモーター）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来プロモーター（例えば、ＨＩＶＬＴＲ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）由来プロモーター（例えば、ＲＳＶＬＴＲ）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）由来プロモーター（例えば、ＭＭＴＶＬＴＲ）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）由来プロモーター（例えば、ＭＭＴＶＬＴＲ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）由来プロモーター（例えば、ＨＳＶチミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター）、ＳＶ４０由来プロモーター（例えば、ＳＶ４０初期プロモーター）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）由来プロモーター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来プロモーター（例えば、ＡＡＶｐ５プロモーター）、アデノウイルス（ＡｄＶ）由来プロモーター（Ａｄ２またはＡｄ５主要後期プロモーター）などが用いられる。

宿主が昆虫細胞である場合、ポリヘドリンプロモーター、P10プロモーターなどが好ましい。

発現ベクターとしては、上記の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製起点などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子［メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性］、アンピシリン耐性（Ａｍｐ^ｒ）遺伝子、ネオマイシン耐性（Ｎｅｏ^ｒ）遺伝子（Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター（ＣＨＯ−ｄｈｆｒ⁻）細胞を用い、ｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によって選択することもできる。さらに、挿入されるＤＮＡが開始コドンおよび終止コドンを含まない場合には、開始コドン（ＡＴＧまたはＧＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ、ＴＧＡ、ＴＡＡ）を、それぞれプロモーター領域の下流およびターミネーター領域の上流に含むベクターが好ましく使用される。

また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列をコードする塩基配列（シグナルコドン）を、高リガンド親和性ＨＳＡ変異体をコードするＤＮＡの５’末端側に付加してもよい。例えば、宿主が酵母である場合、ＭＦαシグナル配列、ＳＵＣ２シグナル配列などが、宿主が動物細胞である場合、インスリンシグナル配列、α−インターフェロンシグナル配列、抗体分子シグナル配列などがそれぞれ用いられる。しかしながら、ＨＳＡのネイティブなプレプロ配列（配列番号２に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号−２４〜−１で示されるアミノ酸配列）は多くの異種真核細胞で分泌シグナルとして機能することが知られているので、プレプロＨＳＡをコードするＤＮＡをそのまま発現ベクター中に挿入することもできる。

上記のように、宿主としては、例えば、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞、動物などが用いられる。

酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２、ＡＨ２２Ｒ⁻、ＮＡ８７−１１Ａ、ＤＫＤ−５Ｄ、２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）ＮＣＹＣ１９１３、ＮＣＹＣ２０３６などが用いられる。

昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のＨｉｇｈＦｉｖｅ^ＴＭ細胞、Mamestra brassicae由来の細胞、Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合、昆虫細胞としては、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、In Vivo, 13, 213-217 (1977)）などが用いられる。

昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる。

動物細胞としては、例えば、サル由来細胞（例えば、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＣＶ−１、Ｖｅｒｏ）、ハムスター由来細胞（例えば、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ｄｈｆｒ⁻）、マウス由来細胞（例えば、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｌ、Ｌ９２９、ＣＴＬＬ−２、ＡｔＴ−２０）、ラット由来細胞（例えば、Ｈ４ＩＩＥ、ＰＣ−１２、３Ｙ１、ＮＢＴ−ＩＩ）、ヒト由来細胞（例えば、ＨＥＫ２９３、Ａ５４９、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＨＬ−６０、Ｊｕｒｋａｔ、Ｕ９３７）などが用いられる。

形質転換は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。

酵母は、例えば、Methods in Enzymology, 194, 182-187 (1991)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)などに記載の方法に従って形質転換することができる。

昆虫細胞および昆虫は、例えば、Bio/Technology, 6, 47-55 (1988)などに記載の方法に従って形質転換することができる。

動物細胞は、例えば、細胞工学別冊8 新細胞工学実験プロトコール, 263-267 (1995)（秀潤社発行）、Virology, 52, 456 (1973)に記載の方法に従って形質転換することができる。

形質転換体の培養は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
培地としては液体培地が好ましい。また、培地は、形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物などを含有することが好ましい。ここで、炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖などが；窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質が；無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがそれぞれ挙げられる。また、培地には、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは、好ましくは約５〜８である。

宿主が酵母である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、バークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地や０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地などが挙げられる。培地のｐＨは、好ましくは約５〜８である。培養は、通常約２０℃〜３５℃で、約２４〜７２時間行われる。必要に応じて、通気や撹拌を行ってもよい。

宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えばGrace’s Insect Mediumに非働化した１０％ウシ血清などの添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは、好ましくは約６．２〜６．４である。培養は、通常約２７℃で、約３〜５日間行われる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。

宿主が動物細胞である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含む最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地などが用いられる。培地のｐＨは、好ましくは約６〜８である。培養は、通常約３０℃〜４０℃で、約１５〜６０時間行われる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。

ところで、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属酵母は、メタノールを唯一の炭素源として増殖することが可能であり、メタノール中で生育させると、メタノールおよびその代謝中間体の処理に必要な酵素が脱抑制されて発現する。このメタノール資化経路を利用すると、異種タンパク質の分泌発現量は、サッカロミセス属酵母を大きく上回ることが知られている。実際、この系を利用したＨＳＡ製造は既に実用化の段階にあり（例えば、特開平６−２２７８４号公報参照）、１Ｌの培地から１０ｇオーダーのＨＳＡを製造することができる。したがって、以下に、本発明の特に好ましい実施態様の１つとして、ピキア属酵母を宿主細胞として用いた高リガンド親和性ＨＳＡ変異体の製造方法について説明する。

用いられるベクターは、ピキア属酵母の菌体内で自律的に複製されるか、あるいは酵母ゲノム内に組み込まれることにより遺伝的に安定に維持されるものであれば特に制限はない。自律複製可能なベクターとして、例えばＹＥｐベクター、ＹＲｐベクター、ＹＣｐベクターなどが挙げられる。また、酵母ゲノム内に組み込まれ得るベクターとしては、例えば、ＹＩｐベクター、ＹＲｐベクターが挙げられる。

ピキア属酵母で機能し得るプロモーターとしては、酵母由来のプロモーター、例えば、Ｓ．セレビシエ由来のＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなど、Ｐ．パストリス由来のアルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ）１プロモーター、ＡＯＸ２プロモーター、ジヒドロキシアセトンシンターゼプロモーター、Ｐ４０プロモーター、ＡＤＨプロモーター、葉酸デヒドロゲナーゼプロモーター等が挙げられる。また、上記酵母由来プロモーターが、遺伝子発現効率がさらに向上するように修飾された変異型プロモーター、例えば、変異型ＡＯＸ２（ｍＡＯＸ２）プロモーター［Ohi et al., Mol. Gen.Genet., 243, 489-499 (1994); 特開平４−２９９９８４号公報］などであってもよい。好ましくは、プロモーターは、ピキア属酵母のメタノール代謝系を利用すべく、メタノールもしくはその代謝中間体の処理に必要な酵素遺伝子のプロモーター、例えば、ＡＯＸ１プロモーターおよびｍＡＯＸ２プロモーターである。

得られた高リガンド親和性ＨＳＡ変異体をコードするＤＮＡを含む発現ベクターは、さらにピキア属酵母で機能し得る転写終結配列（ターミネーター）（例えば、ＡＯＸ１ターミネーターなど）、エンハンサー配列、酵母の選択に利用できる選択マーカー遺伝子（栄養要求性遺伝子、例えば、Ｐ．パストリスもしくはＳ．セレビシエ由来のＨＩＳ４、ＬＥＵ２、ＡＲＧ４、ＵＲＡ３遺伝子など、または抗生物質耐性遺伝子、例えば、シクロヘキシミド、Ｇ−４１８、クロラムフェニコール、ブレオマイシン、ハイグロマイシン等に対する耐性遺伝子など）などを含んでいることが好ましく、また、所望により酵母で機能し得る複製可能単位を含んでいてもよい。さらに、ベクターの大量調製のために、大腸菌で機能し得る複製可能単位および大腸菌の選択に利用できる選択マーカー遺伝子（例えば、アンピシリンやテトラサイクリンに対する耐性遺伝子など）を含んでいることがより好ましい。

発現ベクターが酵母ゲノム内に組み込まれるタイプのベクターである場合、このベクターは、相同組換えに必要な酵母ゲノムと相同な配列をさらに含むことが望ましい。そのような相同配列としては、上述の栄養要求性遺伝子の配列が挙げられる。したがって、好ましい一実施態様において、本発明の発現ベクターは、栄養要求性遺伝子内に上記変異型アルブミンの発現カセット（本明細書において「発現カセット」とは遺伝子発現を可能にする単位を意味し、プロモーターの制御下に蛋白質コード配列が配置されたものを最小単位とするが、好ましくはプロモーター−蛋白質コード領域−ターミネーターからなる単位である）が挿入されたものである。

上記のようにして得られた発現ベクターは、例えば、コンピテント細胞法、プロトプラスト法、リン酸カルシウム共沈法、ポリエチレングリコール法、リチウム法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポソーム融合法、パーティクル・ガン法などの公知の形質転換技術を用いて、標的ピキア属酵母菌体内に導入することができる。

本発明で用いられるピキア属酵母は特に限定されない。例えば、Ｐ．パストリス、ピキア・アカシエ（Pichia acaciae）、ピキア・アングスタ（Pichia angusta）、ピキア・アノマラ（Pichia anomala）、ピキア・カプスルラータ（Pichia capsulata）、ピキア・シフェリイ（Pichia ciferrii）、ピキア・エチェルシイ（Pichia etchellsii）、ピキア・ファビアニイ（Pichia fabianii）、ピキア・ファリノーサ（Pichia farinosa）、ピキア・グイリエルモンディ（Pichia guilliermondii）、ピキア・イノシトヴォラ（Pichia inositovora）、ピキア・ジャディニイ（Pichia jadinii）、ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）、ピキア・ノルヴェゲンシス（Pichia norvegensis）、ピキア・オフナエンシス（Pichia ofunaensis）、ピキア・ピヌス（Pichia pinus）などが挙げられる。好ましくは、Ｐ．パストリス、栄養要求性変異Ｐ．パストリス株（例えば、Ｐ．パストリスＧＴＳ１１５株（ＨＩＳ４^-）［ＮＮＲＬＹ−１５８５１］、Ｐ．パストリスＧＳ１９０株（ＡＲＧ４^-）［ＮＮＲＬＹ−１８０１］、Ｐ．パストリスＰＰＦ１（ＨＩＳ４^-，ＵＲＡ４^-）［ＮＮＲＬＹ−１８０１７］など）である。

形質転換されたピキア属酵母は、当該技術分野で通常使用される方法で培養することにより、高リガンド親和性ＨＳＡ変異体を産生することができる。用いられる培地には、宿主細胞の生育に必要な炭素源および無機または有機窒素源が少なくとも含まれる必要がある。炭素源としては、メタノール、グリセロール、グルコース、ショ糖、デキストラン、可溶性デンプン等が例示される。また、無機または有機窒素源としては、アンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、酵母エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが例示される。さらに、所望により他の栄養素、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどの無機塩、ビオチンなどのビタミン類、抗生物質などを含んでいてもよい。

用いられる培地としては、例えば、通常の天然培地（例えば、ＹＰＤ培地、ＹＰＭ培地、ＹＰＧ培地など）または合成培地が挙げられる。培地のｐＨおよび培養温度は、酵母の増殖およびアルブミンの産生に適したｐＨおよび温度が適宜採用されるが、例えば、ｐＨ約５〜約８、培養温度約２０〜約３０℃が好ましく例示される。また、必要に応じて通気や攪拌を行うこともできる。培養は、通常約４８〜約１２０時間行われる。

例えば、ピキア属酵母菌体内で機能し得るプロモーターとしてＡＯＸ１プロモーター、ｍＡＯＸ２プロモーターなどのメタノールにより発現誘導されるプロモーターを使用する場合、菌体の増殖のための炭素源としてグリセロールを含み、アルブミンの発現誘導因子としてメタノールを含む、ｐＨ約６．０に制御された天然培地を用いて液体通気攪拌培養を行う方法が最も好ましく例示される。アルブミンの発現が菌体の生育にとって好ましくない場合には、まずメタノール以外の炭素源で菌体量を増加させた後でメタノールを添加してアルブミンの発現を誘導する培養方法がより好ましい。また、ジャーファーメンターでの培養においては、高密度培養法がアルブミンの産生に好適な方法として例示される。培養は、回分培養、流加培養、連続培養のいずれの方式により行ってもよいが、好ましくは流加培養法が挙げられる。すなわち、一定期間、宿主菌体をその増殖に適した炭素エネルギー源（例えば、グルコースなど）および／または栄養源を含有する培地（初期培地）中で培養し、状況に応じてある時点から、宿主菌体の増殖を支配する基質（即ち、メタノール）を該培地に追加供給しながら、アルブミンを培養終了時まで系外に抜き出さない方法が用いられる（例えば、特開平３−８３５９５号公報を参照）。

培養物中に産生された高リガンド親和性ＨＳＡ変異体は、培養終了後の培養物を遠心分離および／または濾過して培養上清（分泌発現させた場合）もしくは酵母菌体（菌体内発現させた場合）を回収し、次いで、上清もしくは菌体から公知の方法に従って単離・精製することができる。このような方法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法；透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法；イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法；アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法；逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法；等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法；などが用いられる。これらの方法は、適宜組み合わせることもできる。

こうして得られた高リガンド親和性ＨＳＡ変異体は、必要に応じて、公知の手法（限外濾過、除菌濾過、分注、凍結乾燥など）により処理されて、医療用製剤とされ得る。

医療用製剤として処理された高リガンド親和性ＨＳＡ変異体は、各種微生物に汚染されている可能性はきわめて低いと考えられるが、製剤の無菌性をより積極的に確保するための手段として、無菌充填後に加熱処理（パストリゼーション）による夾雑微生物の不活化を行ってもよい。

加熱処理は、投与単位当たりに容器に充填された製剤が、いずれの容器に充填されたものであっても、例えば、約５０〜約７０℃（好ましくは約６０℃）の湯浴中に約３０分間以上保持することにより十分に夾雑微生物が不活化される。加熱時間は、好ましくは約３０分間〜約２時間である。

高リガンド親和性ＨＳＡ変異体は、代表的には、アルブミン透析に吸着剤として用いられ得る。あるいは、リガンドの種類に応じて、血液などの体液や医療用液体からリガンドを除去する目的であるいはリガンドの濃度を調節する目的で使用され得る。あるいは、医薬としても使用することができる。

以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

（実施例１：ＨＳＡドメインＩＩ（ＨＳＡｄＩＩ）遺伝子の構築）
（実施例１−１：ＨＳＡｄＩＩ遺伝子の調製方法）
Ｔｏｎｅｎ株式会社から恵与されたＨＳＡｃＤＮＡを鋳型とし、ＳｆｉＩ−ｄｏｍａｉｎＩＩ（5'-CCTTTCTATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGATGAAGGGAAGGCT-3'：配列番号３）とＮｏｔＩ−ｄｏｍａｉｎＩＩ（5'-CGGCGCACCTGCGGCCGCCTGAGGCTCTTCCAC-3'：配列番号４）とを合成プライマーとしてＰＣＲを行って、ＨＳＡｄＩＩ遺伝子を得た。ＰＣＲ反応液は、プラスミドｐＰＩＣ９にＨＳＡの遺伝子が挿入されたプラスミドｐＰＩＣ９−ＨＳＡ（５ｎｇ／μＬ）２μＬ、１０×ｐｆｕ緩衝液５μＬ、２．５ｍＭｄＮＴＰｓ４μＬ、Ｈ_２Ｏ３４μＬ、ｃｌｏｎｅｄｐｆｕＤＮＡポリメラーゼ（２．５ユニット／μＬ、STRATAGENE社）１μＬ、および合成プライマー（１０ｐｍｏｌ／μＬ）各２μＬであった。ＰＣＲ条件は、９５℃，２分の後、９５℃，３０秒、５０℃，３０秒、７２℃，３０秒を３０サイクル、次いで７２℃，１０分で行った。

（実施例１−２：ＨＳＡｄＩＩ遺伝子のｐＣＡＮＴＡＢ−５Ｅファージミドベクターへのライゲーション方法）
ｐＣＡＮＴＡＢ−５ＥファージミドベクターおよびＨＳＡｄＩＩ遺伝子を、それぞれ制限酵素ＳｆｉＩ／ＮｏｔＩで切断した。制限酵素で切断したｐＣＡＮＴＡＢ−５Ｅ０．１μｇに対し、ＨＳＡｄＩＩ遺伝子を０．１μｇ加え、さらに１ＭＮａＣｌ１μＬとＴＥ（ｐＨ７．５）とを加えて計２３μＬとした。６５℃，１０分でアニーリング後、室温まで冷却し、５×ライゲーション緩衝液（ＢＲＬ）６μＬ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬ）１μＬを加えて計３０μＬとし、１６℃にて一晩インキュベートし、ライゲーションを行った。

（実施例１−３：調製したＨＳＡｄＩＩ遺伝子のランダム変異）
ＨＳＡｄＩＩ遺伝子の前半部分であるＨＳＡｄＩＩＡ領域に存在する計１２残基のＬｙｓおよびＡｒｇの遺伝子コドンをＲＲＡ配列とし（ＲはＡまたはＧである）、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、およびＧｌｙの４残基にランダムに変異が導入されるようにオリゴヌクレオチドを設計した。このオリゴヌクレオチドから２本鎖ＤＮＡを合成し（フラグメント１、２、および３）、これらのフラグメントを繋いで両末端に制限酵素ＳｆｉＩ／ＮｃｏＩの認識部位を付加したフラグメントを作製した（フラグメント５）。次いで、ＷＴＨＳＡｄＩＩにおいてフラグメント５の位置に対応する配列を、ＷＴＨＳＡｄＩＩ遺伝子を挿入したｐＣＡＮＴＡＢ−５Ｅベクターから切り出し、このベクターとフラグメント５とをライゲーションすることにより、ｒａｎＨＳＡｄＩＩ遺伝子を導入した。

（実施例１−４：オリゴヌクレオチドからの２本鎖ＤＮＡ合成）
オリゴヌクレオチドからの２本鎖ＤＮＡ合成には、酵素としてクレノウフラグメント（ＴａＫａＲａ）用いた。オリゴヌクレオチド（それぞれＨＳＡ＿ｍｕｔ＿１（配列番号５）とＨＳＡ＿ｍｕｔ＿２（配列番号６）、ＨＳＡ＿ｍｕｔ＿３（配列番号７）とＨＳＡ＿ｍｕｔ＿４（配列番号８）、およびＨＳＡ＿ｍｕｔ＿５（配列番号９）とＨＳＡ＿ｍｕｔ＿６（配列番号１０）との組み合わせ）各１ｎｍｏｌを終濃度５０ｍＭのＮａＣｌ中で、９５℃，５分で反応させてアニーリングした。次いで、室温までゆっくり冷却し、１０×ライゲーション緩衝液７．５μＬ、Ｈ_２Ｏ９．５μＬ、２．５ｍＭｄＮＴＰｓ６μＬ、およびクレノウフラグメント（２ユニット／μＬ）２μＬを加え、３７℃にて１時間反応させた。増幅された２本鎖ＤＮＡを、それぞれフラグメント１、２、および３と表記する（図１参照）。使用したオリゴヌクレオチドの配列を表１に示す。なお、塩基に付した下線は変異導入部位を示す。

（実施例１−５：２本鎖ＤＮＡフラグメントのアニーリング・伸長・増幅（ジャンピングＰＣＲ））
クレノウフラグメントを用いて増幅した２本鎖ＤＮＡを等モル量混和した反応液に、１０×ｐｆｕ緩衝液１０μＬ、２．５ｍＭｄＮＴＰｓ８μＬ、Ｈ_２Ｏ７６μＬ、およびｐｆｕＵｌｔｒａＨＦＤＮＡｐａｌ（２．５ユニット／μＬ）１μＬを加えた。ＰＣＲ条件は、９５℃，２分の後、９５℃，１分、６３℃，４分を７サイクル、次いで７２℃，１０分で２本鎖ＤＮＡを伸長させた後、プライマー（２０ｐｍｏｌ／μＬ）を２μＬずつ加え、９５℃，２分の後、９５℃，３０秒、５０℃，３０秒、７２℃，３０秒を３０サイクル、次いで７２℃，１０分で増幅を行った。まず、フラグメント１と２とを繋げてフラグメント４を作製し、次にフラグメント３とフラグメント４とを繋げてフラグメント５を作製した（図２参照）。以下に使用したプライマーを示す。

ＨＳＡ＿ｄＩＩ＿ＳｆｉＩ：
5'-CCTTTCTATGCGGCCCAGCCGGCCATGTCCGATGAA-3'（配列番号１１）
ＨＳＡ＿ｄＩＩ＿１２０ｒ：
5'-GGAAACTTCTGCAAACTCAGC-3'（配列番号１２）
ＨＳＡ＿ｄＩＩ＿ＮｃｏＩ：
5'-CAGATCTCCATGGCAGCATTCCGTGTGGAC-3'（配列番号１３）

（実施例１−６：ｒａｎＨＳＡｄＩＩ遺伝子のｐＣＡＮＴＡＢ−５Ｅファージミドベクターへのライゲーション方法）
ＷＴＨＳＡｄＩＩ遺伝子を挿入したｐＣＡＮＴＡＢ−５Ｅファージミドベクターとフラグメント５を制限酵素ＳｆｉＩ／ＮｃｏＩで切断した。制限酵素で切断したｐＣＡＮＴＡＢ−５Ｅ０．１μｇに対し、フラグメント５（インサート）を０．１μｇ加え、１ＭＮａＣｌ１μＬとＴＥ（ｐＨ７．５）とで計２３μＬとした。６５℃，１０分でアニーリング後、室温まで冷却し、５×ライゲーション緩衝液（ＢＲＬ）６μＬおよびＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬ）１μＬを加えて計３０μＬとし、１６℃にて一晩インキュベートしてライゲーションを行った。

（実施例２：ｒａｎＨＳＡｄＩＩディスプレイファージライブラリーの作製）
ｒａｎＨＳＡｄＩＩ遺伝子を挿入したｐＣＡＮＴＡＢ−５Ｅファージミドベクターを用いて、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ３００μＬをエレクトロポレーション法（２．５ｋＶ，２５μＦ，４００Ω）により形質転換した。パルス直後の菌をＳＯＣ培地３ｍＬで懸濁し、３７℃にて１時間培養した。次いで、１０ｍＬのＳＢ培地（３％Ｔｒｙｐｒｏｎｅ、２％ＹｅａｓｔＥｘｔｒａｃｔ、１％ＭＯＰＳ）（カルベニシリン２０μｇ／ｍＬおよびテトラサイクリン１０μｇ／ｍＬを含む）を加え、緩やかに混和し、３７℃にてさらに１時間培養後、カルベニシリンを終濃度５０μｇ／ｍＬとなるように加えた。さらに１時間培養し、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージを約１０^１２ｐｆｕ加えて緩やかに混和した後、全量を１００ｍＬのＳＢ培地（カルベニシリン５０μｇ／ｍＬおよびテトラサイクリン１０μｇ／ｍＬを含む）に移した。３７℃にて穏やかに振とう培養し、ファージを大腸菌へ感染させ、２時間後に終濃度７０μｇ／ｍＬとなるようにカナマイシンを加え、３７℃にて一晩激しく振とう培養した。当業者が通常用いる一般的手法に従って、ｒａｎＨＳＡｄＩＩディスプレイファージを回収した。

ファージ表面にアルブミンが提示されているかどうかを、ＥＬＩＳＡで確認を行った。９６穴マルチプレートに０．５％ゼラチン／ＰＢＳ溶液で２倍希釈した濃縮ファージディスプレイｒａｎＨＳＡｄＩＩ１００μＬを加え、室温にて一晩静置した。０．０５％のＴｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ溶液３００μＬで３回洗浄後、非特異的結合を除くために０．５％ゼラチン／ＰＢＳ溶液１５０μＬを加え、３７℃にて２時間静置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ溶液３００μＬで３回洗浄後、０．５％ゼラチン／ＰＢＳ溶液で５０００倍希釈した抗Ｍ１３ＫＯ７／ＨＲＰ標識抗体（抗ファージ抗体）または抗ＨＳＡポリクローナル抗体（抗アルブミン抗体）１００μＬを加え、室温にて１時間静置した。０．０５％のＴｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ溶液３００μＬで３回洗浄後、発色液（０．４ｍｇ／ｍＬオルトフェニレンジアミンおよび０．００７％Ｈ_２Ｏ_２）１００μＬを加えた。室温にて５〜１５分間反応させた後、１Ｍ硫酸を加えて反応を停止した。各ウェルの４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。なお、対照として、何も提示していないヘルパーファージについても同様の操作を行った。結果を図３に示す。

図３から明らかなように、何も提示していないヘルパーファージが抗ファージ抗体のみに反応性を示したのに対し、作製したｒａｎＨＳＡｄＩＩディスプレイファージは抗アルブミン抗体にも反応を示した。このことから、ファージ上にＨＳＡのドメインＩＩが提示されていることが確認できた。

（実施例３：バイオパンニング）
ＢＲをカップリングさせたＥＡＨＳｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｅゲルにブロッキング溶液として０．５％ゼラチン／ＰＢＳ溶液１ｍＬ加え、遮光下で室温にて一晩静置した。ゼラチン／ＰＢＳ溶液を除去した後、ブロッキング溶液で２倍希釈したファージライブラリー１ｍＬを加え、３７℃にて２時間静置した。０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで１０回洗浄後、０．１Ｎグリシン／塩酸（ｐＨ２．２）＋１ｍｇ／ｍＬＢＳＡ１ｍＬを加え、室温にて１０分間放置した。次いで、スピンでゲルを落とし、上清を別のチューブに移し、６０μＬの２ＭＴｒｉｓを加えて中和した。ここへ１０ｍＬの増殖期ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株（ＯＤ_６００＝１．０）を加え、室温にて１５分間放置した。１２ｍＬのＳＢ培地（カルベニシリン５０μｇ／ｍＬおよびテトラサイクリン１０μｇ／ｍＬを含む）を加えて静かに混和し、３７℃にて穏やかに振とう培養して大腸菌への感染を行った。２時間後、終濃度７０μｇ／ｍＬとなるようにカナマイシンを加え、３７℃にて一晩激しく振とう培養した。当業者が通常行う一般的手法に従ってＨＳＡｄＩＩディスプレイファージを回収し、ＰＥＧ沈殿を５００μＬのＰＢＳに溶解させ、同量のブロッキング溶液を加えて穏やかに混合した。以上の操作をさらに２回繰り返した。

（実施例４：ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）法による遊離ＢＲ濃度の定量）
パンニング後、スクリーニングされたファージの中から１１１クローンをランダムに拾い、以下に記載のようにＢＲ結合活性を評価した。なお、遊離ＢＲ濃度は、Brodersenらの方法（非特許文献２）を改良して評価した。

９６穴マルチプレートに０．５％ゼラチン／ＰＢＳ溶液で２倍希釈した濃縮ｒａｎＨＳＡｄＩＩディスプレイファージ１００μＬを加え、室温にて一晩静置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ溶液３００μＬで３回洗浄後、非特異的結合を除くために０．５％ゼラチン／ＰＢＳ溶液１５０μＬを加え、３７℃で２時間放置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ溶液３００μＬで３回洗浄後、５０μＭＢＲ溶液２００μＬを加え、３７℃で２０分間静置した。１．７５ｍＭＨ_２Ｏ_２１０μＬを加え、３分間放置した後、１μｇ／ｍＬ西洋ワセビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）溶液１０μＬを加えて反応を開始した。添加後、経時的に各ウェルの４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。初期酸化速度（Ｖ_０）とＢＲ濃度とをプロットした検量線を作成し、反応液中の遊離ＢＲ濃度を算出した。結果を図４に示す。遊離ＢＲ濃度が低いほど、ＢＲ結合活性が高いことを示す。

図４において矢印で示すように、野生型ｄＩＩ（コントロール）に比べ非結合型ＢＲが９０％以下だったクローンが１５クローン存在した。

（実施例５：高ＢＲ結合ファージクローンのシーケンス解析）
野生型ｄＩＩに比べて非結合型ＢＲが９０％以下だったクローンについて、シーケンス解析を行った。１５クローンのうち７クローンは、遺伝子上でフレームシフトを起こしておりＨＳＡｄＩＩの配列を保持していなかった。ＨＳＡｄＩＩ配列を保持していた８クローンのシーケンス解析結果を図５に示す。

図５に示すように、クローン７は、野生型ＨＳＡｄＩＩの配列と全く一致していたので、図５では７（野生型）と表記する。変異を導入した１２残基のうち１０残基は電荷の異なる４残基にランダムに変異が導入されていたのに対し、配列番号２の１９５位および１９９位のＬｙｓは、ほぼ全てのクローンにおいてＬｙｓもしくはＡｒｇという塩基性アミノ酸に保持されていた。この結果より、ＨＳＡの配列番号２の１９５位および１９９位のＬｙｓが、ＢＲ結合に関与していることが考えられた。興味深いことに、この結果はDiaz N Z.ら（非特許文献３）が報告したＨＳＡ分子上のＢＲ結合部位と一致していた。すなわち、さらなる高ＢＲ親和性アルブミン変異体を作製するには、配列番号２の１９５位および１９９位にＬｙｓもしくはＡｒｇという塩基性アミノ酸を保持する必要があると考えられた。

ファージの保持する遺伝子は一本鎖ＤＮＡであるため、二本鎖ＤＮＡに比べて不安定であることが知られている。そのため、ＨＳＡｄＩＩの配列を保持していなかったクローンは、パンニングを繰り返す間に遺伝子上でフレームシフトを起こしたと考えられた。

（実施例６：選択したクローンのタンパク質発現・精製）
選択したクローンを感染させた大腸菌ＸＬ１-ＢｌｕｅのコロニーをＬＢ寒天培地上からピックアップし、ＰＣＲによりＨＳＡｄＩＩｃＤＮＡを増幅・精製した後、ＧＳ１１５株ピキア属酵母のゲノムに挿入し、アルブミン変異体の発現細胞を作製した。その後、当該酵母を、Watanabe H.ら（非特許文献４）の方法に従って培養し、アルブミン変異体の発現・精製を行った。精製したアルブミン変異体をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した（図６）。

図６に示すように、クローンの１、２、４、および６が断片化され、メインバンド（図６中の囲みの位置）が他のバンドより薄いことが認められた。全てのタンパク質を同条件で培養・精製したため、クローンによっては酵母由来のプロテアーゼにより切断されやすい配列または構造を有していることが考えられる。そこで、断片化を受けているクローンの相互比較を行ったところ、配列番号２の２４０位の正電荷が欠落しているクローンが断片化されやすい傾向が見られた。このことから、ＨＳＡの構造を安定化するには、配列番号２の２４０位のリジンを保持する必要があることが示唆された。

（実施例７：ＨＲＰ法によるＢＲ結合活性評価）
ＨＲＰ法を用いて、クローン７（野生型）およびクローン１０７のビリルビン結合活性を評価した。結果を図７に示す。クローン１０７はタンパク質レベルにおいて、野生型ドメインＩＩに比べて高いビリルビン結合活性を有していることが分かった。

本発明の高リガンド親和性アルブミン変異体のスクリーニング法によれば、生体内毒素または疾患に関与する特定の分子に対して、ランダムな変異体についてスクリーニングする場合と比較して、特異性および親和性の高いアルブミン変異体をハイスループットにスクリーニングすることができる。したがって、医薬品、例えば、ＢＲがより効率的に除去されたアルブミン透析液、の迅速な開発および副作用の少ない医薬品を提供する上で非常に有用である。

さらに、本発明の方法は、アルブミンとの結合性が高く透析では除くことが難しい分子、または、本来アルブミンには結合しないが、透析では除くことが難しい分子などに対して高親和性のアルブミン変異体をハイスループットにスクリーニングし、速やかに医薬への応用を実現させることにも有用である。

Claims

高リガンド親和性アルブミン変異体のスクリーニング方法であって、
ヒト血清アルブミン変異体をファージ表面に提示するファージライブラリーを作製する工程；
該ファージライブラリーをリガンドと接触させて、該ファージへの該リガンドの結合量を測定する工程；および
該リガンドの結合量が多いファージを選択する工程；
を含み、
該ヒト血清アルブミン変異体が、配列表の配列番号２の１位から５８５位までのアミノ酸配列を有するヒト血清アルブミンにおいて、１９５位および１９９位のアミノ酸がリジンまたはアルギニンであり、そして２４０位のアミノ酸がリジンであるアミノ酸配列を有する、
方法。
前記リガンドがビリルビンである、請求項１に記載の方法。
高リガンド親和性アルブミン変異体の製造方法であって、
ヒト血清アルブミン変異体をファージ表面に提示するファージライブラリーを作製する工程；
該ファージライブラリーをリガンドと接触させて、該ファージへの該リガンドの結合量を測定する工程；
該リガンドの結合量が多いファージを選択する工程；
該選択したファージを有するクローンから抽出した高リガンド親和性アルブミン変異体をコードするＤＮＡを、宿主細胞に導入して、該宿主細胞を増殖させる工程；
該増殖させた宿主細胞から、該高リガンド親和性アルブミン変異体を回収する工程；
を含み、
該ヒト血清アルブミン変異体が、配列表の配列番号２の１位から５８５位までのアミノ酸配列を有するヒト血清アルブミンにおいて、１９５位および１９９位のアミノ酸がリジンまたはアルギニンであり、そして２４０位のアミノ酸がリジンであるアミノ酸配列を有する、
方法。
前記リガンドがビリルビンである、請求項３に記載の方法。
前記宿主細胞がピキア属酵母である、請求項３または４に記載の方法。