BRPI0708751A2 - método para dobramento de um fator de crescimento transformante beta, ou um análogo funcional do mesmo, em uma forma dimérica e biologicamente ativa e método de produção de um fator de crescimento transformante de beta ativo a partir de um hospedeiro procariótico - Google Patents

Abstract

MéTODO PARA DOBRAMENTO DE UM FATOR DE CRESCIMENTO TRANSFORMANTE BETA, OU UM ANáLOGO FUNCIONAL DO MESMO, EM UMA FORMA DIMéRICA E BIOLOGICAMENTE ATIVA E MéTODO DE PRODUçãO DE UM FATOR DE CRESCIMENTO TRANSFORMANTE BETA ATIVO A PARTIR DE UM HOSPEDEIRO PRO-CARIóTICO. A presente invenção refere-se a um método para dobramento de um fator de crescimento transformante Beta ou um análogo funcional do mesmo, em uma forma biologicamente ativa, dimérica. O método envolve adição de fator de crescimento monomérico não dobrado, solubilizado a uma solução contendo ácido 2-(cilcohexilamino)-etanossulfónico (CHES) ou um análogo funcional do mesmo, e um sistema de oxirredução de sulfidrila/dissulfeto de baixo peso molecular. A solução é, então, incubada sob condições adequadas para a geração de fator de crescimento transformante Beta ativo, biologicamente dimérico.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO PARADOBRAMENTO DE UM FATOR DE CRESCIMENTO TRANSFORMANTEBETA, OU UM ANÁLOGO FUNCIONAL DO MESMO, EM UMA FORMADIMÉRICA E BIOLOGICAMENTE ATIVA E MÉTODO DE PRODUÇÃO DEUM FATOR DE CRESCIMENTO TRANSFORMANTE BETA ATIVO APARTIR DE UM HOSPEDEIRO PROCARIÓTICO".

A presente invenção refere-se a um método para dobramento,ou redobramento de proteínas em uma forma ativa. A invenção particular-mente refere-se a dobramentos dos membros da superfamília de fator decrescimento transformante-beta.

A superfamília de fator de crescimento transformante beta (TGF-Beta) de fatores de crescimento está envolvida na regulação de muitos pro-cessos celulares, incluindo proliferação, migração, apoptose, adesão, diferencia-ção, inflamação, imunossupressão e expressão das proteínas extracelulares. Asuperfamília TGF-Beta inclui: TGF-Beta 1, TGF-Beta 2, TGF-Beta 3, TGF-Beta4, TGF-Beta 5, fatores de diferenciação e crescimento (GDFs 1-16) de proteí-nas morfogenéticas ósseas (BMPs 1-16) e inibidores/ativadores.

Existem três isoformas mamíferas de TGF-Beta, denominadasTGF-Beta 1, 2 e 3. TGF-betas são produzidas por praticamente todos os tipos decélulas (por exemplo, células do tecido conectivo, epitelial, endotelial, hematopoi-ético e neuronal). TGF-betas são secretadas como moléculas precursoras inati-vas latentes 100-kDa (LTGF-Beta). A molécula de LTGF-Beta consiste em: (a)peptídeo de sinal de dímero C-terminal de 25kDa (fragmento ativo) e (b) peptídeoassociado a latente (LAP). LTGF-Beta é ativado pela clivagem de PAL do frag-mento ativo por endopeptidases, tais como, furina, plasmina, trombina e acidifi-cação do espaço pericelular. O fragmento dimérico TGF-Beta ativo liberado éestabilizado por interações hidrofóbicas e por uma ligação dissulfeto de inter-subunidade. Além disso, cada monômero compreende vários filamentos-beta intertravadas por três das quatro ligações intradissulfeto e forma umaestrutura estreita conhecida como "Nódulo de Cisteína".

Proteínas de família TGF-Beta têm sido propostas para um nú-mero de propósitos médicos. Estas incluem a redução de cicatrizes, promoçãoda cicatrização de feridas e a estimulação da substituição de tecidos danifica-dos ou doentes em uma variedade de locais. Esses locais incluem a pele, osso,cartilagem, tecido neural, tecido conectivo (por exemplo, tendões e Iigamen-tos), tecido ocular, fígado e vasos sangüíneos, etc. TGF-Beta 1 e TGF-Beta2, têm sido mostrados para acelerar a cicatrização de ferimentos em mode-los animais experimentais, enquanto a sua inibição reduz a subseqüenteformação da cicatriz. TGF-Beta 3 também significativamente reduz a cicatri-zação tanto em modelos animais quanto em seres humanos e, em 2006,representa um dos membros da superfamília que se encontra mais próximoa obtenção de aprovação legal para uso como um medicamento.

Será apreciado que tais usos clínicos de membros da superfamí-lia TGF-Beta requerem que métodos eficientes para a produção de quanti-dades significativas de fatores de crescimento ativo são disponibilizados.

Os membros da superfamília TGF-Beta têm sido isolados ou produ-zidos por meios recombinantes por um número de anos. A título de exemploTGF-Beta 3 foi originalmente purificado de plaquetas humanas, placenta humanae rim bovino durante a década de 1980. Em vista do potencial terapêutico daTGF-Beta 3, numerosas tentativas têm sido feitas, para produzir esta proteínapor métodos recombinantes. Devido à complexidade de moléculas TGF-Beta bio-logicamente ativas nativas (proteínas homodiméricas com 8 ligações de dissulfe-to intracadeia e uma ligação de dissulfeto intercadeia) elas foram originalmenteexpressadas em organismos eucarióticos (por exemplo, vide EP0200341B1). Noentanto, expressão eucariótica resultou em relativamente níveis baixos de ex-pressão e foi também associada com custos de processo elevados.

Hospedeiros procarióticos foram, então, investigados. No entanto,foi encontrado que hospedeiros microbianos foram incapazes de formar corre-tamente as múltiplas ligações de dissulfeto requeridas para os fatores de cres-cimento para dobrar em uma forma ativa. A proteína dobrada incorretamenteformada como corpos de inclusão insolúveis dentro da célula hospedeira edesses corpos exigia solubilização seguida por renaturação para permitir àsproteínas redobramento em sua conformação biologicamente ativa nativa.

Um número de tentativas tem sido feito para superar os problemasassociados com a formação de fatores de crescimento ativos de hospedeiros pro-carióticos. Por exemplo, US 5.922.846, 5.650.494 e EP-B-0433 225 propõem méto-dos para a renaturação de proteínas da família TGF-Beta de corpos de inclusão.No entanto, nenhum destes métodos fornece métodos eficientes e rápidos para aprodução de fatores de crescimento de grau clínico. Por exemplo, os inventoresdescobriram que muitos dos métodos de redobramento da técnica anterior con-templados nas patentes acima mencionadas são ineficazes. Além disso, os inven-tores descobriram que mesmo a maioria das principais técnicas anteriores preferi-das de condições de redobramento (por exemplo, 0,05M Tris, 1M NDSB-201,20% (v/v) DMSO, 2% (p/v) CHAPS, 1M NaCI, 1% (p/v) GSH, 0,2 mg/mL TGF-Beta 3, pH 9,3 a 2-8°C) pode demorar cerca de 7 dias para redobrar os fatores decrescimento. Este tempo de dobramento representa um atraso inaceitável na fabri-cação de cGMP e poderia resultar em custos operacionais elevados indesejáveisquando grandes quantidades de fator de crescimento ativo são requeridas.

É portanto, um objetivo da presente invenção superar os proble-mas ligados a métodos, da técnica anterior para dobramento ou redobramento,a membros da superfamília do fator de crescimento transformante Beta.

De acordo com um primeiro aspecto da presente invenção é for-necido um método para dobramento de um fator de crescimento transfor-mante Beta ou analógico funcional deste, em uma forma biologicamente ati-va, dimérica compreendendo adição de fator de crescimento monoméricodesdobrado solubilizado a uma solução contendo:

(i) ácido 2-(cicloexilamino)-etanossulfônico ou análogo funcional deste, e

(ii) sistema redox sulfidrila/dissulfeto de baixo peso molecular; e incu-bando o fator de crescimento em uma solução até o fator de crescimentobiologicamente ativo dimérico ser formado.

A presente invenção é baseada em experimentos efetuados pe-los inventores que foram conduzidos em uma tentativa de melhorar métodosde dobramento da técnica anterior.

Os fatores de crescimento transformantes Beta (TGF-Beta) po-dem ser qualquer TGF-Beta (por exemplo, TGF-βΙ, TGF-p2 ou TGF^3). Noentanto, é preferível que o TGF-Beta seja TGF-Beta3 (TGF-P3).Por "análogo funcional deste", entendemos variantes de umTGF-beta que mantém a atividade biológica do fator de crescimento tipo sel-vagem. O análogo funcional é preferencialmente uma proteína e, na formamadura, pode compreender um dímero de dois polipeptídios monoméricosde cerca de 112 aminoácidos de comprimento, embora será apreciado queanálogos funcionais podem ser truncados ou alongados, quando compara-dos ao tipo selvagem. O termo também engloba mutantes de TGF-beta dotipo-selvagem e, particularmente, de TGF-Beta 3 que retém ou até mesmomelhora atividade quando comparada ao tipo selvagem.

Os inventores descobriram que os métodos da invenção são igual-mente aplicáveis a dobramento ou redobramento de tais mutantes.

Será apreciado que "dobramento", como definido na presenteinvenção, engloba "redobramento" de proteínas anteriormente dobradas e,na verdade, este redobramento de proteínas constitui um subconjunto prefe-rido do amplo dobramento englobado pela invenção.

EP O 433 225 contempla uma grande variedade de "condiçõesde redobramento" que são alegadas para permitir um monômero desnatura-do a dimerizar e assumir uma forma biológica ativa. EP O 433 225 descreveque tais condições devem incluir a presença de um "agente solubilizante" eum sistema redóx que permite a oxidação contínua e redução dos pares detiol/dissulfeto. Também contempla uma longa lista de tais agentes solubili-zantes incluindo detergentes; solventes miscíveis em água, orgânicos; e fos-folipídeos ou uma mistura de dois ou mais desses agentes. Exemplos dosdetergentes contemplados no relatório incluem: compostos ativos superfici-ais, tais como, dodecilsulfato de sódio (SDS), Triton ou Tween, detergentesleves não iônicos (por exemplo, digitonin), detergentes leves catiônicos (porexemplo, N-[2,3-(Dioleiloxi)-propil]-N,N,N-trimetilamônio), detergentes levesaniônicos (por exemplo, colato de sódio, deoxicolato de sódio) e onas zwite-riônicas (por exemplo, sulfobetaínas (Zwitergente), 3-(3-clolamidopropil) di-metilamônio-1-propano-sulfonato (Chaps), 3-(3-clolamidopropil) dimetilamô-nio-2-hidróxi-l-propano-sulfonato (Chapso).

Os inventores decidiram testar uma variedade de detergentes,inclusive aqueles contemplados na EP 0 433 225, e foram surpreendidos aodescobrir que a maioria dos detergentes testados foi ineficaz para os mem-bros de dobramento ou redobramento da superfamília TGF-Beta enquantoque aqueles que fizeram trabalho tiveram uma quantidade de tempo inacei-tável para render uma quantidade útil de fator de crescimento ativo. Tabelas1 e 2 do Exemplo ilustram que um número de tais detergentes foi ineficaz.No entanto, para surpresa dos inventores eles descobriram que o uso doácido 2-(cilcoexilamino)-etanossulfônico (CHES) e análogos deste, em com-binação com um sistema redox sulfidrila/dissulfeto de baixo peso molecular,de acordo com o primeiro aspecto da invenção, foi particularmente eficazpara produzir o fator de crescimento dimérico corretamente dobrado.

Os inventores descobriram que o método de acordo com o pri-meiro aspecto da invenção representa uma melhoria significativa sobre osmétodos da técnica anterior. O método resulta em velocidade significativa- mente melhorada do processo comparado a métodos previamente descritosna literatura. Nas modalidades preferidas do método de dobramento da in-venção do fator de crescimento podem ser concluídas dentro de 5 dias, pre-ferencialmente dentro de 3 dias, mais preferencialmente dentro de 2 dias; emais preferencialmente depois de aproximadamente 24 horas após o iníciodo processo de dobramento.

Pelo termo "ácido 2-(cilcoexilamino)-etanossulfônico ou análogosdeste "queremos dizer que o detergente CHES e análogos químicos desteretêm as propriedades de redobramento de CHES.

Análogos adequados de CHES que podem ser utilizados de acordocom os métodos da invenção podem ser definidos pela seguinte fórmula:

<formula>formula see original document page 6</formula>

onde:

R1 e R2 são os mesmos ou diferentes e são selecionados dogrupo consistindo em hidrogênio, grupos alquila C1-4 substituídos ou não-substituídos, grupos cicloalquil C3-8 substituídos ou não-substituídos ou nú-cleos aromáticos substituídos ou não-substituídos, ou R1 e R2 juntos formamum sistema de anel tendo até 10 átomos;

X1 e X2 são independentemente selecionados de -O-, -S-, -S(O)-S(O2)-, -NR3-, -CHR4- e CHR5 onde R3, R4, e R5 são os mesmos ou diferen-tes e são independentemente selecionados do grupo consistindo de hidro-gênio, grupos alquila C„ substituídos ou não substituídos, grupos cicloalqui-la C3.8 substituídos ou não substituídos, ou núcleos aromáticos substituídosou não substituídos ou qualquer dois de R3, R4, e R5 podem juntos formarum sistema de anel tendo até 6 átomos, sujeitados à provisão de que pelomenos um de X1 e X2 é -CHR4-Ou-CHR5-; e

X3 é selecionado de C, S, S = O, ou P-OH.

Se um ou mais de R1* são grupos alquila, então, dependendodo número de átomos de carbono que eles contêm, eles podem ser gruposnormal, secundário, terciário ou iso. Exemplos de grupos alquil adequadospara R1* são grupos Me, Et, n-Pr, i-Pr, n-Bu, sec-Bu e E-Bu.

Se um ou mais de R1* são cicloalifáticos então eles são prefe-rencialmente grupos cicloexila substituídos ou não substituídos, mais prefe-rencialmente não substituídos.

Se um ou mais de R1* são aromáticos, então eles são preferen-cialmente grupos fenila substituídos ou não substituídos.

Preferencialmente R1 é hidrogênio e R2 é cicloexila. Alternativa-mente ou adicionalmente X1 e X2 são preferencialmente -CH2-, alternativa-mente ou adicionalmente X3 é -S = O.

Exemplos preferidos de compostos da fórmula (I) que podem serempregados na invenção são:

<formula>formula see original document page 7</formula>(isto é, um composto de fórmula (i) em que X1 e X2 são ambos -CH2- e X3 é S=O);

<formula>formula see original document page 8</formula>

(isto é, um composto de fórmula (i) em que R1 é hidrogênio, R2 é cicloexila eX3 é S=O); e

<formula>formula see original document page 8</formula>

(isto é, um composto de fórmula (i) em que R1 é hidrogênio, R2 é cicloexila eX1 e X2 são ambos -CH2-).

O exemplo preferido de cada um da fórmula (Ia) (Ib) e (Ic) éCHES, isto é

<formula>formula see original document page 8</formula>

Os inventores têm estabelecido que CHES e o sistema redoxsulfidrila/dissulfeto de baixo peso molecular podem ser utilizados sozinhopara dobrar o fator de crescimento. No entanto, em algumas modalidades dainvenção, os inventores descobriram que CHES também pode ser vantajo-samente combinado com outros agentes que têm detergente/atividade dedobramento. Exemplos desses agentes incluem: taurodeoxicolato, álcoolisopropílico, Arginina-HCI, Sulfobeatina-201 não-detergente e Sulfobeatina-211 não-detergente.

É preferível que a solução compreenda uma concentração decerca de 10 mM a 2.0M de CHES; mais preferivelmente 100mM- 1,0M e maispreferivelmente cerca de 0,7M de CHES.

As concentrações acima mencionadas de CHES podem tambémser utilizadas quando CHES é combinado com outros agentes. Por exemplo,uma combinação preferida de agentes que promovem o redobramento écerca de 30 mM de Taurodeoxicolato e 0,7M de CHES.

Pelo termo "sistema redox sulfidrila/dissulfeto de baixo peso mo-lecular", entendemos sistemas que permitem a formação de ligação dissulfe-to na solução. Sistemas adequados incluem combinações de reagente, talcomo, Glutationa em sua forma oxidada e reduzida, ditiotreitol em sua formaoxidada e reduzida, beta-mercaptoetanol ou beta-mercaptometanol em suaforma oxidada e reduzida, cistina e sua forma reduzida e Cistamina e suaforma reduzida. Estes reagentes podem ser utilizados numa concentraçãode cerca de 1 μΜ a 250 mM, especialmente, cerca de 100 μΜ a 10 mM. Arazão molar de tais sistemas pára as formas oxidadas e reduzidas pode serentre 100:1 e 1:100, especialmente entre 6:1 e 1:6.

É preferível que o sistema redox sulfidrila/dissulfeto de baixo pe-so molecular compreenda o uso de Glutationa em sua forma reduzida (GSH)e oxidada (GSSG). Preferivelmente, a solução contém cerca de 20 μΜ-200mM de Glutationa reduzida, mais preferivelmente 200 μΜ-20 mM de Glutati-ona reduzida, e mais preferivelmente cerca de 2 mM de Glutationa reduzida.A solução pode também conter cerca de 4 μΜ-40 mM de Glutationa oxidada;mais preferivelmente 40 μΜ-4 mM de Glutationa oxidada e mais preferivel-mente cerca de 400 μΜ de Glutationa oxidada.

Por conseguinte, sistema redox sulfidrila/dissulfeto de baixo pe-so molecular preferido pode compreender 200 μΜ-20 mM de Glutationa re-duzida e 40 μΜ-4 mM de Glutationa oxidada. A razão exata de GSH: GSSHdependerá de um número de fatores, incluindo: em que o fator de cresci-mento está sendo dobrado; o pH da solução e o CHES análago empregadono método da invenção. A título de exemplo, o sistema redox sulfidri-la/dissulfeto de baixo peso molecular preferido para o dobramento de TGF-Beta 3 compreende cerca de 2 mM de Glutationa reduzida e ou cerca de 400μΜ ou cerca de 2 mM de Glutationa reduzida.

Como explicado em maiores detalhes abaixo, nas modalidadespreferidas da invenção o sistema redox sulfidrila/dissulfeto de baixo pesomolecular pode ser "envelhecido" antes de ser usado para redobrar o TGF-beta.

Métodos preferidos para dobramento dos fatores de crescimentoenvolvem o uso de CHES em combinação com GSH e GSSG como sistemaredox sulfidrila/dissulfeto de baixo peso molecular. Exemplos de condiçõespreferidas incluem exposição do fator de crescimento desdobrado para:

(a) 0,7M de CHES1 2 mM de GSH e 0,4 mM de GSSG;

(b) 30 mM de Taurodeoxicolato, 0,7M de CHES1 2 mM de GSH e0,4 mM de GSSG; ou

(c) 30 mM de Taurodeoxicolato, 0,7M de CHES, 2 mM de GSH e2 mM de GSSG.

Irá ser apreciado que os agentes acima mencionados podem serdissolvidos em água para fazer uma solução de acordo com a invenção. Noentanto, também será apreciado que os agentes podem ser dissolvidos emuma solução compreendendo um número de outros compostos. Por exem-plo, a solução pode também ainda compreender sais. Sais que podem serutilizados na solução incluem sais de sódio, potássio, e cálcio com cloro,sulfato, fosfato, acetato, etc. É preferível que a solução seja uma solução decloreto de sódio em uma concentração de 0,5 a 2 Μ. A solução pode, porexemplo, ser salina tamponada com fosfato.

Durante suas investigações os inventores também estabelece-ram que as condições de dobramento poderiam ser otimizadas pelo ajusta-mento do pH e da temperatura em que o dobramento é incentivado a pros-seguir.

Temperatura ótima dependia de um número de fatores, tais co-mo, os agentes utilizados, o pH e também a quantidade de fator de cresci-mento a ser redobrado. Sob principais circunstâncias uma temperatura abai-xo de cerca de 15°C é preferida (por exemplo, 2-8°C ou cerca de 10°C). Noentanto temperaturas mais elevadas (por exemplo, temperatura ambiente)também foram eficazes para algumas condições.

Os inventores descobriram que foi geralmente preferível realizaro método da invenção em um pH alcalino. O pH está preferivelmente acimade cerca do pH 8,0, e mais preferivelmente acima de um pH de cerca de pH8,5. Um pH mais preferido para a solução é um pH de cerca de 9,5.

A quantidade do fator de crescimento desdobrado adicionada àsolução foi também encontrada a influenciar a eficiência do dobramento. Emgeral, cerca de 0,005-0,75 mg/mL de um fator de crescimento pode ser adi-cionado à solução; preferencialmente 0,01-0,5 mg/mL; mais preferencial-mente cerca de 0,12-0,25 mg/mL do fator de crescimento; e mais preferenci-almente cerca de 0.25 mg/mL (ou seja, 250 Mg/ml).

Os métodos da invenção podem ser empregados para dobrarqualquer monômero da superfamília do Fator de Crescimento TransformanteBeta em uma forma biologicamente ativa, dimérica. É preferível que o méto-do seja usado para dobrar um TGF-Beta per se (por exemplo, TGF-Beta 1,TGF-Beta 2, ou TGF-Beta 3).

É também preferível que o método seja usado para dobrar pre-cursores monoméricos (em fator de crescimento dimérico ativo) que tenhamsido produzidos em hospedeiros procarióticos que tenham sido transforma-dos para expressar o fator de crescimento. Por exemplo, o método é particu-larmente útil para o dobramento de fatores de crescimento que estão localiza-dos dentro de corpos de inclusão de bactéria que tenha sido transformada emum vetor de expressão codificando um fator de crescimento recombinante.

É mais preferível que os métodos da invenção sejam usadospara dobrar TGF-Beta 3 monomérico que está localizado em um corpo deinclusão de uma bactéria transformada com um vetor de expressão TGF-Beta 3 (por exemplo, como descrito no Exemplo 1, ou como conhecido natécnica). É mais preferido que o TGF-Beta 3 seja TGF-Beta 3 humano, TGF-Beta 3 recombinante humano, ou TGF-Beta 3 humano que contém mutaçõespara otimizar o fator de crescimento para uso clínico em seres humanos.

Exemplos de condições mais preferidas empregadas para dobrar TGF-Beta 3 incluem:(a) 0,7M de ácido 2-(ciclohexilamino)etanossulfônico (CHES)1 2mM de Glutationa reduzida (GSH)1 0,4 mM de Glutationa oxidada (GSSG)10,12 mg/mL de TGF-Beta 3, pH 9,5 a 2-8°C;

(b) 30 mM de taurodeoxicolato, 0,7M de CHES, 2mM de GSH,0,4 mM de GSSG, 0,12 mg/mL de TGF-Beta 3, pH 9,5 a 2-8°C;

(C) 30 mM de taurodeoxicolato, 0,7M de CHES, 2 mM de GSH, 2mM de GSSG, 0,12 mg/mL de TGF-Beta 3, pH 9,5 a 2-8°C; ou

(d) 0,7M de CHES, 1M de NaCI, 2 mM de GSH, 0,4 mM deGSSG, 0,25 mg/mL de TGF Beta 3, pH 9,5 a 2-8°C / temperatura ambiente.

Os inventores desenvolveram os métodos de dobramento deacordo com a invenção em um laboratório (como descrito no Exemplo 1) e,depois, elaboraram para a escala da metodologia, como descrito no Exem-plo 2. Será apreciado que a escala dos métodos representa uma importantecaracterística da invenção. Por isso, de acordo com um segundo aspecto dainvenção é fornecer um método de produção um membro ativo da superfa-mília do Fator de Crescimento Transformante Beta de um hospedeiro proca-riótico, o método compreendendo:

(a) fermentação de organismos procarióticos que tenham sidotransformados para expressar um membro da superfamília do Fator deCrescimento Transformante Beta;

(b) isolamento de corpos de inclusão e recuperação da proteínaexpressada dos corpos de inclusão;

(c) redobramento do membro da superfamília do Fator de Cresci-mento Transformante Beta de acordo com o primeiro aspecto da invenção; e

(d) purificação do membro redobrado da superfamília do Fatorde Crescimento Transformante Beta.

É preferível que etapa (a) envolva a fermentação de bactériasque tenham sido transformadas em um vetor de expressão codificando ummembro da superfamília do Fator de Crescimento Transformante Beta. Ovetor preferivelmente codifica um TGF-beta e mais preferivelmente codificaum TGF-Beta 3 humano ou um análogo funcional deste. Será apreciado quea bactéria transformada pode ser gerada utilizando técnicas de biologia mo-Iecular conhecida do estado da técnica. Um exemplo de tal bactéria é dadono Exemplo 1.

É preferível que os organismos sejam fermentados, de acordocom as técnicas convencionais. Isto pode envolver fermentação de uma pas-ta celular e colher as células por tirar as amostras da fermentação e centrifu-gar a amostra para isolar os organismos.

Etapa (b) do método do segundo aspecto da invenção pode en-volver Iise dos organismos recuperados por centrifugação. Os corpos de in-clusão (IB) podem então ser recuperados por etapas adicionais de centrifu-gação e lavagem. Preferivelmente os IBs são também processados tomandopor etapas para solubilizar as proteínas com IBs e, em seguida, purificá-los.

A proteína (ou seja, o fator de crescimento desdobrado), dos IBsisolados é então submetida aos métodos de dobramento do primeiro aspectoda invenção de acordo com a etapa (c) do método do segundo aspecto dainvenção.

O fator de crescimento redobrado deverá ser então purificado deacordo com a etapa (d). Purificação pode envolver um número de etapas depurificação bioquímicas, tais como, uitrafiltração e cromatografia. Procedi-mentos de purificação preferidos são ilustrados em 1.15, 1.16 e 1.17 do E-xemplo 1. Em uma modalidade preferida o fator de crescimento é primeirofiltrado; também purificado por cromatografia de interação hidrofóbica; e,depois, finalmente purificado por cromatografia de troca catiônica.

Opcionalmente o método do segundo aspecto da invenção podetambém compreender uma etapa (e) em que o fator de crescimento é formu-lado em uma concentração desejada, em uma solução e colocado em fras-cos. Esta solução pode ser a formulação final para uso clínico ou pode serformulada para o armazenamento e/ou transportada. O fator de crescimentopode então ser finalizado para formar o produto final clínico em data posterior.

Os inventores têm reconhecido que W099/18196 descreve ouso de CHES para redobramento de Proteínas Morfogenéticas Ósseas(BMPs). No entanto, as técnicas descreve no W099/18196 não poderiamser consideradas por alguém versado na técnica utilizadas para redobra-mento de TGF-Beta e TGF-Beta3 em particular, de acordo com os métodosdos primeiro ou segundo aspectos da invenção. Um técnico do assunto po-deria chegar a esta conclusão por um número de razões. Estas compreen-dem:

(a) W099/18196 descreve métodos para solubilização de corposde inclusão BMP que usam desnaturantes, tal como, Guanidina-HCI ou poracidificação com um ácido, tal como, ácido acético. Os inventores constata-ram que a acidificação resultou em menos recuperação de TGF-Beta 3 doscorpos de inclusão. Eles descobriram que quando TGF-Beta 3 foi solubiliza-do em ácido e o pH ácido foi, então, titulado a 9,5 (o pH preferido para redo-bramento de acordo com a invenção), que esta mudança de pH ácido paraalcalino resultou na agregação irreversível de TGF-Beta 3 (devido ao TGF-Beta 3 atravessar o seu ponto isoelétrico (pH 6,4)). Isto resultou em rendi-mentos muito baixos de TGF-Beta 3. A Guanidina-HCI foi também examina-da como um agente solubilizante, embora tenha dado recuperações muitoboas de TGF-Beta 3 dos corpos de inclusão e foi também um forte desnatu-rante e impediu o TGF-Beta 3 de redobramento. Assim os inventores encon-traram as etapas de solubilização da técnica anterior inadequada. Experi-mentação estabelecida que solubilização de corpos de inclusão utilizando deUréia a 6M e de DTT a 0,1 M tenha dado boas recuperações de TGF-Beta 3e permitiu o TGF-Beta 3 a redobrar uma vez que foi diluído no tampão deredobramento. Assim sendo, é preferível que TGF-Beta 3 seja solubilizadodos corpos de inclusão usando uréia e DTT.

(b) W099/18196 também declara que o BMP pode ser purificadoutilizando cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) ou cromatografialíquida de alta eficiência de fase reversa (RP-HPLC). Ambos estes métodosseriam impróprios para fabricação em escala comercial de TGF-Beta 3. EmSEC, o volume das amostras influencia a resolução da amostra (menor vo-lume da amostra melhor a resolução de purificação). Métodos de escala co-mercial, de acordo com o segundo aspecto da invenção podem produzir cer-ca de 50L de corpos de inclusão solubilizados. Seria impraticável a utilizaçãode SEC para tais volumes porque processos neste volume em uma únicacorrida exigiriam uma coluna (ou múltiplas colunas) com um volume de ali-mentação único/combinado de 724 L. RP-HPLC é geralmente utilizado comoinstrumento analítico devido ao pequeno volume de coluna e novamente se-ria impraticável a utilização na fabricação em escala comercial de TGF-Beta3, pelas mesmas razões. É preferível que o método do segundo aspecto dainvenção use Filtração de Fluxo Tangencial (TFF), em que dá pureza deTGF-p3 de 70% e acima.

(c) Sabe-se que a pureza de uma proteína expressada afeta osrendimentos de redobramento. Como regra geral, quanto maior for a purezada proteína expressada maior é o rendimento de desdobramento. Os inven-tores descobriram que pureza de TGF-P3 de 70% (de proteína total) e acimadão altos rendimentos de redobramento e que pureza de TGF-P3 baixa(<50% de proteína total) dá baixo rendimento de redobramento. Assim épreferível que TGF-P3 usado em métodos da invenção sejam maiores doque 50% de pureza e mais preferivelmente cerca de 70% de pureza (oumais). Esta pureza pode ser alcançada incluindo etapas de lavagem doscorpos de inclusão e purificação de TGF-Beta 3 solubilizado utilizando TFF(por exemplo, ver Exemplo 2)

(d) TGF-Beta 3 sofre mudanças significativas na conformação(estrutura secundária) e solubilidade em diferentes pHs. Como o pH de umTGF-Beta 3 contendo solução é movido do ácido (<pH 3,8) a pH alcalino(<PH 8,0), agregados aparecem com uma agregação máxima ocorrendo en-tre pH 6,5 e pH 8,5. W099/18196 afirma que o pH preferido para redobra-mento BMPs a ser aproximadamente 8,5. No entanto, este seria inadequadopara o redobramento de TGF-Beta 3 como este causaria o TGF-Beta 3 deagregar-se e, portanto, reduzir significativamente a eficiência e rendimentodo redobramento. Assim sendo, é preferível que os métodos da invençãoutilizem um tampão de redobramento em pH maior do que 8,5, preferivel-mente maior do que pH 9,0 e mais preferivelmente um pH de cerca de 9,5.

(e) Os inventores têm também encontrado que as melhores con-centrações do par Redox (por exemplo, Glutationa reduzida e oxidada) notampão de redobramento podem ser diferentes para BMP e TGF-Beta 3.Concentrações preferidas de Glutationa Reduzida (GSH) e Glutationa Oxi-dada (GSSG) utilizadas na fabricação de TGF-Beta 3, de acordo com a in-venção são 2 mM e 0,4 mM, respectivamente. Além disso, os inventoresconstataram que é mais preferível, uma vez que o par redox seja dissolvidona solução, que o tampão é envelhecido por pelo menos 2 horas, preferen-cialmente pelo menos, 3-5 horas e mais preferencialmente por cerca de 7horas. Os inventores não desejam ser limitados a qualquer hipótese no querefere-se aos benefícios do par redox "envelhecido", eles têm observadoque, em soluções aquosas GSH oxida facilmente para produzir GSSG e empHs fisiológicos a meia-vida de GSH é de aproximadamente 4 h. Além disso,os inventores suspeitam que a meia-vida de GSH em tampão de redobra-mento TGF-Beta preferido (pH 9,5) seria significativamente reduzida (empHs alcalinos haveria menos íons de hidrogênio para protonar grupos tiolatoreativos em GSH para produzir tióis não reativos). Uma estimativa conservado-ra de meia vida de GSH em pH 9,5 seria de 3h. Portanto, após 7 horas de tam-pão de envelhecimento as concentrações do par redox seriam, portanto, cercade 0,5 mM de GSH e 1,15 mM de GSSG. Assim, estas concentrações são asconcentrações preferidas para redobramento de TGF-Beta3. W099/18196 a-firma que a concentração preferida do par redox é para ser 2 mM de GSH e1 mM de GSSG (para dobramento de BMP). Este aumento da concentraçãode GSH iria significativamente prolongar o redobramento de TGF-Beta 3, epode reduzir o rendimento (como GSH quebra as ligações dissulfeto nasproteínas). Além disso, W099/18196 afirma o requerimento de 5 mM deEDTA no tampão de redobramento. A presença de agentes quelantes comoEDTA no tampão de redobramento iria estabilizar o GSH (ou seja, aumentaa meia-vida de GSH) isso também iria aumentar o tempo de redobramentode TGF-Beta 3, e pode reduzir rendimento.

(f) W099/18196 indica a concentração preferida de BMP notampão de redobramento para ser de 1-100 pg/mL, esta é significativamentemenor do que as concentrações dos inventores que foram encontradas paraserem úteis na fabricação de TGF-Beta 3 (otimamente 250 pg/mL ). 250pg/mL de TGF-Beta 3 renderam uma maior eficiência de redobramento doque 100 pg/mL de TGF-Beta 3. Por isso, é preferível que os métodos da in-venção utilizem mais do que 100 pg/mL de TGF-Beta 3 na etapa de redo-bramento e preferencialmente cerca de 250 pg /mL de TGF-Beta 3.

(g) W099/18196 indica a temperatura preferida de redobramentode BMPs para ser de 20°C. Os inventores têm observado que o redobra-mento de TGF-Beta 3 feito à temperatura ambiente (22°C) resulta na agre-gação de TGF-Beta 3, e que redobramento de TGF-Beta 3 deverá ocorrerabaixo de 15°C (de preferência 2-8°C ou cerca de 10°C) para suportar a viade dobramento produtiva de TGF-Beta 3 e a supressão de interação hidrofó-bica.

Um método mais preferido de acordo com o segundo aspecto dainvenção é ilustrado na Figura 10. Detalhes das condições e protocolos ade-quados para utilização no método preferido ilustrado na figura 10 são defini-dos nas figuras 11 a 26. Será apreciado por alguém versado na técnica que,apesar das condições e os protocolos estabelecidos nestas figuras podempreferencialmente ser usados no método ilustrado na Figura 10, podem, sal-vo para onde o contexto exigir outra forma, ser utilizados para realizar qual-quer método de dobramento adequado de acordo com a presente invenção.

A invenção será ilustrada também pelos exemplos e com refe-rência às seguintes figuras, na qual:

Figura 1: é uma fotografia de um gel SDS-PAGE ilustrativo deamostras pós-indução de frascos de agitação referidos em 1.4 do Exemplo 1onde as faixas 1 & 6 são padroões Mark 12 (Invitrogen); e faixas 2-5 sãocarregadas com 3 μΐ_ de clones 1-4, respectivamente (3 h pós-indução);

Figura 2: é uma fotografia de um Western Blot ilustrativo onde aprimeira faixa é um padrão de TGF-Beta 3 não-reduzido e as faixas 2-12correspondem a condições experimentais 2-12 na Tabela 1 do Exemplo 1, edemonstra que a condição 12 foi bem-sucedida na produção corretamentedobrada de TGF-Beta 3 dimérico;

Figura 3: é uma fotografia de um Western Blot ilustrativo de-monstrando o dobramento de TGF-Beta 3 monomérico e dimérico como dis-cutido em 1.14 do Exemplo 1 onde as faixas 1-18 correspondem às condi-ções experimentais 1-18 na tabela 3 do Exemplo 1 após 7 dias de incubação;

Figura 4: é uma fotografia de um Western Blot ilustrativo de-monstrando o dobramento de TGF-Beta 3 monomérico e dimérico como dis-cutido em 1.14 do Exemplo 1 onde as faixas 19-36 correspondem a condi-ções experimentais 19-36 na Tabela 4 do Exemplo 1 após 7 dias de incubação;

Figura 5: é uma fotografia de um Western Blot ilustrativo de-monstrando o dobramento de TGF-Beta 3 monomérico e dimérico para ascondições de redobramento preferidas de acordo com a invenção como dis-cutido em 1.14 do Exemplo 1 onde a faixa 1 representa o redobramento nodia 0; faixa 2 representa o dobramento depois de 1 dia; faixa 3 representaredobramento após 2 dias; a faixa 4 representa o redobramento após 3 diase a faixa 5 é um padrão de TGF-Beta 3 não-reduzido;

Figura 6: é uma fotografia de um Western Blot ilustrativo de-monstrando o dobramento de TGF-Beta 3 monomérico e dimérico utilizandotécnica de redobramento do estado da técnica como discutido em 1.14 doExemplo 1 onde a faixa 1 representa o redobramento depois de 1 dia; faixa 2representa redobramento após 2 dias; faixa 3 representa redobramento após3 dias; e a faixa 5 representa redobramento após 7 dias de tratamento;

Figura 7: representa cromatogramas ilustrando a quantidade deTGF-Beta 3 dimérico produzido por condição de redobramento mais preferi-da de acordo com a invenção como discutido em 1.14 do Exemplo 1 depoisde purificação por HPLC de troca catiônica de amostras de TGF-Beta 3 re-dobradas (a) no dia O, (b) depois de 1 dia e (c) após 2 dias;

Figura 8: representa um cromatograma ilustrando a quantidadede TGF-Beta 3 monomérico e dimérico produzida pela condição de redo-bramento mais preferida de acordo com a invenção como discutido em 1.15do Exemplo 1 depois da purificação pela ultrafiltração e cromatografia deinteração hidrofóbica em um coluna Butil-Sefarose;

Figura 9: representa um cromatograma ilustrando a quantidadede TGF-Beta 3 dimérico produzido por uma condição de redobramento maispreferida de acordo com a invenção como discutido em 1.16 do Exemplo 1após purificação por cromatografia de troca catiônica em uma coluna SP-Sefarose;

Figura 10: é um diagrama de fluxo esquemático ilustrando ummétodo preferido de acordo com o segundo aspecto da invenção, em que:(A) representa a fermentação e etapa de recuperação dos Corpos dê Inclu-são (IB); (B) representa a solubilização do IB e etapa de purificação; (C) re-presenta uma etapa de redobramento de acordo com o primeiro aspecto dainvenção; (D) representa uma etapa de purificação, e (E) representa umaetapa para a formulação e arquivo do produto de fármaco.

Figura 11: ilustra condições e protocolos preferidos para a fer-mentação adequada para uso em métodos da invenção, tal como estabele-cido na Figura 10(A) (i);

Figura 12: ilustra condições e protocolos preferidos para a co-lheita e centrifugação adequada para uso em métodos da invenção tal comoestabelecido na Figura 10 (A) (ii);

Figura 13: ilustra condições e protocolos preferidos para a Iisecelular e recuperação adequada de IB para uso nos métodos da invenção talcomo estabelecido na Figura 10 (A) (iii);

Figura 14: ilustra condições e protocolos preferidos para solubili-zação de corpos de inclusão adequada para uso em métodos da invençãotal como estabelecido na Figura 10(B) (i);

Figura 15: ilustra condições e protocolos preferidos para: (A) pu-rificação da preparação da membrana (Figura 10(B) (ii)) e (B) preparação damembrana UF/ DF pré-redobrada adequada (Figura 10(B) (iii)) para uso nosmétodos da invenção;

Figura 16: ilustra duas condições e protocolos preferidos (A e B)para purificação de corpos de inclusão adequada para uso em métodos dainvenção tal como estabelecido na Figura 10(B) (ii);

Figura 17: ilustra duas condições e protocolos preferidos (A e B)para pré-redobramento UF/DF adequado para uso em métodos da invençãotal como estabelecido na Figura 10(B) (iii);Figura 18: ilustra duas condições e protocolos preferidos (A e B)para a proteína de redobramento adequada para uso em métodos da inven-ção tal como estabelecido na Figura 10 (C) (i);

Figura 19: ilustra condições e protocolos preferidos para prepa-ração da membrana de ultrafiltração de pós-redobramento adequada parauso em métodos da invenção tal como a estabelecido na Figura 10(D) (i);

Figura 20: ilustra duas condições e protocolos preferidos (A e B)para a ultrafiltração de pós-redobramento e preparação de carga butila ade-quada para uso em métodos da invenção tal como estabelecido na Figura10(D)(i);

Figura 21: ilustra duas condições e protocolos preferidos (A e B)para embalar resina de fluxo rápido 4 Butil Sefarose adequada para uso emmétodos da invenção tal como estabelecido na Figura 10(D) (ii);

Figura 22: ilustra duas condições e protocolos preferidos (A e B)para a utilização de resina de fíuxo rápido 4 Butil Sefarose de uma maneiraadequada para uso em métodos da invenção tal como estabelecido na Figu-ra 10(D) (ii);

Figura 23: ilustra duas condições e protocolos preferidos (A e B)para a limpeza e regeneração de resina de fluxo rápido 4 Butil Sefarose a-pós a sua utilização em métodos da invenção tal como estabelecido na Figu-ra 10(D)(N)1

Figura 24: ilustra condições e protocolos preferidos para limpezade resina de fluxo rápido SP Sefarose antes do uso em métodos da inven-ção tal como estabelecido na Figura 10(D) (iii);

Figura 25: ilustra condições e protocolos preferidos para emba-lagem de resina de fluxo rápido SP Sefarose adequada para uso em méto-dos da invenção tal como estabelecido na Figura 10(D) (iii);

Figura 26: ilustra duas condições e protocolos preferidos (A e B)para utilização de resina de fluxo rápido SP Sefarose de uma maneira ade-quada para uso em métodos da invenção tal como estabelecido na Figura10(D) (iii);

Figura 27: ilustra condições e protocolos preferidos para limpezade resina de fluxo rápido SP Sefarose (A) após o uso, e (B) pré-uso/ regene-ração, tal como, definido na Figura 10(D) (iii);

Figura 28: ilustra duas condições e protocolos preferidos (A e B)para preparação de membrana final UF/DF adequada para uso em métodosda invenção tal como estabelecido na Figura 10(E) (i), e

Figura 29: ilustra duas condições e protocolos preferidos (A e B)para UF/DF de solução TGF-33 purificada de eluição SP Sefarose e enchi-mento final, que são adequados para uso em métodos da invenção tal comoestabelecido na Figura 10(E) (i).

EXEMPLO 1

Os inventores investigaram se os métodos aperfeiçoados de re-dobramento de membros da superfamília TGF-Beta poderiam ser ou nãoestabelecidos. O exemplo a seguir é ilustrativo da aplicação dos métodos dainvenção para o redobramento de TGF-Beta 3.

Primeiro, um estudo foi estabelecido à primeira classificação dosreagentes de redobramento (vide 1.13). Os reagentes que foram encontra-dos para ajudar no redobramento em uma classificação primária foram entãotidos como descritos aqui em frente, para uma maior otimização para maxi-mizar o rendimento e reduzir prazos de redobramento (ver 1.14). Finalmente,os métodos de purificação do fator de crescimento de redobramento foraminvestigados (1.15-1.17).

Métodos empregados para testar a atividade biológica do TGF-Beta 3 são descritos em 1.18.

Estes estudos levam os inventores a considerar que melhoresmétodos de membros de dobramento da superfamília TGF-beta em umaforma ativa podem ser estabelecidos pelo seguinte método definido peloprimeiro aspecto da invenção.

EXPERIMENTAL

1.1 Seqüência nucleotídica

A codificação da seqüência nucleotídica pelo fragmento ativoTGF-Beta 3 é como se segue:AAA GTGTGT AGC

GAG AACGAT CTGGCC AACGAC ACAAAC CCTCTG GAG

(SEQ XD Mo. 2)

1.1 Geração de cDNA

RNA total de uma ferida incisional humana (recebida 5 dias pós-ferimento) foi tratado com DNA-Free (Ambion) para remover quaisquer con-taminação de DNA. Utilizando RNA total como um modelo, cDNA de TGF-Beta3 foi gerado por Reação em Cadeia de Polimerase-Transcriptase Re-versa (RT-PCR). O mix principal de RT-PCR foi preparado de Brilliant®QRT-PCR Core Reagente Kit, 1-Etapa (Stratagene). Um micrograma deRNA foi adicionado a 50 μΙ_ de uma solução contendo: Um tampão de etapaQRT-PCR, dNTPs a 0,2 mM, MgCI2 a 3,5 mM, 1 μΙ_ de transcriptase reversaStrataScript, Taq Polymerse 2,5 unidades, 0,4 μΜ de iniciador de sentido (5'GAT ATA CCA TGG CTT TGG ACA CCA ATT ACT ACT GC 3') (SEQ ID Ns2), 0,4 μΜ de iniciador de sentido (5'-CAG CCG GAT CCG GTC GAC TCAGCT ACA TTT ACA AGA C 3') (ID SEQ No. 3). A reação foi-colocada emum ciclo térmico (Hybaid PCR Express) e executada sob as seguintes condi-ções: 30 min a 45°C, 10 min a 95°C, em seguida, 40 ciclos de 95°C durante30 segundos, 65°C por 1 min e 72°C durante 1 min. Etapa final de 72°C du-rante 10 min. Amostras de PCR foram corridas em 2% (p/p) de gel de agaro-se para verificar o tamanho da banda e purificadas utilizando Wizard PCRPrep Kit (Promega).

1.2 Clonagem do Vetor e Transformação de Célula Hospedeira

O vetor pET-24d é derivado do vetor pBR322 e contém um pro-motor T7 sob controle LacUVS e um gene marcador resistente à canamici-na.

Os fragmentos de cDNA de TGF-Beta 3 (gerado na Seção 1.1)foram digeridos com 0,75 μΙ_ de Ncol (New England Biolabs) e 0,75 μί deBamH 1 (New England Biolabs) com 1 X tampão BamHl (New England Bio-labs), em 15 pL de reação (Nuclease Free Water, Novagen) a 37°C durante4 horas. Um microlitro do plasmídeo pET-24d (Novagen) foi digerido damesma forma. O cDNA digerido e o fragmento plasmídeo grande foram puri-ficados em gel de agarose e recuperados utilizando o kit de Gel de extraçãode DNA SpinPrep (Novagen).

O cDNA purificado e os fragmentos de plasmídeo foram ligadosusando kit T4 Iigase (Novagen). O cDNA ligado/plasmídeo foi transformadoem HMS174 (DE3) (Novagen HMS174 (DE3) transformation kit). Os trans-formantes foram selecionados por plaqueamento com placas ágar de caldoLuria (LB) contendo 50 pg/mL de canamicina (Invitrogen). Três clones foramselecionados para a restrição digestiva e/ou expressão.

1.3 Seleção dos Clones para Produto de Expressão

Clones foram cultivados em culturas de frascos de agitação demeia resistência "Terrific Broth" (6 g/L de fitona peptona (Becton Dickinson),12 g/L de extrato de levedura (Becton Dickinson), 2 g/L de glicerol (JT Ba-ker), 1,16 g/L de fosfato de potássio monobásico (JT Baker), 6,25 g/L de fos-fato de potássio dibásico (JT Baker), QS a 1 litro com água destilada) e in-duzidos em fase exponencial em OD600 entre 0,65 e 0,85 com 1mM de beta-D-tiogalactopiranosídeo isopropílico (IPTG). Amostras pós-indução foramcolhidas 3 horas após a adição de IPTG e analisadas por eletroforese em gelde poliacrilamida de dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE) para expressão eindução do produto. Clones 1-4 de alíquotas de amostras pré/pós-indução eMark 12 padrões de peso molecular (Invitogen-peso molecular em torno de2,5-200 kDa) foram executados em 12% NuPAGE ® Novex Bis-Tris Gel, 1,0mm (Invitrogen) por aproximadamente 40-50 minutos em 120milliAmper e200 volts e, depois, corados com Coomassie Blue. Uma proteína cujo tama-nho está entre 6 e 14,4 kDa (ou seja, monômero de TGF-Beta 3) é clara-mente induzida em cada uma dessas culturas (ver figura 1) com 2 Clonesexpressando a maior quantidade de proteína TGF-Beta 3.

1.4 Armazenamento de Células Congeladas

1 -4 clones foram cultivados em frascos de agitação de meia re-sistência Terrific Broth a um OD600 de aproximadamente 1 e armazenadoscomo estoques de glicerol através da adição de glicerol a 20% (v/v). 1,2 mLde caldo foi aliquotado em frascos de congelamento de 12 χ 2 mL (em quecontinha 0,3 ml de glicerol) e em seguida armazenado a -70°C.

1.5 Confirmação da Seqüência do Gene TGF-Beta 3

Amostras de culturas usadas para o congelamento de estoquede células foram antes da adição de glicerol e utilizadas para isolamento doplasmídeo usando um Kit Qiagen MiniPrep. O plasmídeo isolado foi seqüen-ciado e verificado utilizando um iniciador promotor 17 (5'-TAA TAC GACTCA CTA TAG GG-3') (SEQ ID No. 4) e um iniciador terminador T7 (5'-GCTAGT TAT TGC TCA GCG G-3') (SEQ ID No. 5).

1.6 Cultura Semeada

Como Clone 2 expressou a maior quantidade da proteína TGF-Beta 3 uma ampola do estoque congelado (da Secção 1.4), foi recuperada einoculada dentro de um frasco Erlenmeyer de 2 litros, contendo 500 mL demeio HySoy (12 g/L de Hy-Soja (Quest International ), 24 g/L de extrato delevedura (Becton Dickinson), 10 g/L de NaCI (Sigma) e 10 g/L de glicerol(Sigma) e 50 pg /mL de canamicina. O balão foi incubado com agitação a37°C e 200 rpm e amostra periodicamente medida a OD550. Quando o OD dacultura atingiu 3,21 U/mL (após 7 horas) o caldo celular foi usado para se-mear um fermentador de 150L (100 L de volume de trabalho).

1.7 Fermentação

Novecentos mililitros de caldo celular (da Secção 1.6) foram u-sados para inocular um fermentador de 150 L (WHE), contendo 90 L de Meiode Cultura de Batelada (0,6 g/L de K2HPO4, 0,4 g/L de KH2HPO4, 1,25 g/Lde NH4SO4, 12 g/L de Hy-Soja, 24 g/L de extrato de levedura e 10 g/L deglicerol). Os parâmetros de operação da fermentação foram controlados co-mo a seguir: ponto de temperatura estabelecida, 37°C; ponto de pH estabe-lecido, 7,0 (mantido usando hidróxido de amônio a 4N e ácido fosfórico 4N),e; oxigênio dissolvido (DO), inicialmente calibrado para 100%. A pressão norecipiente foi de 48,3 KPa (7 psi), e a agitação e fluxo de ar foram 200-400rpm com um volume de ar por volume de meio por minuto (wm ou slpm),respectivamente. DO foi mantido acima de 20% pelo ajuste dos pontos deparâmetros estabelecidos para fermentação pela seguinte prioridade: Agita-ção (máximo de 400 rpm), aeração (máximo de 1,5 vvm), suplementação deoxigênio (máximo de 33,3 lpm) e contrapressão (máximo de 82,8 KPa (12psi)). Espuma foi controlada com Pluronic L-61 (25% v/v). Quando o OD dacultura atingiu um 10U/mL uma alimentação de glicerol (50% v/v) foi iniciadaem uma vazão de 45 mL/mim. Quando OD atingiu 40 U/mL, as células foraminduzidas com a adição de IPTG a 0,2 mM de concentração final.

1.8 Colheita

Após 4 horas após a indução, o fermentador foi refrigerado a10°C e fluxo de ar e agitação foram reduzidos para 0,3 vvm e 100 rpm, res-pectivamente. O controle da espuma e pH foi encerrado e a contrapressãofoi ajustada para 20,7 KPa (3 psi). A cultura foi colhida pela centrifugaçãocontínua com uma centrífuga contínua Westfalia CSA 8 a 10°C. A centrifu-gação foi operada a 15.000 rprri e a razão do fluxo de 3 litros por minuto epastas fluidas celulares recolhidas.

1.9 Lise Celular e Recuperação IB

Ά fermentação da pasta celular (da Secção 1.8) foi diluída 1:5com tampão de Iise (6,1 g/L TrizmaBase (Tris), 3,7 g/L de Ácido etilenodia-minotetracético (EDTA), 58,44 g/L de NaCI e 10 g/L de Triton X-100, PH8,0) e ressuspendida utilizando um homogenizador manual. A ressuspensãoda pasta celular foi colocada por duas vezes em um homogenizador de altapressão (parâmetros: pressão, 68,94 MPa (10.000 psig); vazão, 450 mUmin;e temperatura de 15°C). O Iisado celular homogeneizado foi, então, centrifu-gado (centrífuga bucket, rotor de ângulo fixo) a 5.000 xg por 20 minutos a4°C. O sobrenadante foi descartado deixando TGF-Beta 3 insolúvel (corposde inclusão). O pélete de corpo de inclusão (IB) foi ressuspendido em tam-pão Wash (6.1 g/L Tris e 3,72 g/L de EDTA, pH 8.0), utilizando um homoge-nizador manual e centrifugado (5000 χ g durante 20 minutos a 4°C).

1.10 Solubilizacão do Coroo de inclusão.

O sedimento da Seção 1.9 foi diluído a 1:10 com tampão de so-lubilização (6,1 g/L Tris, 15,4 g/L de DL-ditiotreitol (DTT) e 360,4 g/L de uréi-a, pH 8,0) e ressuspendido utilizando um homogenizador manual. A suspen-são foi coberta e deixada agitar por 60-75 minutos, à temperatura ambientepara solubilizar os corpos de inclusão e reduzir TGF-Beta 3 a sua forma mo-nomérica. O pH do pélete ressuspendido foi ajustado para pH 9,4-9,6 comNaOH/ácido acético antes de incubação de uma segundo tempo por 60-75minutos.

1.11 Clarificacão/Ultrafiltracão e Diafiltracão.

Material solubilizado da Seção 1.10 foi clarificado, concentrado efiltrado-dia em um sistema (MiIIipore) de Filtração de fluxo Tangencial (TFF).Clarificação e concentração iniciais foram alcançadas com uma clarificaçãopré-condicionada de membrana TFF (Millipore Pellicon 1000 kDa, celuloseregenerada, tela V). O TGF-Beta 3 clarificado foi coletado no permeado.Permutando por uma membrana de Ultrafiltração/Diafiltração (UF/DF) (Milli-pore Pellicon 5 kDa, celulose regenerada, tela C), o TGF-Beta 3 foi entãolavado em 6 diavolumes de tampão de solubilização (6,1 g/L Tris, 15,4g/LDTT e 360,4 g/L de uréia, pH 9,5).

1.12 Matriz 1 de Seleção de redòbramento1.12.1 Metodologia

Conteúdo de proteína TGF-Beta 3 no material clarificado daSecção 1.11 foi quantificado utilizando o Ensaio de Proteína RC DC™ (Bio-Rad), em conjunção com SDS-PAGE, coloração com Coomassie Blue edensitometria. O material TGF-Beta 3 foi diluído dentro de uma série detampões de redobramento (ver tabelas 1 e 2). Amostras de 1 ml foram to-madas diariamente sob um cronograma de 6-dias e analisadas sob condi-ções de não-redução utilizando SDS-PAGE. Alíquotas da amostra e Mark 12de padrões de peso molecular (Invitogen-peso molecular de intervalo de 2,5-200 kDa) foram executados em 12% de Bis-Tris Géis NuPAGE® Novex, 1,0mm (Invitrogen) por cerca de 40-50 minutos a 120 miliAmper e 200 volts. Asamostras de proteína foram, então, eletroforeticamente transferidas para amembrana de nitrocelulose (Invitrogen) usando um aparelho Novex Blotting(Invitrogen). A membrana foi bloqueada com 5% (p/v) de leite desnatado empó, 1% (v/v) de monolaurato de polioxietilenossorbitano (Tween 20; Sigma)em solução salina tamponada com fosfato (PBS). A membrana foi lavada(PBS, 0,1% (v/v) Tween 20) e incubada durante 1 hora em anticorpo primá-rio (Anti-TGF-Beta 3, MAB643 (Sistemas R & D) diluída 1:500 em PBS e 0,1(v/v) Tween 20). Após a incubação com o anticorpo primário, a nitrocelulosefoi lavada em tampão de lavagem (PBS, 1% (v/v) Tween 20). A nitrocelulosefoi então incubada por mais 1 hora em anticorpo secundário (1gG de cabraanti-rato conjugada com fosfatase alcalina (Abcam P0397) diluída em1:2000 com PBS, 0,1% (v/v) Tween 20). A membrana foi novamente lavada(PBS, 1% (v/v) Tween 20 antes de desenvolvimento com substrato estabili-zador Western Blue para fosfatase alcalina (Promega).

O anticorpo MAB 643 detecta corretamente 3 espécies de TGF-Beta 3 monoméricas e diméricas redobradas.

1.12.2 Resultados

Tabelas 1 e 2 resumem os resultados obtidos dos testes de re-dobramento do TGF-Beta 3 sob 50 condições experimentais diferentes.

Os inventores estabeleceram que as condições descritas abaixo(ou seja, as condições experimentais 12, 19 e 44) produziram corretamenteTGF-Beta 3 dimérico redobrado:

1. ácido 2-(cilcohexilamina)etanossulfônico a 0,7M (CHES), glu-tationa reduzida a 2 mM (GSH), Glutationa oxidizada a 0,4 mM (GSSG)1 0,12mg/mL de TGF-Beta 3, pH 9,5 a 2-8°C (Condição experimental 12).

2. Taurodeoxicolato a 30 mM, CHES a 0,7M, GSH a 2 mM,GSSG a 0,4 mM, 0,12 mg/mL de TGF-Beta 3, pH 9,5 a 2-8°C (Condição ex-perimental 19).

3. Taurodeoxicolato a 30 mM, CHES a 0,7M, GSH a 2 mM,GSSG a 2 mM, 0,12 mg/mL de TGF-Beta 3, pH 9,5 a 2-8°C (Condição expe-rimental 44).

A título de exemplo a Figura 2 ilustra a eficácia da Condição Ex-perimental 12.<table>table see original document page 28</column></row><table><table>table see original document page 29</column></row><table><table>table see original document page 30</column></row><table><table>table see original document page 31</column></row><table>1.13 Otimização do Redobramento

As condições de Experimento 12 (CHES a 0,7M, GSH a 2mM, GSSG a0.4MM, 0,12mg/mL de TGF-Beta 3 em pH 9,5 a 2-8°C) resultou em TGF Be-ta 3 particularmente bem dobrado. Estas condições foram, portanto, selecio-nadas para uma maior otimização.

Os parâmetros investigados foram:

• Concentração de TGF-Beta 3 (0,lmg/mL, 0,25mg/mL e 0,5mg/mL)

• pH (8,0, 9,0 e 9,5)

• Temperatura (2-8°C e temperatura ambiente)

• Adição de NaCI a 1M

O material TGF-Beta 3 da Seção 1.12 foi diluído em uma sériede condições de redobramento (ver Tabelas 3 e 4). Amostras de 1 ml foramcolhidas diariamente ao longo de um período de 6 dias. As amostras do dia6 foram analisadas sob condições de não-redução utilizando SDS-PAGE e"Western blotted" (ver Seção 1.13 para metodologia). Monômero de TGF-Beta 3 redobrado corretamente foi detectado por Western Blot em todas ascondições de redobramento. Dímero de TGF-Beta 3 redobrado corretamentefoi detectado por Western Blot em todos os experimentos contendo NaCI a1,0 M (ver figuras 3 e 4).

As condições sob as quais a maior quantidade de TGF-Beta 3 foiredobrada em seu estado dimérico foi condição experimental 34 (CHES a0,7M, NaCI a 1M, GSH a 2mM, 0, GSSG a 4MM, 0,25mg/mL de TGF-Beta 3,pH 9,5 a 2-8°C/temperatura ambiente).

Amostras dos dias 0, 1, 2 e 3 da condição experimental 34 foramexecutados em SDS-PAGE de não-redução e Western blot para determinaros instantes em que o TGF-Beta 3 dobrado corretamente foi produzido. Co-mo mostrado na Figura 5, o material de partida inicial e amostra do dia 1continha pequenas quantidades de TGF-Beta 3 monoméricos e diméricosdobrados corretamente, há um aumento significativo da quantidade de TGF-Beta 3 dobrado corretamente pelos dias 2 e 3 de redobramento.

A figura 6 ilustra um redobramento alcançado pelas condiçõesde redobramento do estado da técnica contempladas nas patentes US5.922.846, US 5.650.494 .e EP 0 433 225 (0,05M de Trisl 1Μ de NDSB-201,20% (v/v) de DMSO, 2% (p/v) de CHAPS1 1M de NaCI1 1% (p/v) de GSH10,2mg/mL de TGF-Beta 3, pH 9,3 a 2-8 °C). Pode-se perceber que a quanti-dade de TGF-Beta 3 redobrado continua a aumentar após 7 dias de trata-mento (faixas em contraste 4 e 5 da Figura 6) enquanto que, em contraparti-da, o fator de crescimento foi totalmente dobrado após 2 dias de tratamentoquando métodos de acordo a invenção são empregados (compare faixas 3 e4 da Figura 5).

O redobramento de TGF-Beta 3 na condição experimental 34 foitambém monitorado usando troca catiônica (CEX) HPLC. Uma coluna HPLCde polissulfoetil-A (200 χ 4,6 mm, 5 pm, 1000A da PoIiLC Inc.) foi equilibradacom fase móvel A (10% (v/v) em ácido acético, 30% (v/v) de álcool isopropí-lico). Amostras redobradas foram acidificadas pela mistura de 1:1 com 20%de ácido acético e 60 % de álcool isopropílico. 100 pL de amostra redobradaacidificada foram carregados na coluna numa vazão de 0,5 mL/min (estavazão foi usada durante o processo). A coluna foi lavada com uma fase mó-vel A por 5 minutos. Um gradiente linear foi executado durante 10 minutosfinalizando com uma mistura de 60% de fase móvel A e 40% de fase móvelB (10% (v/v) de ácido acético, 30% (v/v) de álcool isopropílico e 1M de Na-Cl). A aplicação deste tampão foi realizada por mais 5 minutos. Um segundogradiente linear foi aplicado durante 10 minutos, finalizando com 100% defase móvel B e mantido por 5 minutos. A figura 7 mostra que, no Dia 0, exis-tiam pequenas quantidades de TGF-Beta 3 dimérico redobrado corretamente(vide 7 (a)), enquanto que, no dia 1s, há aumento significativo na concentra-ção da proteína TGF-Beta 3 dobrada corretamente (ver 7 ( b)). A concentra-ção de TGF-Beta 3 dimérico no dia 2 é similar à do dia 1, indicando que oredobramento está completo após 24 horas (vide 7 (c)). A finalização do re-dobramento após 24 horas é significativamente mais rápida do que os méto-dos do estado da técnica (ver figura 6).<table>table see original document page 34</column></row><table><table>table see original document page 35</column></row><table><table>table see original document page 36</column></row><table>As seções 1.14-1.16 descrevem experimentos conduzidos paraestabelecer como TGF-Beta 3 redobrado de acordo com o primeiro aspectoda invenção pode ser purificado.

1.14 Ultrafiltracão/Cromatoarafia de Interação Hidrofóbica.

A solução de redobramento de CHES identificada como condi-ção experimental 34 da Seção 1.13 foi concentrada 5 vezes por ultrafiltração(a membrana foi uma folha plana Millipore Pellicon 5kDa, 0,1 m2, celuloseregenerada, tela). O pH do material redobrado concentrado foi então ajusta-do para um pH de 2,5-2,8 usando ácido acético glacial antes de ser diluído a1:1 em tampão de diluição (2,72g/L de acetato de sódio, 264,28g/L de sulfa-to de amônio, 100 g/L de ácido acético e 210,7g/L de hidrocloreto de argini-na pH 3,3). Uma coluna de fluxo rápido butil sefarose 4 (Amersham, 16 cmde altura de leito) foi equilibrada com quatro volumes de coluna de TampãoA (2,72g/L de acetato de sódio, 132,14g/L de sulfato de amônio e 100 g/l emácido acético pH 3.3). O material redobrado foi filtrado através de membrana0,22 μΜ (filtro Millipore Millipak) antes de ser carregado na coluna de butilsefarose a uma faixa de fluxo de 100cm/h (vazão esta utilizada durante todoo processo). A coluna foi então lavada em Tampão A por volume de quatrocolunas. As proteínas TGF-Beta 3 foram eluídas da coluna usando TampãoB (2,72g/L de acetato de sódio, 100 g/L de ácido acético e 300g/L de etanolpH 3,3). O primeiro pico, que contém proteínas TGF-Beta 3 tanto sob a for-ma monomérica quanto sob a forma dimérica foi agrupado (ver Figura 8).1.15 Cromatoarafia por Troca Catiônica

Foi utilizada cromatografia de troca catiônica para isolar proteí-nas diméricas TGF-Beta 3 das proteínas monoméricas. As frações agrupa-das de TGF-Beta 3 da Seção 1.14 foram diluídas 5 vezes em tampão de di-luição de Carga SP (2,72g/L de acetato de sódio, 100 g/L de ácido acético,300g/L de etanol pH 4.0). Uma coluna de fluxo rápido SP de sefarose (A-mersham) foi equilibrada com 4 volumes de coluna de Tampão A (2,72g/L deacetato de sódio, 100 g/L de ácido acético, 300g/L de etanol e 1,46g/L decloreto de sódio pH 4.0). O material diluído de TGF Beta 3 foi carregado emcoluna SP de sefarose a uma vazão de 169cm/hr (vazão esta utilizada du-rante todo o processo). A coluna foi então lavada em Tampão B (2,72g/L deacetato de sódio, 100 g/L de ácido acético, 300g/L de etanol e 2,92g/L decloreto de sódio pH 4,0) para volume de quatro colunas. As proteínas TGF-Beta 3 foram eluídas da coluna usando Tampão C (2,72g/L de acetato desódio, 100 g/L de ácido acético, 300g/L de etanol e 11,69g/L de cloreto desódio pH 4.0). O primeiro pico eluído é TGF-Beta 3 monomérico, seguido doTGF-Beta 3 dimérico. As frações contendo o TGF-Beta 3 dimérico foram a-grupadas (ver Figura 9).

1.16 Ultrafiltracão / Diafiltracão

As frações contendo moléculas de TGF-Beta 3 dimérico purifica-do da Seção 1.15 sofreram ultrafiltração/diafiltração para trocar o tampãopara 20mM de ácido acético, 20% (v/v) de etanol e concentrar a amostrapara ~10mg/mL (concentração de TGF-Beta 3 determinada por espectrome-tria de UV).

1.17 Ensaio de Atividade Biológica

O ensaio de inibição do crescimento celular (A Meager, 1991 -Journal of Immunological Methods; 141; páginas 1 a 14) foi usado como umteste de atividade biológica in vitro para moléculas de TGF Beta. O ensaiocolorimétrico é baseado no efeito inibitório de moléculas de TGF Beta nocrescimento das células epiteliais do pulmão de vison (MLEC). 50pL de Meiode diluição (Meio Essencial mínimo com Glutamax I (Invitrogen) e 0,1% (p/v)de albumina sérica bovina (Sigma)) foram adicionados a cada cavidade deuma placa de 96 cavidades. 50 pL serialmente diluídos (5000pg/mL a9,75pg/mL), de referência padrão de TGF-Beta 3 (National Institute of Biolo-gical Standards and Controls), 50 pL serialmente diluídos (5000pg/mL a9,75pg/mL), de TGF-Beta 3 (produzidos por métodos divulgados nas paten-tes: US. 5.922.846, US 5.650.494 e EP-B-0433 225) e 50pL serialmente dilu-ídos (5000pg/mL a 9,75pg/mL), proteína de TGF-Beta 3 (fator CHES decrescimento redobrado purificado de acordo com a Seção 1.17) foram adi-cionados à(s) placa (s). 50pL de suspensão celular contendo: 1 x105 de célu-las MLEC/mL em Meio Completo (Meio Essencial Mínimo com Glutamax I(Invitrogen), 0,1% (p/v) de albumina sérica bovina (Sigma) e 10% (v/v) desoro de bovino fetal (Invitrogen) foram adicionados a cada poço.

A(s) placa (s) foi(foram) incubada(s) por 72 horas a 37°C em 5%de CO2. Os conteúdos de cada poço foram aspirados e lavados três vezescom 200 pL de solução salina de fosfato tamponada (Invitrogen). IOOpL desolução de substrato (acetato de sódio a 1M, substrato de fosfatase 104(Sigma) e 1% (v/v) de Triton X-100 (Sigma)) foram adicionados a cada poçoe incubados a 37°C. Após 2 horas a reação foi interrompida utilizando hidró-xido de sódio a 1N. A(s) placa (s) foi(foram) lida(s) usando um leitor multica-nal a 405nm e um filtro de referência a 492m.

Os valores IC50 de referência-padrão de TGF-Beta 3 (NIBSC) eTGF-Beta 3 (produzidos por métodos descritos nas patentes: US. 5.922.846,US 5.650.494 e EP-B-0433 225) foram 242,33pg/mL e 90pg/mL, respecti-vamente, similares aos padrões analisados previamente. Verificou-se que omaterial redobrado de acordo com a invenção apresentava um IC50 de85,573pg/mL, o que indica que o TGF-Beta 3 redobrado de acordo com ainvenção tem pelo menos uma potência equivalente (atividade biológica)para o TGF-Beta 3 produzido pelos métodos da técnica anterior.

CONCLUSÕES

Da matriz de seleção de redobramento das condições descritasnas tabelas 1 e 2, três condições produziram TGF-Beta 3 dimérico redobra-do corretamente:

1. ácido 2-(ciclohexilamino) etanossulfônico a 0,7 M (CHES),glutationa reduzida a 2 mM (GSH), glutationa oxidada a 0,4 mM (GSSG),0,12 mg/mL de TGF-Beta 3, pH 9,5 a 2-8 sC.

2. taurodeoxicolato a 30 mM, CHES a 0,7 M, GSH a 2 mM,GSSG a 0,4 mM, 0,12 mg/mL de TGF-Beta 3, pH 9,5 a 2-8°C.

3. taurodeoxicolato a 30 mM, CHES a 0,7 M, GSH a 2 mM,GSSG a 2 mM, 0,12 mg/mL de TGF-Beta 3, pH 9,5 a 2-8°C.

As condições experimentais de redobramento contendo CHESforam também otimizadas para maximizar o rendimento e reduzir as linhasde tempo. As condições de redobramento ideais continham CHES a 0,7 M,NaCI a 1M, GSH a 2 mM, GSSG a 0,4 mM, 0,25 mg/mL de TGF-Beta 3 e pH9,5, tendo concluído o redobramento entre 24-48 horas. Isto é significativa-mente mais rápido do que 7 dias usando os métodos divulgados nas paten-tes: US. 5.922.846, US 5.650.494 e EP-B-0433 225.

O CHES otimizado e redobrado foi também purificado e desco-briu-se ter atividade biológica comparável a um TGF-Beta 3 padrão (NIBSC)e TGF-Beta 3 gerados usando a metodologia descrito na técnica anterior.

EXEMPLO 2

Um processo industrial foi desenvolvido de acordo ao segundoaspecto da invenção.

A Figura 10 mostra uma visão geral do processo enquanto queas figuras 11-29 mostram mais detalhes, na forma de fluxogramas, das eta-pas individuais descritas na Figura 10.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Renovo Ltd

Ferauson1 MarkMeliors, PhilLaverty, HughOccleston, Nick0'Kane, SharonHigginbottom,' simon

<120> DOBR AMENTO DE PROTEÍNA

<130> P90081PWD

<150> GB0604964.7<151> 2006-03-11

<160> 5

<170> Patentln version 3.3

<210> 1

<211> 336

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

gctttggaca ccaattactg cttccgcaac ttggaggaga actgctgtgt gcgccccctc 60tacattgact tccgacagga tctgggctgg aagtgggtcc atgaacctaa gggctactat I20gccaacttct gctcaggccc ttgcccatac ctccgcagtg cagacacaac ccacagcacg I80gtgctgggac tgtacaacac tctgaaccct gaagcatctg cctcgccttg ctgcgtgccc 240caggacctgg agcccctgac catcctgtac tatgttggga ggacccccaa agtggagcag 300ctctccaaca tggtggtgaa gtcttgtaaa tgtagc

336

<210> 2<211> 35<212> DNA<213> Artificial

<220>

<223> Infciadordesentido

<400> 2

gatataccat ggctttggac accaattact actgc 35

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciadordesentido

<400> 3

cagccggatc cggtcgactc agctacattt acaagac 37

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> T7 Iniciadordesentido

<400> 4

taatacgact cactataggg

<210> 5<211> 19<212> ONA

<213> Artificial

<220>

<223> Τ7 Iniciadorterminador

<400> 5

gctagttatt gctcagcgg

Claims (31)

1. Método para dobramento de um Fator de Crescimento Transfor-mante Beta, ou um análogo funcional do mesmo, em uma forma dimérica ebiologicamente ativa, caracterizado pelo fato de que compreende a adiçãode fator de crescimento monomérico não-dobrado, solubilizado a uma solu-ção contendo:(i) ácido 2-(cilcoexilamino)-etanossulfônico (CHES) ou umanálogo funcional do mesmo; e(ii) um sistema de oxirredução de sulfidrila/dissulfeto debaixo peso molecular; e incubando o fator de crescimento na solução até seformar o fator de crescimento dimérico biologicamente ativo.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que CHES é usado em uma concentração de aproximadamente 100mM-1,0 M.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelofato de que CHES a cerca de 0,7 M, é usado.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o análogo funcional de CHES é definidopela fórmula:<formula>formula see original document page 43</formula>em que:R1 e R2 são os mesmos ou diferentes e são selecionados do grupoconsistindo em hidrogênio, grupos alquila de C1-4 substituídos ou não-substi-tuídos, grupos cicloalquila de C3-8 substituídos ou não-substituídos ou nú-cleos aromáticos substituídos ou não substituídos ou R1 e R2 juntos formamum sistema anel com até 10 átomos;X1 e X2 são independentemente selecionados de -O-, -S-, -S(O),-S(O2)-, -NR3-, -CHR4- e CHR5, onde R3, R4, e R5 são os mesmos ou diferentese são independentemente selecionados do grupo consistindo em hidrogênio,grupos alquila de C1-4 substituídos ou não substituídos, grupos cicloalquilade C3-8 substituídos ou não substituídos ou núcleos aromáticos substituídosou não substituídos ou quaisquer dois de R3, FU, e Rs podem juntos formarum sistema de anel com até 6 átomos, sujeitados ao fato de que pelo menosum dentre Xi e X2 é -CHR4-Ou-CHR5-; eX3 é selecionado de C, S, S=O ou P-OH

5. Método, de acordo a reivindicação 4, caracterizado pelo fatode que o análogo funcional de CHES é definido pela fórmula:

6. Método, de acordo a reivindicação 4, caracterizado pelo fatode que o análogo funcional de CHES é definido pela fórmula:<formula>formula see original document page 44</formula>

7. Método, de acordo a reivindicação 4, caracterizado pelo fatode que o análogo funcional de CHES é definido pela fórmula:<formula>formula see original document page 44</formula>

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7,caracterizado pelo fato de que o sistema de oxirredução de sulfidrila/dissulfetoé glutationa em suas formas, oxidada e reduzida.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelofato de que o sistema de oxirredução de sulfidrila/dissulfeto é cerca de 200μΜ-20 mM de glutationa reduzida e 40 μΜ-4 mM de glutationa oxidada.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-9, caracterizado pelo fato de que o Fator de Crescimento Transformante Betaé incubado em pH de 8-10.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizadopelo fato de que o Fator de Crescimento Transformante Beta é incubado empH entre cerca de 8,5 e 9,5.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-11, caracterizado pelo fato de que o Fator de Crescimento TransformanteBeta é incubado a temperaturas de 0°C-37°C.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-12, caracterizado pelo fato de que o Fator de Crescimento TransformanteBeta é adicionado à solução em uma concentração entre 0,1-0,5 mg/ml.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 13, caracterizado pelo fato de que o Fator de Crescimento TransformanteBeta é Fator de Crescimento Transformante Beta 3.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizadopelo fato de que o Fator de Crescimento Transformante Beta 3 é adicionadoà solução em uma concentração entre cerca de 0,12-0,25 mg/mL

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicação 1 a-15, caracterizado pelo fato de que o dobramento é realizado sob as seguin-tes condições: ácido 2-(cilcoexilamino)etanossulfônico (CHES) a 0,7 M, glu-tationa reduzida a 2mM (GSH), glutationa oxidada a 0,4 mM (GSSG),-0,12mg/mL de TGF-Beta 3, pH 9,5 a 2-8°C.

17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-16, caracterizado pelo fato de que o dobramento é realizado sob as seguin-tes condições: CHES a 0,7 M, NaCI a 1M, GSH a 2mM, GSSG a 0,4 mM,-0,25mg/ml_ de TGF-Beta 3, pH 9,5 a 2-8°C/temperatura ambiente.

18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-17, caracterizado pelo fato de que também se adiciona taurodeoxicolato àsolução.

19. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizadopelo fato de que o Fator de Crescimento Transformante Beta é incubadocom taurodeoxicolato a uma concentração entre 10 mM e 100 mM.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizadopelo fato de que o Fator de Crescimento Transformante Beta é incubadocom taurodeoxicolato a uma concentração de cerca de 30 mM.

21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a20, caracterizado pelo fato de que o dobramento é realizado sob as seguin-tes condições: taurodeoxicolato a 30mM, CHES a 0,7 M, GSH a 2mM,GSSG a 0,4 mM, 0,12mg/mL de TGF-Beta 3, pH 9,5 a 2-8°C;

22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a10 21, caracterizado pelo fato de que o dobramento é realizado sob as seguin-tes condições: Taurodeoxicolato a 30 mM, CHES a 0,7 M, GSH a 2 mM,GSSG a 2 mM, 0,25 mg/mL de TGF-Beta 3, pH 9,5 a 2 -8°C.

23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a22, caracterizado pelo fato de que o Fator de Crescimento Transformante15 Beta representa mais de 50% da proteína na solução.

24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a23, caracterizado pelo fato de que o sistema de oxirredução de sulfidrila/ dis-sulfeto de baixo peso molecular é realizado e envelhecido por cerca de 7horas antes de o Fator de Crescimento Transformante Beta ser adicionado àsolução contendo o sistema.

25. Método de produção de um Fator de Crescimento Transfor-mante Beta ativo a partir de um hospedeiro procariótico, caracterizado pelofato de que compreende:A) fermentação de organismos procarióticos que tenham sidotransformados para expressar um membro da superfamília do Fator deCrescimento Transformante Beta;(B) isolamento de corpos de inclusão e recuperação da proteínaexpressa dos corpos de inclusão;(C) redobramento do membro da superfamília do Fator de Cres-cimento Transformante Beta de acordo com o primeiro aspecto da invenção; e(D) purificação do membro da superfamília do Fator de Cresci-mento Transformante Beta redobrado.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizadopelo fato de que na etapa (A) o hospedeiro procariótico é uma bactéria quetenha sido transformada em um vetor de expressão codificando um Fator deCrescimento Transformante Beta.

27. Método, de acordo com a reivindicação 25 ou 26, caracteri-zado pelo fato de que na etapa (C) o fator de crescimento é redobrado comodefinido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 24.

28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25a 27, caracterizado pelo fato de que o Fator de Crescimento TransformanteBeta é purificado de acordo com a etapa (D) por ultrafiltração e cromatogra-fia de troca tônica.

29. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizadopelo fato de que a cromatografia de troca iônica compreende cromatografiade interação hidrofóbica seguida pela cromatografia de troca catiônica e noqual o Fator de Crescimento Transformante Beta do fator de crescimento éformulado na concentração desejada na solução e colocado em frascos.

30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 25 a 27, caracterizado pelo fato de que o método compreende também umaetapa (E) em que o fator de crescimento é formulado na concentração dese-jada em uma solução e colocado em frascos.

31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25a 28, caracterizado pelo fato de que o método compreende essencialmenteas etapas (A) a (E), como definido na Figura 10.