JPS6314694A

JPS6314694A - トロポエラスチンのｃＤＮＡ

Info

Publication number: JPS6314694A
Application number: JP15865586A
Authority: JP
Inventors: Takeji Nishikawa; 武二西川; Shingo Tajima; 多島　新吾; Ichirou Tokimitsu; 一郎時光; Masahiro Tajima; 正裕田島; Toshio Fukazawa; 深沢　俊夫
Original assignee: Kao Corp; Shiseido Co Ltd
Current assignee: Kao Corp; Shiseido Co Ltd
Priority date: 1986-07-08
Filing date: 1986-07-08
Publication date: 1988-01-21
Anticipated expiration: 2011-07-03
Also published as: JP2512436B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明はエラスチンの前駆体蛋白質トロポエラスチンを
コードするｃＤＮＡ断片に関し、さらに詳しくはニワト
リのトロポエラスチンをコードするｃ、　ｌ）　Ｎ　Ａ
断片に関する。

（従来の技術および発明が解決しようとする問題点）エラスチン（成熟エラスチン）は、コラーゲンや酸性ム
コ多糖などと同様に動物の結合組織の一成分であり、肺
、大動脈、靭帯、皮膚などの弾力性を有する臓器に存在
している。これらのエラスチンは、複雑な架橋構造をも
つ分子量数十万以上の高分子蛋白質であるため、水に不
溶性であり、抽出、純化がむずかしい。一般に、エラス
チンの抽出・分離は、組織を強アルカリで処理したり、
高温で処理するなど苛酷な条件で抽出を行ない、エラス
チンを分解物として分聞１する方法が行なわれている。

エラスチンを比較的高分子で得る方法としては、Ｐａｒ
ｔｒｔｄＰ、ｃらの熱シュウ酸処理法（Ｐａｒｔｒｉｄ
ｇｅ等、Ｂｉｏｃｈｅｎ＋、Ｊ、６１，１１．１９５５
）が知られており、水溶性蛋白質としてα−エラスチン
［分子量約７０ＫＤａ　　（キロダルトン）１とβ−エ
ラスチン〔分子量約１０Ｋｐａ以下］とが得られている
。最近ではα−エラスチンを用いたエラスチンの生理作
用の研究も進められており、動脈硬化の要因となる血小
板の凝集を阻害する機能をα−エラスチンが持つことが
明らかになってきている。

トロポエラスチンは、エラスチン蛋白質の前駆体である
。伝令１？ＮＡから１訳された直後の水溶性蛋白質であ
る。成熟エラスチンと異なり、デスモシン、イソデスモ
シン、リジノノルロイシンを残基として含有−Ｕず、ま
たそれら番、二よる架橋も形成していない。生体からの
トロポエラスチンの分離は、非常にむずかしく、架橋形
成酵素を阻害するために銅欠乏食餌を与えた幼若動物の
組織から分離する方法（Ｓｍｉｔｈ；Ｄ、Ｗ、等、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｍ、３１，３０９．’１９６８）が
知られているが、単離できるトロポエラスチンは非常に
微量である。

このため、トロポエラスチンの分子構造等の研究はなか
なか進まず、分子量、アミノ酸組成が明らかになった程
度であり、アミノ酸配列は未だ明らかにされていない。

本発明の目的は、トロポエラスチンの構造をＤＮＡレベ
ルで解明し、発現ベクターを用いてトロポエラスチンを
産生ずるために必要なＣＤＮＡ断片を捉供することにあ
る。

゛　　〔問題点を解決するための手段〕前記の目的は、
本発明によるトロポエラスチンをコードするｃＤＮＡ断
片によって達成することができる。

以下、本発明を更に詳細に説明する。

まず、本発明に係るｃＤＮＤＮＡの作製方法の一例を示
す。

ニワトリにおいて、エラスチンを多クツ１：産する組織
（以下プラス組織ということがある）例えばニワトリの
大動脈をグアニジルヂオシアネートとともにホモジナイ
ズすることにより細胞を破砕し、塩化セシウム平衡密度
匂配超遠心分離によりＲＮＡ盆画を得る。続いてオリゴ
（ドロ！ル１：１−スを担持したアフィニティークロマ
トグラフィーにより、前記ＲＮＡ分画からポリ八を１．
１っＲＮＡ（ポリＡ＋ＲＮＡ）を単離する。

このポリ／Ｍ　ＲＮＡを鋳型として使用し、公知の方法
、好ましくは岡山用１ａ　ｒ　Ｉ＋の方法（Ｍ（Ｉ　Ｉ
　、　Ｃｏ　Ｉ　１゜Ｂｉｏ＋、２．１６１１９８２）
によって、（：　ｌ）　Ｎパライフ゛ラリ−を得る。岡
山−ＲｃｒＢの方法む、１以ドのように実施する。すな
わち、岡山−ＩｌａｒＨの・ベクターのポリ１゛部分に
ポリＡ″ＲＮＡのポリ八部分を吸着さ・ｌ、逆転写酵素
を反応させて、ｃ：　ｌ）　Ｎ　Ａを合成する。

ターミナルデオキシヌクレオチジルＩ・ランスフェラー
ゼでオリゴｄＣをｃＤＮへの３′未満に付加した後、制
限酵素旧ｎｄｌｉ［でベクターＤＮＡを切断する。オリ
ゴｄＧリンカ−を連結してからベクターを環状化した後
、ＲＮＡ部分をＤＮＡポリメラーゼでＤＮＡに置換し、
ｃ”　Ｄ　Ｎ　Ａ含有プラスミドを得る。これらのプラ
スミドを用いて、塩化カルシウム法（Ｓｔｒｉｋ、Ｐ；
等、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１３８．１０３３゜１９
７９）などの方法により大腸菌を形質転換する。

アンピシリン添加平板培地にてアンピシリン耐性株を選
択することにより、プラスミド受容菌を取得する。

一方、前記のプラス組織すなわちエラスチンを多く生産
する組織と、エラスチンをあまり生産しない組織（以下
、マイナス組織ということがある）例えばニワトりめ皮
膚を用意し、それぞれの細胞から」二連の方法などによ
ってポリＡ”ＲＮＡを単離する。ポリヌクレオチドキナ
ーゼとＴ　３２ｐＡＴＰとを用いてＲＮＡの５′ＯＨを
３２ｐでラベルし、これをプローブとする。　　　　　
　□次に、コロニーハイブリダイゼーション法（ｌｌａ
ｎａｈａｎ、　Ｄ、等、　Ｇｅｎｅ、　１０．６３．１
９８０）により、上述のｃＤＮＡライブラリーの中から
プラス組織由来のプローブと相補性があり、しかもマイ
ナス組織由来のプローブと相補性がない二重ｌニーを選
択する。

こうして選択した二相」ニーからプラスミドＤＮＡを取
得し、ジデオキシヌクレオチド法（Ｍｅｓｓｉｎｇ＋Ｊ
、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ｒ！ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１
０＋、２０．１９８３）などにより、塩基配列を決定す
る。塩）ｌ配列からアミノ酸配列を推定し、そのアミノ
酸配列の中にエラスチン特有のアミノ酸配列が存在する
ことを確かめ、得られたｃＤＮＡクロージがトロポエラ
スチンをコードするｃＤＮＡであることを確認する。

本発明に係るｃＤＮＡ断片はトロポエラスチンをコード
するｃＤＮＡ断片であり、塩基配列に相当するアミノ酸
配列としてトロポエラスチンをコードする。その−例を
第１図に示すが、本発明に係るｃＤＮＡ断片は必ずしも
一定の塩基数を有するもので′はない。

本発明に係るｃＤＮ・Ａ断片は適当なプロモーターの下
流に連結することにより、大腸菌、枯草菌、酵母、動物
細胞等で、ｃＤＮ入断片を鋳型とする翻訳によりトロポ
エラスチンを生産することができる。

生産したトロポエラスチンは、血小板凝集阻害剤などと
して動脈硬化の予防、改善に利用することができる。

〔実施例〕

次に実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。

炎上（１）　　ニワトリの１５日１ｓ０個より心臓周辺の大
動脈を分離し、液体窒素で破砕した後、グアニジウムチ
オシアネート水溶液を添加し、ホモジナイズした。得ら
れたホモジネートをＣｈｉｒｇｗｉｎらの方法（Ｃｈｉ
ｒｇｗｉｎ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１Ｂ、　５２９４．
１９７９）に従って塩化セシウム平衡密度匂配超遠心分
離することにより、ＲＮＡを分離した。オリゴｄＴセル
ロース（ファルマシア社製、タイプ７）を担持するアフ
ィニティークロマトグラフィーにより、前記ＲＮＡ分画
からポリＡを持つポリＡ”　ＲＮＡを単離した。

（２）市販の岡山−ハーグのベクターを用いたｃＤＮＡ
クローニンクシステム（アマジャム社製）によりｃＤＮ
Ａライブラリーを作製した。

すなわち、トリス塩酸ｕ１衝液（ｐＨ８，３）　、塩化
マグネシウム、塩化カリウム、ジチオスレイトール、ｄ
ＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ及びα−３２ｐｄＣＴＰを
含む水溶液に、上記（１）で得られたポリＡ”　ＲＮＡ
約１０８ｇと岡山−ハーグのベクタープライマー約５μ
ｇとを加え、逆転写酵素（生化学工業社製）の存在下で
、３７℃で３０分間逆転写反応を行なった。合成された
ｃＤＮＡを含むベクタープラスミドをエタノール沈澱に
より回収した。この沈澱を乾燥した後、トリス塩酸緩衝
液（ｐｌ＋　６．９）、カコジル酸す１−リウム、塩化
コバルト、ジチオスレイトール、ウシ血清アルブミン及
びα−３２ＰｄＣＴＰを含む水溶液に溶解し、ウシ胸腺
由来のターミナルチオ−１−シヌクレオチジルトランス
フエラーゼを添加し、３７℃で３０分間反応させ、末端
あたり約１５〜３０残Ｊ、％のオリゴシトシンをｃＤＮ
Ａに付加した。得られたｃＤＮＡ含有ベクターを制限酵
素旧ｎｄｌｌＩで消化した後、エタノール沈澱により、
オリゴシトシン付加ｃＤＮ’Ａ含有ベクターを回収した
。

市販のオリゴｄＧテールリンカ−ＤＮＡを含む緩衝液（
トリス塩酸ｐＨ８，６、塩化マグネシウム、ＥＩ）ＴＡ
、ＮＡＤ、硫酸アンモニウムを含む）に上記オリゴシト
シン付加ｃＤＮＡ含有ベクターを溶解し、大腸菌ＤＮＡ
リガーゼを加えて、１６℃で１５時間反応させた。その
後、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ＮＡＤ
、大腸菌ＤＮＡリガーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ、
大腸菌ＲＮａ５ｅ　Ｈを加え、室温で１時間反応させ、
ｃＤＮＡ含有プラスミドを得た。

得られたプラスミドを用い、塩化カルシウム法（Ｍａｎ
ｄｅｌ等、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、５３，１５９．１９
７０）に従って、大腸菌Ｍ２Ｓ株を形質転換し、アンピ
シリン３０μｇ　／　ｍ　ｌを含むＬＢ培地で生育する
アンピシリン耐性株を取得した。

（３）　　上記ｉｌｌに示した方法と同様にして、ニヮ
トすの１５日卯の皮膚組織からポリＡ″ＲＮＡを単離し
た。このポリＡ”　ＲＮＡとに記（１１で得られたポリ
Ａ”　ＲＮＡとを、゛それぞれ、ｐＨ８，０のトリス塩
酸緩衝液中で大腸菌゛ｒルカリフォスファターゼ処理（
２５℃１時間）して５′末端のリン酸をはずし、酵素を
失活さ一１！た後、′Ｉ゛４ポリヌクレオチドキナーゼ
と、ｒ−”＋１−ＡＴ＋）とを添加し、１時間で３７℃
でリン酸化反応をし、３２ｐラヘルボリＡ”　ＲＮＡ　
（プローブ）を１ｉｔた。

（４）上記（３）で得られたプＩ′Ｊ・−ゾを用いて、
上記（２）で得られた形質転換株について、Ｉｔ　ａ　
ｎ　ａ　ｈ　ａ　ｎ　らの方法（Ｈａｎａｈａｎ　１１
．笠、Ｇａｎｅ、　１０，６．’１．１９８０）に従っ
てコロニーハイブリダイゼーシテ１ンを行なった。大動
脈由来のプローブに相補性を小し７、しかも皮膚由来の
プローブに相補性を示さないコロニーを選択したところ
、１０００：目′に一のうち６個のクローンが得られた
。これらのクローンからプラスミドＤＮＡを抽出し、制
限酵素Ｐｖｕｌｌによる制限酵素地図を作成したところ
、３つのクローンについては、共通のＤＮＡ断片が見ら
れた。この共通のＤＮＡ断片をもつｃＤＮＡについて、
Ｍ１３ｍｐＨファージを用いたジデオキシヌクレオチド
酵素法（Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｊ、Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　ｕ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ、１０１＋Ｐ２０゜＾ｃａ
ｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、１９８３）に従ってＤＮＡ塩
基配列を決定した。こうして決定したｃＤＮＡの塩基配
列及びそれより想定されるアミノ酸配列を第１図に示し
た。第１図に示すアミノ酸配列中には、エラスチン特有
のアミノ酸配列として知られているβ−シート構造を形
成するペンタペプチド（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａ
ｌ−Ｇｌｙ；第１図で下線を付けて示す）及び架橋形成
周辺配列（第１図で箱で囲んで示す）がそれぞれ複数存
在した。従って、得られたｃＤＮＡがトロポエラスチン
のｃＤＮＡであることを示していた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に係るｃＤＮＡ断片の塩基配列及びそれ
から想定されるアミノ酸配列を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

１、トロポエラスチンをコードするｃＤＮＡ断片。