BRPI0512757B1 - Método de estabilização de lipossomos catiônicos em formulações aquosas, produto de lipossomo, adjuvante de vacina, vacina contra clamídia, malária ou tuberculose e sistema de distribuição - Google Patents

Abstract

método de estabilização de lipossomos catiônicos em formulações aquosas, produto de lipossomo, adjuvante de vacina, vacina contra clamídia, malária ou tuberculose e sistema de distribuição. a presente invenção refere-se a formulações de lipossomos que são fisicamente estáveis. em particular, a presente invenção refere-se à estabilização estérica de lipossomos catiônicos por incorporação de glicolipídios nos lipossomos. os lipossomos estabilizados podem ser utilizados como um adjuvante para componentes antigênicos ou como um sistema de distribuição de medicamentos. em particular, a invenção refere-se a vacinas com adjuvantes em meios aquosos para imunização, em que o produto final é estável.

Description

MÉTODO DE ESTABILIZAÇÃO DE LIPOSSOMOS CATIÔNICOS EM FORMULAÇÕES AQUOSAS, PRODUTO DE LIPOSSOMO, ADJUVANTE DE VACINA, VACINA CONTRA CLAMÍDIA, MALÁRIA OU TUBERCULOSE E SISTEMA DE DISTRIBUIÇÃO Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a formulações de lipossomos que são fisicamente estáveis. Em particular, a presente invenção refere-se à estabilização estérica de lipossomos por um método de película única, pelo qual se incorporam glicolipídios nos lipossomos. Os lipossomos estabilizados podem ser utilizados como um adjuvante para componentes antigênicos ou como um sistema de distribuição de medicamentos. Em particular, a invenção refere-se a vacinas com adjuvantes em meios aquosos para imunização, em que o produto final é estável.

Antecedentes da Invenção

As primeiras vacinas utilizadas em seres humanos para produzir imunidade contra doenças infecciosas consistiam em patógenos vivos atenuados. As formas atenuadas eram organismos intimamente relacionados de ocorrência natural ou obtidos mediante passagens seriadas em cultura. Um exemplo é a tuberculose, que é combatida por vacinação com cepas atenuadas, mas vivas, de Mycobacterium bovis (vacina BCG) . Entretanto, a eficácia desse procedimento nem sempre confere uma resistência satisfatória à tuberculose humana em todas as populações. Há, conseqüentemente, necessidade de maneiras novas e eficientes de produzir imunidade contra a tuberculose e outras doenças infecciosas. Uma abordagem particularmente promissora foi isolar e usar formas recombinantes de antígenos imunodominantes, como o alvo antigênico secretório precoce (ESAT-6) e o antígeno 85 (Ag85) como uma vacina. Essas vacinas são bem definidas, e as reações colaterais são minimizadas. Infelizmente, muitas substâncias altamente purificadas, por exemplo, proteínas recombinantes purificadas, não são muito imunogênicas e não produzem uma resposta imune eficaz protetora contra a doença infecciosa real. Esse fato é bem conhecido, e foram feitas muitas tentativas para aumentar as propriedades imunogênicas por combinação da substância em questão com os chamados adjuvantes. Dependendo do patógeno, a proteção pode requerem que uma resposta humoral ou mediada por células predomine. O desenvolvimento de um tipo específico de resposta imune (humoral ou mediada por células) pode ser determinado pela escolha do adjuvante.

Imunidade protetora contra um patógeno intracelular, como M. tuberculosis, requeruma resposta imune mediada por células, e um adjuvante adequado para uma vacine de subunidade dirigida contra TB deve intensificar a resposta Thl (Lindblad et al. , 1997). Acredita-se, genericamente, que anticorpos não desempenhem uma função importante na imunidade à TB, ao passo que a liberação mediada por células de IFN-gama (interferon gama) é a citocina mais importante envolvida na proteção (Collins e Kaufmann, 2001).

Um grande número de adjuvantes que induzem uma resposta imune mediada por células foi sugerido, mas, em geral, sem nenhum como ideal em todos os aspectos.

Um tipo particularmente eficaz de adjuvante que promove uma resposta imune mediada por células são compostos de amónio quaternário, como dimetildioctadecilamônio (DDA) (Hilgers e Snippe, 1992). DDA é um anfifílico sintético compreendendo um grupo de cabeça dimetilamônio positivamente carregado hidrofílico e duas cadeias alquila hidrofóbicas longas. Em um ambiente aquoso, DDA se auto-monta formando bicamadas vesiculares similares a lipossomos feitos de fosfolipídios naturais. Foram descritas combinações de DDA e outros agentes imunomoduladores. A administração de Arquad 2HT, que compreende DDA, a seres humanos foi promissora e não induziu efeitos colaterais aparentes (Stanfield et al., 1973) . Uma vacina experimental à base de proteínas do filtrado de cultura de M. tuberculosis e DDA gerou uma resposta imune protetora contra TB em camundongos (Andersen, 1994) . A vacinação de camundongos com uma proteína de fusão das proteínas de M. tuberculosis ESAT-6 e Ag85B, e DDA/MPL como adjuvante, confere proteção similar à obtida pela vacinação com BCG (Olsen et al., 2001). Esses estudos demonstram que, em contraste com, por exemplo, alúmen, adjuvantes à base de DDA são capazes de induzir uma resposta imune protetora contra TB em camundongos. Além disso, DDA foi utilizado como um adjuvante para uma vacina de DNA contra o vírus da pseudorraiva, gerando maiores respostas de células T e imunidade antiviral (van Rooij et al., 2002) .

A adição de emulsões oleosas de TDM (6,6'-dimicolato de alfa,alfa'-trealose) a soluções de DDA foi investigada por Woodard et al. (198 0) como adjuvantes para vacinas contra Brucella abortus à base de bactérias mortas pelo calor. Nem DDA isoladamente nem misturas de DDA e TDM foram capazes de induzir proteção. Em outro estudo de uma vacina de subunidade de Brucella abortus à base de um extrato de proteínas solúveis, uma combinação de DDA e TDM também foi utilizada como adjuvante (Dzata et al., 1991), e se verificou que a mistura intensificava as respostas imunes (níveis de anticorpos, resposta de teste cutâneo e níveis de IL-2) observadas, em comparação com apenas DDA. Holten-Anderesn et al. (2004) estudaram uma combinação de lipossomos de DDA e uma suspensão de TDB (6,6'-dibeenato de alfa, alfa'-trealose) , e se verificou que a administração do antígeno ESAT-6 com essa mistura adjuvante induzia uma forte resposta imune protetora contra tuberculose, que era significativamente mais alta do que quando ESAT-6 era administrado em lipossomos de DDA.

Infelizmente, suspensões de compostos de amônio quaternário anfifílicos, como DDA apenas ou misturas de DDA e MPL, TDM ou TDB, conforme acima descrito, são fisicamente instáveis, e o armazenamento prolongado a 4°C não é possível sem a ocorrência de agregação e precipitados. Como a precipitação impede o uso clínico da formulação, a falta de estabilidade de formulações de DDA foi até agora o maior obstáculo a qualquer aplicação em seres humanos.

Na patente britânica n° 2147263-A, Takahashi e Tsujii descrevem a estabilização de vesículas de compostos de amônio quaternário por misturação de dois compostos de amônio quaternário entre si ou adição de vários detergentes ao compostos de amônio quaternário.

Na patente norte-americana n° 5.026.546, Hilgers e Weststrate descrevem a estabilização de uma suspensão adjuvante de DDA com um polímero de ácido acrílico reticulado com polialil sacarose.

A liofilização de complexos de lipídio catiônico-protamina-DNA para transfecção de células foi descrita por Li et al. (2000) . Avaliou-se o efeito da adição de crioprotetores tradicionais, como monossacarídeos e dissacarídeos, e se verificou que dissacarídeos preservavam o tamanho de partícula melhor do que monossacarídeos. Da mesma forma, complexos de lipídio-protamina-DNA não liofilizados estabilizados com sacarose a 10% mantiveram um tamanho de partícula estável após 8 semanas de armazenamento a 4°C, mas a eficiência de transfecção era maior em amostras liofilizadas do que nas não liofilizadas.

A patente norte-americana n° 5.922.350 descreve um método para prolongar o armazenamento de lipossomos, por exemplo, à base de fosfolipídios, por adição de açúcares como trealose e sacarose antes da desidratação dos lipossomos.
Além disso, a patente descreve que o carregamento retardado dos lipossomos pré-formados e armazenados é possível por uma combinação de gradientes de concentração e o processo de desidratação-reidratação.

Lipossomos de fosfolipídios para distribuição de medicamentos (lipossomos fusogênicos) estabilizados com um derivado de Polietileno glicol são descritos no WO 96/10392. Outra formulação para distribuição de medicamentos descrita no WO 02/03959 apresenta uma formulação compreendendo lipossomos catiônicos e lipossomos neutros, em que cada grupo de lipossomos leva agentes terapêuticos iguais ou diferentes.

Métodos preferidos para formar preparações de lipossomos são descritos por Bangham (Bangham et al. , 1965). Essa preparação envolve a dissolução de fosfolipídios em um solvente orgânico, que é, então, evaporado até secar, deixando uma película lipídica fina no interior do tubo de ensaio. A película lipídica seca é, então, hidratada com uma quantidade apropriada de fase aquosa, e a mistura é aquecida acima da temperatura de transição de fase dos lipídios e deixada "inchar". Os lipossomos resultantes, que consistem em vesículas multilamelares (MLV), são dispersados por agitação do tubo de ensaio. Os lipídios que constituem as membranas em bicamadas vesiculares se organizam de modo que as "caudas" de hidrocarbonetos hidrofóbicos estejam orientadas na direção do centro da bicamada, ao passo que as "cabeças" hidrofílicos se orientam na direção da fase aquosa interna e externa, respectivamente. Essa preparação representa a base para a produção de vesículas unilamelares (UV) por métodos como sonicação (Papahadjopoulos et al. , 1967) ou extrusão, conforme descrito por Cullis et al. na patente norte-americana n° 5.008.050.

Outras técnicas utilizadas para preparar vesículas são a evaporação em fase reversa, introduzida por Szoka e Papahadjopoulos (Szoka e Papahadjopoulos, 1978; patente norte-americana n° 4.235.871). Essa técnica consiste na formação de uma emulsão de água em óleo de lipídios em um solvente orgânico e uma solução tampão aquosa contendo uma substância a ser encapsulada. A remoção do solvente orgânico sob pressão reduzida produz um gel viscoso. Quando esse gel colapsa, forma-se uma suspensão aquosa de vesículas lipídicas.

Outro método descrito por Carmona-Ribeiro e Chaimovich (Carmona-Ribeiro e Chaimovich, 1983) envolve a injeção de uma solução orgânica, por exemplo, em clorofórmio, metanol, etanol, dos lipídios desejados em um tampão aquoso, em que os lipídios formam espontaneamente lipossomos quando o solvente evapora.

Os lipossomos também podem ser preparados por um método térmico aquoso, conforme descrito para DDA por Holten-Andersen et al. (2004), em que uma suspensão do composto formador de lipossomo em um tampão aquoso é aquecida, por exemplo, a 80°C, com agitação intermitente durante 20 minutos, seguido por resfriamento à temperatura ambiente.

O "método térmico aquoso" acima mencionado, utilizado e descrito por Woodard et al. (1980), Dzata et al. (1991) e Holten-Andersen et al. (2004), não estabiliza soluções de DDA e TDB.

Em um método particularmente preferido, antígenos protéicos são aprisionados dentro de vesículas pré-formadas pelo método de desidratação-reidratação (Kirby e Gregoriadis, 1984), em que um oligonucleotídeo, peptídio ou proteína presente na fase aquosa é aprisionado por liofilização, seguida por reidratação dos lipossomos liofilizados.

Alternativamente, o antígeno é incorporado utilizando-se a técnica de congelamento e descongelamento descrita por Pick (Pick, 1981) e por Bally et al. na patente norte-americana n° 4.975.282. Nessa técnica, as vesículas são misturadas com o antígeno protéico e repetidamente congelados rapidamente em nitrogênio líquido e aquecidos a temperaturas acima da principal temperatura de transição de fase dos lipídios relevantes. As vesículas podem ser adicionalmente processadas para remover qualquer antígeno não aprisionado, por exemplo, por lavagem e centrifugação.

Descobriu-se que glicosídeos acilados, como TDB e o fator de cordão isolado da parede celular de micobactérias, TDM, inibem a fusão entre vesículas fosfolipídicas (Spargo et al., 1991, e Crowe et al., 1994). A fração trealose hidrofílica provavelmente é imobilizada na superfície das vesículas, aumentando, assim, a força de hidratação, que é uma importante barreira primária à fusão. Alternativamente, a fração trealose imobilizada poderia agir como uma barreira estérica à fusão (Spargo et al., 1991).

Lipossomos de fosfolipídios (sem TDB) são atualmente utilizados experimentalmente como adjuvantes, por exemplo, em vacina contra gripe (Ben-Yehuda et al. , 2003) . Outro exemplo é a vacina lipossômica IMUXEN™ contra gripe (Lipoxen Technologies Ltd.; Gregoriadis et al., 1999).

Como compostos de amónio quaternário, e particularmente DDA, são candidatos muito promissores para um adjuvante de vacina eficaz, mas têm a grande desvantagem de serem fisicamente instáveis em solução aquosa, formando agregados e precipitados durante o armazenamento, é muito necessário estabilizar as vesículas formadas. A presente invenção descreve um novo método de estabilização de formulações de adjuvantes compostas por lipídios catiônicos, como DDA. Além disso, com esse método, intensifica-se o efeito adjuvante da formulação.

Descrição Resumida da Invenção

A presente invenção apresenta composições e métodos para estabilizar suspensões de lipossomos catiônicos por incorporação de glicolipídios, por exemplo, glicosídeos acilados, como 6,6'-dibeenato de alfa,alfa'-trealose (TDB) ou 6,6'-dimicolato de alfa,alfa'-trealose (TDM), em bicamadas lipossômicas feitas com compostos de amônio quaternário anfifxlicos, como DDA, DODA, DOTAP, DODAP ou DOTMA. Os grupos de cabeça de açúcar fortemente hidratado dos glicolipídios aumentam a hidratação global das bicamadas lipossômicas, o que impede a desidratação dos grupos de cabeça de amónio quaternário e a agregação causada pela reduzida repulsão de cargas das vesículas catiônicas. Essa estabilização de DDA não é obtida apenas pela adição do açúcar, por exemplo, trealose ou açúcar, ou por uma simples misturação de compostos de amônio quaternário e glicolipídios. A presente invenção também apresenta o uso desses lipossomos estabilizados como adjuvantes de vacinas.

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção apresenta um novo método de estabilização de lipossomos catiônicos em formulações aquosas com glicolipídios. Lipossomos catiônicos, por exemplo, preparados com compostos de amônio quaternário anfifílicos, são estabilizados por incorporação de glicolipídios nas membranas lipossômicas.

Uma realização preferida da invenção é quando o composto de amônio quaternário é o sal brometo, cloreto, sulfato, fosfato ou acetato dos compostos dimetildioctadecilamônio (DDA) ou dimetildioctadecenilamônio (DODA).

Outros compostos de amônio quaternário preferidos são 1,2-dioleoil-3-trimetilamônio propano (DOTAP), 1,2-dimiristol-3-trimetilamônio propano, 1,2-dipalmitoil-3-trimetilamônio propano, 1,2-diestearoil-3-trimetilamônio propano e dioleoil-3-dimetilamônio propano (DODAP) e N-[1-(2,3-dioleilóxi)propil]-N,N,N-trimetilamônio (DOTMA).

O glicolipídio para estabilizar os lipossomos é, de preferência, 6,6'-dibeenato de alfa,alfa'-trealose (TDB) ou 6,6'-dimicolato de alfa,alfa'-trealose (TDM). A porcentagem molar do glicolipídio na formulação pode ser de 0,5 a 95% molar, mas, de preferência, de 2,5 a cerca de 20% molar e, mais preferivelmente, de cerca de 5 a cerca de 18% molar.

A invenção também apresenta o uso desses lipossomos estabilizados como um adjuvante, por exemplo, para uso em composições de vacina. Em particular, a invenção refere-se a vacinas com adjuvantes em meios aquosos para imunização, em que o produto final é estável.

A presente invenção também apresenta um produto de lipossomo estabilizado pelo método acima descrito, para uso como um adjuvante de vacina, em que a vacina pode ser contra qualquer doença, por exemplo, tuberculose, malária, clamídia e outras.

"Lipossomos" são definidos como estruturas vesiculares fechadas compostas por uma ou mais bicamadas lipídicas envolvendo um núcleo aquoso. Cada bicamada lipídica é composta por duas monocamadas lipídicas, cada uma das quais com uma região de "cauda" hidrofóbica e uma região de "cabeça" hidrofílica. Na bicamada, as "caudas" hidrofóbicas das monocamadas lipídicas se orientam para dentro da bicamada, ao passo que as "cabeças" hidrofílicas se orientam para o exterior da bicamada. Lipossomos podem ter várias propriedades físico-químicas, como tamanho, composição de lipídios, carga superficial, fluidez e número de membranas de bicamada. De acordo com o número de bicamadas lipídicas, os lipossomos podem ser classificados como vesículas unilamelares (UV) compreendendo uma única bicamada lipídica, ou vesículas multilamelares (MLV) compreendendo duas ou mais bicamadas concêntricas, cada uma separada da próxima por uma camada de água. Compostos solúveis em água são aprisionados dentro das fases aquosas/núcleo dos lipossomos, em oposição a compostos lipofílicos, que são aprisionados no núcleo das membranas de bicamada lipidica.

"Micelas" são definidas como um agregado coloidal de moléculas anfifílicas, que ocorrem a uma concentração bem definida, conhecida como a concentração de micela crítica (CMC) . O número típico de moléculas agregadas em uma micela (número de agregação) é de 50 a 100. As micelas podem ser esféricas, compostas por moléculas surfatantes orientadas de modo que as caudas de hidrocarbonetos estejam orientadas na direção do centro, e as partes de cabeça polares estejam orientadas na direção do ambiente aquoso externo. Outras estruturas possíveis incluem micelas invertidas e micelas cilíndricas.

O termo "lipídio catiônico" pretende incluir qualquer lipídio anfifílico, incluindo lipídios sintéticos e análogos de lipídios, com frações de grupo de cabeça hidrofóbicas e polares, uma carga líquida positiva ao pH fisiológico e que, por si mesmos, formem espontaneamente vesículas ou micelas de bicamadas em água.

Um tipo particularmente preferido de lipídios catiônicos utilizados nesta invenção são compostos de amónio quaternário com a fórmula genérica NR1R2R3R4-X, em que R1 e R2 são independentemente um grupo alquila de cadeia curta contendo de 1 a 3 átomos de carbono, R3 é independentemente hidrogênio ou um grupo metila ou alquila contendo de 12 a 20 átomos de carbono, de preferência de 14 a 18, e R4 é independentemente um grupo hidrocarboneto contendo de 12 a 20 átomos de carbono, de preferência de 14 a 18 átomos de carbono. X é um ânion farmaceuticamente aceitável, que não seja tóxico por si mesmo.

Exemplos desses ânions são ânions haleto, cloreto, brometo e iodo. Ânions inorgânicos, como sulfato e fosfato, e ânions orgânicos derivados de ácidos orgânicos simples, como ácido acético, também podem ser utilizados. Os grupos R1 e R2 podem ser metila, etila, propila e isopropila, ao passo que R3 pode ser hidrogênio, metila ou os grupos dodecila, tridecila, tetradecila, pentadecila, hexadecila, heptadecila, octadecila, nonadecila e eicocila, e R4 pode ser os grupos dodecila, tridecila, tetradecila, pentadecila, hexadecila, heptadecila, octadecila, nonadecila e eicocila. Entretanto, outros grupos C12 - C20 hidrocarboneto também são possíveis, porque, mesmo que os grupos R3 e R4 sejam de preferência saturados sem cadeias laterais ramificadas, eles podem, em pequeno grau, ser ramificados com, por exemplo, cadeias laterais metila e etila. R3 e R4 também podem ter um pequeno grau de insaturação, por exemplo, contendo 1-3 duplas ligações cada, mas são, de preferência, grupos alquila saturados. O lipídio catiônico é, mais preferivelmente, brometo ou cloreto de dimetildioctadecilamônio (DDA-B ou DDA-C) ou seu sal sulfato, fosfato ou acetato (DDA-X), ou brometo ou cloreto de dimetildioctadecenilamônio (DODA-B ou DODA-C) ou seu composto sulfato, fosfato ou acetato (DODA-X). Outros tipos de lipídios catiônicos preferidos utilizados nesta invenção incluem, mas não se limitam a, 1,2-dioleoil-3 -trimetilamônio propano (DOTAP), 1,2-dimiristol-3-trimetilamônio propano, 1,2-dipalmitoil-3-trimetilamônio propano, 1,2-diestearoil-3-trimetilamônio propano e dioleoil-3-dimetilamônio propano (DODAP) e N-[1-(2,3-dioleilóxi)propil]-N,N,N-trimetilamônio (DOTMA).

Os lipossomos catiônicos são estabilizados por incorporação de glicolipídios nas membranas do lipossomo. Incorporação significa procedimentos para incrustar a região hidrofóbica e a região hidrofílica de uma molécula em uma correspondente região ou fração hidrofóbica e hidrofílica de uma membrana, micela, lipossomo ou bicamada. Procedimentos para incorporar glicolipídios em lipossomos podem ser "o método de película fina", "o método de evaporação em fase reversa" e "o método de injeção em solução orgânica" e futuros métodos ainda não conhecidos com o mesmo efeito de incorporação de glicolipídios em membranas de lipossomos. Todos os métodos atualmente conhecidos são mencionados no capítulo de fundamentos da invenção. O método mais preferido para esta invenção é o método de película fina.

Um glicolipídio é definido como qualquer composto contendo um ou mais resíduos monossacarídicos ligados por uma ligação glicosídica a uma fração hidrofóbica, como um ácido graxo de cadeia longa, acilglicerol, um esfingóide, uma ceramida ou um fosfato de fenila. Os glicolipídios desta invenção podem ser de origem sintética, vegetal ou microbiana, por exemplo, de micobactérias.

Uma classe de glicolipídios utilizados nesta invenção são glicosídeos acilados (ou alquilados), que consistem em um ou dois resíduos açúcar esterifiçados a um, dois ou mesmo três ácidos graxos. Os ácidos graxos podem ser de cadeia linear, incluindo ácidos graxos saturados, por exemplo ácido mirístico C14:0, ácido pentadecanóico C:15, ácido palmítico C16:0, ácido heptadecanóico C17:0, ácido estérico C18:0, ácido nonadecanóico C:19, ácido araquídico C: 20, ácido heneicosanóico C21:0, ácido beênico C:22, e ácidos graxos insaturados, por exemplo, ácido oléico C18:In-9, ácido linoléico 18:2n-6, ou ácidos graxos ramificados complexos, como ácido micólico, ácidos metoximicólicos, ácidos cetomicólicos, ácidos epoximicólicos e ácido corinomicólico. Os resíduos açúcar podem ser monossacarídeos simples, por exemplo, glicose e frutose, ou dissacarídeos compreendendo dois monossacarídeos covalentemente ligados, por exemplo, sacarose consistindo em glicose e frutose e trealose, em que duas unidades glicose estão unidas por uma ligação glicosídica. Um tipo de glicolipídios utilizados nesta invenção são glicolipídios de parede celular isolados de micobactéria, que consistem em um dissacarídeo esterificado a um, dois ou três ácidos palmíticos normais C16:0, ácidos oléicos C18:ln-9, ácidos linolécis 18:2n-6, ou ácidos graxos de cadeia ramificada hidróxi complexos, isto é, resíduos ácido micólico variando em comprimento de 60 a 90 átomos de carbono. Outros glicolipídios bacterianos utilizados nesta invenção têm cadeias de ácidos graxos mais curtas, por exemplo, ácidos corinomicólico (22 - 36 carbonos) ou nocardomicólico (44 - 60 carbonos), isolados de Corynobacterium, Nocardia. Um glicolipídio micobacteriano preferido é o 6,6'-dimicolato de alfa, alfa'-trealose (TDM) , f reqüentemente chamado de fator de cordão, que é um dos componentes imunomoduladores mais importantes da parede celular micobacteriana. Em uma realização particularmente preferida, o glicolipídio consiste no dissacarídeo alfa,alfa'-trealose esterificado a dois ácidos graxos docosanóicos (ácido beênico), por exemplo, 5,5'-dibeenato de alfa,alfa'-trealose (TDB), que é um análogo sintético puro de TDM.

Outras classes de glicolipídios utilizados nesta invenção incluem, mas não se limitam a:
Glicolipídios à base de glicerol: esses lipídios consistem em uma fração mono- ou oligossacarídeo ligada glicosidicamente ao grupo hidroxila do glicerol, que pode ser acilado (ou alquilado) com um ou dois ácidos graxos. Além disso, esses glicolipídios podem ser sem carga e, portanto, freqüentemente são chamados de glicoglicerolipídios neutros, ou podem conter um grupo sulfato ou fosfato.
Glicolipídios à base de ceramidas: glicoesfingolipídios foram, de acordo com a estrutura da fração carboidrato, divididos em glicoesfingolipídios neutros contendo um grupo glicosila não substituído e glicoesfingolipídios ácidos contendo um grupo glicosila com um grupo carboxila, sulfato ou fosfato ácido.
Lipopolissacarídeos (LPS): esses compostos complexos são os antígenos endotóxicos encontrados nas paredes celulares de bactérias Gram-negativas (S-lipopolissacarídeos). A parte lipídica (Lipídio A) forma um complexo com um polissacarídeo mediante uma ligação glicosídica. O Lipídio A consiste em uma estrutura principal de b-1,6-glucosaminil-glucosamina com dois grupos fosfoéster na posição 1 da glucosamina I e na posição 4 da glucosamina II. A posição 3 da glucosamina II forma a ligação glicosídica ácido lábil com o polissacarídeo de cadeia longa. Os outros grupos são substituídos (em Escherichia) com ácidos graxos hidroxilados, como hidroximiristato (dois ligados em éster e dois ligados em amida) e ácidos graxos normais (laurato). Um lipopolissacarídeo particularmente preferido desta invenção são os derivados monofosforila de lipídio A (MPL) , que são não tóxicos e têm excelentes propriedades adjuvantes.
Glicosídeos de esteróis: essa família consiste em uma unidade carboidrato ligada ao grupo hidroxila de uma molécula de esterol. Determinou-se que a fração esterol era composta por vários esteróis: colesterol, campesterol, estigmasterol, sitosterol, brassicasterol e diidrositosterol. A fração açúcar é composta por glicose, xilose e mesmo arabinose.
Glicosídeos de ácidos ou álcoois graxos: um grande número de glicolipídios simples é encontrado em bactérias, leveduras e em organismos inferiores (esponjas). Esses compostos são compostos por uma fração glicosila (uma ou várias unidades) ligada a um grupo hidroxila de um álcool graxo ou de um ácido hidróxi graxo ou a um grupo carboxila de um ácido graxo (ligação éster). Esses compostos freqüentemente possuem interessantes propriedades fisicas ou biológicas. Alguns deles são produzidos industrialmente por suas propriedades detergentes (alquil glicosídeos).

Uma cadeia alquila se refere a uma cadeia de hidrocarboneto alifático, que pode ser linear ou ramificada. A cadeia pode ser saturada ou pode conter uma ou mais duplas ligações, por exemplo, ser insaturada.
Uma cadeia acila se refere a um grupo alquil-OC(O), em que o grupo alquila é conforme anteriormente descrito.
Uma cadeia de ácido graxo se refere a uma cadeia de hidrocarboneto saturada ou insaturada, ramificada ou não ramificada, de grupos alquila ou acila.

O termo farmaceuticamente aceitável se refere a uma substância que não interfere com a eficácia ou atividade biológica dos ingredientes ativos e que não é tóxica para o hospedeiro ou paciente.

A temperatura de transição de fase ou Tm é a temperatura em que a bicamada lipossômica vai de uma fase de gel de menor temperatura, caracterizada por cadeias de ácidos graxos ordenadas (uma fase ordenada sólida) , para uma fase fluida de alta temperatura, em que as cadeias de ácidos graxos têm um alto grau de distúrbios conformacionais (uma fase desordenada líquida), conforme medido por calorimetria de varredura diferencial (DSC).

Estabilidade de uma formulação farmacêutica significa a capacidade da formulação de permanecer dentro de limites definidos durante o prazo de validade do produto. Dispersões lipossômicas exibem características de estabilidade química, assim como física.

A estabilidade química está relacionada à degradação química, ao passo que a estabilidade física se refere à estabilidade coloidal do sistema.

A estabilidade física de dispersões lipossômicas é determinada pelas interações inter-vesiculares, que dependem do equilíbrio entre forças atrativas e repulsivas. Sistemas coloidais são estabilizados por forças repulsivas, isto é, repulsão eletrostática e repulsão estérica, devido a diferenças no potencial químico entre a água no volume total e na região de interação.

Um adjuvante é definido como uma substância que intensifica não especificamente a resposta imune a um antígeno. Dependendo da natureza do adjuvante, pode promover uma resposta imune mediada por células, uma resposta imune humoral ou uma mistura das duas. Como a intensificação da resposta imune é não específica, é bem compreendido no campo que o mesmo adjuvante pode ser utilizado com diferentes antígenos para promover respostas contra diferentes alvos, por exemplo, com um antígeno para M. tuberculosis para promover imunidade contra M. tuberculosis ou com um antígeno derivado de um tumor, para promover imunidade contra tumores daquele tipo específico.

Compostos de amônio quaternário, por exemplo, brometo, cloreto ou outros sais orgânicos e inorgânicos de dimetildioctadecilamônio (DDA-B, DDA-C ou DDA-X), cloreto, brometo ou outros sais orgânicos ou inorgânicos de dimetildioctadecenilamônio (DODA-C, DODA-B ou DODA-X), ou 1,2-dioleoil-3-trimetilamônio propano (DOTAP), 1,2-dimiristol-3-trimetilamônio propano, 1,2-dipalmitoil-3 -trimetilamônio propano, 1,2-diestearoil-3-trimetilamônio propano e dioleoil-3-dimetilamônio propano (DODAP) e N- [1-(2,3-dioleilóxi)propil]-N,N,N-trimetilamônio (DOTMA) , têm a capacidade de formar agregados lipídicos, como bicamadas lipídicas, lipossomos de todos os tipos, tanto unilamelares, quanto multilamelares, micelas e outros, quando dispersados em um meio aquoso. As membranas lipídicas dessas estruturas proporcionam uma excelente matriz para a inclusão de outros compostos anfifílicos, como glicolipídios, que demonstradamente estabilização dispersões de vesículas desta invenção.

Além disso, glicolipídios, por exemplo, TDB e TDM, têm propriedades imunoestimuladoras por si mesmos e podem agir de maneira sinérgica com os compostos de amónio quaternário para intensificar a resposta imune. Além do mais, macromoléculas, por exemplo, antígenos oligonucleotídicos, peptídicos ou protéicos, podem ser aprisionadas dentro da fase aquosa tanto de lipossomos unilamelares, quanto multilamelares.

Espera-se que as cadeias acila hidrofóbicas de, por exemplo, TDB, se incrustem na região hidrofóbica das bicamadas lipídicas feitas de compostos de amônio quaternário desta invenção, imobilizando, assim, os grupos de cabeça trealose hidrofílicos na interface entre a região hidrofóbica e o volume total de água. Os grupos de cabeça de açúcar fortemente hidratado aumentam a hidratação global da interface, gerando um aumento potencial nas forças de hidratação, que impedem um contato íntimo de bicamadas opostas, o que é requerido para a agregação ou fusão de vesículas. Além disso, como uma conseqüência da hidratação da interface, a fluidez da bicamada poderiam aumentar, o que também tende a estabilizar as vesículas.

Os meios de dispersão utilizados nas formulações desta invenção podem ser qualquer solvente aquoso adequado. Entretanto, a estabilidade de formulações lipossômicas parece ser sensível a ânions, como íons fosfato e sulfato. Assim, é preferível que as composições adjuvantes da invenção sejam formadas na ausência ou em baixos níveis desses íons.

Quando utilizado como uma adjuvante de vacinas, um componente antigênico é adicionado à solução de adjuvante, possivelmente em conjunto com outros imunomoduladores, como MPL (monofosforil lipídio A) ou seus derivados, ácido poliinosínico policitidílico (poli-IC), muramil dipeptídio (MDP) ou seus análogos, zimosano, RNA de fita dupla (dsRNA) , DC-Chol, oligodesoxinucleotídeos CpG e tamoxifen. Um componente ou substância antigênica é uma molécula que reaja com anticorpos pré-formados e/ou com receptores específicos em células T e B. No contexto da vacinação, a molécula pode estimular o desenvolvimento de células T ou B específicas, levando à formação de uma população de memória de células imunes que promoverão uma resposta de "memória" mais rápida se o antígeno for encontrado uma segunda vez por células imunes. Como populações de memória raramente são clonais, na prática, isso significa que um antígeno é qualquer molécula ou coleção de moléculas que possam estimular um aumento nas respostas imunes, quando forem reencontradas por células imunes de um indivíduo que tenha sido anteriormente exposto a elas.

O componente ou substância antigênica pode ser um polipeptídio ou uma parte do polipeptídio, que gere uma resposta imune em um animal ou em um ser humano e/ou em uma amostra biológica determinada por qualquer um dos ensaios biológicos aqui descritos. A parte imunogênica de um polipeptídio pode ser um epítopo de célula T ou um epítopo de célula B. Para identificar epítopos de células T relevantes que sejam reconhecidos durante uma resposta imune, é possível usar um método de "força bruta": como epítopos de células T são lineares, mutantes de deleção do polipeptídio revelarão, se construídos sistematicamente, que regiões do polipeptídio são essenciais no reconhecimento imune, por exemplo, por submissão desses mutantes de deleção, por exemplo, ao ensaio de IFN-gama aqui descrito. Outro método utiliza oligopeptídios superpostos (de preferência, sintéticos com um comprimento de, por exemplo, 20 resíduos de aminoácidos) derivados do polipeptídio. Esses peptídios podem ser testados em ensaios biológicos (por exemplo, o ensaio de IFN-gama aqui descrito), e alguns deles darão uma resposta positiva (e, dessa forma, serão imunogênicos), como prova da presença de um epítopo de célula T no peptídio. Epítopos de células B lineares podem ser determinados por análise do reconhecimento de células B a peptídios superpostos cobrindo o polipeptídio de interesse, conforme, por exemplo, descrito em Harboe et al., 1998.

Embora se tenha demonstrado que o comprimento mínimo de um epítopo de célula T é de pelo menos 6 aminoácidos, é normal que esses epítopos sejam constituídos por trechos mais longos de aminoácidos. Portanto, é preferível que o fragmento de polipeptídio da invenção tenha um comprimento de pelo menos 7 resíduos de mainoácidos, como pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 14, pelo menos 16, pelo menos 18, pelo menos 20, pelo menos 22, pelo menos 24 e pelo menos 30 resíduos de aminoácidos. Portanto, em realizações importantes do método da invenção, é preferível que o fragmento de polipeptídio tenha um comprimento de no máximo 50 resíduos de aminoácidos, como no máximo 40, 35, 30, 25 e 20 resíduos de aminoácidos. Espera-se que os peptídios com um comprimento entre 10 e 20 resíduos de aminoácidos se mostrem os mais eficientes como ferramentas diagnósticas, e, portanto, comprimentos particularmente preferidos para o fragmento de polipeptídio utilizado no método da invenção são de 18, como 15, 14, 13, 12 e mesmo 11 aminoácidos.

Uma vacina é definida como uma suspensão de microorganismos (bactérias, vírus ou rickétsias) mortos, atenuados ou de outra forma modificados ou de suas partes para inoculação a fim de produzir imunidade a uma doença. A vacina pode ser administrada profilaticamente, para prevenir uma doença, ou como uma vacina terapêutica, para combater doenças já existentes, como câncer ou doenças infecciosas latentes, mas também com relação a alergia e doenças autoimunes. A vacina pode ser emulsifiçada em um adjuvante adequado para potencializar a resposta imune.

As vacinas são administradas de maneira compatível com a formulação de dosagem e em uma quantidade suficiente para ser terapeuticamente eficaz e imunogênica. A quantidade a ser administrada depende do sujeito a ser tratado, incluindo, por exemplo, a capacidade do sistema imune do indivíduo de montar uma resposta imune e o grau de proteção desejado. Faixas de dosagem adequadas são da ordem de várias centenas de microgramas de ingrediente ativo por vacinação, com uma faixa preferida de cerca de 0,1 µg a 1.000 µg, como na faixa de cerca de 1 µg a 300 µg, e particularmente na faixa de cerca de 10 µg a 50 µg. Regimes adequados para administração inicial e reforços também são variáveis, mas são tipificados por uma administração inicial seguida por inoculações ou outras administrações subseqüentes.

O modo de aplicação pode variar amplamente. Qualquer um dos métodos convencionais para administração de uma vacina é aplicável. Acredita-se que esses incluam aplicação oral ou na mucosa sobre uma base fisiologicamente aceitável sólida ou em uma dispersão fisiologicamente aceitável, por via parenteral, por injeção ou outras. A dosagem da vacina dependerá da via de administração e variará de acordo com a idade da pessoa a ser vacinada e, em menor medida, com o tamanho da pessoa a ser vacinada.

As vacinas são convencionalmente administrada por via parenteral, por injeção, por exemplo, subcutânea ou intramuscular. Formulações adicionais que são adequadas para outros modos de administração incluem supositórios e, em alguns casos, formulações para mucosas. Para supositórios, aglutinantes e veículos tradicionais podem incluir, por exemplo, polialquileno glicóis ou triglicerídeos; esses supositórios podem ser formados a partir de misturas contendo o ingrediente ativo na faixa de 0,5% a 10%, de preferência 1 - 2%. Formulações orais incluem excipientes normalmente empregados como, por exemplo, qualidades farmacêuticas de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio e outros. Essas composições podem ter a forma de solução, suspensões, comprimidos, pílulas, cápsulas, formulações de liberação prolongada ou pós e vantajosamente contêm 10 - 95% de ingrediente ativo, de preferência, 25 - 70%.

A vacina de escolha pode ser, por exemplo:
Vacina protéica: uma composição de vacina compreendendo um polipeptídio (ou pelo menos uma parte imunogênica dele) ou polipeptídio de fusão.
Vacinas recombinantes vivas: a expressão do antígeno relevante em uma vacina em um microorganismo ou vírus não patogênico. Os exemplos bem conhecidos desses microorganismos incluem Mycobacterium bovis BCG, Salmonella e Pseudomonas, e os exemplos de vírus incluem o vírus da varíola bovina e adenovirus.

Para todos esses construtos de vacina, a adição de um adjuvante adequado resultou em maiores eficácias da vacina (Brandt et al. , 2000; van Rooij et al. , 2001; Wang et al. , 2002; Eriksson, 2003) .

Ainda outra realização da invenção é um sistema de distribuição que compreende o adjuvante. Lipossomos foram utilizados como sistemas de distribuição em farmacologia e medicina como imunoadjuvantes, tratamento de doenças infecciosas e inflamações, terapia de câncer e terapia genética (Gregoriadis, 1995). Fatores que podem ter influência sobre o efeito adjuvante dos lipossomos são o tamanho do lipossomo, composição do lipídio e carga superficial. Além disso, a localização do antígeno (por exemplo, se é adsorvido ou covalentemente acoplado à superfície do lipossomo ou encapsulado em compartimentos aquosos lipossômicos) também pode ser importante. Células dendríticas podem ser utilizadas como veículos de distribuição de antígeno. O carregamento do antígeno em células de apresentação de antígeno, como células dendríticas, se mostrou um método eficaz para a geração de células T ativas com uma papel na imunidade antitumoral.

Os lipossomos desta invenção podem ser preparados por vários métodos bem conhecidos no estado da técnica.

De preferência, o lipídio catiônico é um composto de amónio quaternário com um grupo de cabeça dimetilamônio e duas longas cadeias alquila hidrofóbicas compreende 12 a 20 átomos de C, por exemplo, brometo de dimetildioctadecilamônio (DDA-B), cloreto de dimetildioctadecenilamônio (DODA-C). Outros tipos de lipídios catiônicos preferidos incluem, mas não se limitam a, 1,2-dioleoil-3-trimetilamônio propano (DOTAP), 1,2-dimiristol-3-trimetilamônio propano, 1,2-dipalmitoil-3-trimetilamônio propano, 1,2-diestearoil-3-trimetilamônio propano e dioleoil- 3-dimetilamônio propano (DODAP) e N- [1- (2,3-dioleilóxi)propil] -N,N,N-trimetilamônio (DOTMA).

O glicolipídios é, de preferência, um glicosídeo acilado formado por um até três ácidos graxos acilando um ou dois resíduos açúcar. Os ácidos graxos são ácidos graxos saturados ou insaturados, de cadeia linear ou ramificados complexos. O açúcar pode ser monossacarídeos simples ou dissacarídeos que compreendem dois monossacarídeos covalentemente ligados. Em uma realização particularmente preferida, os glicolipídios consistem em trealose com um ou dois glicosídeos ligados a cadeias de ácidos graxos que compreendem de 14 a 90 átomos de carbono, por exemplo, 6,6'-dibeenato de alfa,alfa'-trealose (TDB) ou 6,6 '-dimicolato de alfa,alfa'-trealose (TDM).

Em uma realização, lipossomos da presente invenção compreendem um lipídio catiônico formador de bicamada, de preferência com um grupo de cabeça de amônio quaternário e duas cadeias alquila hidrofóbicas longas. Em uma realização particularmente preferida, o grupo de cabeça é dimetilamônio, e as cadeias hidrofóbicas são cadeias de hexadecila, octadecila ou octadecenila. Os lipídios catiônicos da invenção podem ser utilizados isoladamente ou em qualquer combinação. Além disso, os lipídios catiônicos ou suas misturas podem ser utilizados em combinação com qualquer fosfolipídio neutro, como fosfatidilcolina (PC) e fosfatidilglicerol (PG) ou qualquer lipídio eletrostaticamente neutro natural ou sintético formador de bicamada.

Os lipossomos são estabilizados pela incorporação de glicolipídios nas membranas do lipossomo utilizando-se um método de película. Em contraste, esse efeito estabilizador não será obtido por misturação de soluções pré-formadas de DDA e TDB, que são as formulações anteriormente descritas (Woodard et al., 1980, Dzata et al., 1991, Holten-Andersen et al., 2004). O glicolipídio tem de ser incorporado de maneira estável nas bicamadas lipídicas, com sua fração hidrofóbica incrustada na região hidrofóbica da membrana de bicamada, e sua fração de grupo de cabeça polar orientada para a superfície hidrofílica das membranas. As razões molares de glicolipídios adicionados aos lipossomos catiônicos dependem das propriedades do glicolipídio, assim como de excipientes em potencial utilizados na formulação. A porcentagem molar de um glicolipídio particular pode ser de 0,5 a cerca de 95% molar, de preferência de cerca de 2,5 a cerca de 20% molar e, mais preferivelmente, de cerca de 5 a cerca de 18% molar.

Em uma realização particularmente preferida da invenção, o composto de amónio quaternário/lipídio catiônico é DDA-B, e o glicolipídio é TDB. Os lipossomos são preparados por dissolução de quantidades pesadas de DDA-B e TDB em um solvente orgânico adequado, em uma porcentagem molar de 5% molar ou 10% molar ou 15% molar, a uma concentração de lipídios total de cerca de 1 mM, 2 mM, 5 mM ou mesmo 10 mM. O solvente é evaporado, deixando uma película lipídica fina no interior do tubo de ensaio. A película lipídica seca é, então, hidratada em um tampão farmaceuticamente aceitável, sem ou com baixa concentração de sal. A formação de estruturas de lipossomos estáveis parece ser sensível à presença de íons em ânions particulares, como fosfato e sulfato. De preferência, usa-se um tampão orgânico, por exemplo, 2-amino-2-(hidroximetil)-1,3 propanodiol (Trometamolum ou simplesmente Tris) ou 2-bis(2-hidroxietil)amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol (Bis- Tris), com um pH de 6,0 a 8,0 e, mais preferivelmente, com um pH de 6,5 a 7,5, preparado por dissolução da base Tris ou Bis-Tris em água MilliQ e, então, ajuste do pH por adição de HC1. O tampão não se limita a Tris ou Bis-Tris, mas pode ser qualquer tampão farmaceuticamente aceitável ou mesmo água pura, sem nenhuma adição de substância de tampão. A mistura é aquecida a uma temperatura acima da temperatura de transição de fase da mistura lipídica, durante 20 minutos, vigorosamente agitada a cada 5 minutos. A formulação de adjuvante resultante consiste em MLV caracterizadas por terem uma estabilidade física significativamente melhor do que lipossomos catiônicos comuns.

Uma substância antigênica, isto é, uma proteína ou peptídio, é adicionada e misturada com as formulações de adjuvante. Mais preferivelmente, a substância antigênica é ligada às vesículas por forças eletrostáticas atrativas ou interações hidrofóbicas. Em uma realização particularmente preferida desta invenção, uma vacina final contra tuberculose é preparada por misturação de uma formulação de adjuvante contendo lipossomos de DDA estabilizados por TDB com uma solução da proteína de fusão Ag85B-ESAT-6. O adjuvante é preparado de acordo com esta invenção compreendendo 2,50 mg de DDA por mL (4 mM) e 0,2 5 mg de TDB por mL (0,25 mM) , correspondendo a uma concentração de TDB de cerca de 5% molar em um tampão Tris a 10 mM com pH 7,4. Cerca de 4,5 mL dessa formulação de adjuvante são misturados com 0,5 mL de solução em tampão Tris a 1,0 mg/mL de Ag85B-ESAT-6 para atingir uma concentração de 100 microgramas/mL da proteína de fusão na vacina pronta para usar final.Em outra realização preferida, a substância antigênica é encapsulada dentro das vesículas utilizando-se o método de desidratação-reidratação ou, alternativamente, o antígeno é incorporado utilizando-se a técnica de congelamento e descongelamento.

Legendas das Figuras

Figura 1. Esta figura mostra as estruturas de alguns dos lipídios catiônicos utilizados nesta invenção.
Figura 2. Fotografia digital de formulações de DDA a 10 mM depois de 2 meses de armazenamento a 4°C. (Amostra 02) contém 16% molar de TDB, (Amostra 03) contém 12,5% molar de TDB, (Amostra 04) contém 6% molar de TDB, (Amostra 05) contém 2,5% molar de TDB, (Amostra 06) contém 0,5% molar de TDB, e uma amostra de referência contendo apenas DDA. Está claro nessa ilustração que as suspensões contendo TDB são mais homogêneas e sem precipitados.
Figura 3 . Termogramas DSC de lipossomos multilamelares compostos por DDA-B com concentrações crescentes de TDB (de cima para baixo) , obtidos a uma taxa de varredura de 30 C/h. Os lipossomos foram dispersados em tampão Tris a 10 mM com pH 7,4. Os termogramas ilustram claramente que o TDB está inserido nas membranas de lipossomos de DDA.
Figura 4. Termogramas DSC de lipossomos multilamelares compostos por DDA-B e TDB com concentrações crescentes do antígeno Ag85B-ESAT-6 (de cima para baixo, obtidos a uma taxa de varredura de 30 C/h. Os lipossomos foram dispersados em tampão Tris a 10 mM com pH 7,4. Os termogramas ilustram claramente que a temperatura de transição de fase não se altera pela incorporação de um antígeno nos lipossomos.
Figura 5. Desenvolvimento temporal do tamanho de partícula médio de lipossomos de DDA contendo 0 mol% (-♦-), 6% molar (-▲-), 11% molar (-★-) e 20% molar (-■-) de TDB. Os lipossomos foram dispersados em tampão Tris a 10 mM ajustado a pH 7,4. Um aumento significado é observado para lipossomos de DDA sem TDB após 14 dias.
Figura 6A. Desenvolvimento temporal do tamanho de partícula médio de lipossomos de DDA (-♦-) e lipossomos de DDA contendo 11% molar de TDB, preparados pelo método térmico aquoso (-▲-), 11% molar de TDB, preparados pelo método de película (-■-). Os lipossomos foram dispersados em tampão Tris a 10 mM ajustado a pH 7,4. Um aumento significativo foi observado para lipossomos de DDA e para lipossomos de DDA/TDB preparados pelo método térmico aquoso após 14 dias.
Figura 7A. Desenvolvimento temporal do tamanho de partícula médio de lipossomos de DDA contendo 11% molar de TDB (-■-), 10% (p/v) de trealose (-⚫-) e 10% (p/v) de sacarose (-X-). Os lipossomos foram dispersados em tampão Tris a 10 mM ajustado a pH 7,4. Os lipossomos de DDA contendo trealose e sacarose se agregaram em um grau que tornou impossível fazer medições adicionais por PCS após 14 dias.
Figura 7Β. Fotografia digital de formulações de DDA a 10 mM contendo 10% (p/v) de trealose e 11% molar de TDB, respectivamente, após 14 dias de armazenamento a 4°C. Observou-se uma grave agregação na formulação contendo trealose.
Figura 8. A análise SDS-PAGE do sobrenadante e pelota ressuspendida de Ag85B-ESAT-6 ultracentrifugado de vacinas prontas para o uso finais foi realizada para visualizar a adsorção de antígeno nos lipossomos catiônicos.
Figura 9. Liberação de IFN-gama de linfócitos sangüíneos isolados de camundongos C57BI/6j imunizados com Ag85B-ESAT- 6/DDA/TDB preparado conforme descrito no exemplo 1 desta invenção ou Ag85B-ESAT-6/DDA/TDB preparado conforme descrito por Holten-Andersen et al. (2004) . Os linfócitos foram isolados 1 semana após a terceira imunização e estimulados com Ag85B-ESAT-6 a 5 µg/mL.
Figura 10. Liberação de IFN-gama e IL-5 de linfócitos sangüíneos isolados de camundongos C57BI/6j imunizados com 2 µg de Ag85B-ESAT-6/DDA/TDB ou Ag85B-ESAT-6 em 500 µg de alúmen. Os linfócitos sangüíneos foram isolados 1 semana após a terceira imunização e reestimulados in vitro com 5 µg/mL de Ag85B-ESAT-6.
Figura 11A. Liberação de IFN-gama de esplenócitos isolados de camundongos BALB/C imunicados com 2 µg de Ag85B-ESAT-6 em 250 µg de DDA/50 µg de TDB, 100 µg de Poli IC, ou 250 µg de DDA/50 µg de TDB/100 µg de Poli IC. Os esplenócitos foram isolados três semanas após a terceira imunização e reestimulados in vitro com 5 µg/mL de Ag85B-ESAT-6.
Figura 11B. Ligeração de IFN-gama de linfócitos sangüíneos isolados de camundongos BALB/C imunizados com 2 µg de Ag85B-ESAT-6 em 250 µg de DDA/50 µg de TDB, 25 µg de MDP, ou 250 µg de DDA/50 µg de TDB/25 µg de MDP. As células sangüíneas foram isoladas três semanas após a terceira imunização e reestimuladas in vitro com 5 µg/mL de Ag85B-ESAT-6.
Figura 12. Desenvolvimento temporal do tamanho de partícula médio de lipossomos de DDA (-♦-) e lipossomos de DD A contendo 11% molar de TDB (-⚫-), 11% molar de lactocil ceramida (-★-) e 11% molar de α-galactosil ceramida (-X-). Os lipossomos foram dispersados em tampão Tris a 10 mM ajustado a pH 7,4. Observou-se um aumento significativo para lipossomos de DDA sem glicolipídio após 14 dias, indicando que outros glicolipídios, além do TDB, podem estabilizar DDA.

Exemplos Exemplo 1 Preparação de vesículas de DDA contendo concentrações crescentes de TDB

As vesículas de DDA contendo TDB foram preparadas utilizando-se o método de película lipídica fina. Brometo de dimetildioctadecilamônio (DDA-B, Mw = 630,97) e 6,6'-dibeenato de D-(+)-trealose (TDB, Mw = 987,5) (Avanti Polar Lipids, Alabaster, Al) foram dissolvidos separadamente em clorofórmio e metanol (9:1) a uma concentração de 10 mg/mL. Volumes específicos de cada composto individual foram misturados em tubos de ensaio de vidro. O solvente foi evaporado utilizando-se uma corrente suave de N2, e as películas lipídicas foram secadas durante uma noite sob baixa pressão para remover quantidades residuais de solvente. As películas lipídicas secas foram hidratadas em tampão Tris (10 mM, pH = 7,4) às concentrações especificadas na Tabela 1 e colocadas em um banho de água a 70°C durante 20 min, e as amostras foram vigorosamente agitadas a cada 5 min.
Tabela 1. Relaciona uma gama de formulações de adjuvantes preparadas de acordo com a presente invenção.

Exemplo 2 TDB aumenta a estabilidade a longo prazo de formulações de DDA

Formulações de vesículas de DDA-B contendo concentrações crescentes de TDB foram armazenadas a 4°C, e a aparência visual das diferentes formulações foi avaliada após um dia e novamente após dois meses (Tabela 2 e Figura 2) . A avaliação demonstra claramente que TDB estabiliza as vesículas de DDA. Suspensões de DDA em tampão aquoso sem TDB precipitam após um dia, ao passo que, em suspensões de DDA contendo mais de 10% molar de TDB, não se forma nenhum precipitado. Em suspensões com concentrações de TDB tão baixas quanto 6%, apenas quantidades muito pequenas de precipitados são formadas, que podem ser ressuspendidos facilmente por agitação suave.
Tabela 2. Descreve a estabilidade em 2 meses de uma gama de diferentes formulações de adjuvantes.

Para simular um armazenamento prolongado, as suspensões foram centrifugadas durante trinta minutos a 3.000 g. As suspensões de DDA-B contendo mais de 2,5% molar de TDB apenas formaram muito pouco precipitado, que podia ser ressuspendido por agitação.

Exemplo 3 TBD é incorporado na bicamada lipídica de vesículas de DDA

Bicamadas lipídicas formadas com dialquildimetilamônio sintético sofrem uma transição de fase principal de gel para cristal líquido a uma temperatura de transição de fase características, Tm. A transição de fase envolve o derretimento das cadeias dialquila nas bicamadas vesiculares e a organização das cadeias se altera de um estado caracterizado por um alto grau de ordem conformacional para um estado com um grau mais elevado de desordem. Uma grande entalpia de transição está associada com o processo de derretimento da cadeia. Essa mudança na entalpia é detectada como um pico na curva de capacidade térmica, com um máximo à temperatura de transição, Tm. A temperatura de transição, assim como o formato da curva de capacidade térmica dependem da natureza do grupo de cabeça polar, do contra-ion e do comprimento das cadeias dialquila. Genericamente, os valores de Tm diminuem com a diminuição do comprimento de cadeia e o aumento da assimetria das cadeias alquila. O efeito de um segundo surfatante dialquila sobre o comportamento de fase termotrópica pode fornecer informações úteis sobre a interação entre os dois componentes.

Curvas de capacidade térmica foram obtidas utilizando-se um microcalorímetro de varredura diferencial VP-DSC (Calorimetry Sciences Corp., Provo) do tipo de compensação de potência, com um volume de célula de 0,34 mL.
Três varreduras ascendentes consecutivas da amostra de 0,34 mL foram realizadas a 30 C/h. As amostras foram equilibradas durante 50 min à temperatura de partida.

Os termogramas DSC dos dois sistemas de componentes consistindo em DDA-B e TDB mostrados na Figura 3 demonstram uma acentuada influência do aumento da concentração molar de TDB sobre a termodinâmica da membrana lipidica. A inserção em membrana de TDB nas bicamadas de lipossomos de DDA é demonstrada pela redução da temperatura de transição de fase principal, Tm. A transição de gel para fluido dos lipossomos de DDA-B puro é caracterizada por um pico de capacidade térmica estreito e bem definido a 48°C. O aumento da concentração de TDB resulta em uma coexistência de fase de gel para fluido alargada, em que as fases de gel e fluido existem ao mesmo tempo.

A temperatura de transição de fase de lipossomos de DDA-B contendo 20% molar de TDB é deslocada para baixo cerca de 5°C abaixo da do DDA-B puro. A inserção de TDB nas membranas de lipossomos de DDA-B tende a fazer com que o pico de transição de fase se divida em dois. Isso é mais provavelmente devido a uma separação de fase composicional em pequena escala nas membranas lipídicas durante o processo de transição de gel para fluido. Os parâmetros termodinâmicos são mostrados na tabela 3.

O efeito estabilizador do TDB é mais provavelmente causado pelos grupos de cabeça trealose fortemente hidratados do TDB, ancorados na membrana do lipossomo de DDA-B, que impedem a desidratação e a fusão das bicamadas vesiculares. Tabela 3. Parâmetros termodinâmicos de lipossomos de DDA-B contendo concentrações crescentes de TDB obtidos utilizando-se calorimetria de varredura diferencial (DSC) a uma taxa de varredura de 30°C/h. Os lipossomos foram dispersados em tampão Tris a 10 mM com pH 7,4, e a concentração de lipídios total era de 5 mM.

Para avaliar se o estado de transição era influenciado pela adição de um antígeno protéico, lipossomos compostos por DDA e TDB receberam adições crescentes da proteína de fusão micobacteriana Ag85B-ESAT-6, e as formulações foram analisadas por calorimetria de varredura diferencial. Conforme representado na Figura 4, a temperatura de transição de fase não se altera pela incorporação de uma proteína.

Exemplo 4 Tamanho de partícula de lipossomos de DDA contendo TDB Exemplo 4A

A estabilidade de DDA-B é aumentada pela incorporação de TDB.
A estabilidade de partículas de DDA-B contendo concentrações crescentes de TDB são preparadas pelo método de película e foi medida por medições de espalhamento de luz dinâmico utilizando-se um Malvern ZetaSizer 4 (Malvern Instruments Ltd. UK) . Formulações de partículas de DDA-B com 0, 6, 11 e 20% molar de TDB incorporados foram dispersadas em tampão Tris a 10 mM com pH 7,4 no dia 0. As medições foram feitas nos dias 0, 14, 28, 42, 56 e 105 após a preparação (Figura 5). A comparação da estabilidade de tamanho de partícula no tempo mostra que a incorporação de TDB estabiliza as partículas de DDA-B e impede que se agreguem. Em contraste, a formulação com apenas DDA agregou após poucos dias de armazenamento a 4°C, e, após o dia 42, nenhuma medição de tamanho de partícula adicional era possível devido à agregação. Esses dados sustentam a impressão visual das formulações de DDA e DDA/TDB mostradas na Figura 2.

Exemplo 4B

A estabilidade das partículas de DDA-B é eficientemente aumentada pela incorporação de TDB, em vez de misturar os dois componentes pelo método térmico aquoso ou por adição da parte de açúcar sendo trealose.

A necessidade de incorporação de TDB nas partículas de DDA-B para que sejam estáveis foi investigada por medições de espalhamento de luz dinâmico utilizando-se um Malvern ZetaSizer 4 (Malvern Instruments Ltd. UK). O tamanho de partícula das partículas de DDA-B contendo 11% molar de TDB preparadas pelo método de película foi comparado com partículas de DDA-B misturadas com 11% molar de TDB (o método térmico aquoso anteriormente descrito por Holten-Andersen). Ambas as formulações foram dispersadas em tampão Tris a 10 mM com pH 7,4. As medições foram feitas nos dias 0, 14 e 28 após a preparação (Figura 6) . A comparação da estabilidade do tamanho de partícula no tempo mostra que a incorporação de TDB estabiliza as partículas de DDA-B, em comparação com a misturação dos dois componentes, que as impede de se agregarem.

Para investigar se a parte lipídica do TDB é necessária para estabilizar as partículas de DDA-B, o tamanho de partícula de partículas de DDA-B contendo 11% molar de TDB preparadas pelo método de película foi comparado com partículas de DDA-B contendo 10% (p/v) de sacarose e trealose, respectivamente. Todas as formulações foram dispersadas em tampão Tris a 10 mM com pH 7,4. As medições foram feitas nos dias 0, 14 e 28 após a preparação (Figura 7A). A comparação da estabilidade do tamanho de partícula no tempo mostra que a parte lipídica do TDB é essencial para a estabilização dos lipossomos de DDA-B. TDB, mas não trealose e sacarose, impede que lipossomos de DDA-TDB se agreguem (Figura 7B) .

Exemplo 5

O antígeno é adsorvido nas vesículas de DDA contendo TDB.
A análise SDS-PAGE do sobrenadante e pelota ressuspendida de Ag85B-ESAT-6 ultracentrifugado de vacinas prontas para o uso finais foi realizada para visualizar a adsorção de antígeno nos lipossomos catiônicos. O adjuvante compreendia lipossomos catiônicos compostos por DDA estabilizados pela incorporação de 15% molar do glicolipídio TDB. A concentração de Ag85B-ESAT-6 (PM 45 kDa) na vacina final era de 40, 80, 160 e 200 microgramas/mL, e as concentrações de DDA e TDB eram de 10 e 0,6 mM, respectivamente. As vacinas foram ultracentrifugadas (100.000 g) durante 30 min, e a análise SDS-PAGE foi realizada no sobrenadante e na pelota ressuspendida no volume original de tampão Tris (Figura 8). Uma amostra de referência contendo 50 microgramas de Ag85B-ESAT-6 por mL foi carregada na raia 1, e um marcador de peso molecular foi carregado na raia 2. As bandas de proteínas foram visualizadas por coloração com Coomassie. Nenhuma banda visível foi observadas nas raias carregadas com os sobrenadantes, ao passo que bandas claras a um peso molecular aproximado de 45 kDa foram observadas nas raias carregadas com as pelotas ressuspendidas, indicando que todo ou quase todo o antígeno é adsorvido nos lipossomos catiônicos.

Exemplo 6

DDA combinado com TDB promove uma resposta imune eficiente contra Ag85B-ESAT-6.
É geralmente aceito que adjuvantes têm alguma seletividade pela indução de uma certa classe de resposta imune. Como a importância de uma liberação de citocina Thl baseada na produção de IFN-γ foi demonstrada como essencial na resistência a TB (Flynn et al. , 1993; Cooper et al. , 1993), lipossomos de DDA-B contendo 20% molar de TDB foram preparados conforme descrito no exemplo 1 desta invenção e misturados com uma solução em tampão Tris de Ag85B-ESAT-6 em uma vacina final. A concentração na vacina final era de 250 pg de DDA, 100 pg de TDB e 2 µg de Ag85B-ESAT-6. Para comparação, incluiu-se outra vacina, que era composta pelas mesmas quantidades de DDA e TDB, mas preparada conforme anteriormente descrito em DMSO (Holten-Andersen et al., 2004), isto é, sem incorporação d eTDB nos lipossomos pelo método de película. Camundongos foram imunizados três vezes, e, uma semana após a 3a vacinação, as respostas imunes específicas de células sangüíneas foram investigadas (Figura 9) . Observou-se uma resposta muito maior após a imunização com DDA/TDB preparado pelo método de película, em comparação com o método anteriormente descrito, demonstrando que a preparação de DDA/TDB pelo método de película intensifica o efeito adjuvante, em comparação com uma simples misturação de DDA/TDB.

Da mesma forma, a resposta imune de DDA/TDB preparado pelo método de película foi comparada com a de um adjuvante à base de alúmen, Alhydrogel, já aprovado para uso clínico. Conforme mostrado na Figura 10, a imunização com DDA/TDB gera altos níveis de IFN-γ e baixos níveis de IL-5, ao passo que camundongos imunizados com Alhydrogel exibiram um padrão oposto, com secreção desprezível de IFN-γ e níveis mais elevados de IL-5.

A capacidade de DDA/TDB de gerar uma resposta humoral foi investigada por monitorização das resposta de anticorpos IgG específicos para Ag85B-ESAT-6 cinco semanas após a primeira imunização. A concentração na vacina final era de 250 µg de DDA, 100 µg de TDB e 2 µg de Ag85B-ESAT-6. Um grupo de camundongos recebeu Ag85B-ESAT-6 em Alhydrogel para comparação. Conforme mostrado na tabela 5, altos títulos de IgG específica estavam presentes nos soros de camundongos vacinados com Ag85B-ESAT-6 em DDA/TDA. Em comparação com os títulos obtidos após a imunização com Ag85B-ESAT-6/Alhydrogel, a formulação de adjuvante compreendendo DDA/TDB induziu níveis mais elevados de anticorpos específicos.
Tabela 5. Títulos médios de anticorpos específicos para antígeno no soro de camundongos imunizados com Ag85B-ESAT-6

a Níveis de IgG específicos para Ag85B-ESAT-6 5 semanas após a primeira imunização, conforme medidos por ELISA

Exemplo 6A

Intensificação das respostas imunes por incorporação de um terceiro componente na combinação de DDA/TDB.
Recentemente, ligantes para receptores do tipo Toll (TLR) foram considerados alvos atraentes para inclusão em novas formulações de adjuvantes. Para investigar o efeito da incorporação de outros componentes imunoestimuladores, isto é, ligantes TLR, na formulação de DDA/TDB, os camundongos foram imunizados com 2 µg de Ag85B-ESAT-6 em 250 µg de DDA/50 µg de TDB e imunomoduladores selecionados. Esses incluíam 100 µg de Poli IC (ácido poliinosínico-policitidílico, Sigma Aldrich), adicionados a lipossomos de DDA-TDB pré-formados, que é sabidamente um ligante para TLR3, assim como 25 µg de muramil dipeptídio (MDP), que confere ativação de TLR2/TLR4. MDP foi incluído na película lipídica de DDA-TDB antes da hidratação.

Três semanas após a última imunização, esplenócitos ou células sangüíneas (conforme indicado na legenda da figura) foram purificados de camundongos individuais, e o nível de liberação de IFN-γ foi medido após reestimulação in vitro com 5 µg/mL de Ag85B-ESAT-6. Em comparação com a resposta imune gerada com apenas DDA/TDB ou com apenas os terceiros componentes (Poli IC e TDM), as formulações que englobam todos os três componentes deram origem a uma resposta imune intensificada, o que mostra a sinergia entre DDA/TDB e os imunomoduladores (Figura 11a e b).

Exemplo 7

A estabilidade de partículas de DDA-B é eficientemente intensificada pela incorporação de outros glicolipídios diferentes de TDB.

Para exemplificar que partículas de DDA-B podem ser estabilizadas com outros glicolipídios além de TDB, 11% molar de β-D-lactosil ceramida (β-LacCer), 11% molar de β- galactosil ceramida (β-CalCer) e 44% p/p de gangliosídeos G(Ml), respectivamente. As formulações foram preparadas pelo método de película e dispersadas em tampão Tris a 10 mM com pH 7,4 no dia 0. O tamanho de partícula foi medido por medições de espalhamento de luz dinâmico utilizando-se um Malvern ZetaSizer 4 (Malvern Instruments Ltd. UK) . As medições foram feitas nos dias 0, 14 e 28 após a preparação (Figura 12) . A comparação da estabilidade do tamanho de partícula no tempo mostra que a incorporação de glicolipídios estabiliza DDA.

Claims (21)

1. Método de estabilização de lipossomos catiônicos de lipídios catiônicos em formulações aquosas, caracterizado pelo fato de que compreende:
   a incorporação de glicolipídios nos lipossomos, em que os referidos lipídios catiônicos são compostos de amônio quaternário anfifílicos e os glicolipídios são incorporados de maneira estável na bicamada lipídica com sua fração hidrofóbica incorporada na região hidrofóbica da membrana da bicamada e sua fração do grupo principal polar orientada para a superfície hidrofílica da membrana.
2. Método de estabilização de lipossomos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que cada composto de amônio quaternário anfifílicos tem uma ou duas cadeias alifáticas,
   e em que cada uma das cadeias alifáticas compreende de 12 a 20 átomos de C.
3. Método de estabilização de lipossomos, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que os compostos de amônio quaternário anfifílicos são selecionados a partir do grupo que consiste em:
   brometo de dimetildioctadecilamônio (DDA-B), cloreto de dime-tildioctadecilamônio (DDA-C), sulfato, fosfato ou sal acetato de dimetildioctadecilamônio (DDA-X), dimetildioctadecenodiamenodiamônio (brometo de dimetildioctadecilamônio) DODA-C), sulfato, fosfato, composto acetato de dimetildioctadecenilamônio (DODA-X), 1,2-dioleoil-3-trimetilamônio propano; (DOTAP), dioleoil-3-dimetilaminopropano (DODAP) e N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamônio (DOTMA).
4. Método de estabilização de lipossomos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que os glicolipídios são glicosídeos acilados, cada um formado por uma ou até três cadeias de hidrocarbonetos alifáticos ligadas a um ou dois resíduos de monos-sacarídeos na porção de açúcar, em que as cadeias de hidrocarbonetos ali-fáticos compreendem cada uma de 12 a 20 átomos de C.
5. Método de estabilização de lipossomos, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que cada um dos glicolipídios contém um dissacarídeo com duas cadeias acila,
   em que as cadeias acila compreendem de 15 a 90 átomos de C.
6. Método de estabilização de lipossomos, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato do que os glicolipídios são 6,6'-dibeenato de alfa,alfa'-trealose (TDB) ou 6,6'-dimicolato de alfa,alfa'-trealose (TDM).
7. Método de estabilização de lipossomos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a porcentagem molar de glicolipídio é de 0,5 a 95% molar.
8. Método de estabilização de lipossomos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a porcentagem molar de glicolipídeo é de 2,5 a 20% molar.
9. Método de estabilização de lipossomos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a porcentagem molar de glicolípido de 5 a 18% molar.
10. Produto de lipossomo, caracterizado pelo fato de que é estabilizado pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9.
11. Produto de lipossomo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que um composto antigênico é encapsulado nos lipossomos.
12. Produto de lipossomo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que um antígeno é adsorvido ou acoplado cova-lentemente ao lipossomo.
13. Produto de lipossomo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizado pelo fato de que os lipossomos são estabilizados por 6,6'-dibeenato de alfa,alfa'-trealose (TDB) ou 6,6'-dimicolato de alfa,alfa'-trealose (TDM).
14. Produto de lipossomo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 13, caracterizado pelo fato de que é para uso em distribuição de medicamentos.
15. Produto de lipossomo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 13, caracterizado pelo fato de que é para uso como um adjuvante.
16. Adjuvante de vacina, caracterizado pelo fato de que compreende o produto de lipossomo como definido em qualquer uma das reivindicações 10 a 15.
17. Adjuvante de vacina, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que ainda compreende um modulador imune selecionada a partir do grupo que consiste em:
    monofosforil lipídio (MPL), derivados de monofosforil lipídeo A (MPL), ácido poliinosínico policitidílico (poli-IC), miramil dipeptídeo (MDP), análogos de miramil dipeptídeo (MDP), zimosan, RNA de filamento duplo (dSRNA), DC-chol, CpG oligoidesoxinucleotídeos e tamoxifeno.
18. Adjuvante da vacina, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o referido modulador imune é selecionado a partir do grupo que consiste em:
    monofosforil lipídeo A (MPL), ácido poliinosínico policitidílico (po-li-IC), miramil dipeptídeo (MDP), zimosano, RNA de filamento duplo (dSRNA), DC-chol, CpG oligoidesoxinucleotídeos e tamoxifeno.
19. Adjuvante de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 18, caracterizado pelo fato de que ainda compreende miramil dipeptídeo (MDP) e/ou ácido poliinosínico policitidílico (poli-IC).
20. Adjuvante de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 19, caracterizado pelo fato de que é para uso em uma vacina contra clamídia, malária ou tuberculose.
21. Vacina contra clamídia, malária ou tuberculose, caracterizada pelo fato de que compreende o adjuvante como definido qualquer uma das reivindicações 16 a 19.

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