JP2001519149A - 双性イオン性低分子量物質の使用によるタンパク質の再生方法 - Google Patents
双性イオン性低分子量物質の使用によるタンパク質の再生方法Info
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Abstract
(57)【要約】
ＴＧＦ−βファミリーの蛋白の再生方法を開示する。該方法は、非デタージェント性双性イオン性化合物である１またはそれ以上の化合物、例えば、スルホベタイン、置換ピリジン、置換ピロールおよび酸置換アミノシクロヘキサンを再生剤として使用する。
Description
【０００１】 本発明はタンパク質の再生方法、とりわけ骨形態形成タンパク質（「ＢＭＰ」
）のごときタンパク質の形質転換成長因子ベータ（「ＴＧＦ−β」）スーパーフ
ァミリーのタンパク質のメンバーの再生方法に関する。これらの方法はとりわけ
細菌細胞培養で不溶性形態で生成される生物学的に活性な二量体の組換え骨形態
形成タンパク質の製造方法の改良に有用である。
）のごときタンパク質の形質転換成長因子ベータ（「ＴＧＦ−β」）スーパーフ
ァミリーのタンパク質のメンバーの再生方法に関する。これらの方法はとりわけ
細菌細胞培養で不溶性形態で生成される生物学的に活性な二量体の組換え骨形態
形成タンパク質の製造方法の改良に有用である。
【０００２】発明の背景 最近、当該分野で骨形態形成タンパク質と称する多くのタンパク質を哺乳動物
に移植すると骨または軟骨形成を誘起できることが判明している。たとえば、Ｗ
ａｎｇら、米国特許第５０１３６４９号（出典明示により本明細書の一部とする
）ではウシおよびヒトの骨形態形成タンパク質２Ａ（現在は骨形成形態タンパク
質―２という）および２Ｂ（現在は骨形成形態タンパク質―４という）をコード
するＤＮＡ配列；これらのＤＮＡ配列によりコードされる対応するタンパク質、
ならびにＢＭＰ−２Ａ（現在はＢＭＰ−２という）およびＢＭＰ−２Ｂ（現在は
ＢＭＰ−４という）タンパク質の組換え製造方法について記載されている。これ
らのタンパク質は哺乳動物における骨および軟骨損傷および障害の治療において
広範な医学的適用が可能であると考えられる。これらの骨形態形成タンパク質に
関して予期される医学的な必要性を充たすためには非常に多量の生物学的に活性
なタンパク質が必要であろう。
に移植すると骨または軟骨形成を誘起できることが判明している。たとえば、Ｗ
ａｎｇら、米国特許第５０１３６４９号（出典明示により本明細書の一部とする
）ではウシおよびヒトの骨形態形成タンパク質２Ａ（現在は骨形成形態タンパク
質―２という）および２Ｂ（現在は骨形成形態タンパク質―４という）をコード
するＤＮＡ配列；これらのＤＮＡ配列によりコードされる対応するタンパク質、
ならびにＢＭＰ−２Ａ（現在はＢＭＰ−２という）およびＢＭＰ−２Ｂ（現在は
ＢＭＰ−４という）タンパク質の組換え製造方法について記載されている。これ
らのタンパク質は哺乳動物における骨および軟骨損傷および障害の治療において
広範な医学的適用が可能であると考えられる。これらの骨形態形成タンパク質に
関して予期される医学的な必要性を充たすためには非常に多量の生物学的に活性
なタンパク質が必要であろう。
【０００３】 骨形態形成タンパク質の組換え製造は真核および原核細胞培養系の両方で可能
である。細菌のごとき原核細胞における異種性タンパク質の組換え製造において
、封入体として知られている不溶性の細胞内沈殿物が形成されるのが一般的であ
る。細菌では通常異種性タンパク質をコードするＤＮＡ配列を正確に転写し翻訳
することができるが、これらの原核細胞ではある種の異種性タンパク質を十分正
確に折りたたみ、可溶性形態を生成させることができない。これはとりわけ骨形
態形成タンパク質のごとき真核生物由来のタンパク質を原核生物で発現させる場
合にあてはまる。不適切に折りたたまれた異種性タンパク質が形成されると、組
換え哺乳動物タンパク質を生成するための細菌発酵の商業利用がある程度限定さ
れざるを得ない。細菌において生成する場合、組換え骨形態形成タンパク質は封
入体において凝集した、生物学的に不活性な形態でしばしば見出される。
である。細菌のごとき原核細胞における異種性タンパク質の組換え製造において
、封入体として知られている不溶性の細胞内沈殿物が形成されるのが一般的であ
る。細菌では通常異種性タンパク質をコードするＤＮＡ配列を正確に転写し翻訳
することができるが、これらの原核細胞ではある種の異種性タンパク質を十分正
確に折りたたみ、可溶性形態を生成させることができない。これはとりわけ骨形
態形成タンパク質のごとき真核生物由来のタンパク質を原核生物で発現させる場
合にあてはまる。不適切に折りたたまれた異種性タンパク質が形成されると、組
換え哺乳動物タンパク質を生成するための細菌発酵の商業利用がある程度限定さ
れざるを得ない。細菌において生成する場合、組換え骨形態形成タンパク質は封
入体において凝集した、生物学的に不活性な形態でしばしば見出される。
【０００４】 細菌の封入体から正確に折りたたまれた異種性タンパク質を得るいくつかの方
法が周知である。これらの方法は一般に酸またはカオトロピック試薬を用いてタ
ンパク質を変性させることにより、封入体からタンパク質を可溶化する。続いて
、タンパク質を生物学的に活性な形態に再生させる再生バッファー中に希釈する
。タンパク質の一次アミノ酸配列にシステイン残基が存在する場合、ジスルフィ
ド結合を正確に形成させることができる環境（レドックスシステム（redox syst
em））で再生を達成させることがしばしば必要である。再生の常法に関してはＫ
ｏｈｎｏ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１８５：１８７−１９５（１９９０）に記載
されている。
法が周知である。これらの方法は一般に酸またはカオトロピック試薬を用いてタ
ンパク質を変性させることにより、封入体からタンパク質を可溶化する。続いて
、タンパク質を生物学的に活性な形態に再生させる再生バッファー中に希釈する
。タンパク質の一次アミノ酸配列にシステイン残基が存在する場合、ジスルフィ
ド結合を正確に形成させることができる環境（レドックスシステム（redox syst
em））で再生を達成させることがしばしば必要である。再生の常法に関してはＫ
ｏｈｎｏ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１８５：１８７−１９５（１９９０）に記載
されている。
【０００５】 ＥＰ４３３２２５ではカオトロピック試薬およびレドックスシステムに加え、
デタージェントの形態の可溶化剤を用いる、形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）
様タンパク質を再生する方法について記載されている。ＥＰ４３３２２５では、
そこで開示される方法は一般にＴＧＦ−βファミリーの構成要素間の相同性の程
度に基づいて「ＴＧＦ−β様タンパク質」に適用できると予測している。しかし
ながら、ＥＰ４３３２２５に開示される方法では、細菌で生成した非常に多くの
ＢＭＰに適用しても、正確に折りたたまれた生物学的に活性な二量体タンパク質
は望ましくない低容量でしか生成されないことを本発明は見出した。加えて、開
示された方法では可溶化剤として３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアン
モニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）およびその他の高価な化合
物を用いる。
デタージェントの形態の可溶化剤を用いる、形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）
様タンパク質を再生する方法について記載されている。ＥＰ４３３２２５では、
そこで開示される方法は一般にＴＧＦ−βファミリーの構成要素間の相同性の程
度に基づいて「ＴＧＦ−β様タンパク質」に適用できると予測している。しかし
ながら、ＥＰ４３３２２５に開示される方法では、細菌で生成した非常に多くの
ＢＭＰに適用しても、正確に折りたたまれた生物学的に活性な二量体タンパク質
は望ましくない低容量でしか生成されないことを本発明は見出した。加えて、開
示された方法では可溶化剤として３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアン
モニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）およびその他の高価な化合
物を用いる。
【０００６】 ニワトリ卵白リゾチーム（ＨＥＷＬ）およびβ―Ｄ−ガラクトシダーゼを再生
する試みに非デタージェント性スルホベタインを用いた。しかしながら、これら
の試みはそれほど効果的でなく、現実的には収量などの欠点があった。たとえば
、ある種のスルホベタインはβ―ガラクトシダーゼの収量が１００倍の率で減少
した。Ｇｏｌｄｂｅｒｇら、Ｆｏｌｄｉｎｇ Ｄｅｓｉｇｎ，１：２１−２７（
１９９６）。従って、これらの分子は再生試薬として、とりわけＴＧＦ−βタン
パク質のごとき多量体タンパク質の再生における使用において広範に効果的であ
るとは言いがたいことが示された。
する試みに非デタージェント性スルホベタインを用いた。しかしながら、これら
の試みはそれほど効果的でなく、現実的には収量などの欠点があった。たとえば
、ある種のスルホベタインはβ―ガラクトシダーゼの収量が１００倍の率で減少
した。Ｇｏｌｄｂｅｒｇら、Ｆｏｌｄｉｎｇ Ｄｅｓｉｇｎ，１：２１−２７（
１９９６）。従って、これらの分子は再生試薬として、とりわけＴＧＦ−βタン
パク質のごとき多量体タンパク質の再生における使用において広範に効果的であ
るとは言いがたいことが示された。
【０００７】発明の要旨 非デタージェント性窒素含有化合物を再生剤として使用して二量体タンパク質
を復元し、正確に再生する方法を用いて、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のごとき
細菌の培養物からＴＧＦ−βスーパーファミリーの二量体タンパク質、とりわけ
骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）が効果的に得られ、再生できることが、意外な
ことに明らかになった。なかでも本発明に有用な化合物は非デタージェント性双
性イオン、ピリジン、ピロールおよび酸置換されたアミノシクロヘキサンの類で
ある。
を復元し、正確に再生する方法を用いて、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のごとき
細菌の培養物からＴＧＦ−βスーパーファミリーの二量体タンパク質、とりわけ
骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）が効果的に得られ、再生できることが、意外な
ことに明らかになった。なかでも本発明に有用な化合物は非デタージェント性双
性イオン、ピリジン、ピロールおよび酸置換されたアミノシクロヘキサンの類で
ある。
【０００８】 従って、一例を挙げると、本発明はこの方法の試薬として非デタージェント性
化合物を用いて細菌細胞培養から適切に再生されたＴＧＦ−βスーパーファミリ
ーのタンパク質を生成する方法からなる。細菌細胞培養はイー・コリが好ましい
が、別の細菌または原核細胞培養型でもよい。タンパク質はＴＧＦ−βスーパー
ファミリーのいずれのタンパク質でもよく、好ましくはＢＭＰファミリーの構成
員、または成長および分化因子（「ＧＤＦ」）ならびにＭＰ５２および本明細書
においてさらに記載する別のタンパク質である。非デタージェント性化合物は窒
素含有および／または双性イオンでよく、好ましくは芳香性または脂肪族環を含
み、好ましくは窒素を含有し、好ましくはカルボキシル基またはスルフヒドリル
基のごとき求電子性または電子受容体末端基を含む置換基で置換されている。本
明細書に有用な別の末端基にはアミド基などがある。非デタージェント性化合物
をスルホベタイン、ピリジン、ピロールおよびアミノシクロヘキサンからなる群
から選択するのが好ましい。
化合物を用いて細菌細胞培養から適切に再生されたＴＧＦ−βスーパーファミリ
ーのタンパク質を生成する方法からなる。細菌細胞培養はイー・コリが好ましい
が、別の細菌または原核細胞培養型でもよい。タンパク質はＴＧＦ−βスーパー
ファミリーのいずれのタンパク質でもよく、好ましくはＢＭＰファミリーの構成
員、または成長および分化因子（「ＧＤＦ」）ならびにＭＰ５２および本明細書
においてさらに記載する別のタンパク質である。非デタージェント性化合物は窒
素含有および／または双性イオンでよく、好ましくは芳香性または脂肪族環を含
み、好ましくは窒素を含有し、好ましくはカルボキシル基またはスルフヒドリル
基のごとき求電子性または電子受容体末端基を含む置換基で置換されている。本
明細書に有用な別の末端基にはアミド基などがある。非デタージェント性化合物
をスルホベタイン、ピリジン、ピロールおよびアミノシクロヘキサンからなる群
から選択するのが好ましい。
【０００９】 本発明の方法に有用な非デタージェント性双性イオンにはスルホベタインおよ
びピリジニウムピロパンスルホネート、たとえば３−（１−ピリジノ）−１−プ
ロパンスルホネート（「３−１−ＰＰＳ」）などがある。本発明に有用なピリジ
ン化合物は酸またはアミド置換体が好ましく、ピリジン３−スルホン酸、ピリジ
ン−２−カルボン酸（ニコチン酸またはナイアシンまたはビタミンＢとしても周
知である）、ピコリン酸、３−ピリジル酢酸塩酸塩、４−ピリジル酢酸塩酸塩、
イソニコチン酸およびニコチンアミドなどがある。本発明に有用なピロール化合
物には前記のピリジン化合物のピロールアナログなどがある。たとえば、ピロー
ル−２カルボン酸、ニコチン酸のピロールアナログが本発明の方法に有効である
。本発明に有用な別の非デタージェント性双性イオン性化合物は窒素を含有する
芳香環を有する化合物であって、さらに電子受容性置換基を含有する化合物、た
とえばＮ−メチル−Ｎ−ピペリジンプロパンスルホン酸、トリゴネリン塩酸塩お
よび１−カルボキシメチルピリジニウムクロライドなどである。
びピリジニウムピロパンスルホネート、たとえば３−（１−ピリジノ）−１−プ
ロパンスルホネート（「３−１−ＰＰＳ」）などがある。本発明に有用なピリジ
ン化合物は酸またはアミド置換体が好ましく、ピリジン３−スルホン酸、ピリジ
ン−２−カルボン酸（ニコチン酸またはナイアシンまたはビタミンＢとしても周
知である）、ピコリン酸、３−ピリジル酢酸塩酸塩、４−ピリジル酢酸塩酸塩、
イソニコチン酸およびニコチンアミドなどがある。本発明に有用なピロール化合
物には前記のピリジン化合物のピロールアナログなどがある。たとえば、ピロー
ル−２カルボン酸、ニコチン酸のピロールアナログが本発明の方法に有効である
。本発明に有用な別の非デタージェント性双性イオン性化合物は窒素を含有する
芳香環を有する化合物であって、さらに電子受容性置換基を含有する化合物、た
とえばＮ−メチル−Ｎ−ピペリジンプロパンスルホン酸、トリゴネリン塩酸塩お
よび１−カルボキシメチルピリジニウムクロライドなどである。
【００１０】 ピリジンおよびピロール以外で本発明に有用な酸置換されたアミノシクロヘキ
サン化合物はカルボキシルまたはスルフヒドリル基のごとき電子受容基を有する
アミン置換基を有する脂肪族環を含有する。たとえば、２−アミノシクロヘキサ
ンカルボン酸、３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸（ＣＡ
ＰＳ）、３−（シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（
ＣＡＰＳＯ）および２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸（ＣＨＥＳ
）が各々本発明の方法に有効である。
サン化合物はカルボキシルまたはスルフヒドリル基のごとき電子受容基を有する
アミン置換基を有する脂肪族環を含有する。たとえば、２−アミノシクロヘキサ
ンカルボン酸、３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸（ＣＡ
ＰＳ）、３−（シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（
ＣＡＰＳＯ）および２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸（ＣＨＥＳ
）が各々本発明の方法に有効である。
【００１１】 本発明の方法はさらにこれらの化合物の多くが比較的安価であり、市販されて
いるという点でさらに優れている。たとえば、３−１−ＰＰＳはフルカ・ケミカ
ル・カンパニーから市販されており、一方ビタミンＢは食餌性補助剤および食品
添加物として広範に製造されている。
いるという点でさらに優れている。たとえば、３−１−ＰＰＳはフルカ・ケミカ
ル・カンパニーから市販されており、一方ビタミンＢは食餌性補助剤および食品
添加物として広範に製造されている。
【００１２】発明の詳細な説明 本発明の方法を用いて組換えにより製造できるタンパク質のなかでＢＭＰ−２
、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７はたとえ
ば米国特許第５０１３６４９；５１１６７３８；５１０６７４８；５１８７０７
６および５１４１９０５号に開示されており；ＢＭＰ−８はＰＣＴ公開ＷＯ９１
／１８０９８に開示されており；ＢＭＰ−９はＰＣＴ公開ＷＯ９３／００４３２
に開示されており；ＢＭＰ−１０はＰＣＴ出願ＷＯ９４／２６８９３に開示され
ており；ＢＭＰ−１１はＰＣＴ出願ＷＯ９４／２６８９２に開示されており；Ｂ
ＭＰ−１２またはＢＭＰ−１３はＰＣＴ出願ＷＯ９５／１６０３５に開示されて
おり、またはＢＭＰ−１５は米国特許第１６３５３７２号に開示されている。本
発明の方法により製造できるＴＧＦ−βスーパーファミリーのその他のタンパク
質にはＪｏｎｅｓら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．６：１９６１−１９６８
（１９９２）に開示されているＶｇｒ−２；ＷＯ９４／０１５５７に開示されて
いるＢＩＰ；ＪＰ公開番号：７−２５０６８８に開示されているＨＰ００２６９
；およびＰＣＴ出願ＷＯ９３／１６０９９に開示されているＭＰ５２ならびにＰ
ＣＴ出願ＷＯ９４／１５９６５；ＷＯ９４／１５９４９；ＷＯ９５／０１８０１
；ＷＯ９５／０１８０２；ＷＯ９４／２１６８１；ＷＯ９４／１５９６６；ＷＯ
９５／１０５３９；ＷＯ９６／０１８４５；ＷＯ９６／０２５５９等に記載され
ている因子などのいずれかの成長および分化因子（ＧＤＦ）などがある。本発明
の方法を用いて、細菌から商業規模の量のＢＭＰホモ二量体またはヘテロ二量体
を製造し、生物学的に活性な二量体分子に再生できる。ＢＭＰのヘテロ二量体の
製造に関してはたとえばＷＯ９３／１９２２９に記載されている。前記の出願は
全て出典明示により本明細書の一部とする。
、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７はたとえ
ば米国特許第５０１３６４９；５１１６７３８；５１０６７４８；５１８７０７
６および５１４１９０５号に開示されており；ＢＭＰ−８はＰＣＴ公開ＷＯ９１
／１８０９８に開示されており；ＢＭＰ−９はＰＣＴ公開ＷＯ９３／００４３２
に開示されており；ＢＭＰ−１０はＰＣＴ出願ＷＯ９４／２６８９３に開示され
ており；ＢＭＰ−１１はＰＣＴ出願ＷＯ９４／２６８９２に開示されており；Ｂ
ＭＰ−１２またはＢＭＰ−１３はＰＣＴ出願ＷＯ９５／１６０３５に開示されて
おり、またはＢＭＰ−１５は米国特許第１６３５３７２号に開示されている。本
発明の方法により製造できるＴＧＦ−βスーパーファミリーのその他のタンパク
質にはＪｏｎｅｓら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．６：１９６１−１９６８
（１９９２）に開示されているＶｇｒ−２；ＷＯ９４／０１５５７に開示されて
いるＢＩＰ；ＪＰ公開番号：７−２５０６８８に開示されているＨＰ００２６９
；およびＰＣＴ出願ＷＯ９３／１６０９９に開示されているＭＰ５２ならびにＰ
ＣＴ出願ＷＯ９４／１５９６５；ＷＯ９４／１５９４９；ＷＯ９５／０１８０１
；ＷＯ９５／０１８０２；ＷＯ９４／２１６８１；ＷＯ９４／１５９６６；ＷＯ
９５／１０５３９；ＷＯ９６／０１８４５；ＷＯ９６／０２５５９等に記載され
ている因子などのいずれかの成長および分化因子（ＧＤＦ）などがある。本発明
の方法を用いて、細菌から商業規模の量のＢＭＰホモ二量体またはヘテロ二量体
を製造し、生物学的に活性な二量体分子に再生できる。ＢＭＰのヘテロ二量体の
製造に関してはたとえばＷＯ９３／１９２２９に記載されている。前記の出願は
全て出典明示により本明細書の一部とする。
【００１３】 いずれかの細菌種を用いて本発明の方法における再生のための組換えＢＭＰを
生成することができる。好ましくは、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）または大腸菌（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を用いてＢＭＰを含有する封入体を製造する。最も好
ましくは大腸菌を用いて本発明の方法における再生のためのＢＭＰを含有する封
入体を製造する。異種性タンパク質を発現できる株であればイー・コリのいずれ
の株を用いても本発明の方法における再生のためのＢＭＰを製造できる。好まし
い株の一つであるイー・コリＧＩ７２４（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号：５５１５
１）またはＧＩ７７４（ｔｈｙＡを含まない）を用いて本発明の方法における再
生のためのＢＭＰを製造できる。
生成することができる。好ましくは、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）または大腸菌（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を用いてＢＭＰを含有する封入体を製造する。最も好
ましくは大腸菌を用いて本発明の方法における再生のためのＢＭＰを含有する封
入体を製造する。異種性タンパク質を発現できる株であればイー・コリのいずれ
の株を用いても本発明の方法における再生のためのＢＭＰを製造できる。好まし
い株の一つであるイー・コリＧＩ７２４（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号：５５１５
１）またはＧＩ７７４（ｔｈｙＡを含まない）を用いて本発明の方法における再
生のためのＢＭＰを製造できる。
【００１４】 本発明の方法を用いて、周知の方法で細菌内でＢＭＰを製造できる。細菌発現
を最適にするためにＢＭＰのＮ末端配列を修飾する必要がある場合もある。たと
えば、イー・コリではホルミルメチオニンとグルタミンの間で結合を切断するの
は効率的ではないので、グルタミン残基を除去することにより元来の成熟ＢＭＰ
−２タンパク質（Ｍｅｔ−ｇｌｎ−ａｌａ−ｌｙｓ）を修飾し、イー・コリ内で
のＢＭＰ−２生成により適したＮ末端を作る（Ｍｅｔ−ａｌａ−ｌｙｓ−ｈｉｓ
）。別の細菌種ではそれから得られる変異ＢＭＰの収率を最適にするために類似
の修飾が必要とされるかもしれない。かかる修飾は当該分野の通常の技術範囲で
ある。
を最適にするためにＢＭＰのＮ末端配列を修飾する必要がある場合もある。たと
えば、イー・コリではホルミルメチオニンとグルタミンの間で結合を切断するの
は効率的ではないので、グルタミン残基を除去することにより元来の成熟ＢＭＰ
−２タンパク質（Ｍｅｔ−ｇｌｎ−ａｌａ−ｌｙｓ）を修飾し、イー・コリ内で
のＢＭＰ−２生成により適したＮ末端を作る（Ｍｅｔ−ａｌａ−ｌｙｓ−ｈｉｓ
）。別の細菌種ではそれから得られる変異ＢＭＰの収率を最適にするために類似
の修飾が必要とされるかもしれない。かかる修飾は当該分野の通常の技術範囲で
ある。
【００１５】 ＢＭＰをコードする修飾または非修飾ヌクレオチド配列を形質転換および細菌
内のこれらの異種性タンパク質の発現に適したプラスミドに挿入できる。選択し
た細菌内でＢＭＰのごとき異種性タンパク質の発現を指示できるならば、いずれ
の細菌発現プラスミドを用いてもよい。許容できる細菌種には、枯草菌（Ｂ．ｓ
ｕｂｔｉｌｉｓ）、シュウドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、およびイー
・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）などがある。これらの種の各々に適した発現プラスミド
は当該分野で周知である。細菌内でＢＭＰを生成するために適当なベクターはＴ
ａｎｉｇｕｃｈｉら、ＰＮＡＳ：ＵＳＡ，７７：５２３０−５２３３（１９８０
）に記載されている。
内のこれらの異種性タンパク質の発現に適したプラスミドに挿入できる。選択し
た細菌内でＢＭＰのごとき異種性タンパク質の発現を指示できるならば、いずれ
の細菌発現プラスミドを用いてもよい。許容できる細菌種には、枯草菌（Ｂ．ｓ
ｕｂｔｉｌｉｓ）、シュウドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、およびイー
・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）などがある。これらの種の各々に適した発現プラスミド
は当該分野で周知である。細菌内でＢＭＰを生成するために適当なベクターはＴ
ａｎｉｇｕｃｈｉら、ＰＮＡＳ：ＵＳＡ，７７：５２３０−５２３３（１９８０
）に記載されている。
【００１６】 細菌発現プラスミドを常法でコンピテント細菌細胞に形質転換できる。圧選択
に薬物抵抗を用いる場合、適当な薬物を含有する培地での成長、または圧選択に
栄養要求を用いる場合、適当な栄養を欠く培地での成長に関して形質転換体を選
別する。異種性タンパク質の発現は常法を用いて最適化できる。このようにして
得られたＢＭＰは、粉砕し、遠心した細胞のペレットに見出される不溶性で屈折
力のある封入体に存在する。
に薬物抵抗を用いる場合、適当な薬物を含有する培地での成長、または圧選択に
栄養要求を用いる場合、適当な栄養を欠く培地での成長に関して形質転換体を選
別する。異種性タンパク質の発現は常法を用いて最適化できる。このようにして
得られたＢＭＰは、粉砕し、遠心した細胞のペレットに見出される不溶性で屈折
力のある封入体に存在する。
【００１７】 このようにして得られた封入体をグアニジン塩酸塩のごとき変性剤を用いるか
、または酢酸もしくはギ酸のごとき酸で酸性にすることにより可溶化できる。変
性剤を用いて可溶化する場合、β―メルカプトエタノール、グルタチオン、また
はジチオスレイトールのごとき還元剤を変性剤と共に加える。酸性にすることに
よりタンパク質を可溶化する場合、酸性にする前に還元すべきである。 サイズ排除クロマトグラフィーまたは逆相高速液体クロマトグラフィーのごと
き周知のクロマトグラフ法を用いて、再生する前に可溶化した異種性タンパク質
をさらに精製できる。次いでＢＭＰを含有する溶液の容積を減じるか、または減
圧デシケーターでクロマトグラフィーバッファーを除去し、培地に再溶解する。
別法として、還元した可溶性タンパク質を再生培地に希釈して再生できる。たと
えば、適当な培地には以下の培地等がある： （ａ）５０ｍＭ トリス； （ｂ）１．０Ｍ ＮａＣｌ； （ｃ）０．７Ｍ ２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）
または１．０Ｍ ３−（１−ピリジニオ）−プロパンスルホネート（３−１−Ｐ
ＰＳ）または０．４Ｍ ピロール−２カルボン酸または０．７０Ｍ ニコチン酸
； （ｄ）５ｍＭ ＥＤＴＡ； （ｅ）２ｍＭ グルタチオン（還元型） （ｆ）１ｍＭ グルタチオン（酸化型） （ｇ）ｐＨ約８．５。
、または酢酸もしくはギ酸のごとき酸で酸性にすることにより可溶化できる。変
性剤を用いて可溶化する場合、β―メルカプトエタノール、グルタチオン、また
はジチオスレイトールのごとき還元剤を変性剤と共に加える。酸性にすることに
よりタンパク質を可溶化する場合、酸性にする前に還元すべきである。 サイズ排除クロマトグラフィーまたは逆相高速液体クロマトグラフィーのごと
き周知のクロマトグラフ法を用いて、再生する前に可溶化した異種性タンパク質
をさらに精製できる。次いでＢＭＰを含有する溶液の容積を減じるか、または減
圧デシケーターでクロマトグラフィーバッファーを除去し、培地に再溶解する。
別法として、還元した可溶性タンパク質を再生培地に希釈して再生できる。たと
えば、適当な培地には以下の培地等がある： （ａ）５０ｍＭ トリス； （ｂ）１．０Ｍ ＮａＣｌ； （ｃ）０．７Ｍ ２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）
または１．０Ｍ ３−（１−ピリジニオ）−プロパンスルホネート（３−１−Ｐ
ＰＳ）または０．４Ｍ ピロール−２カルボン酸または０．７０Ｍ ニコチン酸
； （ｄ）５ｍＭ ＥＤＴＡ； （ｅ）２ｍＭ グルタチオン（還元型） （ｆ）１ｍＭ グルタチオン（酸化型） （ｇ）ｐＨ約８．５。
【００１８】 再生に適したその他の培地には、低濃度のカオトロープ（たとえばグアニジン
塩酸塩）またはＢＭＰ封入体の可溶化に用いた酸の塩（たとえば酢酸塩）を含有
する培地などがある。再生は典型的には１ないし１００μｇ／ｍｌ タンパク質
濃度のＢＭＰで実施する。本発明によれば、高濃度、たとえば約１ｍｇ／ｍｌま
でのタンパク質で再生を実施するが、１００μｇ／ｍｌ以上のタンパク質濃度で
は沈殿または凝集を生じ、活性なＢＭＰホモ二量体またはヘテロ二量体の生成量
はそれに応じて減少し得る。
塩酸塩）またはＢＭＰ封入体の可溶化に用いた酸の塩（たとえば酢酸塩）を含有
する培地などがある。再生は典型的には１ないし１００μｇ／ｍｌ タンパク質
濃度のＢＭＰで実施する。本発明によれば、高濃度、たとえば約１ｍｇ／ｍｌま
でのタンパク質で再生を実施するが、１００μｇ／ｍｌ以上のタンパク質濃度で
は沈殿または凝集を生じ、活性なＢＭＰホモ二量体またはヘテロ二量体の生成量
はそれに応じて減少し得る。
【００１９】 ヘテロ二量体を生成するために、各々別個のＢＭＰのコーディング配列を含有
する等量の２個のプラスミド［たとえばＢＭＰ−２をコードするｐＡＬＢＰおよ
びＢＭＰ−ＸをコードするｐＡＬＢＰＸ（ここでＸはＢＭＰ−２以外のＢＭＰで
ある）］を用いて前記の方法を実施する。プラスミドを別々に培養し、得られた
封入体を可溶化し、本明細書に記載する方法に従って再生する。再生したタンパ
ク質単量体を等比で一緒に混合し、前記段落に記載したように反応させる。得ら
れた二量体タンパク質ではＢＭＰ−２のホモ二量体およびＢＭＰ−２／Ｘのヘテ
ロ二量体が含まれるのが観察される。これらの種を当該分野の常法により互いに
別々に分離できる。
する等量の２個のプラスミド［たとえばＢＭＰ−２をコードするｐＡＬＢＰおよ
びＢＭＰ−ＸをコードするｐＡＬＢＰＸ（ここでＸはＢＭＰ−２以外のＢＭＰで
ある）］を用いて前記の方法を実施する。プラスミドを別々に培養し、得られた
封入体を可溶化し、本明細書に記載する方法に従って再生する。再生したタンパ
ク質単量体を等比で一緒に混合し、前記段落に記載したように反応させる。得ら
れた二量体タンパク質ではＢＭＰ−２のホモ二量体およびＢＭＰ−２／Ｘのヘテ
ロ二量体が含まれるのが観察される。これらの種を当該分野の常法により互いに
別々に分離できる。
【００２０】 タンパク質を再生するために、以下の条件および培地を用いることができる：
約１０ｍＭないし約１００ｍＭ トリスまたはその他の適当なバッファー、好ま
しくは約５０ｍＭ トリス、約０．１ないし約４．０Ｍ ＮａＣｌまたはその他
の適当な塩、好ましくは約１．０Ｍ ＮａＣｌ、約０．０５ないし約２．０Ｍ
再生剤（非デタージェント性双性イオン性スルホベタイン、ピリジン、ピロール
、またはアミノシクロヘキサン）好ましくは約０．７Ｍ 再生剤、約１ｍＭない
し約１０ｍＭ ＥＤＴＡまたはその他の適当な金属イオンキレート剤、好ましく
は約 ５ｍＭ ＥＤＴＡ、グルタチオンのごとき適当なレドックスシステム、好
ましくは還元剤：酸化剤の比率が約１：１０ないし約１０：１、ｐＨは約７ない
し１１、好ましくは８．５。
約１０ｍＭないし約１００ｍＭ トリスまたはその他の適当なバッファー、好ま
しくは約５０ｍＭ トリス、約０．１ないし約４．０Ｍ ＮａＣｌまたはその他
の適当な塩、好ましくは約１．０Ｍ ＮａＣｌ、約０．０５ないし約２．０Ｍ
再生剤（非デタージェント性双性イオン性スルホベタイン、ピリジン、ピロール
、またはアミノシクロヘキサン）好ましくは約０．７Ｍ 再生剤、約１ｍＭない
し約１０ｍＭ ＥＤＴＡまたはその他の適当な金属イオンキレート剤、好ましく
は約 ５ｍＭ ＥＤＴＡ、グルタチオンのごとき適当なレドックスシステム、好
ましくは還元剤：酸化剤の比率が約１：１０ないし約１０：１、ｐＨは約７ない
し１１、好ましくは８．５。
【００２１】 ＢＭＰは活性な状態でジスルフィド結合二量体であるので、本発明の方法にお
けるチオール／ジスルフィド結合を形成できるレドックスシステムを含むことは
有用である。かかるレドックスシステムはいくつか知られている。たとえばグル
タチオン、ジチオスレイトール、β−メルカプトエタノール、β−メルカプトメ
タノール、シスチンおよびシスタミドの酸化型および還元型を、還元型：酸化型
の比率が約１：１０ないし約１０：１でレドックスシステムとして用いることが
できる。グルタチオンレドックスシステムを用いる場合、還元型グルタチオンの
酸化型グルタチオンに対する比率は１：１０が好ましく；１：１がより好ましく
；還元型：酸化型が２：１であるのが最も好ましい。
けるチオール／ジスルフィド結合を形成できるレドックスシステムを含むことは
有用である。かかるレドックスシステムはいくつか知られている。たとえばグル
タチオン、ジチオスレイトール、β−メルカプトエタノール、β−メルカプトメ
タノール、シスチンおよびシスタミドの酸化型および還元型を、還元型：酸化型
の比率が約１：１０ないし約１０：１でレドックスシステムとして用いることが
できる。グルタチオンレドックスシステムを用いる場合、還元型グルタチオンの
酸化型グルタチオンに対する比率は１：１０が好ましく；１：１がより好ましく
；還元型：酸化型が２：１であるのが最も好ましい。
【００２２】 再生剤に加えて、本発明の方法では塩部分を用いることができる。塩部分はＮ
ａＣｌが好ましく、濃度は約０．１Ｍないし約２．０Ｍが好ましく、好ましくは
約１．０Ｍである。再生剤の濃度変化に応じて塩化ナトリウム濃度を変化させる
のが好ましいであろう。 本発明の再生反応のｐＨは約７．０ないし約１１であるのが好ましく、約８な
いし約１０であるのがより好ましく、約８．５であるのが最も好ましい。 好ましくは、本発明の再生反応は約４℃ないし約３７℃の温度範囲で実施する
。より好ましくは、２０℃で再生反応を実施する。本発明の再生反応を８から１
２０時間完了するまで続け、９６時間が最も好ましい。
ａＣｌが好ましく、濃度は約０．１Ｍないし約２．０Ｍが好ましく、好ましくは
約１．０Ｍである。再生剤の濃度変化に応じて塩化ナトリウム濃度を変化させる
のが好ましいであろう。 本発明の再生反応のｐＨは約７．０ないし約１１であるのが好ましく、約８な
いし約１０であるのがより好ましく、約８．５であるのが最も好ましい。 好ましくは、本発明の再生反応は約４℃ないし約３７℃の温度範囲で実施する
。より好ましくは、２０℃で再生反応を実施する。本発明の再生反応を８から１
２０時間完了するまで続け、９６時間が最も好ましい。
【００２３】 得られる骨形態形成タンパク質の再生の程度をドデシル硫酸ナトリウム・ポリ
アクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により非還元およぎ還元条件下で
モニター観察する。たとえば、ＢＭＰ−４ホモ二量体は非還元条件下１６％ Ｓ
ＤＳポリアクリルアミドゲル上で約３０ｋＤの１本のバンドとして現れ；ＢＭＰ
−４単量体は還元条件下約１３ｋＤの１本のバンドとして現れる。ＢＭＰ−２／
５ヘテロ二量体は非還元条件下１６％ ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で約３
５ｋＤの１本のバンドとして現れ；ＢＭＰ−２単量体は還元条件下約１３ｋＤの
１本のバンドとして現れ；ＢＭＰ−５単量体は還元条件下約１５ｋＤの１本のバ
ンドとして現れる。ＢＭＰ−２／６ヘテロ二量体は非還元条件下１６％ ＳＤＳ
ポリアクリルアミドゲル上で約３５ｋＤの１本のバンドとして現れ；ＢＭＰ−２
単量体は還元条件下約１３ｋＤの１本のバンドとして現れ；ＢＭＰ−６単量体は
還元条件下約１５ｋＤの１本のバンドとして現れる。ＢＭＰ−２／７ヘテロ二量
体は非還元条件下１６％ ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で約３５ｋＤの１本
のバンドとして現れ；ＢＭＰ−２単量体は還元条件下約１３ｋＤの１本のバンド
として現れ；ＢＭＰ−７単量体は還元条件下約１５ｋＤの１本のバンドとして現
れる。
アクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により非還元およぎ還元条件下で
モニター観察する。たとえば、ＢＭＰ−４ホモ二量体は非還元条件下１６％ Ｓ
ＤＳポリアクリルアミドゲル上で約３０ｋＤの１本のバンドとして現れ；ＢＭＰ
−４単量体は還元条件下約１３ｋＤの１本のバンドとして現れる。ＢＭＰ−２／
５ヘテロ二量体は非還元条件下１６％ ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で約３
５ｋＤの１本のバンドとして現れ；ＢＭＰ−２単量体は還元条件下約１３ｋＤの
１本のバンドとして現れ；ＢＭＰ−５単量体は還元条件下約１５ｋＤの１本のバ
ンドとして現れる。ＢＭＰ−２／６ヘテロ二量体は非還元条件下１６％ ＳＤＳ
ポリアクリルアミドゲル上で約３５ｋＤの１本のバンドとして現れ；ＢＭＰ−２
単量体は還元条件下約１３ｋＤの１本のバンドとして現れ；ＢＭＰ−６単量体は
還元条件下約１５ｋＤの１本のバンドとして現れる。ＢＭＰ−２／７ヘテロ二量
体は非還元条件下１６％ ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で約３５ｋＤの１本
のバンドとして現れ；ＢＭＰ−２単量体は還元条件下約１３ｋＤの１本のバンド
として現れ；ＢＭＰ−７単量体は還元条件下約１５ｋＤの１本のバンドとして現
れる。
【００２４】 本発明を特定の理論または反応様式に限定しなければ、本発明に有用な化合物
の概念を統一すると、２個の領域の組み合わせを含む分子、通常窒素含有分子で
あると考えられる。第一に、分子は疎水性領域、たとえばピリジンまたはピロー
ル環のごとき芳香環を含有すべきである。別法として、シクロヘキサンのごとき
非芳香環または窒素が４級アミンの形態で含まれる非芳香窒素含有環、たとえば
Ｎ−メチル−Ｎ−ピペリジンプロパンスルホン酸（１―メチル―１−スルホニル
プロピルピペリジンとしても周知）でよい。第二に、分子は双性イオン性かまた
はアニオン性のいずれかを分子に付与する置換基領域を含有すべきである。好ま
しい具体例では、置換基領域は分子に双性イオン性を付与する。加えて、好まし
くは分子の疎水性および置換基領域は別個の位置に存在するように離れているべ
きである。好ましい具体例では、電子受容末端基は置換された芳香または脂肪族
窒素含有環から炭素４個しか離れておらず、より好ましくは置換された芳香また
は脂肪族窒素含有環から炭素３個しか離れていない。
の概念を統一すると、２個の領域の組み合わせを含む分子、通常窒素含有分子で
あると考えられる。第一に、分子は疎水性領域、たとえばピリジンまたはピロー
ル環のごとき芳香環を含有すべきである。別法として、シクロヘキサンのごとき
非芳香環または窒素が４級アミンの形態で含まれる非芳香窒素含有環、たとえば
Ｎ−メチル−Ｎ−ピペリジンプロパンスルホン酸（１―メチル―１−スルホニル
プロピルピペリジンとしても周知）でよい。第二に、分子は双性イオン性かまた
はアニオン性のいずれかを分子に付与する置換基領域を含有すべきである。好ま
しい具体例では、置換基領域は分子に双性イオン性を付与する。加えて、好まし
くは分子の疎水性および置換基領域は別個の位置に存在するように離れているべ
きである。好ましい具体例では、電子受容末端基は置換された芳香または脂肪族
窒素含有環から炭素４個しか離れておらず、より好ましくは置換された芳香また
は脂肪族窒素含有環から炭素３個しか離れていない。
【００２５】 従って、本発明の方法の再生剤として有用な化合物には、非デタージェント性
双性イオン性化合物などがある。本発明の目的のために、ある種の化合物が選択
されたｐＨ範囲で「双性イオン」であるが、それ以外では双性イオンでなくても
よいことは理解されるべきである。かかる化合物は、それが双性イオンであるｐ
Ｈにおいて本発明に有用であるのが好ましい。この群の好ましい化合物には非デ
タージェント性双性イオン、たとえばスルホベタインなどがあり、特定のピリジ
ンおよびピロールも含まれる。置換された脂肪族窒素含有環もまた、窒素が４級
アミンの形態である場合に有用である。好ましい一つの具体例では、非デタージ
ェント性スルホベタイン双性イオン３―（１―ピリジノ）―１−プロパンスルホ
ネート（「３−１−ＰＰＳ」）（フルカ・ケミカル・カンパニーより市販されて
いる）は本発明において有用である。
双性イオン性化合物などがある。本発明の目的のために、ある種の化合物が選択
されたｐＨ範囲で「双性イオン」であるが、それ以外では双性イオンでなくても
よいことは理解されるべきである。かかる化合物は、それが双性イオンであるｐ
Ｈにおいて本発明に有用であるのが好ましい。この群の好ましい化合物には非デ
タージェント性双性イオン、たとえばスルホベタインなどがあり、特定のピリジ
ンおよびピロールも含まれる。置換された脂肪族窒素含有環もまた、窒素が４級
アミンの形態である場合に有用である。好ましい一つの具体例では、非デタージ
ェント性スルホベタイン双性イオン３―（１―ピリジノ）―１−プロパンスルホ
ネート（「３−１−ＰＰＳ」）（フルカ・ケミカル・カンパニーより市販されて
いる）は本発明において有用である。
【００２６】 また、アミン基およびカルボキシル基またはスルフヒドリル基のごとき電子受
容基で置換されたシクロヘキサンのごとき脂肪族環からなる化合物もまた有効で
ある。このクラスの化合物はまた酸置換されたアミノシクロヘキサンとも称され
る。ある種の一般的な生物学的バッファーすなわち「グッドバッファー（Ｇｏｏ
ｄのバッファー）」がこの群の化合物に含まれ、２−（シクロヘキシルアミノ）
エタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパン
スルホン酸（ＣＡＰＳ）、３−（シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシプロ
パンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）などがある。本発明に有用な好ましい酸置換アミ
ノシクロヘキサンの別の例としては２−アミノシクロヘキサンカルボン酸が挙げ
られる。
容基で置換されたシクロヘキサンのごとき脂肪族環からなる化合物もまた有効で
ある。このクラスの化合物はまた酸置換されたアミノシクロヘキサンとも称され
る。ある種の一般的な生物学的バッファーすなわち「グッドバッファー（Ｇｏｏ
ｄのバッファー）」がこの群の化合物に含まれ、２−（シクロヘキシルアミノ）
エタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパン
スルホン酸（ＣＡＰＳ）、３−（シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシプロ
パンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）などがある。本発明に有用な好ましい酸置換アミ
ノシクロヘキサンの別の例としては２−アミノシクロヘキサンカルボン酸が挙げ
られる。
【００２７】 別法として、本発明の方法に有用な化合物には電子受容基、好ましくはカルボ
キシルもしくはスルフヒドリル基のごとき酸基またはアミド基で置換されたピリ
ジンおよびピロールのごとき置換された芳香窒素含有環を有する化合物などがあ
る。好ましい具体例では、ピリジンニコチン酸またはビタミンＢが本発明におい
て有用である。別のヘテロ環式化合物、たとえば電子受容基、好ましくはカルボ
キシルもしくはスルフヒドリル基のごとき酸基またはアミド基で置換されたプリ
ン、ジアジン、ピラゾールおよびイミダゾール、ならびにこれらの化合物の各々
の誘導体もまた本発明において有用である。
キシルもしくはスルフヒドリル基のごとき酸基またはアミド基で置換されたピリ
ジンおよびピロールのごとき置換された芳香窒素含有環を有する化合物などがあ
る。好ましい具体例では、ピリジンニコチン酸またはビタミンＢが本発明におい
て有用である。別のヘテロ環式化合物、たとえば電子受容基、好ましくはカルボ
キシルもしくはスルフヒドリル基のごとき酸基またはアミド基で置換されたプリ
ン、ジアジン、ピラゾールおよびイミダゾール、ならびにこれらの化合物の各々
の誘導体もまた本発明において有用である。
【００２８】 従って、一例を挙げると、本発明は前記した再生用化合物の一つを以下に詳述
するように該方法の試薬として用いて細菌細胞培養から適切に再生されたＴＧＦ
−βスーパーファミリーのタンパク質を発現する方法からなる。細菌細胞培養は
イー・コリが好ましいが、別の細菌または原核細胞培養型でもよい。タンパク質
はＴＧＦ−βスーパーファミリーのいずれのタンパク質でもよく、ＢＭＰファミ
リーの一員、または成長および分化因子（「ＧＤＦ」）ならびにＭＰ５２および
さらに本明細書で記載するその他のタンパク質であるのが好ましい。再生用化合
物を非デタージェント性スルホベタイン、ピリジン置換体、ピロール置換体およ
びアミノシクロヘキサンの酸置換体などの非デタージェント性双性イオンからな
る群から選択するのが好ましい。再生用化合物は疎水性領域、たとえば芳香環ま
たは脂肪族環を含んでなるのが好ましく、さらに置換領域たとえば電子受容末端
基、好ましくはカルボキシル基またはスルフヒドリル基のごとき酸基を含んでな
るのが好ましい。本発明に有用なその他の置換領域にはアミド基などがある。本
発明の方法に有用な非デタージェント性スルホベタインには３−（１―ピリジノ
）―１−プロパンスルホネート（「３−1−ＰＰＳ」）のごときピリジニウムプ ロパンスルホネートなどがある。本発明に有用なピリジン置換体にはピリジン３
−スルホン酸、ピリジン−２カルボン酸（ニコチン酸、ナイアシンまたはビタミ
ンＢとしても周知）、ピコリン酸、３−ピリジル酢酸塩酸塩、４−ピリジル酢酸
塩酸塩、イソニコチン酸およびニコチンアミドなどがある。本発明に有用なピロ
ール置換体には前記のピリジン化合物のピロールアナログなどがある。たとえば
ピロール−２カルボン酸、ピロール３−スルホン酸、３−ピロール酢酸塩酸塩、
２−ピロール酢酸塩酸塩２−ピロールエタンスルホン酸、３−ピロールヒドロキ
シメタンスルホン酸などがある。本発明に有用なアミノシクロヘキサン置換体に
は２−アミノシクロヘキサンカルボン酸、およびグッドバッファー、たとえばＣ
ＨＥＳ、ＣＡＰＳおよびＣＡＰＳＯなどがある。以下に本発明に有用ないくつか
の化合物を図示する。
するように該方法の試薬として用いて細菌細胞培養から適切に再生されたＴＧＦ
−βスーパーファミリーのタンパク質を発現する方法からなる。細菌細胞培養は
イー・コリが好ましいが、別の細菌または原核細胞培養型でもよい。タンパク質
はＴＧＦ−βスーパーファミリーのいずれのタンパク質でもよく、ＢＭＰファミ
リーの一員、または成長および分化因子（「ＧＤＦ」）ならびにＭＰ５２および
さらに本明細書で記載するその他のタンパク質であるのが好ましい。再生用化合
物を非デタージェント性スルホベタイン、ピリジン置換体、ピロール置換体およ
びアミノシクロヘキサンの酸置換体などの非デタージェント性双性イオンからな
る群から選択するのが好ましい。再生用化合物は疎水性領域、たとえば芳香環ま
たは脂肪族環を含んでなるのが好ましく、さらに置換領域たとえば電子受容末端
基、好ましくはカルボキシル基またはスルフヒドリル基のごとき酸基を含んでな
るのが好ましい。本発明に有用なその他の置換領域にはアミド基などがある。本
発明の方法に有用な非デタージェント性スルホベタインには３−（１―ピリジノ
）―１−プロパンスルホネート（「３−1−ＰＰＳ」）のごときピリジニウムプ ロパンスルホネートなどがある。本発明に有用なピリジン置換体にはピリジン３
−スルホン酸、ピリジン−２カルボン酸（ニコチン酸、ナイアシンまたはビタミ
ンＢとしても周知）、ピコリン酸、３−ピリジル酢酸塩酸塩、４−ピリジル酢酸
塩酸塩、イソニコチン酸およびニコチンアミドなどがある。本発明に有用なピロ
ール置換体には前記のピリジン化合物のピロールアナログなどがある。たとえば
ピロール−２カルボン酸、ピロール３−スルホン酸、３−ピロール酢酸塩酸塩、
２−ピロール酢酸塩酸塩２−ピロールエタンスルホン酸、３−ピロールヒドロキ
シメタンスルホン酸などがある。本発明に有用なアミノシクロヘキサン置換体に
は２−アミノシクロヘキサンカルボン酸、およびグッドバッファー、たとえばＣ
ＨＥＳ、ＣＡＰＳおよびＣＡＰＳＯなどがある。以下に本発明に有用ないくつか
の化合物を図示する。
【００２９】非デタージェント性双性イオン、ピリジン置換体およびニコチン酸誘導体
【化１】
【００３０】ピロール置換体
【化２】 ピリジンおよびピロール置換体以外に、本発明に有用なアミノシクロヘキサン
置換体はカルボキシル基またはスルフヒドリル基のごとき電子受容末端基で置換
されたアミンを有する脂肪族環を含有する。たとえばＣＨＥＳ、ＣＡＰＳおよび
ＣＡＰＳＯは各々本発明の方法において有効である。以下に有用な種々の化合物
を図示する。
置換体はカルボキシル基またはスルフヒドリル基のごとき電子受容末端基で置換
されたアミンを有する脂肪族環を含有する。たとえばＣＨＥＳ、ＣＡＰＳおよび
ＣＡＰＳＯは各々本発明の方法において有効である。以下に有用な種々の化合物
を図示する。
【００３１】 アミノシクロヘキサン置換体：
【化３】 実施例で示すようにＷ−２０アッセイにより再生された骨形態形成タンパク質
のイン・ビトロ生物学的活性をモニター観察できる。インジケーターセルライン
としてＷ−２０−１７骨髄間質細胞を用いるのはＢＭＰと反応させた後これらの
細胞が骨芽細胞様細胞に転換することに基づいている［Ｔｈｉｅｓら、Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５（２
）：３０５（１９９０）；およびＴｈｉｅｓら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，
１３０：１３１８−１３２４（１９９２）］。Ｗ−２０−１７細胞はＤｒ．Ｄ．
Ｎａｔｈａｎの研究室（チルドレンズ・ホスピタル、ボストン、メリーランド州
）の研究者により成熟マウスから誘導されたクローン性骨髄間質細胞系である。
Ｗ−２０−１７細胞をＢＭＰと反応させることにより結果的に（１）アルカリ性
ホスファターゼ生成の増加、（２）副甲状腺ホルモン刺激ｃＡＭＰの誘導、およ
び（３）細胞によるオステオカルシンの誘導に至る。（１）および（２）は骨芽
細胞表現型に関連する特性を表し、オステオカルシン合成能力は成熟骨芽細胞に
よってのみ示される表現型特性である。さらに、現在までのところ、Ｗ−２０−
１７間質細胞の骨芽細胞様細胞への転換は骨形態形成タンパク質と反応させた場
合のみに観察されている。
のイン・ビトロ生物学的活性をモニター観察できる。インジケーターセルライン
としてＷ−２０−１７骨髄間質細胞を用いるのはＢＭＰと反応させた後これらの
細胞が骨芽細胞様細胞に転換することに基づいている［Ｔｈｉｅｓら、Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５（２
）：３０５（１９９０）；およびＴｈｉｅｓら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，
１３０：１３１８−１３２４（１９９２）］。Ｗ−２０−１７細胞はＤｒ．Ｄ．
Ｎａｔｈａｎの研究室（チルドレンズ・ホスピタル、ボストン、メリーランド州
）の研究者により成熟マウスから誘導されたクローン性骨髄間質細胞系である。
Ｗ−２０−１７細胞をＢＭＰと反応させることにより結果的に（１）アルカリ性
ホスファターゼ生成の増加、（２）副甲状腺ホルモン刺激ｃＡＭＰの誘導、およ
び（３）細胞によるオステオカルシンの誘導に至る。（１）および（２）は骨芽
細胞表現型に関連する特性を表し、オステオカルシン合成能力は成熟骨芽細胞に
よってのみ示される表現型特性である。さらに、現在までのところ、Ｗ−２０−
１７間質細胞の骨芽細胞様細胞への転換は骨形態形成タンパク質と反応させた場
合のみに観察されている。
【００３２】 以下の実施例は再生反応において非デタージェント性双性イオン、ピリジン置
換体、ピロール置換体およびアミノシクロヘキサン酸置換体を用いて組換えヒト
ＢＭＰ−２タンパク質を発現し回収する場合の本発明の実施を説明するものであ
る。これらの実施例は限定するものではなく、当業者には非常に多くの修飾およ
び改変が可能であることは理解されよう。かかる修飾は本発明の一部である。本
明細書に関連する特許出願および参考文献の各々の開示は出典明示により本明細
書の一部とする。
換体、ピロール置換体およびアミノシクロヘキサン酸置換体を用いて組換えヒト
ＢＭＰ−２タンパク質を発現し回収する場合の本発明の実施を説明するものであ
る。これらの実施例は限定するものではなく、当業者には非常に多くの修飾およ
び改変が可能であることは理解されよう。かかる修飾は本発明の一部である。本
明細書に関連する特許出願および参考文献の各々の開示は出典明示により本明細
書の一部とする。
【００３３】実施例： 実施例１：イーコリにおけるＢＭＰの発現 以下の主要な特徴を含む発現プラスミドｐＡＬＢＰ２−７８１をイー・コリ内
でＢＭＰ−２を生成するように構築した。ヌクレオチド１−２０６０は宿主イー
・コリ株内で抗生物質アンピシリンに対する耐性を付与するβ―ラクタマーゼに
関する遺伝子を含有する配列およびｃｏｌＥ１由来の複製開始点を含むプラスミ
ドｐＵＣ−１８［Ｎｏｒｒａｎｄｅｒら、Ｇｅｎｅ，２６：１０１−１０６（１
９８３）］に由来するＤＮＡ配列を含む。ヌクレオチド２０６１−２２２１はバ
クテリオファージλの主要左方向プロモーター（ｐＬ）のＤＮＡ５配列を含み、
３個のオペレーター配列０L１、０L２および０L３を含む［Ｓａｎｇｅｒら、Ｊ ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６２：７２９−７７３（１９８２）］。オペレーターは
λｃＩレプレッサータンパク質の結合部位であり、その細胞内濃度がｐＬからの
転写開始の量を調節する。ヌクレオチド２２２２−２７２３は、Ｓａｎｇｅｒら
、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６２：７２９−７７３（１９８２）に記載されるバ
クテリオファージラムダのヌクレオチド３５４７２から３５５６６および３８１
３７から３８３６１に由来する配列に含まれる強力なリボソーム結合配列を含む
。ヌクレオチド２７２４−３１３３は３‘非翻訳配列のさらに６２個のヌクレオ
チドと共に成熟ＢＭＰ−２タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む。ヌクレオ
チド３１３４−３１４９は制限エンドヌクレアーゼ部位を含む「リンカー」ＤＮ
Ａ配列を提供する。ヌクレオチド３１５０−３２１８はイー・コリａｓｐＡ遺伝
子の配列に基づく転写終止配列を提供する［Ｔａｋａｇｉら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．１３：２０６３−２０７４（１９８５）］。ヌクレオチド３２１
９−３６２３はｐＵＣ−１８に由来するＤＮＡ配列である。
でＢＭＰ−２を生成するように構築した。ヌクレオチド１−２０６０は宿主イー
・コリ株内で抗生物質アンピシリンに対する耐性を付与するβ―ラクタマーゼに
関する遺伝子を含有する配列およびｃｏｌＥ１由来の複製開始点を含むプラスミ
ドｐＵＣ−１８［Ｎｏｒｒａｎｄｅｒら、Ｇｅｎｅ，２６：１０１−１０６（１
９８３）］に由来するＤＮＡ配列を含む。ヌクレオチド２０６１−２２２１はバ
クテリオファージλの主要左方向プロモーター（ｐＬ）のＤＮＡ５配列を含み、
３個のオペレーター配列０L１、０L２および０L３を含む［Ｓａｎｇｅｒら、Ｊ ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６２：７２９−７７３（１９８２）］。オペレーターは
λｃＩレプレッサータンパク質の結合部位であり、その細胞内濃度がｐＬからの
転写開始の量を調節する。ヌクレオチド２２２２−２７２３は、Ｓａｎｇｅｒら
、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６２：７２９−７７３（１９８２）に記載されるバ
クテリオファージラムダのヌクレオチド３５４７２から３５５６６および３８１
３７から３８３６１に由来する配列に含まれる強力なリボソーム結合配列を含む
。ヌクレオチド２７２４−３１３３は３‘非翻訳配列のさらに６２個のヌクレオ
チドと共に成熟ＢＭＰ−２タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む。ヌクレオ
チド３１３４−３１４９は制限エンドヌクレアーゼ部位を含む「リンカー」ＤＮ
Ａ配列を提供する。ヌクレオチド３１５０−３２１８はイー・コリａｓｐＡ遺伝
子の配列に基づく転写終止配列を提供する［Ｔａｋａｇｉら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．１３：２０６３−２０７４（１９８５）］。ヌクレオチド３２１
９−３６２３はｐＵＣ−１８に由来するＤＮＡ配列である。
【００３４】 制限エンドヌクレアーゼおよび当該分野で周知の方法を用いてｐＡＬＢＰ２−
７８１に含まれるＢＭＰ−２のコーディング配列をイー・コリ内での生成に望ま
しい別のＢＭＰのコーディング配列と容易に置換することができる。ｐＡＬＢＰ
２−７８１プラスミドにおけるこの置換により、以下の実施例を用いて本発明の
ＢＭＰのいずれかを発現および再生できる。望む場合、当業者は発現系を改善ま
たは簡便化するためにプラスミドおよび／またはセルラインの制御エレンメント
にさらなる修飾を行うことができる。
７８１に含まれるＢＭＰ−２のコーディング配列をイー・コリ内での生成に望ま
しい別のＢＭＰのコーディング配列と容易に置換することができる。ｐＡＬＢＰ
２−７８１プラスミドにおけるこの置換により、以下の実施例を用いて本発明の
ＢＭＰのいずれかを発現および再生できる。望む場合、当業者は発現系を改善ま
たは簡便化するためにプラスミドおよび／またはセルラインの制御エレンメント
にさらなる修飾を行うことができる。
【００３５】 ＤａｇｅｒｔおよびＥｈｒｌｉｃｈ、Ｇｅｎｅ，６：２３（１９７９）の方法
により、プラスミドｐＡＬＢＰ２−７８１をイー・コリ宿主株ＧＩ７２４（Ｆ、
ｌａｃＩq、ｌａｃｐL8、ａｍｐＣ：：λｃＩ+）に形質転換した。形質転換体を
ＩＭＣ培地｛これは１ｍＭ ＭｇＳＯ4、０．５重量／容量％ グルコース、０ ．２重量／容量％ カサミノ酸および１００μｇ／ｍｌ アンピシリンを補充し
たＭ９培地［Ｍｉｌｌｅｒ、「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、ニ
ューヨーク（１９７２）］である｝を含有する１．５重量／容量％ 寒天プレー
ト上で選別した。
により、プラスミドｐＡＬＢＰ２−７８１をイー・コリ宿主株ＧＩ７２４（Ｆ、
ｌａｃＩq、ｌａｃｐL8、ａｍｐＣ：：λｃＩ+）に形質転換した。形質転換体を
ＩＭＣ培地｛これは１ｍＭ ＭｇＳＯ4、０．５重量／容量％ グルコース、０ ．２重量／容量％ カサミノ酸および１００μｇ／ｍｌ アンピシリンを補充し
たＭ９培地［Ｍｉｌｌｅｒ、「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、ニ
ューヨーク（１９７２）］である｝を含有する１．５重量／容量％ 寒天プレー
ト上で選別した。
【００３６】 ｐＡＬＢＰ２−７８１で形質転換したＧＩ７２４を３ｘＭｇＳＯ4および２０ ０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＩＭＣ培地中３２℃でＡ600が１５になるまで 成長させた。ｔｈｙＡ遺伝子を担持しないイー・コリの別の系で成長させる場合
は、培地にアンピシリンは必要でない。培養物のグルコース濃度は約０．２（重
量／容量）％を維持した。ｐＨは７．５Ｍ 水酸化アンモニウムを用いて７．２
を維持した。最終濃度１００μｇ／ｍｌでトリプトファンを加え、培養物を３７
℃でさらに４時間インキュベートした。この間、ＢＭＰタンパク質は、全て封入
体分画で全細胞タンパク質の約１０％まで蓄積された。
は、培地にアンピシリンは必要でない。培養物のグルコース濃度は約０．２（重
量／容量）％を維持した。ｐＨは７．５Ｍ 水酸化アンモニウムを用いて７．２
を維持した。最終濃度１００μｇ／ｍｌでトリプトファンを加え、培養物を３７
℃でさらに４時間インキュベートした。この間、ＢＭＰタンパク質は、全て封入
体分画で全細胞タンパク質の約１０％まで蓄積された。
【００３７】実施例２：ＢＭＰ−２封入体の精製、還元、および可溶化 −８０℃で保存した細胞を４．５ｋｇ測定した。１００ｍＭ トリス（ｐＨ８
．０）を３２ｌ加えた。懸濁液をローター／スターラー・ミキサーを用いて細胞
が十分に懸濁されるまで混合した。懸濁液をＡＰＶガウリンＣＤ−３０ホモジナ
イザーに通して８５００ｐｓｉｇで３回細胞溶解した。シャープレスＡＳ−２６
遠心機を最大相対遠心力１５０００ｘｇ、供給流速０．８ｌ／分で操作して封入
体を回収した。回収した封入体を１００ｍＭ トリス／５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ
８．０）３５ｌと組み合わせて十分懸濁されるまでローター／スターラー・ミキ
サーで混合した。封入体懸濁液をＡＰＶガウリンＣＤ−３０ホモジナイザーに１
２５００ｐｓｉｇで９回通し、シャープレスＡＳ−２６遠心機を最大相対遠心力
１５０００ｘｇで、供給流速０．５−１．０ｌ／分で操作して封入体を回収した
。ＢＭＰ−２含有封入体を約３４０ｇ回収した。封入体を５０ｍＭ トリス（ｐ
Ｈ＝８．０）に９ｇ／ｌで懸濁した後、最大相対遠心力３０００ｘｇで５分間遠
心してさらに精製した。得られた上澄をデカンテートした。封入体を等容量の８
Ｍ グアニジン−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ トリスおよび１０
０ｍＭ ジチオスレイトール（ｐＨ８．５）中３７℃で１時間インキュベートし
て可溶化し、還元した。続いてミリポア・ミレックス０．２μｍフィルターを通
して濾過して不溶性物質を除去した。Ｃ４逆相カラム（２．２ｘ２５ｃｍ、ヴィ
ダック）を用いて還元し、変性したＢＭＰ−２単量体をさらに精製した。４０な
いし８０％ Ｂの直線グラジエントを用いて７２分間、２３ｍｌ／分でカラムを
溶出した［Ａ＝０．５（容量／容量）％ ＴＦＡ；Ｂ＝０．５（容量／容量）％
ＴＦＡ、３０％ ２−プロピルアルコール、６０％ アセトニトリル］。１８
から２０分に溶出したＢＭＰ−２をプールし、０．５（容量／容量）％ ＴＦＡ
、１７％ ２−プロピルアルコール、および３４％ アセトニトリルに対してＡ
２８０で、アミノ酸含量に基づく理論的吸光係数を用いてタンパク質濃度を測定
した。ＢＭＰ−２プールを−８０℃で凍結し、続いて再生の前に凍結乾燥した。
．０）を３２ｌ加えた。懸濁液をローター／スターラー・ミキサーを用いて細胞
が十分に懸濁されるまで混合した。懸濁液をＡＰＶガウリンＣＤ−３０ホモジナ
イザーに通して８５００ｐｓｉｇで３回細胞溶解した。シャープレスＡＳ−２６
遠心機を最大相対遠心力１５０００ｘｇ、供給流速０．８ｌ／分で操作して封入
体を回収した。回収した封入体を１００ｍＭ トリス／５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ
８．０）３５ｌと組み合わせて十分懸濁されるまでローター／スターラー・ミキ
サーで混合した。封入体懸濁液をＡＰＶガウリンＣＤ−３０ホモジナイザーに１
２５００ｐｓｉｇで９回通し、シャープレスＡＳ−２６遠心機を最大相対遠心力
１５０００ｘｇで、供給流速０．５−１．０ｌ／分で操作して封入体を回収した
。ＢＭＰ−２含有封入体を約３４０ｇ回収した。封入体を５０ｍＭ トリス（ｐ
Ｈ＝８．０）に９ｇ／ｌで懸濁した後、最大相対遠心力３０００ｘｇで５分間遠
心してさらに精製した。得られた上澄をデカンテートした。封入体を等容量の８
Ｍ グアニジン−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ トリスおよび１０
０ｍＭ ジチオスレイトール（ｐＨ８．５）中３７℃で１時間インキュベートし
て可溶化し、還元した。続いてミリポア・ミレックス０．２μｍフィルターを通
して濾過して不溶性物質を除去した。Ｃ４逆相カラム（２．２ｘ２５ｃｍ、ヴィ
ダック）を用いて還元し、変性したＢＭＰ−２単量体をさらに精製した。４０な
いし８０％ Ｂの直線グラジエントを用いて７２分間、２３ｍｌ／分でカラムを
溶出した［Ａ＝０．５（容量／容量）％ ＴＦＡ；Ｂ＝０．５（容量／容量）％
ＴＦＡ、３０％ ２−プロピルアルコール、６０％ アセトニトリル］。１８
から２０分に溶出したＢＭＰ−２をプールし、０．５（容量／容量）％ ＴＦＡ
、１７％ ２−プロピルアルコール、および３４％ アセトニトリルに対してＡ
２８０で、アミノ酸含量に基づく理論的吸光係数を用いてタンパク質濃度を測定
した。ＢＭＰ−２プールを−８０℃で凍結し、続いて再生の前に凍結乾燥した。
【００３８】 実施例３：非デタージェント性双性イオン３−（１―ピリジノ）―１−プロパン
スルホネートを用いるＢＭＰ−２の再生 逆相クロマトグラフィーで精製し、凍結乾燥したＢＭＰ−２を２０ｍＭ還元型
グルタチオン中２５０−５００μｇ／ｍｌで１０Ｘ濃度として可溶化させた。可
溶性タンパク質をすぐに再生バッファーに希釈し、５０ｍＭ トリス、５ｍＭ
ＥＤＴＡ、１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ 酸化型グルタチオン、２ｍＭ 還元型グル
タチオン、０．０５−１．７Ｍ ３−（１−ピリジノ）−１−プロパンスルホネ
ートおよび２５−５０μｇ／ｍｌ ＢＭＰ−２を含有する再生溶液（ｐＨ８．５
）を作った。室温（約２０℃）で３ないし４日間再生を進行させた。 イー・コリで製造したＢＭＰ−２の再生を非還元条件下ドデシル硫酸ナトリウ
ムポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いて分析した。７５ｍ
Ａで約２．５時間、１０−２０％ アクリルアミドゲル（インテグレーティッド
・セパレーション・システム）にサンプルの一部を流した。続いて銀染色により
タンパク質を検出した。グルタチオン可溶化ＢＭＰ−２出発物質が適当な分子量
の単量体として現れ、再生培地中でインキュベートしたＢＭＰ−２が非還元条件
下適当な分子量の二量体として現れたときに、再生を陽性として記録した。ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥによりＢＭＰ−２二量体を還元条件下でも分析した。還元条件下で
は、ＢＭＰ−２は適当な分子量の単量体として現れた。以下の実施例１１に記載
するアッセイを用いて再生したＢＭＰ−２の生物学的活性を試験した。０．０５
ないし１．７Ｍ ３−（１−ピリジノ）−１−プロパンスルホネートで；最適に
は１．０ないし１．７Ｍ ３−（１−ピリジノ）−１−プロパンスルホネートで
ＢＭＰ−２二量体を形成した。
スルホネートを用いるＢＭＰ−２の再生 逆相クロマトグラフィーで精製し、凍結乾燥したＢＭＰ−２を２０ｍＭ還元型
グルタチオン中２５０−５００μｇ／ｍｌで１０Ｘ濃度として可溶化させた。可
溶性タンパク質をすぐに再生バッファーに希釈し、５０ｍＭ トリス、５ｍＭ
ＥＤＴＡ、１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ 酸化型グルタチオン、２ｍＭ 還元型グル
タチオン、０．０５−１．７Ｍ ３−（１−ピリジノ）−１−プロパンスルホネ
ートおよび２５−５０μｇ／ｍｌ ＢＭＰ−２を含有する再生溶液（ｐＨ８．５
）を作った。室温（約２０℃）で３ないし４日間再生を進行させた。 イー・コリで製造したＢＭＰ−２の再生を非還元条件下ドデシル硫酸ナトリウ
ムポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いて分析した。７５ｍ
Ａで約２．５時間、１０−２０％ アクリルアミドゲル（インテグレーティッド
・セパレーション・システム）にサンプルの一部を流した。続いて銀染色により
タンパク質を検出した。グルタチオン可溶化ＢＭＰ−２出発物質が適当な分子量
の単量体として現れ、再生培地中でインキュベートしたＢＭＰ−２が非還元条件
下適当な分子量の二量体として現れたときに、再生を陽性として記録した。ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥによりＢＭＰ−２二量体を還元条件下でも分析した。還元条件下で
は、ＢＭＰ−２は適当な分子量の単量体として現れた。以下の実施例１１に記載
するアッセイを用いて再生したＢＭＰ−２の生物学的活性を試験した。０．０５
ないし１．７Ｍ ３−（１−ピリジノ）−１−プロパンスルホネートで；最適に
は１．０ないし１．７Ｍ ３−（１−ピリジノ）−１−プロパンスルホネートで
ＢＭＰ−２二量体を形成した。
【００３９】 実施例４：ニコチン酸（ビタミンＢ）を用いるＢＭＰ−２の再生 逆相精製し、凍結乾燥したＢＭＰ−２を２０ｍＭ還元型グルタチオン中５００
μｇ／ｍｌで１０Ｘ濃縮物として可溶化させた。可溶性タンパク質をすぐに再生
バッファーに希釈し、５０ｍＭ トリス、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１Ｍ ＮａＣｌ、
１ｍＭ 酸化型グルタチオン、２ｍＭ 還元型グルタチオン、０．２５−１．０
Ｍ ニコチン酸および５０μｇ／ｍｌ ＢＭＰ−２を含有する再生溶液（ｐＨ８
．５）（ＢＭＰ−２濃縮物を希釈する前に５−１０Ｍ ＮａＯＨでｐＨ約８．５
に調整）を作った。得られた溶液を３ないし４日間室温（約２０℃）にて維持し
た。 イー・コリで製造したＢＭＰ−２の再生を実施例３に記載するように非還元条
件下ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
を用いて分析した。０．２５ないし１．０Ｍ ニコチン酸のときＢＭＰ−２二量
体形成を観察した。１．０Ｍ ニコチン酸のときＢＭＰ−２二量体の回収が最適
であった。
μｇ／ｍｌで１０Ｘ濃縮物として可溶化させた。可溶性タンパク質をすぐに再生
バッファーに希釈し、５０ｍＭ トリス、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１Ｍ ＮａＣｌ、
１ｍＭ 酸化型グルタチオン、２ｍＭ 還元型グルタチオン、０．２５−１．０
Ｍ ニコチン酸および５０μｇ／ｍｌ ＢＭＰ−２を含有する再生溶液（ｐＨ８
．５）（ＢＭＰ−２濃縮物を希釈する前に５−１０Ｍ ＮａＯＨでｐＨ約８．５
に調整）を作った。得られた溶液を３ないし４日間室温（約２０℃）にて維持し
た。 イー・コリで製造したＢＭＰ−２の再生を実施例３に記載するように非還元条
件下ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
を用いて分析した。０．２５ないし１．０Ｍ ニコチン酸のときＢＭＰ−２二量
体形成を観察した。１．０Ｍ ニコチン酸のときＢＭＰ−２二量体の回収が最適
であった。
【００４０】 実施例５：ピリジン−３スルホン酸を用いるＢＭＰ−２の再生 逆相精製し、凍結乾燥したＢＭＰ−２を実施例４に記載するように可溶化させ
た。可溶性タンパク質をすぐに再生バッファーに希釈し、５０ｍＭ トリス、５
ｍＭ ＥＤＴＡ、１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ 酸化型グルタチオン、２ｍＭ 還元
型グルタチオン、０．２５−０．６０Ｍ ピリジン−３スルホン酸および５０μ
ｇ／ｍｌＢＭＰ−２を含有する再生溶液（ｐＨ８．５）（タンパク質濃縮物を添
加する前に５−１０Ｍ ＮａＯＨでｐＨ約８．５に調整）を作った。得られた溶
液を３ないし４日間約２０℃にて維持した。 イー・コリで製造したＢＭＰ−２の再生を実施例３に記載するように非還元条
件下ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
を用いて分析した。０．２５ないし０．６０Ｍ ピリジン−３スルホン酸でＢＭ
Ｐ−２二量体を形成した。単量体ＢＭＰ−２の二量体への転換は０．４−０．６
Ｍ ピリジン−３スルホン酸のとき最大であった。
た。可溶性タンパク質をすぐに再生バッファーに希釈し、５０ｍＭ トリス、５
ｍＭ ＥＤＴＡ、１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ 酸化型グルタチオン、２ｍＭ 還元
型グルタチオン、０．２５−０．６０Ｍ ピリジン−３スルホン酸および５０μ
ｇ／ｍｌＢＭＰ−２を含有する再生溶液（ｐＨ８．５）（タンパク質濃縮物を添
加する前に５−１０Ｍ ＮａＯＨでｐＨ約８．５に調整）を作った。得られた溶
液を３ないし４日間約２０℃にて維持した。 イー・コリで製造したＢＭＰ−２の再生を実施例３に記載するように非還元条
件下ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
を用いて分析した。０．２５ないし０．６０Ｍ ピリジン−３スルホン酸でＢＭ
Ｐ−２二量体を形成した。単量体ＢＭＰ−２の二量体への転換は０．４−０．６
Ｍ ピリジン−３スルホン酸のとき最大であった。
【００４１】 実施例６：２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）を用い
るＢＭＰ−２の再生 逆相精製し、凍結乾燥したＢＭＰ−２を２０ｍＭ還元型グルタチオン中２５０
−５００μｇ／ｍｌで１０Ｘ濃縮物として可溶化させた。可溶性タンパク質をす
ぐに再生バッファーに希釈した。最終的な再生バッファーは５０ｍＭ トリス、
５ｍＭ ＥＤＴＡ、１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ 酸化型グルタチオン、２ｍＭ 還
元型グルタチオン、０．２５−０．７０Ｍ ２−（シクロヘキシルアミノ）エタ
ンスルホン酸（ＣＨＥＳ）および２５−５０μｇ／ｍｌ ＢＭＰ−２を含有する
（ｐＨ約８．３）。３ないし４日間室温で再生を進行させた。 イー・コリで製造したＢＭＰ−２の再生を実施例３に記載するように非還元条
件下ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
を用いて分析した。０．２５ないし０．７０Ｍ ＣＨＥＳでＢＭＰ−２二量体を
形成した。単量体ＢＭＰ−２の二量体への転換は０．７Ｍ ＣＨＥＳのとき最大
であった。
るＢＭＰ−２の再生 逆相精製し、凍結乾燥したＢＭＰ−２を２０ｍＭ還元型グルタチオン中２５０
−５００μｇ／ｍｌで１０Ｘ濃縮物として可溶化させた。可溶性タンパク質をす
ぐに再生バッファーに希釈した。最終的な再生バッファーは５０ｍＭ トリス、
５ｍＭ ＥＤＴＡ、１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ 酸化型グルタチオン、２ｍＭ 還
元型グルタチオン、０．２５−０．７０Ｍ ２−（シクロヘキシルアミノ）エタ
ンスルホン酸（ＣＨＥＳ）および２５−５０μｇ／ｍｌ ＢＭＰ−２を含有する
（ｐＨ約８．３）。３ないし４日間室温で再生を進行させた。 イー・コリで製造したＢＭＰ−２の再生を実施例３に記載するように非還元条
件下ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
を用いて分析した。０．２５ないし０．７０Ｍ ＣＨＥＳでＢＭＰ−２二量体を
形成した。単量体ＢＭＰ−２の二量体への転換は０．７Ｍ ＣＨＥＳのとき最大
であった。
【００４２】 実施例７：ピロール−２‘カルボン酸を用いるＢＭＰ−２の再生 逆相精製し、凍結乾燥したＢＭＰ−２を２０ｍＭ還元型グルタチオン中５００
μｇ／ｍｌで１０Ｘ濃縮物として可溶化させた。 可溶性タンパク質を再生バッファーに希釈し、５０ｍＭ トリス、５ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ 酸化型グルタチオン、２ｍＭ 還元型グルタチ
オン、０．４０−０．６５Ｍ ピロール−２カルボン酸および５０μｇ／ｍｌＢ
ＭＰ−２を含有する再生溶液（ｐＨ８．４）（ＢＭＰ−２濃縮物を希釈する前に
５−１０Ｍ ＮａＯＨでｐＨ約８．４に調整）を作った。得られた溶液を３ない
し４日間室温（約２０℃）にて維持した。 イー・コリで製造したＢＭＰ−２の再生を実施例３に記載するように非還元条
件下ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
を用いて分析した。０．４０ないし０．６５Ｍ ピロール−２カルボン酸のとき
ＢＭＰ−２二量体形成を観察した。０．４０Ｍ ピロール−２カルボン酸のとき
ＢＭＰ−２二量体の回収は最大であった。
μｇ／ｍｌで１０Ｘ濃縮物として可溶化させた。 可溶性タンパク質を再生バッファーに希釈し、５０ｍＭ トリス、５ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ 酸化型グルタチオン、２ｍＭ 還元型グルタチ
オン、０．４０−０．６５Ｍ ピロール−２カルボン酸および５０μｇ／ｍｌＢ
ＭＰ−２を含有する再生溶液（ｐＨ８．４）（ＢＭＰ−２濃縮物を希釈する前に
５−１０Ｍ ＮａＯＨでｐＨ約８．４に調整）を作った。得られた溶液を３ない
し４日間室温（約２０℃）にて維持した。 イー・コリで製造したＢＭＰ−２の再生を実施例３に記載するように非還元条
件下ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
を用いて分析した。０．４０ないし０．６５Ｍ ピロール−２カルボン酸のとき
ＢＭＰ−２二量体形成を観察した。０．４０Ｍ ピロール−２カルボン酸のとき
ＢＭＰ−２二量体の回収は最大であった。
【００４３】 実施例８：非デタージェント性双性イオン３−（１−ピリジノ）−１−プロパン
スルホネートを用いるＢＭＰ−１３の再生 実施例１に記載したようにＢＭＰ−１３を発現させた。前記したようにＴＥ８
．３（１００：１０）バッファー［１００ｍＭ トリス−Ｈｃｌ（ｐＨ８．３）
、１０ｍＭ Ｎａ2ＥＤＴＡ、１ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルオライド （ＰＭＳＦ）］３０ｍｌ中イー・コリ形質転換体から得られた凍結細胞ペレット
９ｇを解凍した。マイクロフルイダイザー（商標）（＃ＭＣＦ１００Ｔモデル）
に３回通して細胞を溶解した。ＴＥ８．３ １００：１０バッファーを用いて溶
解物を約１２０ｍｌに希釈した。１５０００ｘｇで遠心して封入体物質のペレッ
トを得た。上澄をデカンテートし、封入体物質を１％ トリトンＸ１００をも含
有するＴＥ８．３（１００：１０）５０ｍｌに懸濁した。再懸濁した封入体を１
５０００ｘｇで１０分間遠心し、上澄をデカンテートした。ペレットを１％ジチ
オスレイトール（ＤＴＴ）をも含有するＴＥ８．３（２０：１）バッファー［２
０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１ｍＭ Ｎａ2ＥＤＴＡ、１ｍＭ Ｐ ＭＳＦ］に懸濁した。ヒートンガラスホモジナイザー中懸濁液をホモジナイズし
た後、氷酢酸でｐＨ２．５に酸性にし、次いで１５０００ｘｇで２５分間遠心し
た。この遠心により得られた上澄を収集し、セファロースＳ−１００（商標）サ
イズ排除カラム（８３ｃｍｘ２．６ｃｍ；?４４０ｍｌベッド）のクロマトグラ フィーに２０ｍｌずつ供した。１％ 酢酸の移動相を用いて流速１．４ｍｌ／分
でセファロースＳ−１００（商標）カラムを流した。２８０ｎｍにおける吸収に
よりＢＭＰ−１３単量体に対応するフラクションを検出した。２８０ｎｍでプー
ルの吸収を測定した後、コンピューターで計算した吸光係数および分子量を用い
てタンパク質濃度を決定した。このサイズ排除カラムでプールした物質を再生反
応の出発物質として用いた。
スルホネートを用いるＢＭＰ−１３の再生 実施例１に記載したようにＢＭＰ−１３を発現させた。前記したようにＴＥ８
．３（１００：１０）バッファー［１００ｍＭ トリス−Ｈｃｌ（ｐＨ８．３）
、１０ｍＭ Ｎａ2ＥＤＴＡ、１ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルオライド （ＰＭＳＦ）］３０ｍｌ中イー・コリ形質転換体から得られた凍結細胞ペレット
９ｇを解凍した。マイクロフルイダイザー（商標）（＃ＭＣＦ１００Ｔモデル）
に３回通して細胞を溶解した。ＴＥ８．３ １００：１０バッファーを用いて溶
解物を約１２０ｍｌに希釈した。１５０００ｘｇで遠心して封入体物質のペレッ
トを得た。上澄をデカンテートし、封入体物質を１％ トリトンＸ１００をも含
有するＴＥ８．３（１００：１０）５０ｍｌに懸濁した。再懸濁した封入体を１
５０００ｘｇで１０分間遠心し、上澄をデカンテートした。ペレットを１％ジチ
オスレイトール（ＤＴＴ）をも含有するＴＥ８．３（２０：１）バッファー［２
０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１ｍＭ Ｎａ2ＥＤＴＡ、１ｍＭ Ｐ ＭＳＦ］に懸濁した。ヒートンガラスホモジナイザー中懸濁液をホモジナイズし
た後、氷酢酸でｐＨ２．５に酸性にし、次いで１５０００ｘｇで２５分間遠心し
た。この遠心により得られた上澄を収集し、セファロースＳ−１００（商標）サ
イズ排除カラム（８３ｃｍｘ２．６ｃｍ；?４４０ｍｌベッド）のクロマトグラ フィーに２０ｍｌずつ供した。１％ 酢酸の移動相を用いて流速１．４ｍｌ／分
でセファロースＳ−１００（商標）カラムを流した。２８０ｎｍにおける吸収に
よりＢＭＰ−１３単量体に対応するフラクションを検出した。２８０ｎｍでプー
ルの吸収を測定した後、コンピューターで計算した吸光係数および分子量を用い
てタンパク質濃度を決定した。このサイズ排除カラムでプールした物質を再生反
応の出発物質として用いた。
【００４４】 別法として、前記のように細胞を溶解するが、最初の封入体物質ペレットは８
Ｍ グアニジン−ＨＣｌ、ＴＥ８．５（１００：１０）バッファー［１００ｍＭ
トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１０ｍＭ Ｎａ2ＥＤＴＡで１００ｍＭ Ｄ ＴＴを含有する］に溶解し、３７℃で１時間インキュベートした。この物質を室
温で１２０００ｘｇで１５分間遠心した。上澄をＣ４分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ（逆
相高速液体クロマトグラフィー）カラム（ヴィダック２１４ＴＰ５４）に注入し
、流速１ｍｌ／分で１％ Ｂバッファー［Ａバッファー＝０．１％ トリフルオ
ロ酢酸（ＴＦＡ）、Ｂバッファー＝９５％ アセトニトリル、０．１％ ＴＦＡ
）と平衡にした。５分後、１％ないし７０％の直線グラジエントＢバッファー（
Ａバッファーで希釈）を３５分間流し、その間タンパク質を溶出した。２８０ｎ
ｍにおける吸収によりタンパク質をモニター観察した。ＢＭＰ−１３のピークの
フラクション（２５から３５分の間に溶出）をプールした。コンピューター計算
による吸光度係数および分子量を用いて２８０ｎｍにおけるタンパク質濃度を決
定した。このＲＰ−ＨＰＬＣ Ｃ４カラムでプールした物質を再生反応のための
出発物質として用いた。
Ｍ グアニジン−ＨＣｌ、ＴＥ８．５（１００：１０）バッファー［１００ｍＭ
トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１０ｍＭ Ｎａ2ＥＤＴＡで１００ｍＭ Ｄ ＴＴを含有する］に溶解し、３７℃で１時間インキュベートした。この物質を室
温で１２０００ｘｇで１５分間遠心した。上澄をＣ４分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ（逆
相高速液体クロマトグラフィー）カラム（ヴィダック２１４ＴＰ５４）に注入し
、流速１ｍｌ／分で１％ Ｂバッファー［Ａバッファー＝０．１％ トリフルオ
ロ酢酸（ＴＦＡ）、Ｂバッファー＝９５％ アセトニトリル、０．１％ ＴＦＡ
）と平衡にした。５分後、１％ないし７０％の直線グラジエントＢバッファー（
Ａバッファーで希釈）を３５分間流し、その間タンパク質を溶出した。２８０ｎ
ｍにおける吸収によりタンパク質をモニター観察した。ＢＭＰ−１３のピークの
フラクション（２５から３５分の間に溶出）をプールした。コンピューター計算
による吸光度係数および分子量を用いて２８０ｎｍにおけるタンパク質濃度を決
定した。このＲＰ−ＨＰＬＣ Ｃ４カラムでプールした物質を再生反応のための
出発物質として用いた。
【００４５】 １％ 酢酸中または０．１％ ＴＦＡ、３０−４０％ アセトニトリルを含有
する逆相バッファー中のＢＭＰ−１３タンパク質を乾燥またはスピード・バキュ
ーム（ｓｐｅｅｄ ｖａｃｕｍｅ）を用いて容積を減じ、数μｌの精製水または
還元型グルタチオンを用いて濃縮物として溶解し、５ないし１０分間完全に溶解
させた。続いて溶解したタンパク質を再生バッファーで希釈した。最終的な再生
溶液は５０ｍＭ トリス、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ 酸化型
グルタチオン、２ｍＭ 還元型グルタチオン、１．０Ｍ ３−（１−ピリジノ）
−１−プロパンスルホネートおよび５０μｇ／ｍｌ ＢＭＰ−１３を含有した（
ｐＨ８．４）。室温（２０−２３℃）で３ないし４日間再生を進行させた。非還
元条件下１６％ トリシン−ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳
動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）または１０−２０％ ドデシル硫酸ナトリウムポリアク
リルアミド電気泳動を用いて、イー・コリで製造したＢＭＰ−１３の３−（１−
ピリジノ）−１−プロパンスルホネート中での再生を分析した。銀染色によりタ
ンパク質を検出した。非還元条件下適当な分子量の二量体として、および還元条
件下適当な分子量の単量体としてＢＭＰ−１３が現れたとき、再生を陽性として
記録した。１．０Ｍ ３−（１−ピリジノ）−１−プロパンスルホネートが存在
するときにＢＭＰ−１３二量体が生成された。
する逆相バッファー中のＢＭＰ−１３タンパク質を乾燥またはスピード・バキュ
ーム（ｓｐｅｅｄ ｖａｃｕｍｅ）を用いて容積を減じ、数μｌの精製水または
還元型グルタチオンを用いて濃縮物として溶解し、５ないし１０分間完全に溶解
させた。続いて溶解したタンパク質を再生バッファーで希釈した。最終的な再生
溶液は５０ｍＭ トリス、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ 酸化型
グルタチオン、２ｍＭ 還元型グルタチオン、１．０Ｍ ３−（１−ピリジノ）
−１−プロパンスルホネートおよび５０μｇ／ｍｌ ＢＭＰ−１３を含有した（
ｐＨ８．４）。室温（２０−２３℃）で３ないし４日間再生を進行させた。非還
元条件下１６％ トリシン−ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳
動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）または１０−２０％ ドデシル硫酸ナトリウムポリアク
リルアミド電気泳動を用いて、イー・コリで製造したＢＭＰ−１３の３−（１−
ピリジノ）−１−プロパンスルホネート中での再生を分析した。銀染色によりタ
ンパク質を検出した。非還元条件下適当な分子量の二量体として、および還元条
件下適当な分子量の単量体としてＢＭＰ−１３が現れたとき、再生を陽性として
記録した。１．０Ｍ ３−（１−ピリジノ）−１−プロパンスルホネートが存在
するときにＢＭＰ−１３二量体が生成された。
【００４６】 実施例９：ニコチン酸（ビタミンＢ）を用いるＢＭＰ−１３の再生 実施例８に記載されるように酢酸で可溶化し、サイズ排除精製したＢＭＰ−１
３を凍結乾燥し、続いて２０ｍＭ還元型グルタチオン中５００μｇ／ｍｌで１０
Ｘ濃度として可溶化させた。可溶性タンパク質をすぐに再生バッファーに希釈し
、５０ｍＭ トリス、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ 酸化型グル
タチオン、２ｍＭ 還元型グルタチオン、０．６５−１．０Ｍ ニコチン酸およ
び５０μｇ／ｍｌ ＢＭＰ−１３を含有する再生溶液（ｐＨ８．５）（ＢＭＰ−
１３濃縮物を希釈する前に５−１０Ｍ ＮａＯＨで約８．５にｐＨを調整した）
を作った。得られた溶液は３ないし４日間室温（約２０℃）を維持した。 イー・コリで製造したＢＭＰ−１３の再生を非還元条件下ドデシル硫酸ナトリ
ウムポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いて分析した。７５
ｍＡで約２．５時間、１０−２０％ アクリルアミドゲル（インテグレーティッ
ド・セパレーション・システム）にサンプルの一部を流した。続いて銀染色によ
りタンパク質をを検出した。グルタチオン可溶化ＢＭＰ−１３出発物質が適当な
分子量の単量体として現れ、再生培地中でインキュベートしたＢＭＰ−１３が非
還元条件下適当な分子量の二量体として現れたときに、再生を陽性として記録し
た。０．６５ないし１．０Ｍ ニコチン酸でＢＭＰ−１３が比較的回収された。
３を凍結乾燥し、続いて２０ｍＭ還元型グルタチオン中５００μｇ／ｍｌで１０
Ｘ濃度として可溶化させた。可溶性タンパク質をすぐに再生バッファーに希釈し
、５０ｍＭ トリス、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ 酸化型グル
タチオン、２ｍＭ 還元型グルタチオン、０．６５−１．０Ｍ ニコチン酸およ
び５０μｇ／ｍｌ ＢＭＰ−１３を含有する再生溶液（ｐＨ８．５）（ＢＭＰ−
１３濃縮物を希釈する前に５−１０Ｍ ＮａＯＨで約８．５にｐＨを調整した）
を作った。得られた溶液は３ないし４日間室温（約２０℃）を維持した。 イー・コリで製造したＢＭＰ−１３の再生を非還元条件下ドデシル硫酸ナトリ
ウムポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いて分析した。７５
ｍＡで約２．５時間、１０−２０％ アクリルアミドゲル（インテグレーティッ
ド・セパレーション・システム）にサンプルの一部を流した。続いて銀染色によ
りタンパク質をを検出した。グルタチオン可溶化ＢＭＰ−１３出発物質が適当な
分子量の単量体として現れ、再生培地中でインキュベートしたＢＭＰ−１３が非
還元条件下適当な分子量の二量体として現れたときに、再生を陽性として記録し
た。０．６５ないし１．０Ｍ ニコチン酸でＢＭＰ−１３が比較的回収された。
【００４７】 実施例１０：非デタージェント性双性イオン３−（１−ピリジノ）−１−プロパ
ンスルホネートを用いるＢＭＰ−２／１３ヘテロ二量体の再生 実施例１に記載したようにＢＭＰ−２およびＢＭＰ１３を発現させた。ＢＭＰ
−２封入体を単離し、続いて実施例２で概要を示したように、ＢＭＰ−２を可溶
化し、精製した。実施例８に記載するように還元し型ＢＭＰ−１３単量体を製造
した。凍結乾燥したＢＭＰ−２を精製水中濃縮物として再度溶解した。ＢＭＰ−
２およびＢＭＰ−１３を再生バッファーに希釈し、再生溶液中同一の質量比にし
た。再生溶液の最終的な組成は５０ｍＭ トリス、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１Ｍ Ｎ
ａＣｌ、１ｍＭ 酸化型グルタチオン、２ｍＭ 還元型グルタチオン、１．０Ｍ
３−（１−ピリジノ）−１−プロパンスルホネート、５０μｇ／ｍｌ ＢＭＰ
−２および５０μｇ／ｍｌ ＢＭＰ−１３であった（ｐＨ８．５）。３ないし４
日間室温（２０−２３℃）で再生を進行させた。イー・コリで製造したＢＭＰ−
２／１３の３−（１−ピリジノ）−１−プロパンスルホネート中での再生を非還
元条件下１６％ トリシン−ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳
動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）または１０−２０％ ドデシル硫酸ナトリウムポリアク
リルアミド電気泳動を用いて分析した。銀染色によりタンパク質をを検出した。
ＢＭＰ−２／１３が非還元条件下適当な分子量のヘテロ二量体として、および還
元条件下適当な分子量の単量体として現れたときに、再生を陽性として記録した
。１．０Ｍ ３−（１−ピリジノ）−１−プロパンスルホネートの存在下ＢＭＰ
−２／１３ヘテロ二量体が製造された。
ンスルホネートを用いるＢＭＰ−２／１３ヘテロ二量体の再生 実施例１に記載したようにＢＭＰ−２およびＢＭＰ１３を発現させた。ＢＭＰ
−２封入体を単離し、続いて実施例２で概要を示したように、ＢＭＰ−２を可溶
化し、精製した。実施例８に記載するように還元し型ＢＭＰ−１３単量体を製造
した。凍結乾燥したＢＭＰ−２を精製水中濃縮物として再度溶解した。ＢＭＰ−
２およびＢＭＰ−１３を再生バッファーに希釈し、再生溶液中同一の質量比にし
た。再生溶液の最終的な組成は５０ｍＭ トリス、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１Ｍ Ｎ
ａＣｌ、１ｍＭ 酸化型グルタチオン、２ｍＭ 還元型グルタチオン、１．０Ｍ
３−（１−ピリジノ）−１−プロパンスルホネート、５０μｇ／ｍｌ ＢＭＰ
−２および５０μｇ／ｍｌ ＢＭＰ−１３であった（ｐＨ８．５）。３ないし４
日間室温（２０−２３℃）で再生を進行させた。イー・コリで製造したＢＭＰ−
２／１３の３−（１−ピリジノ）−１−プロパンスルホネート中での再生を非還
元条件下１６％ トリシン−ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳
動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）または１０−２０％ ドデシル硫酸ナトリウムポリアク
リルアミド電気泳動を用いて分析した。銀染色によりタンパク質をを検出した。
ＢＭＰ−２／１３が非還元条件下適当な分子量のヘテロ二量体として、および還
元条件下適当な分子量の単量体として現れたときに、再生を陽性として記録した
。１．０Ｍ ３−（１−ピリジノ）−１−プロパンスルホネートの存在下ＢＭＰ
−２／１３ヘテロ二量体が製造された。
【００４８】実施例１１：Ｗ−２０アルカリ性ホスファターゼアッセイ 緩衝目的を要する場合、再生タンパク質の活性の検定の前に脱塩工程を加えて
もよい。 Ｗ−２０−１７細胞を培地（１０％ 熱不活化ウシ胎児血清、２ｍＭ グルタ
ミンを含むＤＭＥ）２００μｌ中ウェルあたり１００００個の密度で９６ウェル
組織培養プレートに載せた。９５％ 空気、５％ ＣＯ2のインキュベーター中 ３７℃で一晩細胞を付着させた。 マルチチャンネルピペッターで各ウェルから培地２００μｌを除去し、１０％
熱不活化ウシ胎児血清、２ｍＭ グルタミンおよび１％ ペニシリン−ストレ
プトマイシンを含むＤＭＥに分配した等容量の試験サンプルと置換した。 試験サンプルおよび標準物質をＷ−２０−１７インジケーター細胞と共に２４
時間インキュベートした。２４時間後、プレートを３７℃のインキュベーターか
ら取りだし、細胞から試験培地を除去した。 Ｗ−２０−１７細胞層をウェルあたり２００μｌのカルシウム／マグネシウム
不含リン酸バッファーセイラインで３回洗浄し、洗浄液を捨てた。 ５０μｌのガラス製装置による蒸留水を各ウェルに加え、次いで急速凍結する
ためにアッセイプレートをドライアイス／エタノール浴に入れる。一旦凍結させ
、アッセイプレートをドライアイス／エタノール浴から取りだし、３７℃で解凍
した。この工程を２回以上、全体で３回凍結−解凍工程を繰り返した。一度完了
すると、膜結合アルカリ性ホスファターゼが測定可能になる。 ５０μｌのアッセイ混合物［５０ｍＭ グリシン、０．０５％トリトンＸ−１
００、４ｍＭ ＭｇＣｌ2、５ｍＭ ｐ−ニトロフェノールホスフェート（ｐＨ ＝１０．３）］を各ウェルに加え、次いでアッセイプレートを１分間に６０回振
とうする振とう水浴中３７℃で３０分間インキュベートする。 ３０分のインキュベーションの終わりに０．２Ｎ ＮａＯＨ１００μｌを各ウ
ェルに加え、アッセイプレートを氷上に置いて反応を停止させる。 各ウェルの４０５ナノメーターにおける吸光度を読む。次いでこれらの値を既
知の標準値と比較して、各サンプルにおけるアルカリ性ホスファターゼ活性を評
価する。たとえば、ｐ−ニトロフェノールホスフェートの既知量を用いて吸光度
が得られる。これを表Ｉに示す。
もよい。 Ｗ−２０−１７細胞を培地（１０％ 熱不活化ウシ胎児血清、２ｍＭ グルタ
ミンを含むＤＭＥ）２００μｌ中ウェルあたり１００００個の密度で９６ウェル
組織培養プレートに載せた。９５％ 空気、５％ ＣＯ2のインキュベーター中 ３７℃で一晩細胞を付着させた。 マルチチャンネルピペッターで各ウェルから培地２００μｌを除去し、１０％
熱不活化ウシ胎児血清、２ｍＭ グルタミンおよび１％ ペニシリン−ストレ
プトマイシンを含むＤＭＥに分配した等容量の試験サンプルと置換した。 試験サンプルおよび標準物質をＷ−２０−１７インジケーター細胞と共に２４
時間インキュベートした。２４時間後、プレートを３７℃のインキュベーターか
ら取りだし、細胞から試験培地を除去した。 Ｗ−２０−１７細胞層をウェルあたり２００μｌのカルシウム／マグネシウム
不含リン酸バッファーセイラインで３回洗浄し、洗浄液を捨てた。 ５０μｌのガラス製装置による蒸留水を各ウェルに加え、次いで急速凍結する
ためにアッセイプレートをドライアイス／エタノール浴に入れる。一旦凍結させ
、アッセイプレートをドライアイス／エタノール浴から取りだし、３７℃で解凍
した。この工程を２回以上、全体で３回凍結−解凍工程を繰り返した。一度完了
すると、膜結合アルカリ性ホスファターゼが測定可能になる。 ５０μｌのアッセイ混合物［５０ｍＭ グリシン、０．０５％トリトンＸ−１
００、４ｍＭ ＭｇＣｌ2、５ｍＭ ｐ−ニトロフェノールホスフェート（ｐＨ ＝１０．３）］を各ウェルに加え、次いでアッセイプレートを１分間に６０回振
とうする振とう水浴中３７℃で３０分間インキュベートする。 ３０分のインキュベーションの終わりに０．２Ｎ ＮａＯＨ１００μｌを各ウ
ェルに加え、アッセイプレートを氷上に置いて反応を停止させる。 各ウェルの４０５ナノメーターにおける吸光度を読む。次いでこれらの値を既
知の標準値と比較して、各サンプルにおけるアルカリ性ホスファターゼ活性を評
価する。たとえば、ｐ−ニトロフェノールホスフェートの既知量を用いて吸光度
が得られる。これを表Ｉに示す。
【００４９】
【表１】 ＢＭＰ−２の既知量の吸収の値を測定し、表ＩＩに示す単位時間あたりに切断
されるｐ−ニトロフェノールホスフェートのマイクロモルに変換できる。
されるｐ−ニトロフェノールホスフェートのマイクロモルに変換できる。
【００５０】
【表２】 次いでこれらの値を用いてＢＭＰホモ二量体および／またはヘテロ二量体溶液
の活性をＢＭＰ−２ホモ二量体の既知量と比較する。
の活性をＢＭＰ−２ホモ二量体の既知量と比較する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA21 CA04 DA06 EA04 GA11 HA01 4B064 AG02 AG13 CA02 CA19 CC24 DA01 4H045 AA10 BA10 CA40 DA22 EA20 FA74
Claims (23)
- 【請求項１】 形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）スーパーファミリー
のタンパク質を発現する方法であって： ａ） 組換えＴＧＦ−βタンパク質を生成するのに適した条件下ＴＧＦ−βタン
パク質をコードするＤＮＡで形質転換した原核細胞を培養すること； ｂ）組換えにより製造したＴＧＦ−βタンパク質を非デタージェント性双性イオ
ン性化合物を含んでなる再生培地中で再生させること； を含む方法。 - 【請求項２】 原核細胞がイー・コリである請求項１に記載の方法。
- 【請求項３】 タンパク質が骨形態形成タンパク質である請求項２に記載の
方法。 - 【請求項４】 非デタージェント性双性イオン性化合物が非デタージェント
性スルホベタイン置換体である請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】 非デタージェント性双性イオン性化合物が３−（１−ピリジ
ノ）−１−プロパンスルホネートである請求項４に記載の方法。 - 【請求項６】 非デタージェント性双性イオン性化合物が窒素が４級アミン
である窒素含有芳香環または窒素含有脂肪族環を有する化合物であり、該化合物
がさらに電子受容置換基を含有する請求項１に記載の方法。 - 【請求項７】 非デタージェント性双性イオン性化合物がＮ−メチル−Ｎ−
ピペリジンプロパンスルホン酸、トリゴネリン塩酸塩、および１−カルボキシメ
チルピリジニウムクロライドからなる群から選択される請求項６に記載の方法。 - 【請求項８】 形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）スーパーファミリー
のタンパク質を発現する方法であって： ａ） 組換えＴＧＦ−βタンパク質を生成するのに適した条件下ＴＧＦ−βタン
パク質をコードするＤＮＡで形質転換した原核細胞を培養すること； ｂ）組換えにより製造したＴＧＦ−βタンパク質を酸またはアミド置換されたピ
リジン化合物を含んでなる再生培地中で再生させること； を含む方法。 - 【請求項９】 ピリジン置換体がピリジン３−スルホン酸、ピリジン−２カ
ルボン酸、ピコリン酸、３−ピリジル酢酸塩酸塩、４−ピリジル酢酸塩酸塩、２
−ピリジンエタンスルホン酸、３−ピリジルヒドロキシメタンスルホン酸、ニコ
チン酸、イソニコチン酸およびニコチンアミドからなる群から選択される請求項
８に記載の方法。 - 【請求項１０】 原核細胞が細菌細胞である請求項９に記載の方法。
- 【請求項１１】 細菌細胞がイー・コリである請求項１０に記載の方法。
- 【請求項１２】 タンパク質が骨形態形成タンパク質である請求項９に記載
の方法。 - 【請求項１３】 形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）スーパーファミリ
ーのタンパク質を発現する方法であって： ａ） 組換えＴＧＦ−βタンパク質を生成するのに適した条件下ＴＧＦ−βタン
パク質をコードするＤＮＡで形質転換した原核細胞を培養すること； ｂ）組換えにより製造したＴＧＦ−βタンパク質を酸またはアミド置換されたピ
ロール化合物を含んでなる再生培地中で再生させること； を含む方法。 - 【請求項１４】 ピロール置換体がピロール３−スルホン酸、ピロール−２
カルボン酸、３−ピロール酢酸塩酸塩、２−ピロール酢酸塩酸塩、２−ピロール
エタンスルホン酸、３−ピロールヒドロキシメタンスルホン酸からなる群から選
択される請求項１３に記載の方法。 - 【請求項１５】 原核細胞が細菌細胞である請求項１４に記載の方法。
- 【請求項１６】 細菌細胞がイー・コリである請求項１５に記載の方法。
- 【請求項１７】 タンパク質が骨形態形成タンパク質である請求項１４に記
載の方法。 - 【請求項１８】 形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）スーパーファミリ
ーのタンパク質を発現する方法であって： ａ） 組換えＴＧＦ−βタンパク質を生成するのに適した条件下ＴＧＦ−βタン
パク質をコードするＤＮＡで形質転換した原核細胞を培養すること； ｂ）組換えにより製造したＴＧＦ−βタンパク質を酸置換されたアミノヘキサン
化合物を含んでなる再生培地中で再生させること； を含む方法。 - 【請求項１９】 アミノヘキサン置換体が２−アミノヘキサンカルボン酸、
ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳおよびＣＡＰＳＯからなる群から選択される請求項１８に記
載の方法。 - 【請求項２０】 原核細胞が細菌細胞である請求項１９に記載の方法。
- 【請求項２１】 細菌細胞がイー・コリである請求項２０に記載の方法。
- 【請求項２２】 タンパク質が骨形態形成タンパク質である請求項１９に記
載の方法。 - 【請求項２３】 非デタージェント性双性イオン性化合物が、窒素含有芳香
環および４級窒素含有脂肪族環からなる群から選択される疎水基、ならびに酸お
よびアミドからなる基から選択される求電子末端基を含有し、求電子末端基は窒
素含有環から炭素４個しか離れていない請求項１に記載の方法。
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