CN113072622A - 一种选择性降解肿瘤细胞膜上pd-l1蛋白的多肽与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药及制药技术领域,尤其涉及一种选择性降解肿瘤细胞膜上PD‑L1蛋白的多肽与应用。本发明所述多肽可以通过肿瘤细胞外过表达的ALP作用下发生酶促原位自组装,且多肽分子中存在可特异性结合PD‑L1的DPPA‑1序列,使得自组装后的多肽纳米纤维可以选择性地结合肿瘤细胞膜上PD‑L1来模拟其部分变性状态,将其一并内吞进细胞后通过蛋白酶体途径被降解,从而有效降解肿瘤细胞膜上PD‑L1蛋白,解除肿瘤细胞对免疫系统的控制,为肿瘤免疫治疗药物的制备提供新的思路。
Description
技术领域
本发明涉及医药及制药技术领域,尤其涉及一种选择性降解肿瘤细胞膜上PD-L1蛋白的多肽与应用。
背景技术
免疫疗法已成为继手术、放疗和化疗之后的第四种肿瘤治疗手段,特别是针对免疫检查点分子的治疗在肿瘤的临床治疗上获得了非常积极的治疗效果。在众多免疫疗法的相关研究之中,以T细胞为基础的PD-1(细胞程序性死亡受体1)/PD-L1(细胞程序性死亡配体1)免疫检查点通路被认为是扩展免疫疗法的支柱,获得了极其广泛的关注。此前的研究表明,肿瘤细胞中PD-L1的过表达会增强肿瘤的生存能力和转移能力,从而导致肿瘤的免疫逃逸。肿瘤细胞会通过PD-1/PD-L1通路进行免疫抑制以实现局部生长,完成肿瘤的转移复发过程。因此,阻断PD-1/PD-L1免疫轴在阻止肿瘤免疫逃逸的过程中承担着重要角色,将其作为癌症治疗靶点具有坚实的理论基础。目前尚未见研究利用小分子来控制肿瘤细胞膜上PD-L1的表达水平,用于肿瘤的免疫药物的制备中。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种利用小分子控制肿瘤细胞膜蛋白的表达水平,从而应用于肿瘤免疫药物的制备中。具体的为一种选择性降解肿瘤细胞膜上PD-L1蛋白的多肽与应用。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一种可选择性降解肿瘤细胞膜上PD-L1蛋白的多肽,所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。
作为优选,所述SEQ ID NO.1的氨基酸的结构式为:
作为优选,所述SEQ ID NO.2的氨基酸的结构式为:
作为优选,所述SEQ ID NO.3的氨基酸的结构式为:
作为优选,所述SEQ ID NO.4的氨基酸的结构式为:
本发明还提供了一种所述的多肽在制备肿瘤免疫药物中的应用。
本发明还提供了一种选择性降解肿瘤细胞膜上PD-L1蛋白的生物活性溶液,由所述的多肽制备而成。
本发明还提供了一种所述生物活性溶液的制备方法,包括如下步骤,将多肽、缓冲液和ALP混合后进行反应得到;
所述ALP的添加量为4~6U/mL。
作为优选,所述缓冲液为pH5.0~9.0的PBS;所述多肽与缓冲液的质量体积比为3mg:0.8~1.2mL。
本发明还提供了一种生物活性溶液在制备肿瘤免疫药物中的应用。
本发明提供的一种选择性降解肿瘤细胞膜上PD-L1蛋白的多肽与应用具有如下优点:
(1)本发明的多肽能够模拟PD-L1蛋白的部分变性状态,通过免疫印迹和免疫荧光实验,发现其可被细胞识别后内吞随后通过蛋白酶体途径被降解,有效地控制肿瘤细胞膜上PD-L1的表达水平,解除肿瘤细胞对免疫系统的控制,恢复机体对肿瘤的免疫杀伤,进而有效地抑制恶性肿瘤的生长速度。
(2)本发明的多肽的生物相容性很高,基本不会对正常细胞以及机体产生其他影响。
附图说明
图1为实施例1所述多肽2F高效液相色谱质谱图。
图2为实施例2所述多肽0F高效液相色谱质谱图。
图3为实施例3所述多肽1F高效液相色谱质谱图。
图4为实施例4所述多肽3F高效液相色谱质谱图。
图5为对比例1所述多肽FFY高效液相色谱质谱图。
图6为对比例1所述多肽FFY结构式。
图7为对比例2所述多肽DPPA-1结构式。
图8为实施例1所述多肽2F在ALP作用下,转化前后的微观形貌图,(其中,左为2F转化前,右为2F转化后)。
图9为选取细胞层面实验所用浓度(100μM)下的实施例1所述多肽2F在ALP作用下,转化后的微观形貌图。
图10为微量热泳动仪测定多肽与PD-L1蛋白的结合常数图。
图11为免疫荧光检测多肽对肿瘤细胞PD-L1蛋白降解水平图。
图12为定量分析多肽对肿瘤细胞PD-L1蛋白降解水平图。
图13为免疫荧光检测实施例1所述多肽2F对肿瘤细胞及两种正常细胞PD-L1蛋白降解水平图,(其中,+为经2F孵育过,-为未经处理过)。
图14为免疫印迹法检测多肽对肿瘤细胞4T1膜上PD-L1蛋白降解能力。
图15为免疫印迹法检测多肽2F孵育肿瘤细胞4T1不同时间后细胞膜上PD-L1蛋白表达水平图。
图16为免疫印迹法检测不同浓度下的多肽2F孵育4T1细胞24小时后细胞膜上PD-L1蛋白表达水平图。
图17为多肽对小鼠肿瘤细胞生长的抑制作用图。
图18 2F与市售Anti-mouse PD-L1对小鼠肿瘤细胞过表达PD-L1多肽的抑制效果比较。
图19为ELISA法检测多肽促进小鼠血清中免疫相关细胞因子IFN-γ的表达图。
图20为ELISA法检测多肽促进小鼠血清中免疫相关细胞因子IL-2的表达图。
具体实施方式
在本发明中,所述多肽是由D构型的氨基酸序列构成。
在本发明中,所述多肽是由4个氨基酸组成的成胶因子、特异性结合肿瘤细胞膜上PD-L1蛋白的DPPA-1靶向序列以及封端组成。
在本发明中,所述DPPA-1序列为DNDYDSDKDPDTDDDRDQDYDHDF。
在本发明中,所述封端为1-金刚烷乙酸(Ada)。
在本发明中,所述多肽中接近N端的第一个酪氨酸中存在碱性磷酸酶反应位点。
在本发明实施例中所述多肽的合成方法为Fmoc-短肽固相合成法。
在本发明实施例中所述肿瘤免疫药物优选为注射剂。
在本发明实施例中涉及的制剂的来源如下:
2-Cl-Trt树脂购自天津南开和成科技有限公司,活性1.1mmol/mL;
N,N-二异丙基乙胺(DIEPA),购自阿达玛斯公司(Adamas),纯度99%;
苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU),购自西格马奥德里奇公司(Sigma-Aldrich),纯度98%;
三氟乙酸(TFA),购自西格马奥德里奇公司(Sigma-Aldrich),纯度99%;
三异丙基硅烷(TIS),购自西格马奥德里奇公司(Sigma-Aldrich),纯度99%;
无水二氯甲烷(DCM),购自天津渤化化学试剂有限公司,纯度99%;
N,N-二甲基甲酰胺(DMF),购自天津渤化化学试剂有限公司,纯度99%;
甲醇,购自天津康科德科技公司;
氨基酸,购自吉尔生化(上海)有限公司,纯度98%;
Anti-mouse PD-L1,购自北京百奥创新科技有限公司;
BALB/c小鼠,6周龄,雌性,购自维通利华生物科技有限公司。
在本发明实施例中涉及的设备为:
高效液相色谱仪为德国Lumtech,HPLC;
高效液相色谱质谱联用仪为日本岛津,型号为LC-MS 2020;
电子天平为德国arturious,型号为BS124S;
透射电子显微镜为Tecnai G2F20系统;
冷冻干燥机为北京亚泰科隆,型号为LGJ-1-50;
激光共聚焦显微镜为德国Leica,型号为TCS SP5;
液质联用仪为美国安捷伦,Agilent 6520Q-TOF LC/MS);
Western曝光仪为Tanon 5500。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1多肽Ada-GGDFDFDpYGDNDYDSDKDPDTDDDRDQDYDHDF的合成
采用Fmoc-短肽固相合成方法合成。具体步骤为:
1)称取0.5mmol 2-Cl-Trt树脂于固相合成器中,加入10mL的无水二氯甲烷(DCM),放置在摇床上摇晃10min,使2-Cl-Trt树脂充分溶胀;
2)用洗耳球把DCM从装有2-Cl-Trt树脂的固相合成器中压除干净;
3)将0.5mmol Fmoc保护的氨基酸(Fmoc-D-Phe-OH)溶解在10mL的无水DCM里,加入1mmol的DIEPA,然后转移到上述固相合成器中,在室温下反应1h;
4)封闭:用洗耳球除去固相合成器中的反应液,然后用10mL无水DCM洗涤,每次1min,共洗涤5次,加入配好的体积比为无水DCM:DIEPA:甲醇为17:1:2的溶液20mL,在室温下反应20min;
5)用洗耳球除去固相合成器中的反应液,先用无水DCM洗涤,每次DCM用量10mL,洗涤时间1min,共洗涤5次,再用DMF洗涤,每次DMF用量10mL,洗涤时间1min,共洗涤5次,加入10mL含体积百分比为20%的哌啶的DMF,反应25min,然后用DMF洗涤,每次DMF用量10mL、洗涤时间1min,共洗涤5次,进行下一步反应;
6)加入的第二个Fmoc保护的氨基酸(Fmoc-D-His(Boc)-OH)1mmol、HBTU 1.5mmol、DIEPA2mmol和10mL DMF,把配好的溶液加入到上述固相合成器中,反应2h;
7)重复步骤5)和6)的方法依次加入D构型的氨基酸和封端基团(1-金刚烷乙酸);然后用DMF洗涤5遍,二氯甲烷洗5遍,进行下步反应;
8)将按95%TFA,2.5%TIS,2.5%H2O的体积百分比组成的溶液10mL加入到上述固相合成器中,反应0.5h,把产物从2-Cl-Trt树脂上切下,真空浓缩,除去溶剂,得到粗品,之后用HPLC分离提纯,制得本实施例1的多肽,由于本实施例多肽的成胶因子中含有2个苯丙氨酸,因此将本申请的多肽简称2F。得到的2F的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。通过高效液相色谱质谱联用仪检测本实施例1得到的多肽,结果见图1,所述本实施例1多肽的结构式如权利要求2所示。
所述步骤8)中“将按95%TFA,2.5%TIS,2.5%H2O的体积百分比组成的溶液10mL加入到上述固相合成器中,反应0.5h”的步骤也可以通过将TFA与DCM按照体积比1:99配制成TFA体积百分比浓度为1%的TFA溶液,取该TFA溶液每次3mL加入到上述固相合成器中,共加十次,每次反应时间为1min的操作来完成。
实施例2多肽Ada-GGGGDpYGDNDYDSDKDPDTDDDRDQDYDHDF的合成
按照实施例1的Fmoc-短肽固相合成方法合成没有苯丙氨酸的多肽。得到的多肽简称0F,氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。通过高效液相色谱质谱联用仪检测本实施例2得到的多肽,结果见图2,结构式如权利要求3所示。
实施例3多肽Ada-GGGDFDpYGDNDYDSDKDPDTDDDRDQDYDHDF的合成
按照实施例1的Fmoc-短肽固相合成方法合成含有1个苯丙氨酸的多肽。得到的多肽简称1F,氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。通过高效液相色谱质谱联用仪检测本实施例3得到的多肽,结果见图3,结构式如权利要求4所示。
实施例4多肽Ada-GDFDFDFDpYGDNDYDSDKDPDTDDDRDQDYDHDF的合成
按照实施例1的Fmoc-短肽固相合成方法合成含有3个丙苯氨酸的多肽。得到的多肽简称3F,氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。通过高效液相色谱质谱联用仪检测本实施例4得到的多肽,结果见图4,结构式如权利要求5所示。
对比例1多肽Ada-GGDFDFDYGDNDYDSDKDPDTDDDRDQDYDHDF的合成
按照实施例1提供的Fmoc-固相合成方法制备对比例1的多肽,得到的多肽简称FFY。对比例1合成多肽时,较实施例1的方法中未加入碱性磷酸酶反应位点。通过高效液相色谱质谱联用仪检测本对比例1得到的多肽,结果见图5,结构式见图6。
取3mg D构型多肽FFY置于1.5mL的玻璃瓶中,加入1毫升PBS溶液(pH=7.4),用碳酸钠溶液将其pH值调节至6左右,加热使其充分溶解后冷却,即得无色透明的FFY多肽水凝胶。
对比例2多肽DNDYDSDKDPDTDDDRDQDYDHDF的合成
按照实施例1提供的Fmoc-固相合成方法制备对比例2的多肽,得到的多肽简称DPPA-1。合成本对比例2的多肽时,较实施例1的方法中缺少了1-金刚烷乙酸、4个氨基酸组成的成胶因子和碱性磷酸酶反应位点。结构式见图7。
对比例3
称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,溶于800mL蒸馏水中,用HCl调节溶液的pH值至7.4,最后加蒸馏水定容至1L得到PBS溶液。用高压灭菌锅灭菌后,保存于25℃或4℃冰箱中。
对比例4
市售Anti-mouse PD-L1蛋白,须在无菌条件下使用,保存于4℃冰箱中。
实验例1透射电镜实验
称取实施例1制备得到的2F多肽3mg,各加入1×PBS(pH=7.4)溶液1mL,用碳酸钠溶液将其pH值调节至7.4,超声使其全部溶解后得转化前2F生物活性溶液,用投射电镜观察其微观形貌,结果见图8左。接着按照5U/mL的比例加入ALP,置于37℃恒温箱中,反应过夜后即得转化后2F生物活性溶液,用透射电镜观察其转化后的微观形貌,结果见图8右。
图8表明,多肽2F在自组装前后会呈现不同的微观结构。其中,在加入ALP之前,2F表现为直径不一的纳米粒子缠结在一起形成的纳米网络。加入ALP之后,2F在ALP的作用下发生自组装,则表现为直径不一的纳米纤维聚集成束,然后缠绕在一起形成的致密纳米纤维网络。以上结果也可说明,ALP的加入确实可以触发2F的自组装行为,进而形成不同的组装形态。
称取实施例1制备得到的多肽2F 1.2mg,各加入1×PBS(pH=7.4)溶液5mL,用碳酸钠溶液将其pH值调节至7.4,超声使其全部溶解后得浓度为100μM的2F溶液,接着按照5U/mL的比例加入ALP,置于37℃恒温箱中,反应过夜后即得转化后的2F生物活性溶液。
用透射电镜观察上述转化后的2F多肽生物活性溶液的微观形貌,结果如图9所示。
图9表明,在浓度为100μM下的多肽2F的纳米结构表现为针状的细小纳米纤维。以上结果可说明,在细胞层面的实验中,所选取的加药浓度下的多肽2F是可以在ALP的作用下发生自组装,并形成纤维状纳米结构的。
实验例2MST蛋白结合能力测定
首先根据Monolith NT.115TM蛋白标记试剂盒所提供的步骤,将5μL溶剂为DMSO的“Dye NT-647 NHS”加入至PBS中稀释20倍,后将其与100μL 9μM mPD-L1(缓冲液:1×PBS pH7.4,Tween-20(0.05%))混合吹打均匀,然后将该混合物在黑暗中放置反应30分钟。反应完成后将多余的染料通过分子筛完全洗掉,并补加定量缓冲液使溶液在重力作用下流出后收集荧光标记的PD-L1蛋白。根据实施例1制备生物活性溶液的方法,将实施例1~4以及对比例1~2所述的多肽制备成不同浓度的生物活性溶液。将不同浓度梯度的多肽生物活性溶液与等体积的荧光标记的PD-L1蛋白在室温下孵育5分钟,毛细管吸取溶液。最后,通过微热量泳动仪(Monolith NT.115)测定不同多肽对PD-L1蛋白的结合能力,结果如图10所示。
不同多肽对PD-L1蛋白具有不同的结合常数,其中实施例1制备得到的多肽与PD-L1蛋白的结合能力最强,其KD值为75.8μM,与PD-L1靶向多肽序列DPPA-1的KD值423μM相比,提高了与PD-L1蛋白的亲和力5.6倍。以上结果与阻断癌细胞的免疫逃逸密切相关,使其具有成为PD1/PD-L1抑制剂的潜力。
实验例3免疫荧光实验
按照5×104个细胞/孔的密度将小鼠乳腺癌细胞4T1接种在24孔板上,待细胞附着到圆形盖玻片的表面后,除去孔中的培养基。根据实施例1制备生物活性溶液的方法,分别将实施例1~4以及对比例1的多肽制备成浓度为100μM的生物多肽活性溶液,以对比例3的PBS溶液为空白对照,孵育细胞24小时后吸去孔内溶液,用PBS缓冲液洗涤细胞3次,每次1分钟。在室温下,将附着在盖玻片上的细胞用PBS缓冲液中的4%多聚甲醛固定10分钟。然后,将孔中的溶液吸掉,将细胞用PBS缓冲液洗涤3次,每次1分钟。将含有5%的山羊血清的PBS溶液作封闭液,将细胞封闭孵育1小时以减少荧光背景的干扰。吸出封闭液,并重复上述洗涤步骤3次后,加入用5%山羊血清稀释25倍的647偶联的PD-L1抗体,在室温下孵育细胞1.5小时。去除抗体溶液,并用PBS缓冲液洗涤细胞3次,然后在室温下用0.5μg/mL的DAPI染色4分钟。所有操作均需避光。染色后通过激光扫描共聚焦显微镜(Leica TSCSP5)在相同电压下拍摄图像,检测多肽对4T1肿瘤细胞PD-L1蛋白降解水平,如图11所示。之后为了定量测定各组多肽对肿瘤细胞PD-L1的表达水平,用Leica结果分析软件LASX定量统计4T1细胞表达的PD-L1蛋白所指示的红色荧光的荧光强度,得到定量分析多肽对肿瘤细胞PD-L1蛋白降解水平,并将其做成柱状图,结果见图12。
从图11和图12都可以看出来,以对比例3的PBS溶液组作为空白对照,用实施例1、2、3、4及对比例1所述多肽制备成生物活性溶液处理4T1细胞24小时后,红色荧光均存在不同程度的减弱。其中,我们观察到用多肽2F处理过的细胞中红色荧光显著降低。相反,对于用多肽3F或FFY处理过的细胞,它们的红色荧光只显示出中等程度的降低。同样,对于那些用多肽0F或1F处理过的细胞,它们的红色荧光仅略有下降。这些观察结果表明,多肽2F具有降解4T1细胞中PD-L1蛋白的最佳能力。在荧光显微镜捕捉的视野中,多肽2F孵育过的细胞的荧光信号强度要明显低于其他组在24小时的时间点的荧光强度,除个别细胞外,荧光信号基本已经消失。结果表明,经多肽2F处理过的4T1细胞中,指示PD-L1蛋白的红色荧光的荧光强度相比PBS组降低了80.6%。
接着按照5×104个细胞/孔的密度将小鼠乳腺癌细胞4T1和两种正常细胞系HUVEC和LO2分别接种在24孔板上,待细胞附着到圆形盖玻片的膜上后,除去孔中的培养基。分别在孔中加入实施例1所述多肽2F,浓度同样设置为100μM,按照上述步骤完成样品制备。通过激光扫描共聚焦显微镜(Leica TSC SP5)在相同电压下拍摄图像,如图13所示。
从图13可以看出,两种正常细胞上PD-L1的表达水平远远低于4T1细胞,且多肽2F的加入对于两种正常细胞上PD-L1的表达量几乎没有影响,即荧光强度并没有明显的减弱。以上结果都可说明,多肽2F可以有效地诱导PD-L1蛋白的选择性降解,进而导致肿瘤细胞4T1膜上的PD-L1蛋白表达量降低。
实验例4免疫印迹实验
通过免疫印迹试验检测4T1细胞的细胞膜上PD-L1的表达水平。将4T1细胞接种在直径为10mm的细胞培养皿上,培养24小时。待细胞生长到大约80%的密度后,加入根据实施例1制备多肽生物活性溶液的方法制备得到的2F、0F、1F、3F和FFY多肽生物活性溶液,以对比例3所述的PBS溶液作为空白对照,浓度均为100μM,孵育细胞24小时,除去培养基。接着用PBS缓冲液洗涤细胞3次。收集细胞并在含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解缓冲液中裂解,该缓冲液由上海贝博公司生产的细胞膜蛋白提取试剂盒提供。用BCA定量分析后,用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离等量(30μg)样品,然后转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。将膜用3%BSA封闭,以消除非特异性干扰。将膜与ThermoFisher的PD-L1多克隆抗体和Signalway的Na+/K+ ATPase抗体在4℃孵育过夜,然后与ImmunoWay的HRP标记的二抗共孵育1.5小时。最终使用Tanon 5500通过Immobilon Western HRP底物检测膜,检测多肽对肿瘤细胞4T1细胞膜上PD-L1蛋白的降解能力,结果如图14所示。分子量位于52kDa处的条带属于PD-L1蛋白,同时将Na+/K+ ATPase作为细胞膜蛋白的内参蛋白,其分子量为114kDa。
从图14可以看出来,以PBS组作为空白对照组,在各组的内参蛋白条带基本保持一致的条件下,经多肽2F孵育24小时后,52kD条带明显变浅,说明所述多肽2F对于4T1细胞膜上PD-L1具有最有效的降解效果,以诱导其在细胞膜上的表达水平降低,而其他组仅有轻微差别,这和免疫荧光结果基本可以相互验证。
接着,我们分别设置了多个加药浓度梯度和多个孵育时间点,并通过免疫印迹试验检测4T1细胞的细胞膜上PD-L1的表达水平,结果如图15和图16所示。我们发现随着孵育时间的延长和加药浓度的提高,指示PD-L1蛋白的条带出现逐渐变浅的趋势。经多肽2F孵育24小时后,其对PD-L1蛋白的降解效果达到最佳,而置换包含多肽2F的培养基继续孵育24小时后,PD-L1的表达略有回升,说明我们所设计的多肽药物分子针对PD-L1的降解效果是存在时间依赖性和可恢复性的。而在多肽2F的浓度控制在100μM时,对PD-L1蛋白的降解效果达到最佳,存在一定的浓度依赖性。以上结果均说明本项目所设计的药物分子可有效地降低4T1细胞上PD-L1蛋白的表达量,且存在时间依赖性和浓度依赖性,所产生的降解效果具有可恢复性。
实验例5动物肿瘤模型
我们使用按体积百分比为89%培养基(DMEM)+10%胎牛血清(FBS)+1%青链霉素混合液(双抗)配置的培养液将小鼠乳腺癌细胞4T1培养在专用细胞培养皿中,置于37℃恒温培养箱(5%的CO2)中。选用BALB/c雌性裸鼠(6周,16g~19g),构建小鼠乳腺癌细胞4T1皮下荷瘤模型。实验按照制备实施例1、2、3、4所合成的多肽和对比例3依次分组,待每个组的小鼠肿瘤大小到100mm3时,将同种类的肿瘤进行随机分组,每组至少5只鼠。肿瘤体积计算公式:长×宽2/2。采用尾静脉注射的方式给药,给药浓度选取为15mg/kg,分别在第1、4、7天给药一次,共给药三次,监控各组小鼠的肿瘤生长趋势,如图17所示。
从图17可以看出来,在肿瘤生长初期,除PBS组外各组小鼠的肿瘤生长速度都比较缓慢。在给药三次结束后,PBS组小鼠肿瘤平均体积就已经生长至500mm3左右,之后则呈现出指数性增长。相反,经过多肽0F、1F、2F和3F尾静脉给药后的小鼠的肿瘤生长速度都得到了不同程度的抑制。小鼠体内肿瘤平均体积与PBS组相比,0F组降至约43.7%。此外,用多肽1F和3F治疗后小鼠的肿瘤平均体积分别减小至55.5和29.5%,相对抑制率分别为44.5和70.5%。而用多肽2F治疗后,小鼠的最终肿瘤体积进一步减小至约23.7%,这显示出对肿瘤的显著治疗效果。此外,免疫印迹的结果表明,实施例1所述多肽2F对PD-L1表现出最佳的降解效果,这与体内抗肿瘤功效一致,表明由多肽2F诱导的肿瘤细胞膜上的PD-L1蛋白的选择性降解进一步激活了免疫系统并实现了对肿瘤的体内抑制作用。
接着,我们依然选用BALB/c雌性裸鼠(6周,16g~19g),构建小鼠乳腺癌细胞4T1皮下荷瘤模型。实验按照制备实施例1所合成的多肽和对比例3、4依次分组,待每个组的小鼠肿瘤大小到60mm3左右时,将同种类的肿瘤进行随机分组,每组至少5只鼠。肿瘤体积计算公式:长×宽2/2。实施例1所合成的多肽2F的给药浓度及给药时间与上述一致,采用尾静脉注射的方式给药,而对比例4所述Anti-mouse PD-L1蛋白则按照每只小鼠每次给药75μg的剂量,给药时间和给药次数与2F组一致,采用腹腔注射的方式给药。监控各组小鼠的肿瘤生长趋势,如图18所示。
从图18的结果可以看出,三次给药结束后,相比于对比例3的PBS对照组,实施例1和对比例4均对小鼠4T1肿瘤表现出一定的抑制效果。其中,对比例4所述的Anti-mouse PD-L1蛋白三次给药后,小鼠体内肿瘤与PBS组相比减小至约80%,而在实施例1所述多肽2F三次给药结束后,小鼠体内肿瘤减小至PBS组小鼠体内肿瘤大小的46%左右。以上结果说明,与市售的Anti-mouse PD-L1蛋白相比,多肽2F对于PD-L1过表达的小鼠肿瘤的抑制效果更加出色。
实验例6免疫相关细胞因子水平测定
选用BALB/c雌性裸鼠(6周,16g~19g),实验按照制备实施例1、2、3、4及对比例1、2所述多肽依次分组,以对比例3的PBS溶液作为空白对照。由于个体差异较大,每组按照3只小鼠进行实验。按照上述小鼠体内肿瘤实验的给药剂量15mg/kg,对小鼠进行尾静脉给药一次后开始计算时间。在一次给药后的24小时的时间点,对每只小鼠进行眼球取血,去血量大约1mL。将取出的小鼠血液在室温下静止大约2小时后,血液已分层。置于高速离心机中以15000rpm的转速离心15分钟后,位于上层的小鼠血清即为检测样品。根据ELISA试剂盒(Biolegend,ELISAMAXTM Deluxe Set Mouse IFN-γ和ELISAMAXTM Deluxe Set Mouse IL-2)提供的实验步骤,对小鼠血清中的免疫相关细胞因子IFN-γ和IL-2的水平进行测定,结果如图19和图20所示。
从结果可以看出来,实施例1所述多肽2F组小鼠的血清中IFN-γ和IL-2这两种细胞因子的水平都要明显高出PBS组,分别为PBS对照组的10倍和3倍。而IFN-γ是T细胞活性和增殖的重要指标,具有生物活性的IL-12主要是激活的炎性细胞产生的,可以促进细胞毒性T细胞的形成,可以诱导T细胞向介导细胞免疫应答的Th1型分化,同时他还可以促进T细胞和NK细胞产生IFN-γ,IFN-γ也能促进Th1细胞分化与增殖。对于这两种细胞因子,给药的实验组相比空白对照组都出现了不同程度的提高。以上结果说明实施例1所述多肽2F可以有效地诱导小鼠体内持续的T细胞增殖和活化,从而激活机体的免疫反应。
由以上实验例可知,本发明提供多肽,能够诱导肿瘤细胞膜上的PD-L1蛋白的选择性降解,从而导致肿瘤细胞4T1膜上的PD-L1蛋白表达水平的降低。通过免疫荧光实验发现4T1细胞中指示PD-L1的红色荧光强度能够降低80%,而对于LO2和HUVEC两种正常细胞基本上没有影响。进一步通过免疫印迹实验,验证了本发明的多肽能够有效地降低4T1细胞膜上PD-L1蛋白的表达量,且对于PD-L1蛋白的降解效果存在时间和浓度依赖性,具有可恢复性。通过小鼠体内肿瘤实验和小鼠血清中免疫相关细胞因子水平测定,验证了本发明的多肽诱导的4T1细胞膜上PD-L1蛋白表达水平的降低,能够进一步激活机体对肿瘤的免疫杀伤,有效地抑制肿瘤的生长速度。因此本发明提供的多肽能够解除肿瘤细胞对免疫系统的控制,增强免疫系统对肿瘤细胞的识别,减缓肿瘤的生长速度,从而提高对癌症的治疗效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 南开大学
<120> 一种选择性降解肿瘤细胞膜上PD-L1蛋白的多肽与应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Gly Phe Phe Tyr Gly Asn Tyr Ser Lys Pro Thr Asp Arg Gln Tyr
1 5 10 15
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<210> 2
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1 5 10 15
His Phe
Claims (10)
1.一种选择性降解肿瘤细胞膜上PD-L1蛋白的多肽,其特征在于,所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。
6.一种权利要求1~5任意一项所述的多肽在制备肿瘤免疫药物中的应用。
7.一种选择性降解肿瘤细胞膜上PD-L1蛋白的生物活性溶液,其特征在于,由权利要求1~5任意一项所述的多肽制备而成。
8.一种权利要求7所述的生物活性溶液的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:将多肽、缓冲液和ALP混合后进行反应得到;
所述ALP的添加量为4~6U/mL。
9.根据权利要求8所述的制备方法,其特征在于,所述缓冲液为pH5.0~9.0的PBS;
所述多肽与缓冲液的质量体积比为3mg:0.8~1.2mL。
10.权利要求9所述的生物活性溶液在制备肿瘤免疫药物中的应用。
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CHANG H N ET AL.: "Blocking of the PD‐1/PD‐L1 interaction by ad‐peptide antagonist for cancer immunotherapy", 《 ANGEWANDTE CHEMIE INTERNATIONAL EDITION》 * |
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YANG B ET AL.: "Engineering prodrug nanomedicine for cancer immunotherapy", 《ADVANCED SCIENCE》 * |
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