CN115624524B - Peg化白蛋白修饰的溶瘤病毒静脉递送制剂的制备及其应用 - Google Patents
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Abstract
PEG化白蛋白修饰的溶瘤病毒静脉递送制剂的制备及其应用，属于生物技术领域，具体涉及一种PEG化白蛋白修饰的溶瘤病毒静脉递送制剂的制备及其在抗肿瘤方面的应用。该溶瘤病毒静脉递送制剂由溶瘤病毒、白蛋白及PEG组成，该PEG化白蛋白修饰的溶瘤病毒策略通过对溶瘤病毒进行修饰，掩蔽病毒表面抗原，延长了病毒在外周血中的循环时间，提高了溶瘤病毒的抗肿瘤疗效。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种PEG化白蛋白修饰的溶瘤病毒静脉递送制剂的制备及其在抗肿瘤方面的应用。
背景技术
近几十年来，癌症成为了世界范围内的一种高发病率和致死率的疾病，虽然根治性手术、化疗、放疗、靶向及免疫治疗等多种治疗策略在癌症中得到应用，癌症的预后得到一定提升，但仍有许多恶性肿瘤的治疗效果不佳。伴随现代分子生物学、分子免疫学等学科的飞速发展，肿瘤的生物治疗已成为继手术、放疗和化疗之后的第四大治疗模式。作为一种重要的生物治疗策略，溶瘤病毒(Oncolytic Virus,OV)由于良好的肿瘤杀伤效果和高选择性而备受关注。溶瘤病毒(OV)是一类天然存在或经基因改造后能够有效感染并杀灭肿瘤细胞的病毒。根据病毒是否存在包膜结构，OV可分为包膜病毒(如疱疹病毒、痘苗病毒、麻疹病毒、水疱性口炎病毒等)及非包膜病毒(如腺病毒、细小病毒、呼肠病毒、柯萨奇病毒、新城疫病毒等)两大类。溶瘤病毒能够通过多种机制杀伤肿瘤细胞，一方面能够选择性的在肿瘤细胞内进行复制，引发肿瘤细胞的直接裂解；另一方面，肿瘤细胞裂解后释放出大量肿瘤相关抗原，促进抗原呈递细胞、CD8+T细胞和自然杀伤细胞等多种免疫细胞的募集和活化，进而激活抗肿瘤免疫反应。全世界目前已有多种溶瘤病毒产品被批准用于临床，其中较为著名的两种分别是我国于2005年批准的5型腺病毒(Adenovirus 5，Ad5)H101和2015年美国批准的单纯疱疹病毒(Talimogene Laherparepvec，T-VEC)。2000至2020年间，世界范围内已开展了近100项溶瘤病毒为核心的临床研究，病毒种类以腺病毒、疱疹病毒-1、呼肠弧病毒为主。
随着近些年来对溶瘤病毒抗肿瘤研究的深入，进一步促进了使用溶瘤病毒对肿瘤进行生物治疗的发展。尽管溶瘤病毒疗法在癌症治疗中有着巨大的优势，但临床治疗指南中几乎没有推荐溶瘤病毒作为恶性肿瘤的治疗方法。溶瘤病毒需要通过合适的给药方式送入肿瘤组织，并在肿瘤组织内复制进而产生抗肿瘤效果。目前溶瘤病毒递送的主要方式为经皮瘤内注射及静脉注射，但均存在较大问题。溶瘤病毒经皮瘤内注射给药虽然能够提高肿瘤部位的病毒浓度，瘤内注射时病毒在肿瘤组织高度致密的间质组织和肿瘤微环境的高间质压力共同作用下，其渗透能力严重受限，治疗效果难以保证。此外，经皮瘤内注射给药往往需要使用超声、计算机断层扫描、核磁共振成像等技术辅助引导给药，其操作繁琐复杂，患者依从性不佳，并且操作同时存在出血，穿孔等风险，且费用昂贵。
与瘤内注射相比，静脉注射溶瘤病毒治疗肿瘤具有两大优势：一是静脉注射克服了瘤内注射所带来的实际操作困难和患者较差的依从性。二是静脉注射能够有效的将溶瘤病毒递送至全身各处。尽管溶瘤病毒的静脉递送有着诸多优点，但在临床实际情况中，静脉递送的治疗效果却远不如预期，溶瘤病毒的静脉递送还存在瓶颈问题。溶瘤病毒进入体循环后，表面的抗原蛋白的异源性激活自身免疫系统，外周血中的抗体补体将与病毒结合形成免疫复合物，并促进病毒被肝脏和脾脏等免疫器官内吞截流，将溶瘤病毒从外周血中清除，这一过程将极大的降低溶瘤病毒的外周循环时间。此外，由于溶瘤病毒往往需要多次给药才能达到治疗目的，而多次给药易导致患者血清中产生大量病毒中和抗体及补体，抗体补体的中和作用以及人体外周循环系统中的巨噬细胞等免疫细胞对病毒的吞噬与清除作用将大大影响病毒静脉递送的效率，进而影响疗效。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足，提供一种高效的可静脉注射的溶瘤病毒静脉递送制剂的制备方法和应用。该溶瘤病毒静脉递送制剂由溶瘤病毒、白蛋白及PEG组成，该PEG化白蛋白修饰的溶瘤病毒策略通过对溶瘤病毒进行修饰，掩蔽病毒表面抗原，延长了病毒在外周血中的循环时间，提高了溶瘤病毒的抗肿瘤疗效。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明所述的PEG化白蛋白修饰的溶瘤病毒静脉递送制剂的制备方法，包括以下步骤：
称取一定量的聚乙烯亚胺(PEI)(M.W.800-10000)和血清白蛋白(BSA)分别溶于PBS溶液中，PEI溶液的浓度为100-300μg/ml，BSA溶液的浓度为50-200mg/ml；按溶质分子数与病毒粒子数比，即PEI分子数:溶瘤病毒粒子数＝30000:1的条件下，将PEI溶液与溶瘤病毒混合均匀得到PEI包裹的溶瘤病毒，PEI可以通过静电作用吸附在溶瘤病毒表面；
按溶质质量与病毒粒子数比，即BSA:溶瘤病毒粒子＝40:5E9(单位为mg:VP)的条件下，将得到的PEI包裹的溶瘤病毒与BSA溶液混匀后，室温静置10-15min，静电作用下白蛋白吸附在PEI包裹的溶瘤病毒的表面，得到BSA修饰的溶瘤病毒悬液；
按溶质质量与病毒粒子数比，即PEG封端的脂质体水溶液:溶瘤病毒粒子＝0.3:E9(单位为mg:VP)，将PEG封端的脂质体水溶液与BSA修饰的溶瘤病毒悬液混合均匀后，进行冰浴超声获得PEG化白蛋白修饰的溶瘤病毒悬液，即通过PEG封端的脂质体对白蛋白溶瘤病毒进行包被，从而实现白蛋白的PEG化，即PEG化白蛋白修饰的溶瘤病毒静脉递送制剂。
上述PEG化白蛋白修饰的溶瘤病毒静脉递送制剂的制备方法，其中：
将PEG封端的脂质体水溶液与BSA修饰的溶瘤病毒悬液混合均匀后，进行冰浴超声，超声时间为8-12min，冰浴温度为0-8摄氏度。
所述的PEG封端的脂质体由磷脂酰胆碱(PC)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺聚乙二醇(DSPE-PEG)以及胆固醇制得，三者质量比为3.6:0.4:1.2。PEG封端的脂质体的制备过程为：将PC、DSPE-PEG和胆固醇按质量比混合溶解于有机溶剂，室温旋蒸除去有机溶剂，制得PEG封端的脂质体。
所述溶瘤病毒为11亚型。
本发明采用以下方法对制备的PEG化白蛋白修饰的溶瘤病毒静脉递送制剂进行检测：
(1)采用Zeta/激光粒度仪以及扫描电子显微镜对PEG化白蛋白修饰的溶瘤病毒的粒径进行表征。
(2)体外水平通过细胞摄取实验、免疫共沉淀实验以及抵抗抗体结合的细胞转染实验验证PEG化白蛋白修饰的溶瘤病毒的表面抗原掩蔽效果。
(3)采用药物代谢检测实验和qPCR实验，研究PEG化白蛋白修饰的溶瘤病毒在体内的循环情况和在体内的生物分布情况。
(4)采用细胞转染实验研究制剂在体内引起的抗病毒免疫反应的强弱，验证白蛋白修饰在体内循环过程中对溶瘤病毒表面抗原的屏蔽效果。
(5)通过考察皮下瘤体积和转移瘤荧光强度来评价制剂的抗肿瘤效果。
本发明还提供所述的PEG化白蛋白修饰的溶瘤病毒静脉递送制剂在肿瘤治疗中的应用。该制剂极大地提高了溶瘤病毒静脉注射后的抗肿瘤疗效。本发明中具体实施方式以溶瘤腺病毒11亚型(adenovirus 11,ad11)为例，验证该制剂的体内与体外功能。
本发明的有益效果：
通过体外抗巨噬细胞摄取实验，免疫共沉淀实验(IP)以及体内给药后血浆中抗病毒抗体滴度检测实验说明PEG化白蛋白修饰的溶瘤病毒具有较低的免疫原性，证实了PEG化白蛋白对病毒表面抗原具有良好的掩蔽作用。随后通过制剂的分布检测和制剂针对皮下瘤和转移瘤模型的疗效检测证实了PEG化白蛋白溶瘤病毒在体内水平的抗肿瘤能力。
经静脉注射后，相比于普通溶瘤病毒，PEG化白蛋白修饰溶瘤病毒在外周血中的循环时间更长，肿瘤组织的富集能力更强，且具有更佳的抗皮下瘤和转移瘤疗效。
附图说明
图1PEG化白蛋白修饰的溶瘤病毒静脉递送制剂制备过程示意图：
图2PEG化白蛋白修饰的ad11的构建及表征检测。Zeta/激光粒度仪检测普通ad11(bare ad11)，Lip-ad11，ad11-PEI-BSA和ad11-PEI-BSA-Lip的粒径。
图3PEG化白蛋白修饰的ad11的体外功能检测。a：2组制剂(bare ad11，以及ad11-PEI-BSA-Lip)分别与抗ad11中和抗体共孵育后，检测各组制剂未与病毒中和抗体结合的病毒的含量。b：流式细胞学检测2组制剂(bare ad11，以及ad11-PEI-BSA-Lip)与中和抗体共孵育前后的病毒转染活性检测。**P<0.01,***P<0.001,“ns”代表无统计学差异。
图4PEG化白蛋白修饰的溶瘤病毒制剂的体内水平功能检测。a：4组制剂经静脉注射后，各时刻外周血中病毒含量。ID％代表“initial dose％”。b：bare ad11，Lip-ad11，ad11-PEI-BSA，ad11-PEI-BSA-Lip经静脉注射7天后血浆中抗ad11的中和抗体的滴度。
图5各组制剂的分布。a-b：利用Cy5.5-NHS对ad11进行标记，构建ad11-NHS-Cy5.5，检测各组制剂在荷TC-1皮下瘤小鼠中的分布。G1：Bare ad11；G2：Lip-ad11；G3：ad11-PEI-BSA；G4：ad11-PEI-BSA-Lip。c：qPCR实验定量检测各组制剂在荷TC-1皮下瘤小鼠中的分布。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，“ns”代表无统计学差异。
图6各组制剂抗皮下实体肿瘤药效学检测。
图7各组制剂抗转移瘤药效检测。a：小动物活体成像系统检测转移瘤生长情况。b：21天时各组小鼠的肺转移生物发光图像荧光强度定量。c：各组转移瘤实体图片。d：各组模型小鼠肺部转移瘤结节定量。
具体实施方式
为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明的技术方案进行详细描述。需要特别指出的是，具体实施例和附图仅是为了说明，本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。
普通ad11，简称bare ad11；
白蛋白修饰的溶瘤病毒(ad11-PEI-BSA)悬液；
PEG化白蛋白修饰的ad11(ad11-PEI-BSA-Lip)悬液；
以下作为对照：
制备得到的PEG封端的脂质体，与ad11混匀后使用超声法制备得到PEG化的脂质体包被溶瘤病毒(Lip-ad11)静脉递送制剂，简称Lip-ad11制剂；
对比例1
同实施例1，区别在于，ad11并未进行PEI和BSA的包被，直接与脂质体悬液(PEG-Lip)混匀后使用冰浴超声法制得脂质体包被ad11悬液；
本实施例选择溶瘤腺病毒11亚型(ad11)为代表，利用PEG封端的脂质体为例，对白蛋白进行PEG化及进一步对ad11进行PEG化白蛋白修饰(如图1所示)；
以下实施例采用的实验数据统计方法：多组比较采用一步ANOVA法，两组比较采用双侧t检验法。
实施例1：PEG化白蛋白修饰的溶瘤病毒递送制剂的构建
称取一定量的PEI(M.W.800-10000)和BSA分别溶于PBS溶液中，PEI溶液的浓度为100-300μg/ml，BSA溶液的浓度为50-200mg/ml。随后将PEI溶液与溶瘤病毒混匀后(病毒粒子数与PEI分子数对应关系为1：30000)得到PEI包裹的ad11。
然后将得到的PEI包裹的ad11与BSA溶液混匀后(病毒粒子数与BSA对应关系为5E9VP：40mg)，室温静置10-15min，得到BSA修饰的ad11(ad11-PEI-BSA)。
PEG化脂质体制备方法为薄膜水化法。具体操作如下：3.6mg磷脂酰胆碱(PC)、0.4mg DSPE-PEG和1.2mg胆固醇(三者质量比为：9:1:3)用2-5mL二氯甲烷溶解后加入到50mL茄形瓶中，室温下旋转蒸发除去二氯甲烷，形成脂质薄膜。加入2-4mL纯水或PBS后室温搅拌水化0.5-1h得到PEG封端的脂质体水溶液。随后将上述得到的ad11-PEI-BSA与脂质体水溶液混匀后(脂质体与病毒粒子数对应关系为0.3mg：109VP)冰浴超声8-12min，得到PEG化脂质体修饰的白蛋白溶瘤病毒(ad11-PEI-BSA-Lip)悬液(制备过程示意图如图1所示)。
如图1所示，本实施例1中首先，PEI和BSA溶解于PBS形成PEI和BSA溶液，PEI溶液与ad11共孵育使正电性的PEI吸附于带负电的ad11表面，得到PEI包裹的ad11(以，下简称PEI-ad11)，再将PEI-ad11与BSA溶液共孵育使负电性的BSA吸附于带正电的PEI-ad11表面，得到BSA包裹的PEI-ad11(以下简称ad11-PEI-BSA)。磷脂、DSPE-PEG和胆固醇成膜并水化后得到PEG封端的脂质体(PEG-Lipo)，将ad11-PEI-BSA与PEG-Lipo混匀后通过超声法制备PEG化白蛋白修饰溶瘤病毒(以下简称ad11-PEI-BSA-Lip)，即通过脂质体对白蛋白溶瘤病毒包被的方式，实现白蛋白的PEG化。
为了便于下一步进行体外表征及体内药动学和药效学的实验，未特别指定的情况下，ad11-PEI-BSA和ad11-PEI-BSA-Lip均采用上述方法进行制备。同上，不将ad11与PEI和BSA共孵育，直接将其与PEG封端的脂质体混匀后使用超声法制备得到的Lip-ad11作为对照品。
实施例2：PEG化白蛋白修饰的ad11的验证及表征检测
电位/激光粒度仪测定结果显示，相较于bare ad11平均粒径为102.2±1.9nm，ad11-PEI-BSA-Lip平均粒径为213.4±2.3nm，在经由PEG化白蛋白修饰后，粒子的粒径明显增大说明了PEG化白蛋白修饰ad11构建成功(图2)。
实施例3：体外水平检测PEG化白蛋白修饰的溶瘤病毒静脉递送制剂的抗原掩蔽能力
采用免疫沉淀法(IPA法)检测脂质体包被的白蛋白修饰的ad11制剂相较于普通ad11与中和抗体的结合能力是否变化。由于市面上没有可以用于IPA法的ad11抗体，我们在用ad11预免疫的小鼠血清中提取获得了可以用于IPA的ad11中和抗体，并预先测定了ad11中和抗体的滴度。将含有ad11中和抗体的血清按1:100稀释后与各组ad11制剂(107pfu/ml)混合，在4℃共孵育1h后向混合物中加入Protein G包被的琼脂糖珠(Beyotime，中国)孵育1h。最后以6000rpm离心1min，收集上清液。用qPCR法测定上清液中ad11的残留量。结果显示，ad11-PEI-BSA-Lip组上清中剩余的ad11的含量明显多于bare ad11组(图3a)，说明PEG化白蛋白修饰的ad11制剂具有良好的抗中和抗体结合效果。
本发明中所采用的ad11具有GFP基因，ad11感染细胞后能够使细胞表达GFP蛋白，从而可以被激发发出绿色荧光。将含有抗ad11中和抗体的血清按1:800稀释后与制备好的bare ad11和ad11-PEI-BSA-Lip制剂(107pfu/ml)混合，在37℃下共孵育2h，制备得到baread11+Ab以及ad11-PEI-BSA-Lip+Ab两种预先被抗ad11中和抗体结合的ad11制剂。将106个HCT-116细胞接种在共聚焦皿中以37℃，5％ CO2浓度培养过夜使细胞贴壁，将bare ad11(G1)、ad11-PEI-BSA-Lip(G2)、bare ad11+Ab(G3)以及ad11-PEI-BSA-Lip+Ab(G4)分别以20pfu/cell的量加入HCT116细胞中培养4小时，随后撤去病毒培养基，继续培养细胞24h后利用流式细胞学检测各组细胞中GFP阳性细胞的比例说明PEG化白蛋白对ad11表面抗原的掩蔽作用。结果显示bare ad11、ad11-PEI-BSA-Lip以及ad11-PEI-BSA-Lip+Ab组GFP阳性的细胞比例基本没有差异，而bare ad11+Ab组GFP阳性的细胞比例大大下降(图3b)。以上两项结果说明PEG化白蛋白对溶瘤病毒进行修饰后，能够完全屏蔽病毒表面抗原，完全阻止病毒与抗病毒中和抗体的结合。
实施例4：体内水平检测PEG化白蛋白修饰的溶瘤病毒静脉递送制剂的抗原掩蔽能力
将各组制备好的ad11制剂(bare ad11，Lip-ad11，ad11-PEI-BSA，ad11-PEI-BSA-Lip)静脉注射至C57小鼠体内，不同时间点(5，30min，1，2，4，8h)颌下静脉取血，使用全血DNA提取试剂盒(AxyGEN，中国)，用qPCR法检测血液中剩余ad11的含量。结果显示，与Lip-ad11、ad11-PEI-BSA和Bare ad11相比，ad11-PEI-BSA-Lip的循环时间显著延长(图4a)，而ad11-PEI-BSA和Lip-ad11的体内循环时间与Bare ad11相似。
将bare ad11、Lip-ad11、ad11-PEI-BSA以及ad11-PEI-BSA-Lip经静脉注射至小鼠体内。7天后取小鼠的血清，检测小鼠血清中抗ad11的中和抗体的滴度。简单地说，HCT116细胞以每孔10000个细胞的数量接种在96孔板中，并培养过夜。将含中和抗体的血清样本在56℃孵育至补体失活，然后在96孔板中用DMEM稀释不同倍数。向稀释的血清中加入ad11，37℃预孵育1h。然后将与血清共孵育完成后的ad11以MOI＝10pfu/cell的比例加入96孔板各个细胞孔中。孵育1h后，去除含血清与ad11的培养基，加入新鲜培养基。再培养4天，采用流式细胞术(CytoFlex S,Beckman Coulter)检测细胞GFP阳性率。本方法为采用稀释倍数法测定血清中和抗体滴度，使GFP转染的抑制率达到50％。结果显示，ad11-PEI-BSA-Lip和ad11-PEI-BSA两种白蛋白修饰的溶瘤病毒制剂注射至小鼠体内后，血清中和抗体滴度远小于bare ad11和Lip-ad11组。说明ad11-PEI-BSA-Lip和ad11-PEI-BSA引起的周身抗病毒反应弱于普通ad11和Lip-ad11，进一步显示了我们的白蛋白修饰溶瘤病毒策略无论白蛋白表面是否进行PEG化均能够在外周血中保护ad11不被免疫系统识别，降低了病毒引起的周身的炎症反应(图4b)。以上结果在体内水平证明了PEG化白蛋白修饰的溶瘤病毒较其他各组制剂具有着更好的循环和抗原掩蔽效果。
实施例5：白蛋白修饰的溶瘤病毒递送制剂的组织分布研究
为了检测PEG化白蛋白溶瘤病毒的肿瘤富集能力，我们利用一种高表达人源CD46受体的小鼠来源的肺癌TC-1-hCD46细胞构建C57小鼠肩部皮下瘤模型，待肿瘤大小达到80-100mm3后进行后续实验操作。利用Cy5.5-NHS对ad11进行标记，构建ad11-NHS-Cy5.5，然后按上述制备方法成功制备了带有Cy5.5荧光的各组制剂(bare ad11、Lip-ad11、ad11-PEI-BSA以及ad11-PEI-BSA-Lip)进行荧光制剂的体内组织分布研究。将各组制剂等剂量静脉注射至C57皮下瘤小鼠体内，于不同时间点(1，2，4，8，24，48h)在小动物活体荧光/生物发光成像系统下拍摄荷瘤小鼠肿瘤部位的荧光图像(图5a)，然后利用小动物活体荧光/生物发光成像分析软件进行荧光强度的定量，如图5b所示，在各个时间点，ad11-PEI-BSA-Lip组小鼠肿瘤处的制剂荧光强度均显著高于bare ad11，Lip-ad11和ad11-PEI-BSA组，表明脂质体包被的白蛋白修饰的溶瘤病毒递送制剂具有最好的肿瘤靶向富集效果。ad11-PEI-BSA组的肿瘤靶向效果在1h和2h时间点相较于bare ad11和Lip-ad11组也有改善，但效果不如ad11-PEI-BSA-Lip组。
采用qPCR法进一步对组织分布进行研究，用同样方法构建TC-1-hCD46肩部皮下荷瘤小鼠模型，待肿瘤大小至80-100mm3后，分别将各组制剂(bare ad11、Lip-ad11、ad11-PEI-BSA以及ad11-PEI-BSA-Lip)静脉注射入小鼠体内，2h后取小鼠主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)以及实体肿瘤，称重并匀浆，用Fast-pure Cell/Tissue DNA Isolation Mini Kit(Vazyme)收集脏器及实体瘤DNA，以未注射任何ad11相关制剂的空白小鼠的各脏器及实体肿瘤作为标准。结果显示，ad11-PEI-BSA-Lip组小鼠肿瘤处的ad11拷贝数显著高于baread11，Lip-ad11和ad11-PEI-BSA组，约为其他组的5-10倍左右(图5c)，而在肝脏中ad11-PEI-BSA-Lip组的ad11拷贝数低于bare ad11，Lip-ad11和ad11-PEI-BSA组。该结果证实PEG化白蛋白修饰的溶瘤病毒具有更佳的肿瘤靶向能力。
实施例6：PEG化白蛋白修饰的溶瘤病毒递送制剂的抗肿瘤效果研究
采用TC-1-hCD46细胞作为模型细胞，在6周龄雄性C57小鼠右侧肩部皮下注射2×106个细胞，构建皮下肿瘤模型。当肿瘤体积达到80-100mm3时，小鼠随机分为5组，每隔一天分别以108pfu ad11或等量PBS的剂量静脉注射bare ad11、Lip-ad11、ad11-PEI-BSA以及ad11-PEI-BSA-Lip，共5次(0，2，4，6，8天)。肿瘤体积每隔一天测量并计算一次(0，2，4，6，8，10，12天)，计算公式为:体积＝长度*宽度2*π/6，直至肿瘤体积达到1500mm3以上。将监测计算出的肿瘤体积绘制肿瘤随时间生长曲线(图6a)，并于第12天监测肿瘤体积后处死动物，剖出实体瘤进行离体肿瘤大小的比较(图6b)。从肿瘤生长曲线和实体肿瘤图片显示，ad11-PEI-BSA-Lip组的肿瘤生长几乎完全被抑制，从离体肿瘤图片可以更加清晰直观地显示ad11-PEI-BSA-Lip在实验终点时肿瘤最小。而ad11-PEI-BSA组的治疗效果虽然不及ad11-PEI-BSA-Lip组，但也能对肿瘤生长产生明显的抑制效果。上述结果表明PEG化白蛋白修饰的溶瘤病毒递送制剂具有最佳的皮下瘤抑制效果。
将106个TC-1-hCD46-luc细胞静脉注射到c57小鼠体内，产生肺转移瘤模型。1d后，将构建成功的生物发光肺转移瘤小鼠随机分为5组，每隔一天分别以108pfu ad11或等量PBS(G1)的剂量静脉注射bare ad11(G2)、Lip-ad11(G3)、ad11-PEI-BSA(G4)以及ad11-PEI-BSA-Lip(G5)，共6次(2，4，6，8，10，12天)，整个转移瘤药效学流程图如图7a所示。利用小动物活体生物发光成像系统(PerkinElmer,USA)对小鼠每隔一段时间进行一次生物发光成像以监测肺转移瘤的生长情况(1，5，9，13，17，21天)，处理完成的在体转移瘤生物发光图像(图7b)清晰地显示了各组小鼠的肺转移瘤进展过程，可以看到PBS组小鼠的转移瘤进展迅速，肿瘤细胞生物发光面积和强度随时间增加而逐渐增大，相比之下，bare ad11和Lip-ad11组小鼠的肺转移瘤进展速度虽然不及PBS组小鼠，但进展仍相对较快。ad11-PEI-BSA组小鼠的肺转移瘤进展速度低于bare ad11和Lip-ad11组小鼠。而ad11-PEI-BSA-Lip组小鼠的肺转移瘤基本没有明显进展，甚至在肺转移瘤生物发光图像药效学监测终点时，小鼠肺转移瘤部位的生物发光基本消失。对第21天的各组小鼠生物发光图像的荧光强度进行定量分析绘制柱状图，结果显示，ad11-PEI-BSA-Lip组相较于其他各组，小鼠肺转移瘤荧光消失，说明ad11-PEI-BSA-Lip制剂基本治愈了肺转移模型小鼠的肺转移(图7d)。在第21天的生物发光成像监测后处死动物，心脏灌流，取出各组小鼠的肺，用Bouin’s染色液进行浸染固定后，拍照得到各组小鼠肺转移瘤实体图像(图7e)，可以看到ad11-PEI-BSA-Lip组小鼠肺表面转移瘤结节显著少于bare ad11、Lip-ad11、ad11-PEI-BSA组小鼠。对各组模型小鼠肺部转移瘤结节进行计数后的结果如图7c所示，PBS，bare ad11和Lip-ad11组小鼠的肺转移瘤结节数量几乎没有差别，而ad11-PEI-BSA组小鼠肺转移瘤结节数目少于前三组。相比之下，ad11-PEI-BSA-Lip组小鼠肺转移结节数目最少。以上结果显示，ad11-PEI-BSA相较于bare ad11和Lip-ad11制剂，有增强的肺转移瘤治疗效果，ad11-PEI-BSA-Lip组制剂相对于其他各组不仅对皮下实体瘤有最好的治疗效果，对于转移瘤的治疗效果也十分显著。
Claims (5)
1.一种PEG化白蛋白修饰的溶瘤病毒静脉递送制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
称取一定量的PEI和BSA分别溶于PBS溶液中制备溶液；按溶质分子数与病毒粒子数比，即PEI分子数:溶瘤病毒粒子数=30000:1的条件下，将PEI溶液与溶瘤病毒混合均匀得到PEI包裹的溶瘤病毒，PEI可以通过静电作用吸附在溶瘤病毒表面；
按溶质质量与病毒粒子数比，即BSA:溶瘤病毒粒子=40:5E9，单位为mg:VP，将得到的PEI包裹的溶瘤病毒与BSA溶液混匀后，室温静置10-15min，静电作用下白蛋白吸附在PEI包裹的溶瘤病毒的表面，得到BSA修饰的溶瘤病毒悬液；
按溶质质量与病毒粒子数比，即PEG封端的脂质体水溶液:溶瘤病毒粒子=0.3:E9，单位为mg:VP，将PEG封端的脂质体水溶液与BSA修饰的溶瘤病毒悬液混合均匀后，进行冰浴超声获得PEG化白蛋白修饰的溶瘤病毒悬液，即通过PEG封端的脂质体对白蛋白溶瘤病毒进行包被，从而实现白蛋白的PEG化，即PEG化白蛋白修饰的溶瘤病毒静脉递送制剂；所述的PEG封端的脂质体由磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺聚乙二醇以及胆固醇制得，三者质量比为3.6: 0.4:1.2。
2.根据权利要求1所述的PEG化白蛋白修饰的溶瘤病毒静脉递送制剂的制备方法，其特征在于，制备的PEI溶液的浓度为100-300 μg/ml，BSA溶液的浓度为50-200 mg/ml。
3.根据权利要求1所述的PEG化白蛋白修饰的溶瘤病毒静脉递送制剂的制备方法，其特征在于，将PEG封端的脂质体水溶液与BSA修饰的溶瘤病毒悬液混合均匀后，进行冰浴超声，超声时间为8-12min，冰浴温度为0-8摄氏度。
4.根据权利要求1所述的PEG化白蛋白修饰的溶瘤病毒静脉递送制剂的制备方法，其特征在于，所述溶瘤病毒为11亚型。
5.一种PEG化白蛋白修饰的溶瘤病毒静脉递送制剂在制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述PEG化白蛋白修饰的溶瘤病毒静脉递送制剂由权利要求1-4任一项所述制备方法制备得到。
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