JPS62502196A - 新規なインシユリン誘導体およびこれら誘導体を含有する製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規なインシュリン誘導体およ びこれら誘導体を含有する製剤 技術分野 本発明はインシュリン誘導体および持続性作用を示し、新規インシュリン誘導体 の少なくとも１種、所望によって速効性インシュリンを含有するインシュリン製 剤に関する。

重いあるいは慢性の場合、糖尿病は通常インシュリン例えばブタインシュリン、 ウシインシュリンまたはヒトインシュリンを含有する注射製剤で処置される。

可溶性インシュリン製剤は通常速効性であるが、その代りにその作用は数（ｆｅ ｗ　）時間後に停止する。従ってしばしば、通常は１日数回注射を与える必要が ある。

この欠点を克服するため、持続性作用を有するインシュリン製剤は、作用が何時 間（５ｅｖｅｒａｌ　ｈｏｕｒｓ　）、あるいは２４時間もしくはそれ以上長く 維持されるように配合されている。かかる持続性にされた製剤を用いると、糖尿 病患者は少ない数の注射、例えば２４時間で１回または２回の注射を受けるだけ でよい。

かかる持続性作用はインシュリンを僅かに可溶性の塩、例えば亜鉛インシュリン またはプロタミンインシュリンに変えることによって達成できる。

僅かに可溶性のインシュリン塩は懸濁液の形で使用され、皮下注射後インシュリ ンはそこから徐々に放出される。　′近年持続性作用を達成するため他の方法が められている。その例として重合した血清アルブミン中にインシュリン結晶を内 包させることがある。別の例に連続的に作用する注入装置、いわゆるインシュリ ンポンプがある、しかしながらこれは患者にとって不快なもので、危険を伴うこ とがある。

デンマーク特許出願第３５８２／８４号および第３５８３／８４号の明細書には 、Ｂ−鎖のＣ末端を少なくとも一つの正電荷を担持する有機基、好ましくはＡｒ ｇ−ＯＨまたはＡｒｇ　−Ａｒｇ−ＯＨで延長されたインシュリン誘導体の製法 および使用が記載されている。かかるインシュリン誘導体の懸濁液を含有する製 剤は持続性作用を示す。

発明の開示 インシュリン製剤、特に注射製剤において、Ｂ３０が電荷を有しない基（ｕｎｃ ｈａｒｇｅｄ　ｇｒｏｕｐ　）でブロックされているようなインシュリン誘導体 、所望によってＡ４．Ａ１７゜Ａ２１．Ｂ１３およびＢ２１の位置のアミノ酸残 基上のカルボン酸基の四つまでが電荷を有しない基でブロックされているかある いはそれに変換されているインシュリン誘導体を使用することによって従来知ら れていないそして長く継続する持続性にされた作用が達成されることを驚いたこ とにここに見出した。この効果はＢ３０カルボキシル基が少なくとも８個の炭素 原子のアルキル鎖を含有する基でブロックされているとき、またはＢ３０カルボ キシル基が電荷を有しない基でブロックされ、同時に少なくとも１個でかつ４個 より多くない追加のカルボキシル基が電荷を有しない基でブロックされるかもし くはそれに変換されているとき、特に強調される。

従って本発明は、８３０カルボキシル基が電荷を有しない基でブロックされてい るインシュリン誘導体、および所望によってＡ４．Ａ１７．Ａ２１　、Ｂ１３お よびＢ２１のアミノ酸残基上のカルボン酸基の１〜４個が電荷を有しない基でブ ロックされているかもしくは変換されているインシュリン誘導体に関する、ただ し、８３０カルボキシル基のみが電荷を有しない基で置換されているときには、 上記基は少なくとも８個の炭素原子を有するアルキル基を含有する。

特に本発明は炭素原子８〜１２個のアルキル基を含有スる電荷を有しない基でＢ ３０カルボキシル基のみがブロックされているインシュリン誘導体に関する。

特に本発明は少なくとも８個の炭素原子を有するアルキルアミドとしてＢ３０カ ルボキシル基がブロックされているインシュリン誘導体に関する。

本発明は特にＡ４．Ａ１７．Ｂ１３およびＢ２１のアミノ酸残基上のカルボン酸 基の一つが電荷を有しない基でブロックされているかそれに変換されており、８ ３０カルボキシル基が１〜１２個の炭素原子のアルキル基を含有する電荷を有し ない基でまたはアミドとしてブロックされているインシュリン誘導体に関する。

本発明は特にＡ４．Ａ１７．Ｂ１３およびＢ２１の位置のアミノ酸残基上のカル ボン酸基の一つが電荷を有しない基でブロックされているかそれに変換されてお り、８３０カルボキシル基が８〜１２個の炭素原子のアルキル基を含有スる電荷 を有しない基でブロックされているインシュリン誘導体に関する。

本発明はまた８３０カルボキシル基が電荷を有しない基でブロックされ、所望に よってＡ４．Ａ１７．Ａ２１゜Ｂ１３およびＢ２１の位置のアミノ酸基上のカル ボン酸基の１〜４個が電荷を有しない基でブロックされているかそれに変換され ており、ただしＢ３０カルボキシル基のみが電荷を有しない基でブロックされて いるときには、上記基は少なくとも８個の炭素原子を有するアルキル基を含有す る少なくとも１種のインシュリン誘導体を含有し、所望により速効性インシュリ ンも含有するインシュリン製剤に関する。

本発明のインシュリン製剤の特に有利な具体例は持続性インシュリン作用を示し 、中性ｐＨを有する等張水性媒体中に本発明の少なくとも１種のインシュリン誘 導体の懸濁液を含有し、所望によってバッファーおよび／または保存剤を含有し 、そして所望するときには速効性インシュリンを含有する注射製剤にある。

ブタ、ウシ、ヒツジおよびヒトインシュリンの如き、糖尿病の処置のため普通に 使用されるインシュリンは、全て６個の遊離カルボキシル基を含有する、即ちＡ ４−１Ａ１７−１Ａ２１−１Ｂ１３−１Ｂ２１−およびＢ５０−アミノ酸残基中 に含有する。上記番号はＮ末端から出発してそれぞれインシュリンＡ−鎖および Ｂ−鎖中の位置を表わす。

Ｂ３０カルボキシル基がメチルエステルまたはアミドに変換されているインシュ リンは変らぬ生物学的活性を有することが知られている（バー・ツアーン等のナ ツールヴイツセンシャフテン第６８巻、１９８１年、第５６頁〜第６２頁、およ びエム・コバヤシ等のダイアビーテイズ、第３０巻、１９８１年、第５１９頁〜 第５２２頁参照）。持続作用は記載されていない。インシュリンの生物学的活性 は通常誘導体化の増大した程度によって低下する。しかしながら生物学的活性は 遊離カルボン酸基の高度の誘導体化でさえも驚いたことに殆ど影響を受けない、 しかし６個の全てのカルボン酸基が誘導体化されたときには生物学的活性は完全 ′にだめになる（ディ・レヴイのＢｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ 第３１０巻、１９７３年、第４０６頁〜第４１５頁参照）。

本発明のインシュリン製剤によれば、インシュリン活性は維持でき、同時に驚い たことに持続作用を達成できる。

この持続性効果は特殊な誘導体の性質に、即ちブロックされているカルボン酸基 の数のみならずブロック基の大きさおよび化学的組成に依存している。従って意 のままに持続作用を変えることができる。

インシュリン依存性糖尿病の場合、しばしば使用される治療は、基本的インシュ リンレベルを作るため、持続性インシュリン製剤の毎日２回の注射、１回は朝そ して１回は就寝直前の夕方の注射からなっている。更に速効性製剤の３回の注射 は主たる食事の前に与えられる。この治療の欠点は、持続性製剤の夕方遅い注射 が夜の間に危険な低面グルコースレベルを生せしめることがあることである。こ の状況は夕食前に持続性インシュリンと速効性インシュリンの混合製剤を注射す ることによって避けられる、これによって低血糖症はあったとしても夕方中に生 じ、この場合軽食によってそれは避けられる。しかしながらこの種の治療は、最 も使用されている持続性インシュリン製剤、インスレイタート（ｒｎｓｕｌａｔ ａｒｄ　；登録商標）およびモノタート（Ｍｏｎｏｔａｒｄ　；登録商標）が充 分に長く作用しないので、しばしば過血糖症を生ぜしめる。従って普通に使用さ れている製剤よりも長く作用する、特にかかる製剤の１回の注射で１日もしくは 数日間さえも充分であるインシュリン製剤を糖尿病患者に提供するこきが望まし い。本発明により製造されたインシュリン製剤は普通に使用されている持続性イ ンシュリン製剤インスレイタート（登録商標）の持続インシュリン作用と同じか もしくはそれより長い持続したインシュリン作用を示す。

８３０カルボキシル基のみが電荷を有しない基でブロックされている本発明の特 別のインシュリン誘導体を用いたとき、ブロック化がアルキルエステルまたはア ルキルアミドの形で生起し、この場合アルキル基が特にＮ−アルキルの形で、８ 〜１８個の炭素原子を含有するような誘導体が好ましい。アルキル基が小さくな ると、延長はインスレイタート（登録商標）の持続性と実質的に異ならなくなる 、そしてアルキル基が大きくなると誘導体の製造を非常に困難にする溶解度問題 が生ずる。

Ｂ３０カルボキシル基および更に１〜４個のカルボキシル基が電荷を有しない基 でブロックされている本発明のインシュリン誘導体の中では、ブロック化がアミ ド、アルキルエステルの形で、そしてＢ３０カルボキシル基に関する限りまたア ルキルアミドの形で生起し、これによって８３０カルボキシル基中のアルキル基 が１８個以下の炭素原子を含有するが、残余のカルボキシル基は４個より多くな い炭素原子を含有する誘導体が好ましい。

本発明は特に下記の特別な化合物に関する：インシュリンーＢ３Ｑ−オクチルエ ステル、インシュリキサデシルアミド、インシュリン−（Ｂ２１．Ｂ５０）−ジ メチルエステル、インシュリン−（Ａ１７．Ｂ５０）−ジメチルエステル、イン シュリン−（Ａ４．Ｂ５０）−ジアミド、インシュリン−Ａ１７−アミド−Ｂ３ ０−オクチルエステル、インシュリン−（Ａ４．Ｂ１３）−ジアミド−Ｂ３０− へキシアミド、インシュリン−（Ａ４．Ａ１７゜Ｂ２１．Ｂ５０）−テトラミド 、インシュリン−（Ａ１７゜Ｂ５０）−ジアミド、Ａ４−アラ−インシュリン− Ｂ３０−アミド、Ｂ５０−リューインスシュリンー（Ａ４．Ｂ５０）一本発明の インシュリン製剤が速効性インシュリンを含有するとき、このインシュリンは例 えばヒトまたはブタインシュリンであることができる。

本発明のインシュリン誘導体はブタ、ウシ、ヒツジ、ラビットまたは特にヒトイ ンシュリンから誘導でき、これらにはＢ３０アミノ酸残基が例えば半合成によっ て別の天然インシュリン誘導体は例えばエステル化またはアミド化により、カル ボン酸基の電荷を有しない基への変換のためそれ自体知られている方法で製造で きる。例えば合計で６個のカルボン酸基の２個以上がメチル化されているインシ ュリン誘導体は、例えばヒトインシュリン−Ｂ３０−メチルエステルを三弗化硼 素／メタノール中で好適な時間反応させ、続いて僅かに塩基性のｐＨ値で、アニ オン交換カラムで変性されたインシュリン誘導体の分別をして製造する。

最後に生成物を分取ＨＰＬＣで分別し、分離する。

Ｂ３０カルボキシル基の誘導体化は、例えばデンマーク特許第１４６４８２号に 記載された方法に従って、酵素触媒によって生起させることができる。この方法 によれば、Ｂ５０−アミノ酸は、カルボキシペプチダーゼ人で例えばブタインシ ュリンを消化することによって除き、第二工程で、形成されたデス−８３０−イ ンシュリンをトリプシンまたはトリプシン様酵素の存在下に中性アミノ酸エステ ル特にスレオニンメチルエステルと反応させる。

同様な方法がデンマーク特許出願第５７４／８０号から知られている、この方法 によれば、トリブチツク触媒によって所望のアミノ酸エステルまたはアミドで、 ワンポット法でインシュリン中のＢ３０アミノ酸を交換する。上記出願によれば 反応は出発材料としてプリインシュリンを用いて実施することさえできる。

幾つかのカルボキシル基ブロック化は本発明によれば好ましくは、バイオテクノ ロジーの方法で達成できる。これは、Ａ４．Ａ１７．Ｂ１３およびＢ２１の位置 にあるグルタミン酸の幾つかまたは全部を電荷を有しない側鎖を担持する天然産 アミノ酸で交換することにより、またはアミドの形でＡ４．Ａ１７．Ｂ１３およ びＢ２１の位置のカルボキシル基のブロック化に適用する。

通常これらの位置でのアミノ酸はグルタミン酸であるが、本発明のインシュリン 誘導体の幾つかにおいては、それらはグルタミン酸交換される。

これらの変性インシュリンは生合成で、例えばＤＮＡＮ二鎖ディングにおいて、 コドン中の一つの塩基のみをグルタミン酸に変えることにより作ることは明らか であり、このコドンは例えばグルタミンのコードとなしうる。ＮＤＡ鎖コーディ ングにおける塩基をインシュリン（またはプロインシュリン）に変えることによ り、分離についての限界により化学的に作ることが困難もしくは不可能であった 変性をすることができる。

生合成によりヒトインシュリンを製造するための多くの異なる方法がある。全プ ロインシュリン、その修飾変種またはＡ−鎖およびＢ−鎖側々に対するＤＮＡＮ 二鎖ディングは好適なプロモーターを含有する複製可能なプラスミド中に挿入さ れたことはこれら全てに共通である。この系を一定のホスト微生物に変換するこ とによって、それ自体知られている方法で真正のヒトインシュリンに変えること ができる生成物を製造できる。

プロインシュリンまたはＡ−鎖およびＢ−鎖の生合成およびそれらのインシュリ ンへの変換のための幾つかの既知の方法を以下に説明する。

良く知られているジエネンテク（Ｇｅｎｅｎｔａｃｈ　）法において、ポリペプ チドのＥコリ中の細胞内製造がなされ、この場合ポリペプチドはβ−ガラクトシ ダーゼとインシュリンのそれぞれＡ−鎖およびＢ−鎖との間の融合である。醗酵 後二つの生成物が分離され、Ａ−鎖およびＢ−鎖は臭化シアンによりβ−ガラク トシダーゼから分離され、その後ｐＨＩ　０．５で゛ジチオスレイトールの存在 下に還元性条件の下皿硫酸化された鎖が組合される。最後にヒトインシュリンが この反応混合物から分離される。

ｇｐｏ第５５９４５号に記載された方法において、生成物は分割位置で分離され た別の蛋白質と融合蛋白質として合成される。これはプロテアーゼ分割位置また は化合的に分割されうる位置（例えばメチオニン）でありうる。プロインシュリ ンの遺伝子は例えば組換えＤＮＡ法により別の蛋白質と遺伝子融合としてクロー ニングされる。分離後キメラ蛋白質は適切な酵素またはＣＮＢｒによって分割さ れ、次いで変性蛋白質が亜硫酸分解された形で分離される。この生成物はフラン クによって発表された如（ｐＨ１０，５でβ−メルカプトエタノールを用い、還 元性条件下に再生され、次い□でケンムラ−（Ｋｓｍｍｌｅｒ　）　（１９７１ 年）によッテ発表すれた如くトリプシン／ＣｐＢ分割によって再生される。形成 されるインシュリンはそれ自体知られている方法で分離される。

最後にプロインシュリンはＥＰＯ第１１６２０１号に記載された方法を用いて生 合成的に製造することができる。この方法において蛋白質はサツカロミセス　セ ルビジアエからα−因子系を用いて培地中に分泌される。この系にプロインシュ リンの遺伝子コーディングを挿入することにより、プロインシュリンはデンマー ク特許出願第３０９１／８４号に記載された系を用いて培地から分離できる。そ の後プロインシュリンは上述した既知の方法によってインシュリンに変換できる 。

上記出願中には生成物がプロインシュリンあるいは別々にＡ−鎖およびＢ−鎖の 何れかである方法が記載されている。

更にこれらの生成物はシグナル配列と共に合成されるか（その目的は生成物をそ れが解裂される細胞表面にもたらすことである）、あるいは蛋白質との融合とし て合成される（その目的は生成物を安定させることである）。

更に変性プロインシュリンを生合成的に製造することができる。ヨーロッパ特許 出願第８２３０３０７１．３号には組換ＤＮＡ法によりＣ−鎖が変性されたプロ インシュリンが記載されている。

上述したインシュリンの変性は好適な表現系で変性ＤＮＡ配列を表現することに よって製造できる。ＤＮＡ配列の変化はトーツス・ニー・クンケルによって米国 プロシーディング・オフ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オフ・サイエンシス第 ８２巻第４４８頁〜第４９２頁（１９８５年）に発表された方法によってインシ ュリン遺伝子のイン・ビトロでの突然変異生成によって作ることができる。この 方法によれば、インシュリン遺伝子は一重鎖ＤＮＡバタテリオファージＭ１３中 にクローニングされる。このファージからＤＮＡヲ精、製し、ここまででプライ マー典型的には一定の突然変異（一つのミス対合）を含有する１５〜２５マーが 精製され、同様にこの突然変異の各側での相同がアニーリングされる。そしてプ ライマーはＤＮＡポリメラーゼの使用によりファージゲノムの全長において延長 され、かくして完全な二重鎖分子を提供し、この場合一つの鎖は突然変異を含有 し、他の鎖は野生遺伝子を含有する。Ｅコリ細胞中にこの分子を導入することに よって、ファージブロゲニーは一部野生遺伝子を含有するファージ、一部は突然 変異を含有するファージであるであろう。これらのファージの中、ファージプロ ジエニーの一重鎖ＤＮＡに突然変異形成プライマーとハイブリッド形成すること により所望の種にスクリーニングすることができる。プライマーは変異鎖に対し 完全相同を有するが、単一ヌクレオチドで野生種とは異なる。

スクリーニング後、二重鎖ＤＮＡはＥコリ細胞から分離でき、ファージは複製さ れ、変性インシュリン遺伝子はそれから分離できる。その後この遺伝子は元の表 現系に挿入される。

注射製剤は、無定形および／または結晶質懸濁液として本発明のインシュリン誘 導体を含有でき、これは他のかかるインシュリン誘導体および／または天然産イ ンシュリンと組合せであるいは別々に含有できる。これらの誘導体の大部分は、 それらの等電点より高いｐＨ値で、あるいは約等電点ｐＨ値で、結晶化媒体がフ 二／−ルを含有するとき亜鉛で結晶化できる。またプロタミンまたは過剰の亜鉛 の存在下に本発明のインシュリン誘導体を結晶化することもできる、これは更に 持続活性を生せしめる。

発明を実施するための形態 本発明を下記実施例によって更に説明する。しかしながら実施例５は本発明の範 囲外に入るインシュリン誘導体の製造を示し、実施例６における比較化合物とし て使用した。

実施例９は実施例１および５で使用した出発材料の製造を示す。

実施例　１ ヒトインシュリン−Ｂ３Ｑ−ｎ−ドデシルアミドの製造９７０ｔｎｇのＬ−スレ オニン−ｎ−ドデシルアミドを、３．６ｄのｔ−ブタ／−ル、１．２０ｄのジメ チルホルムアミドおよび１．４０　ｒｒｔｌの水の混合物中に溶解した。混合物 中に撹拌しながら４５０ｒｎｇのデスーＢ３０−アラニンブタインシュリンを溶 解し、ｐＨ値を酢酸で６．４〜６．５に調整した。０．００１Ｍの酢酸カルシウ ム０．２０ａｄ中の８１ｎｇのトリプシンの溶液を加え、反応混合物を２時間２ ０℃で置いた。試料を逆相高圧液体クロマトグラフィで分析し、デスーＢ３０− インシュリンの７１％がインシュリン−Ｂ３Ｑ　−ｎ−ドデシルアミドに変換さ れたことを示した。

反応混合物を５　ｔｔｔｌの２−プロパツール中に注入し、１５分間放置した。

沈澱した蛋白質を遠心分離によって分離し、沈澱を２５１１！７！の２−プロパ ツールで洗浄し、再び遠心分離した。

沈澱をＩＭの尿素中ＩＭの酢酸１５ゴ中に再溶解し、−過後溶液をセファデック ス（登録商標）Ｇ５０スーパーフアインで充填した２、６Ｘ９０ｃｒｎカラムに 入れ、１Ｍ酢酸で平衡化した。蛋白質を同じバッファーで２５ｄ／ｈｒの速度で 溶離し、５　ｔｔｔｌの両分を集めた。両分の２７７ｎｍでの光学密度を試験し た、そして蛋白質主画分を集めて凍結乾燥した。

凍結乾燥した蛋白質を６０容量％エタノール２５ゴ中に再溶解し、ｐＨをＩ　Ｍ 　）　ＩＪスで９．０に調整した。沖過後溶液をｑ−セファロース（登録商標） ＣＬ−５８ＦＦの１．６Ｘ２０ｍカラムに付与し、ｐＨ８，２５で６０容量％エ タノール中トリス／塩酸で平衡化した。

カラムを２０℃で５０　ｍｌ／　ｈｒの速度で、最初の１．５時間は平衡化バッ ファーで、次いで１６時間同じバッファー中塩化す）　ＩＪウム０〜０．ＩＭの 線状勾配で溶離した。約０．０５Ｍ塩化ナトリウムの塩濃度で溶離した蛋白質主 画分を集め、次いでエタノールを蒸発除去した。水性残渣のｐＨ値を塩酸で６． ３に調整し、４℃で１時間放置後遠心分離し、その後分離したヒトインシュリン −Ｂ３Ｑ−ｎ−ドデシルアミドを凍結乾燥した。収量：９６ｒｎｇ。

ヒトインシュリン−Ｂ３Ｑ−ｎ−ドデシルアミドを含有するインシュリン製剤の 配合および生物学的効果−３０ｆｎｇのヒトインシュリン−Ｂ３０−ｎ−ドデシ ルアミドを、少量の塩酸を加えることによって０．０５　Ｍのｍ−クレゾール１ ０ｍＪ中に溶解した、その後、溶液を濾過により滅菌した。次いで溶液に、グリ セロールについて０．７Ｍおよびリン酸二水素ナトリウムについて０．０５Ｍで ある滅菌溶液５　ｍｌを加え、次いで水酸化ナトリウム溶液でｐＨ値を７．３に 調整した。最後に容積を滅菌水を加えて２０ｍ／に増量した。

形成された懸濁液製剤をギニアブタ中に皮下注射したとき（２０μｌ　／　Ｋｇ 　）、低血糖症は、標準ＮＰＨインシュリン製剤インスレイタート（登録商標） によって作られた低血糖症効果より実質的に長く継続した。

実施例　３ ヒトインシュリン−（Ｂ２１．Ｂ５０）−ジメチルエステルおよびヒトインシュ リン（Ａ１７．Ｂ５０）−ジメチルエステルのそれぞれの製造 ５００ｆｎｇのヒトインシュリン−Ｂ３０−メチルエステルを５０＋ｄの乾燥メ タノール中に懸濁した。メタノール中２０重量％の三弗化硼素の２．　ＯＷＬｌ を撹拌しながら加えた。常温で２時間放置後、試料を４００−のエーテル中に注 入し、４℃で２５００Ｘ９で２０分間遠心分離した。沈澱を２回エーテルで洗浄 し、１５０ｔ／のエーテル中に再懸濁し、減圧で蒸発させ、２０Ｉ！ＩＭトリス ／塩酸塩、６０容量％エタノール５０１１１１中にｐＨ８，２５で溶解した。次 いで試料を同じバッファで平衡化したＱ−セファロース（登録商標）　ＣＬ　− ５Ｂファスト・フローカラム１．６×２１ｃＩｎに付与した。２４ｃｒｎ／ｈｒ の流速で１時間インクラチック溶離後、次の１６時間の開基化ナトリウム濃度を 直線的にＯＭから０．１Ｍへと増大した。インシュリンジメチルエステルを含有 する極大部を三つの主プール中に集めた。

第一溶出プールをｐＨ４，０の０．１２５Ｍの硫酸アンモニウムおよびアセトニ トリルを含有するバッファーで平衡化した４Ｘ２５０ＪＱＩリクロソープ（Ｌｉ ｃｈｒｏｓｏｒｂ　：登録商標）ＲＰ１８カラム（メルク５０３３３）で更に分 別した。１〜２哩の蛋白質をカラムに付与し、３８％アセトニトリルヲ含有する 上記バッファーで溶離した。主蛋白質画分を２０〜２５分後に溶出した。アセト ニトリルを試料から減圧上除去し、蛋白質をセパク（５ｅｐａｋ　；登録商標） ０１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ　Ａｓｓ　Ａ　５１９１０　）に付与し、Ｂ２０で 洗い、７０％メタノールで溶離した。メタノールを減圧上除去し、蛋白質を凍結 乾燥した。これによってヒトインシュリン−Ｂ２１゜８３０−ジメチルエステル ２０ゴが得られた。

次の溶出プールを相当する方法で処理し、これによって１５岬のヒトインシュリ ン−Ａ１７．Ｂ５０−ジメチルエ両ヒトインシュリンジメチルエステルをプラズ マ脱着質量分析法で特性決定した、これｌこよって正しい分子量を見出した、そ してニス・ナウレウスプロテアーゼで分解し、エステル化されたグルタミン酸を 同定した。

実施例　４ ヒトインシュリンジメチルエステルを含有する製剤の生物学的効果 ｐＨ７，３，、／’７５　Ｍ　Ｏ：）　リン酸ナトリウム、０．３３　％（ｗ／ ｖ）のｍ−クレゾール、１．６％（”／ｖ）のグリセロールを含有する媒体２５ ｍ／を作った。溶液を濾過によって滅菌した。

媒体１．　Ｏｒａｔ中に実施例３に記載した如く作ったヒトインシュリン−（Ｂ ２１　、Ｂ５０）−ジメチルエステルの２．１　ｑを懸濁した。

同様に１．０ｄの媒体中に実施例３に記載した如く作ったヒトインシュリン−（ ＡＩ？、Ｂ５０）−ジメチルエステルの３．２■を懸濁した。

ギニアブタに皮下注射によりこれらの亜鉛不含製剤を投与して強力に持続された 低血糖が観察された。下表から明らかな如く、持続性は普通に使用されている結 晶プロタミン−インシュリン製剤、インスレイタート（登録商標）に匹敵した。

時　間（ｈｒ）　０　１　２　４　６ インスレイタ一ド１１μ９／Ｋｇ　１００　７４　４５　８２　９８ヒトインシ ュリン−（Ｂ”Ｂ３０”　１００　６４　５１　７９　９４ジメチルエステル１ ６μ９／Ｋｇ 表は出発値の％での血糖値（グルコース）　（ｆｉ＝＝６匹）を示す。

ヒトインシュリン−Ｂ３Ｑ−ｎ−へキシルアミドの製造実施例９に記載した如く 作ったＬ−スレオニン−ｎ−へキシルアミド２９０■を、２．６０ｔ／の９６容 量％エタノール、０．８０ｔｅの水および０．１６ｄの酢酸の混合物中に溶解し た。撹拌しつつ２４０ｆｎｇのデスーＢ３０−アラニンブタインシュリンを加え 、ｐＨ値をトリエチルアミンで６．３〜６．４に調整した。０．１０ｄのＯ，０ ０１Ｍ酢酸カルシウム中の５１ｎｇのトリプシンの溶液を次に加え、反応混合物 を１２℃で放置した。２時間後、反応混合物を２−の２−プロパツール中に注入 し、１５分放置後、沈澱した蛋白質を遠心分離で分離した。沈澱を２ゴの２−プ ロパ／−ルで洗い、再び遠心分離した。

逆相高圧液体クロマトグラフィでの沈澱の分析は６５％の変換率を示した。

沈澱を７輩尿素中ＩＭ酢酸の１０＋＋＋／中に再溶解し、濾過後、溶液を、１Ｍ 酢酸で平衡化した２、６Ｘ９０ｃｒｎのセファデックス（登録商標）Ｇ５０スー パーフアインカラムに付与した。このカラムを同じバッファーで２５ｄ／ｈｒの 速度で溶離した。蛋白質主画分を集め凍結乾燥した。

凍結乾燥した蛋白質を、１Ｍトリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン（Ｔ Ｒｘｓ　）　テｐＨ８，２５１ｃＩＡ整Ｌ／　テロ０容量％エタノール２０１１ Ｌｌ！中に再溶解した。濾過後浴液を、ｐＨ８，２５の６０容量％エタノール中 ０．０２　Ｍ　ＴＲｒｓ／塩酸で平衡化した１、５Ｘ２０ｆｆｌのｑ−セファロ ース（登録商標）ＣＬ−５８ＦＦカラムに付与した。カラムを２０℃で５０１１ Ｌｌ！／ｈ　ｒの速度で、最初平衡バッファーで１．５時間、続いて１６時間０ 〜０．１Ｍ塩化ナトリウムの直線勾配で溶離した。塩濃度〜０．０５　Ｍ塩化ナ トリウムで溶離した蛋白質材料を集め、次いでエタノールを減圧除去した。水性 蒸発残渣のｐＨ値を塩酸で６．３に調整し、４℃で４時間放置後遠心分離した。

分離したヒトインシュリン−Ｂ３０−ｎ−へキシルアミドを凍結乾燥した。収量 ＝５０哩。

実施例　６ ヒトインシュリン−Ｂ３Ｑ−ｎ−へキシルアミドラ含有、するインシュリン製剤 の配合および生物学的効果　□３０ｆｎｇのヒトインシュリン−Ｂ３Ｑ−ｎ−ヘ キシルアミドを１０−の０．０５　Ｍのｍ−クレゾール中に少量の塩酸を加えて 溶解した、次いで溶液を濾過して滅菌した。グリセロールについて０．７Ｍおよ びリン酸二水素ナトリウムについて０．０５　Ｍである滅菌溶液５　ｙｔｌを溶 液に加え、ｐＦｉ値を滅菌水酸化ナトリウム溶液で７．３に調整した。最後に滅 菌水を加えて最終容量２０ｔｎｌとした。

ギニャブタにこの製剤を皮下注射（２０μ／／Ｋｇ）ｔ、、標準ＮＰＨインシュ リン製剤（インスレイタート；登録商標）によって誘起される低血糖症に相当す る持続した低血糖症を生じた。

実施例　７ ヒトインシユリンーＡ４−アミド−Ｂ２Ｏ−エチルエステルの製造 本明細書の前の方で記載したバイオテクノロジーの一つによって導入したヒトプ ロインシュリン（位置Ａ４のグルタミン酸をグルタミンで置換した）５０■を、 ４００μｌのＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド、１００μｌの水および１２５ｒｒ ｃ　（７）　Ｌ−スレオニンエチルエステルを含有する混合物中に溶解した。溶 液のｐＨ値を酢酸で６．５に調整した。０．００１Ｖ酢酸カルシウムの１００Ｉ ！／に溶解したブタトリプシン２．５■を加え、反応混合物を１２℃で放置した 。４８時間後１゜＋Ｊ（７）２−プＯパノールで蛋白質を沈澱させることによっ て反応を停止させた。沈澱を遠心分離により分離し、続いて実施例５に記載した 如くゲル濾過およびイオン交換クロマトグラフィで分別した。これによって１５ 〜のヒトインシュリン−′Ａ４−アミドー８３０−エチルエステルが得られた。

実施例　８ ヒトインシュリン−Ａ４−アミド−Ｂ２Ｏ−エチルエステルを含有するインシュ リン製剤の配合および生物学的効果 １５■のヒトインシュリン−Ａ４−アミ）’−８３０−工チルエステルを、１５ ｑの酢酸ナトリウム３水和塩、４ｏ。

■のマンニトールおよび３ｏｆｎｇのフェノールを含有する水溶液５ｍＡ！に懸 濁させた、次いでｐＨ値を７．３に調整し、水を加えて最終容量１０！Ｌｌとし た。

ギニャブタにこの製剤の皮下注射（２０ｐｉ！／Ｋｇ）　シて、標準ＮＰＨ−イ ンシュリン製剤（インスレイタート：登録商標）によって誘起される低血糖症よ りも長い時間低血糖症を生ぜしめた。

実施例　９ Ｌ−スレオニンアルキルアミドの製造 １０關のｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−スレオニンおよびｌ　Ｑ　ｍＭのア ルキルアミンを２５ｄのクロロホルム中に溶解し、次いでｌ　ｌ　ｍＭのＮ−エ チルオキシカルボニル−２−エチルオキシ−１，２−ジハイドロキノン（ＲＥＤ ｑ）　ヲ加えた。反応混合物を２０ｃで１６時間撹拌し、次いで溶媒を減圧上蒸 発させて除去した。形成された粘稠油を１ｏ。

ｄのエチルアセテートに再溶解し、１０％クエン酸５０ｄで２回、ＩＭの重炭酸 ナトリウム５ｏゴで２回、水５０ｔ！！Ｊ！で２回洗浄した。有機相を無水硫酸 ナトリウム上で乾燥し、減圧下蒸発除去した。

保護基を分解するため、残渣を２５ｍＪのトリフルオロ酢酸に溶解し、２０℃で ３０分装いた。蒸発によってトリフルオロ酢酸を除去した後、形成された粘稠油 を５０ｄの１Ｍ炭酸ナトリウムと混合し、混合物を５０１！Ｌｌのクロロボルム で３回抽出した。−緒にした抽出液を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、減圧蒸発 した。残渣は４℃で放置したときワックス状結晶に固化した。収率：５０〜８５ ％。

田繁諏査報告 Ｉ″＋−ｍａｉｌ　Ａｅｅ１１ｃｍ＋ｋ“１０°　ＰＣＴ／ＤＫ８６１０００２ ２

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．Ｂ３０カルボキシル基が電荷を有しない基でブロツクされ、所望によつてＡ ４，Ａ１７，Ａ２１，Ｂ１３およびＢ２１の位置のアミノ酸残基上のカルボン酸 基の１〜４が電荷を有しない基でブロツクされているがそれに変換されており、 ただしＢ３０カルボキシル基のみが電荷を有しない基でブロツクされているとき には上記基が少なくとも８個の炭素原子を有するアルキル基を含有することを特 徴とするインシユリン誘導体。
2. ２．Ｂ３０カルボキシル基のみが、８〜１２個の炭素原子のアルキル基を含有す る電荷を有しない基でブロツクされている請求の範囲第１項記載のインシユリン 誘導体。
3. ３．Ｂ３０カルボキシル基が少なくとも８個の炭素原子を有するアルキルアミド としてブロツクされている請求の範囲第１項記載のインシユリン誘導体。
4. ４．Ａ４，Ａ１７，Ｂ１３およびＢ２１の位置のアミノ酸残基上のカルボン酸基 の一つが電荷を有しない基でブロツクされているかそれに変換され、Ｂ３０カル ボキシル基が１〜１２個の炭素原子のアルキル基を含有する電荷を有しない基で またはアミドとしてブロツクされている請求の範囲第１項記載のインシユリン誘 導体。
5. ５．Ａ４，Ａ１７，Ｂ１３およびＢ２１の位置のアミノ酸残基上のカルボン酸基 の一つが電荷を有しない基でブロツクされるかそれに変換され、Ｂ３０カルボキ シル基が８〜１２個の炭素原子のアルキル基を含有する電荷を有しない基でブロ ツクされている請求の範囲第１項記載のインシユリン誘導体。
6. ６．インシユリン−（Ａ４，Ｂ３０）−ジアミドである請求の範囲第１項記載の インシユリン誘導体。
7. ７．Ｂ３０カルボキシル基が電荷を有しない基でブロツクされ、所望によつてＡ ４，Ａ１７，Ａ２１，Ｂ１３およびＢ２１の位置のアミノ酸残基上のカルボン酸 基の１〜４が電荷を有しない基でブロツクされているかそれに変換されており、 ただしＢ３０カルボキシル基のみが電荷を有しない基でブロツクされているとき には、上記基が少なくとも８個の炭素原子を有する基を含有するインシユリン誘 導体の少なくとも１種および所望によつて速効性インシユリンも含有することを 特徴とするインシユリン製剤。
8. ８．Ｂ３０カルボキシル基のみが８〜１２個の炭素原子を有するアルキル基を含 有する電荷を有しない基でブロツクされているインシユリン誘導体の少なくとも １種を含有する請求の範囲第７項記載のインシユリン製剤。
9. ９．Ｂ３０カルボキシル基が少なくとも８個の炭素原子を有するアルキルアミド としてブロツクされているインシユリン誘導体の少なくとも１種を含有する請求 の範囲第７項記載のインシユリン製剤。
10. １０．Ａ４，Ａ１７，Ｂ１３およびＢ２１の位置のアミノ酸残基上のカルボキシ ル基の一つが、電荷を有しない基でブロツクされているかそれに変換され、Ｂ３ ０カルボキシル基が１〜１２個の炭素原子のアルキル基を含有する電荷を有しな い基でブロツクされているインシユリン誘導体の少なくとも１種を含有する請求 の範囲第７項記載のインシユリン製剤。
11. １１．Ａ４，Ａ１７，Ｂ１３およびＢ２１の位置のアミノ酸残基上のカルボン酸 基の一つが電荷を有しない基でブロツクされているかそれに変換されており、Ｂ ３０カルボキシル基が８〜１２個の炭素原子のアルキル基を含有する電荷を有し ない基でブロツクされているインシユリン誘導体の少なくとも１種を含有する請 求の範囲第７項記載のインシユリン製剤。
12. １２．インシユリン−（Ａ４，Ｂ３０）−ジアミドを含有する請求の範囲第７項 記載のインシユリン製剤。
13. １３．所望によつてバツフアーおよび／または保存剤を含有し、中性ｐＨを有す る等張水性媒体中の少なくとも１種のインシユリン誘導体の懸濁液を含有し、所 望によつて速効性インシユリンを含有し、持続性インシユリン作用を示す注射製 剤である請求の範囲第７項記載の製剤。