CN113087789B

CN113087789B - 丝状噬菌体pⅧ蛋白单克隆抗体及其应用

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Publication number: CN113087789B
Application number: CN201911340110.1A
Authority: CN
Inventors: 王战辉; 于雪芝; 温凯; 沈建忠; 杨慧娟; 袁婷; 郭柳川; 张素霞; 史为民
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2019-12-23
Filing date: 2019-12-23
Publication date: 2022-09-23
Anticipated expiration: 2039-12-23
Also published as: CN113087789A

Abstract

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及丝状噬菌体pⅧ蛋白单克隆抗体及其应用。本发明提供的丝状噬菌体pⅧ蛋白单克隆抗体的重链可变区具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，轻链可变区具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；或者，重链可变区具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，轻链可变区具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。本发明提供的单克隆抗体具有生物活性单一、效价高、特异性高的优点，能够高效、特异地结合和识别丝状噬菌体，在丝状噬菌体识别和噬菌体展示技术中具有重要的应用价值。

Description

丝状噬菌体pⅧ蛋白单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及丝状噬菌体pVIII蛋白单克隆抗体及其应用。

背景技术

噬菌体展示技术是由George Smith于1985年建立的基因表达筛选技术，该技术通过将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时，外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面。噬菌体展示技术可将重组蛋白质筛选和基因筛选合二为一，已经作为一种强大的工具运用在抗体和酶的配体筛选、小分子的受体筛选、基因工程抗体筛选等各个领域。该技术获得了2018年诺贝尔化学奖，主要研究成果涉及对蛋白质演化进行控制，开发特异性蛋白质代替传统方法生产药物、化学品，获得了催化化学反应的定制酶、定向进化的人类抗体药物。诺贝尔化学奖得主发明的方法可利用遗传变异和筛选，开发出人类需要的蛋白质，以推动更为绿色的化学工业，帮助开发新型材料，制造可持续的生物燃料，帮助减轻人类疾病或挽救生命，因此噬菌体展示技术具有极高的应用价值。

利用噬菌体展示技术筛选特异性蛋白，首先要建立噬菌体展示文库，以展示不同外源基因，然后再对噬菌体文库进行筛选。构建文库获得外源基因片段的方法有：人工合成、cDNA法、脱氧核糖核酸酶I(DNase I)水解DNA等。将外源片段连入噬菌粒中，将重组噬菌粒转入到宿主细胞内，再加入M13KO7辅助噬菌体进行超感染培养，收集培养液上清，上清即为噬菌体展示文库。在此过程中，辅助噬菌体作用是为噬菌粒DNA提供复制和包装所需要的酶和外壳蛋白。

在噬菌体展示库筛选过程中，需要对外源多肽的特异性进行鉴定，目前主要是通过抗M13KO7辅助噬菌体抗体来进行识别和信号呈递，以此来区分阴性和阳性克隆。具有效价高，特异性强，稳定性好的抗体等对结果的判定起着至关重要的作用，直接影响着噬菌体展示技术的效率和成功率。目前，国内尚没有可以应用于识别丝状噬菌体的单克隆抗体的报道。pVIII蛋白是噬菌体的主要衣壳蛋白，多达2700个拷贝(相比于其他低拷贝数的衣壳蛋白在数量上具有明显的优势)。因此，制备高特异性的pVIII 蛋白单克隆抗体对噬菌体的识别和噬菌体展示技术具有重要意义。

发明内容

为解决现有技术存在的技术问题，本发明的目的在于提供具有高特异性、高亲和力和高效价的丝状噬菌体pVIII蛋白单克隆抗体以及该单克隆抗体的应用。

为实现上述目的，本发明分别利用丝状噬菌体pVIII衣壳蛋白膜外多肽部分偶联载体蛋白制备的免疫原和丝状噬菌体免疫小鼠，对免疫小鼠进行血清效价和特异性的精确筛选，通过细胞融合获得能够稳定、高效分泌丝状噬菌体pVIII蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞以及具有高特异性和高亲和力的丝状噬菌体pVIII蛋白单克隆抗体。

具体地，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供丝状噬菌体pVIII蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区，能够特异性结合丝状噬菌体pVIII蛋白；所述重链可变区具有如下氨基酸序列中的任一种：

(1)如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示；

(2)如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的序列经一个或多个氨基酸的缺失、替换或插入得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；

(3)与如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的序列具有至少70％同源性且具有相同功能蛋白的氨基酸序列；优选地，所述同源性为至少85％；更优选为至少95％；

所述轻链可变区具有如下氨基酸序列中的任一种：

(1)如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示；

(2)如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的序列经一个或多个氨基酸的缺失、替换或插入得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；

(3)与如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的序列具有至少70％同源性且具有相同功能蛋白的氨基酸序列；优选地，所述同源性为至少85％；更优选为至少95％。

优选地，所述单克隆抗体的重链可变区具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，轻链可变区具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；或者，所述单克隆抗体的重链可变区具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，轻链可变区具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。

第二方面，本发明提供编码所述丝状噬菌体pVIII蛋白单克隆抗体的核酸。

第三方面，本发明提供产生所述丝状噬菌体pVIII蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。

第四方面，本发明提供所述丝状噬菌体pVIII蛋白单克隆抗体经生物标记或化学标记得到的标记复合物。

优选地，所述生物化学标记为选自酶标记、生物素标记、荧光染料标记、化学发光染料标记、放射性标记中的一种或多种。

所述化学标记包括但不限于荧光素分子等标记。

所述生物标记包括但不限于酶标记，例如：辣根过氧化物酶标记。

第五方面，本发明提供一种丝状噬菌体抗原，由包含如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列的多肽与载体蛋白偶联得到。

所述多肽优选为：Cys-Ahx-AEGDDPAKAAFDSLQASAT。

所述载体蛋白优选为钥孔血蓝蛋白(KLH)或牛血清白蛋白(BSA)。

所述多肽与所述载体蛋白的偶联比优选为1:(1～2)。

利用上述丝状噬菌体抗原免疫动物更有利于获得具有高特异性的丝状噬菌体pVIII 蛋白单克隆抗体。

第六方面，本发明提供所述丝状噬菌体pVIII蛋白单克隆抗体或编码所述丝状噬菌体pVIII蛋白单克隆抗体的核酸或产生所述丝状噬菌体pVIII蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞或所述标记复合物或所述丝状噬菌体抗原在丝状噬菌体或丝状噬菌体抗体检测中的应用。

第七方面，发明提供所述丝状噬菌体pVIII蛋白单克隆抗体或编码所述丝状噬菌体 pVIII蛋白单克隆抗体的核酸或产生所述丝状噬菌体pVIII蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞或所述标记复合物或所述丝状噬菌体抗原在丝状噬菌体展示技术中的应用。

第八方面，发明提供所述丝状噬菌体pVIII蛋白单克隆抗体或编码所述丝状噬菌体 pVIII蛋白单克隆抗体的核酸或产生所述丝状噬菌体pVIII蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞或所述标记复合物或所述丝状噬菌体抗原在功能蛋白筛选、抗原抗体库建立、药物或疫苗筛选、病原检测或基因治疗靶标筛选中的应用。

第九方面，本发明提供一种丝状噬菌体检测试剂盒，其包含所述丝状噬菌体pVIII蛋白单克隆抗体或所述标记复合物。

本发明的有益效果在于：

1、本发明提供的抗丝状噬菌体pVIII蛋白的单克隆抗体具有高度均一、生物活性单一、效价高、特异性高的优点，能够高效、特异地结合和识别丝状噬菌体，为丝状噬菌体展示技术提供了不可缺少的工具，可用于功能蛋白筛选、抗原抗体库建立、药物或疫苗筛选、病原检测或基因治疗靶标筛选等；同时本发明提供的抗丝状噬菌体pVIII 蛋白的单克隆抗体还具有较高的稳定性，单克隆抗体M5G8和P8E4的Tm值分别为65℃和67.53℃，在反复冻融和加速老化试验过程中均表现出较高的稳定性。

2、本发明提供的丝状噬菌体pVIII衣壳蛋白免疫原具有优异的免疫原性，能够有效促进获得高特异性和高效价的丝状噬菌体pVIII蛋白单克隆抗体。

附图说明

图1为本发明实施例1中多肽TC21的质谱鉴定结果图。

图2为本发明实施例1中多肽TC21的高效液相色谱图。

图3A为本发明实施例1中BSA的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法图。

图3B为本发明实施例1中BSA与多肽TC21偶联物的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法图。

图4为本发明实施例2中不同剂量的M13KO7辅助噬菌体作为免疫原的小鼠血清效价检测结果；其中，A为M13KO7辅助噬菌体的免疫剂量为1.0×10¹⁰pfu/只；B为M13KO7 辅助噬菌体的免疫剂量为5.0×10⁹pfu/只；C为M13KO7辅助噬菌体的免疫剂量为1.0×10⁹ pfu/只。

图5为本发明实施例2中KLH-TC21、BSA-TC21作为免疫原的小鼠血清效价检测结果；其中，A为KLH-TC21作为免疫原；B为BSA-TC21作为免疫原。

图6为本发明实施例2中第一组第3号小鼠融合细胞筛选的检测结果；其中，A为是用M13KO7辅助噬菌体进行包板的实验结果；B为是用BSA-CT21进行包板的实验结果。

图7为本发明实施例2中第四组第10号小鼠融合细胞筛选的检测结果；其中，A为是用M13KO7辅助噬菌体进行包板的实验结果；B为是用BSA-CT21进行包板的实验结果。

图8为本发明实施例4中腹水单克隆抗体效价检测结果。

图9为本发明实施例4中纯化后单克隆抗体效价检测结果。

图10为本发明实施例6中pH对单克隆抗体影响的圆二光谱图，其中，A为单克隆抗体M5G8，B为单克隆抗体P8E4。

图11为本发明实施例7中pH对单克隆抗体与M13KO7辅助噬菌体结合的影响。

图12为本发明实施例8中抗体的热稳定性试验结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中，M13KO7辅助噬菌体购自NEB公司，产品目录号为N0351S；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购自美国Sigma-Aldrich公司，产品目录号为F5881、F5506；羊抗兔IgG酶标抗体购自Jackson公司，产品目录号为111-035-003；96孔酶标板购自Costar公司，产品目录号为2592；酪蛋白、BSA、KLH、HAT、PEG购自Sigma-Aldrich公司；青霉素G钠盐、硫酸链霉素，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氯化钠(NaCl)、碳酸钠 (Na₂CO₃)、碳酸氢钠(NaHCO₃)、十二水磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)、二水磷酸二氢钠(NaH₂PO₄·2H₂O)、氯化钾(KCl)、蔗糖、浓硫酸等购自国药集团化学试剂有限公；Tween-20购自北京化学试剂公司；proclin 300购自美国Supelco公司。Balb/c 小鼠：购于北京维通利华试验动物技术有限公司；SP2/0骨髓瘤细胞：购自Sigma-Aldrich 公司，产品目录号为08060101。

以下实施例中如无特殊说明，所用的PBS缓冲液均为pH 7.4、0.01M的磷酸盐缓冲液；CB液均为0.05M，pH 9.6的碳酸盐缓冲液；PBST均为含有0.05％(体积百分含量)Tween-20的PBS缓冲液(pH 7.2)。

实施例1 免疫原的合成与鉴定

1、免疫原的制备

(1)针对pVIII蛋白的抗原表位均位于噬菌体衣壳外表面部分(其多肽序列均在N端，序列如SEQ ID NO.5所示：AEGDDPAKAAFDSLQASAT)设计合成丝状噬菌体pVIII 衣壳蛋白膜外的多肽部分Cys-Ahx-AEGDDPAKAAFDSLQASAT，将该多肽命名为 TC21；

(2)将上述合成的多肽与KLH、BSA载体蛋白分别进行偶联获得免疫原。

2、免疫原鉴定

用质谱法、高效液相色谱法鉴定步骤1中合成的多肽，鉴定结果分别如图1(质谱)和图2(高效液相色谱)所示，结果表明多肽合成成功。

用MALDI-TOF方法测定载体蛋白与多肽偶联情况，结果如图3A和图3B所示，结果表明，载体蛋白BSA与多肽偶联成功，偶联比为1:2。

实施例2 丝状噬菌体pVIII蛋白单克隆抗体的制备

(一)免疫动物

动物：Balb/c小鼠，筛选条件为：雌性，体重18-20g，年龄6-8周。

分别以实施例1制备的多肽TC21与载体蛋白的偶联物(多肽组)以及M13KO7辅助噬菌体(噬菌体组)作为免疫原免疫动物，共设置五组，每组免疫10只BALB/c小鼠，其中，M13KO7辅助噬菌体组的免疫分为3组不同剂量浓度(分别为第一组、第二组、第三组)，；多肽组的BSA-CT21、KLH-CT21免疫原分别以低剂量短周期分2组进行免疫(BSA-CT21为第四组、、KLH-CT21为第五组)。免疫前小鼠饲养一周，眼眶静脉丛采血、离心，取血清作为阴性对照。

免疫程序具体如下：

多肽组：将多肽TC21与载体蛋白的偶联物作为免疫原，免疫原浓度为1.0mg/mL，按1:1与弗氏完全佐剂乳化，Balb/c小鼠颈背部皮下注射100μg/只；21天后改用弗氏不完全佐剂乳化抗原，以相同的免疫剂量进行二免，每28天后以同样的方法加强免疫，共加强免疫3次。

噬菌体组：将M13KO7辅助噬菌作为免疫原，分别以1.0×10¹⁰pfu/只、5.0×10⁹pfu/只、1.0×10⁹pfu/只，按1:1与弗氏完全佐剂乳化，Balb/c小鼠颈背部皮下注射100μg/只；21天后改用弗氏不完全佐剂乳化抗原，以相同的免疫剂量进行二免，每28天后以同样的方法加强免疫，共加强免疫3次。

冲击免疫：筛选血清效价高的小鼠于脾脏细胞融合前3天进行冲击免疫，免疫剂量为加强免疫剂量的2倍，免疫原与PBS混合稀释至0.5mL。

(二)免疫小鼠抗血清筛选

通过检测血清效价对小鼠免疫效果进行监测，第2-4次免疫后第7天，小鼠眼眶下静脉丛采血约200μL，用掌上离心机对小鼠血清进行分离，采用间接ELISA检测免疫效果，以空白小鼠血清作为阴性对照，具体方法如下：

1、包被：用碳酸盐缓冲液(CB液)将包被原稀释成一系列浓度加至酶标板，微量移液器加样100μL/孔，37℃孵育2h或4℃孵育过夜；

2、洗涤：甩去孔内液体，用PBST洗涤溶液洗涤1遍，280μL/孔，甩板机甩干；

3、封闭：加入封闭液150μL/孔，37℃孵育1h，甩板机甩干；可放4℃备用；

4、加样：加入稀释成一系列浓度的待检血清，100μL/孔，37℃孵育30min；

5、洗板：甩去孔内液体，用PBST洗液洗3遍，280μL/孔，用甩板机甩干；

6、加酶：加入HRP-羊抗鼠IgG(1:5000倍稀释)100μL/孔，37℃孵育30min；

7、洗板：重复(5)

8、显色：将新配制的TMB溶液加入酶标板，100μL/孔，避光37℃显色15min；

9、终止：加入2mol/L H₂SO₄，50μL/孔；

10、测定：用酶标仪读取各孔OD₄₅₀(双波长：620nm为参考滤光片波长)。

采用方阵滴定法确定包被原、抗体的最适工作浓度，选择OD₄₅₀值在1.0左右为最适。

噬菌体组小鼠的血清效价筛选结果如图4所示，结果显示，第一组第3只小鼠效价最好，融合前效价高达2.05×10⁵，免疫效果比较稳定，选其进行细胞融合筛选。多肽组小鼠的血清效价筛选结果如图5所示，结果显示，第四组第10只小鼠免疫效果最好，融合前效价高达2.05×10⁵，选其进行细胞融合筛选。

(三)细胞融合与克隆

1、骨髓瘤细胞的复苏与培养

(1)将骨髓瘤细胞SP2/0从液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴中晃动至完全融化；

(2)在超净工作台中，将细胞悬液移至15mL的离心管中，加入10mL DMEM不完全培养基，1000rpm离心5min；

(3)弃去上清液，加4mL完全培养液重悬细胞，接种到6孔细胞培养板中，置于 37℃、5％CO₂培养箱中培养；

(4)待细胞长满孔底，至对数生长期的细胞传代培养；弃去原培养液，加入2mL 新培养液，用移液器将贴壁细胞轻轻吹下，平均分到2个孔中，补齐培养液至4mL；一般每隔2-3天传代一次；

对数生长期时细胞浑圆透亮、大小均一，此时细胞的形态、化学组成、生理性质均一，处于代谢旺盛、生长迅速、状态稳定的使其，与脾脏细胞融合最为有利。

2、饲养细胞的制备

在融合前一天制备饲养细胞，取空白BALB/c小鼠的脾细胞制备，具体方法如下：

(1)取BALB/c小鼠，脱颈椎法将其处死，75％酒精浸泡小鼠，消毒5min；

(2)将小鼠转移到超净工作台内，腹部朝上，用灭菌镊子提起小鼠腹部皮肤，用灭菌眼科剪剪开一个小口(切勿剪到腹膜)，然后向头、尾两个方向撕开皮肤，充分暴露腹膜。用灭菌镊子提起腹膜，用灭菌眼科剪剪开小口，充分暴露脾脏；

(3)取出脾脏，置于无菌培养皿中。加入10mLDMEM不完全培养液，用10mL 注射器反复冲洗脾脏，使脾细胞尽可能多的进入不完全培养液中；

(4)将脾细胞悬浮液转移至50mL离心管中，加入不完全培养基至30mL，以1000 rpm离心5分钟；

(5)弃上清，收集细胞即为饲养细胞，使用完全培养液重悬，平均每只小鼠的饲养细胞可以铺5块96孔细胞板，放到CO₂培养箱中，过夜培养；同时观察是否有污染，如果细胞培养液变浑浊，则饲养续保需重新制备。

3、细胞融合与培养

将免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合，得到能够分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，具体方法如下：

(1)收集冲击小鼠的脾脏细胞，试验方法同上述步骤2中饲养细胞的制备方法；

(2)将处于对数期生长骨髓瘤细胞轻轻吹起，生长覆盖面积约占孔底的80％～90％；

(3)将脾细胞与骨髓瘤细胞按照5:1～10:1混合于50mL离心管中，1000rpm离心10min；

(4)弃上清，将离心管倒置，用吸水纸将残留的液体吸干。敲击管底，使细胞松散呈糊状，置于37℃水浴中；

(5)沿管壁缓慢滴入800μL 37℃预热的50％PEG，左手迅速转动离心管，使PEG 充分混匀，1min内加完；然后将细胞悬浮液缓缓吸入移液管内，静置30s，再将其缓缓吹回到离心管中；

(6)在3min内，将30mL 37℃预热的DMEM不完全培养液加入到融合管中，并轻轻转动离心管，终止融合反应。加入速度为：第1min内加1mL，第2min内加4mL，第3min内将剩余的不完全培养液加完。800rpm离心7min；

(7)弃上清，用30mL HAT完全培养液重悬细胞，并转移到无菌培养皿中，加入 HAT培养液和含有2只小鼠饲养细胞的培养液，至总体积约为250mL；

(8)均匀接种于10块左右的96孔细胞培养板，每孔的培养基大约有250μL完全培养基，放到CO₂培养箱中培养；

(9)第二天观察细胞是否有污染的情况。若有污染，重做融合；若无污染，连续培养7-10天，观察细胞集落生长至1/8微孔板底，进行检测。

4、杂交瘤细胞筛选

(1)采用间接竞争ELISA方法筛选阳性克隆：将噬菌体组和多肽组融合的杂交瘤细胞上清以间接ELISA方法进行检测，分别采用M13KO7辅助噬菌体和BSA-TC21包被的酶标板进行交叉筛选，具体方法如下：

首先，通过方阵滴定法确定抗原最佳包被浓度包被酶标板；然后，取50μL细胞上清作为抗体样品加入酶标板，标号应与细胞版一一对应，阴性对照孔(SP2/0上清和阴性血清)OD₄₅₀小于0.2，阳性孔应显色明显。含有克隆细胞的孔吸光值与阴性孔吸光值比值大于2.1时，则可以判定为阳性克隆孔。选择杂交瘤细胞阳性值较高、克隆数目较少的细胞进行克隆，并转移至24孔细胞板中扩大培养，当亚克隆失败时可使用扩大孔细胞重复试验。

根据免疫小鼠血清筛选结果，取第一组3号小鼠、第四组10号小鼠，进行冲击免疫、脾细胞融合。通过方阵滴定法确定了抗原最佳包被浓度，M13KO7辅助噬菌体包被原，选择浓度为3.0×10⁸pfu/mL；BSA比KLH稳定性好，因此以BSA-TC21作为包被原，选择浓度为3μg/mL。分别用两种包被原包被的酶标板来检测细胞上清液，3号小鼠、10 号小鼠均选择对M13KO7辅助噬菌体和BSA-TC21识别较好的杂交瘤细胞进行亚克隆。

第一组第3号小鼠融合细胞以及第四组第10号小鼠融合细胞的筛选过程的检测结果分别如图6和图7所示。通过对图6所示的实验结果进行比对，3号小鼠融合的细胞筛选中，视G7、D2为阳性克隆。通过对图7的实验结果进行比对，10号小鼠融合的细胞筛选中，视D2、D3、D4为阳性克隆。

5、细胞亚克隆

(1)采用有限稀释法进行细胞亚克隆，根据克隆所需要的细胞板数，提前制备饲养细胞，方法同步骤2；

(2)将准备进行克隆的杂交瘤细胞从阳性孔中取出转移到24空培养板，悬浮于1mL完全培养基中，吹打均匀后，进行计数；

(3)根据计数结果，完全培养基将细胞稀释到10³/mL；用加有饲养细胞的培养液，按照2个/孔、1个/孔、0.5个/孔的浓度进行稀释，每个浓度铺32个细胞孔，每孔250μL。具体稀释方法为取80μL、40μL、20μL浓度为10³个/mL的细胞悬液置于10mL加有饲养细胞的培养液中；

(4)置于CO₂培养箱中培养7-10天，待细胞长至孔底1/8左右，采用间接ELISA进行检测细胞上清；

(5)选择效价高特异性好的单团细胞，按照上述方法连续克隆至阳性率为100％(含有细胞的培养孔)，可视为克隆成功；

(6)选择克隆成功的单团细胞孔，扩大培养定株；

(7)将定株的细胞一部分冻存，一部分用于制生产腹水，制备单克隆抗体。

6、杂交瘤细胞的冻存

收集对数生长期、细胞活力处于最好状态的杂交瘤细胞进行冻存，具体方法如下：将准备冻存的杂交瘤细胞吹散收集到15mL离心管中，1000rpm离心5min，弃上清。用冻存液将细胞数目调整冻存为106个/mL，混匀分装至冻存管每个冻存管1mL，标记好后将冻存管置于4℃冰箱中0.5h，然后移入-20℃冰箱0.5h后，转移到-70℃冰箱中过夜，最终移入液氮罐中保存。

经筛选，以多肽TC21与载体蛋白的偶联物作为免疫原和以M13KO7辅助噬菌体作为免疫原分别各获得1株杂交瘤细胞，分别命名为抗丝状噬菌体pVIII蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞M5G8和P8E4，相应分泌的单克隆抗体命名为M5G8和P8E4。

(四)单克隆抗体的大量制备

采用小鼠体内诱生的方法获得大量单克隆抗体。

1、选用健康的BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5mL的无菌石蜡。打石蜡后1～2个星期后可接种杂交瘤细胞。

2、收集对数期杂交瘤细胞，以1000rpm离心5min，弃掉上清液。

3、用DMEM将细胞重悬，将杂交瘤细胞浓度调整到10⁶个/mL，每只小鼠腹腔注射0.5mL的细胞悬液。

4、接种杂交瘤细胞7～12天，观察小鼠腹部，腹部明显膨大，即可用注射器抽取小鼠腹水，待腹部膨大后可再次抽取。

5、3000rpm离心腹水10min，收集上清，0.22μm滤器过滤上清，-20℃保存。

(五)单克隆抗体的纯化

利用Protein A亲和纯柱与抗体的Fc片段特异性结合，洗脱得到腹水中高纯度的IgG。

(六)单克隆抗体透析及浓度测量

纯化后的抗体需要用透析袋透析。Nano Drop微量分光光度计测量抗体IgG浓度，结果如表1所示。

表1抗体浓度检测

实施例3 单克隆抗体的亚型鉴定和测序

将实施例2制备得到的单克隆抗体M5G8和P8E4进行亚型鉴定，具体方法如下：

采用Pierce Rapid ELISAMouse mAb Isotyping Kit(Sigma公司产品，产品目录号为19285)鉴定抗体的亚型分类。检测单克隆抗体的亚型，单克隆抗体的免疫球蛋白亚类结果见表2。

表2抗体亚型鉴定

对单克隆抗体M5G8和P8E4进行序列测定，其中，单克隆抗体M5G8的重链可变区序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO.3所示；单克隆抗体P8E4的重链可变区序列如SEQ ID NO.2所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO.4所示。

实施例4 单克隆抗体的效价测定

采用间接ELISA方法检测实施例2获得的单克隆抗体M5G8和P8E4的效价，具体方法如下：根据方阵滴定试验结果，以1.0×10⁹pfu/mL的M13KO7辅助噬菌体作为包被原包被酶标板，将腹水抗体、纯化后的抗体(1.0mg/mL)稀释为不同浓度的样品进行检测。设阴性血清对照孔，当其吸光度接近1.0左右且阳性血清OD₄₅₀值大于或等于阴性血清OD₄₅₀值2.1倍时，以阳性血清稀释的倍数为效价。

腹水单克隆抗体效价如图8所示，M5G8效价在2.05×10⁵以上，P8E4效价在1.02×10⁵左右。纯化后单克隆抗体效价(1.0mg/mL)如图9所示，P8E4效价在6.4×10³以上，M5G8 效价在1.28×10⁴左右。

实施例5 单克隆抗体最佳工作浓度测定

采用间接ELISA试验方法、方阵滴定法确定M13KO7辅助噬菌体在不同浓度情况下的实施例2获得的单克隆抗体M5G8和P8E4的工作浓度。

将M13KO7辅助噬菌体稀释为1.0×10¹⁰pfu/mL、1.0×10⁹pfu/mL、1.0×10⁸pfu/mL、1.0×10⁷pfu/mL进行包被，将抗体稀释到不同浓度进行检测。结果如表3所示，结果显示，单克隆抗体的稀释浓度为1:100-1:10000。

表3单克隆抗体最佳工作浓度的选择

实施例6 pH对单克隆抗体构像的影响

通过圆二光谱测量实施例2获得的单克隆抗体M5G8和P8E4在不同pH值中的稳定性，分析抗体构像变化。具体步骤如下：

(1)配置pH为1-12的PBS缓冲液；

(2)将纯化后的抗体用不同pH值得PBS缓冲液稀释到0.2mg/mL得浓度，备用；

(3)设置光谱参数范围，选择200nm-280nm；

(4)测量仪器背景值。记录零吸收值，采集空气(氮气)的值，后面的紫外吸收值都是相对于空气背景值而言；

(5)测量样品体系背景值。选择合适的比色皿，装入pH 1-12的PBS缓冲液，测量溶液体系背景值，扫描2次。一系列试验要保持使用同一个比色皿；

(6)测量样品使用上一步骤中同一比色皿，放入样品槽中扫描3次；

结果见图10，结果表明，单克隆抗体M5G8、P8E4在pH值在4-11间抗体构像变化不大。

实施例7 pH对单克隆抗体与M13KO7辅助噬菌体结合的影响

根据纯化后单克隆抗体M5G8和P8E4的效价以及方阵滴定法选择M13KO7辅助噬菌体包被浓度为1.0×10⁹pfu/mL，将1mg/mL的单克隆抗体稀释3000倍，浓度约为0.3 μg/mL，采用间接ELISA进行如下检测：

用pH 1-12的PBS缓冲液对单克隆抗体M5G8和P8E4进行稀释，以抗体稀释溶液pH为横坐标，以OD₄₅₀值为纵坐标做折线图进行对比。

结果见图11，M13KO7辅助噬菌体在pH 3-11之间能够保持其活性。单克隆抗体M5G8在pH 4-12间OD₄₅₀值均能达到检测要求；单克隆抗体P8E4在pH 5-12之间OD₄₅₀值均能达到检测要求。

M13噬菌pVIII蛋白的等电点为pH 4.2，为防止在接近等电点时，抗原发生自凝，影响检测结果，结合实施例6的实验结果(单克隆抗体分别在pH 4-11之间构像基本不改变)，pH为12时可能为假阳性，推荐M5G8、P8E4使用溶液pH值为5-11。

实施例8 单克隆抗体热稳定性试验

采用UNCLE高通量多参数蛋白稳定仪测量针对M13KO7辅助噬菌体的单克隆抗体M5G8和P8E4的Tm值，具体步骤如下：

(1)选择两个浓度的单克隆抗体进行测量，浓度1.0μg/mL和2.0μg/mL左右，进行测量。在通过一个浓度的数据不能确定Tm时，可参考另一个浓度的数据进行判定；

(2)在UNcle软件中编辑样品信息，设置加样位置加样，Uni管中按照位置每管加样9μL；

(3)设置加样温度从20-100℃，升温速度1℃/min，测量5次；

(4)将样品管放置样品台，预览光谱，动态光散射信号(DLS Intensity)平稳后即可开始试验。

结果见图12，用软件进行分析，得到下列结果，M5G8的Tm值为65℃，P8E4的Tm 值为67.53℃。

实施例9 反复冻融试验对单克隆抗体活性的影响

反复冻融情况下抗体会发生变性，形成聚合物而影响抗体结合能力。通常情况下，高浓度抗体反复冻融影响不大。将单克隆抗体M5G8和P8E4以1.0mg/mL分装至6个PCR 管，每管10μL，分别标号1、2、3、4、5、6。标号为1的置于-20℃反复冻融一次，标号为2的反复冻融二次，以此类推，标号为6的反复冻融六次。选择M13KO7辅助噬菌体包被浓度为1.0×10⁹pfu/mL，将1.0mg/mL的单克隆抗体稀释3000倍进行试验。运通t 检验验证反复冻融的结果进行分析。

结果如表4和表5所示，通过统计结果分析，六次反复冻融后单克隆抗体仍能达到检测效果。

表4各次冻融检测结果

表5冻融试验结果统计学分析

实施例10 单克隆抗体加速老化试验

根据阿伦尼乌斯创立的化学反应速率常数随温度变化关系对单克隆抗体进行加速老化试验。

用0.22μm滤器对单克隆抗体进行过滤(除去细菌)，将单克隆抗体M5G8和P8E4 以1.0mg/mL分装PCR小管，每管10μL进行试验。将单克隆抗体置于37℃温箱7天相当于4℃保存一年，选择M13KO7辅助噬菌体包被浓度为1.0×10⁹pfu/mL，将1mg/mL的单克隆抗体稀释3000倍进行试验。

结果见表6，基本可以判定单克隆抗体可以在4℃保存至少一年。

表6单克隆抗体加速老化试验结果

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 丝状噬菌体pⅧ蛋白单克隆抗体及其应用

<130> KHP191115479.8

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 147

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gln Ser Leu Lys Thr Leu Thr Leu Ile Met Ala Cys Asn Trp Ile Leu

1 5 10 15

Pro Phe Ile Leu Ser Val Arg Ser Gly Val Tyr Ser Gln Ile Gln Leu

20 25 30

Gln Gln Ser Gly Ala Arg Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Arg Leu

35 40 45

Ser Cys Lys Ser Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Ser Trp Leu Gln Trp

50 55 60

Leu Lys Gln Arg Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr

65 70 75 80

Pro Gly Asn Gly Asp Thr Arg Tyr Phe Gly Asn Phe Lys Gly Gln Ala

85 90 95

Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser

100 105 110

Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Leu

115 120 125

Ala Thr Asp Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr

130 135 140

Val Ser Ser

145

<210> 2

<211> 147

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gln Ser Leu Lys Thr Leu Thr Leu Ile Met Glu Cys Asn Trp Ile Leu

1 5 10 15

Pro Phe Ile Leu Thr Val Thr Ser Gly Val Tyr Ser Gln Ile Gln Leu

20 25 30

Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Arg Leu

35 40 45

Ser Cys Lys Arg Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Trp Leu Gln Trp

50 55 60

Leu Lys Gln Arg Ala Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr

65 70 75 80

Pro Gly Asn Gly Asp Thr Arg Tyr Phe Pro Asn Phe Lys Gly Gln Ala

85 90 95

Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Ser Ser Thr Arg Tyr Leu Gln Leu Ser

100 105 110

Ser Leu Ala Ser Glu Ser Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Leu Leu

115 120 125

Arg Thr Asp Phe Ala Met Asp Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr

130 135 140

Val Ser Ser

145

<210> 3

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Ile Ala Thr Ile Ser Cys Arg Thr Ser Glu Ser Thr Asp Thr Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ser Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Arg Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Pro Asp Ala Thr Leu Ser Ile Asn

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ala

85 90 95

Lys Asp Pro Gly Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 4

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Glu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Thr Ser Glu Ser Val Asp Thr Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Trp Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Ala Glu Ser Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ala Gly Ser Gly Ser Arg Pro Asp Phe Thr Leu Ser Ile Arg

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asp

85 90 95

Lys Asp Pro Gly Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 5

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Ala Glu Gly Asp Asp Pro Ala Lys Ala Ala Phe Asp Ser Leu Gln Ala

1 5 10 15

Ser Ala Thr

Claims

1.丝状噬菌体pVIII蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区，能够特异性结合丝状噬菌体pVIII蛋白；所述重链可变区的氨基酸序列如SEQID NO.1所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.编码权利要求1所述单克隆抗体的核酸。

3.权利要求1所述单克隆抗体经生物标记或化学标记得到的标记复合物。

4.根据权利要求3所述的标记复合物，其特征在于，所述生物标记或化学标记为选自酶标记、生物素标记、荧光染料标记、化学发光染料标记、放射性标记中的一种或多种。

5.权利要求1所述单克隆抗体或权利要求2所述核酸权利要求3或4所述标记复合物在丝状噬菌体或丝状噬菌体抗体检测中的应用。

6.权利要求1所述单克隆抗体或权利要求2所述核酸或权利要求3或4所述标记复合物在丝状噬菌体展示技术中的应用。

7.权利要求1所述单克隆抗体或权利要求2所述核酸或权利要求3或4所述标记复合物在功能蛋白筛选、抗原抗体库建立或药物或疫苗筛选中的应用。

8.一种丝状噬菌体检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述单克隆抗体或权利要求3或4所述标记复合物。