CN116407682A - 一种基因编码的重组类胶原蛋白超分子水凝胶制备方法和应用 - Google Patents

一种基因编码的重组类胶原蛋白超分子水凝胶制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基因编码的重组类胶原蛋白超分子水凝胶制备方法和应用，具体涉及生物材料领域。所述制备方法包括设计自发交联型类胶原蛋白基本序列，表达、纯化目的类蛋白和利用纯化的类蛋白制备自发交联型蛋白基超分子水凝胶。本发明利用生物合成的配对式半胱氨酸引入的类胶原蛋白制备类胶原蛋白超分子水凝胶。该水凝胶不通过添加任何交联剂，而实现蛋白分子间的共价交联。本发明的水凝胶可作为组织修复、心血管支架、神经损伤修复、药物递送等生物医学产品原材料，市场价值潜力巨大；研发技术处于世界领先水平，可为后续生物医用材料发展做出贡献。

Description

一种基因编码的重组类胶原蛋白超分子水凝胶制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及生物材料领域，具体涉及一种基因编码的重组类胶原蛋白超分子水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
水凝胶在组织工程、药物递送等领域应用广泛。通过生物合成工艺生产仿生细胞外基质蛋白，利用蛋白质工程技术构建蛋白基超分子作为水凝胶骨架是医用级水凝胶发展的重要方向。通过蛋白质工程技术手段，在类细胞外基质蛋白系列中引入半胱氨酸，可利用半胱氨酸巯基相互作用，制备自发交联型蛋白基水凝胶。
根据性质不同，水凝胶系统可分为不同几大类。每种水凝胶具有自身优势，同时也存在自身的不足。制备稳定性强、生物相容性高、成本低廉的医用级水凝胶是目前水凝胶系统研究的关键。首先由于物理凝胶有静电作用、分子间作用力等非共价相互作用结合，导致物理凝胶稳定性相对较差。其次，化学凝胶在制备过程中需添加交联剂，催化分子间相互结合，形成性质相对稳定的水凝胶系统。这虽然极大的提升了水凝胶的稳定性和机械特性，但交联剂成本相对较高，且具有一定的生物副作用，从而限制了水凝胶在生物医学工程领域的应用。最后，合成高分子水凝胶基于化学合成高分子材料开发，相对天然高分子水凝胶，其生物相容性较差、生产成本较高，且制备过程中也需要添加交联剂，这些都大大限制了合成高分子水凝胶的应用。然而，天然高分子水凝胶虽然具有较高的生物相容性，但由于其天然序列或化学结构导致其即使在交联剂作用下，机械特性和稳定性仍然较差。因此，如何制备稳定性强、生物相容性高、成本低廉、无交联剂添加的天然水凝胶系统，是目前水凝胶研究的一大技术瓶颈。
通过基因编辑，构建带有配对式半胱氨酸的生物合成型大分子蛋白，利用半胱氨酸引发类细胞外基质蛋白自发交联形成蛋白基超分子水凝胶，不仅可改善天然蛋白质在机械特性和稳定性上的问题，还可实现无交联剂添加利用巯基-巯基反应，实现共价交联，从一定水平上突破水凝胶研究的技术瓶颈。
由于物理凝胶有静电作用、分子间作用力等非共价相互作用结合，导致物理凝胶稳定性相对较差。然而，化学凝胶在制备过程中需添加交联剂，催化分子间相互结合，形成性质相对稳定的水凝胶系统。这虽然极大的提升了水凝胶的稳定性和机械特性，但交联剂成本相对较高，且具有一定的生物副作用，从而限制了水凝胶在生物医学工程领域的应用。其次，合成高分子水凝胶基于化学合成高分子材料而开发，相对天然高分子水凝胶，其生物相容性较差、生产成本较高，且制备过程中也需要添加交联剂，这些都大大限制了合成高分子水凝胶的应用。然而，天然高分子水凝胶虽然具有较高的生物相容性，但由于其天然序列或化学结构导致其即使在交联剂作用下，机械特性和稳定性仍然较差。
制备稳定性强、生物相容性高、成本低廉的医用级水凝胶是目前水凝胶系统研究的关键。因此，如何制备稳定性强、生物相容性高、成本低廉、无交联剂添加的天然水凝胶系统，是目前水凝胶研究的一技术瓶颈。
发明内容
为此，本发明提供一种基因编辑型仿生细胞外基质重组类胶原蛋白超分子水凝胶的制备方法和应用，通过蛋白质工程技术手段，在人工设计的类胶原蛋白序列中引入配对式半胱氨酸，可利用半胱氨酸巯基相互作用，制备自发交联型蛋白基超分子水凝胶。
基因编辑型蛋白基生物材料的出现，为制备先进的天然水凝胶系统提供了新的科学思路和解决方案。通过蛋白质工程技术手段，构建具有生物功能的蛋白基生物材料，根据其功能不同，主要包括三大部分：a.骨架结构：主要提供基本结构及理化特性；b.功能基团：根据其应用及功能要求，引入具有特殊功能的生物活性序列；c.反应基团：具有反应性质的基团，可根据所处环境的不同做出相应反应。
通过蛋白工程技术手段对细胞外基质蛋白进行改造，使细胞外基质蛋白从功能到理化特性上都得到质的提升，使其成为合适的生物材料骨架蛋白。细胞外基质的天然蛋白在作为生物材料时，具有一定限制。例如，在真核生物体内，胶原蛋白需羟基化修饰才能形成。通过蛋白质工程技术手段，构建重组型胶原蛋白，可免去羟基化修饰的翻译后修饰过程，直接形成类胶原蛋白，从而突破传统胶原蛋白翻译后修饰的限制。类细胞外基质蛋白在生物体虽存在多种形式，但其无法结合生物功能基团，多样性也受到蛋白质天然合成过程中氨基酸种类的限制。通过重组蛋白工程技术，可引入相应功能基团，对类细胞外基质蛋白进行功能化，可有效丰富类细胞外基质蛋白多样性和功能性。
蛋白基生物材料可弥补传统化学高分子材料的不足。传统高分子化合物作为生物材料具有诸多限制：a.传统高分子化合物生物体内代谢后不具有均质性，无法实现药物代谢检测，导致成药性低。b.高分子化合物合成条件相对苛刻，高分子化合物合成往往要求高于其玻璃化温度，从而产生相对较高的温度要求。c.高分子化合物在分解、燃烧时会产生有毒气体，这些条件限制了高分子化合物在生物医药领域中的应用。d.高分子化合物生物相容性较差。高分子化合物在体内代谢后，产生多种异质性化合物。这些物质会引起一定的免疫反应。蛋白基生物材料弥补了传统高分子化合物的不足，首先，类蛋白生物材料通过生物体合成，制备条件温和。类蛋白生物材料通过基因编辑大肠杆菌表达生产，其生产过程温和，纯化过程不产生危害性产物；其次，类蛋白生物材料在体内代谢为具体氨基酸，是生物体基本组成物质，具有良好的生物相容性。最后，类蛋白生物材料具有均质性，在体内代谢为氨基酸，可检测其药物代谢过程。
综上所述，蛋白基生物材料的出现和发展，为制备稳定性强、生物相容性高、成本低廉、无交联剂添加的天然水凝胶系统，提供了科学思路和解决方法。
在本发明中，首先，类胶原蛋白分子构建是本发明的核心内容之一。该类胶原蛋白由本发明自主设计并完成生物合成和纯化。其与传统生物提取胶原蛋白不同，传统胶原蛋白为稳定其三螺旋结构，需进行载体翻译后修饰，而不存在其他活性基团。本发明自主设计的类胶原蛋白，不需要进行额外的翻译后修饰，通过其基因编码序列N端的V-domain，结合类胶原蛋白序列而稳定其三螺旋结构。其次，其胶原蛋白序列源于酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)scl-2基因，为进一步稳定其三螺旋结构，胶原蛋白序列设计为三个重复性的scl-2基因，从而提供适当的序列长度和稳定性。最后，在V-domain和胶原蛋白序列间和C端加入CPPC多肽，该多肽为本发明自己设计用于进一步稳定蛋白质结构的序列，该序列的加入进一步保证了三螺旋结构的稳定性，而不需要额外的载体翻译后修饰过程。
本发明为构建自发交联型类胶原蛋白超分子水凝胶，利用半胱氨酸中具有活性的巯基(-SH)与其他类胶原蛋白分子中的半胱氨酸巯基进行自发性反应，形成二硫键(-S-S-)，通过二硫键从而制备稳定的交叉网络型结构作为类胶原蛋白超分子水凝胶的基本结构。因此，为实现上述目的，在类胶原蛋白序列的两端(N端和C端)分别加入CGG和GGC多肽序列，其中G为甘氨酸，作为连接功能存在；C为半胱氨酸，可提供具有活性的巯基，其两端的半胱氨酸可实现胶原蛋白分子与分子之间的相互作用。
为进一步增强本发明设计的类胶原蛋白功能，在其整体序列C端引入多肽RGD，该多肽可进一步促进细胞贴附，有助于保持细胞活性并促进细胞在该蛋白的支持下生长。从而扩展其在生物医学、组织工程和医美行业中的应用能力。
综上所述，本发明设计的配对式半胱氨酸类胶原蛋白序列为M(CGG)nNADEQEEKAKVRTELIQELAQGLGGIEKKNFPTLGDEDLDHTYMTKLLTYLQEREQAENSWRKRLLKGIQDHALDGGPCPPCRYPISRPRKRGPKGEQGPQGLPGKDGEAGAQGPAGPMGPAGEQGEKGEPGTQGAKEDRGETGPKGPKGERGEAGPAGKDGEPGPVGPAGPKGEQGPQGLPGKDGEAGAQGPAGPMGPAGEQGEKGEPGTQGAKEDRGETGPKGPKGERGEAGPAGKDGEPGPVGPAGPKGEQGPQGLPGKDGEAGAQGPAGPMGPAGEQGEKGEPGTQGAKEDRGETGPKGPKGERGEAGPAGKDGEPGPVGPAGGPCPPCRGD(GGC)nC。
其主要是在源于酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)scl-2基因的N端引入V-domian，并以CPPC多肽连接。中间接入三重scl-2基因，且后续以CPPC和RGD两种多肽接入。重要的是，在整体序列N端和C端分别引入CGG和GGC多个配对式半胱氨酸多肽，且两端半胱氨酸多肽数量相等，即nN＝nC(n为任意正整数)。
本发明的另一关键是利用类胶原蛋白分子中的配对式半胱氨酸制备共价交联的无添加型类胶原蛋白超分子水凝胶。在获得配对式半胱氨酸类胶原蛋白序列后，通过生物合成制备类胶原蛋白，从而利用该蛋白制备自发交联型类胶原蛋白超分子水凝胶。通过上述制备的类胶原蛋白水凝胶，是通过二硫键实现共价交联的蛋白基超分子水凝胶，无需添加任何交联剂，从而具有更强的生物相容性。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
(1)类胶原蛋白生物合成和纯化
在获得配对式半胱氨酸类胶原蛋白序列后，通过分子克隆技术手段将其构建于大肠杆菌表达载体pET-28a载体中。通过生物发酵技术生物合成类胶原蛋白。首先，将构建好的pET-28a-eCLP基因通过热激转化法或电击转化法转入BL21(DE3)表达型大肠杆菌中，于37℃扩大培养，当大肠杆菌OD600数值达到0.6-0.8时，加入IPTG诱导大肠杆菌表达，同时将培养体系置于16℃环境条件下，以180rpm/min的转速过夜培养。24小时后，离心收集大肠杆菌。
将收集好的大肠杆菌进行高压破碎，离心收集上清溶液后，将存在于上清液中的蛋白质溶液过镍柱基质纯化柱，这样带有His标签的类胶原蛋白将与镍柱基质结合。通过洗脱液洗脱3-5次，获得纯化的类胶原蛋白。
(2)类胶原蛋白的还原
本发明在类胶原蛋白分子中引入配对式半胱氨酸多肽，存在配对式的半胱氨酸，该类型配对式半胱氨酸多肽易形成蛋白质聚集体而非有序的共价结合。因此需对纯化的配对式半胱氨酸类胶原蛋白分子进行还原。因此，本发明利用通常的蛋白质还原反应，对上述获得的类胶原蛋白分子进行还原。
在获得的类胶原蛋白分子中加入40mM的二硫苏糖醇(DTT)，震荡孵育一个小时，使类胶原蛋白分子还原，使类胶原蛋白分子间的二硫键还原为巯基，从而获得单体的类胶原蛋白分子。为进一步去除体系中存在的DTT，利用蛋白质浓缩超滤管进行纯化。将上述体系加入30kD蛋白质超滤管中，加入pH＝6的醋酸/醋酸钠缓冲液，进行超滤洗涤。当洗涤10次后，获得在醋酸/醋酸钠溶液中的还原型类胶原蛋白。
(3)蛋白基超分子水凝胶制备
本发明基于配对式半胱氨酸中巯基相互作用，制备无添加式水凝胶，因此，诱导巯基活化为二硫键是本发明的关键技术之二。类胶原蛋白中的配对式半胱氨酸可在一定条件下发生巯基-二硫键交换反应，从而使各类细胞外基质蛋白分子间形成共价键，从而自发交联形成水凝胶。
利用巯基—二硫键交换反应在弱酸环境中活化的反应原理，将溶解于PBS的配对式半胱氨酸类胶原蛋白按照10％(w/v)含量逐滴加入预先制备好的弱酸性(PH＝4-5)醋酸盐缓冲液中，并反应48小时。反应后，将溶液置于预制的PDMS模子中，4℃放置48h。在诱导类胶原蛋白自发性交联后，将该体系置于冷冻干燥机中，冷冻干燥48小时。收集冻干体后，按照10％(w/v)浓度用超纯水回溶冻干粉，震荡直至冻干体完全溶解，即可获得该水凝胶。
根据本发明第二方面提供的一种仿生细胞外基质重组类蛋白超分子水凝胶，所述凝胶是如上所述方法制备而成。
根据本发明第三方面提供的一种仿生细胞外基质重组类蛋白超分子水凝胶用于制备组织修复类产品。
本发明具有如下优点：
本发明利用生物合成的配对式半胱氨酸引入的类胶原蛋白制备类胶原蛋白超分子水凝胶。该水凝胶不通过添加任何交联剂，而实现蛋白分子间的共价交联。
本发明以自主研发设计的类胶原蛋白分子为基础进行制备，该胶原蛋白分子具有良好的生物相容性和细胞生长支撑作用。重要的是，该类胶原蛋白分子通过生物合成制备，不涉及任何化学合成过程，可实现无污染制备。
本发明的水凝胶可作为组织修复、心血管支架、神经损伤修复、药物递送等生物医学产品原材料，市场价值潜力巨大；研发技术处于世界领先水平，可为后续生物医用材料发展做出贡献。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引申获得其它的实施附图。
本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容能涵盖的范围内。
图1为本发明实施例1提供的一种仿生细胞外基质重组类蛋白超分子水凝胶的制备流程图；
图2为本发明实施例1提供的一种类胶原重组蛋白序列设计；
其中，A表明单配对式半胱氨酸序列；B为多配对式半胱氨酸序列；
图3为本发明实施例1制备的一种自发交联型类弹性蛋白水凝胶照片；其中，A.自发交联型类弹性蛋白水凝胶照片；B.凝胶结构模拟；C.单分子配对式半胱氨酸类胶原蛋白凝胶扫描电子显微镜照片；D.多分子配对式半胱氨酸类胶原蛋白凝胶扫描电子显微镜照片。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所描述的内容轻易地了解本发明的其它优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例利用如图1所示的流程图提供一种仿生细胞外基质重组类蛋白超分子水凝胶的制备方法：
步骤一，如图2所示，设计类胶原蛋白基本序列
本发明设计的配对式半胱氨酸类胶原蛋白序列为MCGGADEQEEKAKVRTELIQELAQGLGGIEKKNFPTLGDEDLDHTYMTKLLTYLQEREQAENSWRKRLLKGIQDHALDGGPCPPCRYPISRPRKRGPKGEQGPQGLPGKDGEAGAQGPAGPMGPAGEQGEKGEPGTQGAKEDRGETGPKGPKGERGEAGPAGKDGEPGPVGPAGPKGEQGPQGLPGKDGEAGAQGPAGPMGPAGEQGEKGEPGTQGAKEDRGETGPKGPKGERGEAGPAGKDGEPGPVGPAGPKGEQGPQGLPGKDGEAGAQGPAGPMGPAGEQGEKGEPGTQGAKEDRGETGPKGPKGERGEAGPAGKDGEPGPVGPAGGPCPPCRGDGGC。其主要是在源于酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)scl-2基因的N端引入V-domian，并以CPPC多肽连接。中间接入三重scl-2基因，且后续以CPPC和RGD两种多肽接入。重要的是，在整体序列N端和C端分别引入CGG和GGC单个配对式半胱氨酸多肽。
步骤二，表达、纯化目的类蛋白
即利用BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞转化类蛋白表达质粒，诱导表达目的蛋白，利用镍柱亲和层析纯化法纯化类蛋白。取1μL正确构建的重组蛋白表达质粒加入BL21(DE3)感受态细胞中，冰上放置5min,42℃热击1.5min,加入200μL无抗液体LB培养基，于37℃180rpm/min孵育10min,涂布10μL于卡那抗性的固体培养基平板上，在37℃培养箱过夜培养。约12h后，挑取单克隆置于卡那抗性的液体LB培养基中，在180rpm/min，37℃的摇床中培养，直至菌液浑浊。取1mL菌液接种于1L含有1mL卡那的液体LB中，37℃，200rpm/min培养菌液OD值约为0.6-0.8，加入0.3mM IPTG,在16℃过夜培养。将该过夜诱导表达的重组蛋白菌液离心5000rpm/min,10min，后弃去上清液，收集菌体后利用超声细胞破碎仪超声3s,停止6s,直至将该细胞完全裂解在裂解缓冲液条件(lysis buffer：500mM NaCl,25mM Tris-HCl8.0)下，13000rpm/min离心1h，留下上清悬液，除去不可溶的细胞碎片。将上清液加入平衡好的镍柱基质中，结合后利用洗脱缓冲液洗脱，即可获得纯化后的类胶原蛋白。
步骤三，水凝胶的制备
利用巯基—二硫键交换反应在弱酸环境中活化的反应原理，将溶解于PBS的配对式半胱氨酸类胶原蛋白按照10％(w/v)含量逐滴加入预先制备好的弱酸性(PH＝4-5)醋酸盐缓冲液中，并反应48小时。反应后，将溶液置于预制的PDMS模子中，4℃放置48h。在诱导类胶原蛋白自发性交联后，将该体系置于冷冻干燥机中，冷冻干燥48小时。收集冻干体后，按照10％(w/v)浓度用超纯水回溶冻干粉，震荡直至冻干体完全溶解，即可获得水凝胶，结构如图3所示。
实施例2
本实施例提供一种仿生细胞外基质重组类蛋白超分子水凝胶的制备方法：
步骤一，设计类胶原蛋白基本序列
本发明设计的配对式半胱氨酸类胶原蛋白序列为MCGGCGGADEQEEKAKVRTELIQELAQGLGGIEKKNFPTLGDEDLDHTYMTKLLTYLQEREQAENSWRKRLLKGIQDHALDGGPCPPCRYPISRPRKRGPKGEQGPQGLPGKDGEAGAQGPAGPMGPAGEQGEKGEPGTQGAKEDRGETGPKGPKGERGEAGPAGKDGEPGPVGPAGPKGEQGPQGLPGKDGEAGAQGPAGPMGPAGEQGEKGEPGTQGAKEDRGETGPKGPKGERGEAGPAGKDGEPGPVGPAGPKGEQGPQGLPGKDGEAGAQGPAGPMGPAGEQGEKGEPGTQGAKEDRGETGPKGPKGERGEAGPAGKDGEPGPVGPAGGPCPPCRGDGGCGGC。其主要是在源于酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)scl-2基因的N端引入V-domian，并以CPPC多肽连接。中间接入三重scl-2基因，且后续以CPPC和RGD两种多肽接入。重要的是，在整体序列N端和C端分别引入CGG和GGC多个配对式半胱氨酸多肽，且两端半胱氨酸多肽数量相等，即nN＝nC。
步骤二，表达、纯化目的类蛋白
即利用BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞转化类蛋白表达质粒，诱导表达目的蛋白，利用镍柱亲和层析纯化法纯化类蛋白。取1μL正确构建的重组蛋白表达质粒加入BL21(DE3)感受态细胞中，冰上放置5min,42℃热击1.5min,加入200μL无抗液体LB培养基，于37℃180rpm/min孵育10min,涂布10μL于卡那抗性的固体培养基平板上，在37℃培养箱过夜培养。约12h后，挑取单克隆置于卡那抗性的液体LB培养基中，在180rpm/min，37℃的摇床中培养，直至菌液浑浊。取1mL菌液接种于1L含有1mL卡那的液体LB中，37℃，200rpm/min培养菌液OD值约为0.6-0.8，加入0.3mM IPTG,在16℃过夜培养。将该过夜诱导表达的重组蛋白菌液离心5000rpm/min,10min，后弃去上清液，收集菌体后利用超声细胞破碎仪超声3s,停止6s,直至将该细胞完全裂解在裂解缓冲液条件(lysis buffer：500mM NaCl,25mM Tris-HCl8.0)下，13000rpm/min离心1h，留下上清悬液，除去不可溶的细胞碎片。将上清液加入预平衡的镍柱基质中，结合后利用洗脱缓冲液洗脱，即可获得纯化后的类胶原蛋白。
步骤三，水凝胶的制备
利用巯基—二硫键交换反应在弱酸环境中活化的反应原理，将溶解于PBS的配对式半胱氨酸类胶原蛋白按照10％(w/v)含量逐滴加入预先制备好的弱酸性(PH＝4-5)醋酸盐缓冲液中，并反应48小时。反应后，将溶液置于预制的PDMS模子中，4℃放置48h。在诱导类胶原蛋白自发性交联后，将该体系置于冷冻干燥机中，冷冻干燥48小时。收集冻干体后，按照10％(w/v)浓度用超纯水回溶冻干粉，震荡直至冻干体完全溶解，即可获得该水凝胶。
实施例3
前端的CGG和后端的GGC的数量可以是一个，比如实施例1；也可以是两个，比如实施例2；亦可以是大于2的任一数字，本实施例提供一种通用仿生细胞外基质重组类蛋白超分子水凝胶的制备方法：
步骤一，设计类胶原蛋白基本序列
本发明设计的配对式半胱氨酸类胶原蛋白序列为M(CGG)nNADEQEEKAKVRTELIQELAQGLGGIEKKNFPTLGDEDLDHTYMTKLLTYLQEREQAENSWRKRLLKGIQDHALDGGPCPPCRYPISRPRKRGPKGEQGPQGLPGKDGEAGAQGPAGPMGPAGEQGEKGEPGTQGAKEDRGETGPKGPKGERGEAGPAGKDGEPGPVGPAGPKGEQGPQGLPGKDGEAGAQGPAGPMGPAGEQGEKGEPGTQGAKEDRGETGPKGPKGERGEAGPAGKDGEPGPVGPAGPKGEQGPQGLPGKDGEAGAQGPAGPMGPAGEQGEKGEPGTQGAKEDRGETGPKGPKGERGEAGPAGKDGEPGPVGPAGGPCPPCRGD(GGC)nC。
其主要是在源于酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)scl-2基因的N端引入V-domian，并以CPPC多肽连接。中间接入三重scl-2基因，且后续以CPPC和RGD两种多肽接入。重要的是，在整体序列N端和C端分别引入CGG和GGC多个配对式半胱氨酸多肽，且两端半胱氨酸多肽数量相等，即nN＝nC(n为任意正整数)。
步骤二，表达、纯化目的类蛋白
即利用BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞转化类蛋白表达质粒，诱导表达目的蛋白，利用镍柱亲和层析纯化法纯化类蛋白。取1μL正确构建的重组蛋白表达质粒加入BL21(DE3)感受态细胞中，冰上放置5min,42℃热击1.5min,加入200μL无抗液体LB培养基，于37℃180rpm/min孵育10min,涂布10μL于卡那抗性的固体培养基平板上，在37℃培养箱过夜培养。约12h后，挑取单克隆置于卡那抗性的液体LB培养基中，在180rpm/min，37℃的摇床中培养，直至菌液浑浊。取1mL菌液接种于1L含有1mL卡那的液体LB中，37℃，200rpm/min培养菌液OD值约为0.6-0.8，加入0.3mM IPTG,在16℃过夜培养。将该过夜诱导表达的重组蛋白菌液离心5000rpm/min,10min，后弃去上清液，收集菌体后利用超声细胞破碎仪超声3s,停止6s,直至将该细胞完全裂解在裂解缓冲液条件(lysis buffer：500mM NaCl,25mM Tris-HCl8.0)下，13000rpm/min离心1h，留下上清悬液，除去不可溶的细胞碎片。将上清液加入预平衡的镍柱基质中，结合后利用洗脱缓冲液洗脱，即可获得纯化后的类胶原蛋白。
步骤三，水凝胶的制备
利用巯基—二硫键交换反应在弱酸环境中活化的反应原理，将溶解于PBS的配对式半胱氨酸类胶原蛋白按照10％(w/v)含量逐滴加入预先制备好的弱酸性(PH＝4-5)醋酸盐缓冲液中，并反应48小时。反应后，将溶液置于预制的PDMS模子中，4℃放置48h。在诱导类胶原蛋白自发性交联后，将该体系置于冷冻干燥机中，冷冻干燥48小时。收集冻干体后，按照10％(w/v)浓度用超纯水回溶冻干粉，震荡直至冻干体完全溶解，即可获得水凝胶。
对比例1
本对比例提供一种现有水凝胶的制备方法：
将海藻酸钠(SA)加入NaCl溶液，常温搅拌均匀制得3％SA溶液，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)混合溶液，4℃活化3h；制备3％羧甲基壳聚糖(CMCS)水溶液，混匀两种液体制备水凝胶；将制备的SA/CMCS水凝胶负载1％刺五加/桂皮紫萁有效提取物，得到载刺五加/桂皮紫萁SA/CMCS水凝胶。
研究结果表明，载刺五加/桂皮紫萁SA/CMCS水凝胶敷料具有良好的机械强度、理化性能和抑菌抗炎功能，具有开发成为新型伤口敷料的潜力。与本发明相比，该制作水凝胶的方法，添加的材料含有化学药物提取物，且添加剂种类较多，操作步骤更复杂，其副作用会更大一些；但是本发明的水凝胶，不需要额外的添加药物提取物，即可以得到机械强度强、理化性能优和抑菌抗炎好的水凝胶。
对比例2
本对比例提供一种现有水凝胶的制备方法：
先将(聚乙烯醇)PVA原料按照增塑配方加入不同含量的淀粉、低相对分子质量聚酯(相对分子质量约300g/mol)，然后加入与PVA等量的蒸馏水进行混合，充分搅拌后，在室温下放置12h，使其充分溶胀。将溶胀后的PVA混合料加入密炼机中，进行熔融共混，密炼机加工温度设定为95℃，时长为10min，得到PVA增塑改性料。取5g共混改性后的PVA增塑改性料，使用平板硫化机进行压片制成规定厚度的薄膜，密封保存，平板硫化机上下板设定温度为95℃，压力为20MPa，即可制成PVA水凝胶膜。其中，PVA水凝胶膜凝胶含量随PVA相对分子质量的增加而增加。但是该水凝胶制备的过程较为复杂，且加入了其它化学材料，使得其生物相容性降低；但本发明是纯粹的生物方法制备而成，所以有更好的生物相容性。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Figure SMS_1
Figure SMS_2
Figure SMS_3
Figure SMS_4

Claims (9)

1.一种基因编码的重组类胶原蛋白超分子水凝胶的制备方法，其特征在于，包括设计自发交联型类胶原蛋白基本序列，表达、纯化目的类蛋白和利用纯化的类蛋白制备自发交联型蛋白基超分子水凝胶。
2.根据权利要求1所述一种基因编码的重组类胶原蛋白超分子水凝胶的制备方法，其特征在于，所述设计自发交联型类胶原蛋白基本序列是利用overlap PCR方式构建由CGG-Vdomain-CPPC-eCLP-GGC构成的类蛋白基本单元。
3.根据权利要求2所述一种基因编码的重组类胶原蛋白超分子水凝胶的制备方法，其特征在于，所述类蛋白基本单元构建方法为：先利用球状多肽V domain构建增强型类胶原蛋白分子；再在两者中间加入CPPC多肽结构；最后在序列N和C端加入配对式半胱氨酸多肽，得到类胶原蛋白基因。
4.根据权利要求3所述一种基因编码的重组类胶原蛋白超分子水凝胶的制备方法，其特征在于，所述增强型类胶原蛋白分子为GXY结构构成，其中G为甘氨酸，X、Y均为任意氨基酸。
5.根据权利要求3所述一种基因编码的重组类胶原蛋白超分子水凝胶的制备方法，其特征在于，所述增强型类胶原蛋白分子是由三个连续的突变型scl-2基因构成。
6.根据权利要求1所述一种基因编码的重组类胶原蛋白超分子水凝胶的制备方法，其特征在于，所述表达、纯化目的类蛋白的方法为将得到的类胶原蛋白基因，利用大肠杆菌生物合成该蛋白，并通过蛋白质纯化技术获得纯化蛋白。
7.根据权利要求1所述一种基因编码的重组类胶原蛋白超分子水凝胶的制备方法，其特征在于，所述利用纯化的类蛋白制备自发交联型蛋白基超分子水凝胶的方法为将纯化的蛋白通过冷冻干燥法冷冻干燥，获得相应蛋白产物冻干产出；将产物回溶于PBS溶液中，在4℃存放48小时以上，利用配对式半胱氨酸的巯基形成二硫键自发机制，制备自发交联型水凝胶。
8.一种基因编码的重组类胶原蛋白超分子水凝胶，其特征在于，所述凝胶是由权利要求1-7任一方法制备而成。
9.一种基因编码的重组类胶原蛋白超分子水凝胶应用于制备组织修复类产品。
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