CN116840475A - 夹心阻断elisa试剂在制备口蹄疫病毒抗体检测试剂盒中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及夹心阻断ELISA试剂在制备口蹄疫病毒抗体检测试剂盒中的应用，属于生物技术领域，本发明将阴阳性血清及被检血清直接在已包被捕获抗体的ELISA板上稀释后紧接着加入酶标抗体，最后加入病毒抗原，同时设置病毒抗原对照，被检血清及阴阳性血清中口蹄疫型特异抗体阻断病毒抗原参与酶标单抗与ELISA板上的捕获抗体的双抗夹心ELISA反应的进行，判定参照液相阻断ELISA，以病毒抗原对照孔OD值平均值的50%作为病毒抗原被50%阻断的临界值，成功建立阻断夹心ELISA方法，也称为液相阻断ELISA一步法，可用于定性、定量检测口蹄疫抗体，为口蹄疫疫苗免疫抗体监测、疫苗免疫效果评估等方面提供新的技术支持。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种用于检测口蹄疫病毒抗体的新方法（夹心阻断ELISA）。
背景技术
口蹄疫（Foot and Mouth Disease, FMD）是由口蹄疫病毒(Foot and MouthDisease Virus, FMDV)引起的猪、牛、羊等偶蹄动物易感的一种急性、热性、高度接触性传染病,被感染动物多以在口腔黏膜、蹄部和乳房皮肤发生水泡性疹为主要临床特征，该病传播途径多、速度快，每次爆发均会给当地的畜牧养殖业造成巨大经济损失。世界动物卫生组织（WOAH）将其列为必须申报的传染病，我国也将其列在一类动物传染病的首位。口蹄疫病毒在全世界主要有七个血清型:O、A、亚洲1、C型及南非1、2、3型，疫苗免疫不能使各型之间交叉保护。现阶段我国主要针对O型和A型口蹄疫病毒进行疫苗接种。
口蹄疫血清型特异性抗体检测是疫苗免疫效果评估及流行病学调查采用的主要血清学调查手段之一。液相阻断ELISA方法检测口蹄疫抗体是世界动物卫生组织指定的参考方法，传统液相阻断ELISA方法需要将被检血清与抗原预先在载体反应板上充分孵育作用后再移板至已包被捕获抗体的ELISA板内；抑制ELISA方法是兰州兽医研究所科研人员基于病毒中和试验基本原理建立的新方法,该方法将血清抗原直接在捕获抗体的ELISA板内反应,省去了抗原抗体预先孵育的步骤,缩短了操作时间；双抗体夹心ELISA方法是WOAH推荐的FMDV定型方法，血清型特异性单抗是该方法的关键试剂；基于单克隆抗体发展起来的抗体竞争ELISA方法,操作简便、省时,具有较高的特异性。口蹄疫疫苗免疫动物抗体检测是我国每年口蹄疫防疫程序中要求必检的内容。
目前，液相阻断ELISA方法是农业部指定口蹄疫免疫抗体检测方法，抑制ELISA方法作为传统液相阻断ELISA方法的升级版，已被全国各级兽医诊断实验室广泛采用，与口蹄疫病毒抗体单抗竞争ELISA方法相比，抑制ELISA方法仍然有进一步简化操作步骤、缩短操作时间的用户需求；基于单抗的口蹄疫病毒双抗体夹心ELISA定型方法具有敏感性好、型特异性高的优点，单抗竞争ELISA方法检测口蹄疫抗体的敏感性不如液相阻断ELISA方法，但由于其操作步骤简便、用时短，越来越多的被用于口蹄疫抗体的检测。
口蹄疫病毒包括完整病毒粒子（146S）、空衣壳(76S)、病毒感染相关肽(45S)、小分子蛋白（12S），146S抗原是口蹄疫疫苗中使动物肌体产生保护性抗体的主要免疫成分。纯化146S抗原免疫实验动物制备的多克隆抗体及鼠源骨髓瘤融合小鼠脾细胞筛选杂交瘤技术制备单克隆抗体常被用作试剂材料，是液相阻断ELISA、抑制ELISA、夹心ELISA、单抗竞争ELISA采用的技术方案。单克隆抗体是通过杂交瘤筛选出针对口蹄疫病毒主要免疫原VP1基因蛋白特异性反应的细胞株分泌的抗体。
如何对现有方法进行优化创新，是建立口蹄疫抗体检测新方法需要解决的一个关键问题。新方法应该具有液相阻断ELISA、抑制ELISA检测同样的敏感性、特异性和稳定性，具有单克隆抗体竞争ELISA一样的操作简便性，并且能最大限度的减少操作造成的试验失败。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能够检测口蹄疫抗体的新方法—夹心阻断ELISA方法，其基本原理是在已包被口蹄疫型特异抗体的ELISA板上将被检血清和阴阳性对照血清按一定的比例进行系列稀释后紧接着加入酶标抗体，最后加入稀释至工作浓度的口蹄疫灭活病毒抗原，设置至少4孔病毒抗原对照（对照孔内预先加等量的血清稀释液），最终反应体系为200ul/孔，经孵育洗涤后加入TMB底物，显色终止后OD450nm波长读取吸光值。被检血清或阴阳性对照血清中的抗体阻断病毒抗原参与夹心反应的进行，以病毒抗原对照4孔的平均值的50%作为病毒抗原被50%阻断的临界值，结果判定与液相阻断ELISA方法基本一致。本发明将这种ELISA检测技术命名为夹心阻断ELISA方法，也可称为液相阻断ELISA一步法。
与液相阻断ELISA、抑制ELISA测定血清抗体的相同点：两种方法所用的关键试剂（兔抗口蹄疫病毒血清、病毒抗原）相同。
与液相阻断ELISA、抑制ELISA测定血清抗体的区别：液相阻断ELISA方法测定抗体需要将抗原、抗体预先在反应板上充分作用后再转移至ELISA板上，操作时间需要2天；抑制ELISA方法需要将被检血清直接在ELISA板上稀释后加入病毒抗原，反应时间上抑制ELISA方法完整操作过程可以在2小时内完成；夹心阻断ELISA方法，被检血清、阴阳性对照血清、酶标抗体、病毒抗原均在一步反应内完成，用时30分钟。
本发明在国内外率先突破了液相阻断ELISA、抑制ELISA、单抗竞争ELISA及双抗夹心ELISA方法的利用，首次实现了液相阻断ELISA方法复杂的操作步骤简化为一步完成，检测敏感性与液相阻断ELISA一致，提高了检测特异性，是口蹄疫抗体检测更为理想、适用的ELISA方法。
为了达到该目的，本发明所采取的技术方案步骤如下：
1． 通过利用破乳的方法对口蹄疫灭活疫苗破乳后得到口蹄疫病毒抗原，作为抗血清制备抗原和检测用到的病毒抗原；
2．口蹄疫病毒146S抗原纯化（蔗糖密度梯度离心法） ；
3．兔抗口蹄疫病毒血清、豚鼠抗口蹄疫病毒血清、阴阳性参考血清制备；
4．Balb/c小鼠免疫、杂交瘤细胞制备、单克隆抗体细胞株筛选、腹水制备；
5．阳性对照血清抗体效价测定（液相阻断ELISA方法）；
6．单抗腹水制备、测定、IgG抗体纯化及HRP标记；
7．操作步骤优化；
8．结果判定；
9．敏感性和特异性分析；
10．与液相阻断ELISA方法符合性（敏感性、特异性）。
具体的，本发明为一种用于检测口蹄疫病毒抗体的夹心阻断ELISA方法，其特征在于通过在已包被口蹄疫型特异抗体的ELISA板上将被检血清及阴阳性对照血清按要求稀释后加入酶标抗体，每板设置4孔不加血清对照（对照孔预先加等量的血清稀释液），最后加入稀释至工作浓度的病毒抗原，最终反应体系为200ul/孔。被检血清及阴阳性血清中的口蹄疫型特异抗体阻断病毒抗原参与夹心反应的进行。以4孔不加血清对照OD值平均值的50%表示病毒抗原被阻断50%的临界值，如果该临界值处于某份被检血清某相邻两个稀释度OD值之间，则该份血清的抗体效价取该相邻两个稀释滴度的中间值，与液相阻断ELISA方法的判定方法一致。
在本发明所述的方法中，优选的，所述的口蹄疫病毒抗原为血清型特异的口蹄疫病毒抗原，可以是口蹄疫病毒灭活得到的，也可以是经口蹄疫灭活疫苗破乳后得到的。优选的，所属的酶标抗体，可以是1株及以上单克隆抗体标记HRP后混合使用，也可以是146S抗原免疫制备多克隆抗体标记HRP后使用。
优选的，本发明所述的方法，具体的包括以下步骤：
（1）口蹄疫灭活疫苗破乳获得口蹄疫型特异病毒抗原；
（2）口蹄疫病毒146S抗原纯化；
（3）兔抗口蹄疫病毒血清、豚鼠抗口蹄疫病毒血清及阴阳性参考血清制备；
（4）豚鼠抗口蹄疫病毒血清IgG纯化、型特异性单克隆抗体制备及HPR标记；
（5）标准阳性血清抗体效价测定（液相阻断ELISA）；
（6）兔抗血清、酶标抗体及病毒抗原浓度的确定；
（7）操作步骤的优化；
（8）结果判定。
a、包被ELISA板
用pH值9.6 0.05M碳酸盐缓冲液将血清型特异的兔抗FMDV 血清稀释并包被ELISA板，100µl/孔，室温过夜，PBST洗板5次，干燥处理后真空包装，4℃保存。
b、血清稀释
在已包被兔抗口蹄疫病毒血清的ELISA板上按每孔50µl量加入血清稀释液，将阴阳性对照血清及被检血清按要求在ELISA板内进行2倍连续稀释。每块反应板均设置至少4孔不加血清对照（预先加入50µl的血清稀释液），ELISA反应板内体系均为50µl/孔。
c、加酶标抗体
在血清样品稀释后紧接着加入酶标抗体，50ul/孔，反应体系变为100ul/孔。
d、加病毒抗原
最后加入稀释至工作浓度的病毒抗原，每孔100µl，最终反应体系为200ul/孔。封板，震荡， 37℃孵育30分钟。
e、底物及终止反应
用1倍PBST洗板3~5次，加入TMB底物溶液，单组分为50µl/孔或双组分AB液各50ul/孔，37℃孵育10分钟后再每孔加入50µl的2MH2SO4终止反应，酶标仪450nm波长下读取吸光值。
F、结果判定
以病毒抗原对照4孔OD值平均值的50%作为病毒抗原被阻断50%的临界值，将阴阳性对照血清和被检血清相应孔的OD值与临界值相比较，某份血清抗体效价即为该份血清稀释孔OD值略高于临界值与略低于临界值孔（相邻两孔）对应的抗体滴度的平均值。抗体效价≥64判为口蹄疫抗体阳性。
在本发明所述的方法中，标准阳性血清的抗体效价由兰州兽医研究所生产的液相阻断ELISA试剂盒测定。
在本发明以上任一项所述的方法，所述的FMDV抗原包括O型FMDV抗原及A型FMDV抗原。
本发明利用将阴阳性血清及被检血清直接在已包被捕获抗体的ELISA板上稀释后紧接着加入等量的酶标抗体，最后加入又等体积的稀释至工作浓度的病毒抗原，同时设置至少4孔病毒抗原对照（预先加入等体积的血清稀释液），被检血清及阴阳性血清中口蹄疫型特异抗体阻断病毒抗原参与酶标单抗与ELISA板上的捕获抗体的双抗夹心ELISA反应的进行，判定参照液相阻断ELISA方法，以病毒抗原对照孔OD值平均值的50%作为病毒抗原被50%阻断的临界值，成功地建立起了阻断夹心ELISA方法，也成为液相阻断ELISA一步法，可用于定性、定量检测口蹄疫抗体。
有益效果：本发明创造性的解决了传统液相阻断ELISA方法繁琐步骤简化的难题，解决了被检血清、捕获抗体、酶标抗体同时与病毒抗原感作的难题，解决了从口蹄疫灭活疫苗破乳得到检测用病毒抗原的方法，解决了试验操作过程中各种试剂需要临时配制、操作繁琐、不稳定、费时的难题。因此，本发明成功的建立了与传统液相阻断ELISA方法相比较，在检测口蹄疫抗体时操作更为简便、省时、稳定的夹心阻断ELISA方法，即液相阻断ELISA一步法，为口蹄疫免疫抗体监测、疫苗免疫效果评估、流行病学调查、免疫指导等提供了新的技术支持。
具体实施方式
本发明综合分析了口蹄疫血清抗体检测的液相阻断ELISA方法、单抗竞争ELISA方法、双抗夹心ELISA方法。液相阻断ELISA方法测定抗体需要被检血清和抗原首先在液相中发生充分中和反应后再移至已包被兔抗口蹄疫病毒血清作为捕获抗体的酶标板上；抑制ELISA方法将血清直接在ELISA板上稀释，紧接着加入工作浓度的抗原，随后还有检测抗体孵育、酶标抗体孵育等步骤。单抗竞争ELISA方法是将血清稀释后加入酶标记的竞争抗体，30分钟孵育后就可以显色。笔者从中得到启发，首先将兔抗口蹄疫病毒血清包被在ELISA板上，在ELISA板上直接将被检血清、阴阳性对照血清按要求作系列稀释（50ul/孔），紧接着加入酶标记的检测抗体（1种及以上单克隆抗体，50ul/孔），最后加入稀释至工作浓度的口蹄疫病毒抗原（100ul/孔），最终反应体系为200ul/孔，37℃孵育30分钟，TMB底物显色10分钟，终止反应后OD450nm读取吸光值。在ELISA反应体系中，酶标单抗与已包被在ELISA板内的多克隆抗体形成双抗夹心法结合反应体系中的抗原，样品血清及阴阳性血清中的口蹄疫抗体阻断反应体系中的抗原参与夹心法的进行，样品中的抗体水平与抗原阻断率成正比。基于此原理，本发明成功建立了一种检测口蹄疫抗体的新技术，本发明将这种ELISA方法命名为口蹄疫病毒抗体检测夹心阻断ELISA方法，也可称为口蹄疫病毒抗体检测液相阻断ELISA一步法。
作为口蹄疫抗体检测的夹心阻断ELISA 方法，它继承了液相阻断ELISA、抑制ELISA方法用于测定血清抗体时可定性、定量、稳定、敏感、特异、可批量检测等方面的所有优点，是在传统液相阻断ELISA方法、抑制ELISA方法基础上的进一步创新，极大的简化了操作步骤并缩短了反应时间；与单抗竞争ELISA方法一样简便、省时，全部操作可在1小时内完成，试验中除抗原之外所用到的其他关键试剂均以工作液的形式提供，减少了操作人员自行配制的步骤，极大的降低了试验操作过程中的人为失误。利用该项技术发明笔者已经初步建立起口蹄疫O型和A型抗体检测的夹心阻断ELISA方法。
因此，本发明建立的口蹄疫病毒抗体夹心阻断ELISA方法为口蹄疫疫苗免疫抗体监测、疫苗免疫效果评估、流行病学调查、免疫指导等方面提供了新的技术支持。
下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。
实施例1利用夹心阻断ELISA测定O型口蹄疫抗体方法的建立和应用
1材料和方法
1.1口蹄疫病毒抗原、抗血清制备
1.1.1 FMDV抗原制备及146S抗原纯化：将口蹄疫灭活疫苗（O/Mya98株）与破乳剂按一定比例混合，震荡分层后经3000rpm，4℃，离心10分钟，小心吸取下层抗原液。取100ml抗原液，45000rmp, 4℃超速离心1h，将离心管底壁的沉淀用pH值7.6PBS重悬至2ml，经蔗糖密度梯度（45%、35%、25%、15%）35000rpm,4℃离心2.5小时，按0.5ml取样并合并同一级峰，并经260nm紫外分光光度仪检测，收集含口蹄疫完整病毒粒子146S抗原的吸收峰（第二峰）合并。
1.1.2 O型兔抗口蹄疫病毒血清：选取健康2.0kg左右的健康兔子，将纯化的146S抗原与等量的佐剂乳化后免疫兔子，于第30天颈部动脉放血并分离血清，分装，贴签，-70℃冻存。
1.1.3 O型豚鼠抗口蹄疫病毒血清：以与兔抗血清同源的FMDV纯化的146S抗原免疫豚鼠，第30天心脏采血并分离血清，分装，贴签，-70℃冻存。
1.1.4O型鼠源单克隆抗体制备
1.1.4.1Balb/c小鼠免疫：以与兔抗血清同源的FMDV纯化的146S抗原免疫8周龄Balb/c小鼠，5ug/只，间隔15天，共免疫4次，与杂交瘤细胞SP20融合前3天用抗原作腹腔冲击。
1.1.4.2融合：前一天用小鼠腹腔冲洗液DMEM（含HAT）铺饲养层，3板/只。用无抗、无血清DMEM培养基分离小鼠脾细胞，将小鼠脾脏冲洗、研磨、离心、淘洗，脾细胞计数约1.0*10^8个活细胞；脾细胞与SP20细胞数量之比为5:1，混合后的脾细胞与SP20细胞离心后轻轻拍起，至于37℃水浴内，，1min加1ml PEG，边加边转动离心管，加完后盖上离心管，静置1～2min。加DMEM终止。第1min滴加1ml DMEM，第2min滴加1ml DMEM，第3min滴加3ml DMEM，第4min滴加10ml DMEM，第5min滴加10ml DMEM。5min内共加入25ml DMEM，贴壁滴加，加完盖好离心管，静置2min，轻颠倒2次，37℃静置7分钟，离心后用含有1%双抗、20%肽牛血清及HAT培养基的DMEM将融合后的细胞悬起，加入铺有饲养层的96孔细胞培养板内，100ul/孔, 37℃CO2培养箱培养。
1.1.4.3检测：融合后一周用间接ELISA方法检测，选取OD值大于1.0,与口蹄疫O型全病毒抗原、VP1结构蛋白抗原反应的阳性孔，且与口蹄疫A型全病毒抗原及其VP1结构蛋白抗原反应呈阴性，准备进行亚克隆筛选。
1.1.4.4亚克隆筛选：筛选前一天在96孔细胞培养板内铺饲养层（含有HT培养基），将选取待亚克隆筛选的阳性孔内细胞充分悬起并计数，按照0.5-0.8个细胞/孔进行稀释，加之铺有饲养层的96孔细胞培养板，100ul/孔。37℃静置培养5天后开始标记单克隆孔，当单克隆细胞群落长满70%板孔时进行检测，检测方法为间接ELISA及阻断ELISA方法，选取间接ELISA方法检测OD值大于1.0,与口蹄疫O型全病毒抗原、VP1结构蛋白抗原反应的阳性孔，且与口蹄疫A型全病毒抗原及其VP1结构蛋白抗原反应呈阴性，继续进行阻断ELISA方法检测，选取口蹄疫O型特异阳性参考血清反应敏感性与液相阻断ELISA检测一致，与口蹄疫A型特异性参考血清检测为阴性的孔，准备进行扩大培养。
1.1.4.5单克隆抗体腹水制备：将选定的目的单克隆杂交瘤细胞株扩大培养，液氮冻存，同时用于腹水制备，将8周龄Balb/c雌性小鼠，腹腔预先注射0.2ml的弗氏不完全佐剂，3天后注射杂交瘤细胞，细胞数为50-200万个细胞/只，约接种7天左右观察小鼠腹部状态，当腹部鼓起，腹水充盈时抽取腹水。
1.1.5酶标抗体：单克隆抗体腹水IgG纯化及豚鼠抗口蹄疫血清IgG纯化，均用改良的高碘酸钠法进行HRPb标记；加50%甘油分装后-20冻存备用。
1.1.6 O型口蹄疫抗体阳性血清：由与兔抗血清同源的口蹄疫灭活疫苗免疫牛制备的高免血清，首次免疫后第30天加强免疫一次，二免后2周采血并分离血清，分装，贴签，-70℃冻存。
1.1.7口蹄疫抗体阴性血清：为购买口蹄疫抗体阴性的新生牛血清。
1.2方法
2.1 O型口蹄疫抗体阳性血清效价测定
用口蹄疫O型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒（兰州兽医研究所）测定。
2.2试剂工作浓度的确定
兔抗口蹄疫病毒血清、酶标抗体，以阳性血清抗体效价为参照，依次确定各试剂的工作浓度。
2.3抗原工作浓度的确定
设置O型阳性血清对照、A型高免血清对照，阳性对照抗体效价与已知相符合，测定A型高免血清抗体效价不大于32，选择合适的病毒抗原的稀释滴度。
2.4 操作步骤优化
2.4.1血清稀释及酶标抗体、抗原一步反应
在已包被O型口蹄疫病毒兔抗血清的ELISA板上，按每孔50µl量加入样品稀释液，将阴性、阳性对照血清及被检血清按要求进行2倍连续稀释，紧接着加入50ul/孔的酶标抗体，最后加入稀释至工作浓度的O型口蹄疫病毒抗原，每孔100µl，每块反应板均设置至少4孔病毒抗原对照（预先加入50µl的样品稀释液），最终ELISA反应板内液体量均为200µl/孔，封板膜封板，震荡， 37℃孵育30分钟。
2.4.2底物及终止反应
用1倍PBST洗板3~5次，加入单组分TMB底物溶液，50µl/孔，或双组分TMB AB液，各50µl/孔，37℃孵育10分钟后再每孔加入50µl的2MH2SO4终止反应，酶标仪450nm波长下读取吸光值。
2.4.3结果判定
以病毒抗原对照4孔OD值平均值的50%作为病毒抗原被阻断50%的临界值，将阴、阳性对照血清和被检血清相应孔的OD值与临界值相比较，某份血清抗体效价即为该份血清稀释孔OD值略高于临界值与略低于临界值孔（相邻两孔）对应的抗体滴度的平均值。抗体效价≥64判为O型口蹄疫抗体阳性，＜32判为O型口蹄疫抗体阴性，32~64之间判为可疑。
2.5与液相阻断ELISA方法的符合性（敏感性和特异性）
O型口蹄疫灭活疫苗免疫动物血清30份（牛10份，羊10份，猪10份），A型口蹄疫灭活疫苗免疫牛血清30份，口蹄疫抗体阴性动物30份（牛15份，猪15份）。与液相阻断ELISA方法作平行检测。
2.6重复性
30份口蹄疫O型灭活疫苗免疫动物血清利用夹心阻断ELISA方法重复测定3次。
3结果
3.1 O型口蹄疫阳性血清抗体效价测定结果
O型口蹄疫阳性血清经液相阻断ELISA方法检测确定为720（512~1024），作为夹心阻断ELISA的阳性对照血清，其抗体效价同样控制在720（512~1024）。
3.2抗血清工作浓度测定结果
经液相阻断ELISA方法测定，O型兔抗血清的工作浓度为1：1000，酶标抗体的工作浓度为1：5000。O型兔抗血清以工作浓度包被ELISA板，4℃保存；酶标抗体稀释至工作浓度，4℃保存。
3.3病毒抗原浓度测定结果
病毒抗原对照4孔的OD值应不小于1.0，阳性血清的抗体效价为720，与其A型口蹄疫高免血清的交叉反应均不大于32。若病毒抗原的工作浓度过高，则阳性血清的抗体效价会减小，敏感性降低；若病毒抗原的工作浓度过低，则阳性血清的抗体效价会升高，与其它型高免血清的交叉反应增大，特异性降低。
3.4操作步骤的优化结果
以满足抗原、酶标抗体、血清能充分反应为原则，血清、酶标抗体、抗原在ELISA板上反应的时间为37℃30分钟；满足抗原对照OD值应不小于1.0 之间为原则， TMB底物显色反应为10分钟。
3.5与液相阻断ELISA方法的符合结果（敏感性和特异性）
兰州兽医研究所生产的口蹄疫O型液相阻断ELISA方法抗体检测试剂盒，抗体效价≥128判为O型口蹄疫抗体阳性；夹心阻断ELISA方法，抗体效价≥64判为O型口蹄疫抗体阳性。30份口蹄疫抗体阴性动物和30份O型口蹄疫灭活疫苗免疫动物的血清抗体效价测定：夹心阻断ELISA方法与液相阻断ELISA方法测定的抗体效价的差异均在1个滴度以内，敏感性符合率为100%；30份A型灭活疫苗免疫动物（A型抗体效价均＞1024），液相阻断ELISA方法的假阳性检出率为10%，夹心阻断ELISA方法的假阳性检出率为1%，即检测特异性方面夹心阻断ELISA方法比液相阻断ELISA高。
3.6重复性
对30份O型口蹄疫灭活疫苗经抑制ELISA方法重复检测3次，抗体效价完全一致的为26份，相差一个滴度内的为3份，相差超过1个滴度为1份，说明本方法重复性很好。
4结论
4.1本研究建立的测定O型口蹄疫免疫抗体的夹心阻断ELISA方法，与液相阻断ELISA具有很好的符合性；敏感性一致的情况下，提高了检测特异性。夹心阻断ELISA方法，抗体效价≥64判为O型口蹄疫抗体阳性，与口蹄疫免疫抗体监测规定的免疫合格判定相一致。
4.2夹心阻断ELISA方法测定O型口蹄疫抗体，完整操作用时小于1个小时，与液相阻断ELISA方法抗原、抗体反应需要过夜，在不过夜的情况下也需要5个小时以上相比，极大提高了检测速度。
4.3夹心阻断ELISA方法检测O型口蹄疫抗体在开发试剂盒的过程中，兔抗口蹄疫病毒血清已经预先包被在ELISA板上，酶标抗体以工作液的形式提供，待检血清、酶标抗体、病毒抗原在一个反应体系内一步完成，减少了使用者在操作过程中因为试剂配制和步骤繁琐造成的操作失误和试验失败。该试剂盒的操作将传统液相阻断ELISA试剂盒的繁琐操作简化到极致。
4.4经口蹄疫灭活疫苗破乳获得检测用抗原，扩大了口蹄疫病毒抗原的来源，并保证了口蹄疫病毒抗原是安全的。少量口蹄疫病毒抗原通过连续超速离心再经蔗糖密度梯度离心纯化的方式，减少了病毒抗原预浓缩造成的抗原损失，解决了在有限抗原量的情况下纯化制备抗血清的难题。
4.5本研究为测定O型口蹄疫免疫抗体检测提供了快速、敏感、特异、稳定的检测新技术。
实施例2利用夹心阻断ELISA测定A型口蹄疫抗体方法的建立和应用
1材料和方法
1.1口蹄疫病毒抗原、抗血清制备
1.1.1 FMDV抗原制备及146S抗原纯化：将口蹄疫灭活疫苗（AF72株）与破乳剂按一定比例混合，震荡分层后经3000rpm，4℃，离心10分钟，小心吸取下层抗原液。取100ml抗原液，45000rmp, 4℃超速离心1h，将离心管底壁的沉淀用pH值7.6PBS重悬至4ml，经蔗糖密度梯度（45%、35%、25%、15%）35000rpm离心2.5小时，按0.5ml取样并合并同一级峰，并经260nm紫外分光光度仪检测，收集含口蹄疫完整病毒粒子146S抗原的吸收峰（第二峰）合并。
1.1.2 A型兔抗口蹄疫病毒血清：选取健康2.0kg左右的健康兔子，将纯化的146S抗原与等量的佐剂乳化后免疫兔子，于第30天颈部动脉放血并分离血清，分装，贴签，-70℃冻存。
1.1.3 A型豚鼠抗口蹄疫病毒血清：以与兔抗血清同源的FMDV纯化的146S抗原免疫豚鼠，第30天心脏采血并分离血清，分装，贴签，-70℃冻存。
1.1.4 A型鼠源单克隆抗体制备
1.1.4.1Balb/c小鼠免疫：以与兔抗血清同源的FMDV纯化的146S抗原免疫8周龄Balb/c小鼠，5ug/只，间隔15天，共免疫4次，与杂交瘤细胞SP20融合前3天用抗原作腹腔冲击。
1.1.4.2融合：前一天用小鼠腹腔冲洗液DMEM（含HAT）铺饲养层，3板/只。用无抗、无血清DMEM培养基分离小鼠脾细胞，将小鼠脾脏冲洗、研磨、离心、淘洗，脾细胞计数约1.0*10^8个活细胞；脾细胞与SP20细胞数量之比为5:1，混合后的脾细胞与SP20细胞离心后轻轻拍起，至于37℃水浴内，，1min加1ml PEG，边加边转动离心管，加完后盖上离心管，静置1～2min。加DMEM终止。第1min滴加1ml DMEM，第2min滴加1ml DMEM，第3min滴加3ml DMEM，第4min滴加10ml DMEM，第5min滴加10ml DMEM。5min内共加入25ml DMEM，贴壁滴加，加完盖好离心管，静置2min，轻颠倒2次，37℃静置7分钟，离心后用含有1%双抗、20%肽牛血清及HAT培养基的DMEM将融合后的细胞悬起，加入铺有饲养层的96孔细胞培养板内，100ul/孔, 37℃CO2培养箱培养。
1.1.4.3检测：融合后一周用间接ELISA方法检测，选取OD值大于1.0,与口蹄疫A型全病毒抗原、VP1结构蛋白抗原反应的阳性孔，且与口蹄疫O型全病毒抗原及其VP1结构蛋白抗原反应呈阴性，准备进行亚克隆筛选。
1.1.4.4亚克隆筛选：筛选前一天在96孔细胞培养板内铺饲养层（含有HT培养基），将选取待亚克隆筛选的阳性孔内细胞充分悬起并计数，按照0.5-0.8个细胞/孔进行稀释，加之铺有饲养层的96孔细胞培养板，100ul/孔。37℃静置培养5天后开始标记单克隆孔，当单克隆细胞群落长满70%板孔时进行检测，检测方法为间接ELISA及阻断ELISA方法，选取间接ELISA方法检测OD值大于1.0,与口蹄疫A型全病毒抗原、VP1结构蛋白抗原反应的阳性孔，且与口蹄疫O型全病毒抗原及其VP1结构蛋白抗原反应呈阴性，继续进行阻断ELISA方法检测，选取口蹄疫A型特异阳性参考血清反应敏感性与液相阻断ELISA检测一致，与口蹄疫O型特异性参考血清检测为阴性的孔，准备进行扩大培养。
1.1.4.5单克隆抗体腹水制备：将选定的目的单克隆杂交瘤细胞株扩大培养，液氮冻存，同时用于腹水制备，将8周龄Balb/c雌性小鼠，腹腔预先注射0.2ml的弗氏不完全佐剂，3天后注射杂交瘤细胞，细胞数为50-200万个细胞/只，约接种7天左右观察小鼠腹部状态，当腹部鼓起，腹水充盈时抽取腹水。
1.1.5酶标抗体：单克隆抗体腹水IgG纯化及豚鼠抗口蹄疫血清IgG纯化，均用改良的高碘酸钠法进行HRPb标记；加50%甘油分装后-20冻存备用。
1.1.6 A型口蹄疫抗体阳性血清：由与兔抗血清同源的口蹄疫灭活疫苗免疫牛制备的高免血清，首次免疫后第30天加强免疫一次，二免后2周采血并分离血清，分装，贴签，-70℃冻存。
1.1.7口蹄疫抗体阴性血清：为购买口蹄疫抗体阴性的新生牛血清。
2方法
2.1 A型口蹄疫抗体阳性血清效价测定
用口蹄疫A型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒（兰州兽医研究所）测定。
2.2抗血清工作浓度的确定
兔抗口蹄疫病毒血清、豚鼠抗口蹄疫病毒血清、酶标抗体，以阳性血清抗体效价为参照，依次确定各试剂的工作浓度。
2.3抗原工作浓度的确定
设置A型阳性血清对照、O型及亚洲1型高免血清对照，阳性对照抗体效价与已知相符合，测定O型和亚洲1型高免血清抗体效价不大于64，选择合适的病毒抗原的稀释滴度。
2.4 操作步骤优化
2.4.1血清稀释及酶标抗体、抗原一步反应
在已包被A型口蹄疫病毒兔抗血清的ELISA板上，按每孔50µl量加入样品稀释液，将阴性、阳性对照血清及被检血清按要求进行2倍连续稀释，紧接着加入50ul/孔的酶标抗体，最后加入稀释至工作浓度的A型口蹄疫病毒抗原，每孔100µl，每块反应板均设置至少4孔病毒抗原对照（预先加入50µl的样品稀释液），最终ELISA反应板内液体量均为200µl/孔，封板膜封板，震荡， 37℃孵育30分钟。
2.4.2底物及终止反应
用1倍PBST洗板3~5次，加入单组分TMB底物溶液，50µl/孔，或双组分TMB AB液各50µl/孔，37℃孵育10分钟后再每孔加入50µl的2MH2SO4终止反应，酶标仪450nm波长下读取吸光值。
2.4.3结果判定
以病毒抗原对照4孔OD值平均值的50%作为病毒抗原被抑制50%的临界值，将阴、阳性对照血清和被检血清相应孔的OD值与临界值相比较，某份血清抗体效价即为该份血清稀释孔OD值略高于临界值与略低于临界值孔（相邻两孔）对应的抗体滴度的平均值。抗体效价＞90判为A型口蹄疫抗体阳性，≤32判为A型口蹄疫抗体阴性，32~64之间判为可疑。
2.5与液相阻断ELISA方法的符合性（敏感性和特异性）
A型口蹄疫灭活疫苗免疫动物血清30份（牛10份，羊10份，猪10份），亚洲1型口蹄疫灭活疫苗免疫牛血清30份，O型口蹄疫灭活疫苗免疫牛血清30份，口蹄疫抗体阴性动物30份（牛15份，猪15份）。与液相阻断ELISA方法作平行检测。
2.6重复性
30份口蹄疫A型灭活疫苗免疫动物血清利用抑制ELISA方法重复测定3次。
3结果
3.1 A型口蹄疫阳性血清抗体效价测定结果
A型口蹄疫阳性血清经液相阻断ELISA方法检测确定为720（512~1024），作为夹心阻断ELISA的阳性对照血清，其抗体效价同样控制在720（512~1024）。
3.2抗血清工作浓度测定结果经液相阻断ELISA方法测定，A型兔抗血清的工作浓度为1：1000，酶标抗体的工作浓度为1：5000。A型兔抗血清以工作浓度包被ELISA板，4℃保存；酶标抗体稀释至工作浓度，4℃保存。
3.3病毒抗原浓度测定结果
病毒抗原对照4孔的OD值应不小于1.0，阳性血清的抗体效价为720，与其O型口蹄疫高免血清的交叉反应均不大于32。若病毒抗原的工作浓度过高，则阳性血清的抗体效价会减小，敏感性降低；若病毒抗原的工作浓度过低，则阳性血清的抗体效价会升高，与其它型高免血清的交叉反应增大，特异性降低。
3.4操作步骤的优化结果
以满足抗原、酶标抗体、血清能充分反应为原则，血清、酶标抗体、抗原在ELISA板上反应的时间为37℃30分钟；满足抗原对照OD值应不小于1.0 之间为原则， TMB底物显色反应为10分钟。
3.5与液相阻断ELISA方法的符合结果（敏感性和特异性）
兰州兽医研究所生产的口蹄疫A型液相阻断ELISA方法抗体检测试剂盒，抗体效价≥128判为A型口蹄疫抗体阳性；夹心阻断ELISA方法，抗体效价≥64判为A型口蹄疫抗体阳性。30份口蹄疫抗体阴性动物和30份A型口蹄疫灭活疫苗免疫动物的血清抗体效价测定：夹心阻断ELISA方法与液相阻断ELISA方法测定的抗体效价的差异均在1个滴度以内，敏感性符合率为100%；30份O型灭活疫苗免疫动物（O型抗体效价均＞1024），液相阻断ELISA方法的假阳性检出率为10%，夹心阻断ELISA方法的假阳性检出率为1%，即检测特异性方面夹心阻断ELISA方法比液相阻断ELISA高。
3.6重复性
对30份A型口蹄疫灭活疫苗经抑制ELISA方法重复检测3次，抗体效价完全一致的为26份，相差一个滴度内的为3份，相差超过1个滴度为1份，说明本方法重复性很好。
4结论
4.1本研究建立的测定A型口蹄疫免疫抗体的夹心阻断ELISA方法，与液相阻断ELISA具有很好的符合性；敏感性一致的情况下，提高了检测特异性。夹心阻断ELISA方法，抗体效价≥64判为A型口蹄疫抗体阳性，与口蹄疫免疫抗体监测规定的免疫合格判定相一致。
4.2夹心阻断ELISA方法测定A型口蹄疫抗体，完整操作用时小于1个小时，与液相阻断ELISA方法抗原、抗体反应需要过夜，在不过夜的情况下也需要5个小时以上相比，极大提高了检测速度。
4.3夹心阻断ELISA方法检测A型口蹄疫抗体在开发试剂盒的过程中，兔抗口蹄疫病毒血清已经预先包被在ELISA板上，酶标抗体以工作液的形式提供，待检血清、酶标抗体、病毒抗原在一个反应体系内一步完成，减少了使用者在操作过程中因为试剂配制和步骤繁琐造成的操作失误和试验失败。该试剂盒的操作将传统液相阻断ELISA试剂盒的繁琐操作简化到极致。
4.4经口蹄疫灭活疫苗破乳获得检测用抗原，扩大了口蹄疫病毒抗原的来源，并保证了口蹄疫病毒抗原是安全的。少量口蹄疫病毒抗原通过连续超速离心再经蔗糖密度梯度离心纯化的方式，减少了病毒抗原预浓缩造成的抗原损失，解决了在有限抗原量的情况下纯化制备抗血清的难题。
4.5本研究为测定A型口蹄疫免疫抗体检测提供了快速、敏感、特异、稳定的检测新技术。
Claims (7)
1.夹心阻断ELISA试剂在制备口蹄疫病毒抗体检测试剂盒中的应用，其特征在于：在已包被口蹄疫型特异抗体的ELISA板上将被检血清和阴阳性对照血清进行系列稀释后紧接着加入酶标抗体，然后加入稀释至工作浓度的口蹄疫病毒抗原，设置至少4孔病毒抗原对照，经孵育洗涤后加入TMB底物，显色终止后OD450nm波长读取吸光值；
所述口蹄疫型特异抗体为兔抗口蹄疫病毒血清。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述夹心阻断ELISA反应体系为200ul/孔；其中，被检血清或阴阳性对照血清为50ul/孔，酶标抗体为50ul/孔，口蹄疫灭活病毒抗原为100ul/孔。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：在所述夹心阻断ELISA反应体系中，酶标抗体与已包被在ELISA板内的多克隆抗体形成双抗夹心法结合反应体系中的抗原，被检血清及阴阳性对照血清中的口蹄疫抗体阻断反应体系中的抗原参与夹心法的进行，样品中的抗体水平与抗原阻断率成正比。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述口蹄疫病毒抗原为血清型特异的口蹄疫病毒抗原，是经口蹄疫病毒灭活得到或经口蹄疫灭活疫苗破乳后得到。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述口蹄疫病毒抗原包括O型FMDV抗原及A型FMDV抗原。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述酶标抗体，是1株及以上单克隆抗体标记HRP后混合使用，或是146S抗原免疫制备多克隆抗体标记HRP后使用。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：利用夹心阻断ELISA试剂制备口蹄疫病毒抗体检测试剂盒的方法，包括以下步骤：
步骤一、包被ELISA板：
用pH值9.6、0.05M碳酸盐缓冲液将血清型特异的兔抗口蹄疫病毒血清稀释并包被ELISA板，100µl/孔，室温过夜，PBST洗板5次，干燥处理后真空包装，4℃保存；
步骤二、血清稀释：
在已包被兔抗口蹄疫病毒血清的ELISA板上按每孔50µl量加入血清稀释液，将阴阳性对照血清及被检血清按要求在ELISA板内进行2倍连续稀释；每块反应板均设置至少4孔不加血清对照，预先加入50µl的血清稀释液，ELISA反应板内体系均为50µl/孔；
步骤三、加酶标抗体
在血清样品稀释后紧接着加入酶标抗体，50ul/孔，反应体系变为100ul/孔；
步骤四、加病毒抗原：
最后加入稀释至工作浓度的病毒抗原，每孔100µl，最终反应体系为200ul/孔；封板，震荡， 37℃孵育30分钟；
步骤五、底物及终止反应
用1倍PBST洗板3~5次，加入TMB底物溶液，单组分为50µl/孔或双组分AB液各50ul/孔，37℃孵育10分钟后再每孔加入50µl的2M H2SO4终止反应，酶标仪450nm波长下读取吸光值；
步骤六、结果判定：
以病毒抗原对照4孔OD值平均值的50%作为病毒抗原被阻断50%的临界值，将阴阳性对照血清和被检血清相应孔的OD值与临界值相比较，某份血清抗体效价即为该份血清稀释孔OD值略高于临界值与略低于临界值孔对应的抗体滴度的平均值；抗体效价≥64判为口蹄疫抗体阳性。
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