MXPA00003436A - Metodo para el repliegue de proteinas mediante el uso de agentes zwitterionicos de bajo peso molecular - Google Patents

Abstract

Se describen métodos para el repliegue de proteínas de la superfamilia de proteínas TGF-ß. Los métodos emplean como agentes de repliegue uno o más compuestos que son compuesto zwiteriónicos no detergentes, tales como sulfobetaínas, piridinas substituidas pirroles substituidos y aminociclohexanos substituidos.

Description

M2TGBO PARA EL REPLIEGUE BE PROTE AS MEBEANTE EL USO BE AGENTES ZWITTERIÓNICOS BE BAJO PESO MOLECULAR Campo de la Invención La presente invención se refiere a métodos para el repliegue de proteínas, parlicuiarmente a miembros de proteínas de la superfamilia del factor ß de crecimiento de transformación ("TGF-ß"). tales como las proteínas morfogenéticas de hueso ("BMPs"). Estos métodos son particularmente útiles en procesos mejorados para la preparación de proteínas morfogenéticas de hueso, recombinantes, diméricas y biológicamente activas, producidas en forma insoluble a partir de cultivos de células de bacterias.

Antecedente-; de la Invención Un número de proteínas referidas en la técnica como proteínas morfogenéticas de hueso han sido identificadas recientemente, las cuales son capaces de inducir la formación cíe hueso o cartílago cuando se implantan dentro de mamíferos. Por ejemplo, Wang et al, en la patente ?e los E.U.A. 5,013,649, la cual se incorpora a la presente como referencia, describe las secuencias de ADN que codifican para proteínas morfogenéticas de hueso 2A de bovino y de humano (ahora proteína morfogenética de hueso-2) y 2B (ahora proteína morfogenética de hueso-4); las correspondientes proteínas codificadas por esas secuencias de AEN, y procesos para la producción recombinante de las proteínas BMP-2A (ahora BMF-2) y BMP-2B (ahora BMP-4). Se espera que estas proteínas tengan amplia aplicación médica en el tratamiento de daños y desordenes de hueso y cartílago en mamíferos. Con el objeto de llenar los requerimientos médicos esperados para estas proteínas morfogenéticas de hueso se requerirían grandes cantidades de proteína biológicamente activa. La producción recombinante de las proteínas morfogenéticas de hueso es posible lanío en sistemas de cultivo de células eucarióticas como procarióticas. Una ocurrencia común en la producción recombinante de proteínas heterólogas en células procarióticas, tales co o bacterias, es la formación de precipitados intracelulares insolubles, conocidos como cuerpos de inclusión. Si bien las bacterias son generalmente capaces de transcribir y traducir secuencias de ADN que codifican para proteína heterólogas correctamente, estas células procarióticas no son capaces de plegar algunas proteína heterólogas con suficiente corrección para permitir su producción en una forma soluble. Esto es particularmente verdadero para la expresión procariótica de proteínas de origen eucariótico, tales como las proteínas morfogenéticas de hueso. La formación de proteínas heterólogas plegadas incorrectamente tiene hasta cierto grado ima utilidad comercial limitada de la fermentación bacteriana para la producción de proteínas recombinantes de mamífero. Cuando se producen en bacterias, las proteínas morfogenéticas de hueso, recombinantes, son frecuentemente encontradas de manera similar en cuerpos de inclusión en una forma agregada y biológicamente inactiva. Se conocen varios métodos para la obtención de proteínas heterólogas correctamente plegadas a partir de cuerpos de inclusión bacterianos. Estos métodos generalmente involucran la solubilización de la proteína procedente de los cuerpos de inclusión mediante la desnatui'alización de la proteína utilizando ácidos o un agente cao trópico. Subsecuentemente, la proteína es diluida dentro de un regulador de replegamiento que soporte la renaturalización hasta una forma biológicamente activa. Cuando están presentes residuos de cisteina en la secuencia primaria de aminoácidos de la proteína, es a menudo necesario- realizar el repliegue en un ambiente que permita la formación correcta de enlaces disulfuro (un sistema redox). En Kohno, Meth. Enzym., 185: 187-195 (1990) se describen métodos generales de replegamiento. La Patente Europea 433225 describe un método para el replegamiento de proteínas similares al factor de crecimiento de transformación ß (TGF-ß), el cual emplea además de un agente caotrópico y un sistema redox, un agente de solubilización en la forma de un detergente. La patente Europea 433225 pronostica que los métodos descritos ahí son generalmente aplicables al repliegue de "proteínas similares a TGF-ß", sobre la base del grado de homología entre miembros de la familia TGF-ß. Sin embargo, los presentes inventores han encontrado que los métodos descritos en EP433225 producen rendimientos indeseablemente bajos de proteína dimérica biológicamente activa y correctamente plegada cuando se aplica a numerosas BMPs producidas por bacterias. Además, los métodos descritos emplean 3- [(3 -colamidopropil)dimetilamonio]-l -propanosulfonato (CHAPS) y otros compuestos caros como el agente de solubilización. En un intento de renaturalizar lisozima de huevo de gallina blanca (HEWL) y ß-D-galactosidasa se han empleado sulfobetaínas no detergentes. Sin embargo, estos intentos no han sido muy efectivos y tienen desventajas prácticas, tales como el rendimiento. Por ejemplo, ciertas sulfobetaínas disminuyeron el rendimiento de ß-D-galactosidasa en un factor de 100 veces. Goldberg et al., Folding Design., 1 :21-27 (1996). En consecuencia, estas moléculas no han mostrado ser ampliamente efectivas como agentes de replegamiento, particularmente para el uso en el replegamiento de proteínas multiméricas íales co o las proteínas TGF-ß.

Obj suyos de la Invención Se ha encontrado, inesperadamente, que las proteínas diméricas de la superfamilia TGF-ß, y particularmente las proteínas morfogenéticas de hueso (BMPs), pueden ser producidas y replegadas eficientemente a partir de cultivos bacterianos, tales como la E. coli, usando métodos que emplean como agentes de replegamiento compuestos que contienen hidrógeno, no detergentes, para la renaturalización y replegamiento correcto de proteína dimérica. Entre los compuestos útiles en la invención se encuentran miembros de los zwitteriones, piridinas, pirróles y aminociclohexanos substituidos con ácido. En consecuencia, en una modalidad, la invención comprende métodos para producir proteínas replegadas apropiadamente de la superfamilia TGF-ß a partir de cultivos de células bacterianas usando un compuesto no detergente como un reactivo en el método. El cultivo de células bacterianas es preferiblemente E. coli, pero puede ser otro tipo de cultivo de células bacterianas o procarióticas. La proteína puede ser cualquier proteína procedente de la superfamilia TGF-ß y es, preferiblemente, un miembro de la familia de las BMP, o los factores de crecimiento y diferenciación ("GDFs"), así como también MP52 y otras proteínas como se describe aquí más adelante. El compuesto no detergente puede ser uno que contenga nitrógeno y/o zwitteriones, y preferiblemente incluye un anillo aromático o alifáíico, es preferiblemente uno que contenga nitrógeno, y es preferiblemente substituido con un substituyente que incluya un grupo terminal electrofílico o aceptador de electrones, tal como un grupo carboxilo o sulfidrilo. Otros grupos terminales que pueden ser útiles en la presente invención incluyen a los grupos amida. El compuesto no detergente es preferiblemente seleccionado del grupo consistente en sulfobetaínas, piridinas, pirróles y a inociclohexanos. Los switteriones no detergentes que son útiles en los presentes métodos incluye sulfobetaínas y propanosulfonatos de piridinio, tales como 3-(l -piridinio)- 1-propanosulfonato ("3-1-PPS"). Los compuestos de piridina útiles en la presente invención son preferiblemente substituidos con ácido o amida, e incluyen al ácido piridin-3 -sulfónico, ácido ?iridin-2-carboxílico [también conocido como ácido nicotínico o niacina o Vitamina B], ácido picolínico, hidrocloruro de ácido 3-piridilacético, hidrocloruro de ácido 4-piridilacético, ácido isonicotínico y nicotinamida. Los compuestos de pirrol que son útiles en la presente invención incluyen análogos de pirrol de los compuestos de piridina anteriores. Por ejemplo, ácido pirrol-2- carboxílico, el análogo de pirrol del ácido nicotínico es efectivo en los métodos de la presente invención. Otros compuestos de zwitteriones no detergentes y que son útiles en la presente invención son compuestos con un anillo aromático y conteniendo nitrógeno, conteniendo además un grupo substituyente que acepta electrones, tal como el ácido N-metil-N-piperidin propano sulfónico, hidrocloruro de trigomelina, y cloruro de 1-carboximetilpiridinio. De manera distinta a las piridinas y pirróles, los compuestos de aminociclohexano substituidos con ácido, los cuales son útiles en la presente invención, contienen un anillo alifático con un substituyente amino y con un grupo aceptador de electrones, tal como un grupo carboxilo o sulfhidrilo. Por ejemplo, ácido 2-aminociclohexano carboxílico, ácido 3-(ciclohexilamino)-l-propanosulfónico (CAPS), ácido 3-ciclohexilamino)-2-hidroxipropanosulfónico (CAPSO) y ácido 2-(ciclohexilamino)etanosulfónico (CHES) son cada uno efectivo en los métodos de la presente invención. Los métodos de la invención son ventajosos además debido a que muchos de estos compuestos son relativamente baratos y están comercialmente disponibles. Por ejemplo, el 3-1 -PPS esíá comercialmente disponible en Fluka Chemical Company, en tanto que la Vitamina B es ampliamente fabricada como un complemento dietético y como aditivo alimenticio.

Besciipc.on Detallada de la Invención Entre las proteínas que pueden ser producidas recombinantemente usando métodos de la presente invención se encuentran: BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6 y BMP-7, descritas por ejemplo en las patentes de los E.U.A. Nos. 5,013,649; 5,1 16,738; 5,106,748; 5,187,076 y 5,141,905; BMP-8 descrita en la publicación PCT WÓ91/18098; y BIVíP-9, descrita en la Publicación PCT WO93/00432, BMP-10, descrita en la solicitud PCT WD94/26893; BMP-11, descrita en la solicitud PCT WO94/26892; BMP- 12 o BMP-13, descrita en la solicitud PCT WO95/16035, o BMP- 15, descrita en la solicitud de patente de los E.U.A. No. 5,635,372. Otras proteínas de la superfamilia de TGF-ß que pueden ser producidas por los métodos de la presente invención incluyen Vgr-2, descrita en Jones et al., ?/íol. Endocrinol., 6: 1961-1968 (1992); BIP, descrita en WO94/01557; HP00269, descrita en la Publicación JP numero 7-250688; y MP52, que se describe en la solicitud PCT WO93/16099, y cualquiera de los factores de crecimiento de diferenciación [GDFsJ. incluyendo aquellos descritos en las solicitudes PCT WO94/15965; W94/15949; WO95/01801 ; WO95/01802; WO94/21681 ; WO94/15966, WO95/10539; WO96/01845; WO96/02559 y otras. Los métodos de la presente invención pueden ser usados para producir cantidades a escala comercial de homodímeros o heterodímeros de BMP a partir de bacterias y replegados dentro de moléculas diméricas biológicamente activas. La producción de heíerodímeros de BMPs es descrita, por ejemplo, en WO93/19229. Las descripcrones de todas las solicitudes anteriores se incorporan aquí como referencias para la presente descripción. Cualquier especie bacteriana puede ser utilizada para generar BMP recombinante para repliegue en el método de la invención. Preferiblemente, se emplea Badilas subtilis, Psendomon s o Escherichia coli para producir cuerpos de inclusión conteniendo BMP. Más preferiblemente, se utiliza Escherichia coli para producir cuerpos de inclusión conteniendo BMP para repliegue en el método de la invención. Cualquier cepa de E. coli puede ser empleada para producir BMP para repliegue en el método de la invención, en tanto que esa cepa sea capaz de expresión de proteínas heterólogas. Un cepa de E. coli preferida es la cepa GI724 (ATCC número de acceso 55151) o GI774 [sin thyA] puede ser usada para producir BMP para repliegue en el método de la invención.

Los métodos de la presente invención pueden ser usados para producir BMPs en bacteria-r usando métodos conocidos. Puede ser necesario modificar las secuencias de terminación N de la BMP con el objeto de optimizar la expresión de bacteria. Por ejemplo, debido a que la división del enlace entre formil-metionina y glutamina es ineficiente en E. coli, ia íerm i nación N de la proteína de BMP -2 madura nativa (Met-gln-ala-lys) es modificada mediante deleción del residuo de glutamina para producir una terminación N más adecuada para la producción de BMP-2 en E. coli (Met-ala-lys-his). Otras especies de bacterias pueden requerir modificaciones análogas para optimizar la producción de BMP muíante obtenida a partir de esto. Tales modificaciones se encuentran dentro del nivel común de habilidades de la técnica pertinente. La secuencia de nucleótidos modificada o sin modificar que codifica para las BMPs puede ser insertada dentro de un plásmido apropiado para la transformación y expresión de aquellas proteínas heterólogas en bacterias. Cualquier plásmido de expresión bacteriana puede ser empleado, en tanto que sea capaz de dirigir la expresión de una proteína heteróloga íal como una BMP en la bacteria seleccionada. Especies aceptables de bacterias incluyen a la B. subtilis, especies de Pseudomonas y E. coli. Se conocen en la técnica los plásmidos de expresión apropiados para cada ima de estas especies. Para la producción de BMP en bacterias, un vector adecuado es descrito en Taniguchi et al PNAS: USA 77:5230-5233 (1930). El plásmido de expresión bacteriana puede ser transformado en una célula de bacteria ompetente usando métodos conocidos. Los transformantes son seleccionados para crecer en medio conteniendo un medicamento apropiado cuando se usa resistencia a medicamentos como la presión selectiva, o para crecer en medio que es deficiente en un nutriente apropiado cuando se usa auxotrofía como la presión selectiva. La expresión de la protema heteróloga puede ser optimizada usando métodos conocidos. La BMP así obtenida estará presente en cuerpos de inclusión refractivos e insolubles que pueden ser encontrados en granulos de células centrifugadas y rotas. Los cuerpos de inclusión así obtenidos pueden ser solubilizados usando un desnaturalizador tal como l idrocloruro de guanidina o mediante acidificación con un ácido tal cono ácido acético o ácido fórmico. Si se solubilizan usando un desnaturalizador, se agrega con el desnaturalizador un agente reductor tal como ß-mercaptoetanol, glutation o diíioíreitol. Si la proteína es solubilizada mediante acidificación, debe reducirse antes de la acidificación. Antes del repliegue, la proteína heteróloga solubilizada puede ser purificada adicionalrnente usando métodos cromatográficos conocidos tales como la cromatografía de exclusión por tamaño o la cromatografía líquida de alta resolución y de fase inversa. La solución conteniendo la BMP puede ser entonces ser reducida en volumen o desecada al vacío para eliminar regulador de cromatografía y redisuelta en medio. Alternativamente, proteína soluble reducida puede ser renaturalizada diluyéndola en medio de repliegue. Por ejemplo, el medio adecuado puede incluir lo siguiente: (a) Tris 50 mM. (b) NaCl l.O M. (c) ácido 2-(ciclohexilamino)etanosulfónico (CHES) 0.7 M o 3-(l -piridinio)- propanosulfonato (3-1 -PPS) 1.0 M. o ácido pirrol-2-carboxílico 0.4 M o ácido nicotínico 0.70 M. (d) EDTA 5 mM. (e) glutation (reducido) 2 mM. (í) glutation (oxidado) 1 mM. (g) a un pH de aproximadamente 8.5 Oíros medios pueden ser apropiados para la renaturalización, incluyendo medio conteniendo bajos niveles del caotropo (por ejemplo hidrocloruro de guanidina) o la sal del ácido (por ejemplo, acetato) usada para solubilizar los cuerpos de inclusión de la BMP. El repliegue típicamente es llevado a cabo a una concentración de BMP de 1 a 100 µg/ml de proteípa. Concentraciones más elevadas de proteína pueden ser replegadas de acuerdo con la invención, por ejemplo, hasta aproximadamente 1 mg/ml, pero pueden estar présenles precipitados o agregados por arriba de concentraciones de proteína de 100 µg/ml y la producción del homodímero o heterodímero de BMP activo puede en consecuencia disminuir. Para ía producción de heterodímeros, el procedimiento anterior es realizado utilizando cantidades iguales de dos plásmidos, cada uno conteniendo una secuencia de codificación para una BMP distinta (por ejemplo, pALBP2 codificando BMP-2 y pALBPX codificando BMP-X, en donde X es una BMP distinta de BMP -2). Los plásmidos son cultivados en forma separada, y los cuerpos de inclusión resultantes son solubilizados y replegados de acuerdo con los métodos descritos aquí. Los monómeros de proteína replegada son mezclados conjuntamente en proporciones equivalentes y tratados como se describió en el párrafo anterior. Se observa que las proteínas diméricas resultanles incluyen homodímeros de BMP-2, así como heterodímeros de BMP-2/X. Estas especies pueden ser separadas unas de otras a través de procedimientos conocidos en la técnica. Con el objeto de replegar las proteínas, las siguientes condiciones y medio pueden ser empleados: Tris aproximadamente 10 mM a aproximadamente 100 mM u otro regulador apropiado, preferiblemente Tris a aproximadamente 50 mM; NaCl a aproximadamente 0.1 a aproximadamente 4.0 M u otra sal adecuada, preferiblemente NaCl a aproximadamente 1.0 M; agente de repliegue [zwitteriones no detergentes, sulfobetaína, piridina, pirro! o aminociclohexano] a aproximadamente 0.05 a aproximadamente 2.0 M, preferiblemente agente de repliegue a aproximadamente 0.7 M; EDTA a aproximadamente 1 mM a aproximadamente 10 mM u otro reactivo de quelación de ion metálico que sea adecuado, preferiblemente EDTA a aproximadamente 5 mM; un sistema redox apropiado, tal como glutation, preferiblemente en una relación de aproximadamente 1 : 10 a aproximadamente 10: 1 de reductor a oxidante, a un pH de aproximadamente 7 a aproximadamente 1 1 , preferiblemente aproximadamente 8.5. Debido a que las BMPs son dímeros en su estado activo unidos a disulfuro, es útil incluir un sistema redox que permita la formación de enlaces tiol/disulfuro en el método de la invención. Se conocen diversos sistemas redox. Por ejemplo, las formas oxidada y reducida de glutaíion, ditiotreitol, ß-mercaptoetanol, ß-mercaptometanol, cistina y cistamina pueden ser usados como sistemas redox en relaciones de reductor a oxidante de aproximadamente 1 :10 a aproximadamente 10:1. Cuando se usa el sistema redox de glutation, la proporción de glutation reducido a glutation oxidado es preferiblemente de 1 a 10; más preferiblemente 1 a 1 ; y más preferiblemente 2 a 1 de forma reducida a forma oxidada. Además del agente de replegado, el método de la presente invención puede emplear una fracción de sal. La fracción de sal es preferiblemente NaCl, preferiblemente a una concentración de aproximadamente 0.1M a aproximadamente 2.0M, preferiblemente aproximadamente 1.OM. Puede ser preferible el variar la concentración de cloruro de sodio conforme la concentración del agente de repliegue varía. El pH de la reacción de replegado de la presente invención es preferiblemente de aproximadamente 7 a aproximadamenle 1 1 ; más preferiblemente de desde aproximadamente 8 a aproximadamente 10, y más preferiblemente aproximadamente -8,5. Preferiblemente, la reacción de replegado de la invención es llevada a cabo a un intervalo de temperatura de desde aproximadamente 4 °C a aproximadamente 37 °C. Más preferiblemente, la reacción de replegado es realizada a 20 °C. Se deja que las reacciones de replegado de la presente invención avancen hasta su terminación entre 8 y 120 horas y más preferiblemente 96 horas. El grado de repliegue de las proteínas morfogenéticas de hueso que se obtienen es monitoreado mediante electroforesia de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) bajo condiciones no reducidas y reducidas. Por ejemplo, el homodímero de BMP-4 aparece como una banda a aproximadamente 30 kD bajo condiciones no reducidas en un gel de SDS-pcliacrilamida al 16 por ciento; y el monómero de BMP-4 aparece como una banda a aproximadamente 13 kD bajo condiciones reducidas. El heterodímero de BMP-2/5 aparecerá como una banda de aproximadamente 35 kD bajo condiciones no reducidas en un gel de SDS-pcliacriiaminda al 16 por ciento; el monómero de BMP-2 aparece como una banda de aproximadamente 13 kD bajo condiciones reducidas; y el monómero de BMP-5 aparece como una banda de aproximadamente 15 kD bajo condiciones reducidas. El heterodímero de BMP-2/6 aparecerá como una banda de aproximadamente 35 kD bajo condiciones no reducidas en un gel de SDS-poliacrilaminda al 16 por ciento; el monómero de BMP -2 aparece como una banda de aproximadamente 13 kD bajo condiciones reducidas; y el monómero de BMP-6 aparece como una banda de aproximadamente 15 kD bajo condiciones reducidas. El heterodfmero de BMP -2/7 aparecerá como una banda de aproximadamente 35 kD bajo condiciones no reducidas en un gel de SDS-poliacrilaminda al 16 por ciento; el monómero de BMP-2~aparece como una banda de aproximadamente 13 kD bajo condiciones reducidas; y el monómero de BMP-7 aparece como una banda de aproximadamente 15 kD bajo condiciones reducidas.

Sin limitar la invención a una teoría o modo de acción particular, un concepto unificador ce los compuestos que son útiles en la presente invención parece ser el de moléculas que contienen una combinación de dos dominios, usualmente moléculas que contienen nitrógeno. Primero, la molécula debe contener un dominio hidrofóbico, por ejemplo, un anillo aromático tal como un anillo de piridina o pirrol. Alternativamente, puede ser un anillo no aromático tal como ciciohexano o un anillo no aromático conteniendo nitrógeno, en el que el nitrógeno está en la forma de una amina cuaternaria, tal como el ácido N-metil-N -piperidinpropanosulfónico (también conocido como 1 -metil- 1 -sulfonilpropilpiperidina). Segundo, la molécula debe contener un(os) dominio(s) substiíuyeníe(s) que proporciona(n) ya sea aíributos de zwitterion o bien de anión a la molécula. En una modalidad preferida, el dominio substituyente confiere a la molécula atributos de zwitterion. Además, los dominios hidrofóbico y substituyente de la molécula deben preferiblemente ser separados a fin de presentar distintas regiones. En una modalidad preferida, el grupo terminal aceptador de electrones es no más de cuatro átomos de carbono eliminados del anillo aromático o alifático substituido que contiene nitrógeno, más preferiblemente no más de tres átomos de carbono eliminados del anillo aromático o alifático substituido que contiene nitrógeno. En consecuencia, los compuestos útiles como agentes de repliegue en los métodos presentes incluyen compuestos zwitteriónicos no detergentes. Para propósitos de la presente invención, deberá reconocerse que ciertos compuestos pueden ser "zwitteriónicos" a intervalos seleccionados de pH, pero no así con otros. Tales compuestos son preferiblemente útiles en la presente invención a un pH en el que el compuesto es zwitteridnico. Los compuestos preferidos en este grupo incluyen zwitteriones no detergentes, tales como sulfobetaínas, incluyendo ciertos tipos de piridinas y pirróles. Anillos alifáticos substituido y conteniendo nitrógeno también pueden ser útiles cuando el nitrógeno está en la forma de una amina cuaternaria. En una modalidad preferida, es útil en la presente invención el zwitterion de sulfobetaína no detergente 3-(l-piridinio)--oropa-nosulfonato ("3-1-PPS"), el cual está comercialmente disponible en Fluka Chemical Company. Bn adición, también son efectivos compuestos que comprenden un anillo alifático tal como ciciohexano substituido con un grupo amina y un substituyente aceptador de electrones tal como un grupo carboxilo o sulfhidrilo. Esta clase de compuestos también pueden ser referidos como aminociclohexanos substituidos con ácido. Incluidos en este grupc de compuestos se encuentran algunos reguladores biológicos comunes o "reguiadores de Good," incluyendo el ácido 2-(ciclohexilamino)etanosulfónico (CHES), acide 3-(ciclohexilamino)-l-propanosulfónico (CAPS), ácido 3-(ciclohexilammo)-2-hidroxipropanosulfónico (CAPSO). Otro ejemplo preferido de un aminociclohexano substituido con ácido, que es útil en la presente invención es el ácido 2-aminociclohexanocarboxílico. Alternativamente, compuestos útiles en los presentes métodos incluyen compuestos con anillos aromáticos substituidos que contienen nitrógeno, tales como piridinas y pirróles substituidos con grupos aceptadores de electrones, preferiblemente grupos ácidos tales como grupos carboxilo o sulfhidrilo, o grupos amida. En una modalidad preferida, el ácido piridir. nicotínico, o vitamina B, es útil en la presente invención. También pueden ser útiles en la presente invención otros compuestos heterocíclicos, por ejemplo, purinas, diazinas, pirazoles e imidazoles substituidos con substituyentes aceptadores de electrones, preferiblemente grupos ácidos tales como grupos carboxilo o sulfhidrilo, o grupos amida, así como también derivados de cada uno de estos compuestos. En consecuencia, en una modalidad la presente invención comprenden métodos para la expresión de proteínas replegadas apropiadamente de la superfamilia TGF-ß a partir de cultivosjcelulares de bacteria usando uno de los compuestos de repliegue anteriores, como se describe con detalle más adelante, como un reactivo en el método. El cultivo de células de bacteria es preferiblemente E. coli, pero puede ser otro tipo de cultivo de células de bacterias o procarióticas. La proteína puede ser cualquier proteína procedente de la superfamilia TGF-ß, y es preferiblemente un miembro de la familia de las BMP, o de los factores de crecimiento y diferenciación ("GDFs"), así como también MP52 y otras proteínas como se describe con mayor detalle enseguida. El compuesto de replegado es preferiblemente seleccionado del grupo consistente en zwitteriones no detergentes, incluyendo sulfobetaínas no detergentes, piridinas substituidas, pirróles substituidos y aminociclohexanos substiíuidos con ácido. El compuesto de repliegue preferiblemente comprende un dominio hidrofóbico, por ejemplo, un anillo aromático o aíifático, y preferiblemente además comprende un dominio substituyente, por ejemplo, un grupo terminal aceptador de eleclrones, preferiblemente un grupo ácido tal como un grupo carhoxiío o sulfhidrilo. Otros dominios substituyentes que pueden ser útiles en la presente invención incluyen grupos amidas. Las sulfobetaínas no detergentes que son útiles en los métodos presentes incluyen propanosulfonatos de piridinio, tales como 3 -( 1 -piridinio)- 1-propanosulfonato ("3-1-PPS"). Los compuestos de piridina substituida que son útiles en la presente invención incluyen el ácido piridin-3 -sulfónico, ácido piridin-2-carboxílico [también conocido como ácido nicotínico, niacina o Vitamina B], ácido picolínico, hidrocloruro de ácido 3-piridilacético, hidrocloruro de ácido 4-piridilacético, ácido isoxiicotínico y nicotinamida. Los compuestos de pirrol substituidos que son útiles en ia presente invención incluyen análogos de pirrol de los compuestos de piridina anteriores. Por ejemplo, ácido pirrol-2-carboxílico, ácido pirrol-3 -sulfónico, hidrocloruro de ácido ?irrol-3-acético, hidroclururo del ácido 2-pirrol acético, ácido 2-pirroletanosulfónico, ácido 3-pirroIhidroximetano sulfónico. Entre los aminociclohexanos substituidos que son útiles en la presente invención se encuentra el ácido 2-aminociclohexanocarboxílico, y Reguladores de Good, tales como CHES, CAPS y CAPSO. Enseguida se ilustran algunos compuestos que son úíiles en la presente invención: ZwiííerñG-jies No-Detergentes, PMdinas Srabstitaidas y Derivados de Ácido Nicotínñco HidrocloruiO de cido 3-Piridilacético Hidrocloruro de Ácido 4-Piridilacético Ácido Picolínico Ácido Piridin-3-Sulfónico Hidrocloiiiro de Trigonelina Ácido nicotínico Nicotinamida Ácido isonicotínico 5ÍE*roIes SMT-.s itM! l©§ Ácido pi?tol-2-carboxílico De manera distinta a las piridinas y pirróles substituidos, los aminociclohexanos substituidos que son útiles en la presente invención contienen un anillo alifático con un substitayenle de amina con un grupo terminal aceptador de electrones, tal como un grupo carboxilo o sulfhidrilo. Por ejemplo, CHES, CAPS y CAPSO son cada uno efectivos en los métodos de la presente invención. Enseguida se ilustran varios compuestos que son útiles.

AffitoocScloIhexalaos Substituidos _ CAPSO Ácido 2-aminociclohexanocarboxílico . c CAPS La actividad biológica in vitro de las proteínas morfogéneticas de hueso replegadas pueden ser monitoreada mediante los ensayos W-20 presentados en los ejemplos. El uso de células estromáticas de médula ósea W-20-17 como una línea celular indicadora está basado en la conversión de estas células a células de tipo osteoblasto después del tratamienío con BMP [Thies eí al, Journal of Bone and Mineral Research 5(2):305 (1990); y Thies et al., Endocrinology 130: 1318-1324 (1992)]. Las células W-20-17 son una línea celular estromáfica de médula ósea clonal derivada de ratones adultos por investigadores en el laboratorio del Dr. D. Nathan, Children' s Hospital, Boston, MA. El tratamiento de células W-20-17 con BMP resulta en (1) producción incrementada de fosfatasa alcalina, (2) inducción de AMPc estimulada por hormona paratiroidea, y (3) inducción de síntesis de osteocaleina por las células. Si bien (1) y (2) representan características asociadas con el fenotipo de osteoblastos, la capacidad de sintetizar osteocalcina es una propiedad fenotípica solamente desplegada por osteoblastos maduros. Además, hasta la fecha nosotros hemos observado conversión de células estromálicas W-20-17 a células de tipo osteoblastos solo con el tratamiento con proteínas morfogenéticas de hueso.

Los siguientes ejemplos ilustran la práctica de la presente invención en la expresión y recuperación de protema BMP-2 humana y recombinante usando zwitíeriones no detergentes, piridinas substituidas, pirróles substituidos y aminociclohexanos substituidos con ácido, en la reacción de repliegue. Estos ejemplos no son limitativos y la persona capacitada en la técnica reconocerá que numerosas modificaciones y variaciones son posibles. Tales modificaciones constituyen parte de la presente invención. La descripción de cada una de las publicaciones y referencias citadas aquí, por medio de la presente se incorporan como referencia. i o Ejemplos Ejemplo 1: Expresión de BMP en E. coli Un plásmido de expresión pALBP2-781 conteniendo las siguientes características principales fue construido para la producción de BMP-2 en E. coli. Los nucleótidos 1-2060 contienen secuencias de ADN que se originan a partir del plásmido pUC-18 [Norrander et al., Gene 26:101-106 (1983)] incluyendo secuencias que contienen el gene para ß- laclamssa, el cual confiere resistencia al antibióíico ampicilina en cepas hospederas de E. coli, y un origen de replicación derivado de colEl. Nucleótidos 2061-2221 contienen 5 secuencias de ADN para el promotor mayor izquierdo (pL) del bacteriófago ? [Sanger eí al, Mol Biol. 162: 729-773 (1982)], incluyendo tres secuencias operadoras O- , OL2 y OL3. Los operadores son los sitios de unión para la proteína represora de ?cl, niveles iníracelulares -del cual controlan el monto de iniciación de transcripción a partir de pL. Nucleótidos 2222-2723 contienen una secuencia de unión a ribosoma fuerte incluida en mía secuencia derivada de los nucleótidos 35472-35566 y 38137 a 38361 del bacteriófago lambda como se describe en Sanger et al., Mol. Biol. 162:729-773 (1982). Nucleótidos 2724-3133 contienen una secuencia de ADN que codifica para proteína BMP-2 madura con unos 62 nucleótidos adicionales de secuencia 3' no traducida. Nucleótidos 3134-3149 proveen una secuencia de ADN "Ligadora" que contiene sitios de endonucleasa de restricción. Nucleótidos 3150-3218 proveen una secuencia de terminación de transcripción basada en aquella del gene de asp. A de E. coli [Takai et al., Nucí. Acids Res. j_3: 2063- 30 2074 (1985)]. Nucleótidos 3219-3623 son secuencias de ADN derivadas de pUC-18.

Usando endonucleasas de restricción y procedimientos conocidos en la técnica, uno puede fácilmente reemplazar la secuencia de codificación para BMP -2 contenida en pALBP2-781 con la secuencia de codificación para otra BMP que se desea producir en E. coli. Con esta substitución en el plásmido pALB2-781, los siguientes ejemplos pueden ser usados para expresar y replegar cualesquiera de las BMPs de la presente invención. Si se desean modificaciones adicionales dentro de los conocimientos de la técnica pueden ser hechas en los elementos reguladores del plásmido y/o línea celular con el objeto de mejorar o simplificar el sistema de expresión. El plásmido pALBP2-781 fue transformado dentro de la cepa hospedera de E. coli GI724 (F, Iaclq, lacp 8, ampC:: ?cl+) mediante el procedimiento de Daget y Ehrlich, Gene 6:23 (1979). Los transformantes fueron seleccionados en placas de agar al 1.5% peso/volumen conteniendo medio IMC, el cual está compuesto de medio M9 [Miller, "Experiments in Molecular Genetics," Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1972)] complementado con MgSO 1 mM, glucosa al 0.5% peso/volumen, ácidos casamino al 0.2%o peso/volumen y 100 µg/ml de ampicilina. GI724 transformado con pALBP2-781 fue hecho crecer a 32 °C a una A600 de 15 en medio IMC con 3xMgSO4 y 200 µg/ml de ampicilina. Para crecer con otras líneas de E. coli que no transportaban el gene de thyA, no se requirió de ampicilina en el medio. La concentración de glucosa del medio de cultivo fue mantenida a aproximadamente 0.2% (peso/vol). El pH se mantuvo a 7.2 con hidróxido de amonio al 7.5 M. Se agregó triptófano hasta una concentración final de 100 µg/ml y el cultivo se incubó por 4 horas más a 37 °C. Durante este tiempo la proteína BMP se acumuló hasta aproximadamente 10%> de la proteína celular total; toda en la fracción del cuerpo de inclusión.

Ejemplo 2: Purificación, Reducción y Sotabilización de Cuerpos de Incl?sión de BMP-2 4.5 kg de células almacenadas a -80 °C fueron medidos Y2 L de Tris 100 mM, pH 8.0 fueron agregados. La suspensión se mezcló con un agitador de rotor/estator hasta que ías células estaban bien suspendidas. Las células fueron Usadas haciendo pasar la suspensión a través de un homogeneizador APV Gaulin CD-30 tres veces a 8500 psig. Los cuerpos de inclusión fueron recuperados en una centrífuga Sharples AS-26 operada a una fuerza centrífuga relativa máxima de 15,000 x g con una velocidad de flujo de alimentación de 0.8 L/min. Los cuerpos de inclusión recuperados fueron combinados con 35 L de Tris 100 mM/EDTA 5 mM, pH 8.0 y mezclados con un agitador de rotor/estator hasta estar bien suspendidos. La suspensión de los cuerpos de inclusión fue hecha pasar a través de un hcmogeneizador APV Gaulin CD-30 nueve veces a 12,500 psig y los cuerpos de inclusión fueron recuperados en una centrífuga Sharples AS-26 operada a una fuerza centrífuga relativa máxima de 15,000 x g con una velocidad de flujo de alimentación de 0.5-1.0 L/min. Aproximadamente 340 gramos de cuerpos de inclusión conteniendo BMP-2 fueron recuperados. Los cuerpos de inclusión fueron purificados adicionalmente después de suspenderlos en Tris 50 mM, pH 8.0 a 9 gramos/L mediante centrifugación durante cinco minutos a una fuerza centrífuga relativa máxima de 3000 x g. Los sobrenadantes resultaníes fueron decantados. Los cuerpos de inclusión fueron solubilizados y reducidos medianíe incubación en un volumen igual de guanidina-HCl 8 M, EDTA 10 mM, Tris 100 mM y ditioíreitol 100 mM, pH 8.5, durante una hora a 37 °C. El maíerial insoluble fue subsecuentemente eliminado mediante filtración a través de un filtro Mülipore Millex de 0.2 µm. El monómero de BMP-2 reducido y desnaturalizado fue purificado adicionalmente usando una columna de fase inversa C4 (2.2 x 25 cm Vydac). La columna fue eluida usando un gradiente lineal de 40 a 80% B en 72 minutos a 23 mL/min [A=0.5% (v/v) de TFA; B=0.5% (v/v) de TFA, 30% alcohol 2-propílico, 60% acetonitrilo]. La BMP-2 que eíuyó entre 18 y 20 minutos fue acumulada y la concentración de proteína fue determinada mediante A280 versus 0.5% (v/v) TFA, 17% de alcohol 2-propílico, y 34% de acetonitrilo usando el coeficiente de extensión teórico sobre la base del contenido de aminoácido. El acumulado de BMP-2 fue congelado a -80 °C y subsecuentemente liofilizado antes del repliegue.

Ejemplo 3: Repliegue de BMP-2 con el Zw?tte_tion No detergente 3-(l- piridñnio)-l-propano§uIfomato. BMP-2 purificada por fase inversa y liofílizada fue solubilizada como concentrado 10X a "250-500 µ/ml en glutation reducido al 20 mM. La proteína soluble fue inmediatamente diluida en regulador de replegado produciendo una solución de repliegue conteniendo Tris 50 mM, EDTA 5 mM, NaCl 1 M, glutation oxidado 1 mM, glutation reducido 2 M, 3 -(piridinio)- 1 -propanosulfonato 0.05-1.7 M y 25-50 µg/ml de BMP-2 a un pH de 8.5. El repliegue avanzó durante tres a cuatro horas a temperatura ambiente (aproximadamente 20 °C). El repliegue de la BMP -2 producida por E. coli se analizó bajo condiciones no reductoras usando electroforesia en dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE). Alícuotas de muestra fueron corridas en geles de acrilamida al 10-20%> (Integrated Separation Systems) durante aproximadamente 2.5 horas a 75 miliamperes. Subsecuentemente fue detectada la proteína mediante teñido con plata. El repliegue fue registrado como positivo cuando el material de inicio de BMP-2 solubilizada con glutatíon apareció como un monómero de peso molecular apropiado y BMP-2 incubada en medio de repliegue apareció como un dímero del peso molecular apropiado bajo condiciones no reductoras. El dímero de BMP -2 también fue analizado bajo condiciones reductoras mediante SDS-PAGE. Bajo condiciones reductoras, la BMP-2 apareció como un monómero de peso molecular apropiado. La actividad biológica de la BMP-2 replegada fue probada usando los ensayos descritos en el Ejemplo 1 1. El dímero de BMP -2 se formó a una concentración de 0.05 a 1.7 M del 3-(l-piridinio)-l-propanosulfonato; óptimamente a 1.0 a 1.7 M de 3-(l-piridinio)-l-propanosulfonato.

Ejenapíß 4: Repliegue de BMP-2 con ácido Nicotínico (Vitapuna B) BMP -2 purificada por fase inversa y liofilizada fue solubilizada como concentrado 10X a 500 µg/ml en glutation reducido 20 mM. La proteína soluble fue inmediatamente diluida en regulador de replegado produciendo una solución de repliegue conteniendo Tris 50 mM, EDTA 5 M, NaCl 1 M, glutation oxidado 1 mM, glutation reducido 2 mM, ácido nicotínico 0.25-1.0 M y 50 µg/ml de BMP-2 a un pH de 8.5 (el pH fue ajustado a aproximadamente 8.5 con NaOH 5-10 M antes de la dilución del concentrado de BMP -2). La solución resultante fue mantenida a temperatura ambiente (aproximadamente 20 °C) durante tres a cuatro días.

El repliegue de la BMP-2 producida por E. coli se analizó bajo condiciones no reductoras usando electroforesia en dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) como se describe en el Ejemplo 3. Se observó que el dímero de BMP -2 se formó a una concentración de 0.25 a 1.0 M del ácido nicotínico. La recuperación del dímero de BMP-2 fue óptima a una concentración de ácido nicotínico 1.0 M.

Eje?m?plo 5: Repliegue de BMP-2 con ácido piridin-3-sulfónico BMP-2 purificada por fase inversa y liofilizada fue solubilizada como en el Ejemplo 4. La proteína soluble fue inmediatamente diluida en regulador de replegado produciendo una solución de repliegue conteniendo Tris 50 mM, EDTA 5 mM, NaCl 1 M, glutation oxidado 1 mM, glutation reducido 2 mM, ácido piridin-3 -sulfónico 0.25-0.60 M y 50 µg/ml de 3MP-2 a un pH de 8.5 (el pH fue ajustado a aproximadamente 8.5 con NaOH 5-10 M antes de la dilución del concentrado de BMP-2). La solución resultante fue mantenida a temperatura ambiente (aproximadamente 20 °C) durante tres a cuatro días. El repliegue de la BMP-2 producida por E. coli se analizó bajo condiciones no reductores usando electroforesia en dodecilsulfaío de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) como se describe en el Ejemplo 3. Se observó que el dímero de BMP-2 se formó a una concentración de 0.25 a 0.60 M del ácido piridin-3-sulfónico. La conversión de la BMP-2 monomérica a dímero fue mayor a una concentración de ácido piridin-3 -sulfónico de 0.4-0.6 M.

Ejemplo 6: Repliegue de BMP-2 con ácido 2-(c lohe--ilanaino)etanosuñíónico (CHES) BMP -2 purificada por fase inversa y liofilizada fue solubilizada como concentrado 10X a 250-500 µ ml en glutation reducido 20 mM. La proteína soluble fue inmediatamente diluida en regulador de replegado. La solución final de repliegue contenía Tris 50 mM, EDTA 5 mM, NaCl 1 M, glutation oxidado 1 mM, glutation reducido 2 mM, ácido 2-(ciclohexila mo)etanosulfónico (CHES) 0.25-0.70 M y 25-50 µg/ml de BMP-2 a un pH de 8.3. El repliegue avanzó durante tres a cuatro días.

El repliegue de la BMP-2 producida por E. coli se analizó bajo condiciones no reductoras usando electroforesia en dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) como se describe en el Ejemplo 3. Se observó que el dímero de BMP -2 se formó a una concentración de 0.25 a 0.70 M de CHES. La conversión de la BMP-2 monomérica a dímero fue mayor a una concentración de CHES de 0.70 M.

Ejemplo 7: Repliegue de BMP-2 con ácido pirrol-2-carbosilico BMP-2 purificada por fase inversa y liofilizada fue solubilizada como un concentrado 10X a 500 µg/ml en glutation reducido 20 mM. La proteína soluble fue imriediaramente diluida en regulador de replegado produciendo una solución de repliegue conteniendo Tris 50 mM, EDTA 5 mM, NaCl 1 M, glutation oxidado 1 mM, glutation i-educido 2 rnM, ácido pütol-2-carboxílico 0.40-0.65 M y 50 µg/ml de BMP-2 a un pH de 8.4 (el pH fue ajustado a aproximadamente 8.4 con NaOH 5-10 M antes de la dilución del concentrado de BMP-2). La solución resultante fue mantenida a temperatura ambiente (aproximadamente 20 °C) durante tres a cuatro días. El repliegue de la BMP-2 producida por E. coli se analizó bajo condiciones no reductoras usando electroforesia en dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) como seYescribe en el Ejemplo 3. Se observó que el dímero de BMP-2 se formó a una concentración de 0.40 a 0.65 M del ácido pirrol-2-carboxílico. La recuperación del dímero de la 3MP-2 fue mayor a una concentración de ácido pirrol-2-carboxílico de 0.40 M.

Ejemplo 8: Repliegue de BMP- 13 con el Zwiíterion No detergente 3-(l-piridinio)-l- propamosu Onato. Se expresó BMP-13 como se describió en el Ejemplo 1. Nueve gramos de granulos de células congeladas que se obtuvieron de transformantes de E. coli como se describió más arriba fueron descongelados en 30 ml de regulador TE8.3 (100:10) (Tris-HCl 100 mM, pH 8.3, Na2BDTA 10 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo [PMSF] 1 mM). Las células fueron Usadas mediante tres pasos a través de un Microfluidizador™ [modelo #MCF 100T]. EL Iisaío fue diluido a aproximadamente 120 ml con regulador TE8.3 100:10. Un granulo del material del cuerpo de inclusión fue obtenido mediante centrifugación a 15,000 x g. El sobrenadante fue decantado y el material del cuerpo de inclusión fue suspendido en 50 ml de TE8.3(100:10) el cual también contenía Triton-X-100 al 1%. Los cuerpos de inclusión resuspepdidos fueron centrifugados durante 10 minutos a 15,000 x g, y el sobrenadante se ¿ecantó Los granulos fueron suspendidos en regulador TE8.3(20:1) (Tris-CHl 20 mM, pH 8.3, Na2EDTA 1 mM, PMSF 1 mM) el cual también contenía ditiotreiíol [DTT] al 1%. Después de que la suspensión fue homogeneizada en un homogeneizador de vidrio Wheaton, se acidificó a un pH de 2.5 con ácido acético glacial y posteriormente se centrifugó durante 25 minutos a 15,000 x g. El sobrenadante procedente de esta ceptrrfag c?ón fue recolectado y sometido a cromatografía sobre una columna de exclusión por tamaflo de Sepharose S-100™ (83 cm x 2.6 cm; «440 ml de lecho) en incrementos de 20 ml. La columna de Sepharose S-100™ fue corrida con una fase móvil de 1% de ácido acético a una velocidad de flujo de 1.4 ml/min. Las fracciones correspondientes al monómero de BMP-13 fueron detectadas mediante absorbancia a 280 nm. La concentración de protefna fue determinada usando un coeficiente de extinción y peso molecular calculados por computadora después de medir la absorbancia de un acumulador a 280 mu. Este material acumulado de la columna de exclusión por tamaño fue usado como material de arranque para reacciones de repliegue. Alternativamente, fueron Usadas células como se indicó anteriormente, pero el granulo de material de los cuerpos de inclusión fue disuelto en guanidina-HCl 8 M. regulador TE8.5(100: 10) (Tris-HCl 100 mM, pH 8.5, Na2EDTA 10 mM, efcual contenia DTT 100 mM, e incubadas a 37 °C durante 1 hora. Este material fue centrifugado a 12,000 x g durante 15 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante fue inyectado a una columna RP-HPLC (cromatografía líquida de alta resolución y en fase inversa) analítica C4 (Vydac 214TP54) equilibrada a 1% de regulador B (regulador A = 0.1% ácido trifluoroacético [TFA], regulador B = 95% acetonitrilo, 0.1%) TFA), con una velocidad de flujo de 1 ml/min. Después de 5 minutos, un gradiente lineal de 1% a 70% de regulador B (diluido en regulador A) fue corrido en 35 minutos, tiempo durante el cual eluye la proteípa. La proteína fue monitoreada por absorbancia a 280 nm. Las fracción de BMP- 13 del pico (eluyendo entre 25 y 35 minutos) fueron acumuladas. La concentración de proteína fue determinada por absorbancia a 280 nm usando el peso molecular y el coeficiente de extinción calculados por computadora. Este material acumulado de columna C4 de RPHPLC también fue usado como el material de inicio para reacciones de repliegue. Proíeína BMP- 13 en 1% de ácido acético o en regulador de fase inversa conteniendo O.P/o TFA, 30-40%) de acetonitrilo fue secada o reducida en volumen usando un vació de velocidad, redisueltas como un concentrado con unos pocos microlitros de agua purificada o glutation reducido, y se dejo disolver completamente durante 5 a 10 minutos. La proteína soluble fue subsecuentemente diluida en regulador de repliegue. La solución de repliegue final contenía Tris 50 mM, EDTA 5 mM, NaCl 1 M, glutation oxidado 1 mM, glutation reducido 2 mM, 3 -(l-piridinio)-l -propanosulfonato 1.0 M y 50 µg/ml de BMP-13 a un pH de 8.4. El repliegue avanzó durante tres a cuatro días a temperatura ambiente (20-23 °C). El repliegue de la BMP- 13 producida por E. coli en 3 -(1 -piridinio)- 1 -propanosulfonato fue analizado bajo condiciones reductoras y no reductoras usando electroforesia de Tricino-dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) o electroforesia al 10-20% de dcdecilsulfato de sodio-poliacrilamida. La proteína fue detectada mediante teñido con plata. El repliegue fue registrado como positivo cuando la BMP- 13 apareció como un dímero del peso molecular apropiado bajo condiciones no reductoras y como un monómero del peso molecular apropiado bajo condiciones reductoras. El dímero de BMP- 13 fue producido en la presencia de 3 -(1 -piridinio)-! -propanosulfonato 1.0 M.

Ejemplo 9: Repliegue de BMP-13 con ácido cotín o (Vitamina ES) BMP- 13 purificada por exclusión por tamaño y solubilizada con ácido acético, como se describió en el Ejemplo 8, fue liofilizada y subsecuentemente solubilizada como un concentrado 10X a 500 µ/ml en glutation reducido 20 mM. La proteína soluble fue inmediatamente diluida en regulador de replegado produciendo una solución de repliegue conteniendo Tris 50 mM, EDTA 5 mM, NaCl 1 M, glutation oxidado 1 mM, glutation reducido 2 mM, ácido nicotínico 0.65-1.0 M y 50 µg/ml de BMP-13 a un pH de 8.5 (el pH fue ajustado a aproximadamente 8.5 con NaOH 5-10 M antes de la dilución del concentrado de BMP-13). La solución resultante fue mantenida a temperatura ambiente (aproximadamente 20 °C) durante tres a cuatro días.

El repliegue de la BMP-13 producida por E. coli se analizó bajo condiciones no reductoras usando electroforesia en dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE). Alícuotas de muestra fueron corridas en geles de acrilamida al 10-20% (Integrated Separetion Systems) durante aproximadamente 2.5 horas a 75 miliamperes. Subsecuentemente fue detectada la proteína mediante teñido con plata. El repliegue fue registrado como positivo cuando el material de inicio de BMP- 13 solubilizada con glutation apareció como un monómero de peso molecular apropiado y BMP- 13 incubada en medio de repliegue apareció como un dímero del peso molecular apropiado bajo condiciones no reductoras. La recuperación del dímero de BMP- 13 fue comparable a ácido nicotínico 0.65-1.0 M.

Ejemplo ID: Repliegue de Pleterodímero de BJV?P-2/13 con el Zwitterion No detergente 3-(l-piridinio)-l-propanosMlfonato. Se expresaron BMP -2 y BMP- 13 como se describió en el Ejemplo 1. Los cuerpos ¿e inclusión de BMP-2 fueron aislados, y la BMP -2 fue subsecuentemente solubilizada y purificada co o se definió en el Ejemplo 2. Monómero de BMP-13 reducida fue preparada co o se describió en el Ejemplo 8. BMP-2 liofilizada fue redisuelta como un concentrado en agua purificada. Las BMP-2 y BMP- 13 fueron diluidas en regulador de repliegue resultando en proporciones de masa iguales en la solución de repliegue. La composición final de la solución de repliegue era de Tris 50 mM, EDTA 5 mM, NaCl 1 M, glutation oxidado 1 mM, glutation reducido 2 mM, 3-(l -piridinio)- 1 -propanosulfonato 1.0 M, 50 µg/ml de BMP -2 y 50 µg/ml de BMP- 13 a aproximadamente pH de 8.5. El repliegue avanzó durante tres a cuatro días a temperatura ambiente (20-23 °C). El repliegue del BMP-2/13 producido por E. coli en 3 -(1 -piridinio)- 1 -propanosulfonato fue analizado bajo condiciones reductoras y no reductoras usando electroforesia de 16% de Tricino-dodeci sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) o electroforesia al 10-20% de dodeciisulfato de sodio-poliacrilamida. La proteína fue detectada mediante teñido con plata. El repliegue fue registrado como positivo cuando el BMP-2/13 apareció como un heíerodímero del peso molecular apropiado bajo condiciones no reductoras y como proteínas monoméricas del peso molecular apropiado bajo condiciones reductoras. El heterodímero de BMP-2/13 fue producido en la presencia de 3-(l -piridinio)- 1 -pro?ar_osulfonato 1.0 M.

Ejemplo 11 Ensayo de Fosfatasa Alcalina de W-20. Si se desea para propósitos de regulación, pueden agregarse una etapa de desalado antes ce la prueba para determinar la actividad de protema replegada. Células W-20-17 son colocadas en placa dentro de placas de cultivo de tejido de 96 pozos ani a densidad de 10,000 células por pozo en 200 µl de medio (DME con 10% de suero de res fetal inacíivado con calor, glutamina 2 mM). Se permitió que las células se unieran durante toda la noche en un incubador con 95% de aire, 5% de CO2, a 37 °C. Los 200 µl de medio se retiraron de cada pozo con una pipeta multicanal y se reemplazaron con un volumen igual de la muestra de prueba entregada en DME con 10% de suero de res fetal inactivado con calor, glutamina 2 mM y 1% de penicilina-estreptomicina. Las muestras de prueba y los estándares se dejan duraníe un periodo de incubación de 24 horas con las células indicadoras de W-20-17. Después de las 24 horas, las placas son retiradas del incubador a 37 °C y el medio de prueba es eliminado de las células. Las capas de células W-20-17 son lavadas tres veces con 200 µl por pozo de salmuera regulada con fosfato y libre de calcio/magnesio y estos lavados son desechados. 50 µl de agua destilada en vidrio son agregados a cada pozo y las placas de ensayo son entonces colocadas sobre un baño de hielo seco/etanol para un congelamiento rápido. Una vez congeladas, las placas de ensaye son retiradas del baño de hielo seco/etanol y descongeladas a 37 °C. Esta etapa es repetida dos veces más para un periodo total de tres procedimientos de congelación-descongelación. Una vez terminado, la fosfatasa alcalina unida a membrana está disponible para las mediciones. 50 µl de la mezcla de ensayo (glicina 50 mM, 0.05% Tritón X-100, MgCl2 4 mM, fosfato Ye p-nitrofenol 5 mM, pH=10.3) se agregan a cada placa de ensayo y las placas de ensayo son entonces incubadas durante 30 minutos a 37 °C en una baño de agua con agitación a 60 oscilaciones por minuto.

AI final de la incubación de 30 minutos, la reacción es detenida agregando 100 µl de NaOH 0.2 N a cada pozo y colocando las placas de ensaye sobre hielo. La absorbancia espectrofotométrica para cada pozo es leída a una longitud de onda de 405 nanometros. Estos valores se comparan entonces con estándares conocidos para dar un estimado de la actividad de fosfatasa alcalina en cada muestra. Por ejemplo, usando cantidades conocidas de fosfato de p-nitrofenol se generan los valores de absorbancia. Esto se muestra en la Tabla I. Tabla I Valores de Absorbancia para Estándares Conocidos de Fosfato de P-Nitrofenol µmoles de fosfato de p-nitrofenol Absorbancia media (405 nm) 0.000 0 0.006 0.261 +/- 0.024 0.012 0.521 +/- 0.031 0.018 0.797 +/- 0.063 0.024 1.074 +/- 0.061 0.030 1.305 +/- 0.083 Los valores de absorbancia para cantidades conocidas de BMP-2 pueden ser deíerrriipados y convertidos a µmoles de fosfato de p-nitrofenol cortadas por unidad de tiempo como se muestra en la Tabla II. Tabla II Valores de Fosfatasa Alcalina para Tratamiento de Células W-20 con BMP-2 Concentración de Lectura de Absorbancia Umoles de substraío BMP-2 (ns/ml) (405 nanómetros) (Por hora) 0.00 0.645 0.024 1.56 0.696 0.026 3.12 0.765 0.029 6.25 0.923 0.036 12.50 1.121 0.044 25.00 1.457 0.058 50.00 1.662 0.067 100.00 1.977 0.080 Estos valores son entonces usados para comparar las actividades de homodímero de BMF y/o soluciones de heterodímero con cantidades conocidas de homodímero de BMP-2.

Claims (23)

1. Novsdad de la Invención 1. Un método para la expresión de una proteína procedente de la superfamilia del factor beta de crecimiento de transformación [TGF-ß], el cual comprende: a) cultivar células procarióticas que han sido transformadas con un ADN que codifica para una proteína de TGF-ß bajo condiciones adecuadas para la producción de proteína TGF-ß recombinante; y b) replegar la proteína TGF-ß recombinante en medio de replegado que comprende un compuesto zwitteriónico no detergente.
2. 2. El método de la reivindicación 1, en donde las células procarióticas son E. coli.
3. 3. El método de la reivindicación 2, en donde la proteína es proteína morfogenética de hueso.
4. 4. El método de la reivindicación 3, en donde el compuesto zwitteriónico no detergente es una sulfobetaína no detergente y substituida.
5. 5. El méíodo de la reivindicación 4, en donde el compuesto zwitteriónico no detergente es un 3-(l -?iridinio)-l-piOpanosulfonato.
6. 6. El método de la reivindicación 1, en donde el compuesto zwitteriónico no detergente es un compuesto con un anillo aromático conteniendo nitrógeno o un anillo alifático conteniendo nitrógeno, en donde el nitrógeno está en la forma de una amina cuaternaria, dicho compuesío además conteniendo un grupo substituyente aceptador de electrones.
7. 7. El méíodo de la reivindicación 6, en donde el compuesto zwitteriónico no detergente se selecciona del grupo consistente en ácido N-metil-N-piperidinpropanosulfónico, hidrocloruro de trigomelina y cloruro de 1-carboximetilpiridino.
8. 8. Un método para la expresión de una proteína procedente de la superfamilia del factor beta de crecimiento de transformación [TGF-ß], el cual comprende: a) cultivar células procarióticas que han sido transformadas con un ADN que codifica para una proteína de TGF-ß bajo condiciones adecuadas para la producción de proteína TGF-ß recombinante; y b) replegar la proteína TGF-ß recombinante en medio de replegado que comprende un compuesto de piridina substituida con ácido o amida.
9. 9. El método de la reivindicación 8, en donde el compuesto de piridina substituida se selecciona del grupo consistente en ácido piridin-3 -sulfónico, ácido piridin-2-carboxílico, ácido picolínico, hidrocloruro de ácido 3-piridilacético, hidrocloruro de ácido 4-?iridilacético, ácido 2-piridinetanosulfónico, ácido 3-piridilhidroximetanosulfónico, ácido nicotínico, ácido isonicotínico y nicotinamida.
10. 10. El método de la reivindicación 9, en donde las células procarióticas son células de bacteria.
11. 11. El método de la reivindicación 10, en donde las células procarióticas son K coli.
12. 12. El método de la reivindicación 9, en donde la proteína es proteína morfogenética" de hueso.
13. 13. Un método para la expresión de una proteína procedente de la superfamilia del factor beta de crecimiento de transformación [TGF-ß], el cual comprende: a) cultivar células procarióticas que han sido transformadas con un ADN que codifica para una proteína de TGF-ß bajo condiciones adecuadas para la producción de proteína TGF-ß recombinaníe; y b) replegar la proteína TGF-ß producida recombinantemeníe en medio de replegado que comprende un compuesto de pirrol substituido con ácido o amida.
14. 14. El método de la reivindicación 13, en donde el compuesto de pirrol substituido se selecciona del grupo consistente en ácido pirrol-2-carboxílico, ácido ?irrol-3-sulfónico, hidrocloruro de ácido pirrol-3 -acético, hidroclururo del ácido 2-pirrol acético, ácido 2-pirroletanosulfónico, ácido 3-pirrolhidroximetanosulfónico.
15. 15. El método de la reivindicación 14, en donde las células procarióticas son células de bacteria.
16. 16. El método de la reivindicación 15, en donde las células procarióticas son E. coli.
17. 17. El método de la reivindicación 14, en donde la proteína es proteína morfogenética de hueso.
18. 18. Un método para la expresión de una proteína procedente de la superfamilia del factor beta de crecimiento de transformación [TGF-ß], el cual comprende: a) cultivar células procarióticas que han sido transformadas con un ADN que codifica para una proteína de TGF-ß bajo condiciones adecuadas para la producción de proteína TGF-ß recombinante; y b) replegar la proteína TGF-ß producida recombinantemente en medio de replegado que comprende un compuesto de aminohexano substituido con ácido.
19. 19. El método de la reivindicación 18, en donde el compuesto de aminohexano substituido se selecciona del grupo consistente en ácido 2-aminohexanocarboxílico, CHES, CAPS y CAPSO.
20. 20. El método de la reivindicación 19, en donde las células procarióticas son células de bacteria.
21. 21. El método de la reivindicación 20, en donde las células procarióticas son K coli.
22. 22. El método de la reivindicación 19, en donde la pro teína es pro teína morfogenélica de hueso.
23. 23. Ei método de la reivindicación 1, en donde el compuesto zwitteriónico no detergente contiene un grupo hidrofóbico seleccionado del grupo consistente en anillos aromáticos que contienen nitrógeno y anillos alifáticos que contienen nitrógeno cuaternario, y un grupo terminal electrofílico seleccionado del grupo consistente en ácido y amida, y en donde el grupo terminal electrofílico es no más de cuatro átomos de carbono eliminados del anillo conteniendo nitrógeno.