KR102138153B1

KR102138153B1 - 세포 투과성 펩타이드 및 이의 고속 대량 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR102138153B1
Application number: KR1020180121303A
Authority: KR
Inventors: 심태진; 김지훈; 강원화; 이민재; 김종필; 정연화; 이유진; 한승희; 남택현
Original assignee: 주식회사 프롬바이오
Priority date: 2018-10-11
Filing date: 2018-10-11
Publication date: 2020-07-27
Also published as: KR20200041185A

Abstract

본 발명은 박테리아 시스템을 이용하여 고속 및 대량으로 세포 투과성이 우수한 세포 투과성 펩타이드를 스크리닝 하는 방법 및 이를 통해 선별된 세포 투과성 펩타이드에 관한 것이다. 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드의 스크리닝 방법을 이용하면 생물학적 활성 물질을 세포 내로 효과적으로 전달할 수 있는 소수성 세포 투과성 펩타이드를 고속으로 대량 스크리닝할 수 있으며, 선별된 세포 투과성 펩타이드는 기존에 보고된 세포 투과성 펩타이드와 달리 독특한 아미노산 구성을 가지고 있어 목적하는 생물학적 활성 물질을 세포 내로 효과적으로 운반할 할 수 있다.

Description

세포 투과성 펩타이드 및 이의 고속 대량 스크리닝 방법 {A Cell penetrating peptide and high throughput screening method thereof}

본 발명은 박테리아 시스템을 이용하여 고속 및 대량으로 세포 투과성이 우수한 세포 투과성 펩타이드를 스크리닝 하는 방법 및 이를 통해 선별된 세포 투과성 펩타이드에 관한 것이다.

고등동물의 세포는 인지질 이중층(phospholipid bilayer)인 세포막(plasma membrane)으로 세포안과 밖을 구분하고 있으며, 세포안으로의 물질 이동을 엄격히 규제하고 있다. 세포막의 소수성 특성으로 인하여 단백질, 핵산 등과 같은 거대분자(macromolecule)들은 세포 안으로 이동이 거의 불가능하다. 따라서, 세포막은 펩타이드, 단백질, 핵산 그리고 치료 목적의 약물이나 유전자 치료제들을 세포 내로 이동하는데 있어 장애물의 역할을 한다. 이와 같은 문제를 해결하기 위하여 세포투과성 펩타이드를 사용하려는 시도가 많이 진행되고 있다.

세포투과성 펩타이드(CPP, cell penetrating peptide) 는 5-30개의 아미노산으로 구성된 펩타이드로서 에너지 의존적 또는 에너지 비의존적 기작으로 특별한 수용체없이 리포좀(liposome), 핵산 및 단백질 그리고 작은 약물(small drug) 등과 같은 cargo(세포안으로 전달하는 물질)들을 세포 안으로 전송하는 기능을 가지고 있으며, PTD(protein transduction domain), MTS(membrane translocation sequence) 그리고 MTD(macromolecular transport domain)이라고 명명하기도 한다 (Ruczynski J et. al., Folia histolochemica et cytobiologica, 2014 : 257~269).

CPP는 1988년에 HIV의 전사인자(transcription factor) Tat가 세포안으로 전송되는 것이 처음 보고되면서 알려졌으며, 그 이후 초파리의 안테나피디아 호메오도메인 (Drosophila antennapedia homeodomain)의 세번째 helix에 존재하는 16개 아미노산인 penetratin, 허피스 심플렉스 바이러스-1 DNA 결합단백질 VP22(herpes-simplex-virus-1 DNA-binding protein VP22)에서 유래된 VP22, 신경펩타이드 galanin과 mastoparan에서 유래된 transportan, 인공적으로 반복시킨 폴리아르기닌(poly-arginine), signal sequence을 구성하는 h-region의 유사 서열을 통한 변형체 등과 같이 많은 CPP가 알려졌다 (Guidotti G. et al., Trends in Pharmacological Sciences, 2017: 406~424, Nguyen T.V. et al., Journal of Pharmaceutical Investigation, 2018 :77-87)

CPP는 구성하는 아미노산 잔기 특성에 따라 세가지 그룹으로 분류될 수 있으며, Tat와 같이 양이온 아미노산을 가지고 있는 양이온(cationic) CPP, 친수성 잔기와 소수성 잔기로 이루어진 양친매성 (Amphipathic) CPP, 그리고 소수성 잔기로만 구성된 소수성(hydrophobic) CPP로 분류된다. 이와 같은 CPP들의 세포내 전송 기작은 확실히 보고된 바는 없지만 여러가지 모델들이 제시되고 있다 (Guidotti G. et al., Trends in Pharmacological Sciences, 2017: 406~424).

많은 양이온성 CPP들은 세포 표면에 존재하는 음이온 잔기들과 먼저 결합을 한 후 endocytosis 방법으로 cargo들을 세포 안으로 내재화(internalization)하여 엔도좀 (endosome) 을 형성 후 세포질로 분비가 되는데 엔도좀에서 세포질로 분비되는 효율이 적은 제한인자를 가지고 있을 뿐만 아니라 리소좀에 의해 분해가 되는 단점을 가지고 있다. 이러한 결과로 인해 양이온성 CPP을 이용한 치료적 약물 및 물질들의 세포 내 전송은 효율이 낮은 특성을 가지고 있다 (Richard, J.P. et al. J. Biol. Chem. 2003 :585-590, Vasconcelos, L. et al. Ther. Deliv. 2013 : 573-591).

양친매성 CPP는 일시적인 pore을 형성하거나 인지질층의 유동성 불안정화를 유도하여 cargo들을 세포 안으로 전송하지만, 이러한 pore 형성 및 인지질층의 불안정화들은 세포질 물질 유출 및 세포막 포텐셜 변화 등을 초래하여 세포독성을 가지는 단점이 있다 (Jarver, P. et al. Trends Pharmacol. Sci. 2010 : 528-535, Pouny, Y. et al. Biochemistry 1992 : 12416-12423).

소수성 CPP들의 세포내 전송 기작에 대한 모델은 아직까지 보고된 바는 없지만 지질 이중층의 소수성 잔기들과 직접적인 상호작용을 통해 cargo을 세포 내로 전송한다고 보고되고 있다 (Marks, J.R. et al. J. Am.Chem. Soc. 2011 : 8995-9004)

치료목적의 약물, 단백질들을 조직으로 전달하여 치료적인 효과를 보기 위해서는 혈관이 없는, 혈액이 확산되지 않는 조직 및 세포 내로, 깊숙이까지 전달되어야 치료효과를 볼 수 있는데, Tat 유래 양이온성 CPP들은 하나의 세포로 전달되면 인근에 위치한 주변세포로 전달이 되지 않는 문제점이 있다. 반면 소수성 CPP들은 하나의 세포로 전송되면 그 세포에서 CPP들이 밖으로 재전송되고 또한 주변 세포들 내로 다시 전송되어 하나의 세포에서 또 다른 세포로 전송되는 특징을 가지고 있기 때문에 조직 깊숙이 치료목적의 약물이나 단백질을 전달할 수 있는 장점이 있다 (Lim JH. et al., the American Society of Gene and Therapy 2012 : 1540-1549).

그러나 이와 같은 소수성 CPP 들의 장점에도 불구하고, 지금까지 보고된 CPP 들은 세포 내로 전송되는 단백질의 특정 아미노산 서열에서 유래하였거나 또는 그 서열들의 변형된 유도체이거나 소수성 서열에 양성전하를 가지는 아미노산(리신, 아르기닌)들을 병합하여 만든 것들이 대부분으로 다양한 소수성 CPP 를 확보하는데 많은 기술적 한계점이 있었다. 특히 이와 같은 방법은 소수성 CPP 특성을 나타낼 수 있는 구체적인 기초 펩타이드를 우선 동정해야 하며, 이를 토대로만 변형을 가할 수 있어 매우 제한적인 소수성 CPP 만 이용이 가능한 것으로 알려져 있다. 따라서, 기존 CPP 대비 우수성을 갖는 다양한 소수성 CPP 및 이를 고속으로 대량 선별할 수 있는 새로운 방법에 대한 필요성이 절실하다.

본 발명자들은 기존 CPP 대비 우수성을 갖는 다양한 소수성 CPP를 고속으로 대량 선별할 수 있는 새로운 방법에 대하여 연구하던 중, 박테리아 시스템을 이용하면 무작위로 합성된 다양한 펩타이드 중 효과적으로 생물학적 활성 물질을 세포 내로 전달할 수 있는 소수성 CPP 를 빠르게 선별할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 박테리아 시스템을 이용한 세포 투과성 펩타이드의 스크리닝 방법 및 이를 통해 선별된 세포 투과성 펩타이드, 이를 포함하는 세포막 투과 개선용 조성물, 세포막 투과 개선용 조성물의 제조방법, 생물학적 활성 물질의 세포 투과도를 높이는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 1) 10 내지 15개의 무작위 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 코딩하는 세포 투과성 펩타이드 (Cell penetrating peptide, CPP) 후보 유전자와 제1 항생제 선별 마커 유전자를 융합하여 CPP-제1 항생제 선별 마커 유전자 라이브러리를 제조하는 단계; 2) 상기 1) 단계에서 제조된 CPP-제1 항생제 선별 마커 유전자를 증폭하는 단계; 3) 상기 2) 단계에서 증폭된 CPP-제1 항생제 선별 마커 유전자를 제1항생제와 상이한 제2 항생제 선별 마커 유전자를 포함하는 벡터에 삽입하는 단계; 4) 상기 3) 단계의 벡터를 박테리아에 형질전환시키는 단계; 5) 상기 4) 단계의 형질전환된 박테리아를 3) 단계의 제2 항생제 선별 마커에 대응되는 제2 항생제를 포함하는 배지에서 배양하여 제2 항생제 내성 콜로니를 선별하는 단계; 6) 상기 5) 단계에서 선별된 콜로니를 제1 항생제 선별 마커에 대응되는 제1 항생제를 포함하는 배지에서 배양하여 제1 항생제 내성 콜로니를 선별하는 단계; 및 7) 상기 6) 단계에서 선별된 콜로니에 삽입된 CPP 후보 유전자가 코딩하는 CPP 펩타이드 중 70% 이상의 소수성을 나타내는 CPP 펩타이드를 선별하는 단계; 를 포함하는 세포 투과성 펩타이드의 스크리닝 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 스크리닝 방법을 통해 스크리닝된 세포 투과성 펩타이드를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 세포 투과성 펩타이드를 포함하는 세포막 투과 개선용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 10 내지 15개 길이의 아미노산 서열로 이루어지며, 상기 아미노산 서열은 70% 이상의 소수성을 나타내고, 전체 아미노산 중 페닐알라닌을 15 내지 70% 로 포함하며, 알라닌, 발린 및 프롤린을 0 개 또는 1개 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포 투과성 펩타이드 제공한다.

또한 본 발명은 상기 세포 투과성 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 세포 투과성 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 세포 투과성 펩타이드와 생물학적 활성 물질을 융합하는 단계; 를 포함하는 세포막 투과 개선용 조성물의 제조방법을 제공한다.

또한 본 발명은 1) 상기 세포 투과성 펩타이드와 생물학적 활성 물질을 융합하는 단계; 및 2) 상기 1) 단계에서 제조된 세포 투과성 펩타이드와 생물학적 활성 물질 융합체를 세포에 처리하는 단계를 포함하는 생물학적 활성 물질의 세포 투과도를 높이는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드의 스크리닝 방법을 이용하면 생물학적 활성 물질을 세포 내로 효과적으로 전달할 수 있는 소수성 세포 투과성 펩타이드를 고속으로 대량 스크리닝할 수 있으며, 선별된 세포 투과성 펩타이드는 기존에 보고된 세포 투과성 펩타이드와 달리 독특한 아미노산 구성을 가지고 있어 목적하는 생물학적 활성 물질을 세포 내로 효과적으로 운반할 할 수 있다.

도 1은 bla 유전자의 기능 검증을 위하여 제조한 신호 서열 유무에 따른 양성 및 음성 대조군 벡터의 벡터맵을 나타낸 도이다. 신호서열(signal sequence)이 있는 bla 유전자를 클로닝한 양성 대조군 벡터(positive control)와 신호서열(signal sequence)이 없는 bla 유전자를 클로닝한 음성 대조군 벡터(negative control).
도 2는 IPTG 유/무에 따라 양성대조군과 음성대조군의 앰피실린 배지에서 생장을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 MTM-bla 융합 라이브러리의 모식도이다.
도 4는 MTM-bla 융합 라이브러리를 형질전환 한 후, 저농도 앰피실린(100 ㎍/㎖)과 고농도 앰피실린(2,000 ㎍/㎖) 고체배지에서 내성 박테리아 선별 과정을 나타낸 도이다 (CM: 클로람페니콜, AMP: 앰피실린).
도 5는 앰피실린(100 ㎍/㎖)을 포함하는 고체배지에서 생장한 콜로니를 액체 배지에서 배양한 후 고농도 앰피실린 (2,000 ㎍/㎖)을 포함하는 고체배지에서 MTM-bla 라이브러리 콜로니를 선별한 결과를 나타낸 도이다 (AMP: 앰피실린).
도 6은 10⁰에서 10^-3까지 희석한 박테리아를 고농도(3,000 ㎍/㎖) 앰피실린 고체배지에 spot 한 후 각각의 희석배수에서 생장한 MTM-bla 박테리아 콜로니들을 그룹으로 분류한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 loxp유전자, 토마토 Red 단백질(TMT) 유전자와 GFP 단백질 유전자들의 융합 유전자가 CMV 프로모터에 의해 조절되는 벡터 (loxP-TMT-loxP-GFP의 융합 유전자들을 클로닝한 벡터)를 나타낸 도이다.
도 8은 pCMV/loxPTMT-GFP 벡터가 형질전환된 293T 세포에 PBS buffer, BL21DE3 soluble 단백질, Tat-Cre 단백질 발현이 유도된 수용성 단백질들을 1 시간 동안 처리한 후 Red filter와 green filter로 사진을 촬영한 후 서로의 사진을 중첩(overlap) 하여 형광현미경으로 형광단백질 발현을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 박테리아에서 MTM-Cre 융합 단백질들을 IPTG로 발현 유도하고 난 다음 sonicator를 사용하여 파쇄한 후 수용성 단백질만을 12% SDS-PAGE에서 분리한 결과를 나타낸 도이다. 1: BL21(DE3), 2: Tat-Cre, 3: MTM4-Cre, 4: MTM37-Cre, 5: MTM137-Cre, 6: MTM157-Cre, 7: MTM182-Cre, 8: MTM370-Cre, 9: MTM483-Cre, 10: MTM486-Cre, 11: MTM519-Cre, 12: MTM538-Cre, 13: MTM542-Cre, 14: MTM548-Cre, 15: MTM579-Cre, 16: MTM600-Cre, 17: MTM601-Cre, 18: MTM607-Cre, 19: MTM610-Cre, 20: MTM783-Cre, 21: MTM787-Cre, 22: MTM797-Cre, 23: MTM807-Cre, 24: MTM816-Cre, 25: MTM847-Cre, 26: MTM848-Cre, 27: MTM886-Cre, 28: MTM1007-Cre, 29: MTM1016-Cre, 30: MTM1061-Cre, 31: MTM1157-Cre, 32: MTM1181-Cre, 33: MTM1426-Cre, 34: MTM1523-Cre, 35: MTM1889-Cre, 36: MTM2113-Cre, 37: MTM2435-Cre, 38: MTM2475-Cre, 39: MTM2498-Cre, 40: MTM2502-Cre, 41: MTM2638-Cre, 42: MTM3001-Cre, 43: MTM3003-Cre, 44: MTM3005-Cre, 45: MTM3007-Cre.
도 10 a 및 도 10b 는 pCMV/loxPTMT-GFP 벡터가 형질전환된 293T 세포에 PBS buffer, BL21DE3 soluble 단백질, Tat-Cre 단백질 발현이 유도된 soluble 단백질 및 MTM-Cre soluble 단백질들을 1 시간 동안 처리하여 형광현미경으로 형광단백질 발현 (Red 단백질, GFP 단백질)을 확인하고 Red filter와 green filter로 사진을 촬영 후 서로의 사진들을 중첩(overlap)한 결과를 나타낸 도이다 (PBS 버퍼: 음성 대조군, BL21(DE3) soluble 단백질: 음성 대조군, Tat-Cre soluble 단백질: 양성 대조군).
도 11은 발현 벡터(pET41a 벡터)에 MTM-bla 유전자를 클로닝한 벡터의 모식도이다.
도 12 박테리아에서 MTM-Bla 단백질 발현을 유도하고 난 다음 정제하여 12% SDS-PAGE에서 분리하여 확인한 결과를 나타낸 도이다. 1: Tat-Bla, 2: MTM4-Bla, 3: MTM137-Bla, 4: MTM406-Bla, 5: MTM528-Bla, 6: MTM600-Bla, 7: MTM783-Bla, 8: MTM797-Bla, 9: MTM814-Bla, 10: MTM816-Bla, 11: MTM848-Bla, 12: MTM1181-Bla, 13: M2378-Bla, 14: MTM2435-Bla, 15: MTM3001-Bla, 16: MTM3007-bla
도 13은 FITC로 표지된 MTM-Bla 단백질(17 nM)들과 Tat-Bla 단백질(17 nM)을 Hela 세포에 1시간 동안 처리하고 난 다음 세척하여 Hela 세포들에 대해 FITC를 FACS 기기로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 FITC로 표지된 MTM-Bla 단백질(170 nM)들과 Tat-Bla 단백질(170 nM)을 37℃, 5% CO₂에서 1시간 동안 Hela 세포에 처리하고 난 다음 세척하여 형광 공초점 현미경으로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 FITC로 표지된 MTM-Bla 단백질(170 nM)들과 Tat-Bla 단백질(170 nM)을 4℃ 에서 1시간 동안 Hela 세포에 처리하고 난 다음 세척하여 형광 공초점 현미경으로 분석한 결과를 나타낸 도이다.

본 발명은 세포 투과성 펩타이드의 스크리닝 방법을 제공한다.

보다 구체적으로 본 발명은 박테리아 시스템을 이용한 소수성 세포 투과성 펩타이드의 스크리닝 방법을 제공하며, 본 발명은 세포막을 형성하는 인지질 이중층의 주요 구성성분들은 진핵세포의 인지질 이중층에서만 콜레스테롤을 함유하고 있는 것 외에는 진핵세포나 원핵세포에서 큰 차이가 없기 때문에 박테리아에서 세포 투과성 펩타이드를 선별하더라도 세포 투과성 펩타이드의 본래 기능은 유지할 수 있음을 기초로 한다.

특히 본 발명의 박테리아 시스템을 이용한 세포 투과성 펩타이드의 스크리닝 방법은 인지질 이중층의 소수성과 직접적으로 상호작용하여 세포 내로 전송되는 소수성 세포 투과성 펩타이드를 선별하는데 적합하며, 본 발명의 스크리닝 방법에 따르면 소수성 세포 투과성 펩타이드를 동물 세포 또는 사람 세포에서 선별하는 것과 비교하여 쉽고 빠르게 고속-대량으로 스크리닝할 수 있다.

보다 구체적으로 본 발명의 스크리닝 방법은 1) 10 내지 15개의 무작위 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 코딩하는 세포 투과성 펩타이드 (Cell penetrating peptide, CPP) 후보 유전자와 제1 항생제 선별 마커 유전자를 융합하여 CPP-제1 항생제 선별 마커 유전자 라이브러리를 제조하는 단계; 2) 상기 1) 단계에서 제조된 CPP-제1 항생제 선별 마커 유전자를 증폭하는 단계; 3) 상기 2) 단계에서 증폭된 CPP-제1 항생제 선별 마커 유전자를 제1항생제와 상이한 제2 항생제 선별 마커 유전자를 포함하는 벡터에 삽입하는 단계; 4) 상기 3) 단계의 벡터를 박테리아에 형질전환시키는 단계; 5) 상기 4) 단계의 형질전환된 박테리아를 3) 단계의 제2 항생제 선별 마커에 대응되는 제2 항생제를 포함하는 배지에서 배양하여 제2 항생제 내성 콜로니를 선별하는 단계; 6) 상기 5) 단계에서 선별된 콜로니를 제1 항생제 선별 마커에 대응되는 제1 항생제를 포함하는 배지에서 배양하여 제1 항생제 내성 콜로니를 선별하는 단계; 및 7) 상기 6) 단계에서 선별된 콜로니에 삽입된 CPP 후보 유전자가 코딩하는 CPP 펩타이드 중 70% 이상의 소수성을 나타내는 CPP 펩타이드를 선별하는 단계; 를 포함하는 세포 투과성 펩타이드의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

본 발명의 방법에 따르면, 세포 투과성 펩타이드 (Cell penetrating peptide, CPP)후보 유전자가 코딩하는 펩타이드가 세포 투과성을 나타내는 경우, 함께 융합된 제1 항생제 선별 유전자가 세포 내에서 발현되어, 제1 항생제 선별 마커 단백질이 세포 밖으로 전달될 수 있고, 보다 구체적으로 세포질 간극으로 분비될 수 있으므로 상호 상이한 제1 항생제 선별 마커 유전자 및 제2 항생제 선별 마커 유전자의 존재에 의하여 제1 및 제2 항생제를 포함하는 배양 조건에서 콜로니를 형성할 수 있고, 이를 통해 후보 펩타이드가 세포 투과성을 갖는지 여부를 신속, 정확하게 판단할 수 있다. 세포 투과성 펩타이드 (Cell penetrating peptide, CPP) 후보 유전자가 코딩하는 펩타이드가 세포 투과성을 나타내지 못하는 경우, 제1 항생제 선별 마커 단백질은 세포질 간극으로 분비되지 못하고 세포질에 존재하게 되므로, 제1항생제를 포함하는 배양 조건에서 콜로니를 형성할 수 없다.

본 발명의 용어 “세포 투과성 펩타이드”는 거대 분자 전달 모티프 (MTM, macromolecular transport motif), PTD(protein transduction domain), MTS(membrane translocation sequence) 또는 MTD(macromolecular transport domain) 과 상호 동일한 의미로 교환적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법에 있어, 제 1) 단계는 10 내지 15개의 무작위 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 코딩하는 세포 투과성 펩타이드 (Cell penetrating peptide, CPP)후보 유전자와 제1 항생제 선별 마커 유전자를 융합하여 CPP-제1 항생제 선별 마커 유전자 라이브러리를 제조하는 단계이다.

상기 제 1) 단계에 있어, 무작위 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 10 내지 15개, 바람직하게는 10 내지 13개, 더욱 바람직하게는 12개의 아미노산으로 이루어질 수 있으며, 상기 펩타이드는 소수성 아미노산을 주요 아미노산으로 포함할 수 있다. 상기 소수성 아미노산은 이소류신(Ile, I), 류신(Leu, L), 메티오닌(Met, M), 페닐알라닌(Phe, F), 티로신(Tyr, Y) 또는 트립토판(Trp, W)일 수 있다.

상기 제 1) 단계의 융합은 제1 항생제 선별 마커의 N, C 말단 또는 양 말단에 10 내지 15개의 무작위 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 코딩하는 세포 투과성 펩타이드 암호화 후보 유전자를 융합하여 이루어질 수 있으며, 이와 같은 유전자의 융합은 당분야에 공지된 유전자 융합 방법을 통해 제한없이 수행될 수 있다.

상기 제 1) 단계에 따르면 CPP-제1 항생제 선별 마커 유전자 라이브러리가 수득될 수 있으며, 본 발명에 있어 'CPP-제1 항생제 선별 마커 유전자 라이브러리' 란, 세포 투과성 펩타이드 후보 펩타이드를 암호화하는 유전자와 제1 항생제 선별 마커 유전자가 융합된 임의의 무작위 융합 유전자 집단을 의미한다. 본 발명에 있어, 세포 투과성 펩타이드 후보 펩타이드란, 10 내지 15개의 무작위 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드로, 세포 투과성을 가질 것으로 기대되는 임의의 펩타이드를 의미한다.

본 발명에 있어, 상기 제1 항생제 선별 마커 유전자는 융합된 세포 투과성 펩타이드 (Cell penetrating peptide, CPP) 후보 유전자의 세포 투과성을 확인하는데 사용할 수 있는 항생제 저항성 유전자 또는 내성 유전자를 의미하며, 당 분야에 공지된 세포 밖으로 분비되어 작용을 하는 항생제에 대한 저항성을 나타내는 항생제 저항성 또는 내성 유전자를 제한없이 포함할 수 있고, 바람직하게는 베타 락타마제를 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 할 수 있다. 이에 따라 바람직하게는 제1 항생제는 베타 락탐 계열 항생제일 수 있다. 베타 락탐 계열 항생제는 페니실린계, 세팔로스포린계, 카바페넴계, 모노박탐에 속하는 항생제를 제한없이 포함할 수 있고, 바람직하게는 페니실린계, 예컨대 앰피실린일 수 있다.

본 발명에 있어, 제 2항생제 선별 마커 유전자는 벡터의 도입을 확인하는데 사용할 수 있는 항생제 저항성 유전자 또는 내성 유전자를 의미하며, 당 분야에 공지된 항생제 저항성 또는 내성 유전자를 제한없이 포함할 수 있고, 바람직하게는 에리트로마이신 저항성 유전자, 카나마이신 저항성 유전자, 클로람페니콜 저항성 유전자, 카베니실린 저항성 유전자, 스트렙토마이신 저항성 유전자 및 테트라사이클린 저항성 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 제1 항생제 선별 마커 유전자 및 제2 항생제 선별 마커 유전자는 상호 상이한 항생제에 대한 선별 마커 유전자를 의미한다.

본 발명의 바람직한 일 예에서는 제1 항생제 선별 마커 유전자로 베타 락타마제를 코딩하는 bla 유전자를 이용하였으며, 제2 항생제 선별 마커 유전자로 클로람페니콜 저항성 유전자를 이용하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 선별 마커 유전자 선택에 따라 제2항생제는 비-베타락탐 계열 항생제일 수 있으며, 예컨대 에리트로마이신, 카나마이신, 클로람페니콜, 카베니실린, 스트렙토마이신 및 테트라사이클린으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

본 발명의 2) 단계는 1) 단계에서 제조된 CPP-제1 항생제 선별 마커 유전자를 증폭하는 단계이며, 유전자 증폭은 당 분야에 공지된 유전자 증폭 방법, 예컨대 PCR 방법에 의하여 제한없이 수행할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 예에서는 제1항생제 선별 마커로 베타 락타마제를 코딩하는 유전자를 선택하고, 서열번호 78 및 서열번호 79의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다.

본 발명의 3) 단계는 2) 단계에서 증폭된 CPP-제1 항생제 선별 마커 유전자를 제1항생제와 상이한 제2 항생제 선별 마커 유전자를 포함하는 벡터에 삽입하는 단계이며, 본 발명의 바람직한 일 예에서 사용된 CPP-제1 항생제 선별 마커 유전자 및 제2 항생제 선별 마커 유전자를 포함하는 벡터를 도 3에 나타내었다.

본 발명의 4) 단계는 3) 단계의 벡터를 박테리아에 형질전환시키는 단계이며, 형질전환은 전기천공법 (electroporation) 과 같은 당 분야에 공지된 방법을 이용할 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 박테리아는 DH5α, XL1-Blue, TG1, Top10, JM109, HB101를 포함할 수 있으나, 이제 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 5) 단계 및 6) 단계는 상기 4) 단계의 형질전환된 박테리아를 3) 단계의 제2 항생제 선별 마커에 대응되는 제2 항생제를 포함하는 배지에서 배양하여 제2 항생제 내성 콜로니를 선별하는 단계; 및 6) 상기 5) 단계에서 선별된 콜로니를 제1 항생제 선별 마커에 대응되는 제1 항생제를 포함하는 배지에서 배양하여 제1 항생제 내성 콜로니를 선별하는 단계로, 각각의 항생제에 대한 내성 유전자 존재에 따라 콜로니를 선별하는 단계이다.

상기 단계에서 콜로니 선별은 항생제의 농도를 점진적으로 증가시키면서 수행할 수 있으며, 예컨대 앰피실린을 사용하는 경우, 처음에는 앰피실린 저농도(50 ~ 100 ㎍/ml)에서 선별하고 난 다음 고농도 (2,000 ~ 4,000 ㎍/ml)에서 선별하는 것이 좋으나 탐색 시간을 단축하기 위해 고농도에서 단축하여 선별할 수 있다. 고체배지에서 선별은 콜로니 형성, 생장, 크기 및 콜로니 테두리 형태에 따라 선별할 수 있다. 항생제를 포함하는 고체배지에서 생장하는 박테리아들은 항생제 선별 마커와 융합된 융합 단백질들을 분비하는 박테리아로서 세포 투과성 펩타이드 성능에 따라 그 분비 정도가 다르기 때문에 콜로니 크기 및 테두리의 형태에 영향을 미친다. 따라서, 콜로니가 크기가 크고 테두리가 진한 콜로니를 선별하는 것이 바람직하다. 예컨대 순차적인 농도 증가 선별은 항생제 농도 (50~100 ㎍/㎖) 고체배지에 도말하여 배양하는 단계, 액체배지에서 배양한 후 항생제 고농도(100~2,000 ㎍/㎖)의 고체 배지에서 spot하여 선별하는 단계, 액체배지에서 배양한 후 일련의 희석(10⁰~10^-3)으로 항생제 고농도(3,000~4,000 ㎍/㎖) 고체배지에 spot하여 선별하는 단계를 포함하여 수행될 수 있다.

본 발명의 7) 단계는 상기 6) 단계에서 선별된 콜로니에 삽입된 CPP 후보 유전자가 코딩하는 CPP 펩타이드 중 70% 이상의 소수성을 나타내는 CPP 펩타이드를 선별하는 단계로, 세포 투과성을 갖는 펩타이드를 최종적으로 선별하는 단계를 의미한다.

70% 이상의 소수성이란, 소수성 아미노산의 비율이 전체 아미노산 개수 기준으로 70% 이상을 차지하는 것을 의미할 수 있으며, 소수성의 비율은 peptide2, ExPASy 등과 같이 인터넷에서 사용할 수 있는 당 분야의 공지된 프로그램을 이용하여 측정할 수 있다.

예컨대 본 발명은 다음과 같은 방식으로 스크리닝을 수행할 수 있다: 1) 10 내지 15개의 무작위 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 코딩하는 세포 투과성 펩타이드 (Cell penetrating peptide, CPP) 후보 유전자와 베타 락타마제를 코딩하는 유전자를 융합하여 CPP-베타 락타마제 유전자 라이브러리를 제조하는 단계; 2) 상기 1) 단계에서 제조된 CPP-베타 락타마제 유전자를 증폭하는 단계; 3) 상기 2) 단계에서 증폭된 CPP-베타-락타마제 유전자를 비-베타 락탐 계열 항생제 선별 마커 유전자를 포함하는 벡터에 삽입하는 단계; 4) 상기 3) 단계의 벡터를 박테리아에 형질전환시키는 단계; 5) 상기 4) 단계의 형질전환된 박테리아를 3) 단계의 비-베타 락탐 계열 항생제 선별 마커 유전자에 대응되는 항생제를 포함하는 배지에서 배양하여 비-베타 락탐 계열 항생제 내성 콜로니를 선별하는 단계; 6) 상기 5) 단계에서 선별된 콜로니를 베타 락탐계열 항생제를 포함하는 배지에서 배양하여 베타 락탐 계열 항생제에 내성인 콜로니를 선별하는 단계; 및 7) 상기 6) 단계에서 선별된 콜로니에 삽입된 CPP 후보 유전자가 코딩하는 CPP 펩타이드 중 70% 이상의 소수성을 나타내는 CPP 펩타이드를 선별하는 단계; 를 포함하는 세포 투과성 펩타이드의 스크리닝 방법.

본 발명의 스크리닝 방법을 통해 선별된 세포투과성 펩타이드는 바람직하게는 70% 이상의 소수성을 나타내는 펩타이드로, 전체 아미노산 중 페닐알라닌을 15 내지 70%, 바람직하게는 16 내지 67%, 25 내지 50% 포함하고, 알라닌을 포함하지 않고, 발린 및 프롤린을 0 개 또는 1개 포함하는 것을 특징으로 할 수 있고, 이는 우수한 세포 인지질 이중층 투과능을 가질 수 있다.

따라서, 본 발명은 본 발명의 방법으로 스크리닝된 세포 투과성 펩타이드 및 이를 포함하는 세포막 투과 개선용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 10 내지 15개 길이의 아미노산 서열로 이루어지며, 상기 아미노산 서열은 70% 이상의 소수성을 나타내고, 전체 아미노산 중 페닐알라닌을 15 내지 70%, 바람직하게는 16 내지 67%, 25 내지 50% 포함하고, 알라닌, 발린 및 프롤린을 0 개 또는 1개 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포 투과성 펩타이드에 관한 것이다.

본 발명의 세포 투과성 펩타이드는 본 발명의 스크리닝 방법에 따라 선별될 수 있는 것으로, 중복되는 설명은 명세서상의 복잡성을 피하기 위하여 생략한다.

본 발명의 세포 투과성 펩타이드는 10 내지 15개 길이의 아미노산, 바람직하게는 10 내지 13개, 더욱 바람직하게는 12개의 아미노산으로 이루어질 수 있으며, 상기 펩타이드는 소수성 아미노산을 주요 아미노산으로 포함할 수 있다. 상기 소수성 아미노산은 이소류신(Ile, I), 류신(Leu, L), 메티오닌(Met, M), 페닐알라닌(Phe, F), 티로신(Tyr, Y) 또는 트립토판(Trp, W)일 수 있다.

본 발명의 세포 투과성 펩타이드는 기존의 소수성 세포 투과성 펩타이드가 작은 측쇄를 가지는 알라닌, 발린, 프롤린, 류신, 이소류신으로 이루어진 것과 달리 페닐알라닌의 비율이 높은 것을 공통적인 특징으로 공유한다.

보다 구체적으로 본 발명의 세포 투과성 펩타이드는 전체 아미노산 중 페닐알라닌을 15 내지 70% 포함할 수 있으며, 예컨대 전체 아미노산이 12개로 이루어져 있는 경우 2 내지 8개의 페닐알라닌을 구성으로 할 수 있다.

또한 본 발명의 세포 투과성 펩타이드는 기존의 소수성 세포 투과성 펩타이드의 주요 아미노산으로 포함되는 알라닌, 발린 및 프롤린의 비율이 현저하게 낮은 것을 특징으로 공유하므로, 알라닌, 발린 및 프롤린이 아미노산 서열 내 존재하지 않거나 1개 존재하는 것을 특징으로 할 수 있다. 예컨대 표 3 내지 표 5에 기재된 세포 투과성 펩타이드 들 중 대부분의 세포 투과성 펩타이드들은 알라닌, 발린 및 프롤린을 포함하지 않으며, 일부 세포 투과성 펩타이드들은 서열 내 알라닌, 발린 및 프롤린을 0 또는 1개 포함한다.

본 발명의 10 내지 15개 길이의 아미노산 서열로 이루어지며, 상기 아미노산 서열은 70% 이상의 소수성을 나타내고, 전체 아미노산 중 페닐알라닌을 15 내지 70% 로 포함하며, 알라닌, 발린 및 프롤린을 0 개 또는 1개 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포 투과성 펩타이드는 서열번호 1 내지 서열번호 75로 표시되는 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종일 수 있다.

또한 본 발명의 세포 투과성 펩타이드는 바람직하게는 전체 아미노산 중 페닐알라닌을 15 내지 70% 로 포함하며, 알라닌을 포함하지 않고, 발린 및 프롤린을 0 개 또는 1개 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포 투과성 펩타이드일 수 있다.

보다 구체적으로 본 발명의 세포 투과성 펩타이드는 전체 아미노산 중 페닐알라닌을 15 내지 70%, 바람직하게는 16 내지 67% 또는 25 내지 50% 포함할 수 있으며, 예컨대 전체 아미노산이 12개로 구성되어 있는 경우 2 내지 8개 또는 3 내지 6개의 페닐알라닌을 구성으로 할 수 있다.

또한 본 발명의 세포 투과성 펩타이드는 알라닌을 포함하지 않으며, 발린 및 프롤린을 0 개 또는 1개 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 본 발명의 세포 투과성 펩타이드는 하기 표에 나타낸 세포 투과성 펩타이드 중 선택된 1종인 것을 특징으로 하는, 세포 투과성 펩타이드일 수 있다.

[표]

또한 본 발명은 본 발명의 세포 투과성 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 RNA 또는 DNA의 형태일 수 있는데, 상기 DNA는 cDNA 및 합성 DNA를 포함한다. DNA는 단일 가닥이거나 이중 가닥일 수 있다. 만약 단일 가닥이라면, 이는 코딩 가닥 또는 비-코딩(안티센스) 가닥일 수 있다. 당 분야의 통상의 기술자는 10 내지 15개 길이의 아미노산 서열로 구성되는 본원 발명의 세포 투과성 펩타이드의 서열을 기초로 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 용이하게 도출할 수 있으며, 이들은 유전적 코드의 축퇴성 (degeneracy) 또는 중복성 (redundancy) 을 갖는 서열을 모두 포함할 수 있다.

또한 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 관한 것이다.

상기 벡터는 본 발명의 세포 투과성 펩타이드 암호화 폴리뉴클레오티드를 포함하여 목적하는 생물학적 활성 물질을 세포 내로 전달하는데 사용할 수 있는 당 분야에 공지된 벡터를 제한없이 포함할 수 있다.

또한 본 발명은 본 발명의 세포 투과성 펩타이드를 포함하는 세포막 투과 개선용 조성물을 제공한다.

본 발명의 세포 투과성 펩타이드를 이용하면, 세포 투과성 펩타이드가 갖는 세포 인지질 이중층 투과능에 의하여 융합된 생물학적 활성 물질을 세포막을 투과하여 세포 내로 효과적으로 전달할 수 있다.

따라서 본 발명의 세포막 투과 개선용 조성물은 세포 내로 전달하고자 하는 생물학적 활성 물질을 세포 투과성 펩타이드와 융합된 형태로 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 생물학적 활성 물질은 이에 제한되는 것은 아니나, 유전자 재조합 효소, 전사인자, 독소, 펩타이드, 전장항체, 항체 절편(scFv), 단일도메인 항체(sdAb), 신호(signaling) 단백질, 신호 억제 단백질, 염증 억제 단백질, 폴리펩타이드, 핵산, mRNA 및 안티센스 RNA 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

또한 본 발명은 본 발명의 세포 투과성 펩타이드와 생물학적 활성 물질을 융합하는 단계; 를 포함하는 세포막 투과 개선용 조성물의 제조방법을 제공한다.

또한 본 발명은 본 발명에 따른 1) 세포 투과성 펩타이드와 생물학적 활성 물질을 융합하는 단계; 및 상기 1) 단계에서 제조된 세포 투과성 펩타이드와 생물학적 활성 물질 융합체를 세포에 처리하는 단계를 포함하는 생물학적 활성 물질의 세포막 투과도를 높이는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에 따르면, 종래 세포막을 투과하기 어려웠던 다양한 생물학적 활성 물질이 세포 투과성 펩타이드의 세포 인지질 이중층 투과능에 의하여 세포막을 가로질러 세포 내로 효과적으로 전달될 수 있으므로, 세포막 투과도를 높일 수 있다. 상기 세포막 투과도는 세포막을 가로질러 세포 내로 흡수되는 정도를 말한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. MTM- bla 라이브러리 DNA 제조를 위한 bla 기능 검증

MTM-bla 라이브러리를 제조하기 전에 bla의 기능을 먼저 확인하였다. 신호서열(signal sequence) 유무에 따라 Bla 단백질이 세포질 간극 (periplasmic space) 으로 분비되었을 때와 분비되지 않았을 때 앰피실린에 대한 내성을 확인하기 위하여, 신호서열을 포함하는 bla 유전자와 신호서열을 포함하지 않는 bla 유전자를 pBIB 벡터에 클로닝하였다. 구체적으로 상기 벡터를 제조하기 위하여 bla-a1/bla-b3의 프라이머로 신호서열을 포함하는 bla 유전자를 증폭하였고, bla-a2/bla-b3 프라이머를 사용하면서 신호서열이 결여된 bla 유전자를 증폭하였다. 증폭된 bla 유전자 단편들을 Nde I/Sal I으로 절단을 하고 난 다음 젤 추출 키트를 사용하여 각각 절단된 단편들을 추출 후 Nde I/Sal I으로 절단된 pBIB 벡터에 클로닝 하였다. 제조된 벡터를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, pBIB 벡터는 클로람페니콜을 선별 마커로 포함하고 있으며, 박테리아 세포 당 3 내지 5개 복제 수를 가지는 벡터로서, IPTG 에 의해 발현이 유도된다. IPTG가 없을 때에도 basal 수준으로 발현이 유도된다.

양성대조군(신호서열을 가지는 bla 유전자가 클로닝된 벡터)과 음성대조군(신호서열이 결여된 bla 유전자가 클로닝된 벡터)으로 형질전환된 XL1-blue 박테리아 균주들을 배양하고 난 다음 IPTG(10 μM/㎖) 가 첨가되거나 첨가되지 않은 앰피실린(100㎍/㎖) 및 클로람페니콜(37 ㎍/㎖)을 함유하는 고체배지에 도말하고 배양하였다. 배양 후 신호 서열 유무에 따른 콜로니 형성 여부를 확인하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 신호서열이 결여된 bla 유전자를 가지고 있는 음성대조군의 박테리아는 IPTG 첨가에 상관없이 클로람페니콜 고체배지에서는 콜로니를 형성하였지만 앰피실린 고체배지에서는 콜로니를 형성하지 못했다. 이를 통해, 신호서열이 결여된 경우, Bla 단백질은 세포질 간극으로 분비되지 않으며, 앰피실린에 대한 내성을 나타낼 수 없음을 확인하였다.

이러한 결과를 토대로, 신호서열이 결여된 bla 유전자에 세포투과성 펩타이드 후보를 융합하고 발현을 유도하였을 때, 융합된 세포투과성 펩타이드 후보 물질이 Bla 단백질을 세포질 간극으로 이동시킬 수 있다면, 앰피실린에 대한 내성을 나타낼 수 있을 것이며, 이 경우 해당 후보 물질이 세포투과성 펩타이드임을 결정할 수 있을 것으로 예상하였다.

실시예 2. MTM-bla 라이브러리의 제조 및 형질전환 콜로니 선별

실시예 1 에서 확인한 결과를 토대로, 세포투과성 펩타이드를 제조 및 선별하기 위한 라이브러리를 제조하고, 앰피실린에 내성을 갖는 박테리아 선별을 통해 효과적으로 세포투과성을 갖는 펩타이드를 선별하였다.

2.1 MTM- bla 라이브러리의 제조

구체적으로 다음과 같은 방법으로 세포투과성 펩타이드 후보물질과 bla 유전자의 융합 라이브러리 (MTM-bla 라이브러리)를 구축하였다. 먼저 12개 아미노산을 무작위하기 위한 프라이머(bla-a1-1)과 bla 유전자의 3' 말단 프라이머(bla-b3)로 PCR를 사용하여 무작위한 12개 아미노산 길이를 가지는 MTM-bla 유전자를 증폭하고 난 다음 아가로스 젤에서 추출하였다. MTM-bla 유전자를 증폭하기 위한 PCR 반응은 다음과 같이 진행하였다. 주형 DNA 20 ng, 0.5 U DNA 중합효소, 각 2.5 mM의 4가지 dNTP 그리고 5 ㎕의 10× 반응버퍼로 구성하였으며, 증류수로 최종 부피가 50 ㎕ 되도록 보충하였다. PCR 반응은 95 ℃에서 5분 노출 후, 95 ℃에서 30초, 60 ℃에서 30초, 72 ℃에서 60초 노출을 30회 반복하였다. 증폭된 DNA는 1% 아가로즈 젤에서 전기영동으로 분리 후 젤 추출 키트(gel extraction kit)로 추출하였다.

상기 방법으로 제조되는 MTM-bla 라이브러리의 모식도를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 12개 아미노산을 무작위하기 위한 프라이머(bla-a1-1)과 bla 유전자의 3' 말단 프라이머(bla-b3)로 PCR를 사용하여 무작위한 12개 아미노산 길이를 가지는 MTM-bla 유전자를 증폭하고 난 다음 아가로스 젤에서 추출하였으며, 사용한 프라이머의 서열은 표 1에 나타내었다.

서열번호	프라이머	염기서열 (5'----＞3')
76	bla-a1	CGA CAT ATG AGT ATT CAA CAT TTC CGT
77	bla-a2	CGA CAT ATG CCT GGT TTT GCT CAC CCA
78	bla-b3	CAG GTC GAC CCA ATG GTT AAT CAG TGA
79	bla-a1-1	CGA CAT ATG NNK NNK NNK NNK NNK NNK NNK NNK NNK NNK NNK NNK GGC GGA GGA CCT GGT TTT GCT CAC CCA

상기 표 1에서 N 은 구아닌(G), 아데닌(A), 싸이토신(C), 티민(T)이 1:1:1:1 비율로 무작위하게 삽입된 것을 의미하며, K 는 구아닌(G), 티민(T)이 1:1 비율로 무작위 삽입된 것을 의미한다. 또한 상기 표 1에서 밑줄 친 CAT ATG 는 Nde I site 를 GTC GAC 는 Sal I site 를 의미한다.

MTM-bla 유전자를 증폭하기 위한 PCR 반응은 다음과 같이 진행하였다. 주형 DNA 20 ng, 0.5 U DNA 중합효소, 각 2.5 mM의 4가지 dNTP 그리고 5 ㎕의 10× 반응버퍼로 구성하였으며, 증류수로 최종 부피가 50 ㎕ 되도록 보충하였다. PCR 반응은 95 ℃에서 5분 노출 후, 95 ℃에서 30초, 60 ℃에서 30초, 72 ℃에서 60초 노출을 30회 반복하였다. 증폭된 DNA는 1% 아가로즈 젤에서 전기영동으로 분리 후 젤 추출 키트(gel extraction kit)로 추출하였다. 증폭한 MTM-bla 유전자들을 Nde I/Sal I으로 절단한 후 pBIB 벡터의 Nde I/Sal I 자리에 ligation 하였다. 90% 이상 ligation이 된 것을 확인한 후 ligation mixture은 PCR 정제 키트로 정제하여 -20 ℃에 보관하였다.

2.2 MTM- bla 라이브러리를 이용한 형질전환 콜로니 제조

2.1 에서 제조된 MTM-bla/pBIB 라이브러리 ligation mixture을 TG1 박테리아로 형질전환을 하기 위해 competent cell를 제작하였다. LB 10 ㎖에 TG1 박테리아를 접종하고 난 다음 37 ℃에서 220 rpm으로 16 시간 동안 배양하였다. 배양한 배양액을 LB 500 ㎖에 0.1% (v/v) 비율로 접종한 다음 OD 값이 0.6될 때까지 배양하였다. 5,000 rpm으로 5분간 원심분리 후 상등액은 버리고 차가운 멸균 DW 500 ㎖로 pellet을 현탁하였다. 현탁 후, 5,000 rpm으로 5분간 원심분리 후 상등액은 버리고, pellet을 차가운 10% 글리세롤 250 ㎖로 현탁하여 5,000 rpm으로 5분간 원심분리를 수행하였다. 차가운 10% 글리세롤 150 ㎖로 세척하고 난 다음 pellet은 잔존하는 10% 글리세롤로 pellet를 현탁하여 competent cell를 제조하였다.

제조한 competent cell(100 ㎕)를 5개의 튜브에 옮기고, MTM-bla/pBIB 라이브러리 ligation mixture 를 10 ㎕(200 ng)씩 첨가하여 가볍게 혼합한 후 electroporation cuvette으로 옮기고 얼음에서 5분 동안 방치하였다. Cuvette들을 chamber에 넣고 난 다음 Micropulser(Biorad) 프로그램 1번으로 electroporation을 수행 후 Cuvette 당 2xYT 배지 2 ㎖로 cuvette에 있는 TG1 박테리아 세포를 현탁하여 15 ㎖ 코니컬 튜브(conical tube)로 옮겨 37 ℃에서 220 rpm으로 60분간 배양한 다음 클로람페니콜이 함유된 고체배지의 square plate 5장에 도말하여 37 ℃에서 18 시간동안 배양하였다. 앰피실린 내성 콜로니들을 선별하기 위해, 클로람페니콜 배지에서 성장한 콜로니들을 이쑤시개를 사용하여 앰피실린 (100 ㎕/㎖)을 함유하는 고체배지 총 100장 square plate로 옮겼다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 클로람페니콜이 함유된 고체배지의 square plate 상에서1.41x10⁵ 콜로니들을 확보하였으며, 앰피실린을 함유하는 고체배지에서는 총 3,008 콜로니들을 선별하였다. 각 콜로니들은 25% 글라이세롤에 넣어 다음 실험까지 -80 ℃에 보관하였다.

2.3 앰피실린 고농도 배지에서 저항성 박테리아 선발

실시예 2.2 에서 앰피실린(100 ㎍/㎖) 고체 배지에서 성장한 콜로니들을 앰피실린 저항성 별로 분류하기 위해, 먼저 100 ㎍, 200 ㎍, 300 ㎍/㎖의 앰피실린 농도 고체 배지를 이용하였다.

구체적으로 앰피실린(100 ㎍/㎖)에서 선별한 콜로니들 중 186개의 콜로니들을 2xYT 800 ㎕가 각 well에 첨가된 96 well deep plate 두 개에 접종한 다음 37 ℃에서 220 rpm으로 16 시간 동안 배양하였다. 그 배양액 400 ㎕와 새로운 2xYT 400 ㎕을 혼합한 후 5 시간 동안 추가적으로 배양하였으며, 그 배양액 5 ㎕를 앰피실린 농도 (100~300 ㎍/㎖) 고체배지에 각각 spot 하여 배양하였다. 그 결과, 100 ㎍과 200 ㎍에서는 차이가 나타나지 않았으며, 300 ㎍에서도 차이를 볼 수 없었다. 추가적으로 앰피실린 1,000 ㎍, 1,500 ㎍ 및 2,000 ㎍/㎖ 농도에서 상기와 같이 테스트 해 본 결과 1,000 ㎍과 1,500 ㎍에서 보다 2,000 ㎍/㎖에서 콜로니의 모양, 크기 및 테두리 형태 들을 구분할 수 있었다. 앰피실린 농도(2,000 ㎍/㎖)에서 앰피실린 저항성 별로 분류하기 위해 선별한 콜로니(3,008)들을 상기와 같이 배양한 다음 배양액 5 ㎕를 앰피실린 농도(2,000 ㎍/㎖) 고체배지에 spot 하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 2,000 ㎍/㎖ 앰피실린을 포함한 배지에서 생장한 콜로니를 크기 및 테두리 형태별로 5등급으로 분류하여 콜로니가 크기가 크고 테두리가 진한 콜로니들을 총 1,889개를 선별하였다.

2.4 일련의 희석 spot으로 앰피실린 고농도에서 항생제 내성 박테리아 선별

실시예 2.3 에서 선별한 1,889개의 콜로니들을 항생제 저항성 별 그룹으로 분류하였다. 앞서 실시한 spot 실험 방법으로는 분류하기가 힘들기 때문에 배양 후 일련 희석하여 각 희석 배수에서 spot을 하여 각 희석 배수에서 성장하는 콜로니들을 분류하는 방법을 수행하였다. 적절한 앰피실린 농도를 확인하기 위해 3 ㎎, 4 ㎎, 6 ㎎, 8 ㎎/㎖의 앰피실린 농도을 함유하는 배지에 배양한 배양액을 희석한 후 spot을 하였다. 임의적으로 8개의 콜로니를 선별하여 상기와 같이 96 deep plate에서 16시간 동안 배양 후 그 배양액 400 ㎕와 새로운 배지(2xYT) 400 ㎕을 혼합하여 OD가 0.2 될 때까지 배양하였다. 그 배양액을 10^-1에서 10^-6까지 일련의 희석한 후 그 희석액을 각각 5 ㎕씩 3 ㎎, 4 ㎎, 6 ㎎, 8 ㎎/㎖의 앰피실린 농도을 함유하는 고체배지에 spot하였다.

그 결과 3 ㎎/㎖ 앰피실린을 함유하는 고체배지에서 10^-1에서 8개의 클론(콜로니)들이 모두 콜로니를 형성하였으나 10^-2에서는 콜로니를 형성한 클론(2개)와 그렇지 못한 클론(6개)이 있었다. 또한 4 ㎎/㎖ 앰피실린을 함유하는 고체배지에서는 8개의 클론 중 2개의 클론만이 10^-1에서 콜로니를 생성하였고, 8 ㎎/㎖ 앰피실린을 함유하는 고체배지에서는 10⁰에서 2개의 클론만이 콜로니를 형성하였다. 따라서, 3 ㎎/㎖ 앰피실린을 함유하는 고체배지에서 선별 시 각 그룹으로 분류할 수 있을 것이라 판단하였다.

앰피실린 농도(2,000 ㎍/㎖) 고체배지에서 선별한 콜로니 1,889개를 상기와 같이 96 deep plate에 접종한 후 16 시간 동안 배양하였으며, 그 배양액 400 ㎕와 새로운 배지(2xYT) 400 ㎕을 혼합하여 OD가 0.2 될 때까지 배양하였다. 10^-0에서 10^-3까지 일련의 희석한 후 그 희석액들을 각각 5 ㎕씩 3 ㎎/㎖ 앰피실린 농도을 함유하는 고체배지에 spot하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 10^-2에서 큰 콜로니를 형성하는 클론 31개, 10^-2에서 작은 콜로니를 형성하는 클론 21개, 그리고 10^-1에서 큰 콜로니를 형성하는 클론 187개로, 각 희석배수에서 콜로니 크기별로 3개의 그룹을 선별하였다.

2.5. 염기서열 분석 후 소수성( hydrophobicity ) 분석

소수성 세포투과성 펩타이드를 수득하기 위하여, 이전 과정을 통해 각 그룹으로 선별된 콜로니들의 염기서열을 분석하여 아미노산으로 전환 후 소수성(hydrophobicity) 비율에 따라 소수성이 70% 이상 되는 클론(콜로니)들을 선별하기 위해 아미노산 서열을 분석하였다.

10^-2에서 큰 콜로니를 형성하는 클론 31개 중 29개, 10^-2에서 작은 콜로니를 형성하는 클론 21개 중 20개, 그리고 10^-1에서 큰 콜로니를 형성하는 클론 187개 중 43개를 염기서열 분석하였으며 peptide2 프로그램을 이용하여 각 클론에 대한 소수성을 분석하였다. 그 결과를 표 2에 나타내었다.

표 2에 나타낸 바와 같이, 10^-2에서 큰 콜로니를 형성하는 그룹 1에서는 클론 29개 중 27개가 70% 이상의 소수성을 가지고 있었으며, 10^-2에서 작은 콜로니를 형성하는 그룹 2에서는 클론 20개 중 18개가 그리고 10^-1에서 큰 콜로니를 형성하는 그룹 3에서는 클론 43개 중 30개가 70% 이상의 소수성을 가지고 있음을 확인하였다. 각 그룹에서 소수성이 70% 이상 되는 개수의 비율을 보면 그룹 1은 93.5%, 그룹 2는 90.4% 그리고 그룹 3은 69.7%인 것으로 나타났으며, 10^-1 보다는 10^-2에서, 그리고 10^-2에서는 큰 콜로니가 70% 이상 소수성 비율을 가지는 펩타이드를 많이 가지고 있었다. 따라서, 소수성 비율이 70% 이상인 그룹 1(10^-2에서 큰 콜로니를 형성)에서 클론 27개, 그룹 2(10^-2에서 작은 콜로니를 형성)에서 클론 18개, 그룹 3(10^-1에서 큰 콜로니를 형성)에서 클론 30개를 최종적으로 선별하였다.

선별된 3개의 그룹에서 확인되는 MTM 서열 정보를 표 3 내지 표 5 에 나타내었다.

Group 1 : 27 ea
서열번호	MTM	서열정보
1	M1-137	HLFFFILFFSII
2	M1-528	FTNIIFIFFLLI
3	M1-548	IFFMILMFFIFF
4	M1-600	YFFFYFILFFIL
5	M1-601	FINLLIFLLFMI
6	M1-783	FFYYLLFLYLIF
7	M1-816	FIFFLICFCLLLA
8	M1-885	MFYIFMIFILLF
9	M1-1157	IFFIFFIILFYL
10	M1-1181	FYIIFISLFFLL
11	M1-1319	YFLLFFLFLFSL
12	M1-1335	FIQFMYFILLFF
13	M1-1397	LFLFIIFFLSFL
14	M1-1405	SFFLLYILVLIF
15	M1-1914	YFIFLFIFFLLL
16	M1-2262	ILRFLFILIISL
17	M1-2346	FIFYFFIIFFFI
18	M1-2395	IFLYIILLFFIF
19	M1-2418	FYKYLLILLPIF
20	M1-2435	FIIFFLFIMLIF
21	M1-2511	LFKFSLYLILML
22	M1-2525	SYFYIFIILFFF
23	M1-2638	KFFYILMIFFLI
24	M1-3001	FFFFINFLSPI
25	M1-3003	LFLFIIFLLSLL
26	M1-3005	YYIFLLFCIFFL
27	M1-3007	FFFYFLILTLLF

Group 2 : 18 ea
서열번호	MTM	서열정보
28	M1-4	FFFITSFIFSIF
29	M1-37	FFYLLPFIIYFF
30	M1-486	HFLFILCLCFIF
31	M1-787	IYLFFLPMLFIS
32	M1-806	LFYMISFILFIL
33	M1-848	FYIYTFIFYLFF
34	M1-814	FWYVLFFSYLFF
35	M1-886	FIYFILFLFYFF
36	M1-1061	FYLSLFMLIFLL
37	M1-1277	PYNFFFLMFLLI
38	M1-1336	FYFFTSIFFFIL
39	M1-1426	IFSIIFFLYFFF
40	M1-1523	NFYYFFIFFFFI
41	M1-2378	YFFYLILLSFLF
42	M1-2484	FPFIFFIINILH
43	M1-2649	PYLCIIIIFFF
44	M1-2668	FFYFFLIIFYLL
45	M1-2671	IFIILFILLNFI

Group 3 : 30 ea
서열번호	MTM	서열정보
46	M1-79	FFNIFLILIMFF
47	M1-167	FFFYIYFLLFFF
48	M1-182	YFFLLYIIFFIL
49	M1-360	IFFKFLILFLIF
50	M1-406	TILLFFLLLSFL
51	M1-460	NFFFIFFFIILF
52	M1-483	FFYILILTFLFL
53	M1-484	LHFIIFFFLPIF
54	M1-538	IFLFFCMFYLLL
55	M1-542	YTFIIFLLFFFY
56	M1-579	IFNFFFMLFFFF
57	M1-603	SFFINFFFLFIL
58	M1-610	LPYLLFIYFFLF
59	M1-797	FYLLLLILIFSF
60	M1-807	FILFIFIFIFFT
61	M1-818	LFNFFSFMILLI
62	M1-824	FFFYFCSLILFF
63	M1-843	LFTIFMYFFFYF
64	M1-847	YFFFILFIYCM
65	M1-1007	FYLFLCILIYLL
66	M1-1016	FIHFFWIILFLL
67	M1-1213	IYKFNFFLFFLF
68	M1-1415	SFFFFYFITLIL
69	M1-1545	KIFFFCIIFMNL
70	M1-1842	FNIFLFFFILLM
71	M1-1889	FIIYLYIIFFLL
72	M1-2113	IFYILCIISFLL
73	M1-2475	YFIFMIFFLLFF
74	M1-2498	FFFMFFILFFYF
75	M1-2502	LFLFIIFFLSFL

상기 표 3 내지 표 5에 기재된 MTM 펩타이드는 모두 총 12개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 종래 소수성을 갖는 세포 투과성 펩타이드들이 알라닌(A), 발린 (V), 프롤린 (P) 를 주요 구성 아미노산으로 하는 것과 달리, 이들을 전혀 가지고 있지 않거나, 최대 1개만을 포함하고 있는 것을 확인하였다. 특히 본 발명의 MTM 펩타이드는 페닐알라닌 (F) 을 아미노산 내 최대 8까지 포함하고 있어, 페닐알라닌의 비율이 약 16 내지 67% 인 공통점을 가진 것을 확인하였다. 기존의 소수성 세포투과성 펩타이드들에 페닐알라닌이 거의 존재하지 않는 점에 비추어, 이는 본원 발명의 MTM의 독특한 특성임을 확인하였다.

실시예 3. MTM- Cre 융합 단백질 제조 후 세포투과성 검증

상기 실시예 2의 과정을 통해 선별된 소수성이 70% 이상 되는 MTM에 Cre을 융합하여 MTM-Cre 융합단백질을 제조한 후 pCMV/loxPTMT-GFP 벡터를 함유하는 세포에 처리 시, MTM-Cre 융합 단백질이 세포 안으로 전송될 수 있다. 세포 안으로 전송될 경우 전송된 Cre 단백질에 의해 loxP 재조합으로 loxPTMT가 제거되므로, GFP가 발현되는 양상으로 MTM이 Cre 단백질을 세포 내로의 이동을 매개하는지 확인하였다.

3.1 GFP 발현 벡터의 제조

pCMV/loxPTMT-GFP 벡터를 제조하기 위해, 하나의 loxP 서열을 포함하는 프라이머(loxPRFP-F)와 프라이머(loxPRFP-R)을 사용하여 loxP-Red (Tomato Red) 융합 유전자를 증폭하고 난 다음 Nco I으로 처리된 pEGFP-N1 벡터에 상동성 재조합 ligation 방법으로 Nco I 자리에 loxP-Red 유전자가 삽입된 벡터를 제조하였다. 이 벡터를 Sal I으로 처리하고 난 다음 프라이머(loxPSV-F)과 하나의 loxP가 함유하는 프라이머(loxPSV-R)로 SV poly A 유전자를 증폭하고 난 다음 상동성 재조합 ligation 방법으로 Sal I 자리에 클로닝을 하여 도 7과 같이 백터를 제조하였다. 벡터 제조를 위해 사용된 프라이머를 표 6에 나타내었다.

프라이머	염기서열(5'--- 3')
loxPRFP-F	TCG AGG ATC CAT GGG CAT AAC TTC GTA TAG CAT ACA TTA TAC GAA GTT ATC AAT GGC CTC CTC CGA GAA CGT CAT C
loxPRFP-R	AAA CGA ATT CTG ATA ACT TCG TAT AAT GTA TGC TAT ACG AAG TTA TGC CCT ACA GGA ACA GGT GGT GGC GGC CC
loxPSV-F	TCG ACT CGA GAT GGG CAT AAC TTC GTA TAG CAT ACA TTA TAC GAA GTT ATC AAT GGT GAG CAA GGG CGA GGA GCT G
loxPSV-R	ACC TGA ATT CTG ATA ACT TCG TAT AAT GTA TGC TAT ACG AAG TTA TGC CTT ACT TGT ACA GCT CGT CCA TGC CG

유전자 증폭은 다음과 같이 진행하였다. 주형 DNA 20 ng, 0.5 U DNA 중합효소, 각 2.5 mM의 4가지 dNTP 그리고 5 ㎕의 10× 반응버퍼로 구성하였으며, 증류수로 최종 부피가 50 ㎕ 되도록 보충하였다. PCR 반응은 95 ℃에서 5분 노출 후, 95 ℃에서 30초, 60 ℃에서 30초, 72 ℃에서 60초 노출을 30회 반복하였다. 증폭된 DNA는 1% 아가로즈 젤에서 전기영동으로 분리 후 젤 추출 키트(gel extraction kit)로 추출하였다. pCMV/loxPTMT-GFP 벡터는 일반적인 조건하에서는 CMV 프로모터에 의해 RFP인 TMT(Tomato Red) 만 발현되지만, Cre 단백질이 존재할 경우 loxP가 재조합 되어 벡터에서 loxPTMT-SV polyA가 제거되고 이러한 결과로 인해 CMV 프로모터에 의해 GFP 단백질이 발현되는 벡터이다.

상기 벡터가 Cre 단백질에 의해 loxPTMT-SV polyA가 제거되어 GFP가 발현되는지 확인하기 위해 pCMV/loxPTMT-GFP 벡터가 리포펙타민으로 형질전환된 293T 세포에 PBS 버퍼(음성 대조군), 박테리아 soluble 단백질 (BL21, 음성대조군), Tat-Cre가 발현 유도된 soluble 단백질(양성대조군)을 1시간 동안 처리한 후 GFP 발현을 확인하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 음성대조군에서는 RFP만이 발현되었으나, Tat-cre soluble 단백질을 처리한 군에서는 RFP와 GFP가 발현되는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 Tat에 의해 Cre 단백질이 세포 내로 이동이 매개되었으며 Cre 단백질에 의해 loxPTMT-SV polyA가 제거되어 GFP가 발현됨을 반영하는 것으로, loxP-Cre 시스템이 제대로 작동하는 것을 나타내는 결과이다. 또한 공백터를 함유하는 박테리아 soluble 단백질과 Tat-Cre 단백질 발현 유도한 박테리아 soluble 단백질들을 처리 시, Tat-Cre 단백질을 처리한 시료에서만 GFP의 발현을 확인할 수 있기에 정제한 단백질이 아닌 발현 유도한 soluble 단백질을 처리하여도 MTM 효능을 검증하는데 문제가 없음을 확인하였다.

3.2 MTM- Cre 단백질 발현 유도

실시예 2를 통해 소수성으로 최종 선별한 클론들 중 그룹 1에서 14개, 그룹 2에서 10개 그리고 그룹 3에서 19개 클론들을 임의로 선정하였다. 선정한 클론들을 주형으로 하여 하기 표 7에 있는 프라이머 M-a2와 M-b1을 사용하면서 lac-uv5프로모터-MTM 유전자를 증폭하였으며, Xba I/Nco I으로 절단하여 pET28b/Cre의 Xba I과 Nco I 자리에 클로닝 하였다.

프라이머	염기 서열(5'--- 3')
M-a2	CTG CCG TCT AGA TGT AGC ACC TGA AGT CAG
M-b1	CGA GCC CAT GGT AAA AAC AGG TCC TCC GCC

클로닝한 pET28b-Cre/MTM 총 43개 클론들을 박테리아 발현 균주인 BL21(DE)로 형질전환을 하고 난 다음 발현을 각각 유도하였다. 구체적으로 형질전환된 박테리아 균주의 콜로니를 카나마이신이 함유하는 3 ㎖ LB에 접종하고 난 다음 37 ℃에서 220 rpm으로 16 시간 동안 배양하였다. 그 배양액을 카나마이신이 함유하는 100 ㎖ LB에 0.1% (v/v)이 되게 접종하고 OD가 0.6될 때까지 배양한 다음 IPTG 최종농도가 1 mM되게 첨가하여 37 ℃에서 220 rpm으로 3 시간 동안 추가 배양하여 발현을 유도하였다. 그 배양액을 3,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 박테리아 세포들을 수득하고 난 다음 PBS 버퍼 15 ㎖에 현탁하였고, sonicator를 사용하면서 박테리아 세포들을 파쇄하였다. 그 파쇄액을 10,000 rpm에서 10분간 원심분리하고 상등액을 취해 0.45 ㎛ 일회용 실린지 필터로 필터를 하고 난 다음 12% SDS-PAGE로 발현 정도를 확인하였으며 그 결과를 도 9 에 나타내었다.

도 9에 나타낸 바와 같이, MTM-Cre 단백질의 발현은 MTM에 따라 발현 정도가 상이한 것을 확인하였다.

3.3 GFP 발현을 이용한 세포 투과성 확인

MTM에 따라 발현정도가 상이한 MTM-Cre 단백질을 같은 양으로 보정하여 pCMV/loxPTMT-GFP 벡터가 transfection된 293T 세포에 처리하였을 시, MTM-Cre 융합단백질이 세포안으로 전송되어, 그 결과로 GFP 발현이 유도되는지 확인하였다.

구체적으로 24 well plate에 1X10⁵ 293T cells/well를 계대 배양하여 준비한 후 well 당 0.5 ug pCMV/loxPTMT-GFP 백터를 리포펙타민으로 형질전환하였다. 다음날 배양액을 제거한 후 농도를 맞춘 개별 MTM-Cre soluble 단백질, Tat-Cre soluble 단백질 및 PBS 버퍼를 DMEM 배지와 혼합한 혼합배지를 첨가하고 1시간 동안 CO₂배양기에서 배양한 후 PBS 버퍼로 3번 세척을 한 다음 새로운 DMEM 배지로 교환하여 overnight 배양하였다. 그 배양한 세포들에 대해 RFP(Red) 및 GFP 형광 발현 정도를 형광 현미경으로 관찰하였으며, 그 결과를 도 10에 나타내었다.

도 10에 나타낸 바와 같이, 음성대조군인 PBS 버퍼와 BL21(DE3) soluble 단백질에서는 GFP 발현정도를 확인할 수 없었으나 양성대조군인 Tat-Cre soluble 단백질에서는 GFP 발현을 확인할 수 있었다. 또한, 처리한 시료 MTM-Cre soluble 단백질 43개에서 모두 GFP 가 발현되었으며, 그 중 22 개는 Tat-Cre와 유사하거나 월등히 많은 GFP가 발현되는 것을 확인하였다. 우수한 GFP 발현을 나타내는 총 22개의 MTM 의 정보를 하기 표 8에 나타내었다.

서열번호	MTM	서열정보
28	MTM4	FFFITSFIFSIF
1	MTM137	HLFFFILFFSII
50	MTM406	TILLFFLLLSFL
2	MTM528	FTNIIFIFFLLI
4	MTM600	YFFFYFILFFIL
6	MTM783	FFYYLLFLYLIF
59	MTM797	FYLLLLILIFSF
34	MTM814	FWYVLFFSYLFF
7	MTM816	FIFFLICFCLLL
33	MTM848	FYIYTFIFYLFF
10	MTM1181	FYIIFISLFFLL
71	MTM1889	FIIYLYIIFFLL
72	MTM2113	IFYILCIISFLL
41	MTM2378	YFFYLILLSFLF
20	MTM2435	FIIFFLFIMLIF
73	MTM2475	YFIFMIFFLLFF
74	MTM2498	FFFMFFILFFYF
23	MTM2638	KFFYILMIFFLI
24	MTM3001	FFFFFINFLSPI
25	MTM3003	LFLFIIFLLSLL
26	MTM3005	YYIFLLFCIFFL
27	MTM3007	FFFYFLILTLLF

상기와 같이 높은 GFP 전달 효율을 갖는 MTM 들은 모두 총 12개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 소수성이 70% 이상이고, 페닐알라닌 (F) 을 아미노산 내 최소 2 개 내지 최대 8 개를 포함 (16 내지 67%) 하는 특징으로 가지고 있으며, 알라닌(A) 을 포함하지 않고, 발린 (V) 및 프롤린 (P) 을 포함하지 않거나, 1개만 포함하는 공통적인 특징을 가진 것을 확인하였다.

이와 같은 결과는 본 발명의 방법에 의해 제조 및 선별된 MTM을 이용한 MTM-Cre 융합 단백질이 MTM의 매개로 세포 내로 이동하고 전달된 Cre 단백질의 활성으로 loxP을 인지하여 상동성 재조합 과정으로 loxPTMT-SV polyA가 제거되어 GFP가 발현될 수 있음을 보여주는 결과이다. 즉, 본 발명의 방법에 따른 MTM-bla 라이브러리를 제조 후 앰피실린 내성으로 박테리아에서 세포 투과성 펩타이드를 선별할 수 있다는 것을 확인할 수 있다.

실시예 4. 선별된 MTM의 세포 투과성 검증

소수성 세포투과성 펩타이드의 경우, cargo (세포내로 전달할 물질)에 따라 CPP 기능이 상실되는 경우가 있음이 알려져 있다. 이에 따라 상기에서 확인한 MTM-Cre 융합단백질 22개 중 15개에 대해 cargo를 Bla로 하였을 때 MTM-Bla가 세포 내로 전송이 되는지 확인하여, 선별된 MTM 의 세포 투과성을 검증하였다.

4.1 MTM- bla 단백질 발현 및 정제

MTM-Cre 융합단백질 22개 중 15개에 대한 pBIB/MTM-bla 벡터를 Nde I/Sal I으로 절단하여 MTM-bla 유전자를 수득한 다음 pET41a 벡터의 Nde I/Sal I 자리에 클로닝 하였으며, 제조된 벡터를 도 11에 나타내었으며, 실험에 이용한 15개의 MTM 의 정보를 하기 표 9에 나타내었다.

서열번호	MTM	서열정보
28	MTM4	FFFITSFIFSIF
1	MTM137	HLFFFILFFSII
50	MTM406	TILLFFLLLSFL
2	MTM528	FTNIIFIFFLLI
4	MTM600	YFFFYFILFFIL
6	MTM783	FFYYLLFLYLIF
59	MTM797	FYLLLLILIFSF
34	MTM814	FWYVLFFSYLFF
7	MTM816	FIFFLICFCLLL
33	MTM848	FYIYTFIFYLFF
10	MTM1181	FYIIFISLFFLL
41	MTM2378	YFFYLILLSFLF
20	MTM2435	FIIFFLFIMLIF
24	MTM3001	FFFFFINFLSPI
27	MTM3007	FFFYFLILTLLF

클로닝한 pET41a/MTM-bla 재조합 벡터들을 박테리아 발현 균주인 BL21(DE)로 형질전환한 후, 하기와 같이 각각 발현 유도 및 정제하였다.

형질전환된 박테리아 균주의 콜로니를 카나마이신을 함유하는 3 ㎖ LB에 접종하고 난 다음 37 ℃에서 220 rpm으로 16 시간 동안 배양하였다. 그 배양액을 카나마이신이 함유하는 100 ㎖ LB에 0.1% (v/v)이 되게 접종하고 OD가 0.6될 때까지 배양한 다음 IPTG 최종농도가 1 mM되게 첨가하여 37 ℃에서 220 rpm으로 3 시간 동안 추가 배양하면서 발현을 유도하였다. 그 배양액을 3,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 박테리아 세포들을 수득하였고, 수득한 균주에 결합완충액(binding buffer) [20mM Tris-HCl (pH 7.9), 500mM NaCl, 30mM Imidazole]을 첨가하여 현탁하고 초음파분해기(sonicator)를 이용하여 20분간 세포를 파쇄한 후 초고속원심분리기(centrifuge)에서 6,000rpm으로 20분간 회전시켜 파쇄된 균주의 상층액을 회수하였다. 회수된 상층액은 용해완충액[50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 10mM Imidazole, pH 8.0]으로 평형을 유지시킨 6개 히스티딘 아미노산에 친화성 크로마토그래피인 Ni-NTA 세파로오스 컬럼(Shepharose column)에 흡착시키고, 세척 완충액(washing buffer) [0.1M Tris-HCl (pH7.5), 0.5M NaCl, 20mM Imidazole, 0.1% Tween20], [0.1M Tris-HCl (pH7.5), 0.5M NaCl, 20mM Imidazole], [0.1M Tris-HCl(pH8.0), 0.5M NaCl, 20mM Imidazole, 0.1% Tween20], [0.1M Tris-HCl (pH 8.0), 0.5M NaCl, 20mM Imidazole]을 10 ㎖씩 첨가하여 레진을 세척하였다. 용출 완충액(Elution buffer) [50mM NaH₂PO₄, 300mM NaCl, 250mM Imidazole, pH 8.0]을 사용하여 Ni-NTA column에 부착된 재조합 단백질을 회수하였고 PBS 완충액으로 투석하였다. 정제한 MTM-bla 융합단백질은 12% SDS-PAGE로 분리하여 확인하였으며, 그 결과를 도 12에 나타내었다.

도 12에 나타낸 바와 같이, 정제된 MTM-bla 단백질이 각각 확인되었다.

4.2 FITC 표지 후 세포 투과성 확인

중탄산염-탄산염 완충액[0.1M Carbonate-bicarbonate buffer (pH9.0)]으로 투석 완료된 MTM-Bla 정제 융합 단백질을 1 ㎎/㎖의 농도로 맞추고, 1 ㎎/㎖ FITC(in DMSO)를 제작하여, 1.5 ㎖ amber Tube에 MTM-bla 융합 단백질 1 ㎖과 FITC 30 ㎕(1 ㎎/㎖ FITC in DMSO)를 넣어주고, 상온에서 2시간 동안 rotation 하면서 반응시켰다. 세파덱스 G-25 (Sephadex G-25)를 이용하여 컬럼(column)을 제작한 후 FITC-융합단백질 반응액들을 젤 필터레이션 (gel-filteration)으로 표지가 되지 않은 FITC들을 제거하고 FITC 표지가 된 MTM-Bla 융합 단백질들은 fraction을 받아 수득하였다. 양성대조군으로 Tat-Bla 융합단백질은 상시와 같은 방법으로 FITC를 표지하였으며, 음성대조군으로 사용할 시료는 단백질 없이 상기와 같이 같은 방법으로 fraction을 받아 사용하였다. FITC가 표지된 정도를 12% SDS-PAGE로 분리한 후 UV로 각각을 확인하였다.

12-well plate에 well 당 1x10⁵로 Hela 세포를 접종하여 배양한 다음 FITC가 표지된 MTM-Bla 융합 단백질(17 ng)과 Tat-Bla 융합 단백질(양성 대조군) 및 단백질 없이 반응 후 수득한 fraction(음성 대조군)을 1 시간 동안 처리 후 PBS 버퍼로 3회 세척하였다. Trypsin-EDTA 용액으로 세포를 plate에서 분리하고 2,000 rpm으로 3 분간 원심분리 하여 pellet를 0.2% FBS가 함유된 PBS에 현탁하여 세포 현탁액을 준비하였다. 세포 현탁액들을 Aria III FACS 기기를 사용하여 10,000개의 세포에 대해 FITC의 강도를 측정하였으며, 그 결과를 도 13에 나타내었다.

도 13에 나타낸 바와 같이, 양성 대조군(Tat-Bla)은 음성대조군에 비해 그래프가 오른쪽으로 이동하였다. 이와 동일하게 15개의 MTM-Bla 시료를 처리한 세포에서도 모두 오른쪽으로 그래프가 이동되었음을 확인하였고, 이를 통해 cargo로서 Cre 단백질을 융합하거나 Bla 단백질을 융합하더라도 선별된 본 발명의 MTM은 모두 세포 내로 이동을 매개한다는 것을 확인하였다. 특히 MTM 600, MTM783, MTM848, MTM2378, MTM2435, MTM3007은 양성대조군인 Tat-Bla 보다 훨씬 이동을 매개하는 정도가 뛰어난 것을 확인하였다.

추가적으로 FITC가 표지된 MTM-Bla 융합단백질 15개 중에 8개 시료들을 37 ℃에서 1 시간 동안 Hela 세포에 처리한 후 세포 내로 전송된 정도를 형광 공초점 현미경으로 확인하였으며, 그 결과를 도 14에 나타내었고, 사용한 8개의 MTM을 하기 표 10에 나타내었다.

서열번호	MTM	서열정보
50	MTM406	TILLFFLLLSFL
4	MTM600	YFFFYFILFFIL
6	MTM783	FFYYLLFLYLIF
33	MTM848	FYIYTFIFYLFF
41	MTM2378	YFFYLILLSFLF
18	MTM2395	IFLYIILLFFIF
24	MTM3001	FFFFFINFLSPI
27	MTM3007	FFFYFLILTLLF

도 14에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 MTM 시료들은 8개 시료 모두 세포 안으로 효과적으로 전달된 것을 확인하였다. 또한 FACS로 분석한 결과와 유사하게 MTM 600, MTM783, MTM848, MTM2378, MTM2395, MTM3007은 양성대조군인 Tat-Bla 보다 세포내 전송능이 훨씬 높은 것을 확인하였다.

4.3 에너지 비의존적 cago 전달능 확인

Tat와 같은 양이온성 세포 투과성 펩타이드 (Cell penetrating peptide, CPP)들은 에너지 의존적 방법으로 CPP-cargo들을 내재화(endocytosis)하여 cargo들은 세포안으로 전송하나, 소수성 CPP들은 에너지 비의존적인 방법으로 cargo들을 세포안으로 전송하기 때문에 이를 확인하고자 하였다. 따라서, 양성대조군인 Tat-Bla 보다 세포내 전송능이 좋은 MTM 600, MTM783, MTM848, MTM2378, MTM2395, MTM3007의 시료에 대해 FITC로 표지한 후 4 ℃에서 1시간 동안 Hela 세포에 처리한 후 세포 내로 전송된 정도를 형광 공초점 현미경으로 확인하였으며, 그 결과를 도 15에 나타내었다.

도 15에 나타낸 바와 같이, 에너지 의존방법으로 내재화하여 전송하는 양성대조군(Tat-bla)은 cargo들을 세포내로 전송하지 못하는 반면에 본 발명의 6개 MTM 시료들은 cargo를 세포내로 모두 전송하는 것을 확인할 수 있었다.

상기 8 개의 세포 투과성을 갖는 MTM 들은 모두 총 12개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 소수성이 70% 이상이고, 페닐알라닌 (F) 을 아미노산 내 최소 3 개 내지 최대 6 개를 포함 (25 내지 50%) 하는 특징으로 가지고 있으며, 알라닌(A) 및 발린 (V) 을 포함하지 않고, 프롤린 (P) 을 포함하지 않거나, 1개만 포함하는 공통적인 특징을 가진 것을 확인하였다.

상기와 같은 결과는, 본 발명에 따른 MTM-bla 라이브러리를 제조하고, 앰피실린 내성여부의 검증을 통해 박테리아에서 세포 투과성 펩타이드를 선별할 수 있다는 것을 나타내는 결과이며, 이와 같은 방법을 이용하면, 총 12개 길이, 70% 이상의 소수성을 가지면서 페닐알라닌을 전체 아미노산 중 15-70%로 포함하고 알라닌, 발린 및 프롤린을 0 또는 1 개 포함하는 공통적인 특징을 가진 MTM 을 효과적으로 제조 및 선별할 수 있음을 확인하였다.

<110> Frombio Co., Ltd <120> A Cell penetrating peptide and high throughput screening method thereof <130> Prombio1-1P <160> 79 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-137 <400> 1 His Leu Phe Phe Phe Ile Leu Phe Phe Ser Ile Ile 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-528 <400> 2 Phe Thr Asn Ile Ile Phe Ile Phe Phe Leu Leu Ile 1 5 10 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-548 <400> 3 Ile Phe Phe Met Ile Leu Met Phe Phe Ile Phe Phe 1 5 10 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-600 <400> 4 Tyr Phe Phe Phe Tyr Phe Ile Leu Phe Phe Ile Leu 1 5 10 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-601 <400> 5 Phe Ile Asn Leu Leu Ile Phe Leu Leu Phe Met Ile 1 5 10 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-783 <400> 6 Phe Phe Tyr Tyr Leu Leu Phe Leu Tyr Leu Ile Phe 1 5 10 <210> 7 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-816 <400> 7 Phe Ile Phe Phe Leu Ile Cys Phe Cys Leu Leu Leu Ala 1 5 10 <210> 8 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-885 <400> 8 Met Phe Tyr Ile Phe Met Ile Phe Ile Leu Leu Phe 1 5 10 <210> 9 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-1157 <400> 9 Ile Phe Phe Ile Phe Phe Ile Ile Leu Phe Tyr Leu 1 5 10 <210> 10 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-1181 <400> 10 Phe Tyr Ile Ile Phe Ile Ser Leu Phe Phe Leu Leu 1 5 10 <210> 11 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-1319 <400> 11 Tyr Phe Leu Leu Phe Phe Leu Phe Leu Phe Ser Leu 1 5 10 <210> 12 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-1335 <400> 12 Phe Ile Gln Phe Met Tyr Phe Ile Leu Leu Phe Phe 1 5 10 <210> 13 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-1397 <400> 13 Leu Phe Leu Phe Ile Ile Phe Phe Leu Ser Phe Leu 1 5 10 <210> 14 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-1405 <400> 14 Ser Phe Phe Leu Leu Tyr Ile Leu Val Leu Ile Phe 1 5 10 <210> 15 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-1914 <400> 15 Tyr Phe Ile Phe Leu Phe Ile Phe Phe Leu Leu Leu 1 5 10 <210> 16 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-2262 <400> 16 Ile Leu Arg Phe Leu Phe Ile Leu Ile Ile Ser Leu 1 5 10 <210> 17 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-2346 <400> 17 Phe Ile Phe Tyr Phe Phe Ile Ile Phe Phe Phe Ile 1 5 10 <210> 18 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-2395 <400> 18 Ile Phe Leu Ser Thr Cys Ser Leu Leu Phe Asn Phe 1 5 10 <210> 19 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-2418 <400> 19 Phe Tyr Lys Tyr Leu Leu Ile Leu Leu Pro Ile Phe 1 5 10 <210> 20 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-2435 <400> 20 Phe Ile Ile Phe Phe Leu Phe Ile Met Leu Ile Phe 1 5 10 <210> 21 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-2511 <400> 21 Leu Phe Lys Phe Ser Leu Tyr Leu Ile Leu Met Leu 1 5 10 <210> 22 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-2525 <400> 22 Ser Tyr Phe Tyr Ile Phe Ile Ile Leu Phe Phe Phe 1 5 10 <210> 23 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-2638 <400> 23 Lys Phe Phe Tyr Ile Leu Met Ile Phe Phe Leu Ile 1 5 10 <210> 24 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-3001 <400> 24 Phe Phe Phe Phe Ile Asn Phe Leu Ser Pro Ile 1 5 10 <210> 25 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-3003 <400> 25 Leu Phe Leu Phe Ile Ile Phe Leu Leu Ser Leu Leu 1 5 10 <210> 26 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-3005 <400> 26 Tyr Tyr Ile Phe Leu Leu Phe Cys Ile Phe Phe Leu 1 5 10 <210> 27 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-3007 <400> 27 Phe Phe Phe Tyr Phe Leu Ile Leu Thr Leu Leu Phe 1 5 10 <210> 28 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-4 <400> 28 Phe Phe Phe Ile Thr Ser Phe Ile Phe Ser Ile Phe 1 5 10 <210> 29 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-37 <400> 29 Phe Tyr Ile Tyr Thr Phe Ile Phe Tyr Leu Phe Phe 1 5 10 <210> 30 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-486 <400> 30 His Phe Leu Phe Ile Leu Cys Leu Cys Phe Ile Phe 1 5 10 <210> 31 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-787 <400> 31 Ile Tyr Leu Phe Phe Leu Pro Met Leu Phe Ile Ser 1 5 10 <210> 32 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-806 <400> 32 Leu Phe Tyr Met Ile Ser Phe Ile Leu Phe Ile Leu 1 5 10 <210> 33 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-848 <400> 33 Phe Tyr Ile Tyr Thr Phe Ile Phe Tyr Leu Phe Phe 1 5 10 <210> 34 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-814 <400> 34 Phe Trp Tyr Val Leu Phe Phe Ser Tyr Leu Phe Phe 1 5 10 <210> 35 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-886 <400> 35 Phe Ile Tyr Phe Ile Leu Phe Leu Phe Tyr Phe Phe 1 5 10 <210> 36 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-1061 <400> 36 Phe Tyr Leu Ser Leu Phe Met Leu Ile Phe Leu Leu 1 5 10 <210> 37 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-1277 <400> 37 Pro Tyr Asn Phe Phe Phe Leu Met Phe Leu Leu Ile 1 5 10 <210> 38 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-1336 <400> 38 Phe Tyr Phe Phe Thr Ser Ile Phe Phe Phe Ile Leu 1 5 10 <210> 39 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-1426 <400> 39 Ile Phe Ser Ile Ile Phe Phe Leu Tyr Phe Phe Phe 1 5 10 <210> 40 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-1523 <400> 40 Asn Phe Tyr Tyr Phe Phe Ile Phe Phe Phe Phe Ile 1 5 10 <210> 41 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-2378 <400> 41 Tyr Phe Phe Tyr Leu Ile Leu Leu Ser Phe Leu Phe 1 5 10 <210> 42 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-2484 <400> 42 Phe Pro Phe Ile Phe Phe Ile Ile Asn Ile Leu His 1 5 10 <210> 43 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-2649 <400> 43 Pro Tyr Leu Cys Ile Ile Ile Ile Phe Phe Phe 1 5 10 <210> 44 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-2668 <400> 44 Phe Phe Tyr Phe Phe Leu Ile Ile Phe Tyr Leu Leu 1 5 10 <210> 45 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-2671 <400> 45 Ile Phe Ile Ile Leu Phe Ile Leu Leu Asn Phe Ile 1 5 10 <210> 46 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-79 <400> 46 Phe Phe Asn Ile Phe Leu Ile Leu Ile Met Phe Phe 1 5 10 <210> 47 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-167 <400> 47 Phe Phe Phe Tyr Ile Tyr Phe Leu Leu Phe Phe Phe 1 5 10 <210> 48 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-182 <400> 48 Tyr Phe Phe Leu Leu Tyr Ile Ile Phe Phe Ile Leu 1 5 10 <210> 49 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-360 <400> 49 Ile Phe Phe Lys Phe Leu Ile Leu Phe Leu Ile Phe 1 5 10 <210> 50 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-406 <400> 50 Thr Ile Leu Leu Phe Phe Leu Leu Leu Ser Phe Leu 1 5 10 <210> 51 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-460 <400> 51 Asn Phe Phe Phe Ile Phe Phe Phe Ile Ile Leu Phe 1 5 10 <210> 52 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-483 <400> 52 Phe Phe Tyr Ile Leu Ile Leu Thr Phe Leu Phe Leu 1 5 10 <210> 53 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-484 <400> 53 Leu His Phe Ile Ile Phe Phe Phe Leu Pro Ile Phe 1 5 10 <210> 54 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-538 <400> 54 Ile Phe Leu Phe Phe Cys Met Phe Tyr Leu Leu Leu 1 5 10 <210> 55 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-542 <400> 55 Tyr Thr Phe Ile Ile Phe Leu Leu Phe Phe Phe Tyr 1 5 10 <210> 56 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-579 <400> 56 Ile Phe Asn Phe Phe Phe Met Leu Phe Phe Phe Phe 1 5 10 <210> 57 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-603 <400> 57 Ser Phe Phe Ile Asn Phe Phe Phe Leu Phe Ile Leu 1 5 10 <210> 58 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-610 <400> 58 Leu Pro Tyr Leu Leu Phe Ile Tyr Phe Phe Leu Phe 1 5 10 <210> 59 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-797 <400> 59 Phe Tyr Leu Leu Leu Leu Ile Leu Ile Phe Ser Phe 1 5 10 <210> 60 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-807 <400> 60 Phe Ile Leu Phe Ile Phe Ile Phe Ile Phe Phe Thr 1 5 10 <210> 61 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-818 <400> 61 Leu Phe Asn Phe Phe Ser Phe Met Ile Leu Leu Ile 1 5 10 <210> 62 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-824 <400> 62 Phe Phe Phe Tyr Phe Cys Ser Leu Ile Leu Phe Phe 1 5 10 <210> 63 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-843 <400> 63 Leu Phe Thr Ile Phe Met Tyr Phe Phe Phe Tyr Phe 1 5 10 <210> 64 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-847 <400> 64 Tyr Phe Phe Phe Ile Leu Phe Ile Tyr Cys Met 1 5 10 <210> 65 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-1007 <400> 65 Phe Tyr Leu Phe Leu Cys Ile Leu Ile Tyr Leu Leu 1 5 10 <210> 66 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-1016 <400> 66 Phe Ile His Phe Phe Trp Ile Ile Leu Phe Leu Leu 1 5 10 <210> 67 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-1213 <400> 67 Ile Tyr Lys Phe Asn Phe Phe Leu Phe Phe Leu Phe 1 5 10 <210> 68 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-1415 <400> 68 Ser Phe Phe Phe Phe Tyr Phe Ile Thr Leu Ile Leu 1 5 10 <210> 69 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-1545 <400> 69 Lys Ile Phe Phe Phe Cys Ile Ile Phe Met Asn Leu 1 5 10 <210> 70 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-1842 <400> 70 Phe Asn Ile Phe Leu Phe Phe Phe Ile Leu Leu Met 1 5 10 <210> 71 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-1889 <400> 71 Phe Ile Ile Tyr Leu Tyr Ile Ile Phe Phe Leu Leu 1 5 10 <210> 72 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-2113 <400> 72 Ile Phe Tyr Ile Leu Cys Ile Ile Ser Phe Leu Leu 1 5 10 <210> 73 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-2475 <400> 73 Tyr Phe Ile Phe Met Ile Phe Phe Leu Leu Phe Phe 1 5 10 <210> 74 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-2498 <400> 74 Phe Phe Phe Met Phe Phe Ile Leu Phe Phe Tyr Phe 1 5 10 <210> 75 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-2502 <400> 75 Leu Phe Leu Phe Ile Ile Phe Phe Leu Ser Phe Leu 1 5 10 <210> 76 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bla-a1 primer <400> 76 cgacatatga gtattcaaca tttccgt 27 <210> 77 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bla-a2 primer <400> 77 cgacatatgc ctggttttgc tcaccca 27 <210> 78 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bla-b3 primer <400> 78 caggtcgacc caatggttaa tcagtga 27 <210> 79 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bla-a1-1 primer <400> 79 cgacatatgn nknnknnknn knnknnknnk nnknnknnkn nknnkggcgg aggacctggt 60 tttgctcacc ca 72

Claims

1) 10 내지 15개의 무작위 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 코딩하는 세포 투과성 펩타이드 (Cell penetrating peptide, CPP) 후보 유전자와 제1 항생제 선별 마커 유전자를 융합하여 CPP-제1 항생제 선별 마커 유전자 라이브러리를 제조하는 단계;
2) 상기 1) 단계에서 제조된 CPP-제1 항생제 선별 마커 유전자를 증폭하는 단계;
3) 상기 2) 단계에서 증폭된 CPP-제1 항생제 선별 마커 유전자를 제1 항생제와 상이한 제2 항생제 선별 마커 유전자를 포함하는 벡터에 삽입하는 단계;
4) 상기 3) 단계의 벡터를 박테리아에 형질전환시키는 단계;
5) 상기 4) 단계의 형질전환된 박테리아를 3) 단계의 제2 항생제 선별 마커에 대응되는 제2 항생제를 포함하는 배지에서 배양하여 제2 항생제 내성 콜로니를 선별하는 단계;
6) 상기 5) 단계에서 선별된 콜로니를 제1 항생제 선별 마커에 대응되는 제1 항생제를 포함하는 배지에서 배양하여 제1 항생제 내성 콜로니를 선별하는 단계; 및
7) 상기 6) 단계에서 선별된 콜로니에 삽입된 CPP 후보 유전자가 코딩하는 CPP 펩타이드 중 70% 이상의 소수성을 나타내는 CPP 펩타이드를 선별하는 단계; 를 포함하는 세포 투과성 펩타이드의 스크리닝 방법.

제1항에 있어서, 상기 제1 항생제 선별 마커 유전자는 베타 락타마제를 코딩하는 유전자이며, 제1 항생제는 베타 락탐 계열 항생제인 것을 특징으로 하는, 세포 투과성 펩타이드의 스크리닝 방법.

제1항에 있어서, 상기 제2 항생제 선별 마커 유전자는 에리트로마이신 저항성 유전자, 카나마이신 저항성 유전자, 클로람페니콜 저항성 유전자, 카베니실린 저항성 유전자, 스트렙토마이신 저항성 유전자 및 테트라사이클린 저항성 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 세포 투과성 펩타이드의 스크리닝 방법.

제1항에 있어서, 상기 제2 항생제는 에리트로마이신, 카나마이신, 클로람페니콜, 카베니실린, 스트렙토마이신 및 테트라사이클린으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 세포 투과성 펩타이드의 스크리닝 방법.

제2항에 있어서, 상기 2) 단계의 증폭은 서열번호 78 및 서열번호 79의 프라이머를 이용하여 증폭되는 것을 특징으로 하는, 세포 투과성 펩타이드의 스크리닝 방법.

제1항에 있어서, 상기 7) 단계의 70% 이상의 소수성을 나타내는 CPP 펩타이드는 전체 아미노산 중 페닐알라닌을 15 내지 70% 로 포함하며, 알라닌, 발린 및 프롤린을 0 개 또는 1개 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포 투과성 펩타이드의 스크리닝 방법.

제1항에 있어서, 상기 7) 단계의 70% 이상의 소수성을 나타내는 CPP 펩타이드는 전체 아미노산 중 페닐알라닌을 15 내지 70% 로 포함하며, 알라닌을 포함하지 않고, 발린 및 프롤린을 0 개 또는 1개 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포 투과성 펩타이드의 스크리닝 방법.

제1항에 있어서, 상기 세포 투과성 펩타이드는 세포 인지질 이중층 투과능을 갖는 것을 특징으로 하는, 세포 투과성 펩타이드의 스크리닝 방법.

제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법으로 스크리닝된 세포 투과성 펩타이드로,
상기 세포투과성 펩타이드는 10 내지 15개 길이의 아미노산 서열로 이루어지며, 상기 아미노산 서열은 70% 이상의 소수성을 나타내고, 전체 아미노산 중 페닐알라닌을 15 내지 70% 로 포함하며, 알라닌, 발린 및 프롤린을 0 개 또는 1개 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포 투과성 펩타이드.

제9항의 세포 투과성 펩타이드를 포함하는 세포막 투과 개선용 조성물.

제10항에 있어서, 상기 조성물은 세포 투과성 펩타이드와 융합된 생물학적 활성 물질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포막 투과 개선용 조성물.

10 내지 15개 길이의 아미노산 서열로 이루어지며, 상기 아미노산 서열은 70% 이상의 소수성을 나타내고, 전체 아미노산 중 페닐알라닌을 15 내지 70% 로 포함하며, 알라닌, 발린 및 프롤린을 0 개 또는 1개 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포 투과성 펩타이드.

제12항에 있어서, 상기 세포 투과성 펩타이드는 12개 길이의 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 세포 투과성 펩타이드.

제12항에 있어서, 상기 세포 투과성 펩타이드는 서열번호 1 내지 서열번호 75로 표시되는 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종인 것을 특징으로 하는, 세포 투과성 펩타이드.

제12항에 있어서, 상기 세포 투과성 펩타이드는 전체 아미노산 중 페닐알라닌을 15 내지 70% 로 포함하며, 알라닌을 포함하지 않고, 발린 및 프롤린을 0 개 또는 1개 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포 투과성 펩타이드.

제15항에 있어서, 상기 세포 투과성 펩타이드는 하기 표에 나타낸 세포 투과성 펩타이드 중 선택된 1종인 것을 특징으로 하는, 세포 투과성 펩타이드.
[표]

제12항 내지 제16항 중 어느 한 항의 세포 투과성 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.

제17항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.

제12항 내지 제16항 중 어느 한 항의 세포 투과성 펩타이드를 포함하는 세포막 투과 개선용 조성물.

제19항에 있어서, 상기 조성물은 세포 투과성 펩타이드와 융합된 생물학적 활성 물질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포막 투과 개선용 조성물.

제20항에 있어서, 상기 생물학적 활성 물질은 유전자 재조합 효소, 전사인자, 독소, 펩타이드, 전장항체, 항체 절편(scFv), 단일도메인 항체(sdAb), 신호(signaling) 단백질, 신호 억제 단백질, 염증 억제 단백질, 펩타이드, 폴리펩타이드, 핵산, mRNA 및 안티센스 RNA 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 세포막 투과 개선용 조성물.

제12항 내지 제16항 중 어느 한 항의 세포 투과성 펩타이드와 생물학적 활성 물질을 융합하는 단계; 를 포함하는 세포막 투과 개선용 조성물의 제조방법.

1) 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항의 세포 투과성 펩타이드와 생물학적 활성 물질을 융합하는 단계; 및
2) 상기 1) 단계에서 제조된 세포 투과성 펩타이드와 생물학적 활성 물질 융합체를 세포에 처리하는 단계를 포함하는 생물학적 활성 물질의 세포막 투과도를 높이는 방법.