PL206761B1 - Sposób ekstrahowania i oczyszczania rekombinowanego łożyskowego czynnika wzrostu i rekombinowany łożyskowy czynnik wzrostu otrzymany tym sposobem - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób ekstrahowania i oczyszczania rekombinowanego łożyskowego czynnika wzrostu w aktywnej postaci dimerycznej i multimerycznej oraz rekombinowany łożyskowy czynnik wzrostu otrzymany tym sposobem.

Dziedzina wynalazku

Niniejszy wynalazek odnosi się do sposobu ekstrahowania i oczyszczania rekombinowanego łożyskowego czynnika wzrostu z komórek modyfikowanych genetycznie.

Stan techniki

Łożyskowy czynnik wzrostu (PLGF) jest homodimeryczną glikoproteiną o strukturze podobnej do czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF). Pełną sekwencję polinukleotydową kodującą białko PLGF opisali Maglione i Persico w opisie patentowym EP-B-550 519 (WO-A-92/06194) zastrzegającym pierwszeństwo z Włoch z 27.09.1990. Alternatywne procesy splicingu ARN PLGF tworzą trzy postacie homologiczne łożyskowego czynnika wzrostu, dokładnie PLGF-1, PLGF-2 i PLGF-3, mające inne sekwencje polipeptydowe i wszystkie opisane są w literaturze.

Wyżej wymieniony opis patentowy opisuje także metodę wytwarzania czynnika PLGF obejmującą stosowanie indukowalnego prokariotycznego układu ekspresyjnego, charakteryzującego się komórkami gospodarza zmodyfikowanymi wektorem ekspresyjnym, z którym zintegrowany jest ludzki gen PLGF, pod kontrolą promotora indukowalnego (bezpośrednio lub pośrednio). Po indukowaniu ekspresji PLGF odpowiednim aktywatorem, komórki inkubuje się, izoluje i poddaje lizie.

Tak otrzymany surowy lizat jest złożoną mieszaniną białek zawierającą małe ilości białka PLGF uzyskanego w wyniku ekspresji i mającą niską aktywność swoistą. W rzeczywistości, w znanym procesie, ekspresję białka indukuje się w hodowlach zawierających niską gęstość komórkową, jak wynika z niskiej gę stości optycznej w czasie indukcji, która wynosi mię dzy 0,2-0,6 OD przy 600 nm. Ponadto, proces opisany we wcześniejszym dokumencie nie obejmuje dodatkowych etapów oczyszczania białka uzyskanego w wyniku ekspresji. Z tego powodu, lizaty otrzymane według zgłoszenia WO-A-92/06194 są nieodpowiednie do zastosowania bezpośrednio przy wytwarzaniu leków.

Bardziej kompleksowa metoda oczyszczania tego samego czynnika łożyskowego jest przedstawiana przez Maglione i innych w „II Farmaco 55 (2000), strony 165-167. Niemniej jednak opis metody podaje jedynie prosty spis znanych technik, bez opisywania warunków i ich szczegółów doświadczalnych, które są zasadnicze dla otrzymywania białka PLGF o czystości i w ilości koniecznej dla zastosowań farmaceutycznych.

Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie nowego sposobu ekstrahowania i oczyszczania rekombinowanego PLGF otrzymanego przez ekspresję w komórkach bakteryjnych, pozwalającego otrzymać PLGF o wysokim poziomie czystości i z wydajnością odpowiednią do zastosowania przemysłowego przy wytwarzaniu leków.

Innym celem wynalazku jest otrzymanie białka PLGF w postaci zasadniczo aktywnej (ponad 98,5%), która składa się głównie z postaci dimerycznych (nie mniej niż 70%) i multimerycznych i zawiera pozostałości postaci monomerycznej (mało lub nieaktywne), nie więcej niż 1,5%.

Streszczenie wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób ekstrahowania i oczyszczania rekombinowanego łożyskowego czynnika wzrostu (PLGF) w aktywnej postaci dimerycznej i multimerycznej zawierającej nie więcej niż 1,5% postaci monomerycznej, przez ekspresję w indukowalnym układzie ekspresyjnym w modyfikowanych komórkach prokariotycznych, obejmujący następujące etapy: (I) fermentacji komórek prokariotycznych, (II) ekstrakcji i oczyszczania ciał inkluzyjnych, (III) renaturacji białka otrzymanego w wyniku ekspresji, (IV) chromatografii jono-wymiennej, (V) chromatografii w odwróconej fazie, polegający na tym, że etap (I) prowadzi się do uzyskania gęstości optycznej pożywki hodowlanej wynoszącej od 14 do 50 przy 600 nm (OD⁶⁰⁰ 14-50), po którym następuje indukcja, w etapie (II) lizuje się komórki hodowlane, rozrywa DNA i izoluje się ciała inkluzyjne, w etapie (III) ciała inkluzyjne solubilizuje się w buforze denaturującym i otrzymane w wyniku ekspresji białko przynajmniej częściowo przywraca się do postaci dimerycznej, w etapie (IV) postacie dimeryczne i multimeryczne uzyskanego w wyniku ekspresji białka oddziela się od postaci monomerycznej za pomocą chromatografii anionowymiennej, i w etapie (V) postacie dimeryczne i multimeryczne uzyskanego w wyniku ekspresji białka dodatkowo oddziela się od postaci monomerycznej za pomocą chromatografii w odwróconej fazie z dwoma kolejnymi etapami wymywania z rosną cym gradientem rozpuszczalnika organicznego oddzielonymi etapem wymywania w warunkach izokratycznych, i na koniec izoluje.

PL 206 761 B1

Korzystnie jako łożyskowy czynnik wzrostu (PLGF) otrzymuje się ludzki PLGF-1 lub PLGF-1 pochodzenia zwierzęcego.

Korzystnie jako komórki prokariotyczne stosuje się komórki bakteryjne.

Korzystnie etap (I) prowadzi się w pożywce pozwalającej na otrzymanie wysokiej gęstości bakterii w etapie fermentacji i wolnej od jakiegokolwiek materiału pochodzenia ludzkiego lub zwierzęcego.

Korzystnie etap (I) prowadzi się w pożywce obejmującej jeden lub więcej czynników selekcji, ekstrakt drożdżowy, glicerol i sole amoniowe.

Korzystnie jako indukowalny układ ekspresyjny stosuje się układ ekspresyjny T7.

Korzystnie jako komórki bakteryjne stosuje się szczep otrzymany z E.coli.

Korzystnie jako szczep bakteryjny stosuje się E.coli {B121(DE3)pLysS}.

Korzystnie ekspresję indukuje się za pomocą laktozy, izopropylo-e-D-tiogalaktopiranozydu (IPTG) lub funkcjonalnie równoważnych analogów.

Korzystnie gęstość optyczna hodowli w czasie indukcji wynosi 14-30 OD przy 600 nm (14-30 OD⁶⁰⁰), korzystnie 16-20 (16-20 OD⁶⁰⁰).

Korzystnie etap (I) obejmuje wstępny etap inokulacji wstępnej.

Korzystnie w etapie (II) lizę komórkową prowadzi się za pomocą technik zamrażania/topienia, prasy francuskiej lub innych technik równoważnych.

Korzystnie w etapie (II) rozrywanie DNA prowadzi się za pomocą DNAzy pochodzenia ekstrakcyjnego lub rekombinacyjnego, korzystnie benzonazy, albo przez działanie chemiczno-mechaniczne.

Korzystnie w etapie (II) rozrywanie DNA prowadzi się za pomocą mieszalnika.

Korzystnie w etapie (II) ciała inkluzyjne izoluje się za pomocą co najmniej dwóch cykli wirowania i przemywania w odpowiednim buforze.

Korzystnie w etapie (III) ciała inkluzyjne solubilizuje się w buforze denaturującym zawierającym mocznik, izotiocyjanian guanidyny, chlorowodorek guanidyny lub każdy inny środek denaturujący, i ewentualnie poddaje się homogenizacji lub sonifikacji.

Korzystnie w etapie (III) po solubilizacji ciał inkluzyjnych, roztwór rozcieńcza się, a materiał białkowy poddaje się renaturacji przez dodanie do roztworu środków utleniających/redukujących oraz przez inkubację przez 10-30 godzin, korzystnie 18-20, w temperaturze 10-30°C, korzystnie 20°C, przy mieszaniu.

Korzystniej roztwór rozcieńcza się do uzyskania gęstości optycznej przy 280 nm (OD²⁸⁰) 0,01 do 2, korzystnie 0,5, a środkiem utleniającym/redukującym jest glutation w jego postaciach utlenionej i zredukowanej w stężeniach odpowiednio pomiędzy 0,1 mM a 2,5 mM i pomiędzy 0,25 mM a 6,25 mM.

Korzystnie w etapie (IV) roztwór pochodzący z poprzedniego etapu nakłada się na kolumnę aniono-wymienną, przy stosunku objętość ładowania/objętość kolumny wynoszącym od 1:1 do 10:1.

Korzystniej stosunek objętość ładowania/objętość kolumny wynosi 10:1.

Korzystniej białko wymywa się etanoloaminą-HCl, buforem NaCl a białko w postaci monomerycznej jest zawarte głównie we frakcjach zawierających materiał nie związany z żywicą, podczas gdy białko w postaci dimerycznej jest zasadniczo zawarte w następnych frakcjach wymywanych przy stężeniu NaCl wynoszącym 150 do 250 mM.

Korzystnie w etapie (V) roztwór wymywany w poprzednim etapie przy stężeniu NaCl wynoszącym 150 do 250 mM rozcieńcza się i nakłada na kolumnę do chromatografii w odwróconej fazie, w ilości odpowiadającej gęstości optycznej wynoszącej 4,5 do 5,5 OD przy 280 nm na ml żywicy.

Korzystnie pierwszy etap wymywania prowadzi się w warunkach rosnącego gradientu rozpuszczalnika organicznego do pojawienia się piku wymywania postaci monomerycznej, po czym kontynuuje się wymywanie w warunkach izokratycznych do wyczerpania piku wymywania postaci monomerycznej, a drugi etap prowadzi się w warunkach rosnącego gradientu rozpuszczalnika organicznego do całkowitego wymycia białka w postaci głównie dimerycznej.

Korzystniej stosuje się bufor do wymywania zawierający etanol, metanol lub acetonitryl.

Korzystniej jako bufor do wymywania stosuje się roztwór wodno-alkoholowy zawierający rosnące odsetki procentowe etanolu.

Korzystniej chromatografię w odwróconej fazie prowadzi się na żywicy mającej przeciętną średnicę cząstek wynoszącą 30 mikronów.

Korzystnie sposób ten obejmuje po etapie (V) dodatkowy etap ultrafiltracji, po którym następuje liofilizacja w obecności odpowiednich dodatków.

Przedmiotem wynalazku jest także łożyskowy czynnik wzrostu w postaci aktywnej otrzymany sposobem określonym powyżej, charakteryzujący się tym, że jest wolny od zanieczyszczeń ze szcze4

PL 206 761 B1 pu gospodarza oraz zawiera postać monomeryczną w odsetku nie wyższym niż 1,5% i występuje zasadniczo w postaci dimerycznej i multimerycznej.

Wynalazek oparty jest na zidentyfikowaniu kolejności technik oczyszczania szczególnie odpowiednich do ekstrakcji i oczyszczania ludzkiego PLGF, eksprymowanego w komórkach bakteryjnych. Wynalazek dodatkowo oparty jest na określeniu optymalnych warunków operacyjnych dla pojedynczej techniki oraz cech fizyko-chemicznych oczyszczanej substancji.

Następnie, zgodnie z wynalazkiem sposób ekstrahowania i oczyszczania rekombinowanego łożyskowego czynnika wzrostu (PLGF) otrzymywanego w wyniku ekspresji w indukowalnym prokariotycznym układzie ekspresyjnym, obejmuje etapy: (I) fermentacji komórek bakteryjnych, (II) ekstrakcji i oczyszczania ciał inkluzyjnych, (III) renaturacji białka uzyskanego w wyniku ekspresji, (IV) chromatografii jonowymiennej, (V) chromatografii w odwróconej fazie, oraz ewentualnie (VI) końcowe etapy ultrafiltracji, preparatyki i liofilizacji. Według takiego sposobu, etap fermentacji (etap I) prowadzi się do otrzymania wysokiej gęstości bakterii w pożywce, przed dalszym etapem indukcji. Etap (II) obejmuje lizę bakteryjną, rozrywanie DNA i izolację ciał inkluzyjnych. Renaturację białka otrzymanego w wyniku ekspresji (etap III) uzyskuje się przez solubilizację ciał inkluzyjnych w buforze do renaturacji oraz przez transformowanie, co najmniej częściowo, białka otrzymanego w wyniku ekspresji w postać dimeryczną. Przynajmniej, w etapie (IV) i (V) postacie dimeryczne i multimeryczne białka otrzymanego w wyniku ekspresji, oddziela się od postaci monomerycznych i izoluje w postaci czystej, w celu dalszej ultrafiltracji i liofilizacji w obecności powszechnie stosowanych dodatków do liofilizacji i preparatyki.

Konkretnym przedmiotem wynalazku jest wyżej wymieniony sposób ekstrahowania i oczyszczania białka PLGF-1 pochodzenia ludzkiego, lecz zasadniczo możliwy do zastosowania również w przypadku PLGF-1 pochodzenia zwierzęcego.

Zastrzeżony sposób dogodnie pozwala na uzyskiwanie wydajności produkcyjnej białka otrzymanego w wyniku ekspresji, 30-50 razy wyższej niż wydajność uzyskiwana zgodnie ze sposobem opisywanym w stanie techniki. Ponadto, zastrzegany sposób pozwala na uzyskanie białka o wysokiej czystości, o wysokiej swoistej aktywności i w postaci zasadniczo dimerycznej.

Innym przedmiotem wynalazku jest łożyskowy czynnik wzrostu otrzymany sposobem według wynalazku, pozbawiony jakiegokolwiek białka resztkowego lub innego zanieczyszczenia bakteryjnego i zawierają cy pozostał o ś ci postaci monomerycznych w iloś ci nie wię kszej od 1,5%.

Opis figur

Fig. 1: Figura ta ukazuje wyniki elektroforezy SDS-PAGE otrzymane w warunkach redukujących dla monitorującego etapu I. Pre1 i Pre2 reprezentują kontrole przedindukcyjne, przygotowywane w następujący sposób. Tuż przed indukcją pobiera się około 0,064 jednostki absorpcji optycznej mierzonej przy 600 nm (OD600) i rozcieńcza 5-krotnie wodą. Z tego rozcieńczenia pobiera się 20 μ|, które dodaje się do 20 μl buforu redukującego i gotuje. 20 μl z tego ostatniego roztworu ładuje się na matrycę SDS-PAGE. Post1 i Post2 reprezentują kontro|e poindukcyjne sporządzane jak wyżej. M oznacza mieszaninę markerów masy cząsteczkowej. W ko|umnach poindukcyjnych (Post1 i Post2) widoczny jest prążek tuż nad wskaźnikiem masy cząsteczkowej 14.3 zasadniczo nieobecny w ko|umnach przedindukcyjnych (Pre1 i Pre2) odpowiadający białku PLGF-1 otrzymanemu przez ekspresję i oddzie|onemu wewnątrz ciał ink|uzyjnych.

Fig. 2: Figura ta ukazuje chromatogram monitoringowy chromatografii aniono-wymiennej na żywicy Q-Sepharose Fast F|ow. Oś X ukazuje objętość wymywania (ML), oś Y ukazuje jednostki absorpcji optycznej (OD). Pierwszy pik wymywania otrzymany przez wymywanie do 20% buforem B (NaC| 200 mM) odpowiada białku PLGF-1 w postaci zasadniczo dimerycznej, |ecz obejmuje on zanieczyszczenia i postać monomeryczną. Następny pik, wymywany do 100% buforem B (NaC| 1 M) zawiera zanieczyszczenia, które są wye|iminowane.

Fig. 3: Figura ta ukazuje chromatogram monitoringowy pierwszego etapu wymywania w chromatografii w odwróconej fazie, na żywicy RP Source 30. Oś X ukazuje objętość wymywania, oś Y ukazuje jednostki absorpcji optycznej (OD). Pierwszy, obfity pik wymywania odpowiada różnym zanieczyszczeniom, które nie wiążą się z żywicą. Drugi pik wymywania odpowiada białku PLGF w postaci monomerycznej, wymywanej w warunkach izokratycznych (doświadcza|nie znajdowane przy około 10-15% buforu B).

Fig. 4: Figura ta ukazuje chromatogram monitoringowy drugiego etapu wymywania w chromatografii w odwróconej fazie, na żywicy RP Source 30. Oś X ukazuje objętość wymywania (m|), oś Y ukazuje jednostki absorpcji optycznej (OD). Pik wymywania odpowiada białku PLGF w postaci dimerycznej-mu|timerycznej.

PL 206 761 B1

Fig. 5: figura ta ukazuje wyniki otrzymane dla elektroforezy na SDS-PAGE dla końcowego monitoringu całego procesu. Prerefol i Postrefol reprezentują kontrole poprzedzające denaturację i następującego po renaturacji białka otrzymanego w wyniku ekspresji (etap III). QFF reprezentuje pik wymywany z żywicy Q Sepharose Fast Flow, zawierającej białko, głównie w postaci dimerycznej. Mon reprezentuje pik zawierający postać monomeryczną. Dim reprezentuje pik wymywany w drugim podetapie chromatografii w odwróconej fazie, na żywicy RP Source 30. Widać, że przed renaturacją białko otrzymane w wyniku ekspresji występuje głównie w postaci monomerycznej. Po renaturacji, część białka występuje w postaci dimerycznej. W następstwie oczyszczania za pomocą chromatografii na QFF i RF 30 otrzymuje się białko PLGF-1 oczyszczone w wysokim stopniu.

Szczegółowy opis wynalazku

Genetyczna modyfikacja bakteryjnych komórek gospodarza jest opisana przez Maglione i innych, w poprzednim opisie patentowym EP-B-0550519 (WO-A-92/06194). W tym celu, komórki bakteryjne transformuje się wprowadzając wektor ekspresyjny obejmujący wstawkę odpowiadającą ludzkiemu genowi kodującemu PLGF-1. Pełna sekwencja genowa jest znana w literaturze i jest łatwo dostępna. Plazmid zawierający taką sekwencję zdeponowano w ATCC pod numerem dostępu ATCC

40892. Ekspresja jest prowadzona pod kontrolą układu polimerazy RNA faga T7 i indukowana IPTG (izopropylo-e-D-tiogalaktopiranozydem).

Niemniej jednak, można wykorzystywać inne indukowalne prokariotyczne układy ekspresyjne.

Przykłady takich układów, możliwych do otrzymania na rynku, to:

1) Układ ekspresyjny pBAD (In vitrogen BV), w którym synteza białka jest umieszczana pod kontrolą promotora araBAD i może być indukowana w różnych szczepach E.coli, za pomocą arabinozy.

2) Układ ekspresyjny T7 (In vitrogen BV lub Promega), w którym synteza białka jest kontrolowana przez promotor polimerazy RNA faga T7 i może być indukowana za pomocą laktozy lub jej analogów (IPTG). W tym przypadku, konieczne jest stosowanie pochodnych E.coli typu DE3 (B121(DE3) lub JM109(DE3)), zawierających mianowicie kopię genu polimerazy RNA faga T7 umieszczoną pod kontrolą promotora indukowalnego przez laktozę.

3) Układ ekspresyjny Trc (In vitrogen BV), w którym syntezę białka umieszcza się pod kontrolą hybrydowego promotora trp. Taki promotor został uzyskany przez stopienie promotora trp i promotorów lac i można go indukować w różnych szczepach E.coli, za pomocą laktozy lub jej analogów (IPTG).

4) Układ ekspresyjny Tac (Amersham Biosciences), w którym syntezę białka umieszcza się pod kontrolą promotora tac. W tym układzie, synteza białka jest indukowana w szczepach E.coli laclq (typ JM105) za pomocą laktozy lub jej analogów (IPTG).

5) Układ ekspresyjny PL, w którym synteza białka umieszczana jest pod kontrolą promotora PL i może być indukowana przez dodanie tryptofanu. W tym przypadku, konieczne jest stosowanie pochodnych E.coli (GI724) zawierających kopię genu kodującego dla represora cl faga lambda umieszczonego pod kontrolą promotora indukowalnego tryptofanem.

Etap 1: Fermentacja i indukcja

Pierwszy etap zastrzeżonego sposobu polega na fermentacji funkcjonalnie modyfikowanego szczepu bakteryjnego, równoważnego szczepowi opisywanemu we wcześniejszym europejskim opisie patentowym (wyżej). W zalecanej postaci realizacji, drobnoustrojem jest pochodna Escherichia coli modyfikowana plazmidem ekspresyjnym zawierającym ludzki gen PLGF. Korzystnym drobnoustrojem jest ten zwany [B12(DE3)pLysS PLGF-1], uzyskany przez integrację genu ludzkiego PLGF-1 z dostępnym w handlu szczepem [B12(DE3)pLysS](Promega Corporation USA). Niniejszy wynalazek nie jest jednak ograniczony do ludzkiego czynnika PLGF-1, lecz odnosi się także do czynnika pochodzenia zwierzęcego (małpy, myszy, królika, itd.). Niniejszy wynalazek nie jest jednakże ograniczony do stosowania pochodnej E.coli, lecz obejmuje stosowanie jakiegokolwiek prokariotycznego drobnoustroju podatnego na modyfikację genetyczną i zdolnego do ekspresji heterologicznego białka, pod postacią ciał inkluzyjnych.

Szczepy wykorzystywane jako inokulum w sposobie według wynalazku utrzymuje się, przed użyciem, w postaci liofilizowanej, aby zabezpieczyć ich zdolność do ekspresji. W czasie użycia, materiał liofilizowany jest rekonstytuowany w roztworze z wykorzystaniem odpowiedniego buforu.

Choć istnieje szeroki zakres znanych pożywek hodowlanych dostępnych na rynku i które można skutecznie stosować, etap fermentacji według wynalazku prowadzi się korzystnie w pożywce pozbawionej jakiegokolwiek materiału pochodzenia zwierzęcego lub ludzkiego, w celu uniknięcia jakiegokolwiek ryzyka zakażenia. Ekstrakty drożdżowe (Difco) dodawane z jednym lub więcej odpowiednich

PL 206 761 B1 antybiotyków, stanowią najodpowiedniejszy środek dla tego sposobu. W zalecanej postaci realizacji, stosuje się pożywkę, która została otrzymana przez wymieszanie w warunkach jałowych, pierwszego roztworu (A) zawierającego ekstrakty drożdżowe, glicerol i siarczan amonu, z drugim roztworem (B) zawierającym bufor fosforanowy. Mieszaninę łączy się potem z chloramfenikolem lub równoważnymi antybiotykami. Odpowiednie stężenia antybiotyków wynoszą od 50-300 μg/ml ampicyliny, w szczególności od 100-200 μg/ml i od 10-100 μg/ml chloramfenikolu, w szczególności od 30-40 μg/ml.

Etap fermentacji może być poprzedzony etapem wstępnej inokulacji, w którym liofilizowany drobnoustrój jest zawieszany w pożywce i poddawany kolejnym etapom inkubacji i rozcieńczania, których celem jest zawartość w hodowli optymalnej ilości komórek drobnoustroju. Dogodnie, drobnoustrój jest inkubowany przez jedną noc, w temperaturze 37°C, następnie rozcieńczany i ponownie inkubowany przez kilka godzin. Wybrana objętość inokulum wstępnego jest następnie wirowana, ponownie zawieszana w roztworze hodowlanym, wzbogaconym w ampicylinę i wysiewana do naczynia fermentacyjnego do etapu fermentacji.

Fermentacja jest prowadzona w wyżej wymienionej pożywce z dodatkiem ampicyliny i chloramfenikolu, w temperaturze odpowiedniej dla drobnoustroju, zwykle w temperaturze około 37°C, w obecności pewnego odsetka rozpuszczonego O2, ze względu na nasycenie powietrzem, od 20% do 40%, w szczególności 30%. pH podczas fermentacji jest utrzymywane na poziomie obojętnym lub słabo kwasowym (6,4-7,4). Ponadto, ponieważ proces fermentacji zachodzi przy mieszaniu, zalecane jest stosowanie środków przeciwpieniących.

Postępowi fermentacji towarzyszy wzrost gęstości optycznej pożywki. Z tego powodu, gęstość optyczna jest parametrem wykorzystywanym według wynalazku do monitorowania postępu stopnia fermentacji. Odczyty przy 600 nm są szczególnie odpowiednie.

Zasadniczą cechą wynalazku jest wysoka gęstość komórkowa uzyskana w hodowli w czasie indukcji ekspresji. Gęstości optyczne przy 600 nm (OD600) od 1-50 można uzyskać dzięki pożywkom hodowlanym tu opisanym. Gęstości wyższe niż 18 są jednak zalecane dla uzyskania wysokiego poziomu produkcji typowego dla zastrzeżonego sposobu. Gęstości między 16-20 są szczególnie korzystne dla indukcji produkcyjnego szczepu bakteryjnego i dawały optymalne wyniki. Fermentacja jest następnie utrzymywana w powyższych warunkach do uzyskania takich wartości gęstości optycznej, następnie dalej indukuje się ekspresję białka.

Z powodzeniem można stosować jakikolwiek środek lub warunki fizyko-chemiczne zdolne do indukcji w komórkach wykorzystywanych drobnoustrojów procesu ekspresji heterologicznego białka. W konkretnym przypadku, w którym stosuje się szczep bakteryjny BL21(DE3)pLysS modyfikowany plazmidem ekspresyjnym zawierającym promotor faga T7, ekspresja jest indukowana laktozą lub jej pochodnymi, takimi jak izopropylo-e-tiogalaktopiranozyd (IPTG) w odpowiednim stężeniu, mianowicie około 1 mM. Czas trwania indukcji może się zmieniać zgodnie z potrzebą. Dobre wyniki uzyskuje się dla okresów kilku godzin, w szczególności 3-4 godzin; w optymalnym procesie, indukcję utrzymuje się przez 3 godziny i 20 minut stosując pewien odsetek rozpuszczonego O2, równy około 10%.

Próbki komórek pobiera się przed i po indukcji i poddaje analitycznym technikom kontroli, takim jak elektroforeza na SDS-PAGE, w celu określenia wyniku indukcji.

Gdy ekspresja białka osiągnie żądany poziom, hodowlę wiruje się, a komórki przeprowadza się do następnego etapu.

Etap II: Ekstrakcja i oczyszczanie

Białko heterologiczne otrzymane w wyniku ekspresji jest segregowane wewnątrz samej komórki, w postaci ciał inkluzyjnych. Zatem, sposób według wynalazku zapewnia pasaże lizy komórek, rozrywania wyekstrahowanego materiału jądrowego (DNA) i odzyskiwania oraz przemywanie ciał inkluzyjnych.

Komórki są przemywane, choć niekoniecznie, i zawieszane w roztworach zawierających środki emulgujące o odpowiednim stężeniu, w szczególności Triton X100 o stężeniu 0,5-1%, następnie poddawane są lizie błony komórkowej. Proces lizy może być prowadzony za pomocą technik zamrażania/topienia, prasy francuskiej, sonifikacji lub innymi podobnymi, znanymi technikami. Tym niemniej, zalecaną metodą dla szczepu bakteryjnego BL21(DE3)pLysS jest metoda zamrażania/topienia, która w najbardziej zalecanej postaci realizacji jest powtarzana przez co najmniej dwa kolejne cykle. Po lizie mechanicznej, etap lizy kontynuowany jest przez kilka minut w roztworze do lizy w temperaturze pokojowej, przy mieszaniu.

Uwalnianiu ciał inkluzyjnych do pożywki do lizy towarzyszy uwalnianie różnych składników drobnoustrojów i substancji komórkowych, przede wszystkim materiałów jądrowych. Te substancje

PL 206 761 B1 mogłyby zakłócać i narażać na szwank dalszy proces oczyszczania białka. Zatem, zawiesinę/roztwór otrzymany przez lizę, poddaje się rozrywaniu takiego materiału jądrowego, konkretnie DNA, za pomocą środków enzymatycznych, takich jak DNAza (naturalna lub rekombinowana, taka jak benzonaza), środków chemicznych, takich jak kwas deoksycholowy, albo fizyczno-mechanicznych, takich jak sonifikacja lub mieszanie z dużą energią za pomocą łopatek, np. w mieszalniku. Rozrywanie DNA, wykonywane np. w mieszalniku, prowadzi się na komórkach poddanych lizie, ponownie zawieszonych w odpowiednich objętoś ciach roztworów do przemywania, zawierających środki chelatujące i powierzchniowo czynne, np. EDTA i Triton X100. Korzystnie powtarza się je przez więcej cykli, korzystnie 2, na przemian z etapami rozcieńczania, w roztworze do przemywania, wirowania i eliminacji supernatantu, w celu usunięcia składników i substancji komórkowych z frakcji zawierających ciała inkluzyjne.

Etap III Renaturacja (ponowne zwijanie) białka

Frakcję zawierającą oczyszczone ciała inkluzyjne PLGF-1 solubilizuje się następnie w buforze denaturującym zawierającym znane środki denaturujące, takie jak mocznik, izotiocyjanian guanidyny, chlorowodorek guanidyny. Zalecanym roztworem denaturującym jest roztwór mocznika o stężeniu denaturującym, np. 8M. Aby przyspieszyć proces solubilizacji, frakcję można korzystnie poddać homogenizacji lub sonifikacji. Po solubilizacji ciał inkluzyjnych roztwór jest rozcieńczany tym samym buforem denaturującym do otrzymania gęstości optycznej, mierzonej przy 280 nm wynoszącej około 0,8 (OD280 0,8). Następnie, roztwór jest dodatkowo rozcieńczany buforem do rozcieńczania, do uzyskania OD280 = 0,5. Odpowiednie roztwory do rozcieńczania zawierają sole i glikol polietylenowy (PEG) i mają zasadowe pH (około 8). Renaturacja białka PLGF-1 w rozcieńczonym roztworze jest uzyskiwana przez dodanie do roztworu odpowiednich stężeń par utleniających/redukujących, po czym inkubację prowadzi się przez 10-30 godzin, korzystnie 18-20, w temperaturze 10-30°C, korzystnie 20°C, przy mieszaniu. Przykładami takich par są: cystyna/cysteina, cystamina/cysteamina, 2-hydroksyetylodisiarczek/2-merkaptoetanol. Korzystnym przykładem pary utleniającej/redukującej jest glutation w swej postaci utlenionej i zredukowanej, odpowiednio o stężeniach między 0,1 mM i 2,5 mM (w szczególności 0,5 mM) i między 0,25 mM i 6,25 mM (w szczególności 1,25 mM). Za pomocą renaturacji, białko PLGF-1 uzyskane przez ekspresję w postaci zasadniczo monomerycznej, jest częściowo cofane do postaci dimerycznej (fig. 5).

Etap IV: Chromatografia aniono-wymienna

Roztwór otrzymany z poprzedniego etapu, dogodnie poprzez wirowanie i/lub filtrację i zawierający białko w postaci głównie monomerycznej i częściowo dimerycznej, ładuje się na żywicę aniono-wymienną, w celu wzbogacenia mieszaniny w postać dimeryczną i w celu oczyszczenia jej z zanieczyszczeń bakteryjnych. Można podobnie użyć jakąkolwiek dostępną na rynku matrycę odpowiednią do chromatografii aniono-wymiennej, w stopniu, w jakim cechy pojemności ładowania i prędkości przepływu są podobne do tych dla żywicy Q Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences), poza tym, że są odpowiednie dla procesów przemysłowych. W zalecanej postaci realizacji stosuje się żywicę o dużym przepływie, np. Q-sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences) lub równoważną. Żywicę przemywa się i równoważy roztworami mającymi niską moc jonową. Przykładem takiego roztworu jest etanoloamina-HCl pH 8,5 o niskiej lub braku zawartości soli. Taki sam roztwór można wykorzystać do ładowania, absorpcji i przemywania mieszaniny oczyszczanych białek. Wykorzystywane żywice pozwalają na ładowanie dużych objętości roztworu białka przy stosunku objętość ładowana/objętość kolumny w zakresie od 1:1 do 10:1. Stosunek objętość/objętość bliski 10:1 jest korzystny, ponieważ pozwala on na optymalizację wykorzystania kolumny. Jednak stosunku wyższego niż 10:1 należy unikać, gdyż z powodu nasycenia pojemności adsorbowania matrycy, prowadzi on do utraty postaci dimerycznych białka.

Podczas gdy białko PLGF-1 w postaci monomerycznej już perkoluje w etapach przemywania przy niskiej mocy jonowej, wymywanie postaci dimerycznych i multimerycznych uzyskuje się przez zwiększenie mocy jonowej roztworu wyjściowego. Takie zwiększenie osiąga się przez mieszanie roztworu równoważącego z rosnącym i wstępnie ustalonym odsetkiem drugiego roztworu zawierającego 1 M NaCl. W korzystnej postaci realizacji, białko w postaci dimerycznej jest wymywane roztworami zawierającymi 15-25% 1 M roztworu NaCl, co odpowiada stężeniu NaCl od 150 do 250 mM. W najlepszej postaci realizacji, białko jest wymywane w warunkach izokratycznych przy stężeniu NaCl wynoszącym 200 mM. Wymywanie różnych rodzajów jest automatycznie monitorowane przez pomiar absorpcji optycznej przy 280 nm (fig. 2). Zebrane frakcje zawierające białko PLGF-1 w postaci dimerycznej, są następnie kontrolowane przez elektroforezę SDS-PAGE (fig. 5). Dogodnie, cały proces chro8

PL 206 761 B1 matografii jest prowadzony automatycznie przez komputerowy system operacyjny pod kontrolą odpowiedniego programu, np. systemu Software FPCL Director (Amersham Biosciences).

Etap V: Chromatografia w odwróconej fazie

Frakcje wychodzące z poprzedniego etapu, zawierające białko PLGF-1 wzbogacone w postać aktywną, zbiera się, rozcieńcza odpowiednim buforem i ładuje na kolumnę do chromatografii w odwróconej fazie, aby dodatkowo oczyścić białko w postaci aktywnej. Ilość załadowanego roztworu odpowiada OD280 między 4,5 a 5,5 na mililitr matrycy chromatograficznej. Takie ilości należy uważać za ilości maksymalne.

Można wykorzystywać jakąkolwiek dostępną na rynku matrycę chromatograficzną odpowiednią do zamierzonego wykorzystania, w stopniu, w jakim cechy pojemności ładowania i prędkości przepływu są zgodne z wymaganiami sposobu. W zalecanej postaci realizacji, stosuje się żywicę mającą taką wielkość ziaren żelu, że gwarantuje najlepsze wykorzystanie pojemności absorbującej wraz z łatwością upakowania samej kolumny. Przykładami takich matryc są żywice RP Source 15 lub RP Source 30 (Amersham Biosciences). Wszystkie roztwory do równoważenia, ładowania, przemywania żywic i wymywania są roztworami wodno-organicznymi obejmującymi różny procent rozpuszczalnika organicznego. Przykładami takich roztworów są roztwory obejmujące etanol, metanol lub acetonitryl. Korzystnie, stosuje się roztwory wodno-alkoholowe zawierające pewien odsetek etanolu. W postaci realizacji wynalazku, odpowiednie ilości dwóch roztworów buforowych miesza się, przy czym pierwszy zawiera bufor A, to znaczy 40% etanol i 0,1% TFA (kwas trifluorooctowy), drugi zawiera bufor B, to znaczy 70% etanol i 0,1% TFA.

Materiał białkowy załadowany na żywicę i prawidłowo przemyty, jest następnie wymywany poprzez wymywanie obejmujące dwa kolejne etapy, w których wykorzystuje się roztwory wymywające zawierające rosnący gradient rozpuszczalnika. Etap pierwszy prowadzi się w warunkach rosnącego gradientu rozpuszczalnika organicznego, do uzyskania piku wymywania postaci monomerycznej. Taki gradient otrzymuje się dodając bufor B do buforu A w odsetku od 4% do 40%, przy rosnącym udziale buforu B wynoszącym 3% dla każdej wymytej objętości kolumny. Wraz z pojawieniem się piku wymywania odpowiadającego postaci monomerycznej białka, wymywanie jest kontynuowane w warunkach izokratycznych do wyczerpania piku wymywania postaci monomerycznej. Tak ustawione warunki izokratyczne powodują największe możliwe rozdzielenie pików chromatograficznych na dwie postacie monomeryczną i dimeryczną, a następnie najlepszą możliwą do uzyskania rozdzielczość dla procesu typu przemysłowego, a nie analitycznego. Drugi etap prowadzi się ponownie w warunkach rosnącego gradientu rozpuszczalnika organicznego dotąd, aż nastąpi pełne wymycie białka w postaci dimerycznej. W tym drugim etapie, gradient otrzymuje się dodając bufor B do buforu A w odsetku od 10% do 100%, z rosnącym udziałem buforu B wynoszącym 40,9% dla każdej wymytej objętości kolumny. Wymywanie różnych postaci białka PLGF-1 jest monitorowane automatycznie poprzez pomiar absorpcji optycznej przy 280 nm (fig. 3 i fig. 4). Zebrane frakcje zawierające białko PLGF-1 zasadniczo w postaci dimerycznej, są nastę pnie kontrolowane poprzez elektroforezę SDS-PAGE (fig. 5). Dogodnie, cały proces chromatografii w odwróconej fazie jest prowadzony przez komputerowy system operacyjny pod kontrolą odpowiedniego programu, np. systemu Software FPCL Director (Amersham Biosciences).

Wyniki elektroforezy ukazują, że białko PLGF-1 otrzymane w drugim etapie chromatografii w odwróconej fazie jest w bardzo czystej postaci aktywnej, mianowicie zawiera białko w postaci dimerycznej i częściowo multimerycznej lecz jest zasadniczo pozbawione jakichkolwiek zanieczyszczeń postaci monomerycznej. Tak otrzymany produkt obejmuje nie mniej niż 98,5% postaci aktywnej, w szczególnoś ci nie mniej niż 99,5%, przy czym nie mniej niż 70% jest w postaci dimerycznej. Resztkowa postać monomeryczną występuje w ilości nie większej niż 1,5%. Białko w postaci aktywnej uzyskuje się w ilości średniej wynoszącej 160 mg na litr hodowli bakteryjnej. Czyste białko uzyskane według wyżej opisanego sposobu może być poddane dodatkowym etapom procesowym, takim jak ultrafiltracja na błonie. W tym przypadku produkt jest filtrowany na błonie o wartości odcięcia mniejszej lub równej 30 kD i jest poddawane dializowaniu wobec wody zakwaszonej TFA do uzyskania czynnika rozcieńczenia wynoszącego 1:106. Tak otrzymany produkt końcowy może być prawidłowo preparowany z dodatkami do liofilizacji i liofilizowany w celu utrzymania jego najwyższej aktywności biologicznej.

Wynalazek jest tu poniżej opisany za pomocą przykładów mających na celu jedynie jego zilustrowanie, a nie ograniczanie.

PL 206 761 B1

P r z y k ł a d 1: Fermentacja

Następująca procedura odnosi się do metody fermentacji i indukcji genetycznie modyfikowanego drobnoustroju (MOGM)[B121(DE3)pLysS PLGF-1] w naczyniu fermentacyjnym, przy użyciu 1 mM IPTG.

Materiały:

Roztwór SBM złożony z: roztworu A (na 1 litr)

Ekstrakt drożdżowy Bacto (Difco) 34 g

Siarczan amonu 2,5 g

Glicerol 100 ml

H2O q.s do 900 ml

Roztwór B (10 X)(na 100 ml)

KH2PO4 1,7 g

K2HPO4 -3H2O 20 g lub

K2HPO4 15,26 g

H2O q.s. do 100 ml

Roztwory A i B są autoklawowane oddzielnie i przed stosowaniem mieszane w jałowych warunkach. Alternatywnie, roztwory A i B miesza się i filtruje w jałowych warunkach.

200 mM IPTG (200X) otrzymuje się przez rozpuszczenie 5 g czystej substancji w 100 ml wody destylowanej. Roztwór filtruje się za pomocą filtrów 0,22 μm, dzieli na równe części i zamraża w temperaturze -20°C.

Wykorzystywanym środkiem przeciwpieniącym jest Antifoam 0-10 (nie silikonowy) Sigma nr katalogowy A-8207.

Wykorzystywanym szczepem bakteryjnym jest [BL21pLysS PlGF-1 WCB](roboczy bank komórek).

Inokulum wstępne: Bierze się probówkę z liofilizowanymi, genetycznie modyfikowanymi drobnoustrojami (MOGM) WCB i zawiesza w 1 ml SBM + 100 μg/ml ampicyliny + 34 μg/ml chloramfenikolu.

Zawiesinę rozcieńcza się w 30 ml SBM + 100 μg/ml ampicyliny + 34 μg/ml chloramfenikolu.

Zawiesinę inkubuje się w temperaturze 37°C przez jedną noc (O/N). Dzień później, 30 ml hodowli O/N rozcieńcza się w 800 ml SBM + 100 μg/ml ampicyliny + 34 μg/ml chloramfenikolu, dzieli na 4 1-litrowe kolby Erlenmeiera, każda zawierająca 200 ml.

Zawartość każdej kolby inkubuje się w temperaturze 37°C przez 24 godziny. Zawartość 4 kolb miesza się i odczytuje OD600 przez rozcieńczenie 1/20 w wodzie (50 μl + 950 μl wody).

Ustaloną objętość inokulum wstępnego wiruje się następnie przez 10 minut przy 7,500 x g, w temperaturze 4°C w jałowych probówkach.

Następnie bakterie ponownie zawiesza się w 20 ml SBM + 200 μg/ml ampicyliny + 10 μg/ml chloramfenikolu na każdy litr mieszaniny fermentacyjnej, przez wymieszanie z prędkością 420 obrotów na minutę, w temperaturze pokojowej, przez 20 minut. W tym samym czasie, przygotowuje się naczynie fermentacyjne i kalibruje sondy tlenowe.

Sondy tlenowe kalibruje się w temperaturze 37°C przy 0% azotu, następnie przy 100% powietrza bez środka przeciwpieniącego, przy mieszaniu z prędkością 600 obrotów na minutę.

Fermentację prowadzi się w następujących warunkach doświadczalnych:

Pożywka: SBM + 200 μg/ml ampicyliny + 10 μg/ml chloramfenikolu

Temperatura: 37°C % rozpuszczonego O2: 30% (w odniesieniu do nasycenia powietrzem) pH: od 6,4 do 7,4.

Środek przeciwpieniący: 1:10 jest rozcieńczany w wodzie; silne mieszanie przed dodaniem go w ilości 140 μl na 750 ml pożywki.

Indukcja:

Indukcję prowadzi się w następujących warunkach doświadczalnych:

OD600 indukcji: 16-20.

Środek indukujący: IPTG o stężeniu końcowym 1 mM.

% rozpuszczonego O2: 10% (w odniesieniu do nasycenia powietrzem)

Długość indukcji: 3 godziny i 20 minut.

PL 206 761 B1

Tuż przed indukcją pobiera się 20 μl bakterii, dodaje do 80 μl wody i utrzymuje dla kontroli przedindukcyjnej.

W czasie indukcji, IPTG dodaje się do końcowego stężenia wynoszącego 1 mM.

Procent rozpuszczonego O2 doprowadza się do 10%.

Na końcu indukcji odczytuje się końcowe OD600 i mierzy całkowitą objętość.

Następnie, pobiera się 10 μl bakterii, dodaje do 90 μl wody i utrzymuje dla kontroli poindukcyjnej.

Indukcję kontroluje się za pomocą elektroforezy SDS-PAGE, przez załadowanie 20 μl 2 uprzednio gotowanych próbek.

Pożywkę zawierającą indukowane bakterie wiruje się następnie przy 7, 500 x g przez 10 minut lub przy 3000 x g przez 25 minut, w temperaturze 4°C i supernatant usuwa.

Wyniki: Wyniki indukcji sprawdza się za pomocą elektroforezy SDS-PAGE, jak ukazano w fig. 1.

P r z y k ł a d 2: Ekstrakcja i oczyszczanie ciał inkluzyjnych.

Następująca procedura odnosi się do otrzymywania i ponownego zwijania ciał inkluzyjnych PLGF-1. Za pomocą ponownego zwijania białko bakteryjne PLGF-1 częściowo przywraca się do postaci dimerycznej.

Materiał:

Mieszalnik o odpowiedniej pojemności.

Roztwór do lizy: 1 mM Mg2SO4 + 20 mM Tris-HCl, pH 8 + Triton X100 do 1%.

Roztwór do przemywania: 0,5% Triton X100 + 10 mM EDTA pH 8.

BD (bufor denaturujący): 8 M mocznik, 50 mM Tris pH 8, 20 mM etylenodiamina.

Rozpuszczanie i doprowadzanie do objętości w H2O.

Utleniony glutation 200x: 100 mM w H2O.

Zredukowany glutation 200X: 250 mM w H2O.

Bufor do rozcieńczania: końcowe 600 μl PEG 4000 (2,4 g/l), 50 mM Tris-HCl pH 8, 20 mM NaCl.

Środek przeciwpieniący: Antifoam 0-10 (nie silikonowy) Sigma.

Otrzymywanie ciał inkluzyjnych PLGF-1.

Roztwory do lizy i przemywania równoważy się w temperaturze pokojowej (RT).

Przeprowadza się dwa cykle zamrażania/topienia w temperaturze -80/37°C.

Osad bakteryjny poddaje się lizie w 1 ml roztworu do lizy na każde 450 OD600 bakterii.

Następnie inkubuje się go w RT, przez 30 minut, przy mieszaniu (250 obrotów na minutę).

Roztwór wylewa się do mieszalnika o odpowiedniej pojemności i dodaje się ilość roztworu do przemywania wynoszącą 3 ml dla każdego 450 OD600 bakterii.

Jeśli jest to konieczne, dodaje się 0,4 μl nierozcieńczonego środka przeciwpieniącego na każdy mililitr próbki.

Roztwór wiruje się z maksymalną prędkością przez 1 minutę lub dopóki próbka nie jest odpowiednio jednorodna.

Zawartość mieszalnika przenosi się następnie do pojemnika o odpowiedniej pojemności i dodaje 6,5 ml roztworu do przemywania na każde 450 OD600 bakterii. Inkubuje się przez 45 minut, w RT, przy mieszaniu.

Tak otrzymaną zawiesinę wiruje się przy 13,000 x g przez 45 minut i supernatant usuwa.

Osadzony osad ponownie zawiesza się w 4 ml roztworu do przemywania na każde 450 OD600 bakterii i cykl w mieszalniku powtarza się drugi raz.

Zawiesinę przenosi się do pojemnika o odpowiedniej pojemności, rozcieńcza 6,5 ml roztworu do przemywania na każde 450 OD600 bakterii i inkubuje przez 30 minut, w RT, przy mieszaniu.

Wirowanie w powyższych warunkach powtarza się następnie i supernatant usuwa.

P r z y k ł a d 3: Renaturacja białka

Ciała inkluzyjne solubilizuje się w 7 ml buforu denaturującego BD (zawierającego 8 M mocznik) i dodatkowo rozcieńcza w BD do OD280 = 0, 8. Następnie, dodaje się 0,6 objętości buforu do rozcieńczania, w celu doprowadzenia końcowego stężenia mocznika do 5 M.

Potem, dodaje się 1/200 zredukowanego glutationu 200X (stężenie końcowe 1,25 mM) i 1/200 utlenionego glutationu 200X (stężenie końcowe 0,5 mM). Pobiera się 15 μl próbkę do sprawdzenia (prerefol) i roztwór inkubuje w temperaturze 20°C przez 18-20 godzin, przy mieszaniu.

Na końcu inkubacji, pożywkę wiruje się przez 10 minut w temperaturze 20°C, 10,000 x g, filtruje za pomocą filtrów 0,45 lub 0,8 μm i pobiera 15 μl próbkę do sprawdzenia (postrefol).

PL 206 761 B1

Wyniki: 15 μ| próbki roztworu przed- i poindukcyjnego ponownego zwijania ana|izuje się za pomocą e|ektroforezy SDS-PAGE (fig. 5).

P r z y k ł a d 4: Chromatografia aniono-wymienna

Następująca procedura odnosi się do pierwszego etapu oczyszczania białka PLGF-1 po ponownym zwijaniu. W czasie ładowania próbki na ko|umnę będzie zachodzić duża utrata nieabsorbowanego monomeru PLGF-1. Załadowana i|ość nie może przekraczać 10-krotnej objętości ko|umny, ponieważ spowodowałoby to znaczną utratę dimerycznego PLGF-1.

Wymywanie prowadzi się w warunkach izokratycznych, przy 20% buforu B (patrz poniżej), co odpowiada stężeniu NaC| wynoszącemu 200 mM. Wymywany pik wciąż zawiera g|utation używany do ponownego zwijania, który przyczynia się do około 50% OD280.

Materiały i parametry

Układ FPLC: Amersham biosciences prowadzony przez program o nazwie FPLC Director.

Parametry monitorujące:

U.V.: długość fa|i = 280 nm; szczyt ska|i = 2.

Temperatura: 20°C (minimum 15, maksimum 25)

Żywica: Q Sepharose Fast F|ow (Amersham biosciences).

Objętość/wysokość ko|umny: objętość: 1/10 objętości próbki do załadowania; wysokość: 13-16 cm.

Równoważenie: 2 objętości ko|umny (CV) buforu B, następnie 1,5 CV buforu A.

Próbka: renaturowany, wirowany i/|ub fi|trowany PLGF-1. Ładować go nie więcej niż 10 CV.

Bufor A: 20 mM etano|oamina-HC| pH 8,5.

Bufor B: bufor A + 1 M NaC|.

Prędkość wstrzyku: 1 cm/minutę (maksyma|na testowana prędkość na małych ko|umnach = 1,887 cm/minutę; minima|na testowana prędkość =0,5 cm/minutę.

Przemywanie po wstrzyku: 1,5 CV 0% buforu B.

Zebrane piki: Pik wymywany w warunkach izokratycznych przy 20% buforu B, przebieg przez około 3 CV.

Końcowe przemywanie: 2 CV przy 100% B.

Procedura:

Zbiera się pik wymyty w warunkach izokratycznych przy 20% buforu B, następnie dodaje się 0,271 objętości wody, 0,0045 objętości TFA i 0,225 objętości etano|u. W ten sposób otrzymuje się próbkę, która jest rozcieńczona 1,5 raza i zawiera ona 15% etano|u i 0,3% TFA. Dodatek tych 2 substancji ułatwia związanie PLGF-1 z żywicą w odwróconej fazie (patrz przykład 5).

Wyniki: Etap chromatografii jest kontro|owany w sposób ciągły za pomocą monitoringu gęstości optycznych przy 280 nm, jak zi|ustrowano w fig. 2.

Czystość wyizo|owanego białka ana|izuje się za pomocą e|ektroforezy SDS-PAGE (fig. 5).

P r z y k ł a d 5: Chromatografia w odwróconej fazie.

Następujący etap można przeprowadzić z użyciem żywicy RP Source o przeciętnej średnicy cząstki wynoszącej 15 mikronów |ub 30 mikronów. Jednak 30-mikronowa żywica RP Source, choć nie powoduje żadnych zmian w procesie oczyszczania, pozwa|a na zaoszczędzenie samej żywicy (około 50%), ułatwienie procedury pakowania ko|umny i niższe przeciwciśnienie.

Procedura odnosi się do drugiej fazy oczyszczania białka PLGF-1 po przejściu przez żywicę QFF. Podczas wstrzyku próbki widoczna jest wysoka absorbancja i odpowiada ona nieadsorbowanemu pikowi g|utationu, który nie wiąże się z żywicą. Procedura ta składa się z 2 podetapów, przy czym pierwszy, nazywany RPCmon, stosowany jest do e|iminowania większości monomerycznego składnika PLGF-1, podczas gdy drugi jest stosowany do wymywania zasadniczo dimerycznego składnika białka i jest nazywany RPCdim.

Podetap pierwszy (RPCmon)

Materiały i parametry:

Układ FPLC: Amersham biosciences prowadzony przez program o nazwie FPLC Director.

Parametry monitorujące:

U.V.: długość fa|i = 280 nm; pełna szczyt ska|a = 0,05.

Temperatura: 20°C (minimum 15, maksimum 25).

Żywica: Reverse Phase Source 30 (Amersham biosciences).

Objętość/wysokość ko|umny: objętość: 1/5-1/6 całkowitej OD280 próbki do załadowania; wysokość: 27-33 cm.

Równoważenie: 2 objętości ko|umny (CV) buforu B, następnie 2 CV buforu A.

PL 206 761 B1

Próbka: PLGF-1 pochodzący z poprzedniego etapu (przykład 4), rozcieńczony 1,5 raza i zawierający 15% etanol oraz 0,3% TFA. Ładowanie maksymalnie 4,5-5,5 OD280 na ml żywicy.

Bufor A: etanol 40% + TFA 0,1%

Bufor B:. etanol 70% + TFA 0,1%

Prędkość wstrzyku: 1,887 cm/minutę;

Prędkość wymywania: 1,887 cm/minutę

Przemywanie po wstrzyku: 1,5 CV 4% buforu B.

Pik monomerowy: Gradient w zakresie od 4 do 40% B w 12 CV (3%B/CV). Tuż po rozpoczęciu wymywania piku, przy OD280 sięgającej 25% pełnej skali, wymywanie jest kontynuowane w warunkach izokratycznych, przy stężeniu buforu B osiągniętym w tym momencie, aż do zakończenia wymywania piku (około 2,5-3,5 CV).

Operacje

Pobiera się odpowiednią ilość roztworu, odpowiadającą pikowi „monomerycznemu i zatęża się go do sprawdzenia (mon w fig. 5).

Podetap drugi (RPCdim)

Materiały i parametry:

Bez ponownego równoważenia kolumny lecz przez zwykłe przesunięcie zakresu skali monitora UV do wartości 2, wprowadza się gradient w zakresie od 10 do 100% buforu B w 2,2 CV (40,9% B/CV).

Operacje:

Pobiera się frakcje odpowiadające pikowi „dimerycznemu. Fig. 4 ilustruje ich przykład. Zbiera się je i mierzy objętość oraz gęstość optyczną przy 280 nm.

Całkowitą wydajność (wyrażoną w mg) uzyskaną przed liofilizacją, oblicza się przez pomnożenie OD280 przez objętość razy rozcieńczenie. Średnia wartość takiej wydajności wynosi 164 mg czystego PLGF-1 na litr hodowli bakteryjnej, przy odchyleniu standardowym wynoszącym 23,21. Można ją także wyrazić w mg na 1000 OD600 fermentowanych bakterii, co daje 5,58 mg czystego PLGF-1 na każde 1000 OD600 fermentowanych bakterii, przy odchyleniu standardowym wynoszącym 0,8.

Tak otrzymany roztwór dimeru przechowuje się w temperaturze -20°C do ultrafiltracji i liofilizacji. Próbkę takiego roztworu poddaje się elektroforezie SDS-PAGE, jak zilustrowano w fig. 5.

Claims (28)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób ekstrahowania i oczyszczania rekombinowanego łożyskowego czynnika wzrostu (PLGF) w aktywnej postaci dimerycznej i multimerycznej zawierającej nie więcej niż 1,5% postaci monomerycznej, przez ekspresję w indukowalnym układzie ekspresyjnym w modyfikowanych komórkach prokariotycznych, obejmujący następujące etapy: (I) fermentacji komórek prokariotycznych, (II) ekstrakcji i oczyszczania ciał inkluzyjnych, (III) renaturacji białka otrzymanego w wyniku ekspresji, (IV) chromatografii jonowymiennej, (V) chromatografii w odwróconej fazie, znamienny tym, że etap (I) prowadzi się do uzyskania gęstości optycznej pożywki hodowlanej wynoszącej od 14 do 50 przy 600 nm (OD⁶⁰⁰ 14-50), po którym następuje indukcja, w etapie (II) lizuje się komórki hodowlane, rozrywa DNA i izoluje się ciała inkluzyjne, w etapie (III) ciała inkluzyjne solubilizuje się w buforze denaturującym i otrzymane w wyniku ekspresji białko przynajmniej częściowo przywraca się do postaci dimerycznej, w etapie (IV) postacie dimeryczne i multimeryczne uzyskanego w wyniku ekspresji białka oddziela się od postaci monomerycznej za pomocą chromatografii aniono-wymiennej, i w etapie (V) postacie dimeryczne i multimeryczne uzyskanego w wyniku ekspresji białka dodatkowo oddziela się od postaci monomerycznej za pomocą chromatografii w odwróconej fazie z dwoma kolejnymi etapami wymywania z rosnącym gradientem rozpuszczalnika organicznego oddzielonymi etapem wymywania w warunkach izokratycznych, i na koniec izoluje.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako łożyskowy czynnik wzrostu (PLGF) otrzymuje się ludzki PLGF-1 lub PLGF-1 pochodzenia zwierzęcego.
3. 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, zamienny tym, że jako komórki prokariotyczne stosuje się komórki bakteryjne.
4. 4. Sposób według jednego z zastrz. 1-3, znamienny tym, że etap (I) prowadzi się w pożywce pozwalającej na otrzymanie wysokiej gęstości bakterii w etapie fermentacji i wolnej od jakiegokolwiek materiału pochodzenia ludzkiego lub zwierzęcego.

   PL 206 761 B1
5. 5. Sposób według jednego z zastrz. 1-4, znamienny tym, że etap (I) prowadzi się w pożywce obejmującej jeden lub więcej czynników selekcji, ekstrakt drożdżowy, glicerol i sole amoniowe.
6. 6. Sposób według jednego z zastrz. 1-5, znamienny tym, że jako indukowalny układ ekspresyjny stosuje się układ ekspresyjny T7.
7. 7. Sposób według jednego z zastrz. 1-6, znamienny tym, że jako komórki bakteryjne stosuje się szczep otrzymany z E.coli.
8. 8. Sposób według jednego z zastrz. 1-7, znamienny tym, że jako szczep bakteryjny stosuje się E.coli {B121(DE3)pLysS}.
9. 9. Sposób według jednego z zastrz. 1-8, znamienny tym, że ekspresję indukuje się za pomocą laktozy, izopropylo-e-D-tiogalaktopiranozydu (IPTG) lub funkcjonalnie równoważnych analogów.
10. 10. Sposób według jednego z zastrz. 1-9, znamienny tym, że gęstość optyczna hodowli w czasie indukcji wynosi 14-30 OD przy 600 nm (14-30 OD⁶⁰⁰), korzystnie 16-20 (16-20 OD⁶⁰⁰).
11. 11. Sposób według jednego z zastrz. 1-10, znamienny tym, że etap (I) obejmuje wstępny etap inokulacji wstępnej.
12. 12. Sposób według jednego z zastrz. 1-11, znamienny tym, że w etapie (II) lizę komórkową prowadzi się za pomocą technik zamrażania/topienia, prasy francuskiej lub innych technik równoważnych.
13. 13. Sposób według jednego z zastrz. 1-12, znamienny tym, że w etapie (II) rozrywanie DNA prowadzi się za pomocą DNAzy pochodzenia ekstrakcyjnego lub rekombinacyjnego, korzystnie benzonazy, albo przez działanie chemiczno-mechaniczne.
14. 14. Sposób według jednego z zastrz. 1-13, znamienny tym, że w etapie (II) rozrywanie DNA prowadzi się za pomocą mieszalnika.
15. 15. Sposób według jednego z zastrz. 1-14, znamienny tym, że w etapie (II) ciała inkluzyjne izoluje się za pomocą co najmniej dwóch cykli wirowania i przemywania w odpowiednim buforze.
16. 16. Sposób według jednego z zastrz. 1-15, znamienny tym, że w etapie (III) ciała inkluzyjne solubilizuje się w buforze denaturującym zawierającym mocznik, izotiocyjanian guanidyny, chlorowodorek guanidyny lub każdy inny środek denaturujący, i ewentualnie poddaje się homogenizacji lub sonifikacji.
17. 17. Sposób według jednego z zastrz. 1-16, znamienny tym, że w etapie (III) po solubilizacji ciał inkluzyjnych, roztwór rozcieńcza się, a materiał białkowy poddaje się renaturacji przez dodanie do roztworu środków utleniających/redukujących oraz przez inkubację przez 10-30 godzin, korzystnie 18-20, w temperaturze 10-30°C, korzystnie 20°C, przy mieszaniu.
18. 18. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że roztwór rozcieńcza się do uzyskania gęstości optycznej przy 280 nm (OD²⁸⁰) 0,01 do 2, korzystnie 0,5, a środkiem utleniającym/redukującym jest glutation w jego postaciach utlenionej i zredukowanej w stężeniach odpowiednio pomiędzy 0,1 mM a 2,5 mM i pomiędzy 0,25 mM a 6,25 mM.
19. 19. Sposób według jednego z zastrz. 1-18, znamienny tym, że w etapie (IV) roztwór pochodzący z poprzedniego etapu nakłada się na kolumnę aniono-wymienną, przy stosunku objętość ładowania/objętość kolumny wynoszącym od 1:1 do 10:1.
20. 20. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że stosunek objętość ładowania/objętość kolumny wynosi 10:1.
21. 21. Sposób według zastrz. 19 albo 20, znamienny tym, że białko wymywa się etanoloaminąHCl, buforem NaCl a białko w postaci monomerycznej jest zawarte głównie we frakcjach zawierających materiał nie związany z żywicą, podczas gdy białko w postaci dimerycznej jest zasadniczo zawarte w następnych frakcjach wymywanych przy stężeniu NaCl wynoszącym 150 do 250 mM.
22. 22. Sposób według jednego z zastrz. 1-21, znamienny tym, że w etapie (V) roztwór wymywany w poprzednim etapie przy stężeniu NaCl wynoszącym 150 do 250 mM rozcieńcza się i nakłada na kolumnę do chromatografii w odwróconej fazie, w ilości odpowiadającej gęstości optycznej wynoszącej 4,5 do 5,5 OD przy 280 nm na ml żywicy.
23. 23. Sposób według zastrz. 1 i 22, znamienny tym, że pierwszy etap wymywania prowadzi się w warunkach rosnącego gradientu rozpuszczalnika organicznego do pojawienia się piku wymywania postaci monomerycznej, po czym kontynuuje się wymywanie w warunkach izokratycznych do wyczerpania piku wymywania postaci monomerycznej, a drugi etap prowadzi się w warunkach rosnącego gradientu rozpuszczalnika organicznego do całkowitego wymycia białka w postaci głównie dimerycznej.
24. 24. Sposób według zastrz. 22 albo 23, znamienny tym, że stosuje się bufor do wymywania zawierający etanol, metanol lub acetonitryl.

    PL 206 761 B1
25. 25. Sposób według jednego z zastrz. 22-24, znamienny tym, że jako bufor do wymywania stosuje się roztwór wodno-alkoholowy zawierający rosnące odsetki procentowe etanolu.
26. 26. Sposób według jednego z zastrz. 22-25, znamienny tym, że chromatografię w odwróconej fazie prowadzi się na żywicy mającej przeciętną średnicę cząstek wynoszącą 30 mikronów.
27. 27. Sposób według jednego z zastrz. 1-26, znamienny tym, że obejmuje po etapie (V) dodatkowy etap ultrafiltracji, po którym następuje liofilizacja w obecności odpowiednich dodatków.
28. 28. Łożyskowy czynnik wzrostu w postaci aktywnej otrzymany sposobem określonym w jednym z zastrz. 1-24, znamienny tym, że jest wolny od zanieczyszczeń ze szczepu gospodarza oraz zawiera postać monomeryczną w odsetku nie wyższym niż 1,5% i występuje zasadniczo w postaci dimerycznej i multimerycznej.