NO170978B

NO170978B - Analogifremgangsmaate ved fremstilling av nye peptider

Info

Publication number: NO170978B
Application number: NO873018A
Authority: NO
Inventors: Jan Markussen; Kjeld Norris; Liselotte Langkjaer
Original assignee: Novo Nordisk As
Priority date: 1986-07-21
Filing date: 1987-07-20
Publication date: 1992-09-28
Also published as: IL83243A; EP0254516B1; NO170978C; ES2061504T3; PT85355B; DE3788684T2; IL83243A0; FI873185A; EP0254516A2; YU135387A; JPS6399096A; NO873018L; CN87104988A; KR880001701A; AU7591687A; PT85355A; EP0254516A3; NL300018I1; HU203371B; DE3788684D1

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en analogifremgangsmåte ved fremstilling av forbindelser med den generelle formel I

hvor bokstavene A og B etterfulgt av tall i parentes angir peptidfragmentene for A- og B-kjedene, hhv., angitt med tallene i parenteser, E<1>, E<2>, E<3> og E<A> er de samme eller forskjellige og betyr hver glutaminsyre eller glutamin, X betyr en L-treonin-, L-arginin- eller L-lysinrest, Y betyr threonin eller lysin, og R betyr hydroksy eller en amidorest som blokkerer den C-terminale karboksylgruppen til B-kjeden, og W betyr histidin, asparginsyre, glysin, serin, threonin eller aspargin, med det forbehold at når W er asparagin, er R hydroksy; og når W er asparagin, både X og -Y-R er en threoninrest og E<3> er en glutaminrest, er ikke alle E<1>, E2 og E<*> glutaminsyrerester; med det videre forbehold at minst én av de seks aminosyrerester E<1>, E2, E3, E<4>, W og X er forskjellige fra de andre aminosyrerester som foreligger i de tilsvarende posisjoner i humaninsulin, og at minst én av de sju aminosyrerester E<1>, E<2>, E<3>, E\ W, X og Y og gruppen R er valgt slik at forbindelsen med formel I har minst én ladning mer enn humaninsulin ved en pH-verdi på 7.

I behandlingen av diabetes mellitus er mange varianter av insulinpreparater foreslått og brukt. Noen av preparatene er hurtigvirkende, og andre preparater har mer eller mindre lang-varige virkninger. En slik langvarig virkning kan oppnås ved å gi insulinet som en suspensjon av insulinkrystaller. De krystallinske preparater kan erholdes ved krystallisering av insulin i nærvær av sink (såsom "Lente", se Schlichtkrull: Insulin Crystals, Chemical and Biological Studies on Insulin Crystals and Insulin Zinc Suspensions, Munksgaard, 1958) eller ved krystallisering av insulin i nærvær av sink og protamin (såsom NPH-insulin, se Rep.Steno Mem.Hosp. 1 (1946), 60).

En ulempe ved bruken av de kjente suspensjoner av sink-insulinkrystaller eller av sinkprotamininsulin er nødvendigheten av å riste glasset for å sikre at den riktige mengde insulin injiseres og å sikre at konsentrasjonen av insulin i glasset forblir konstant mens det brukes. I "Penfill"-patroner som må være fri for luft, krever lengevirkende insulinsuspensjoner innføring av et fast legeme i patronen for å muliggjøre røring. Ristingen av insulinsuspensjoner og insulinløsninger med luft er i seg selv en uønsket prosess, da insulin har en tendens til å denaturere under dannelse av fibriller ved vann/luft-rense-flater. Følgelig ønskes løsninger av insuliner med langvarig virkning.

Løsninger av insulinderivater med en langvarig virkning ble oppnådd fra insulin som var blitt modifisert i sine aminogrupper ved omsetning med fenylisocyanat (såkalt isoinsulin, se Hallas-Moeller: Chemical and Biological Insulin Studies basert på reaksjonen mellom insulin og fenylisocyanat, København 1945).

På lignende måte ble Al,B29-di-Boc substituert insulin (Boe betyr tertiær-butyloksykarbonyl) rapportert å vise en langvarig insulinvirkning etter subkutan administrering (se Geiger & Enzmann i: Proinsulin, Insulin, C-peptide; Proceedings of the Symposium on Proinsulin, Insulin and C-Peptide, Tokushima 1978; Amsterdam-Oxford 1979, 306 - 310). Det Al,B29-di-Boc-substituerte insulin ble funnet å vise en litt for langvarig virkning til å være klinisk anvendelig.

Løsninger av ikke-modifiserte insuliner krever store mengder av sinkioner (f.eks. 0,4 - 1 mg/enhet insulin) for å gi langvarig virkning (se J. Pharmacol. 55. (1935), 206). Injeksjon av slike store doser av sinkioner vil sannsynligvis forårsake smerte, og slike løsninger har derfor aldri vært brukt i terapi.

Det isoelektriske punkt for insulin er ca. 5,5, og det er foretatt forsøk på å redusere løseligheten av insulinderivater ved nøytral pH ved å forskyve det isoelektriske punkt oppover, f.eks. gjennom tilføyelser i N-enden av B-kjeden av basiske aminosyrer såsom lysin eller arginin (se f.eks. tysk Offen-lequngsschrift nr. 2.042.299) eller med det basiske dipeptid arginyl-arginin (se Geiger & Enzmann sitert ovenfor). Imidler-tid, var løseligheten av ArgB("1)-ArgB0 nær dets isoelektriske punkt meget høyere enn for det opprinnelige insulin.

Japansk patentsøknad nr. 55-144032 vedrører analoge av humaninsulin hvor B30-aminosyren er blitt erstattet med en aminosyre med minst fem karbonatomer, og amider og estere derav. Disse insulinanaloge skulle brukes i pasienter som hadde utviklet antistoffer mot pattedyrinsuliner. I den japanske patentsøknad beskrives seks spesifikke forbindelser, hvorav ingen ble angitt å ha langvarig virkning. Ingen spesifikke injiserbare preparater er beskrevet i den japanske patentsøknad.

Europeisk patentsøknad nr. 84108442.9 vedrører insulinanaloge hvor en basisk, organisk gruppe' er knyttet til B30-aminosyren og innfører derved en positiv ladning ved nøytral pH. I disse analoge er B30-aminosyren nøytral, og fortrinnsvis treonin som i humaninsulin. Tysk patentsøknad nr. 3.327.709.5 vedrører en suspensjon av krystaller av derivatene som er beskrevet i den forutnevnte europeiske patentsøknad, samt en aromatisk hydroksy-forbindelse. Tysk patentsøknad nr. 3.326.473.2 vedrører et medikament som inneholder en blanding av insulinforbindelser, hvorav minst ett er beskrevet i den ovenfornevnte europeiske patentsøknad.

Europeisk patentsøknadpublikasjon nr. 194.864 som krever prioritet fra 12. mars 1985 vedrører insulinderivater hvori den C-terminale B3 0-rest alltid er blokkert med en amido- eller estergruppe, og hvori A21 aminosyren alltid er asparagin likesom i humaninsulin.

Den foreliggende oppfinnelse omfatter fremstilling av nye analoger av humaninsulin som adskiller seg fra humaninsulin ved: a) eventuelt nærvær av en amid- eller esterrest på den C-terminale karboksylgruppen til B-kjeden, b) med minst én ladning mer enn humaninsulin ved pH 7, fortrinnsvis ikke mer enn 4 ladninger mer enn humaninsulin ved

PH 7,

c) at den C-terminale asparaginresten i A-kjeden, Asn<*21>, kan være erstattet med enhver annen naturlig forekommende

aminosyre, som kan kodes for med nukleotidsekvenser,

d) hvis en forandring i ladningen oppnås ved å blokkere karboksylgruppen i B30 aminosyren, er A21 aminosyren forskjellig

fra en asparaginrest.

Forbindelsene med formel I kan foreligge i løsninger som eventuelt inneholder et kontrollerbart nivå av sinkioner. Forlengelsesgraden av insulinvirkning økes og kontrolleres derved.

Det er overraskende funnet at injiserbare løsninger med en kombinert kort og langvarig insulinvirkning kan fremstilles ved som aktiv bestanddel å bruke et eneste insulinderivat med den generelle formel I.

Sammenlignet med humaninsulin oppnås forandringen i ladning ved å erstatte treoninresten i B27-posisjonen med en arginin-eller lysinrest og/eller ved å erstatte enhver av de fire glutaminsyrerester i A4-, A17-, B13- og B21-stilling med en nøytral aminosyrerest, fortrinnsvis med en glutaminrest. I tillegg kan den C-terminale karboksylgruppen i B-kjeden blokkeres med en amidgruppe og derved fjerne den negative ladningen til karboksylgruppen.

Da forbindelser med formel I kan anvendes klinisk som løsninger med langvarig virkning, kan en reduksjon i immunogeni-sitet sammenlignet med de vanlige brukte suspensjoner av svine-eller humaninsuliner forekomme.

Forlengelsesgraden kan økes og kontrolleres ved tilsetning av sinkioner.

Hovedparametere som kontrollerer forlengelsesgraden av insulinvirkningen, er konsentrasjonen av sink, og valget av forbindelsen med formel I. Området for foretrukket sinkinnhold strekker seg fra 0 til 2 mg/ml, fortrinnsvis fra 0 til 200 jug/ml sink med erstatning i B13- og/eller B27-posisjonen og fortrinnsvis fra ca. 20 til 200 jig/ml med andre analoge i en fremstilling som inneholder 240 nmol av en forbindelse med formel I pr. ml. Ved å bruke andre konsentrasjoner av forbindelsen med formel I, må sinkinnholdet justeres tilsvarende.

Den forlengede virkning av løsninger av forbindelser med formel I i nærvær av sinkioner tilskrives slike forbindelsers lave løselighet ved nøytral pH.

pH-et i den injiserbare løsningen fremstilt bør fortrinnsvis være under den fysiologiske pH, og den øvre grense er den pH hvor utfelling opptrer. Ved den fysiologiske pH-verdi har forbindelser med formel I fremstilt ifølge denne oppfinnelse en lav løselighet. Stabile løsninger som inneholder ca. 240 nmol/ml forbindelser med formel I pr. ml er blitt oppnådd ved pH på ca. 5,5. Den øvre grense avhenger av bestanddelene i løsningen, f.eks. isotonikum, preserveringsmiddel og sinkkonsentrasjon, og av valget av forbindelse med formel I. Det er ingen lavere pH-grense for løsningene, og den kjemiske stabiliteten av forbindelsene med formel I, hvor W er forskjellig fra asparagin, er høy, selv ved pH 3. Det foretrukne pH-området for de injiserbare løsninger er fra ca. 2,5 til 8,5, enda heller fra ca. 4,5 til 8. Spesielt foretrekkes pH-områder på ca. 2,5 til 5,5, sterkest foretrukket er ca. 3 til 4,5.

En videre fordel ved denne oppfinnelse er at man får forbedret fleksibilitet for pasientene. Med to vandige løs-ninger, én som inneholder en forbindelse med formel I og den andre som inneholder et sinksalt, kan pasienten oppnå en ønsket grad av forlenget virkning og en ønsket profil ved å blande de to løsninger tilsvarende. Således har pasienten ved å bruke to stamløsninger muligheten for å velge en virkning og profil for morgeninjeksjonen og en annen virkning og profil for kvelds-injeksjonen. Fortrinnsvis inneholder sinkløsningen mellom ca. 2 Mg og 20 mg sink pr. ml. Alternativt kan begge stamløsningene inneholde sink, enten i samme eller forskjellige konsentrasjoner, og/eller begge stamløsnignene kan inneholde en forbindelse med formel I, enten den samme eller forskjellige forbindelser.

Fortrinnsvis har de injiserbare løsningene en styrke på mellom ca. 60 og 6000 nmol av forbindelsen med formel I pr. ml.

Særlig foretrukne forbindelser med formel I er

A17 . B27 , . ,. Gin /Arg <B27> human-insulin „, B13 _ B27 , ,. Gin ,Arg human insulin _, A17 „, B13 , ,. Gin ,Gln human insulin

» B2 7 , ..

Arg human insulin

B2 7 , ..

Lys <B27> human insulin AspA21,Ar<gB27>,Thr<B30->NH2 human insulin

. A21 . B27 _ B30

Asp <A21>/Arg <B27> ,Lys -NH2

human insulin

A21 . B2 7 _, B30 Gly /Arg ,Thr -NH2

human insu_lin TI . A21 B2 7 . , . His ,Arg human insulin „. A21 . B27 _, B30 M„ His /Arg ,Thr ~NH2

human insulin _, A21 . B27' B13 B30 Gly /Arg ,Gln ,Thr NH- human insulin

„ A21 . B27 B13 B30 Ser ,Arg ,Gln ,Thr NH_ human insulin

m. A21 . B27 B13 B30 Thr ,Arg ,Gln ,Thr NH_ human insulin

„ A21 _ B27 _, B30 „„ Ser ,Arg ,Thr -NH2~ human insulin

humaninsulinmolekylet forandres uten at insulinaktiviteten redusrees merkbart innbefattet noen rester som påvirker molekylets isoelektriske punkt.

I de kjente tofåsers insulinpreparater er det vanlig å kombinere hurtigvirkende oppløselig insulin med lengevirkende krystallinsk insulin i den samme injeksjon. Ved å bruke forbindelser med formel I fremstilt ifølge denne oppfinnelse kan en lignende kombinert kort og lang virkning oppnås med en løsning av en eneste forbindelse med formel I. Forholdet mellom kort og langvarig virkning avtar når konsentrasjonen av sinkioner i løsningen økes.

Forbindelser med formel I fremstilles ifølge oppfinnelsen ved at man transpeptiderer et insul inf orstadium med den generelle formel II: hvor A og B angir fragmentene til A- og B-kj edene som er angitt med tallene i parenteser, Q er en peptidkjede med q aminosyrer, q er et heltall fra 0 til 33, T er Lys eller Arg, og r er 0 eller 1 og E<1>, E2, E<3>, E<4>, W og X er hver som forut definert, med en forbindelse med den generelle formel III:

hvor Y og R hver er som ovenfor definert, og hvor sidekjedeaminogruppene og hydroksygruppen i Y eventuelt er blokkert med amino- og hydroksybeskyttelsesgrupper ved bruk av trypsin eller et trypsinlignende enzym som katalysator.

Blant trypsinlignende enzymer er lysylendopeptidase fra Achromobacter lyticus anvendelig.

Forbindelsen med formel II kan uttrykkes i en verts-organisme såsom en gjær i likhet med beskrivelsen i publisert europeisk patentsøknad nr. 163.529 ved å bruke et gen med de korrekte kodoner for de aktuelle aminosyrer. Genet som koder for det nye insulinderivat innsettes deretter i en passende ekspresjonsvektor, som etter overføring til gjær er i stand til å uttrykke den ønskede forbindelse. Det uttrykte produkt isoleres deretter fra cellene eller suppekulturen avhengig av om den er utskilt fra cellene eller ikke.

Et eksempel på en reversibel aminobeskyttende gruppe er tertiær butoksykarbonyl, og en reversibel hydroksybeskyttende gruppe er tertiært butyl. Slike grupper fjernes under betingelser som ikke forårsaker uønskede forandringer i forbindelsen med formel I, f.eks. med trifluoreddiksyre.

Forandringer i A4, A17, A21, B13, B21 eller B27-posisjonen kan lett innføres ved genespleising, hvoretter det gjenstår for trypsinkatalysert semisyntese å innføre den ønskede C-terminale rest i B-kjeden.

Fordelen ved å innføre de ytterliere positive ladninger i rammen av de 51 aminosyrer i insulinmolekylet for å danne de nye forbindelser med formel I i stedet for ved forlengelse av B-kjeden utover 30 rester i pattedyrsinsulinene, ligger i at det er lett å fremstille dem. I den semisyntetiske transpeptidering anvendes et stort molart overskudd av aminosyreamidet eller aminosyreesteren. Hvis et dipeptidamid eller ester skulle brukes i transpeptideringsreaksjonen, er enten pris eller oppløseligehet eller begge hindrende for bruk i stort overskudd, og følgelig blir utbyttet av produktet lavere. Selv når det samme ekvimolare overskudd av f.eks. Lys(Boc)-NH2 eller Lys(Boe)-Lys(Boc)-NH2 brukes i transpeptideringsreaksjonen under lignende betingelser, blir utbyttet av aminosyreamidet betydelig høyere enn med dipeptidamidet.

Insulinpreparater fremstilles ifølge denne oppfinnelse ved å oppløse en forbindelse med formel I i et vandig medium ved svakt sure betingelser, f.eks. i en konsentrasjon på 240 eller 600 nmol/ml. Det vandige medium gjøres isotonisk, f.eks. med natriumklorid, natriumacetat eller glyserol. Videre kan det vandige medium inneholde sinkioner i konsentrasjoner på opptil ca. 30 fig Zn<++> pr. nmol forbindelse med formel I, buffere såsom acetat, citrat og histidin og preserveringsmidler såsom m-kresol, nipagin eller fenol. pH-verdien til det ferdige insulinpreparat avhenger av antallet ladninger som er blitt endret i forbindelse med formel I, konsentrasjonen av sinkioner, konsentrasjonen av forbindelsen med formel I og forbindelsen med formel I som velges. pH-verdien justeres til en hensiktsmessig verdi for administrering såsom ca. 2,5 - 4,5, som forhindrer utfelling. Insulinpreparatet gjøres sterilt ved steril fil-trering .

Insulinpreparatene fremstilt gjennom denne oppfinnelse brukes på lignende måte som de kjente insulinpreparater.

Ethvert nytt trekk eller kombinasjon av trekk som her er beskrevet anses vesentlig for denne oppfinnelse.

Her er forkortelsene som brukes for aminosyrene dem som er angitt i J.Biol.Chem. 243 (1968), 3558. Aminosyrene som her er angitt foreligger i L-form. I formel I og her for øvrig er A(l-3) Gly-Ile-Val, A(5-6) er Gln-Cys osv., jfr. aminosyresekvensen i humaninsulin. Med mindre annet er angitt, er typene av insuliner som her er angitt humane.

Syntese av insulinforbindelsene

Insulinkilden var et insulinforstadium uttrykt i gjær som er beskrevet i publisert europeisk patentsøknad nr. 163.529.

Insulinforstadiene ble utvunnet fra fermenteringssupper ved adsorpsjon på "LiChroprep"RP-18 som beskrevet i eksempel 7 i den samme europeiske patentsøknad. Forstadiene ble eluert fra kolonnen med 0,2 M KC1, 0,001 M HC1 i 33 volum-% etanol. Insulinforstadiene ble krystallisert fra det sammenslåtte ved suksessive tilsetninger av vann (1 volumdel pr. volumdel sammen-slått) , fast trinatriumcitrat for å oppnå en molaritet på 0,05 M og til slutt sinkacetat for å oppnå en molaritet på 0,006 M. pH-verdien ble justert til 6,8 og blandingen fikk stå natten over ved 4°C. Krystallene ble isolert ved sentrifugering, vasket med vann og tørket i vakuum.

Beskyttede aminosyrer og beskyttede peptider for enzymatisk semisyntese ble enten fremstilt ved standardmetoder eller kjøpt (kundesyntese) fra enten Nova Biochem eller Bachem, begge Sveits.

I utgangsmaterialene i eksempel 1 til og med 14 ble (Qq-T)r med formel II valgt som Ala-Ala-Lys og konstruert som beskrevet for gjærplasmid pMT610 i eksmpel 10 i publisert europeisk patentsøknad nr. 163.529. Nukleotider som koder for Gln<B13>, GlnA1<7>, Arg<B27>, Lys<B27>, Asp<*21>, Gly<*21>, His<*21>, Ser<*21> og Thr<*21> ble substituert i pMT610 ved setespesifikk mutagenese ved bruk av fremgangsmåten i Nucl.Acids.Res. 11 (1983), 5103 - 5112.

Eksempel 1

Syntese av GlnB13, ArcrB27 humaninsulin

Til en suspensjon av 5 g GlnB13,ArgB27,B(l-29) -Ala-Ala-Lys-A(l-21)-insulinforstadium i 50 ml 2 M Thr-OBu<*>,CH3COOH (L-treonin tert.butylester, hydroacetatsalt) i DMF, satte man 25 ml 25,5 volum-% vann i DMF (25,5 ml vann, DMF til å fylle opp til 100 ml). Suspensjonen ble avkjølt til 12°C under røring. En løsning av 0,5 g svinetrypsin i 12,5 ml av en 0,05 M vandig løsning av kalsiumacetat ble tilsatt. Røringen fortsatt inntil oppløsning. Etter 48 timer ved 12°C ble proteinene utfelt ved å helle blandingen i 600 ml aceton. Fellingen ble isolert ved sentrifuger ing, vasket en gang med 200 ml aceton, isolert ved sentrifugering og tørket i en strøm av nitrogen. Fellingen ble opp-løst i 100 ml 0,04 N saltsyre, pH-verdien ble justert til 2,5 og løsningen ble satt på en 5 x 30 cm preparativ høytrykksvæske-kromatografi (heretter kalt HPLC) kolonne pakket med kiselgel-partikler substituert med oktadecyldimetylsilyl (midlere partikkelstørrelse 15 mikron, porestørrelse 100 Ångstrøm). Kolonnen ble ekvilibrert med etanol/0,3 M vandig løsning av kaliumklorid, 0,001 N saltsyre i et forhold på 35,5/64,5 (volumdeler). Proteinene ble eluert fra kolonnen med den samme buffer ved en hastighet på 2 l/time.

GlnB1<3>,Arg<B27>,Thr<B30->OBu<t> humaninsulin ble funnet i en topp som kom ut fra kolonnen mellom 55 og 100 min.. Gln<B13>,Arg<B27>, Thr<30->OBu<t >humaninsulin ble isolert fra det sammenslåtte ved suksessive tilsetninger av vann til å gjøre etanolkonsentrasjonen 15 volum-%, fast trinatriumcitrat til å oppnå en molaritet på 0,05 M med hensyn til citrat og fast sinkklorid for å oppnåd en molaritet på 0,006 M med hensyn til sink. pH-verdien ble justert til 6,8, og etter 1 time ved romtemperatur fortsatte krystalliseringen ved 4°C i 24 timer under røring. Krystallene ble sentrifugert ned, vasket to ganger med 20 ml iskaldt vann, sentrifugert ned og tørket i vakuum. Utbytte: 2,51 g GlnB13,Arg<B27>,Thr<B30->OBu<t >humaninsulin.

GlnB13,Arg<B27>,Thr<B30->OBu<t> humaninsulin ble oppløst i 100 ml trifluoreddiksyre og fikk stå 2 timer ved romtemperatur. Trifluoreddiksyre ble fjernet ved frysetørking. Det fryse-tørkede produkt ble oppløst i 100 ml vann, pH-verdien justert til 2,5 og 20 g natriumklorid ble tilsatt. Saltkaken som bestod av GlnB13, Arg<B27> humaninsulin ble isolert ved sentrifuger ing. Saltkaken ble oppløst i 850 ml vann og GlnB13,Arg<32>7 humaninsulin ble krystallisert ved suksessive tilsetninger av 150 ml etanol, 14,7 g trinatriumcitratdihydrat og 0,82 g sinkklorid etterfulgt av justering av pH-verdien til 6,8. Etter 1 time ved romtemperatur fortsatte krystalliseringen ved 4°C i 24 timer under forsik-tig røring. Krystallene ble sentrifugert ned, vasket to ganger med 20 ml iskaldt vann, sentrifugert ned og tørket i vakuum. Utbytte: 1,71 g GlnB13,ArgB27 humaninsulin, tilsvarende 36%.

Aminosyresammensetningen var i overensstemmelse med det teoretiske, idet arginin var 2 rester/molekyl. Produktet var rent i DISC PAGE elektroforese, idet vandringshastigheten er 55% av humaninsulinet tilsvarende en forskjell i ladninger på ca. 2. For detaljer for DISC PAGE elektroforese se Horm.Metab.Res. Supplement Series No. 5 (1974), 134. Innholdet av sink i krystallene var 0,42 vekt-%.

Eksempel 2- 6

Syntese av GlnB1<3>,GlnA1<7> humaninsulin, GlnA17,Arg<B27> humaninsulin, ArgB2<7> humaninsulin, Lys<B27> humaninsulin og His<*>21,ArgB27 humaninsulin

De 5 tittelforbindelser ble syntetisert fra de tilsvarende enkeltkjedete insulin-forstadier, nemlig

GlnB1<3>, Gln<A17>, B (1-29) -Ala-Ala-Lys-A (1-21) ,

GlnA17,ArgB27,B(l-29) -Ala-Ala-Lys-A(l-21) ,

ArgB27,B(l-29) -Ala-Ala-Lys-A(l-21) ,

LysB27,B(l-29) -Ala-Ala-Lys-A(l-21) og

His*21, Arg827, B( 1-29) -Ala-Ala-Lys-A(l-21) , ved bruk av metodene som er beskrevet i eksempel 1. Utbytter, ladninger i forhold til humaninsulin, vandringshastigheter i forhold til insulin i DISC PAGE elektroforese ved pH 8,9 og avvik i aminosyresammensetninger fra humaninsulin fremgår av tabell I, nedenunder.

Eksempel 7- 13

Syntese av Asp*21,ArgB27,Thr<B30->NH2 humaninsulin,

Gly*21, Arg<B>27, Thr<B30->NH2 humaninsul in,

His*21, Arg<B27>, Thr^-NHj, humaninsul in,

Gly<*21>,Ar<g>B<27>, Gln<B13>,Thr<B30->NH2 humaninsulin,

Ser*21,Ar<g>B<27>, Gln<B>13, Thr<B30->N<H>2 humaninsulin,

Thr^SArg^Gln^Thr<830->!^ <h>umaninsulin og

Ser* 21, ArqB27, Thr^- NH, humaninsulin

De 7 tittelforbindelser ble syntetisert fra de tilsvarende enkeltkjedede insulinforstadier, nemlig

Asp*21,ArgB27,B(l-29) -Ala-Ala-Lys-A(l-21) ,

Gly*21, ArgB27, B (1-2 9) -Ala-Ala-Lys-A (1-21),

His*21,ArgB27,B(l-29) -Ala-Ala-Lys-A(l-21) ,

Gly*21, Arg<B27>, GlnB1<3>, B (1-29) -Ala-Ala-Lys-A (1-21) ,

SerA21,ArgB27,GlnB13,B(l-2 9) -Ala-Ala-Lys-A(1-21) ,

Thr*21, Arg<B27>, GlnB13, B (1-29) -Ala-Ala-Lys-A (1-21) og

Ser*21, ArgB27,B( 1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21) med trypsintranspeptidering i organisk vandig løsning i nærvær av Thr-NH2 som beskrevet i publisert europeisk patentsøknad nr. 194.864, eksempel 4 og 6. Utbytter, ladninger i forhold til humaninsulin, vandringshastigheter i forhold til insulin i DISC PAGE elektroforese ved pH 8,9 og avvik i aminosyresammensetninger fra humaninsulin fremgår fra tabell I.

Eksempel 14

Syntese av Asp* 21, Arg827 , LvsB3°- NH? humaninsulin

Tittelforbindelsen ble syntetisert fra det tilsvarende enkeltkjedede insulinforstadium, nemlig Asp*21, ArgB27, B( 1-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) ved trypsintranspeptidering i organisk vandig løsning i nærvær av Lys(Boe)-NH2, rensing av mellomproduktet, Lys (Boe) B30-NH2 humaninsulin, etterfulgt av fjerning av Boc-beskyttelsesgruppen med TFA som beskrevet i publisert europeisk patentsøknad nr. 194.864, eksempel 5 og 7. Utbytte og analytiske data er vist i tabell I.

Eksempel 15

Fremstilling av injiserbare løsninger av forbindelser med formel I

Sterile injiserbare løsninger av forbindelsene med formel I for utprøving av graden av forlenget virkning ble foretatt ved å bruke 1,6% (vekt/volum) glyserol som isotonikum, bruke 0,3%

(vekt/volum) m-kresol som preserveringsmiddel og etter bufring med 0,01 M natriumacetat. Konsentrasjonen av sinkioner var 8 eller 80 fig/ ml. Løsningenes pH-verdier ble justert tilstrekke-lig fra det isoelektriske punktet for forbindelsene med formel I til å holde løsningene klare etter lagring ved 4°C. Løsningene inneholdt 240 nmol/ml av forbindelsene med formel I. Konsentrasjonen på 240 nmol/ml ble funnet ved måling av absorpsjonen ved 276 nm for en mer konsentrert stamløsning uten m-kresol, ved å bruke den molare ekstinksjonskoeffisient for svineinsulin på 6100 for disse derivater (se Handbuch der Inneren Medizin, Vo.

7/Part 2A, Editor: Oberdisse, 1975, 113). For enkomponentsvine-insulin er den fastlagte styrke 28,5 enheter/mg tørrsubstans (se Diabetes Care, Vol. bind 6, tillegg 1 (1983), 4), nemlig 1 enhet tilsvarer 5,95 nmol.

Injiserbare løsninger som inneholder 240 nmol/ml av forbindelsene med formel I angitt i tabell II og med pH-verdier og innhold av sink angitt deri ble fremstilt.

Prøve på forlengelsen av insulinvirkning

Forlengelsen av den hypoglykemiske virkning frembrakt med de injiserbare løsninger av insulin ble undersøkt ifølge British Pharmacopoeia 1980, A 142, i fastede kaniner. Hver forsøksløs-ning ble gitt subkutant i en dose på 14,3 nmol pr. kanin til 12 dyr som veide 3 - 4 kg, og hypoglykemiforløpet ble fulgt i 6 timer. Til sammenligning ble det hurtigvirkende preparat, "Actrapid" svineinsulin og det som mellomprodukt virkende "Monotard" humaninsulin inntatt i forsøkene. Resultatene av undersøkelsene er vist i tabell II.

Styrkene av insulinforbindelsene ble målt i museblodsukker-mangelprøven (British Pharacopoeia 1980, A 141 - A142). For å minimalisere problemet og måle insulinets styrke med en forskjellig timeing fra standarden, ble insulinløsninger for styrkebestemmelser forberedt uten tilsetninger av sink. Løsningene ble fremstilt med et innhold på 240 nmol/ml basert på absorpsjonen ved 276 nm. Sinkinnholdet til løsningene var 8-10 Mg/ml som stammet fra de krystallinske derivater. De målte styrker for noen insulinforbindelser er vist i tabell III nedenunder.

Claims

1. Analogifremgangsmåte ved fremstilling av forbindelser med den generelle formel I hvor bokstavene A og B etterfulgt av tall i parentes angir peptidfragmentene for A- og B-kjedene, hhv., angitt med tallene i parenteser, E<1>, E2, E3 og E4 er de samme eller forskjellige og betyr hver glutaminsyre eller glutamin, X betyr en L-treonin-, L-arginin- eller L-lysinrest, Y betyr threonin eller lysin, og R betyr hydroksy eller en amidorest som blokkerer den C-terminale karboksylgruppen til B-kjeden, og W betyr histidin, asparginsyre, glysin, serin, threonin eller aspargin, med det forbehold at når W er asparagin, er R hydroksy; og når W er asparagin, både X og -Y-R er en threoninrest og E<3> er en glutaminrest, er ikke alle E<1>, E2 og E4 glutaminsyrerester; med det videre forbehold at minst én av de seks aminosyrerester E<1>, E<2>, E<3>, E<4>, W og X er forskjellige fra de andre aminosyrerester som foreligger i de tilsvarende posisjoner i humaninsulin, og at minst én av de sju aminosyrerester E<1>, E<2>, E<3>, E<4>, W, X og Y og gruppen R er valgt slik at forbindelsen med formel I har minst én ladning mer enn humaninsulin ved en pH-verdi på 7, karakterisert ved at man transpeptiderer et insulinforstadium med den generelle formel II: hvor A og B angir fragmentene til A- og B-kjedene som er angitt med tallene i parenteser, Q er en peptidkjede med q aminosyrer, q er et heltall fra 0 til 33, T er Lys eller Arg, og r er 0 eller 1 og E<1>, E<2>, E<3>, E\ W og X er hver som forut definert, med en forbindelse med den generelle formel III: hvor Y og R hver er som ovenfor definert, og hvor sidekjedeaminogruppene og hydroksygruppen i Y eventuelt er blokkert med amino- og hydroksybeskyttelsesgrupper ved bruk av trypsin eller et trypsinlignende enzym som katalysator.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1 ved fremstilling av A17 . B27 .. ,. Gin ,Arg <B27> human-insulin „, B13 . B27 .. ,. Gin ,Arg human insulin _, A17 B13 , ,. Gin ,Gln human insulin a B27 u 1' Arg human insulin t B27 , .. Lys human insulin A21 „ B2 7 m. B30 „tT Asp ,Arg ,Thr -NH2 human insulin . A21 . B27 _ B30 XTU Asp ,Arg ,Lys -NH2 human insulin A21 . B27 B30 „„ Gly ,Arg ,Thr -NH2 human insulin HisA2"1", ArgB27 human insulin HisA<21>,Arg<B27>,Thr<B30->NH2 human insulin « A21 . B27' ^, B13 B30 Gly ,Arg ,Gln ,Thr NH_ human insulin o A21 , B27 . B13 „, ^630 Ser #Arg ,Gln ,Thr NH_ human insulin Thr<A21>,Arg<B27>,Gln<Bl3>,Thr<B3>°-NH_ human insulin „ A21 . B27 B30 MU Ser ,Arg ,Thr -NH2~ human insulin karakterisert ved at man anvender tilsvarende substituerte utgangsmaterialer.