CN103509115B

CN103509115B - 人胱抑素c纳米抗体及其应用

Info

Publication number: CN103509115B
Application number: CN201210206704.5A
Authority: CN
Inventors: 姚刚; 许超; 季军捷
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Shanghai Fang En Medical Products Co., Ltd.
Priority date: 2012-06-21
Filing date: 2012-06-21
Publication date: 2016-03-23
Anticipated expiration: 2032-06-21
Also published as: CN103509115A

Abstract

本发明涉及人胱抑素C纳米抗体及其高灵敏定量检测的试剂盒。本发明揭示了针对胱抑素C不同表位的纳米抗体以及单克隆抗体，所述的抗体与胱抑素C具有良好的亲和性。利用所述的纳米抗体与单克隆抗体，可制备出方便、快速且准确地检测胱抑素C的系列试剂盒。本发明解决的技术问题：提供一种可用于配对检测胱抑素C的纳米抗体；本发明的试剂盒解决的技术问题一：灵敏检测胱抑素C抗原，重复性好，结果稳定；本发明的试剂盒解决的技术问题二：快速检测，方便快捷，纳米抗体生产成本低且易于获得。

Description

人胱抑素C纳米抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及人胱抑素C纳米抗体及其高灵敏定量检测试剂盒。

背景技术

自比利时布鲁塞尔自由大学的免疫学家HamersCasterman从骆驼血液中分离出的天然缺失轻链，仅含两条重链，相比传统抗体在结构上简单许多的天然抗体后，基于一个重链可变区组成的单域抗体(VHH)，因其晶体结构直径为2.5nm、长4nm,纳米抗体概念得以提出。纳米抗体一经发现，它所具有的一些独特特征便引起研究者们的注意。作为一种小分子抗体，纳米抗体有很多的优点。包括：1、分子小，结构稳定，耐热性好。研究证实，将纳米抗体在37℃放置一周或在高温条件(90℃)下保存，都能保持比较好的生物活性。另外，纳米抗体在强变性剂的条件下表现出不易变性或者变性后易复性的特点，研究表明纳米抗体比常规抗体更容易储藏和运输，作为诊断试剂更具有优势。2、亲和力较高。虽然纳米抗体缺少VL，但是VHH自身的一些性质使得纳米抗体仍然保持了较高的亲和力。研究发现从免疫的单域VHH抗体库中分离出来的VHH单体具有nmol/L级的亲和力，并且特异性好；3、对人体的免疫原性弱。目前已有的抗体大都是鼠源的，作用于人体会产生人抗鼠抗体的免疫反应。Revets等将其制备的纳米抗体反复注射小鼠后未见有针对这种单域VHH抗体的抗体产生。所以纳米抗体的免疫原性较弱，与人的生物相容性较好，可能是由于骆驼VHH基因与人VH3家族序列高度同源的原因；4、易表达、易纯化。由于纳米抗体单独能够形成完整的独立结合抗原的结构域，很容易实现可溶性表达，从而使得纳米抗体的生产比一般抗体的生产更加容易，作为诊断试剂的制备也更快、更便宜。

另一方面，血清胱抑素C是首次在鸡蛋清中被发现的，然后分离纯化得到高纯度的半胱氨酸蛋白酶抑制剂(CysteineProteaseInhibitor，CPI)，后被命名为CysC，属于CPI超家族，是一种非糖基化的碱性低分子蛋白，相对分子质量为13.6KDa，由120个氨基酸组成，带正电荷，等电点为9.3，编码基因位于20号染色体短臂，长约615kb。胱抑素C是一种分泌性蛋白，广泛存在于各种体液中，如脑脊液、唾液、尿液、精液等，其中脑脊液中的浓度最高，为5.8±2.2mg/L，唾液中胱抑素C含量为1.8±0.88mg/L，血清中的胱抑素C的含量在0.7±0.23mg/L，而尿液中胱抑素C的含量最低，约为0.095±0.057mg/L。胞外胱抑素C含量高可能是由于局部的高分泌速率，或是低的组织液更新速率的结果。

胱抑素C由看家基因控制，在所有有核细胞内表达，并且以恒定的速度产生。在人体多数组织中持续恒定表达，由于胱抑素C相对分子质量低、等电点高，使胱抑素C能被肾小球自由滤过，然后在近曲小管上皮细胞内分解代谢，不被肾小管重吸收和分泌，其排泄仅受肾小球滤过率(GRF)的影响，而不受其它因素如性别、年龄、饮食、炎症和血脂水平等的影响，且与性别、年龄、肌肉量无关。

利用胱抑素C对一些疾病的显著指示作用为人们对某些疾病的早期诊断和及时救治提供了可能性，胱抑素C已在临床评价心脑血管疾病，肾脏移植，血液疾病，甲亢，肿瘤，化疗，儿童、老年人疾病等多个领域得以应用，并显示了良好的应用前景。

然而，现有技术中的检测胱抑素C的检测试剂，如用于配对的单克隆的制备存在困难，专利“一种制备胱抑素C配对单克隆抗体的方法(201110254775.8)”为解决这一困难提供了一种途径。然而，即便如此，此种方法仍然操作繁杂，且所研制出来的单克隆抗体仍然存在部分缺陷，例如敏感性低、再现性差、抗体不易获得等问题。因此，本领域迫切需要开发改进的检测胱抑素C的检测试剂，以满足市场所需。

发明内容

本发明的目的在于提供人胱抑素C纳米抗体及其高灵敏定量检测试剂盒。

在本发明的第一方面，提供一种来源于驼羊或骆驼的纳米抗体（单域重链抗体，VHH），能高亲和力特异性与人胱抑素C结合；且骨架区含有如SEQIDNO:11所示的共同特征氨基酸序列。

在一个优选例中，所述的纳米抗体中，在抗体超变区含有共同特征氨基酸序列：IT＊＊GNT，其中“＊”代表一个随机氨基酸。

在另一优选例中，所述的纳米抗体具有SEQIDNO:1-10任一所示的氨基酸序列。

在本发明的另一方面，提供一种多核苷酸，其编码前面任一所述的纳米抗体。

在本发明的另一方面，提供一种表达载体，该表达载体中含有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种宿主细胞，该宿主细胞中含有所述的表达载体或其基因组中整合有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种产生纳米抗体的方法，包括：培养所述的宿主细胞，使之表达所述的纳米抗体。

在本发明的另一方面，提供一种纳米抗体噬菌体(噬菌粒)，其包括：噬菌体(噬菌粒)，以及展示于噬菌体表面的前面任一所述的纳米抗体。

在另一优选例中，所述的噬菌体是商业化噬菌体，即是常规用于进行蛋白展示的噬菌体。较佳地，所述的噬菌体是M13K07。

在本发明的另一方面，提供一种特异性检测人胱抑素C的试剂盒，包括：前面任一所述的纳米抗体；或任一所述的纳米抗体噬菌体。

在一个优选例中，所述试剂盒还包括人胱抑素C特异的单克隆抗体；所述的单克隆抗体与所述的纳米抗体结合人胱抑素C蛋白的不同表位。

在一个优选中，所述的试剂盒中，所述的人胱抑素C特异的单克隆抗体选自：

(a)中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCCC201239的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体；或

(b)中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCCC201253的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。

在另一优选例中，所述的试剂盒中包括：

(a)中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCCC201239的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，和(b)具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的纳米抗体；或

(a)中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCCC201239的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，和(b)具有SEQIDNO:5所示的氨基酸序列的纳米抗体；或

(a)中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCCC201253的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，和(b)具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的纳米抗体；或

(a)中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCCC201253的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，和(b)具有SEQIDNO:5所示的氨基酸序列的纳米抗体；或

(a)中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCCC201239的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，和(b)表面展示有具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的纳米抗体的纳米抗体噬菌体；或

(a)中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCCC201239的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，和(b)表面展示有具有SEQIDNO:5所示的氨基酸序列的纳米抗体的纳米抗体噬菌体；或

(a)中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCCC201253的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，和(b)表面展示有具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的纳米抗体的纳米抗体噬菌体；或

(a)中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCCC201253的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，和(b)表面展示有具有SEQIDNO:5所示的氨基酸序列的纳米抗体的纳米抗体噬菌体；或

(a)具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的纳米抗体，和(b)表面展示有具有SEQIDNO:7所示的氨基酸序列的纳米抗体的纳米抗体噬菌体；或

(a)具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的纳米抗体，和(b)表面展示有具有SEQIDNO:8所示的氨基酸序列的纳米抗体的纳米抗体噬菌体；或

(a)具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的纳米抗体，和(b)表面展示有具有SEQIDNO:10所示的氨基酸序列的纳米抗体的纳米抗体噬菌体。

在另一优选例中，所述试剂盒中还包括固相载体，所述的纳米抗体被固定于固相载体(如多孔板、盖玻片、微珠)；或所述的单克隆抗体被固定于固相载体。

在另一优选例中，所述试剂盒中还包括：能与所述的纳米抗体或单克隆抗体连接的可检测标记物(如HRP)，所述的可检测标记物被连接于所述的纳米抗体或单克隆抗体或分离地存在于试剂盒；

胱抑素C标准品；和/或

与可检测标记物相对应的底物；和/或

酶联免疫反应试剂(包括但不限于：包被(缓冲)液，洗涤(缓冲)液，封闭液，固定液，终止液，显色液)；和/或

说明检测人胱抑素C的方法的使用说明书。

在本发明的另一方面，提供一种单克隆抗体，所述的单克隆抗体选自：

在本发明的另一方面，提供所述的纳米抗体或所述的单克隆抗体的用途，用于制备特异性检测人胱抑素C的检测试剂盒。

在本发明的另一方面，提供产生特异性结合人胱抑素C的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，选自：

(a)中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCCC201239的杂交瘤细胞株；或

(b)中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCCC201253的杂交瘤细胞株。

在本发明的另一方面，提供一种检测(较佳地，为非诊断性地)待测样品中胱抑素C存在情况的方法，所述方法包括：

以所述的试剂盒中(a)抗体作为包被抗体(第一抗体)，(b)抗体作为检测抗体(第二抗体)，且在所述的检测抗体上设置一可检测标记物；通过双抗夹心酶联免疫反应法来检测待测样品中胱抑素C的存在情况。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、单抗5F2的亲和系数测定。

图2、单抗4E4的亲和系数测定。

图3、单抗1E11的亲和系数测定。

图4、镍柱纯化后的纳米抗体SDS-PAGE(左图)，以及各个克隆纳米抗体的理论分子量(右图)。

图5、以单抗5F2作为包被抗体，以相应纳米抗体进行检测的结果。

图6、以单抗1E11作为包被抗体，以相应纳米抗体进行检测的结果。

图7、以单抗5F2作为包被抗体，以相应纳米抗体噬菌粒进行检测的结果。

图8、以单抗1E11作为包被抗体，以相应纳米抗体噬菌粒进行检测的结果。

图9、以纳米抗体3-2作为包被抗体，以相应纳米抗体噬菌粒进行检测的结果。

图10、以单抗5F2作为包被抗体，以相应纳米抗体噬菌粒进行检测的结果。

图11、精密度检测结果。

具体实施方式

本发明人经过长期的研究和试验，找到了针对胱抑素C不同表位的纳米抗体以及单克隆抗体(即可用于配对检测胱抑素C)，所述的抗体与胱抑素C具有良好的亲和性。利用所述的纳米抗体与单克隆抗体，可制备出方便、快速且准确地检测胱抑素C的试剂盒。本发明解决的技术问题：提供一种可用于配对检测胱抑素C的纳米抗体；本发明的试剂盒解决的技术问题一：灵敏检测胱抑素C抗原，重复性好，结果稳定；本发明的试剂盒解决的技术问题二：快速检测，方便快捷，纳米抗体生产成本低且易于获得。

术语

如本文所用，所述的“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤培养来合成的，不会被其它免疫球蛋白污染。“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。

如本文所用，所述的“纳米抗体”是指缺失轻链的重链抗体(如：来源于骆驼体内)，克隆其可变区得到的单域抗体，是最小的功能性抗原结合片段，相对分子质量(Mr)仅为15000。纳米抗体具有Mr小、稳定性强、可溶性好、易表达，免疫原性低等特点。

如本文所用，所述的“双抗夹心法”是酶联免疫反应(ELISA)的一种，将包被抗体固定于载体，然后包被抗体与抗原反应，洗涤后再与带标记的检测抗体反应，洗涤，最后进行化学发光或酶联显色反应检测信号。双抗夹心法特别适用于具有两个或两个以上表位的抗原的检测。

如本文所用，所述的“包被抗体”、“第一抗体”、“捕获抗体”、与“一抗”可互换使用，都是指用于固定于固相载体上的、特异性抗胱抑素C的抗体。

如本文所用，所述的“检测抗体”、“第二抗体”、“酶标(记)抗体”与“二抗”可互换使用，都是指特异性地抗胱抑素C且对应于所述试剂盒中相应的包被抗体的抗体。对于抗原胱抑素C而言，相应的包被抗体和检测抗体是不同的，并且可同时结合于所述的胱抑素C的不同表位(抗原决定簇)。

如本文所用，所述的“可检测标记物”是指位于检测抗体上的，用于确定待检测样品中胱抑素C的存在与否以及存在的量的标志物。如：酶、荧光标记、核素、量子点、胶体金等。优选的，所述的标记物选自：辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酯酶(AP)、葡萄糖氧化酶、β–D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、或葡萄糖淀粉酶。

如本文所用，所述的“与可检测标记物相对应的底物”是指可被检测抗体的标记物所催化显色，用于显示检测抗体与胱抑素C发生结合的识别信号。所述的底物比如：用于辣根过氧化物酶的邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)、ABTS；用于碱性磷酸酯酶的对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenylphosphate，p-NPP)；等等。

胱抑素C

胱抑素C是一种已知的蛋白，其氨基酸序列和核苷酸序列都是本领域已知的。例如，其氨基酸序列如GenBank:AAH13083.1所示。

生产胱抑素C的方法也是已知的。例如，通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用胱抑素C的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的胱抑素C蛋白。一般来说有以下步骤：

(1).用编码人胱抑素C蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；和

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

上述获得的重组胱抑素C蛋白可被加工成具有一定纯度的蛋白，用于配制标准品。

抗胱抑素C蛋白的纳米抗体

本发明提供了一种纳米抗体，所述的纳米抗体筛选自驼源性天然单域重链抗体库。

本发明所述的纳米抗体，能高亲和力特异性与人胱抑素C结合；且骨架区含有共同特征氨基酸序列GGSLRL；更佳地，在抗体超变区含有共同特征氨基酸序列：IT**GNT，其中*为随机氨基酸。

较佳地，所述的纳米抗体具有SEQIDNO:1-10任一所示氨基酸序列。

本发明也包括所述的纳米抗体的变异体、衍生物和类似物，只要它们保留有氨基酸序列GGSLRL和/或IT**GNT。如本文所用，术语“变异体”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的纳米抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽变异体、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或多肽原序列，或融合多肽)。根据本文的定义这些变异体、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

本发明的“纳米抗体”还包括保留有氨基酸序列GGSLRL和/或IT＊＊GNT结构、且具有特异性结合胱抑素C功能的、SEQIDNO:1-10任一所示氨基酸序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个或1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或减少一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。

本发明还提供保留有氨基酸序列GGSLRL和/或IT＊＊GNT的、纳米抗体的类似物。这些类似物与天然纳米抗体的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。

此外，在所述的纳米抗体的氨基端或羧基端还可添加其它基本上不影响本发明所述的纳米抗体的活性、表达量和稳定性的氨基酸序列。较佳地，这些添加的氨基酸序列有利于表达(如信号肽)，有利于纯化(如6×His序列)，或其它可促进所述的纳米抗体的活性、表达量或稳定性的序列。

本发明还包括编码本发明的纳米抗体或其变异体、衍生物的DNA分子。所述的DNA分子可以全部人工合成，也可用PCR扩增的方法获得。

为了进一步提高宿主细胞的表达量，可以对本发明的纳米抗体的编码序列进行改造，例如采用宿主细胞偏好的密码子，消除不利于基因转录及翻译的序列。

在获得了编码本发明新纳米抗体或其变异体、衍生物的DNA序列之后，将其克隆入合适的表达载体，再转入合适的宿主细胞。最后，培养转化后的宿主细胞，通过分离纯化得到本发明的新的纳米抗体。

如本文所用，术语“载体”包括质粒、表达载体、克隆载体、病毒载体等。可选用本领域已知的各种载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明新纳米抗体的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成表达载体。

在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。用于表达纳米抗体的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母细胞、昆虫细胞、COS细胞、CHO细胞等。较佳地，该宿主细胞是原核细胞，更佳地是大肠杆菌细胞。

在获得转化的宿主细胞后，可在适合表达本发明纳米抗体的条件下培养该细胞，从而表达出纳米抗体；然后再分离出表达的纳米抗体。

抗胱抑素C蛋白的单克隆抗体

用于本发明的单克隆抗体是对人胱抑素C具有特异性的单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人胱抑素C蛋白或其片段。更特别地，指那些能与人胱抑素C蛋白或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。

本发明利用针对胱抑素C不同表位的高特异性纳米抗体和单克隆抗体，根据双抗夹心法原理，制备了可方便、快速且准确地检测胱抑素C的试剂盒。本发明中涉及的2种高特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞系代号以及保藏号对应如下：

杂交瘤细胞系5F2，保藏号为：CCTCCNO:C201239；

杂交瘤细胞系1E11，保藏号为：CCTCCNO:C201253。

上述的单克隆抗体的抗体亚型均为IgG₁。

本发明的单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature256;495，1975;Kohler等人，Eur.J.Immunol.6:511，1976;Kohler等人，Eur.J.Immunol.6:292，1976;Hammerling等人，InMonoclonalAntibodiesandTCellHybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的单克隆抗体可以利用人胱抑素C基因产物或片段或功能区，通过常规免疫技术获得。此外，还可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。

本领域人员均了解，在得到了所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞系或通过测序等手段得知所述的单克隆抗体后，本领域人员可以采用多种方法方便地获得所述的抗体。

在本发明的一个实例中，所述的单克隆抗体可以由下列制备方法所制备，所述方法包括步骤：(1)提供佐剂预处理的小鼠；(2)在小鼠腹腔内接种所述的杂交瘤细胞并分泌单克隆抗体；(3)抽取腹水，分离获得所述的单克隆抗体。作为一种优选方式，从腹水中分离单克隆抗体的方法是：收集腹水，用经硫酸铵、辛酸沉淀，接着用ProteinG预装层析柱纯化，获得高纯度的胱抑素C单克隆抗体。

此外，也可按照常规的动物细胞培养方法，体外培养扩增所述的杂交瘤细胞，从而使之分泌所述的单克隆抗体。

试剂盒

本领域技术人员均了解，一种抗原可能含有多个表位(抗原决定簇)，因此，针对同一个抗原可以获得不止一个抗体，这些抗体对抗原的结合特性(如特异性等)均可能是不同的。因此，针对同一个抗原，本领域人员需要进行比较和筛选，才能找到适合于特异性结合的、效果优异的抗体。

通常情况下，若是采用一种抗体来结合胱抑素C，可能在测定过程中不可避免地发生非特异性结合；而基于双抗夹心法原理来制备检测试剂盒，采用的是结合于胱抑素C抗原不同表位的双抗体，这种情况下出现非特异性结合的几率大大降低，因此结果的准确性和精密度大大提高。并且，采用两种特异性非常高的抗体来将目标抗原胱抑素C吸附及定位，其定位和放大效果更好，从而使得特异性和精密度更高。且测定时仅需要很少的样品量即可。

因此，本发明提供一种检测胱抑素C的试剂盒，所述的试剂盒可用于胱抑素C的特异性检测，所述的试剂盒含有：本发明所述的纳米抗体或纳米抗体噬菌体(噬菌粒)。更佳地，所述的试剂盒中还包括人胱抑素C特异的单克隆抗体；所述的单克隆抗体与所述的纳米抗体结合人胱抑素C蛋白的不同表位。

作为本发明的优选方式，所述的试剂盒中包括：

(a)单克隆抗体5F2，和(b)纳米抗体3-2；或

(a)单克隆抗体5F2，和(b)纳米抗体4-5；或

(a)单克隆抗体1E11，和(b)纳米抗体3-2；或

(a)单克隆抗体1E11，和(b)纳米抗体4-5；或

(a)单克隆抗体5F2，和(b)纳米抗体噬菌体P-3-2；或

(a)单克隆抗体5F2，和(b)纳米抗体噬菌体P-4-5；或

(a)单克隆抗体1E11，和(b)纳米抗体噬菌体P-3-2；或

(a)单克隆抗体1E11，和(b)纳米抗体噬菌体P-4-5；或

(a)纳米抗体3-2，和(b)纳米抗体噬菌体P-5-10；或

(a)纳米抗体3-2，和(b)纳米抗体噬菌体P-6-1；或

(a)纳米抗体3-2，和(b)纳米抗体噬菌体P-7-4。

本发明人出乎意料地发现，这样的一种组合能够产生最好的胱抑素C检测效果，其检测灵敏度非常高。

在确定了本发明的试剂盒所采用的包被抗体和检测抗体后，可以采用本领域常规可用于与检测抗体结合来进行检测的各种标记物。本发明对所采用的标记物没有特别的限制，只要是能够与所述的检测抗体结合，且在适当处理后能够准确地指示待检测样品中胱抑素C的存在与否以及存在量的标记物均是可用的。例如，所述的标记物可以选自(但不限于)：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、或葡萄糖淀粉酶。例如，所述的检测抗体采用辣根过氧化物酶(HRP)标记。抗体标记的方法在本领域是公知的，例如用简易过碘酸钠法或者戊二醛二步法进行HRP标记抗体。

当采用如上所示的一些酶标记物时，还需要采用一些与相应的酶结合的底物，从而可通过显色等方式来报导标记物的存在情况或者存在量。所述的底物例如(但不限于)：用于辣根过氧化物酶的邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)、ABTS；用于碱性磷酸酯酶的对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenylphosphate，p-NPP)。

为了消除假阳性和假阴性，宜在检测过程中设置质控(对照)。所述的质控品例如采用胱抑素C标准品。此外，为了获得定量结果，可以在检测过程中设置含已知浓度的多个胱抑素C的标准品。对于标准品的设置方法可采用常规的方法。利用所述的标准品，标准曲线如下设置：用标准品的OD值检测结果为纵坐标(Y轴)，标准品浓度为横坐标(X轴)绘制成胱抑素C试剂盒的定量标准曲线。从而，根据待测样品检测获得的OD值，利用标准曲线可计算出待测样品中胱抑素C的浓度。

此外，为了使本发明的试剂盒在检测时更方便，所述的试剂盒中优选的还包含其它一些辅助试剂，所述的辅助试剂是酶联免疫试验中常规使用的一些试剂，这些试剂的特性以及它们的配制方法均是本领域技术人员所熟知的。所述的试剂例如(但不限于)：显色剂、洗涤液、终止液，增敏稀释液。

所述的包被抗体被包被在固相载体上。本发明对所采用的固相载体没有特别的限制，只要其能够与包被抗体相偶联(连接)即可。例如，所述的固相载体选自：微量滴定板(又称为多孔板，如96孔板)或微球。

在本发明的一个实例中，采用的固相载体是微量滴定板(酶标板)，所述的微量滴定板是一种聚苯乙烯板，规格是12×8可拆卸条板。

由于本发明的试剂盒采用的纳米抗体配合单克隆抗体对于胱抑素C具有极其优异的结合特性(高特异性)。按照上述方法，只要设置已知浓度的抗原对照，制作浓度标准曲线，通过比照浓度标准曲线就可以得出待测样品中的胱抑素C含量。

本发明的主要优点在于：

(1)首次将纳米抗体用于胱抑素C的检测，使得胱抑素C检测用的配对抗体的制备变得容易，所制备的试剂盒成本更低，且更易于储藏和运输。

(2)由于本发明的试剂盒采用对胱抑素C具有高亲和力，且高特异性识别胱抑素C不同表位的纳米抗体和单克隆抗体，灵敏度和准确性非常高。其中尤以单抗5F2包被，纳米抗体噬菌粒3-2检测的效果最佳，其线性范围值为0.5-31.3ng/ml，检测的准确度为94.8%。

(3)由于采用的纳米抗体和单克隆抗体对于胱抑素C具有极其优异的结合特性，因此本发明的试剂盒可以极其快速地检测出血液中胱抑素C。

(4)由于纳米抗体的优点，本发明试剂盒还具有简便、稳定等特点。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、胱抑素C重组表达

一、聚合酶链式反应(PCR)扩增胱抑素C的全长基因

(一)模板：人肾上皮细胞293T总RNA。

(二)引物设计：以成熟胱抑素C的全长基因363bp，设计出用于扩增除去信号肽序列后的胱抑素C基因的引物，上下游引物分别带有内切酶BamHI和XhoI的酶切位点序列。

上游引物：5’GGATCCAGTCCCGGCAAGCCG-3’(SEQIDNO:12)；

下游引物：5’-CCTCGAGCTAGGCGTCCTGACAGGT-3’(SEQIDNO:13)；；

(三)抽提细胞总RNA，使用引物Oligo(dT)18和反转录酶，反转录为cDNA。

RT-PCR获得成熟胱抑素C的基因(363bp)，并连接到克隆载体(pEASY-T1simple[购自北京全式金生物技术有限公司])，菌落PCR验证后，测序结果证明克隆到的基因序列100%与胱抑素C已知基因序列(GenBank:BC013083.1)相同。

二、原核表达质粒pET-32a-CysC的构建

(一)胱抑素C(CysC)天然蛋白结构的分析：除掉信号肽的胱抑素C是包含120个氨基酸残基和2对二硫键的非糖基化多肽链。

(二)内切酶BamHI和XhoI双酶切含有目的基因的克隆载体和原核表达载体pET-32a(Novagen)，胶回收目的片段后使用T4连接酶连接，转化感受态细胞，涂抗生素琼脂板，经测序证明，成功构建了pET-32a-CysC。

三、胱抑素C在大肠杆菌中的表达、蛋白纯化以及浓度测定

(一)载体pET-32a-CysC在Rosseta(DE3)菌种中诱导出了融合蛋白的理论序列是：

MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAGSGSGHMHHHHHHSSGLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTDDDDKAMADIGSSPGKPPRLVGGPMDASVEEEGVRRALDFAVGEYNKASNDMYHSRALQVVRARKQIVAGVNYFLDVELGRTTCTKTQPNLDNCPFHDQPHLKRKAFCSFQIYAVPWQGTMTLSKSTCQDA-(SEQIDNO:14)；

RG是凝血酶酶切位点，KA是肠激酶酶切位点。

凝血酶酶切蛋白之后，目的蛋白大小为16984Da，带有多余蛋白序列。

(二)融合蛋白诱导表达的诱导条件是：

1)培养基：含有100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基；

2)诱导温度：30℃；

3)IPTG浓度：0.5mM；

4)诱导时间：4小时。

(三)包涵体的复性

1)蛋白诱导表达4小时后，5000rpm离心，5min。

2)按照裂解缓冲液：原菌液=1:4的体积比例，用缓冲液重悬菌体，加PMSF至终浓度0.5mM，超声破碎3s超、5s停，总共100循环。

3)12,000rpm，10min，舍上清，沉淀，按照洗涤缓冲液:原菌液=1:10的体积比例加入含有2M尿素的洗涤缓冲液，超声洗涤10分钟。

4)洗涤液倒入透析袋中，4℃透析过夜，融合蛋白包涵体的复性率高达90%以上。

(四)Ni²⁺-琼脂糖凝胶亲和层析柱对透析液中的含有组氨酸标签的融合蛋白进行大量纯化，纯化的融合蛋白使用截留分子量为10KDa的Millipore超滤管对表达的融合蛋白进行浓缩，提高融合蛋白浓度，经过考马斯亮蓝结合法的检测，重组蛋白浓度高达3mg/ml。

(五)标签蛋白的切除

由于融合蛋白带有融合标签蛋白序列，为了确保免疫动物时，抗体的专一性和高效价，所以应该尽量切除多余的外源蛋白序列，于是使用肠激酶对融合蛋白进行酶切，但发现酶切效果不佳，在37℃酶切12小时后，大部分融合蛋白未被切开，可能的原因是肠激酶的酶切位点被遮蔽在蛋白的三维结构内部，而凝血酶的酶切效果却十分显著，将融合标签与目的蛋白酶切后，再次过Ni²⁺-NTA亲和层析柱，将融合标签吸附，将其与目的蛋白片段分开，超滤管再次浓缩目的蛋白。

(六)胱抑素C标准品以及重组胱抑素C的免疫比浊法测定

使用抗胱抑素C包被的颗粒与抗原反应，反应体系发生的浊度变化，在546nm波长处吸光度值与胱抑素C的浓度成比例，用标准品标准曲线便可测定胱抑素C的浓度。试验参数：37℃，波长546nm，样品:试剂＝1:100；吸光度范围0-2A。

胱抑素C标准品购自Enzolifesciences公司，是从人类的尿液里面纯化而来，纯度大于95%。所使用的试剂盒为上海景源医疗器械有限公司的《胱抑素C检测试剂盒(免疫比浊法)》，胱抑素C浓度的有效检测范围是0.4-7.5μg/ml。

操作流程如下：

取值△A=A2-A1。

结果如下：

(1)阴性对照

第一组：实验中胱抑素C标准品需要用试剂盒自带的MOPS缓冲液予以稀释，所以以MOPS缓冲液做阴性对照，其△A均为0。

第二组：以BSA蛋白液的相应稀释液做为阴性对照样品，其△A均为0。

(2)标准曲线的绘制

将标准品进行如表1的稀释。

表1

标准品浓度μg/ml	5.963	4.472	3.354	2.515	1.887	1.415	1.061
								△A	0.079	0.063	0.05	0.035	0.029	0.018	0.015

进行标准曲线的拟合，拟合的标准方程：Y=0.0138X；X：标准品浓度；Y：△A值。

(3)重组胱抑素C(R-CysC)的浓度测定浓度测定结果如表2。

表2

由标准曲线的拟合方程计算，经原核表达、酶切、纯化的胱抑素C浓度达到了2.377mg/ml，同时说明重组胱抑素C可以作为制备多克隆抗体以及单克隆抗体的免疫用抗原。

实施例2、动物免疫

(一)BALB/c小鼠的免疫

小鼠品种是BALB/c，取100μg重组胱抑素C蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合后，乳化完全，在小鼠背部皮下及足部进行注射免疫。第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后用不完全弗氏佐剂。第四次免疫后一周眼眶取血，分离血清，测抗胱抑素C蛋白抗体的效价。经ELISA检测，小鼠四次免疫后的抗体效价为1:512,000。

(二)ELISA步骤

1)包被：用0.05M碳酸盐包被缓冲液(pH=9.6)将抗原(天然胱抑素C)稀释至蛋白质含量为1.0μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液200μl/孔在微孔振荡器上洗3次，每次1分钟。

2)封闭：每孔加入200μl5%BSA封闭液，置37℃孵育2小时，然后用洗涤缓冲液200μl/孔在微孔振荡器上洗3次，每次1分钟。

3)一抗孵育：加一定稀释的待检样品(天然胱抑素C标准液)0.1ml于上述已包被的反应孔中，置37℃孵育1小时，然后用洗涤缓冲液200μl/孔在微孔振荡器上洗4次，每次5分钟。同时做空白孔，阴性对照孔。

4)二抗孵育：于各反应孔中，加入新鲜稀释(1:10000)的酶标二级抗体(羊抗鼠-HRP酶标IgG，购自于SantaCruz有限公司)0.1ml。37℃孵育1小时，然后用洗涤缓冲液200μl/孔在微孔振荡器上洗4次，每次5分钟。

5)显色：于各反应孔中加入临时配制的底物(TMB-H₂O₂溶液)溶液0.1ml，37℃，10分钟。终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

6)结果判定：在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

实施例3、单克隆杂交瘤细胞的融合、筛选、亚克隆

(一)细胞融合

1)加强免疫：四次免疫后的小鼠经腹腔注射100μg重组胱抑素C蛋白再次加强免疫，3天后，取该小鼠脾脏用于融合，留血清以做ELISA检验。

2)饲养层细胞的准备：融合前一天，将5ml培养液注入10周龄的小鼠BALB/c腹腔中，轻轻晃动后抽出腹腔液，离心、计数，调整细胞浓度为1×10⁵/ml，接种到96孔培养板内。

3)将活性良好的对数增殖期的骨髓瘤细胞SP2/0洗涤后计数，细胞悬浮在培养液中备用。

4)脾脏细胞的准备：解剖加强免疫后小鼠，取脾脏，用机械法在一次性BD尼龙网上研磨、分散脾细胞，得到脾细胞悬液，RPM1640培养液洗涤后计数。

5)细胞融合：取SP2/0细胞与脾细胞混合于50ml离心管中，加入无血清培养液，离心，1500rpm，3分钟，弃上清。振松沉淀细胞，逐滴加入50%聚乙二醇4000，体积为1ml，静置90秒。然后逐滴加入37℃预温的无血清培养液10ml，静置5min。融合后细胞悬液离心，1000rpm，3min。弃上清，沉淀细胞轻轻打匀，完全培养液，接种于加有饲养层细胞的96孔板内，每孔2×104骨髓瘤细胞。置37℃，5%CO₂培养箱内培养。第二天，加入2×HAT的完全培养液，使孔内终浓度为1×HAT。

(二)杂交瘤阳性孔的筛选

融合后，待杂交瘤细胞集落长至孔底1/10-1/5面积的时候，即用ELISA方法筛选融合细胞抗体阳性孔。

将重组胱抑素C蛋白用ELISA包被液稀释成1.0μg/ml包被到96孔板内。用5%BSA/PBST封闭后，加入待测孔内杂交瘤细胞培养上清，同时加入阳性、阴性对照，阳性对照为稀释过的免疫后小鼠血清，阴性对照为不含抗体的细胞培养液。随后加入HRP酶标记的羊抗小鼠Ig抗体(酶标二抗)，温育后显色，反应后，加入2MH₂SO₄溶液终止反应，酶标仪调波长到450nm测OD值。部分结果如表3。

表3

细胞上清液	5F2	4E4	1E11	1E8	4G6
						OD450值	2.449	1.119	1.667	1.597	0.147
细胞上清液	2C7	2A1	2H10	5A5	5B3
						OD450值	0.221	0.355	1.323	0.462	0.908

(三)杂交瘤细胞亚克隆

选择培养液抗体检测呈阳性且滴度高的杂交瘤孔用有限稀释法对其中的杂交瘤细胞进行克隆化，一般初次稀释到3个细胞/孔。待细胞培养至20%孔底面积时，吸取有细胞的孔的上清培养液用ELISA方法再次筛选单抗阳性孔再连续3次克隆。克隆率小于2/3和阳性率为100%，这样获得的细胞即为单克隆细胞。

(四)单抗识别天然胱抑素的特异性检测

取经过重组胱抑素C检测为阳性的杂交瘤细胞1×10⁶，加入9ml完全培养液，转入24.8平方厘米的培养瓶内，置于37℃，5%CO₂培养箱内培养3天，取细胞上清液以1:100比例稀释，天然胱抑素C(购自Enzolifesciences公司，是从人类的尿液里面纯化而来，纯度大于95%)1μg/ml的浓度包被96孔板，用ELISA检测测其对天然胱抑素C的特异性识别。

最终筛选到了3株效价较高(OD₄₅₀>0.45)的单克隆杂交瘤细胞株，分别是细胞株5F2、4E4、1E11。

(五)杂交瘤细胞的冻存

挑选生长状态良好的细胞，去掉细胞培养瓶中的旧的培养液，加入完全培养液使细胞悬浮。1000rpm离心10分钟，去上清。加入冻存液制成细胞悬液，使成1.0×10⁷细胞／ml。台盼兰染色，计数活细胞，应在95%以上。

将细胞悬液分装冻存管，每瓶0.5～1.0ml，放-70℃冰箱，一周后，转入液氮罐内保存。

(六)单克隆抗体亚型的鉴定

用Bio-Rad的MouseTypersub-isotyping试剂盒检测杂交瘤细胞所分泌抗体的亚型。

3株阳性细胞株中5F2、4E4、1E11三株的亚型是IgG1。

实施例4、腹水的制备、单抗的纯化、抗体HRP(辣根过氧化酶)酶标

(一)腹水制备

取F1小鼠，于腹腔注射0.5ml石蜡油，7天后，腹腔注射0.5ml1×10⁶杂交瘤细胞。每天观察小鼠生长情况，8天左右可见腹部隆起，及时采集腹水。

(二)单抗的纯化

ProteinGResin是通过溴化氰的方法将ProteinG固定到SpharoseCl-4B基质上。ProreinG与免疫球蛋白重链相互作用结合到它的FC片段。已有大量的文献记载，ProteinG可与大多数哺乳类动物的IgG结合，及少部分IgM和IgA。

(1)介质的准备

ProteinG介质用20%乙醇贮存，使用前，倾去20%乙醇，加入结合缓冲液(20mMpH7.0的磷酸钠缓冲液)，使胶与结合液的比例为3：1，结合液的成分不能明显增加匀浆的黏度，装柱完成后，介质可在低速条件下用粘性缓冲液平衡。

(2)装柱

将所有的材料温度平衡至层析条件指定的温度，不断用缓冲液冲洗下端垫片，以排出层析柱死体积中残留的气泡，确保层析柱滤网下有滞留空气，当层析柱中剩余少量的缓冲液时，关闭柱子出口。用玻璃棒紧靠柱子内壁引流，将介质加入到层析柱中，静置待介质自然沉降。

(3)结合

用20mMpH7.0的磷酸钠缓冲液作为结合液，预先将血清于结合缓冲液中4℃透析过夜，然后以约0.5ml/min流速过柱结合。

(4)洗脱

通常将pH降到3.0-2.5左右，IgG会从填料上洗脱下来。用0.1MpH3.0的甘氨酸缓冲液，作为洗脱缓冲液洗脱结合在介质上的IgG。并用pH9.0的TE缓冲液中和洗脱下来的甘氨酸溶液至pH7.0

步骤同多抗纯化，ProteinGResin纯化得到单抗5F2、4E4、1E11，纯度在95%以上。获得单抗5F2蛋白量为4mg，单抗4E4、1E11收集量均为2mg。

(三)抗体HRP(辣根过氧化酶)酶标

1)称取2mgHRP溶解于500μL蒸馏水中。

2)向溶液中加入500μL新配的0.1MNaIO₄溶液，混匀，4℃静置30分钟。

3)加入0.16M乙二醇水溶液500μL，混匀，静置30分钟。

4)将2mg的单克隆抗体溶于500μL去离子蒸馏水(DDH₂O)中，加入上述溶液中，混匀装入透析袋中，pH9.5的碳酸盐缓冲液透析，4℃过夜。

5)加入200μL新配的5mg/mlNaBH₄，混匀，再置4℃，2H。

6)放于pH7.4的磷酸缓冲液中4℃透析过夜。

抗体酶标后进行Native-PAGE，并通过ELISA检验酶标效果，证明成功获得酶标抗体。

实施例5、单抗与天然胱抑素C之间亲和力的测定

(一)操作流程

1)抗原准备：天然胱抑素C3μg。

2)缓冲液准备：0.05MPBS，调pH=7.4，用0.22μm过滤膜过滤，然后脱气。

3)耦联：由于芯片表面带有负电，因此要耦联到芯片上的分子必须带上正电，才有利于分子吸附到芯片表面，以利于共价耦联反应的完成。预结合实验证明，等电点为9.0的胱抑素C在HCl-甘氨酸缓冲液(pH=4.5)中可以很好地结合在CM5表面，于是将3μg胱抑素C溶解在200μL的HCl-甘氨酸缓冲液(pH=4.5)充分地结合在传感器CM5上，然后用PBS平衡过夜。

4)测试

将分析物用PBS稀释处理，上样。

单抗5F2摩尔浓度梯度(nM)：0，1，32，4，5，8，10，20。

单抗4E4摩尔浓度梯度(nM)：0，25，50，75，100，120，150。

单抗1E11摩尔浓度梯度(nM)：0，2，4，5，8，10，20。

单抗5F2、4E4、1E11分别上样。

5)再生

再生是指将结合到芯片表面的分析物洗脱，以便芯片的重复使用。

(二)结果

Ka：结合系数；Kd：解离系数；KD：Kd/Ka，亲和力系数；

单抗5F2的亲和系数测定结果如图1。Ka=1.180E+6；Kd=0.002665；KD=2.258E-9。

单抗4E4的亲和系数测定结果如图2。Ka=3.402E+4；Kd=0.001012；KD=2.975E-8。

单抗1E11的亲和系数测定结果如图3。Ka=9.031E+4；Kd=0.003271；KD=3.622E-9。

综上结果可见，单抗5F2、4E4、1E11均具有较高的亲和力，其中单抗5F2和1E11的亲和力更高。

实施例6、噬菌体展示技术筛选胱抑素C的纳米抗体

自然界在骆驼(Camelidae)体内存在缺失轻链的重链抗体，克隆其可变区得到的单域抗体是最小的功能性抗原结合片段，相对分子质量仅为13KDa左右，称为纳米抗体(variabledomainofheavychainofheavychainantibody，VHH)，具有稳定性强、可溶性好、易表达、免疫原性低等特点。

首先，将未经免疫的骆驼体内免疫B细胞中的纳米抗体mRNA反转录为cDNA，然后可变区克隆到噬菌粒(Phagemid，噬菌体质粒)M13K07(购自美国Stratagene公司)，转化入大肠杆菌菌株XL1-Blue，最后在辅助噬菌体M13K07辅助扩增、包装下，将纳米抗体蛋白片段展示在噬菌体M13K07的表面，成为驼源性天然单域重链抗体库。

本发明所用到的驼源天然单域重链抗体库获自意大利IFOM-IEO大学。

(一)胱抑素C纳米抗体的筛选、富集

1)M13K07滴度测定

1.单菌落XL1-Blue，接种于2×TY/Tet(15μg/ml)培养基，37℃过夜。

2.以1:100比例重新接种于新鲜2×TY培养基，37℃至OD600=1.0。

3.将噬菌体储液进行一系列10倍梯度稀释，溶于0.1ml分装的2×TY培养基中，每个梯度两份，以得到一个每毫升10³-10⁵噬菌体的浓度。

4.2×TY上层琼脂融化，每份噬菌体稀释液至少3ml，冷却至45℃。

5.每个噬菌体稀释液，10μl噬菌体液于500μl新鲜XL1-Blue细胞在一个10ml的培养试管中，10分钟之后加入3ml上层琼脂，迅速混匀，立即将上层琼脂混合物倒至LB琼脂平板上，摇晃平板，让上层琼脂铺开，防止上层琼脂结成块，37℃静置过夜。

6.噬菌斑的数目×100×相应的稀释倍数，等于原始储液中的噬菌体的滴度。

2)M13K07的扩增

1.用枪头从过夜培养的平板上挑取一个单噬菌斑，在1ml新鲜XL1-Blue细胞中吹洗，37℃振荡培养1小时。

2.吸取100μl培养物在50μg/ml四环素的2×TY50ml中，37℃振荡培养24小时。

3.将培养物转移到无菌管里，14000rpm，4℃10分钟，上清液转移到新管中，1/5体积比例的40%PEG4000＆2.5MNaCl液，强烈震动，冰浴15分钟。

4.14000rpm，4℃15分钟，尽量去除上清，用1/20体积的1×TE缓冲液重悬沉淀，15000rpm4℃5分钟，上清转移到无菌管中，OD268=1.0对应每毫升5×10¹²个噬菌体。

3)原始纳米抗体库的大量扩增

1.单菌落XL1-BLUE，接种于2×TY/Tet(15μg/ml)培养基，37℃过夜。

2.以1:100比例重新接种于新鲜2×TY培养基，37℃至OD600=0.4～0.5。

3.用10¹⁰-10¹¹数量级的噬菌体侵染50ml的XL1-Blue，37℃静置40分钟。

4.取100μl细胞悬液，在2×TY培养基里做10倍梯度稀释(10^-1-10^-12)，取10μl的各稀释度的细胞液于LB-氨苄平板上涂布，30℃过夜。

5.剩下的培养物37℃继续培养1H，然后加入500ml2×TY培养基，37℃继续培养1H。

6.用20倍的M13K07(10¹³)100μL进行侵染，37℃静置40分钟。

7.3000g，室温15分钟，沉淀重新悬浮于1000ml2×TY+AMP+KAN+GLU，30℃，150rpm摇荡培养过夜。

8.将上清转移到无菌管里，14000rpm，4℃10分钟，上清液转移到新管中，按照每400μl上清液加入100μl40%PEG4000＆2.5MNaCl液，强烈震动，冰浴15分钟。

9.14000rpm，4℃15分钟，去掉上清，用4ml1×TE缓冲液溶解，滴度为10¹¹pfu/μl。

4)胱抑素C纳米抗体的筛选、富集-第一轮

1.称取前述制备的重组胱抑素C44μg，溶于3ml的碳酸钠-碳酸氢钠包被液(pH=9.5)中，加入容量为4ml的Nunc-Immuno^TMMaxisorp^TM免疫试管中，4℃过夜。

2.Tris-HCl封闭免疫试管的未饱和的蛋白偶联位点。先用偶联液清洗免疫试管3次，尽量去除上清，加入4ml0.1MTris-HCl缓冲液(pH8.0)，室温静置2H，以封闭活性位点。

3.BSA封闭潜在蛋白结合位点。4ml5%BSA放入免疫试管中，室温缓慢摇动2H，PBS清洗3次，甩干净。

4.1ml噬菌体纳米抗体库液，总共10¹⁴个噬菌体加入免疫试管，室温下，混合器缓慢摇晃30分钟，然后室温静置90分钟，PBST清洗免疫试管10次，PBS清洗免疫试管10次，甩干。

5.噬菌体洗脱。免疫试管中加入600μl的10mMHCl，缓慢摇晃，室温30分钟，然后加入100μl0.1MTris-HCl将pH调至7.5，加入2ml新鲜的，OD=7.0的XL1-Blue菌液，37℃静置50分钟，转移到50ml离心管中，加入5ml2×TY，37℃摇荡30分钟。

6.加入1μl的10¹¹个M13K07噬菌体，37℃静置50分钟，3000g，离心5分钟，去掉上清，沉淀溶于50ml的2×TY+AMP+KAN+GLU培养基，30℃过夜。

7.PEG4000沉淀培养基上清液中噬菌体，14000rpm离心，2ml的1×TE溶解噬菌体，滴度约为10¹¹。

5)胱抑素C纳米抗体的筛选、富集

第二、三、四、五轮，步骤同第一轮。

6)ELISA检测胱抑素C的纳米抗体富集度

1.抗原包被：天然胱抑素C分别包被ELISA板，包被浓度为1μg/ml。

2.BSA封闭；

3.每个ELISA孔加入10⁹个不同富集度的纳米抗体噬菌粒，稀释到PBST中，100μl/孔，1H静置。

4.Anti-噬菌体抗体(兔来源)，稀释度1:5000，100μl/孔，37℃，1H。

5.羊抗兔IgG抗体(HRP)，稀释度1:10000，100μl/孔，37℃，1H。

随着一轮一轮的筛选的进行，能够特异性识天然胱抑素C的纳米抗体逐渐被富集。

(二)单克隆纳米抗体菌落选取

ELISA法检测胱抑素C的抗体富集度，到达平台期的第三轮筛选得到的抗体库随机选取60个纳米抗体单菌落，而到达平台期的第四轮的抗体库随机选取30个纳米抗体单菌落，分别用M13K07辅助扩增，离心后的上清液直接作为抗体溶液做ELISA，选取光度值最高的单菌落作为单克隆纳米抗体，根据单克隆纳米抗体噬菌粒(Phage-VHH)ELISA的结果，第三轮、第四轮分别挑取了10个阳性菌落测序，结果显示纳米抗体编码基因序列存在重复的现象，只有6种不同序列，其中4种来自第三轮，分别是3-2、3-24、3-30、3-33，2种来自第四轮，分别是4-5、4-8。进一步的筛选，得到了可以和3-2配对的纳米抗体，分别是5-10、6-1、7-2、7-4。

(三)序列测定与分析

1序列测定

3-2

MADVQLQASGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIVSINDMGWYRQAPGKQRDLVALITRGGNTNYADSVKGRFTISRDNAKSTVYLQMNNLKPEDTAVYYCATLTRPAYWGQGTLVTVSSGR(SEQIDNO:1)

3-24

MADVQLQASGGGLVQPGGSLRLSCAVSGTNFRLNDMAWYRQPPEKRRELVALITGGGNTSYADSVKDRFTISRDNIQRTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTTQRSGRQYWGKGTHVTVSSGR(SEQIDNO:2)

3-30

MADVQLQASGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIASIHDMGWYRQTPGKQRDLVALITRGGNTNYADSVKGRFTISRDNAKSTVYLQMNSLKPEDTAVYYCATLTRPAYWGQGTLVTVSSGR(SEQIDNO:3)

3-33

MAEVQLQASGGGLVQPGGSLRLSCAASRMVIRTFSGADMGWYRQISRNQRELVALITSGGNTNYTDSVKGRFTISRDNAKGTLYLQMSNLKPEDTAHYYCAKISFTGPHRWGQGTQVTVSSGR(SEQIDNO:4)

4-5

MAEVQLQASGGGLVQPGGSLRLSCAASRMVFSTFSGADMGWYRQISGNQRELVALITSGGNTNYTDSVKGRFTISRDNAKGTLYLQMSSLKPEDTAHYYCAKISRTTPHYWGQGTQVTVSSGR(SEQIDNO:5)

4-8

MAEVQLQASGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSINDMGWYRQAPGKQRELVAFITRGGNTHYADSAKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCNTVNTRTRSWGQGTQVTVSSGR(SEQIDNO:6)

5-10

MADVQLQASGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIVSINDMGWYRQAPGKQRDLVALITRGGNTNYADSVKGRFTISRDNAKSTVYLQMNNLKPEDTAVYYCATLTRPAYWGQGTLVTVSSGR(SEQIDNO:7)

6-1

MADVQLQASGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQAPGKGLEWVSANITGGGNTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKSEDTAVYYCAKDLVRSAYGQPAFGSWGQGTLVTVSSGR(SEQIDNO:8)

7-2

MAEVQLQASGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIVSINDMGWYRQAPGKQRDLVALITRGGNTNYADSVKGRFTISRDNAKSTVYLQMNNLKPEDTAVYYCNTLTSPAYWGQGTQVTVSSGR(SEQIDNO:9)

7-4

MADVQLQASGGGLVQPGGSLRLTCAASGTIFRRNDMGWYRQAPGKQRELVAFITREGNTNYADSVKGRFAISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCYDYRGYRSWGQGTQVTVSSGR(SEQIDNO:10)

2序列分析

①各个纳米抗体氨基酸数量以及MW特性如表4。

表4

②各纳米抗体骨架区含有共同特征氨基酸序列：GGSLRL(SEQIDNO:11)。

③各纳米抗体超变区含有共同特征氨基酸序列：IT**GNT(*为随机氨基酸)。

(四)竞争性ELISA测定纳米抗体噬菌粒的亲和力

步骤：

1.抗原天然胱抑素C用包被液稀释至1μg/ml，包被96孔板，37℃孵育2h。

2.在一排EP管中，建立从0.1nmol/L-1μmol/L浓度梯度的抗原PBS溶液，分别加入单克隆Phage-VHH(P-VHH)稀释液，浓度为0.5×nmol/L(注意纳米抗体噬菌粒摩尔浓度要低于Kd)，使总体积为400μl。

3.室温孵育30min后，加入100μl反应混合物到上述已经包被了天然胱抑素C的微孔中(实验时要重复3次，避免误差)后37℃孵育，但时间不能超过10min。

4.充分洗涤微孔，加入稀释倍数为10,000的兔抗M13K07的IgG，37℃孵育1h。

5.充分洗涤微孔，加入稀释倍数为10,000的辣根过氧化酶(HRP)酶标羊抗兔的IgG(购自SantaCruz公司)，37℃孵育1h。

6.充分洗涤，TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺)显色，10分钟后，2M硫酸终止反应，在波长450nm下读取吸光光度值(见表5)。

当抗原浓度较低时，OD值高；当抗原浓度高到一定程度时，没有显色信号，最强信号的一半时的抗原浓度相当于Phage-VHH的解离常数Kd，根据此原理，计算得到各个纳米抗体噬菌粒的亲和力常数(见表6)。

表5

表6

编号	3-2	3-24	3-30	3-33	4-5	4-8	5-10	6-1	7-2	7-4
											Kd	1.00E-09	1.00E-08	5.00E-08	1.00E-08	5.00E-08	1.00E-08	1.00E-09	1.00E-08	5.00E-07	1.00E-08

(五)单克隆纳米抗体的原核表达以及纯化

合成包含有内切酶NcoI、XhoI酶切位点的引物，以含有纳米抗体编码基因信息的噬菌粒(phagemid)为模板，扩增获得纳米抗体基因片段，将纳米抗体基因片段构建入pET-28a，转化Rosetta(DE3)，IPTG诱导表达，表达的纳米抗体携带6×His标签蛋白，ELISA检测全菌裂解液识别天然胱抑素C的效果，选取阳性的克隆使用镍柱纯化纳米抗体，SDS-PAGE检测蛋白纯化情况，WesternBlot检测抗体特异性。

上游引物：5’-GCCCAGGGATCCATGGCTG-3’(SEQIDNO:15)；下划线为NcoI切点；

下游引物：5’GGAACGTCCTCGAGGTAGCGG-3’(SEQIDNO:16)，下划线为XhoI切点。

纳米抗体镍柱纯化后SDS-PAGE结果如图4。

实施例7：鼠单抗5F2和纳米抗体的配对检测人胱抑素C

标准品的配制：将购买的胱抑素C天然蛋白，用稀释液配制各种浓度梯度(ng/ml)：250.0，125.0，62.5，31.3，15.6，7.8，3.9，2.0，1.0，0.5，0.2。

1.包被：用0.05M碳酸盐包被缓冲液(pH=9.6)将鼠单抗5F2稀释为5.0μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液200μl/孔在微孔振荡器上洗3次，每次1分钟。同时设置仅以包被缓冲液处理而无包被抗体的空白孔(BLANK)。

2.封闭：每孔加入200μl5%BSA封闭液，置37℃孵育2小时，然后用洗涤缓冲液200μl/孔在微孔振荡器上洗3次，每次1分钟。

3.胱抑素C孵育：起始孵育浓度为250ng/ml，然后倍比稀释至0.2ng/ml，0.1ml于上述已包被的反应孔中，置37℃孵育1小时，然后用洗涤缓冲液200μl/孔在微孔振荡器上洗4次，每次5分钟。设置阴性对照孔，用PBST代替胱抑素C孵育。

4.纳米抗体的孵育：于各反应孔中，加入1μg/ml的纳米抗体0.1ml，37℃孵育1小时，然后用洗涤缓冲液200μl/孔在微孔振荡器上洗4次，每次5分钟。

5.Anti-His兔抗(购自中科英沐生物技术有限公司)的孵育：稀释至0.1μg/ml，0.1ml于上述反应孔中，置37℃孵育1小时，然后用洗涤缓冲液200μl/孔在微孔振荡器上洗4次，每次5分钟。

6.HRP-Goatanti-rabbit抗体(购自SantaCruz公司)的孵育：稀释至0.1μg/ml，0.1ml于上述反应孔中，置37℃孵育1小时，然后用洗涤缓冲液200μl/孔在微孔振荡器上洗4次，每次5分钟。

7.显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～25分钟。终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。之后测OD450值。说明：OD450值若大于阴性对照孔OD450值的2倍的话，则视为阳性结果。

2)结果与分析

单抗5F2配对各纳米抗体的检测结果如表7和图5。

表7

综上结果可见，单抗5F2与纳米抗体3-2、4-5可用于配对检测胱抑素C。

单抗5F2与纳米抗体3-2配对检测胱抑素C最为理想，灵敏度高，可以稳定检测7.8～62.5ng/ml浓度的胱抑素C，单抗5F2与纳米抗体4-5配对检测胱抑素C，可以稳定检测31.3～250ng/ml的胱抑素C，极具市场价值。本发明人进行了重复多次的研究验证，发现其重复性好，结果稳定。

实施例8：鼠单抗1E11和纳米抗体的配对检测人胱抑素C

1.包被：用0.05M碳酸盐包被缓冲液(pH=9.6)将鼠单抗1E11稀释为5.0μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液200μl/孔在微孔振荡器上洗3次，每次1分钟。同时设置仅以包被缓冲液处理而无包被抗体的空白孔(BLANK)。

单抗1E11配对各纳米抗体的检测结果如表8以及图6。

表8

可见，单抗1E11与纳米抗体3-2、4-5可用于配对检测胱抑素C，均可以稳定检测7.8～250ng/ml的胱抑素C，极具市场价值。本发明人进行了重复多次的研究验证，发现其重复性好，结果稳定。

实施例9：鼠单抗5F2和纳米抗体噬菌粒的配对检测人胱抑素C

检测步骤：

4.纳米抗体噬菌粒的孵育：于各反应孔中，加入1μg/ml的纳米抗体0.1ml，37℃孵育1小时，然后用洗涤缓冲液200μl/孔在微孔振荡器上洗4次，每次5分钟。

5.Anti-M13K07兔抗(购自中科英沐生物技术有限公司)的孵育：稀释至0.1μg/ml，0.1ml于上述反应孔中，置37℃孵育1小时，然后用洗涤缓冲液200μl/孔在微孔振荡器上洗4次，每次5分钟。

结果，单抗5F2配对纳米抗体噬菌粒的检测结果如表9以及图7。

表9

综上结果可见，单抗5F2与纳米抗体噬菌粒P-3-2、P-4-5可用于配对检测胱抑素C。

单抗5F2与纳米抗体噬菌粒P-3-2配对检测胱抑素C最为理想，灵敏度高；可以稳定检测0.5～31.3ng/ml浓度的胱抑素C，单抗5F2与纳米抗体P-4-5配对检测胱抑素C，可以稳定检测2.0～62.5ng/ml的胱抑素C，极具市场价值。本发明人进行了重复多次的研究验证，发现其重复性好，结果稳定。

实施例10、鼠单抗1E11和纳米抗体噬菌粒的配对检测人胱抑素C

检测步骤：

单抗1E11配对各纳米抗体噬菌粒的检测结果如表10以及图8。

表10

可见，单抗1E11与纳米抗体噬菌粒P-3-2、P-4-5可用于配对检测胱抑素C，均可以稳定检测15.6～62.5ng/ml的胱抑素C。本发明人进行了重复多次的研究验证，发现其重复性好，结果稳定。

实施例11、纳米抗体3-2和纳米抗体噬菌粒配对检测人胱抑素C

检测步骤：

1.包被：用0.05M碳酸盐包被缓冲液(pH=9.6)将重组、镍柱(购自上海业力生物技术有限公司)纯化的纳米抗体3-2稀释为10.0μg/ml，同时做空白孔(BLANK)，空白孔中无胱抑素C，只有包被缓冲液。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液200μl/孔在微孔振荡器上洗3次，每次1分钟。

4.纳米抗体的孵育：分别将纳米抗体噬菌粒P-5-10、P-6-1、P-7-4的浓度稀释至10¹⁰个/ml，于各反应孔中，加入0.1ml的稀释液，37℃孵育1小时，然后用洗涤缓冲液200μl/孔在微孔振荡器上洗4次，每次5分钟。

5.RabbitAnti-M13K07的兔抗(通过纯化的M13K07噬菌体直接作为抗原免疫新西兰大耳兔，取血纯化而得)孵育：稀释10000倍，0.1ml于上述反应孔中，置37℃孵育1小时，然后用洗涤缓冲液200μl/孔在微孔振荡器上洗4次，每次5分钟。

7.显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～25分钟。终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml，之后测OD450值，OD450值若大于阴性对照孔OD450值的2倍的话，则视为阳性结果，结果见表11以及图9。

表11

根据以上数据，计算得到纳米抗体噬菌粒和3-2配对检测的线性范围，见表12。

表12

克隆编号	检测范围(ng/ml)
		P-5-10	7.8～125
P-6-1	7.8～125
		P-7-4	7.8～250

实施例12、ELISA试剂盒特性测定

1、线性范围、灵敏度测定

采用在测定范围内的多个浓度样品进行测定范围的研究，该样品浓度应平均分布于试剂盒的整个测定范围。

免疫测定的标准曲线比较复杂，通常不呈线性包括经过直线化处理的曲线，曲线中点附近斜率绝对值较大，测定准确度较高。在高浓度和低浓度端斜度变化较大，变异增加，限制了可测范围。

灵敏度是指应用该法能检出待测物的最低量，即最小检出量"最小检出量越低，灵敏度越高，在酶联免疫试剂中，可用测“0”标准管的光密度值来确定，测定10个或10个以上“0”标准管，求出平均数，再加上两倍标准差所对应的待测物浓度为最低检测限。

表13与图10显示，5F2包被，P-3-2检测配对检测人胱抑素C诊断试剂盒在0.5-31.3ng/ml范围内OD450与人胱抑素C浓度呈良好的线性关系。

表13

2、准确度测定

某种方法测定结果接近真值的程度，称为该方法的准确度，常通过添加回收率试验进行评价，对于定量测定产品而言，可以采用对国际或国家标准品的测定、加入回收试验等方法，评价该产品的测定准确度。

(1)尿液样本

向稀释了5倍的尿液中添加人胱抑素C配制成不同标准浓度，用本试剂盒检测其回收率(表14)：

表14、尿液中添加人胱抑素C检测ELISA试剂盒回收率

由表中的数据计算该试剂盒准确度=1-{(105.6%-1)+(107.4%-1)+(1-95.1%)+(104.4%-1)+(103.4%-1)+(112.5%-1)}/6=94.8%。

所以人胱抑素C试剂盒的准确度为94.8%。

3、精密度测定

精密度又称可重复性，反映测定方法对某一特定样本多次测定所得结果的重复程度，这是评定质量最基本的参数，精密度可以用变异系数(CV)表示。

分别配制30、20、10、5ng/ml的HCC样品溶液，分别测量10次，表15和图11数据显示，批内变异度CV分别为4.1%、4.5%、7.94%、10.1%，符合CV<15%的要求。

表15

编号	30ng/ml	20ng/ml	10ng/ml	5ng/ml
					1	2.136	1.424	0.712	0.356
2	2.036	1.321	0.703	0.296
					3	2.108	1.396	0.654	0.387
4	2.001	1.489	0.689	0.402
					5	2.236	1.323	0.723	0.367
6	2.112	1.41	0.754	0.435
					7	1.936	1.512	0.789	0.371
8	2.006	1.452	0.596	0.365
					9	2.113	1.367	0.673	0.412
10	2.035	1.402	0.756	0.398

综上所述，本发明通过表达胱抑素C重组蛋白并研制单克隆抗体，筛选到可以与天然胱抑素C具高亲和力的亚型为IgG1的单克隆抗体5F2和1E11，亲和常数达10^-9，同时经过配对筛选的初步实验，单抗5F2与纳米抗体3-2配对可以稳定检测7.8～62.5ng/ml的胱抑素C，单抗5F2与纳米抗体4-5配对检测胱抑素C，可以稳定检测31.3～250ng/ml的胱抑素C；单抗1E11与纳米抗体3-2、4-5配对均可以稳定检测7.8～250ng/ml的胱抑素C；单抗5F2与纳米抗体噬菌粒P-3-2配对可以稳定检测0.5～31.3ng/ml浓度的胱抑素C，单抗5F2与纳米抗体噬菌粒P-4-5配对可以稳定检测2.0～62.5ng/ml的胱抑素C；单抗1E11与纳米抗体噬菌粒P-3-2、P-4-5配对，均可以稳定检测15.6～62.5ng/ml的胱抑素C。纳米抗体噬菌粒P-5-10、P-6-1、P-7-4与纳米抗体3-2配对可以检测7.8～250ng/ml范围的人胱抑素C。

上述各种配对组合构成的一系列试剂盒极具市场价值。

生物材料保藏

本申请中，产生所述单克隆抗体5F2的杂交瘤细胞株已经保藏于中国典型培养物保藏中心(中国，武汉)，保藏号为：CCTCCNO:C201239，保藏日为：2012年4月11日。

本申请中，产生所述单克隆抗体1E11的杂交瘤细胞株已经保藏于中国典型培养物保藏中心(中国，武汉)，保藏号为：CCTCCNO:C201253，保藏日为：2012年4月11日。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种纳米抗体，其特征在于，能高亲和力特异性与人胱抑素C结合；且骨架区含有如SEQIDNO:11所示的共同特征氨基酸序列；并且，在抗体超变区含有共同特征氨基酸序列：IT**GNT，其中“*”代表一个随机氨基酸；

所述的纳米抗体的氨基酸序列如SEQIDNO:1-10任一所示。

2.一种多核苷酸，其特征在于，其编码权利要求1任一所述的纳米抗体。

3.一种纳米抗体噬菌体，其特征在于，其包括：噬菌体，以及展示于噬菌体表面的权利要求1任一所述的纳米抗体。

4.一种特异性检测人胱抑素C的试剂盒，其特征在于，包括：

权利要求1任一所述的纳米抗体；或

权利要求3所述的任一纳米抗体噬菌体。

5.如权利要求4所述试剂盒，其特征在于，还包括人胱抑素C特异的单克隆抗体。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的人胱抑素C特异的单克隆抗体选自：

7.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包括：

(a)中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCCC201239的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，和(b)氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的纳米抗体；或

(a)中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCCC201239的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，和(b)氨基酸序列如SEQIDNO:5所示的纳米抗体；或

(a)中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCCC201253的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，和(b)氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的纳米抗体；或

(a)中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCCC201253的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，和(b)氨基酸序列如SEQIDNO:5所示的纳米抗体；或

(a)中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCCC201239的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，和(b)表面展示有氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的纳米抗体的纳米抗体噬菌体；或

(a)中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCCC201239的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，和(b)表面展示有氨基酸序列如SEQIDNO:5所示的纳米抗体的纳米抗体噬菌体；或

(a)中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCCC201253的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，和(b)表面展示有氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的纳米抗体的纳米抗体噬菌体；或

(a)中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCCC201253的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，和(b)表面展示有氨基酸序列如SEQIDNO:5所示的纳米抗体的纳米抗体噬菌体；或

(a)氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的纳米抗体，和(b)表面展示有氨基酸序列如SEQIDNO:7所示的纳米抗体的纳米抗体噬菌体；或

(a)氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的纳米抗体，和(b)表面展示有氨基酸序列如SEQIDNO:8所示的纳米抗体的纳米抗体噬菌体；或

(a)氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的纳米抗体，和(b)表面展示有氨基酸序列如SEQIDNO:10所示的纳米抗体的纳米抗体噬菌体。

8.如权利要求4-7任一所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括固相载体，所述的纳米抗体被固定于固相载体；或所述的单克隆抗体被固定于固相载体。

9.如权利要求4-7任一所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：

能与所述的纳米抗体或单克隆抗体连接的可检测标记物，所述的可检测标记物被连接于所述的纳米抗体或单克隆抗体或分离地存在于试剂盒；

胱抑素C标准品；和/或

与可检测标记物相对应的底物；和/或

酶联免疫反应试剂；和/或

说明检测人胱抑素C的方法的使用说明书。

10.权利要求1所述的纳米抗体的用途，用于制备特异性检测人胱抑素C的检测试剂盒。

11.一种检测待测样品中胱抑素C存在情况的非诊断性方法，其特征在于，所述方法包括：

以权利要求7的试剂盒中(a)抗体作为包被抗体，(b)抗体作为检测抗体，且在所述的检测抗体上设置一可检测标记物；通过双抗夹心酶联免疫反应法来检测待测样品中胱抑素C的存在情况。