CN113087776B - 一种丝状噬菌体多克隆抗体及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种丝状噬菌体多克隆抗体及其制备方法与应用。本发明以M13KO7噬菌体作为免疫原，与弗氏完全/不完全佐剂混合对兔进行5～7次免疫，每次免疫间隔21～28天，收集兔全血，分离血清获得多克隆抗体。本发明提供的丝状噬菌体多克隆抗体能够特异性结合并识别丝状噬菌体，具有特异性高、效价高、灵敏度高的优点，且制备方法简单便捷，为丝状噬菌体展示技术提供了重要的筛选试剂，在功能蛋白筛选、抗原抗体库建立、药物或疫苗筛选、病原检测或基因治疗靶标筛选等方面具有重要的应用价值。

Description

一种丝状噬菌体多克隆抗体及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种丝状噬菌体多克隆抗体及其制备方法与应用。

背景技术

噬菌体展示技术是由George Smith于1985年建立的基因表达筛选技术，该技术通过将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时，外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面。噬菌体展示技术可将重组蛋白质筛选和基因筛选合二为一，已经作为一种强大的工具运用在抗体和酶的配体筛选、小分子的受体筛选、基因工程抗体筛选等各个领域。该技术获得了2018年诺贝尔化学奖，主要研究成果涉及对蛋白质演化进行控制，开发特异性蛋白质代替传统方法生产的药物、化学品，获得了催化化学反应的定制酶、定向进化的人类抗体药物。诺贝尔化学奖得主发明的方法可利用遗传变异和筛选，开发出人类需要的蛋白质，以推动更为绿色的化学工业，帮助开发新型材料，制造可持续的生物燃料，帮助减轻人类疾病或挽救生命，因此噬菌体展示技术具有极高的应用价值。

利用噬菌体展示技术筛选特异性蛋白，首先要建立噬菌体展示文库，以展示不同外源基因，然后再对噬菌体文库进行筛选。构建文库获得外源基因片段的方法有：人工合成、cDNA法、脱氧核糖核酸酶I(DNase I)水解DNA等。将外源片段连入噬菌粒中，将重组噬菌粒转入到宿主细胞内，再加入M13KO7辅助噬菌体进行超感染培养，收集培养液上清，上清即为噬菌体展示文库。在此过程中，辅助噬菌体作用是为噬菌粒DNA提供复制和包装所需要的酶和外壳蛋白。

在噬菌体展示库筛选过程中，需要对外源多肽的特异性进行鉴定，目前主要是通过抗M13KO7辅助噬菌体抗体来进行识别和信号呈递，以此来区分阴性和阳性克隆。抗M13KO7辅助噬菌体抗体的效价、特异性和稳定性对噬菌体展示库筛选的结果的判定起着至关重要的作用，直接影响着噬菌体展示技术的效率和成功率。因此，开发效价高、特异性强、稳定性好的抗M13KO7辅助噬菌体抗体具有重要意义。

发明内容

为解决现有技术存在的技术问题，本发明的目的在于提供能够特异性结合丝状噬菌体M13KO7的多克隆抗体、该多克隆抗体的制备方法以及应用。

为实现上述目的，本发明开展能够特异性结合丝状噬菌体且效价高的多克隆抗体的筛选和制备，经过大量的研发和实践，本发明发现，相比于采用丝状噬菌体不同结构蛋白的混合物或融合蛋白作为免疫原进行免疫动物，采用一定浓度的M13KO7丝状噬菌体作为免疫原同时配合适宜的免疫佐剂，能够获得特异性结合丝状噬菌体且灵敏度和效价更高的多克隆抗体。进一步结合免疫动物程序的优化，本发明获得了丝状噬菌体特异的高灵敏度、高效价的多克隆抗体。

具体地，本发明的技术方案如下：

首先，本发明提供一种免疫原性组合物，其包含丝状噬菌体和佐剂；所述免疫原性组合物中，所述丝状噬菌体的浓度为0.5×10¹¹～2×10¹¹pfu/ml。采用上述免疫原性组合物免疫动物更有利于获得特异性结合丝状噬菌体且效价高的多克隆抗体。

优选地，所述免疫原性组合物中，所述丝状噬菌体的浓度为0.5×10¹¹～1.5×10¹¹pfu/ml。

优选地，所述丝状噬菌体为M13KO7；所述佐剂为弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂。

更优选地，所述免疫原性组合物中，所述弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂的体积百分含量为40％～60％。

作为本发明的优选方案，所述免疫原性组合物中，丝状噬菌体的浓度为1×10¹¹pfu/ml，弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂的体积百分含量为50％。

进一步地，本发明提供一种丝状噬菌体多克隆抗体的制备方法，其包括利用所述免疫原性组合物免疫动物的步骤。

优选地，所述免疫动物包括5～7次免疫，每次免疫间隔21～28天。

优选地，首次免疫使用的所述免疫原性组合物中佐剂为弗氏完全佐剂；后续免疫使用的所述免疫原性组合物中佐剂为弗氏不完全佐剂。

优选地，所述免疫动物所采用的动物为兔。所述免疫动物的方式为皮下注射。

优选地，每次免疫动物的剂量为3×10¹⁰～8×10¹⁰pfu丝状噬菌体/只。更优选为5×10¹⁰pfu丝状噬菌体/只。

作为本发明的优选方案，所述制备方法包括如下步骤：

(1)首次免疫：将浓度为1×10¹¹pfu/ml的丝状噬菌体M13KO7与弗氏完全佐剂以1:1的体积比混合后免疫家兔，免疫方式为颈背部皮下多点注射，免疫剂量为5×10¹⁰pfu丝状噬菌体/只；

(2)加强免疫：首次免疫后间隔21天进行第2次免疫，将浓度为1×10¹¹pfu/ml的丝状噬菌体M13KO7与弗氏不完全佐剂以1:1的体积比混合后免疫家兔，免疫方式和免疫剂量与首次免疫相同；在第2次免疫后再进行3～5次免疫，每次免疫之间间隔21天，免疫方式和免疫剂量均与第二次免疫相同；

(3)收集全血，离心分离血清。

本发明提供利用上述制备方法制备得到的丝状噬菌体多克隆抗体。

进一步地，本发明提供所述丝状噬菌体多克隆抗体的如下任一种应用：

(1)在丝状噬菌体或丝状噬菌体抗体识别或检测中的应用；

(2)在丝状噬菌体展示技术中的应用；

(3)在功能蛋白筛选、抗原抗体库建立、药物或疫苗筛选、病原检测或基因治疗靶标筛选中的应用。

本发明提供一种丝状噬菌体检测试剂盒，其包含所述丝状噬菌体多克隆抗体。

本发明还提供一种丝状噬菌体的间接ELISA检测方法，包括：将待检测丝状噬菌体包被、封闭后，加入所述丝状噬菌体多克隆抗体反应，再加入酶标二抗反应，显色后终止反应。

优选地，所述包被为以0.05M、pH 9.6的碳酸盐缓冲液为包被缓冲液，在4～8℃包被10～15h；所述封闭为以2％酪蛋白溶液作为封闭液。

本发明的有益效果在于：本发明提供的丝状噬菌体多克隆抗体能够特异性结合并识别丝状噬菌体，具有特异性高、效价高、灵敏度高的优点，且制备方法简单便捷，为丝状噬菌体展示技术系统提供了重要的筛选试剂，在功能蛋白筛选、抗原抗体库建立、药物或疫苗筛选、病原检测或基因治疗靶标筛选等方面具有重要的应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例1中A兔在各次免疫后的血清效价检测结果。

图2为本发明实施例1中B兔在各次免疫后的血清效价检测结果。

图3为本发明实施例2中M13KO7辅助噬菌体最佳包被浓度确定；其中，A为A兔的实验结果，B为B兔的实验结果。

图4为本发明实施例3中pH对B兔制备的多克隆抗体的构象影响。

图5为本发明实施例3中pH对B兔制备的多克隆抗体与M13KO7辅助噬菌体结合的影响。

图6为本发明实施例3中B兔制备的多克隆抗体热稳定性实验结果。

图7为本发明实施例3中多克隆抗体及商品化抗体的效价检测结果。

图8为本发明实施例4中多克隆抗体与商品化抗体的灵敏度分析，其中，自制代表实施例1中B兔制备的多克隆抗体，商品代表商品化抗体。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中，M13KO7辅助噬菌体购自NEB公司，产品目录号为N0351S；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购自美国Sigma-Aldrich公司，产品目录号为F5881、F5506；羊抗兔IgG酶标抗体购自Jackson公司，产品目录号为111-035-003；96孔酶标板购自Costar公司，产品目录号为2592；商品化多克隆抗体(Anti-fd Bacteriophage antibody produced in rabbit)购自Sigma；氯化钠(NaCl)、碳酸钠(Na₂CO₃)、碳酸氢钠(NaHCO₃)、十二水磷酸氢二钠(Na₂HPO₄〃12H₂O)、二水磷酸二氢钠(NaH₂PO₄〃2H₂O)、氯化钾(KCl)、蔗糖、浓硫酸等购自国药集团化学试剂有限公；酪蛋白、BSA(牛血清白蛋白)购自Sigma-Aldrich公司；Tween-20购自北京化学试剂公司；proclin 300购自美国Supelco公司；新西兰大白兔购自北京市海淀区兴隆实验动物养殖场。

如无特殊说明，以下实施例中所用的PBS缓冲液均为pH 7.4、0.01M的磷酸盐缓冲液；CB缓冲液均为0.05M、pH 9.6的碳酸盐缓冲液；BB缓冲液均为0.02M、pH 9.0的硼酸盐缓冲液；PBST溶液均为含有0.05％(体积百分含量)的Tween-20的PBS缓冲液(pH 7.2)。

实施例1 M13KO7辅助噬菌体多克隆抗体的制备

以M13KO7辅助噬菌体作为免疫原、弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂作为免疫佐剂，免疫新西兰家兔，制备M13KO7辅助噬菌体的多克隆抗体。

共免疫2只新西兰家兔，编号分别为A兔和B兔，新西兰家兔的筛选条件为：雌性，单重在2.5kg-3.0kg之间。

M13KO7辅助噬菌体的多克隆抗体的制备方法具体如下：

(1)首次免疫：M13KO7辅助噬菌体的免疫剂量为5×10¹⁰pfu/只，将M13KO7辅助噬菌体按照免疫剂量稀释成1mL与等体积的弗氏完全佐剂进行乳化，水相推入油相充分乳化成(W/O)乳剂，每只兔子按1mL的免疫剂量进行颈背部皮下多点注射，与第2次免疫间隔时间为3周；

(2)第2～7次免疫：将M13KO7辅助噬菌体按照免疫剂量稀释成1mL与等体积的弗氏不完全佐剂进行乳化，水相推入油相充分乳化成(W/O)乳剂，免疫剂量、免疫途径与首次免疫相同，免疫间隔时间为3周，直至第7次免疫；

(3)每次免疫后7天耳缘静脉采血(每只1mL)，分离血清测定血清效价，至第7次免疫后确定血清效价稳定；

(4)股动脉放血收集全血，离心分离血清样本，分装后-20℃保存。

对A兔和B兔每次免疫后7天耳缘静脉采血的效价进行检测的结果如图1(A兔)和图2(B兔)所示。结果表明，每次免疫后血清效价都有所上升，经7次免疫A兔和B兔的血清效价均达到稳定状态。

实施例2 利用M13KO7辅助噬菌体多克隆抗体进行间接ELISA检测

利用实施例1制备的M13KO7辅助噬菌体多克隆抗体进行间接ELISA检测，通过优化确定抗原的最佳包被浓度、包被条件、封闭条件和多克隆抗体的工作浓度。

1、抗原最佳包被浓度的确定

采用间接ELSA法、方阵法确定抗原的包被浓度，选择当包被浓度增高时，对应不同浓度的抗体稀释液的OD₄₅₀值增长幅度较大的抗原包被浓度为最适包被浓度。结果如图3所示，通过方阵法测定M13KO7辅助噬菌体的最佳包被浓度为1.0×10⁹pfu/mL。

2、间接ELISA检测

(1)包被

取96孔酶标板，每孔加入100μL包被液，37℃温箱孵育2h，然后用PBST溶液洗板3次。

包被液：pH 9.6、0.05M的碳酸盐缓冲液。

(2)封闭

每孔加入150μL封闭液，37℃温箱孵育1h，然后用PBST溶液洗涤3次，拍干。

封闭液：2％酪蛋白缓冲溶液。

(3)加待测抗体

试验孔：每孔加入50μLPBS缓冲液和50μL待测多克隆抗体的稀释液；

对照孔：每孔加入50μLPBS缓冲液和50μL首次免疫前的阴性血清；

37℃温箱孵育30min，然后用PBST溶液洗涤3次，拍干。

稀释液：以PBS缓冲液作为溶剂，从1:100稀释度开始，以3倍为梯度，共11个稀释度。

(4)加酶标二抗

每孔加100μL酶标二抗稀释液，37℃温箱孵育30min，然后用PBST溶液洗涤3次，拍干。

酶标二抗稀释液：羊抗兔IgG酶标抗体稀释至5000倍体积。

(5)显色

每孔加入100μL显色液，37℃温箱孵育15min。

显色液：将2％3,3’,5,5’-四甲基联苯胺溶液和30％过氧化氢等体积混合。

(6)终止

每孔加入50μL 2mol/L浓硫酸。

(7)读数。

3、间接ELISA检测条件的优化

(1)最佳包被缓冲液

采用方阵滴定法，分别用PBS和CB溶液，对M13KO7辅助噬菌体以最佳包被浓度分别用PBS、CB、BB包被液，于37℃包被2h，100μL/孔，封闭后按照间接ELISA操作程序测定。

包被缓冲液的筛选结果见表1，确定CB缓冲液为最佳包被缓冲液。

表1抗原包被缓冲液的选择

(2)最佳包被时间及温度

采用方阵滴定法，对M13KO7辅助噬菌体以最适包被浓度，用CB缓冲液分别在4℃12h、37℃ 1h、37℃ 2h条件下进行包被，100μL/孔，封闭后按照间接ELISA操作程序测定。

包被时间及温度的筛选结果见表2，确定4℃ 12h为最佳包被时间和温度。

表2抗原包被温度和时间的确定

(3)最佳封闭液

M13KO7辅助噬菌体以最佳包被浓度、最佳包被缓冲液包板，分别用封闭液Ⅰ(2％酪蛋白)、封闭液Ⅱ(2％脱脂奶粉)、封闭液Ⅲ(5％小牛血清)在37℃封闭1.5h，按照间接ELISA操作程序测定。

封闭液的筛选结果见表3，确定封闭液Ⅰ(2％酪蛋白)为最佳缓冲液。

表3最佳封闭液的选择

(4)抗体最佳工作浓度

采用间接ELISA试验方法、方阵滴定法确定M13KO7噬菌体在不同浓度情况下的多克隆抗体的工作浓度。将M13KO7噬菌体稀释为1.0×10⁸pfu/mL、1.0×10⁷pfu/mL、1.0×10⁶pfu/mL进行包被，将抗体稀释到不同浓度进行试验，以OD₄₅₀大于1.0为判定条件。

抗体最佳工作浓度的筛选结果见表4，确定多克隆抗体稀释倍数1:10000。

表4多克隆抗体最佳工作浓度的选择

实施例3 多克隆抗体性能分析

本实施例对实施例1制备的M13KO7辅助噬菌体多克隆抗体的稳定性和效价等性能进行分析。

1、多克隆抗体的pH稳定性分析

(1)pH对抗体构象的影响

蛋白质在天然状态是以特定的形态折叠起来的，当环境发生变化时，蛋白质的折叠状态会发生变化。通过圆二光谱测量多克隆抗体在不同pH值中的稳定性，探究抗体构象变化。具体方法如下：

①对多克隆抗体进行纯化：利用Protein A亲和纯化柱与抗体的Fc片段特异性结合，洗脱得到血清抗体中高纯度的IgG，PBS缓冲液透析16h。

②配置pH为1-12的PBS缓冲液。

③将纯化后的抗体用不同pH的PBS缓冲液稀释到0.2mg/mL的浓度，备用。

④设置光谱参数范围，选择200nm-280nm。

⑤测量仪器背景值：记录零吸收值，采集空气(氮气)的值，后面的紫外吸收值都是相对于空气背景值计算的。

⑥测量样品体系背景值：选择合适的比色皿，装入pH 1-12的PBS缓冲液，测量溶液体系背景值，扫描2次(一系列实验要保持使用同一个比色皿)。

⑦使用步骤⑥中同一比色皿测量样品，放入样品槽中扫描3次。

圆二光谱测量结果见图4。结果表明，纯化后的多克隆抗体在pH值在3-10范围内抗体构象变化不大。

(2)pH对多克隆抗体与M13KO7辅助噬菌体结合的影响

根据纯化后多克隆抗体效价及方阵滴定法选择的M13KO7辅助噬菌体包被浓度为3.3×10⁸pfu/mL，血清抗体稀释1:2.0×10⁴，在上述条件下采用间接ELISA进行检测。利用pH1-12的PBS缓冲液对多克隆抗体进行稀释，以抗体稀释溶液的pH为横坐标，以OD₄₅₀值为纵坐标做折线图进行对比。结果见图5，结果表明，多克隆抗体在pH 4-10间OD₄₅₀值均能达到检测要求。

2、多克隆抗体的热稳定性测评

使用UNcle高通量多参数蛋白稳定仪进行测量。设置加样温度从20-100℃，升温速度1℃/min，测量5次。结果见图6，结果表明，多克隆抗体的Tm值为68.72℃。

3、多克隆抗体的反复冻融稳定性

将多克隆抗体进行反复冻融6次，选择M13KO7辅助噬菌体包被浓度为3.3×10⁸pfu/mL，血清抗体稀释1:2.0×10⁴进行间接ELISA检测。利用t检验对反复冻融稳定性的检测结果进行分析，结果见表5，结果表明，6次反复冻融实验后多克隆抗体仍可达到检测效果。

表5多克隆抗体各次冻融检测结果

4、加速老化试验

根据阿伦尼乌斯创立的化学反应速率常数随温度变化关系，将单克隆抗体置于37℃温箱7天，选择M13KO7辅助噬菌体包被浓度为3.3×10⁸pfu/mL，血清抗体稀释1:2.0×10⁴进行间接ELISA检测。结果见表6，结果表明，与多克隆抗体加速老化前的效价相比较抗体活性减半，可以判定多克隆抗体可以在4℃保存至少一年。

表6多克隆抗体加速老化试验结果

5、多克隆抗体的效价分析

采用间接ELISA方法测定实施例1制备的多克隆抗体效价，以商品化多克隆抗体作为对照，具体方法如下：

首先，以最佳包被浓度进行包被酶标板，待测多克隆抗体为实施例1制备的血清和商品化多克隆抗体。以450nm波长测定各孔OD值。当吸光度接近1.0左右且阳性血清OD₄₅₀值大于或等于阴性血清OD₄₅₀值2.1倍时，以阳性血清稀释的倍数为效价。

结果见图7，结果表明，多克隆抗体效价高达6.56×10⁵，与商品化抗体相比，在相同稀释倍数下，实施例1的多克隆抗体的信号值显著高于商品化多克隆抗体。

实施例4 多克隆抗体在磺胺药物纳米抗体制备中的应用

以磺胺药物纳米抗体制备中噬菌体单克隆抗体特异性鉴定为例，检测实施例1制备的多克隆抗体的可应用性，具体方法如下：

采用噬菌体展示技术中第五轮筛选后获得的噬菌体侵染宿主菌，静止半小时后，涂布于2×YT抗性平板上过夜培养；次日，在平板上随机挑取32个菌落(分别编号为噬菌体单克隆抗体1～32)扩增培养至对数期，加入M13KO7辅助噬菌体，再过夜培养后，离心取上清，之后用Phage ELISA进行噬菌体多克隆的特异性检测。

采用磺胺半抗原偶联OVA作为检测包被原包被96孔酶标板，ELISA操作步骤如下：

(1)包被：包被原经包被液稀释后加入酶标板中，100μL/孔，37℃孵育2h；

(2)洗涤：甩掉孔内的液体，用洗液洗涤3遍，270μL/孔，拍干；

(3)封闭：将封闭液加至酶标板中，150μL/孔，37℃孵育1h；

(4)洗涤：甩掉孔内的液体，用洗液洗涤3遍，270μL/孔，拍干；

(5)加样：每个噬菌体多克隆抗体检测时，一孔加入PBS(0.01mol/L，pH 7.4)，50μL/孔，一孔加入50μL 20ppb的磺胺二甲基嘧啶标准品；然后每孔加入噬菌体单克隆培养液上清50μL，37℃孵育30min；

(6)洗涤：甩掉孔内液体，洗涤3遍，270μL/孔，拍干；

(7)加入抗M13KO7辅助噬菌体抗体：加入经稀释的抗M13KO7辅助噬菌体的多克隆抗体，100μL/孔，37℃孵育30min；

(8)洗涤：甩去孔内液体，洗涤3遍，270μL/孔，拍干；

(9)加酶标二抗：加入经适当稀释的HRP标记的羊抗兔IgG，100μL/孔，37℃孵育30min；

(10)洗涤：甩去孔内液体，洗涤3遍，270μL/孔，拍干；

(11)显色：加入新鲜配制的TMB底物溶液(A、B液1：1配制)，100μL/孔，37℃避光显色15min；

(12)终止：加入2mol/L的硫酸溶液终止显色，50μL/孔；

(13)测定：用酶标仪读取各孔OD₄₅₀值。

将实施例1制备的多克隆抗体与商品化多克隆抗体设置两组实验平行进行比较，结果见图8，实施例1制备的多克隆抗体与商品化多克隆抗体对阴性及阳性克隆的判定一致，灵敏度相当。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (6)

1.一种丝状噬菌体多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括：利用免疫原性组合物以皮下注射的方式免疫兔；

所述免疫原性组合物包含丝状噬菌体M13KO7以及弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂；

所述免疫原性组合物中，所述丝状噬菌体的浓度为0.5×10¹¹～2×10¹¹pfu/ml；所述弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂的体积百分含量为40％～60％；

每次免疫的剂量为3×10¹⁰～8×10¹⁰pfu丝状噬菌体/只；

所述免疫包括5～7次免疫，每次免疫间隔21～28天；

首次免疫使用的所述免疫原性组合物中佐剂为弗氏完全佐剂；后续免疫使用的所述免疫原性组合物中佐剂为弗氏不完全佐剂。

2.权利要求1所述的制备方法制备得到的丝状噬菌体多克隆抗体。

3.权利要求2所述的丝状噬菌体多克隆抗体的如下任一种应用：

(1)在丝状噬菌体或丝状噬菌体抗体识别或检测中的应用；

(2)在丝状噬菌体展示技术中的应用；

(3)在功能蛋白筛选、抗原抗体库建立、药物或疫苗筛选、病原检测或基因治疗靶标筛选中的应用。

4.一种丝状噬菌体检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求2所述的丝状噬菌体多克隆抗体。

5.一种丝状噬菌体的间接ELISA检测方法，其特征在于，包括：将待检测丝状噬菌体包被、封闭后，加入权利要求2所述的丝状噬菌体多克隆抗体反应，再加入酶标二抗反应，显色后终止反应。

6.根据权利要求5所述的间接ELISA检测方法，其特征在于，所述包被为以0.05M、pH9.6的碳酸盐缓冲液为包被缓冲液，在4～8℃包被10～15h；所述封闭为以2％酪蛋白溶液作为封闭液。

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