KR101275837B1 - 당지질들을 이용하여 지질기반 보강제 제형을 안정화시키기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 물리적으로 안정한 리포솜 제형들에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 당지질이 리포솜 내로 함입되도록 하는 독특한 박막 방법에 의한 양이온 리포솜들의 입체적 안정화에 관한 것이다. 상기 안정화된 리포솜들은 항원 성분들을 위한 보강제(adjuvant) 또는 약물 전달 시스템(DDS) 중 어느 하나로서 이용될 수 있다. 특히 본 발명은 최종 산물이 안정되고, 면역을 위한 수성 매질(aqueous media)의 보강제들을 갖는 백신에 관한 것이다.
보강제, 당지질, 리포솜, 백신, 약물 전달 시스템

Description

당지질들을 이용하여 지질기반 보강제 제형을 안정화시키기 위한 조성물 및 방법{Compositions and methods for stabilizing lipid based adjuvant formulations using glycolipids}
본 발명은 물리적으로 안정한 리포솜 제형들에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 당지질이 리포솜 내로 함입되도록 하는 독특한 박막 방법에 의한 양이온 리포솜들의 입체적 안정화에 관한 것이다. 상기 안정화된 리포솜들은 항원 성분들을 위한 보강제(adjuvant) 또는 약물 전달 시스템(drug delivery system; DDS) 중 어느 하나로서 이용될 수 있다. 특히 본 발명은 최종 산물이 안정되고, 면역을 위한 수성 매질(aqueous media)의 보강제들을 갖는 백신에 관한 것이다.
전염성 질병에 대한 면역력을 얻고자 인체에 사용된 최초의 백신들은 약독화된(attenuated), 살아있는 병원체들로 구성되었다. 상기 약독화된 형태들은 관련된 생물체에서 자연적으로 발생하거나 연속계대(serial passage) 배양을 통해서 얻어졌다. 일례로 약독화되었으나, 살아있는 미코박테리아 보비스(BCG 백신) 균주의 접종에 의해 방지되는 결핵이 있다. 그러나, 이러한 과정의 효능이 모든 인구집단 내의 인간 결핵에 대해 항상 만족스러운 저항력을 제공하는 것은 아니다. 그러므로, 결핵 또는 다른 전염성 질병에 대한 면역력을 얻기 위한 새롭고 효율적인 방법을 필요로 한다. 특히 유망한 접근법으로 ESAT-6(early secretory antigenic target) 및 항원85(Ag85)과 같은 면역우성(immunodominant) 항원들의 재조합(recombinant) 형태들을 백신으로 분리하여 사용하는 것이다. 이 백신들은 명확히 정의되고 부작용이 최소화되어 있다. 불행하게도, 고도로 정제된 다수의 물질들, 예를 들어, 정제된 재조합형 단백질들은 매우 면역성인(immunogenic) 것은 아니며, 실제 전염성 질병을 방어할 수 있는 효과적인 면역반응을 생성하지 못한다. 이러한 사실은 이미 잘 알려져 있으며, 소위 보강제와 문제의 물질을 결합함으로써 면역성을 증가시키기 위한 수많은 시도가 수행되어 왔다. 병원체에 따라서, 체액성 면역반응 또는 세포매개성 면역반응 중 어느 하나의 방어기작이 우세하게 나타난다. 특별한 종류의 면역반응(체액성 또는 세포매개성)의 발현은 보강제의 선택에 의하여 결정될 수 있다.
미코박테리움 결핵과 같은 세포내의 병원체에 대한 방어 면역은 세포매개성 면역반응을 필요로 하고, 소단위(subunit) 결핵 백신용의 적당한 보강제가 Th1반응을 강화하여야 한다(Lindblad et al., 1997). 항체들은 결핵에 대한 면역에 있어서 중요한 역할을 하지 못하는 반면, 인터페론 감마(IFN-gamma)의 세포매개성 방출은 방어기작에 관련된 가장 중요한 사이토카인(cytokine)이라는 점이 알려져 있다(Collins & Kaufmann, 2001).
세포매개성 면역반응을 일으키는 다수의 보강제들이 제시되었으나 모든 면에서 이상적이라고 할 수 없는 일반적인 것이었다.
세포매개성 면역반응을 촉진하는 특히 효과적인 하나의 형태는 디메틸디옥타데실암모늄(dimethyldioctadecylammonium:DDA)과 같은 4급 암모늄 화합물이다(Higers and Snippe, 1992). DDA는 양전하를 띤 친수성의 디메틸암모늄(dimethylammounium) 머리부분(head group) 및 2개의 긴 소수성 알킬 사슬들을 포함하는 합성의 양친매성(synthetic amphiphile) 물질이다. 수성(aqueous) 환경에서, DDA는 천연 인지질들로부터 만들어진 리포솜과 유사한 소포성의 이중층을 자가-조립적으로(self-assemble) 형성한다. DDA 및 다른 면역조절제들과의 조합이 알려져 있다. DDA를 포함하는 아르쿼드 2HT(arquad 2HT)의 인체 내 투여는 유망했으며, 뚜렷한 부작용을 유도하지 않았다(stanfield et al., 1973). 미코박테리아 결핵(M.tuberculosis)로부터 얻은 배양액 여과단백질(cuture filtrate protein) 및 DDA에 기초한 실험 백신은 쥐들의 결핵에 대해 방어 면역반응을 발생시켰다(Andersen, 1994). 미코박테리아 결핵 단백질 ESAT-6 및 Ag85B의 융합 단백질(fusion protein) 및 보강제로서 DDA/MPL을 쥐들에게 접종한 결과, BCG 접종에 의해 얻을 수 있는 방어(protection)와 유사한 방어를 제공한다(Olsen et al., 2001). 이러한 연구들은, 예를 들어 명반(alum)과 대조적으로, DDA 기반 보강제들이 쥐들의 결핵에 대해 방어 면역반응을 일으킬 수 있다는 것을 입증하고 있다. 더욱이, DDA는 강화된 T세포 반응 및 항바이러스 면역을 유도하는 가성광견병(pseudorabies) 바이러스에 대한 DNA 백신을 위한 보강제로 사용되어 왔다(van Rooij et al., 2002).
가열사멸시킨 박테리아를 기초로 한 소 브루셀라균(Brucella abortus) 백신의 보강제로서, DDA 용액에 TDM(alpha,alph'-trehalose 6,6'-dimycolate) 오일 에멀젼(oil emulsion)을 첨가하는 것은 우다드(Woodard) 등(1980)에 의해 조사되었다. DDA 또는 DDA 및 TDM의 혼합으로도 방어효과를 유도하지 못하였다. 가용성 단백질 추출물을 기초로 한 소 브루셀라균 소단위 백신에 관한 또 다른 연구에서, DDA 및 TDM의 조합이 보강제로 사용되었으며(Dzata et al, 1991), DDA 단독일 때와 비교 관찰하여, 면역반응(항체 수준, 피부 테스트 반응 및 IL-2 수준)을 강화하는 혼합물이 발견되었다. 홀텐-안데르센 등(Holten-Andersen et al., 2004)는 DDA 리포솜 및 TDB(alpha, alph'-trehalose 6, 6'-dibehenate) 현탁액의 조합을 연구하였으며, 이러한 보강제 혼합물을 갖는 ESAT-6 항원의 투여가 DDA 리포솜에 ESAT-6이 투여되었을 때보다 결핵에 대해 훨씬 더 강력한 방어 면역반응을 유도함을 발견하였다.
불행하게도, 상기한 바와 같은 DDA 단독 또는 DDA 및 MPL, TDM 또는 TDB의 혼합물과 같은 양친매성 4급 암모늄 화합물의 현탁액은 물리적으로 불안정하며, 응집과 침전의 발생 없이는 4℃에서의 지속적 보관이 불가능하다. 침전은 상기 제형(formulation)의 임상적인 사용을 방해할 것이기 때문에, DDA 제형의 안정성 결여는 인체 적용에 있어서 지금까지 주요 장애가 되었다.
영국 특허번호 2147263-A에서, 다까시(Takahashi) 및 쯔지이는(Tsujii)는 2개의 4급 암모늄 화합물을 함께 혼합하거나, 다양한 계면활성제를 상기 4급 암모늄 화합물에 첨가함으로써 4급 암모늄 화합물의 소포의 안정화(stabilization)를 기술하고 있다.
미국 특허번호 5026546에서, 힐거스(Hilgers) 및 웨스트스트레이트(Weststrate)는 폴리아릴 수크로스(polyalyl sucrose)와 교차결합된(crosslinked) 아크릴산 중합체를 갖는 DDA의 보강제 현탁액의 안정화를 기술하고 있다.
세포의 형질전환(transfection)을 위한 양이온 지질-프로타민-DNA 복합체의 동결건조법(lyophilization)이 리(Li) 등(2000)에 의해 기술되었다. 단당류 및 이당류와 같은 종래의 저온보호제(cryoprotectants)를 첨가하는 효과가 평가되었으며, 이당류들은 단당류들에 비해 입자크기를 보존하는 데 더 양호한 것으로 밝혀졌다. 또한, 10% 수크로스로 안정화된 동결건조되지 않은 지질-프로타민-DNA 복합체는 4℃에서 8주간의 보관 후에도 안정한 입자 크기를 유지하나, 형질전환 효율은 동결건조되지 않은 시료에서보다 동결건조된 경우에 더 높았다.
미국 특허번호 5922350은 리포솜의 탈수반응 이전에 트레할로스 및 수크로스와 같은 당류를 첨가함으로써, 인지질 등에 기초한 리포솜의 저장기간을 연장하는 방법을 기술하고 있다. 더욱이, 상기 특허는 농도 구배(gradients)의 조합 및 탈수-수화 과정에 의하여, 미리 형성되고 저장된 리포솜의 지연된 로딩이 가능함을 기술하고 있다.
폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol) 유도체로 안정화된, 약물 전달을 위한 인지질의 리포솜(푸소지닉(fusogenic) 리포솜)이 WO 96/10392에서 기술되어 있다. WO 02/03959에 기술된 또 다른 약물 전달 제형은 양이온 리포솜 및 중성 리포솜을 포함하는 제형을 개시하고 있으며, 각각의 리포솜 그룹은 동일 또는 서로 다른 치료제 중 어느 하나를 수반한다.
리포솜 조제(preparation)를 위한 바람직한 방법들이 방햄 등(Bangham et al., 1965)에 의해 기술되어 있다. 상기 조제는 인지질의 유기 용매에서의 용해를 수반하며, 이후 증발 건조시켜 시험관의 내부에 얇은 지질막을 남기도록 한다. 상기 건조된 지질막은 적당량의 수용액 상에서 수화되며, 혼합물은 상기 지질의 상전이(phase transition) 온도를 넘어서 가열되어 "팽창(swell)" 된다. 그 결과 생성된 리포솜은 다중막 소포들(multiamellar vesicles:MLV's)로 구성되며, 시험관을 흔들어 줌으로써 흩어진다. 소포성 이중막을 구성하는 상기 지질들은 소수성 탄화수소 "꼬리"가 이중층의 중심부로 향하게 하고, 반면, 소수성 "머리"부분은 수용액 상(aqueous phase)의 내부 및 외부로 향하게 한다. 상기 조제는 초음파분해처리(sonication)(Papahadjopoulos et al., 1967) 또는 미국특허번호 5008050에서 컬리스(Cullis)가 기술한 바대로 압출(extrusion)과 같은 방법들에 의하여 단일막 소포들을 생산하는 토대를 제공한다.
스조카 및 파파하드조포러스(Szoka and Papahadjopoulos, 1978: 미국특허출원 4235871)에 의하여 소개된 역상 증발법은 소포들을 준비하는데 사용하는 다른 기법 중 하나이다. 상기 기법은 유기용매 내의 지질의 유중수 에멀젼(water-in-oil emulsion) 및 캡슐화될 물질을 포함하는 수성 완충용액을 형성하는 것을 포함한다. 감압된 상태에서 상기 유기용매의 제거는 점성의 겔(gel)을 생산한다. 상기 겔이 붕괴될 때 지질 소포들의 수성 현탁액이 형성된다.
카르모나-리베이로 및 차이모비흐(Carmona-Ribeiro and Chaimovich, 1983)에 의한 다른 방법은 원하는 지질의 클로로포름, 메탄올, 에탈올 등과 같은 유기용액을 수성 완충액에 분사하는 것을 포함한다. 상기 지질들은 용매가 증발함에 따라 자발적으로 리포솜을 형성한다.
또한, 상기 리포솜은 DDA에 관하여 홀텐-안데르센 등(2004)에 의하여 기술된 수성 가열법에 의하여 준비될 수도 있다. 상기 방법에 의하여 완충 수용액(aqueous buffer)내에서 화합물을 형성하는 리포솜의 현탁액은 20분간 간헐적으로 흔들어 줌으로써 예컨대, 80℃까지 가열되고, 이후 실내온도까지 냉각된다.
우다드(Woodard) 등(1980), 드자타(Dzata) 등(1991) 및 홀텐-안데르센 등(2004)에 의하여 사용되고 기술된 상기 언급된 "수성 가열법"은 DDA 및 TDB 용액을 안정화시키지는 않는다.
하나의 특별한 바람직한 방법에서, 단백질 항원들은 탈수-재수화 방법(Kirby and Gregoriadis, 1984)에 의해 먼저 형성된 소포들 내에 갇히게 된다. 상기 방법에서 수용액 상에 존재하는 올리고뉴클레오티드, 펩티드 또는 단백질들이 동결건조에 의해 갇히게 되고, 이후 동결건조된 리포솜들이 재수화된다.
별법으로, 상기 항원은 픽(Pick, 1981) 및 발리 등(Bally et al.)에 의해 미국특허번호 4975282에서 기술된 동결 및 해동 기술을 이용하여 함입된다. 상기 기술에서 소포들은 단백질 항원과 함께 혼합되고, 액체 질소 내에서 반복적으로 약간 동결(snap frozen)되며, 해당 지질의 주된 상전이 온도를 넘어서는 온도까지 가열된다. 상기 소포들은 비속박(non-entrapped) 항원을 제거하기 위하여 세척 및 원심분리 등의 더 많은 처리를 거칠 수 있다.
TDB와 같은 아실화된 글리코시드들(acylated glycosides) 및 미코박테리아 세포벽으로부터 분리된 코드 팩터(cord factor)인 TDM이 인지질 소포들 간의 융합(fusion)을 억제함이 알려져 있다(Spargo et al., 1991 및 Crowe et al., 1994). 친수성의 트레할로스 부분(trehalose moiety)은 상기 소포들의 표면에서 고정될 수 있으며, 이에 의하여 융합에 중요한 일차적 장애가 되는 수화력(hydration force)을 증가시킨다. 별법으로, 고정된 트레할로스 부분은 융합에 입체(steric) 장애로서 작용할 수 있다(Spargo et al., 1991).
인지질로부터의 리포솜들(TDB 없이)은 인플루엔자 백신 등에서 실험적으로 보강제로서 현재 사용된다(Ben-Yehuda et al., 2003). 또 다른 예는 인플루엔자에 대한 IMUXENTM 리포솜 백신이다(Lipoxen Technologies Ltd.; Gregoriadis et al., 1999).
4급 암모늄 화합물 및 특히 DDA는 매우 유망한 효과적인 백신 보강제 후보물질이나 수용액에서 물리적으로 불안정하여, 보관 중 응집과 침전물을 형성하는 주요 단점을 가지고 있기 때문에, 형성된 소포들을 안정화하는 것이 절대적으로 필요하다. 본 발명은 DDA와 같은 양이온 지질로 구성되는 보강제 제형들을 안정화시키는 새로운 방법을 기술한다. 덧붙여, 상기 방법에 의하여 상기 제형의 보강제 효과가 강화된다.
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본 발명은 당지질 예컨대, 알파,알파'-트레할로스 6,6'-디베헤네이트(TDB) 또는 알파,알파'-트레할로스 6,6'-디미코레이트(TDM)과 같은 아실화된 글리코시드를 DDA, DODA, DOTAP, DODAP 또는 DOTMA와 같은 양친매성의 4급 암모늄 화합물로부터 만들어진 리포솜 이중층에 함입함으로써 양이온 리포솜 현탁액을 안정화하는 조성물 및 방법을 개시한다. 당지질의 강하게 수화된 당의 머리 부분은 리포솜 이중층의 전체적인 수화반응을 증가시키고, 이는 4급 암모늄 머리 부분의 탈수반응 및 양이온 소포들의 감소된 전하 반발력에 의해 야기된 응집작용을 방해한다. 이러한 DDA의 안정화는 트레할로스 또는 수크로스와 같은 당류를 첨가하거나 4급 암모늄 화합물과 당지질을 간단히 혼합함으로써만 달성되는 것은 아니다. 또한, 본 발명은 이들 안정화된 리포솜들을 백신 보강제로서 사용하는 방법을 개시한다.
본 발명은 당지질을 갖는 수용액상의 제형 내의 양이온 리포솜을 안정화시키는 새로운 방법을 개시한다. 예컨대, 양친매성 4급 암모늄 화합물로부터 만들어진 양이온 리포솜들은 당지질을 리포솜막 내로 주입함으로써 안정화된다.
본 발명의 바람직한 실시예는 4급 암모늄 화합물이 디메틸디옥타데실암모늄(dimethyldioctadecylammonium)(DDA) 또는 디메틸디옥타데세닐암모늄(dimethyldioctadecenylammonium)(DODA)의 브롬화물, 염화물, 황산염, 인산염 또는 초산염일 때이다.
그 밖의 바람직한 4급 암모늄 화합물들은 1,2-디올레오일(dioleoyl)-3-트리메틸암모늄 프로판(trimethylammonium propane)(DOTAP), 1,2-디미리스토일(dimyristoyl)-3-트리메틸암모늄 프로판, 1,2-디팔미토일(dipalmitoyl)-3-트리메틸암모늄 프로판, 1,2-디스테아로일(distearoyl)-3-트리메틸암모늄 프로판 및 디올레오일-3-디메틸암모늄 프로판(DODAP) 및 N-[1-(2,3-디올레일옥시(dioleyloxy))프로필(propyl)]-N, N, N-트리메틸암모늄(DOTMA)들이다.
리포솜들을 안정화시키는 당지질은 바람직하게는 알파, 알파'-트레할로스 6, 6' 디베헤네이트(TDB) 또는 알파, 알파'-트레할로스 6, 6'-디미코레이트(TDM)이다. 제형 내에서 상기 당지질의 몰백분율은 0.5 내지 95 몰%일 수 있으나 바람직하게는, 2.5 내지 약 20 몰%, 더 바람직하게는 약 5 내지 18 몰%이다.
또한, 본 발명은 이들 안정화된 리포솜들을 백신 조성물 등의 보강제로서 사용하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 최종 산물이 안정된, 면역화를 위한 수성 매질에 보강제를 갖는 백신에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 기술된 백신 보강제로서의 사용법에 의하여 안정화된 리포솜 산물을 개시한다. 상기의 백신은 예컨대, 결핵, 말라리아, 클라미디아(chlamydia) 등의 질병에 대해 사용할 수 있다.
"리포솜"은 수성의 핵(aqueous core)을 둘러싸는 하나 이상의 지질 이중층으로 구성된 폐쇄(closed) 소포 구조체로서 정의된다. 각각의 지질 이중층은 2개의 지질 단일층으로 구성되고, 각각은 소수성 "꼬리" 부분 및 친수성 "머리" 부분을 가진다. 이중층에서, 상기 지질 단일막들의 소수성의 꼬리들은 이중층 내부로 향하는 반면, 친수성의 머리들은 이중층의 외부로 향한다. 리포솜은 크기, 지질 성분, 표면 전하, 유동성 및 이중막의 갯수 등과 같은 다양한 물리화학적 특성을 가진다. 지질 이중층의 갯수에 따라서 리포솜은 단일 지질 이중층을 포함하는 단일막 소포(UV) 또는 물로 채워진 층에 의해 분리된 2개 이상의 동심원의 이중층을 포함하는 다중막 소포(MLV)로 분류될 수 있다. 수용성 화합물은 지질 이중막의 내부에 갇힌 친유성의 화합물과 반대로, 리포솜의 수성의 상(phases)/핵(core) 내에 갇힌다.
"미셀(micelle)"은 양친매성 분자들의 콜로이드성 응집체(aggregate)로서 정의되며, 임계 미셀 농도(critical micelle concentration;CMC)로서 알려진 잘 정의된 농도에서 발생한다. 미셀 내에 응집된 분자들의 일반적인 갯수(응집수)는 50 내지 100개이다. 미셀은 탄화수소 꼬리부분이 중심을 향하고 극성의 머리부분은 외부의 수성 환경을 향하도록 지향된 계면활성제(surfactant) 분자들로 구성된 구형일 수 있다. 그 밖의 가능한 구조로 역전된(inverted) 미셀 및 원통형의 미셀을 포함한다.
"양이온 지질"이란 용어는 소수성 및 극성 머리 부분을 가지며, 생리학적 pH에서 순 양전하을 띠고, 자체로 물속에서 자발적으로 이중막 소포 또는 미셀로 형성될 수 있는 합성 지질 및 지질 유사체를 비롯한 양친매성 지질을 모두 포괄할 것으로 의도된다.
본 발명에서 사용된 특히 바람직한 하나의 양이온 지질 형태는 일반적으로 공식 NR1R2R3R4-X를 갖는 4급 암모늄 화합물로서, R1 및 R2는 각기 독립적으로 1 내지 3개의 탄소 원자를 포함하는 단쇄(short chain) 알칼기(alkyl group)이며, R3는 독립적으로 수소이거나 12 내지 20개, 바람직하게는 14 내지 18개의 탄소 원자를 포함하는 메틸 또는 알킬기이며, R4는 독립적으로 12 내지 20개, 바람직하게는 14 내지 18개의 탄소 원자를 포함하는 탄화수소기이다. X는 제약학적으로 허용가능한 음이온이며, 자체로 무독성이다.
이러한 음이온들의 예는 할로겐화 음이온(halide anions), 염화물, 브롬화물 및 요오드(iodine)들이다. 또한, 황산염, 인산염과 같은 무기질의(inorganic) 음이온 또는 아세트산과 같은 간단한 유기산으로부터 유래한 유기질 음이온이 사용될 수 있다. 상기 R1 및 R2 그룹은 메틸, 에틸, 프로필 및 이소프로필일 수 있는 반면, R3는 수소, 메틸 또는 도데실(dodecyl), 트리데실(tridecyl), 테트라데실(tetradecyl), 펜타데실(pentadecyl), 헥사데실(hexadecyl), 헵타데실(heptadecyl), 옥타데실(octadecyl), 노나데실(nonadecyl) 및 에이코킬(eicocyl) 기이며 R4는 도데실, 트리데실, 테트라데실, 펜타데실, 헥사데실, 헵타데실, 옥타데실, 노나데실 및 에이코킬일 수 있다. 그러나, 비록 상기 R3 및 R4기가 바람직하게는 가지가 없는(no branched) 부사슬(side chains)로 포화되어 있을지라도 어느 정도 메틸 및 에틸 등의 부사슬을 가지며 가지를 뻗을 수 있기 때문에, C12-C20 탄화수소기 역시 가능하다. 또한, R3 및 R4는 예컨대, 1-3 이중결합을 포함하는 약간의 불포화성을 가질 수 있으나, 바람직하게는 알킬기로 포화된다. 상기 양이온 지질은 가장 바람직하게는 디메틸디옥타데실암모늄 브롬화물 또는 염화물(DDA-B or DDA-C) 또는 이들의 황산염, 인산염, 초산염(DDA-X), 또는 디메틸디옥타데세닐암모늄(dimethyldioctadecenylammonium) 브롬화물 또는 이의 염화물(D0DA-B 또는 DODA-C) 또는 이들의 황산염, 인산염, 초산염 화합물(DODA-X)이다. 본 발명에 사용된 바람직한 양이온 지질의 다른 형태는 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄 프로판(DOTAP), 1,2-디미리스토일-3-트리메틸암모늄 프로판, 1,2-디팔미토일-3-트리메틸암모늄 프로판, 1,2-디스테아로일-3-트리메틸암모늄 프로판, 1,2-디올레오일-3-디메틸암모늄 프로판(DODAP) 및 N-[1-(2,3-디올레일옥시 프로필]-N, N, N-트리메틸암모늄(DOTMA)이나, 이에 국한되는 것은 아니다.
상기 양이온 리포솜은 당지질이 리포솜 막내로 함입됨으로써 안정화된다. 함입에 의한다 함은 분자의 소수성 부분 및 친수성 부분이 막, 미셀, 리포솜 또는 이중층의 해당 소수성 및 친수성 부분 또는 일부에 삽입되는 절차를 의미한다. 당지질들을 리포솜들 내로 함입하기 위한 절차들은 "박막법(the thin film method)", "역상증발법(the reverse phase evaporation method)" 및 "유기용액분사법(the organic solution injection method)"일 수 있으며, 그외 현재 또는 미래에서 당지질을 리포솜 막 내로 함입하는 동일한 효과를 갖는 것으로서 아직 알려지지 않은 방법을 포함한다. 현재 알려진 모든 방법들은 발명의 배경기술에서 언급되어 있다. 본 발명에 있어서 가장 바람직한 방법은 박막법이다.
당지질은 긴사슬 지방산, 아실글리세롤(acylglycerol), 스핑고이드(sphingoid), 세라미드(ceramide) 또는 프레닐 인산(prenyl phosphate)과 같은 소수성 부분에 글리코시드 결합된 하나 이상의 단당류 잔기를 포함하는 화합물로서 정의된다. 본 발명의 당지질은 합성에 의하거나 식물 또는 미코박테리아와 같은 미생물로부터 기원한다.
본 발명에 이용된 하나의 당지질 계열은 1 내지 3개의 지방산으로 에스테르화된 1 내지 2개의 당잔기(sugars residues)로 구성되는 아실화된(또는 알킬화된) 글리코시드이다. 상기 지방산들은 포화지방산 예를 들어, 미리스트산(myristic acic) C14:0, 펜타데칸산(pentadecanoic acid) C15:0, 팔미트산(palmitic acid) C16:0, 헵타데칸산(heptadecanoic acid) C17:0, 스테아르산(stearic acid) C18:0, 노나데칸산(nonadecanoic acid) C19:0, 아라키드산(arachidic acid) C20:0, 헤네이코산산(heneicosanoic acid) C21:0, 베헨산(behenic acid) C22:0 및 불포화 지방산 예컨대, 올레산(oleic acid) C18:1n-9, 리놀산(linoleic acid) 18:2n-6, 또는 미콜산(mycolic acid), 메톡시기미콜산(methoxymycolic acid), 케토미콜산(ketomycolic acid), 에폭시미콜산(epoxymycolic acid) 및 코리노미콜산(corynomycolic acid)과 같은 고급 분지 지방산(complex branched fatty acid)들 중 어느 하나를 포함하는 직선형 사슬일 수 있다. 당잔기는 포도당, 과당과 같은 간단한 단당류 또는 2개의 단당류가 공유결합으로 연결된 이당류, 예를 들면 포도당과 과당으로 구성된 자당(sucrose) 및 2개의 글루코스가 글리코시드 결합된 트레할로스일 수 있다. 본 발명에 이용된 하나의 당지질의 형태는 미코박테리아로부터 분리된 세포벽 당지질로서, 1 내지 3분자 중 어느 하나의 통상의 팔미트산 C16:0, 올레산 C18:1n-9, 리놀산 18:2n-6 또는 복잡한 히드록시(complex hydroxy), 분기사슬(branched chain) 지방산 예를 들면, 탄소원자 60 내지 90의 길이를 갖는 미콜산 잔기(residues)로 에스테르화된 이당류로 구성된다. 본 발명에 이용된 그 밖의 세균성 당지질은 코리노 박테리아(Corynobacterium), 노카르디아(Nocardia)로부터 분리된 코리노미콜산(22-36개의 탄소) 또는 노카르도미콜산(44-60개의 탄소)과 같은 더 짧은 지방산 사슬을 가진다. 바람직한 미코박테리아 당지질은 종종 코드 팩터로 언급되는 알파, 알파'-트레할로스 6, 6'-디미코레이트(TDM)으로서, 미코박테리아 세포벽의 가장 중요한 면역조절 성분 중 하나이다. 특히 바람직한 실시예에서, 상기 당지질은 TDM의 순수 합성 유사체인 알파, 알파'-트레할로스 6, 6'-디베헤네이트(TDB)와 같은 2분자의 도코산(docosanoic) 지방산(베헨산)으로 에스테르화된 이당류의 알파, 알파'-트레할로스로 구성된다.
본 발명에 이용된 다른 당지질 계열은 하기를 포함하나 이에 국한되지는 않는 것으로서;
글리세롤에 기초한 당지질: 이 지질은 1 또는 2개의 지방산으로 아실화(또는 알킬화)될 수 있는 글리세롤의 히드록시기에 글리코시드결합을 하는 단당류 또는 올리고당의 부분으로 구성된다. 더욱이, 상기 당지질은 전기적으로 중성을 띨 수 있고, 따라서 종종 중성 글리세롤당지질(neutral glycoglycerolipids)로 불리거나, 황산기 또는 인산기를 포함할 수 있다.
세라미드에 기초한 당지질: 글리코스핑고지질은 탄수화물 부분에 따라서 비치환(unsubstituted) 글리코실기를 포함하는 중성 글리코스핑고지질 및 산성 카르복실기, 황산기 또는 인산기를 갖는 글리코실기를 포함하는 산성 글리코스핑고지질로 구분된다.
지질다당류(lipopolysaccharides)(LPS): 이러한 착체화합물들(complex compounds)은 그램 음성(Gram-negative) 박테리아의 세포벽에서 발견된 내독소(endotoxic) 항원들이다(S-지질다당류). 지질 파트(지질 A)는 글리코시드결합을 통해 다당류와 복합체를 형성한다. 지질 A는 글루코사민 I의 1-위치 및 글루코사민 II의 4-위치에서 2개의 포스포에스테르(phosphoester)기를 갖는 b-1,6-글루코사미닐(glucosaminyl)-글루코사민의 백본(backbone)으로 구성된다. 상기 글루코사민 II의 3-위치는 긴사슬 다당류에 산 불안정성의(acid labile) 글리코시드 결합을 이룬다. 그 밖의 작용기들(groups)은 히드록시미리스틴산(2개의 에스테르결합 및 2개의 아미드결합)으로서 히드록실화된 지방산 및 통상의 지방산(라우린산)으로 치환된다(Escherichia에서). 특히 바람직한 본 발명의 지질다당류는 지질 A의 단인산기(monophosphoryl) 유도체(MPL)로서, 무독성이며 탁월한 보강제 특성을 가진다.
스테롤의 글리코시드: 이 패밀리(family)는 하나의 스테롤 분자의 히드록시기에 결합된 하나의 탄수화물로 구성된다. 상기 스테롤 부분은 콜레스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 시토스테롤, 브라시카스테롤 및 디히드로시토스테롤과 같은 다양한 스테롤들로 구성되도록 하였다. 상기 당 부분은 포도당, 자일로스(xylose) 및 아리비노스(arabinose)로 구성된다.
지방산 또는 알콜의 글리코시드: 다수의 간단한 당지질들이 박테리아, 효모 및 하등 생물(해면)에서 발견된다. 이 화합물은 지방 알콜 또는 히드록시 지방산의 히드록시기 또는 하나의 지방산의 카르복시기(에스테르결합)에 연결된 글리코실 부분(하나 또는 수개의 단위들)로 구성된다. 이들 화합물은 종종 흥미로운 물리적 또는 생물학적 특성을 갖는다. 이들 중 일부는 계면활성제(detergent)의 특성으로 인해 산업적으로 생산된다(알킬 글리코시드).
알킬 사슬은 직선형 또는 분기형일 수 있는 지방족 탄화수소 사슬을 지칭한다. 상기 사슬은 포화될 수 있거나, 예컨대 불포화된, 하나 이상의 이중결합을 포함할 수 있다.
알킬 사슬은 알킬-OC(O)기를 지칭하며, 상기 알킬기는 앞서 언급된 바와 같다.
지방산 사슬은 알킬 또는 아실기의 분기되거나 분기되지 않은 포화 또는 불포화 탄화수소 사슬에 속한다.
제약학적으로 허용가능한 이라는 상기 용어는 활성 성분들의 효과 및 생물학적 활성을 방해하지 않는 물질을 지칭하는 것이며 또한, 숙주(host) 또는 환자에게 무독성이다.
상전이 온도 또는 Tm은, 시차주사열량계(differential scanning calorimetry)(DSC)에 의하여 측정되는 바와 같이, 리포솜 이중층이 정돈된 지방산 사슬들(고체상태)을 특징으로 하는 더 저온의 겔상(gel phase)에서 지방산 사슬들이 고도로 구조적으로 무질서해지는(액체상태) 고온의 액상(fluid phase)으로 변화하는 온도이다.
제약학적 제형의 안정성에 의함이라 함은 제형의 용량이 제품의 유효기간 동안 정의된 한계 내에 남아 있는 것을 의미한다. 리포솜의 분산들은 화학적, 물리적 안정성의 특징들을 보여준다.
화학적 안정성은 화학적 분해(degradation)와 관련있는 반면, 물리적 안정성은 시스템의 콜로이드적 안정성과 관련이 있다.
리포솜 분산의 물리적 안정성은 소포상 간의 상호작용에 의하여 결정되는 것으로서, 인력과 척력 간의 균형에 좌우된다. 콜로이드계(colloidal system)는 척력 즉, 덩어리(bulk) 물과 상호작용 영역의 물 간의 화학적 포텐셜의 차이에 기인한 정전기적 척력 및 입체적(steric) 척력에 의하여 안정화된다.
보강제는 항원에 대한 면역반응을 비특이적으로 강화하는 물질로서 정의된다. 상기 어주반트의 성질에 의거하여, 세포매개성 면역반응, 체액성 면역반응 또는 상기 두 면역반응의 혼합을 촉진할 수 있다. 상기 면역반응의 강화는 비특이적이기 때문에, 동일한 보강제가 서로 다른 표적들에 대한 면역반응들을 촉진하기 위하여 서로 다른 항원 예컨대, 결핵균(M. tuberculosis)에 대한 면역을 촉진하기 위하여 결핵균으로부터 얻은 항원 또는 특별한 종류의 종양에 대해 면역을 촉진하기 위하여 상기 종양으로부터 유래한 항원과 함께 사용될 수 있음은 자명하다.
4급 암모늄 화합물 예를 들어, 디메틸디옥타데실암모늄(DDA)의 브롬화물, 염화물 또는 이들의 다른 유기 또는 무기염(DDA-B, DDA-C 또는 DDA-X) 또는 디메틸디옥타데세닐암모늄의 염화물, 브롬화물 또는 이들의 다른 유기 또는 무기염(DODA-C, DODA-B 또는 DODA-X), 또는 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄 프로판(DOTAP), 1,2-디미리스토일-3-트리메틸암모늄 프로판, 1,2-디팔미토일-3-트리메틸암모늄 프로판, 1,2-디스테아로일-3-트리메틸암모늄 프로판 및 디올레오일-3-디메틸암모늄 프로판(DODAP) 및 N-[1-(2,3-디올레일옥시 프로필]-N, N, N-트리메틸암모늄(DOTMA)은 수성 매질 내에서 분산될 때 지질 이중층, 단일 및 다중막의 모든 형태의 리포솜, 미셀 등과 같은 지질 응집체를 형성할 수 있다. 이런 구조의 지질막은 본 발명의 소포 분산을 안정화시키는 것으로 알려진 당지질과 같은 그 밖의 양친매성 화합물의 내포(inclusion)를 위한 탁월한 기질(matrix)을 제공한다.
게다가, TDB 및 TDM과 같은 당지질은 그들 스스로 면역자극성을 지니고 있으며, 4급 암모늄과 함께 상승효과를 발휘하여 면역반응을 강화한다. 더욱이, 올리고뉴클레오티드, 펩타이드 또는 단백질 항원들과 같은 거대 분자들은 단일 및 다중막 리포솜의 수용액상(aqueous phase)에 갇힐 수 있다.
예컨대, TDB의 소수성 아실 사슬들은 본 발명의 4급 암모늄 화합물로부터 만들어진 지질 이중층의 소수성 영역에 삽입될 것으로 예상되며, 이로 인해 소수성 영역과 벌크워터(bulk water) 간의 경계면에서 친수성 트레할로스 머리부분을 고정시킨다. 강하게 수화된 당의 머리부분은 상기 경계면의 전반적인 수화를 증가시켜, 소포들의 응집 또는 융합을 위하여 필요한 대립하는(opposing) 이중층의 근접을 방지하는 수화력을 증가시킬 수 있다. 상기 경계면의 수화의 결과로서 상기 이중층의 유동성이 증가할 수 있으며 또한, 소포들을 안정화시키는 경향이 있다.
본 발명의 제형에 이용되는 분산 매질은 어떠한 적합한 수성의 유기용매일 수 있다. 그러나, 리포솜 제형의 안정성은 인산 및 황산 이온과 같은 음이온들에게 민감한 것으로 나타난다. 따라서, 본 발명의 보강제 조성물은 상기 이온들이 없거나 낮은 수준에서 형성되는 것이 선호된다.
백신 보강제로서 사용될 때, 항원 성분이 MPL(모노포스포릴 지질 A) 또는 이의 유도체, 폴리이노신 폴리시티딜산(polyinosinic polycytidylic acid)(poly-IC), 무라밀디펩티드(muramyldipeptide;MDP) 또는 이의 유사체, 지모산(zymosan), 이중가닥 RNA(double stranded RNA;dsRNA), DC-Chol, CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(olideoxynucleotides) 및 타목시펜(tamoxifen)과 같은 다른 면역조절제와 가능한 함께 상기 보강제 용액에 첨가된다. 항원 성분 또는 물질은 분자로서, T 및 B세포상의 특이 수용체 및/또는 미리 형성된 항체와 작용한다. 예방접종의 맥락에서, 특이 T 및 B세포들의 발현을 자극하여, 만약 상기 항원이 면역세포들과 2차로 만나게(encounter) 되는 경우, 더 빠른 "기억(memory)" 반응을 촉진하는 면역세포들의 기억세포 군집(memory population)을 형성시키는 분자를 말한다. 기억세포 군집은 거의 클론이 아니므로, 실제로 이는 이전에 그에 노출된 적이 있는 개체의 면역세포와 다시 만날 경우, 면역반응 증가를 촉진할 수 있는 분자 또는 분자 집단이면 어느 것이든 항원이 될 수 있음을 의미한다.
상기 항원 성분 또는 물질은 폴리펩티드 또는 이의 일부로서, 동물 또는 인체 및/또는 본 원에 기술된 어떤 생물학적 분석시험에 의해 결정된 생물학적 표본 내에서 면역반응을 유도할 수 있다. 폴리펩티드의 면역원성(immunogenic) 부분은 T세포 또는 B세포의 항원결정기(epitope)일 수 있다. 면역반응 동안에 인식되는 관련 T세포의 항원결정기를 식별하기 위해서, "브루트포스(brute force)"법을 사용하는 것이 가능하다: T세포 항원결정기는 선형이기 때문에, 폴리펩티드의 결실변이체(deletion mutants)는, 만약 체계적으로 조성된다면, 예를 들어 상기 결실변이체를 본 원에 기술된 IFN-감마 분석시험 등을 함으로써 상기 폴리펩티드의 어느 영역이 면역 인식에 있어서 필수적인지 보여주게 된다. 위와 달리, 상기 폴리펩티드로부터 유래한 오버랩핑(overwrapping) 올리고펩티드(바람직하게는 20 아미노산 잔기의 길이를 가짐)를 이용하는 방법이 있다. 이 펩티드들은 생물학적 분석시험(예컨대, 상기 IFN-감마 분석시험)에서 시험될 수 있으며, 이들 중 일부는 상기 펩티드의 T세포 항원결정기의 존재에 대한 증거로서 양성 반응(즉, 면역원성)을 보여 줄 것이다. 선형 B세포 항원결정기는 하보에 등(Harboe et al., 1998)이 기술한 바와 같이 관심있는 폴리펩티드를 덮고 있는 오버래핑 펩티드들에 대한 상기 B세포 인식(recognition)을 분석함으로써 결정될 수 있다.
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비록 T세포의 항원결정기의 최소 길이가 6개라는 점을 알고 있으나, 그러한 항원결정기는 더욱 길게 연장되어 구성되는 것이 보통이다. 그러므로, 본 발명의 상기 폴리펩티드 단편은 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 12, 적어도 14, 적어도 16, 적어도 18, 적어도 20, 적어도 22, 적어도 24, 적어도 30개의 아미노산 잔기와 같은, 적어도 7개의 아미노산 잔기의 길이를 가지는 것이 바람직하다. 그러므로, 본 발명의 방법에 관한 중요한 실시예에 있어서, 상기 폴리펩티드 단편은 최대 50개의 아미노산 잔기의 길이를 가지며, 마찬가지로 최대 40, 35, 30, 25 및 20개의 아미노산 잔기를 가지는 것이 바람직하다. 10 내지 20개 사이의 아미노산 잔기의 길이를 갖는 펩티드들은 진단 수단(diagnostic tools)으로서 가장 효율적이라는 점이 증명될 것이며, 본 발명의 방법에 이용된 폴리펩티드 단편의 특별히 바람직한 길이는 18이며, 마찬가지로 15, 14, 13, 12 및 11개까지의 아미노산을 포함한다.
백신은 질병에 대한 면역성을 얻기 위하여 접종에 사용되는, 사멸 또는 약독화되거나 그 밖의 변형된 미생물(박테리아, 바이러스 또는 리케차(rickettsiae)) 또는 이들 일부의 현탁액으로 정의된다. 상기 백신은 질병을 예방하기 위한 예방 백신 또는 암 또는 잠복중인 감염성 질병과 같은 이미 존재하는 질병과 싸우기 위한 치료 백신으로서 투여되며 또한, 알레르기 및 자가면역성 질병과도 관련이 있다. 상기 백신은 면역반응을 증강시키기 위한 적당한 보강제에 유화될 수 있다.
상기 백신은 투여 제형(dosage formulation)에 적합한 방법으로, 그리고 치료상 효과적이고 면역성이 있을 양으로 투여된다. 그 양은 치료될 대상에 좌우되며, 예를 들어 면역반응에 이르게 되는 개인의 면역 체계의 수용력 및 원하는 방어도(degree of protection)를 포함한다. 적당한 투여량의 범위는 예방접종마다 대략 수백 마이크로그램의 활성 성분으로 바람직하게는 약 1 내지 300㎍, 특별하게는 약 10 내지 50㎍의 범위와 같은 약 0.1 내지 1000㎍ 범위이다. 최초 투여 및 추가 접종(booster shot)에 있어 적절한 요법들이 다양하게 있으나, 후속되는 접종 또는 그 밖의 투여들에 앞서, 최초 투여가 대표적이다.
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적용 방식은 널리 다양할 수 있다. 백신의 투여에 대한 종래의 방법들 중 임의의 방법을 적용할 수 있다. 상기 방법들은 비경구적으로, 주사 등에 의하여 생리학적으로 허용될 수 있는 고체의 베이스(base) 또는 분산(dispersion)으로 구강 또는 점막에 적용되는 것으로 알려져 있다. 상기 백신의 투여량은 투여 경로에 따라 다르며, 백신접종을 받을 사람의 나이, 보다 덜 중요한 요인으로는 접종을 받을 사람의 체구의 크기에 따라 다양할 것이다.
상기 백신들은 종래 주사에 의하여, 예를 들면 피하 또는 근육 주사 중 어느 하나로 비경구적으로 투여된다. 그 밖의 투여방식에 적당한 추가적 제형들로 좌약 및 때로는 구강 또는 점막용 제형 등을 포함한다. 좌약에 있어서, 전통적인 바인더(binders) 및 캐리어(carriers)는 폴리알카린 글리콜(polyalkalene glycols) 또는 트리글리세리드(triglycerides) 등을 포함할 수 있다; 그러한 좌약들은 0.5 내지 10%, 바람직하게는 1 내지 2%의 범위의 활성 성분을 포함하는 혼합물로부터 형성될 수 있다. 구강 제형은 약제학적 등급의 마니톨, 락토스, 녹말, 마그네슘 스테아린산염(stearate), 소듐 사카린, 셀룰로오스, 마그네슘 탄산염 등으로서, 통상적으로 사용되는 첨가제(excipients)를 포함한다. 이들 성분들은 용액, 현탁액, 타블릿(tablets), 정제, 캡슐, 지효성 약제(sustained release) 또는 파우더의 형태를 취하고, 유리하게는 10 내지 95%, 바람직하게는 25 내지 70%의 활성 성분을 포함한다.
상기 선택된 백신은 예를 들어;
단백질 백신: 폴리펩티드(또는 이의 적어도 하나의 면역원성의 성분) 또는 융합 폴리펩티드를 포함하는 백신 성분.
재조합형(live recombinant) 생백신: 비병원성 미생물 또는 바이러스 백신의 관련된 항원의 발현. 그러한 미생물들의 잘 알려진 예들은 미코박테리아 보비스 BCG, 살모넬라 및 슈도모나스(Pseudomonas)이며, 바이러스의 예들로는 우두 바이러스(Vaccinia Virus) 및 아데노바이러스(Adenovirus)들이 있다.
이들 백신 구성체들 모두에게 있어서, 적당한 보강제의 첨가는 백신 효율을 강화하는 결과를 가져왔다(Brandt et al., 2000; van Rooij et al., 2002; Wand et al., 2002); Eriksson, 2003).
본 발명의 또 다른 실시예는 보강제를 포함하는 전달 시스템이다. 리포솜은 면역보강제, 감염성 질병 및 염증의 치료, 암치료 및 유전자치료 분야 등 약리학 및 의학에 있어서 전달 시스템으로서 이용되어 왔다(Gregoriadis, 1995). 리포솜의 보강 효과에 영향을 미칠 수 있는 요소들은 리포솜의 크기, 지질 성분 및 표면 전하이다. 더욱이, 항원 위치(예컨대, 흡수되는지 아니면 공유결합으로 리포솜 표면에 결합되는지, 아니면 리포솜의 수성의 구획 내에 캡슐화되는지 여부)도 중요할 수 있다. 수지상 세포들이 항원전달체로서 사용될 수 있다. 수지상 세포와 같은 항원제시세포(antigen presenting cells)에 항원을 로딩하는 것은 항종양(antitumor) 면역에서 작용하는 활성 T세포들을 생성하는 효과적인 방법이 될 수 있음이 알려져 있다.
상기 본 발명의 리포솜들은 당해 기술분야에서 잘 알려진 다양한 방법들에 의하여 만들어질 수 있다.
바람직하게는, 상기 양이온 지질은 디메틸암모늄 머리부분 및 12 내지 20개의 C원자들 예컨대, 디메틸디옥타데실암모늄 브롬화물(DDA-B), 디메틸디옥타데세닐암모늄 염화물(DODA-C)을 포함하는 2개의 긴 소수성 알킬 사슬들을 갖는 4급 암모늄 화합물이다. 바람직한 양이온 지질의 다른 형태들은 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄 프로판(DOTAP), 1,2-디미리스토일-3-트리메틸암모늄 프로판, 1,2-디팔미토일-3-트리메틸암모늄 프로판, 1,2-디스테아로일-3-트리메틸암모늄 프로판, 1,2-디올레오일-3-디메틸암모늄 프로판(DODAP) 및 N-[1-(2,3-디올레일옥시(dioleyloxy))프로필(propyl)]-N, N, N-트리메틸암모늄(DOTMA)을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다.
상기 당지질은 바람직하게는 1 내지 2개의 당잔기를 아실화하는 1 내지 3분자의 지방산에 의하여 형성된 아실화된(또는 알킬화된) 글리코시드이다. 상기 지방산들은 포화 또는 불포화된 직선형 사슬 또는 복잡한 분기형(complex branched) 지방산들이다. 당류로는 간단한 단당류 또는 2개의 단당류가 공유결합된 이당류 중 어느 하나일 수 있다. 특히, 상기 당지질의 바람직한 실시예는 14 내지 90개의 C원자들 예컨대, 알파, 알파'-트레할로스 6, 6'디베헤네이트(TDB) 및 알파, 알파'-트레할로스 6, 6'-디미코레이트(TDM)을 포함하는 1 또는 2개의 글리코시드 결합된 지방산 사슬들을 갖는 트레할로스로 구성된다.
하나의 실시예에서, 본 발명의 리포솜들은 바람직하게는 4급 암모늄 머리부분 및 2개의 긴 소수성 알킬 사슬들을 갖는 양이온 지질을 형성하는 이중층을 포함한다. 특히 바람직한 실시예에서, 상기 머리부분은 디메틸암모늄이고 상기 소수성의 사슬들은 헥사데실기(hexadecyl), 옥타데실기 또는 옥타데세닐기 사슬이다. 본 발명의 상기 양이온 지질들은 단독으로 또는 임의의 조합의 형태로 사용될 수 있다. 더욱이, 상기 양이온 지질들 또는 이들의 혼합물은 포스파디틸콜린(phosphaditylcholine;PC) 및 포스파디틸글리세롤(phosphaditylglycerol;PG)와 같은 중성 인지질 또는 천연 또는 합성된 정전기적으로 중성인 지질들을 형성하는 다른 이중층과 결합한 형태로 사용될 수 있다.
상기 양이온 리포솜들은 박막법을 이용하여 당지질들을 상기 리포솜막들 내부로 함입함으로써 안정화된다. 반대로, 이 안정화 효과는 앞서 기술된 제형인 DDA 및 TDB의 미리 형성된 용액을 혼합함으로써 얻어지지는 않을 것이다(Woodard et al., 1980, Dzata et al., 1991, Holten-Andersen et al., 2004). 상기 당지질은 안정되게 상기 지질 이중층 내부로 함입되어 이의 소수성 부분은 상기 이중막의 소수성 영역에 삽입되고, 이의 극성 머리부분은 상기 막들의 친수성 표면을 향하게 놓인다. 상기 양이온 리포솜들에 첨가된 당지질의 몰비(molar ratio)는 당지질의 특성 및 제형에 사용될 수 있는 첨가제(potential excipient)에 좌우된다. 특유의 당지질의 몰 백분율은 0.5 내지 약 95 몰%이고, 바람직하게는 약 2.5 내지 약 20 몰%이며, 더욱 바람직하게는 약 5 내지 약 18 몰%일 수 있다.
본 발명의 특히 바람직한 실시예에서, 4급의 암모늄 화합물/양이온 지질은 DDA-B이며 상기 당지질은 TDB이다. 리포솜들은 약 1mM, 2mM, 5mM 또는 10mM의 총 지질 농도에서 5몰%, 10몰% 또는 15몰%로 적당한 유기 용매에 정량의 DDA-B 및 TDB를 용해함으로써 준비된다. 상기 용매는 증발되어 얇은 지질막을 시험관의 내부에 남긴다. 이후, 건조된 지질막은 영(0)에 가까운 염(salt) 농도를 갖는 약학적 허용범위의 완충액에서 수화된다. 안정된 리포솜 구조체의 형성은 인산 또는 황산과 같은 특별한 음이온들의 존재 여부에 민감한 것으로 나타난다. 바람직한 유기 완충액(organic buffer) 예컨대, pH 6.0 내지 8.0, 더 바람직하게는 pH 6.5 내지 7.5를 갖는 2-아미노-2-(히드록시메틸(hydroxymetyl))-1,3-프로파네디올(propanediol)(트로메타모룸(Trometamolum) 또는 간단히 Tris) 또는 2-비스(2-히드록시메틸)아미노-2-(히드록시메틸)-1,3-프로파네디올(비스-트리스(Bis-Tris))는 상기 트리스 또는 비스-트리스 염기를 밀리큐 워터(MilliQ water)에 용해하여 염산(HCl)를 첨가하여 상기 pH를 조절함으로써 준비된다. 상기 완충액은 트리스 또는 비스-트리스에 국한되지 않으며 임의의 약학적 허용범위의 완충액이면 되며, 심지어 완충물질이 첨가되지 아니한 순수한 물일 수도 있다. 상기 혼합물은 20분간 5분마다 강하게 흔들어주면 지질 혼합물의 상전이 온도 이상으로 가열된다. 결과적으로 생성된 보강제 제형은 통상의 양이온 리포솜들에 대해 현저히 개선된 물리적 안정성을 갖는 것을 특징으로 하는 MLV를 구성한다.
항원 물질 즉, 단백질 또는 펩티드는 상기 보강제 제형에 첨가 및 혼합된다. 가장 바람직하게는, 상기 항원 물질은 유도 정전기력 또는 소수성 상호작용에 의하여 소포들에 결합된다. 본 발명의 특히 바람직한 실시예에서, 결핵에 대한 최종 백신은 융합 단백질(fusion protein) Ag85B-ESAT-6의 용액상의 TDB에 의하여 안정화된 DDA 리포솜들을 포함한 보강제 제형을 혼합함으로써 준비된다. 상기 보강제는 본 발명에 따라서 ml당 2.50 mg DDA(4mM)및 ml당 0.25mg TDB(0.25mM)를 포함하도록 준비되며, 이는 pH 7.4의 10mM 트리스 완충액에서 약 5 몰%의 TDB 농도에 해당한다. 약 4.5 ml의 상기 보강제 제형은 Ag85B-ESAT-6의 0.5 ml 1.0 mg/ml 트리스-완충용액과 혼합되어 최종 사용가능한 백신의 형태인 100 ㎍/ml의 융합 단백질의 농도를 이루게 된다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 항원 물질은 탈수-재수화 방법을 이용하여 소포 내로 캡슐화되어 인입되거나 별법으로, 상기 항원은 냉각 및 해동 기법을 이용하여 함입된다.
도 1은 본 발명에 이용된 일부의 양이온 지질의 구조도를 도시하고 있다.
도 2는 4℃에서 2개월의 저장을 거친 10mM DDA 제형의 디지털 사진으로서, 시료 02는 16 몰% TDB, 시료 03은 12.5 몰% TDB, 시료 04은 6 몰% TDB, 시료 05은 2.5 몰% TDB, 시료 06은 0.5 몰% TDB을 포함하고, 참고 시료(REF)은 DDA만을 포함한다. 이 사진에서 TDB를 포함하는 현탁액은 더 균질하며 침전물이 없음을 명확하게 알 수 있다.
도 3은 30 C/h의 주사 속도(scan rate)에서 얻어지는, (상단부터 하단으로) TDB의 농도가 증가하는 경우의 DDA-B로 구성된 다중막 리포솜들의 DSC 열분석도이다. 상기 리포솜들은 pH 7.4의 10mM 트리스 완충액에 분산되었다. 상기 열분석도는 TDB가 DDA 리포솜막들에 삽입됨을 명확하게 도시하고 있다.
도 4는 30 C/h의 주사 속도(scan rate)에서 얻어지는, 상단부터 하단으로 항원 Ag85B-ESAT-6의 농도가 증가하는 경우의 DDA-B 및 TDB로 구성된 다중막 리포솜들의 DSC 열분석도이다. 상기 리포솜들은 pH 7.4의 10mM 트리스 완충액에 분산되었다. 상기 열분석도는 항원을 상기 리포솜에 함입시킴으로써 상전이 온도가 변하지 않음을 명확하게 도시하고 있다.
도 5는 0몰%(-◆-), 6몰%(-▲-), 11몰%(-★-) 및 20몰%(-■-)의 TDB를 포함하는 DDA 리포솜들의 평균 입자 크기의 변화를 시간에 따라 보여주는 그래프이다. 상기 리포솜들은 pH 7.4의 10mM 트리스 완충액에 분산되었다. 14일 이후 TDB가 없는 DDA 리포솜들에서 급격한 증가가 관찰된다.
도 6A는 DDA 리포솜들(-◆-) 및 수성 가열법(aqueous heat method)으로 준비한 11몰%의 TDB(-▲-), 박막법으로 준비한 11몰%의 TDB(-■-)를 포함하는 DDA 리포 솜들의 평균 입자 크기의 변화를 시간에 따라 보여주는 그래프이다. 상기 리포솜들은 pH 7.4의 10mM 트리스 완충액에 분산되었다. 14일 이후, DDA 리포솜들 및 수성 가열법으로 준비한 DDA/TDB 리포솜들에게서 급격한 증가가 관찰된다.
도 7A는 11몰% TDB(-■-), 10%(w/v) 트레할로스(-●-) 및 10%(w/v) 수크로스(-Ｘ-)를 포함하는 DDA 리포솜들의 평균 입자 크기의 변화를 시간에 따라 보여주는 그래프이다. 상기 리포솜들은 pH 7.4의 10mM 트리스 완충액에 분산되었다. 14일 이후, 트레할로스 및 수크로스를 포함하는 DDA 리포솜들은 더 이상 PCS에 의한 측정이 불가능할 정도로 응집되었다.
도 7B는 4℃에서 14일간의 보관을 거친 10mM DDA 제형들의 디지털 사진으로서, 각각 10%(w/v) 트레할로스와 11mol% TDB를 포함한다. 트레할로스를 포함하는 제형 내에서 극심한 응집이 관찰되었다.
도 8은 최종 사용단계 백신의 초원심분리된 Ag85B-ESAT-6의 상청액(supernatant) 및 재현탁된 침전물(resuspended pellet)의 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) 분석이 수행되어 양이온 리포솜들에 항원이 흡수되는 것을 시각화하고 있다.
도 9는 본 발명의 실시예 1에서 기술된 바와 같이 준비된 Ag85B-ESAT-6/DDA/TDB 또는 홀텐-안데르센 등(2004)에 의해 기술된 바와 같이 준비된 Ag85B-ESAT-6/DDA/TDB로 면역된 C57BI/6j 쥐로부터 분리된 혈액 림프구로부터 IFN-감마의 방출량을 도시한 그래프이다. 상기 림프구들은 제3차 면역 1주 후에 분리되었으며 5㎍/ml에서 Ag85B-ESAT-6로 자극되었다.
도 10는 500υg 명반의 형태로 Ag85B-ESAT-6 또는 Ag85B-ESAT-6/DDA/TDB 2㎍으로 면역된 C57BI/6j 쥐로부터 분리된 혈액 림프구로부터 IFN-감마 및 IL-5의 방출량을 도시한 그래프이다. 상기 혈액 림프구들은 제3차 면역 1주 후에 분리되었으며, 시험관 내에서(in vitro) Ag85B-ESAT-6 5㎍/ml으로 재자극되었다.
도 11A는 250㎍ DDA/50㎍ TDB, 100㎍ 폴리(poly) IC, 또는 250㎍ DDA/50㎍ TDB/100㎍ 폴리(poly) IC 중 어느 하나의 형태로 Ag85B-ESAT-6 2㎍으로 면역된 BALB/C 쥐로부터 분리된 비장세포들로부터 IFN-감마의 방출을 도시한 그래프이다. 상기 비장세포들은 제3차 면역 3주 후에 분리되었으며, 5㎍/ml의 Ag85B-ESAT-6로 시험관 내에서 재자극되었다.
도 11B는 250㎍ DDA/50㎍ TDB, 25㎍ MDP, 또는 250㎍ DDA/50㎍ TDB/25㎍ MDP 중 어느 하나의 형태로 Ag85B-ESAT-6 2㎍으로 면역된 BALB/C 쥐로부터 분리된 혈액 림프구들로부터 IFN-감마의 방출을 도시한 그래프이다. 상기 혈액 세포들은 제3차 면역 3주 후에 분리되었으며, 5㎍/ml의 Ag85B-ESAT-6로 시험관 내에서 재자극되었다.
도 12는 DDA 리포솜들(-◆-) 및 11몰%의 TDB(-●-), 11몰%의 락토실 세라미드(lactocyl ceramide)(-*-), 및 11몰%의 α-갈락토실 세라미드(α-galactocyl ceramide)(-X-)를 포함하는 DDA 리포솜들의 평균 입자 크기의 변화를 시간에 따라 보여주는 그래프이다. 상기 리포솜들은 pH 7.4로 조절된 10mM 트리스 완충액에 분산되었다. 14일 이후 당지질이 없는 DDA 리포솜들에게서 급격한 증가가 관찰되었으며, 이는 DDA를 안정화하는데 TDB보다 다른 당지질이 더욱 효과가 있음을 나타낸다.
예 1
TDB 농도가 증가하는 DDA 소포의 조제(preparation)
DDA 소포를 포함하는 TDB는 지질 박막법을 이용하여 만들어진다. 디메틸디옥타데실암모늄 브롬화물(DDA-B, 분자량-630.97) 및 D-(+)-트레할로스6, 6'-디베헤네이트(TDB, 분자량=987.5)(Avanti Polar Lipids, Alabaster, Al)는 10mg/ml의 농도로 클로로포름 메탄올(9:1)에 개별적으로 용해되었다. 각각의 개별적인 화합물의 정해진 양이 유리 시험관에서 혼합되었다. 용매는 N2의 완만한 흐름을 통해 증발되었으며, 지질막은 미량의 용매를 제거하기 위하여 낮은 압력에서 밤새 건조되었다. 상기 건조된 지질막은 표 1에서 명시된 농도로 트리스-완충액(10mM, pH=7.4)에서 수화되었으며, 20분간 70℃의 물중탕(water bath)에 놓고 시료를 매 5분마다 강하게 흔들어 주었다.
[표 1]
본 발명에 따라서 준비된 보강제 제형의 범위 리스트.

Mole% TDB		 농도
DDA(mM) TDB(mM) DDA(mg/ml) TDB(mg/ml)
0 10 0.0 6.25 0.0
0.5 10 0.05 6.25 0.05
2.5 10 0.25 6.25 0.25
6 10 0.6 6.25 0.625
12.5 10 1.3 6.25 1.25
16 10 1.9 6.25 1.875
20 10 2.5 6.25 2.5
예 2
TDB는 DDA 제형의 장기 안정성을 증가시킨다.
농도가 증가하는 TDB를 포함하는 DDA-B 소포의 제형은 4℃에서 저장되었으며, 서로 다른 제형의 외관을 1일 및 다시 2개월이 지난 후 평가하였다(표 2 및 도 2). 상기 평가로 TDB가 DDA 소포를 안정화시킴이 명백히 입증되었다. TDB가 없는 수용성 완충액상의 DDA의 현탁액은 하루가 지난 후에 침전되는 반면, 10몰% 이상의 TDB를 포함하는 DDA 현탁액에서는 침전물이 발생하지 않는다. 6% 미만의 TDB 농도의 현탁액에서는 가볍게 흔들어주는 것만으로 쉽게 재현탁될 수 있는 매우 적은 양의 침전물만이 형성된다.
[표 2]
서로 다른 보강제 제형의 2개월 안정성 기술.

몰% TDB		 4℃에 보관된 시간
1일 2개월
0 침전 침전, 재현탁불가
0.5 침전 침전, 재현탁불가
2.5 침전없음 침전, 상분리, 재현탁가능
6 침전없음 소량침전, 재현탁용이
11 침전없음 침전없음
16 침전없음 침전없음
20 침전없음 침전없음
장기 보관을 모사(simulate)하기 위하여 상기 현탁액은 3000g에서 30분간 원심분리되었다. 2.5몰% 이상의 TDB를 포함하는 상기 DDA-B 현탁액만이 거의 침전이 발생하지 않았으며, 흔들기(shaking)에 의하여 재현탁될 수 있었다.
예 3
TDB는 DDA 소포의 지질 이중층에 함입된다.
합성 디알킬디메틸암모늄으로부터 형성된 지질 이중층은 겔상태를 거쳐 특징적인 상전이 온도(Tm)에서 액체 결정 주(main) 상 전이를 겪는다. 상기 상전이는 소포 이중층의 디알킬 사슬들이 융해되는 것을 포함하며, 상기 사슬들의 조직은 높은 구조적 질서로 특징되는 상태로부터 더 무질서 정도가 높은 상태로 변화한다. 다량의 전이 엔탈피가 상기 사슬 융해 과정과 관련이 있다. 엔탈피의 변화는 상기 전이 온도(Tm)에서 열용량 곡선에서 정점을 이루는 것으로 검측된다. 상기 전이 온도 및 열용량 곡선의 형상은 극성 머리부분의 성질, 반대이온(counterion), 및 디알킬 사슬의 길이에 좌우된다. 일반적으로 Tm 값은 사슬 길이가 작아짐에 따라 감소하고 상기 알킬 사슬들의 비대칭성이 증가함에 따라 감소한다. 제2 디알칼 계면활성제의 열방성 상 거동(thermotropic phase behavior)에 대한 영향은 두 성분 간의 상호작용에 관한 유용한 정보를 제공할 수 있다.
열용량 곡선은 0.34 mL의 세포 용적(cell volume)을 갖는 전력보상형(power compensating type)의 VP-DSC 시차주사열량계(Calorimetry Sciences Corp, Provo)를 사용하여 얻어졌다. 0.34 ml 시료에 대해 3회의 연속적인 업스캔(upscan)이 30 C/h로 수행되었다. 상기 시료들은 시작 온도에서 50분간 평형을 이루었다.
도 3에서 도시된 DDA-B 및 TDB를 포함하는 두 성분의 시스템에 관한 DSC 열분석도는 TDB의 몰농도가 증가할 때의 지질막의 열역학에 대한 뚜렷한 영향을 보여준다. DDA 리포솜의 이중층 내의 TDB의 막삽입은 주전이 온도(Tm)을 낮춤으로써 입증된다. 순수 DDA-B 리포솜의 겔로부터 액상으로의 전이는 48℃에서 잘 정의된 열용량 정점을 특징으로 한다. TDB 농도의 증가는 겔에서 액상으로의 공존구간을 넓히는 결과를 가져오며, 상기 구간에서 겔 및 액상 양자 모두 동시에 존재할 수 있다.
20 몰%의 TDB를 포함하는 DDA-B 리포솜의 상전이 온도는 순수 DDA-B의 상전이 온도보다 약 5℃ 아래로 이동한다. DDA-B 리포솜막에 TDB의 삽입은 상전이 정점을 둘로 나누는 경향을 가진다. 이는 겔로부터 액상으로의 전이 과정 중에 지질막에서 소규모 성분적(compositional) 상분리에 대체로 기인하는 것으로 보인다. 표 3은 열역학적 파라미터들을 나타낸다.
TDB의 안정화 효과는 DDA-B 리포솜막에 정착된, TDB의 강하게 수화된 트레할로스 머리부분에서 비롯되며, 이는 소포 이중층의 탈수 및 융합을 방해한다.
[표 3]
표 3은 30℃/h의 주사속도(scan rate)에서 시차주사열량계(DSC)를 이용하여 얻어진 농도가 증가하는 TDB를 포함하는 DDA-B 리포솜들 대한 열역학적 파라미터들을 나타낸다. 상기 리포솜은 pH 7.4의 10mM 트리스 완충액에 분산되었으며, 총 지질 농도는 5mM이었다.
몰% Tm(℃) Area ΔT½(℃)
0 47.24 8932 0.33
1 46.92 10830 0.46
5 45.94 8009 1.79
10 43.18 11252 2.92
15 42.80 9793 1.13
20 43.55 14139 2.26
전이상태가 단백질 항원의 추가에 의해 영향을 받는지 여부를 평가하기 위하여, DDA 및 TDB로 구성된 리포솜을 농도가 증가하는 미코박테리아의 융합 단백질 Ag85B-ESAT-6에 첨가하고, 제형을 DSC에 의하여 분석하였다. 도 4에서 묘사된 바와 같이, 상전이 온도는 단백질의 함입에 의하여 변화하지 않는다.
예 4
TDB를 포함하는 DDA 리포솜의 입자 크기
예 4A
DDA -B의 안정성은 TDB 의 함입에 의하여 강화된다.
농도가 증가하는 TDB를 포함하고 박막법에 의하여 준비된 DDA-B의 입자들의 안정성은 몰번 제타사이저(Malvern ZetaSizer) 4(Malvern Instruments Ltd. UK)을 이용하여 동적 광산란법(dynamic light scattering)에 의하여 측정되었다. 함입된 0, 6, 11 및 20 몰%의 TDB를 갖는 DDA-B 입자들의 제형은 0 일차에 pH 7.4의 10mM 트리스 완충액에 분산되었다. 측정은 조제 후 0, 14, 28, 42, 56 및 105 일차에 수행되었다(도 5). 시간에 대한 입자 크기의 안정성의 비교로써, TDB의 함입이 DDA-B의 입자들을 안정화하고 응집되는 것을 방지한다는 사실을 알 수 있다. 이와는 대조적으로, DDA만을 갖는 제형의 경우 4℃에서 수일이 경과하여 응집되었으며 42일차 이후에는 응집으로 인하여 더 이상의 입자 크기를 측정하는 것이 불가능하였다. 이러한 자료는 도 2에서 보는 바와 같은 DDA 및 DDA/TDB 제형의 시각적 인상(visual impression)을 뒷받침한다.
예 4B
DDA-B 입자의 안정성은 수성 가열법 또는 트레할로스인 당부분(sugar part)을 첨가함으로써 TDB와 DDA-B 성분을 혼합하는 대신 TDB의 함입을 통해 효과적으로 강화된다.
DDA-B 입자들을 안정화하기 위하여 그들 내부로 TDB가 함입될 필요에 대해 몰번 제타사이저 4(Malvern Instruments Ltd. UK)를 이용하여 동적 광산란법에 의해 조사하였다. 박막법에 의해 준비된 11몰% TDB를 포함하는 DDA-B 입자들의 크기는 11몰%의 TDB와 혼합된 DDA-B 입자들(상기 홀텐-안데르센에 의한 수성 가열법)과 비교되었다. 상기 두 방법에 의한 제형들은 pH 7.4의 10mM 트리스 완충액에 분산되었다. 측정은 0일차, 14일차, 28일차에 조제 후 수행되었다(도 6). 시간대비 입자 크기의 안정성을 비교한 결과 두 성분을 혼합하는 것에 비하여 TDB의 함입으로 DDA-B 입자들을 안정화하고 응집을 방해하는 것을 알 수 있다.
TDB의 지질부분이 상기 DDA-B 입자들을 안정화하는데 필요한지 여부를 조사하기 위하여, 상기 박막법에 의해 준비된 11몰%의 TDB를 포함하는 DDA-B 입자들의 크기와 10% (w/v) 수크로스 및 트레할로스를 각각 포함하는 DDA-B 입자들과 비교하였다. 모든 제형들은 pH 7.4의 10mM 트리스 완충액에 분산되었으며, 측정은 0일차, 14일차, 28일차에 조제 후 수행되었다(도 7). 시간대비 입자 크기의 안정성을 비교한 결과 TDB의 지질부분이 상기 DDA-B 리포솜들의 안정화에 필수적임을 알 수 있다. 트레할로스 및 수크로스가 아닌 TDB는 DDA-TDB 리포솜들이 응집하는 것을 방해하였다(도 7B).
예 5
항원은 DDA 소포를 포함하는 TDB에 흡수된다.
최종 사용단계 백신의 초원심분리된 Ag85B-ESAT-6의 상청액 및 재현탁된 침전물의 SDS-PAGE 분석을 수행하여 양이온 리포솜에 항원이 흡수되는 것을 시각화하였다. 보강제는 15 몰%의 당지질 TDB의 함입에 의해 안정화된 DDA로 구성된 양이온 리포솜을 포함하였다. 최종 백신의 Ag85B-ESAT-6(Mw 45 KDa) 농도는 40, 80, 160, 및 200 ㎍/ml이었으며 상기 DDA 및TDB 농도는 각각 10 및 0.6 mM이었다. 백신은 30분간 초원심분리(100,000g)되었으며, SDS-PAGE 분석은 상청액 및 트리스 완충액의 최초 용량에 재현탁된 침전물에 대해 수행되었다(도 8). ml당 50 ㎍ Ag85B-ESAT-6를 포함하는 참조 시료는 1 레인에 로딩되었으며 분자량 마커(marker)는 2 레인에 로딩되었다. 단백질 띠들(bands)이 코마시 염색에 의하여 시각화되었다. 상청액이 로딩된 레인에서는 띠들이 관찰되지 않은 반면, 재현탁된 침전물로 로딩된 레인에서 대략 45kDa의 분자량에서 명확한 띠들이 관찰되었으며, 이는 모든 또는 거의 모든 항원이 양이온 리포솜에 흡수됨을 의미한다.
예 6
TDB와 결합된 DDA는 Ag85B-ESAT-6에 효율적인 면역반응을 촉진한다.
일반적으로 보강제들은 임의 계열의 면역반응의 유도에 대해 어느 정도의 선택성(selectivity)을 가지는 것으로 알려져 있다. IFN-감마 생산에 근거한 Th1 시토킨 방출의 중요성은 TB에 대한 저항성에 있어서 필수적인 것으로 알려져 있기 때문에(Flynn et al., 1993; Cooper et al., 1993), 20 몰%의 TDB를 포함하는 DDA-B 리포솜은 본 발명의 실시예 1에서 기술된 바와 같이 준비되었으며, 최종 백신으로 Ag85B-ESAT-6의 트리스 완충용액과 혼합되었다. 최종 백신의 농도는 250㎍의 DDA, 100㎍의 TDB 및 2㎍의 Ag85B-ESAT-6이었다. 비교를 위하여, 또 다른 백신이 포함된 바, 상기와 동일한 양의 DDA 및 TDB로 구성되었으나, DMSO에서 이전에 기술된 바와 같이(Holten-Adersen et al., 2004) 즉, 박막법에 의한 리포솜에 TDB를 함입하는 방식이 아닌 방법으로 준비되었다. 쥐들은 3차례에 걸쳐 면역화되었으며 3차 백신 접종 일주일 후에 혈액 세포들의 특이 면역반응들을 조사하였다(도 9). 이전에 기술된 방법과 비교하여 상기 박막법에 의하여 준비된 DDA/TDB로 면역화된 결과 더 높은 반응이 관찰되었으며, 이는 상기 박막법에 의한 DDA/TDB의 조제가 단순한 DDA/TDB의 혼합을 통한 조제에 비하여 보강제의 효과를 한층 더 강화하는 것을 보여준다.
이와 유사하게, 상기 박막법에 의하여 준비된 DDA/TDB의 면역반응은 알루미늄 기반 보강제인, 이미 임상적 사용이 승인된 알히드로겔(Alhydrogel)의 면역반응과 비교되었다. 도 10에서 도시된 바와 같이, DDA/TDB로 면역화하는 것은 높은 수준의 IFN-감마 및 낮은 수준의 IL-5에 이른 반면, 알히드로겔로 면역된 쥐들은 무시할 만한 IFN-감마의 분비 및 더 높은 수준의 IL-5의 상반된 패턴을 나타내었다.
체액성 반응을 일으키는 DDA/TDB의 능력을 1차 면역 5주 후에 Ag85B-ESAT-6 특이 IgG 항체 반응을 모니터링 함으로서 조사하였다. 최종 백신의 농도는 250㎍의 DDA, 100㎍의 TDB 및 2㎍의 Ag85B-ESAT-6이었다. 비교를 위해 한 군의 쥐들은 알히드로겔의 Ag85B-ESAT-6이 투여되었다. 표 5에서 보듯이, 특이 IgG의 역가(titer)가 DDA/TDB의 Ag85B-ESAT-6로 예방접종된 쥐들의 혈청에서 더 높이 나타났다. Ag85B-ESAT-6/알히드로겔로 면역된 후에 얻어진 역가와 비교하여, DDA/TDB를 포함하는 보강제 제형은 더 높은 수준의 특이 항체들을 유도하였다.
[표 5]
Ag85B-ESAT-6로 면역된 쥐들로부터 얻은 혈청에서의 항원-특이 항체의 중간 역가.
전체 IgGa
무처치 대조군(Naive control) <100
Ag85B-ESAT-6/알히드로겔 51600
Ag85B-ESAT-6/DDA/TDB 218000
a ELISA에 의하여 측정된 1차 면역 5주 후의 Ag85B-ESAT-6 특이 IgG 수준.
예 6A
제3 성분을 DDA / TDB 조합에 함입함으로써 얻어지는 면역반응의 강화
최근, 톨 유사 수용체(toll-like receptor;TLR)의 리간드들(ligands)이 신규 보강제 제형의 함유물을 위한 대상으로 각광받아왔다. 다른 면역촉진 성분 예를 들면, TLR-리간드를 DDA/TDB 제형에 함입하는 효과를 조사하기 위하여, 250㎍의 DDA/50㎍의 TDB 중의 2㎍의 Ag85B-ESAT-6 및 선별된 면역조절물질로 쥐들을 면역화하였다. 이들은 TLR3 및 TLR2/TLR4의 활성화를 수반하는 25㎍의 무라밀디펩티드(muramyldipeptide;MDP)을 위한 리간드로 알려지고, 미리 형성된 DDA-TDB 리포솜들에 첨가되는 100㎍의 폴리 IC(폴리이노신-폴리시티딜산(Polyinosinic-polycytidylic acid), 씨그마 알드리치(Sigma Aldrich))을 포함한다. MDP는 수화 전에 DDA-TDB 지질막에 포함되었다.
최종 면역조치 3주 후에, 비장세포 또는 혈액세포들(도면에 범례로 나타남)은 개별 쥐들로부터 정제되었으며, IFN-감마 방출의 수준이 5㎍/ml의 Ag85B-ESAT-6로 시험관내에서 재자극된 후 측정되었다. DDA/TDB 단독 또는 제3의 성분(폴리 IC 및 TDB) 단독만으로 야기된 면역반응과 비교하여, 세가지 성분들 모두를 포함하는 제형의 경우 DDA/TDB와 상기 면역조절물질 간의 상승효과을 보여주는 강화된 면역반응이 나타났다(도 11A 및 11B).
예 7
DDA-B 입자의 안정성은 TDB외의 다른 당지질을 함입함으로써 효과적으로 강화된다.
DDA-B 입자들이 TDB 외의 다른 당지질에 의하여 안정화될 수 있음을 예시하기 위하여, 11몰%의 베타-D-락토실 세라미드(β-LacCer), 11몰%의 베타-갈락토실 세라미드(β-GalCer) 및 44 w/w%의 G(M1) 강글리오시드 각각을 섞은 제형들을 준비하였다. 상기 제형들은 박막법에 의하여 준비되었으며, 0일차에 pH 7.4의 10mM 트리스 완충액에 분산되었다. 입자 크기는 몰번 제타-사이저 4를 이용하여 동적 광산란법에 의하여 측정되었다. 측정은 조제 후 0, 14, 28 일차에 수행되었다(도 12). 시간대비 입자 크기의 안정성의 비교로 당지질의 함입이 DDA를 안정화한다는 사실을 알 수 있다.
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Claims (21)

  1. 당지질을 리포솜들 내로 함입함으로써 수성의 제형 내에서 양이온 지질로 이루어진 리포솜들을 안정화하는 방법으로서, 상기 양이온 지질은 양친매성 4급 암모늄 화합물이고, 상기 당지질은 그의 소수성 모이어티는 이중막의 소수성 부분에 삽입되고 그의 극성 머리부분의 모이어티는 이중막의 친수성 표면을 향하여 배향되어 안정적으로 상기 이중막 내로 함입되는 것인 양이온 지질로 이루어진 리포솜들을 안정화하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 양친매성의 4급 암모늄 화합물은 1 또는 2개의 지방족 사슬들을 가지는 것을 특징으로 하는 양이온 지질로 이루어진 리포솜들을 안정화하는 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 지방족 사슬들은 각각 12 내지 20개의 C 원자들을 포함하는 것을 특징으로 하는 양이온 지질로 이루어진 리포솜들을 안정화하는 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 양친매성의 4급 암모늄 화합물은 디메틸디옥타데실암모늄 브롬화물, 디메틸디옥타데실암모늄 염화물, 디메틸디옥타데실암모늄 황산염, 디메틸디옥타데실암모늄 인산염, 디메틸디옥타데실암모늄 초산염, 디메틸디옥타데세닐암모늄 브롬화물, 디메틸디옥타데세닐암모늄 염화물, 디메틸디옥타데세닐암모늄 황산염, 디메틸디옥타데세닐암모늄 인산염, 디메틸디옥타데세닐암모늄 초산염, 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄 프로판, 디올레오일-3-디메틸암모늄 프로판 및 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N, N, N-트리메틸암모늄으로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 양이온 지질로 이루어진 리포솜들을 안정화하는 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 당지질은 1 또는 2개의 당 잔기에 결합된 1 내지 3개의 지방족 탄화수소 사슬들에 의하여 형성된 아실화된 글리코시드인 것을 특징으로 하는 양이온 지질로 이루어진 리포솜들을 안정화하는 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 당지질은 2개의 아실 사슬들을 갖는 이당류인 것을 특징으로 하는 양이온 지질로 이루어진 리포솜들을 안정화하는 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 아실 사슬들은 15 내지 90개의 C원자들을 포함하는 것을 특징으로 하는 양이온 지질로 이루어진 리포솜들을 안정화하는 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 당지질은 알파,알파'-트레할로스 6,6' 디베헤네이트(TDB) 또는 알파,알파'-트레할로스 6,6'-디미코레이트(TDM)인 것을 특징으로 하는 양이온 지질로 이루어진 리포솜들을 안정화하는 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 특유의 당지질의 몰 백분율은 0.5 내지 95 몰%인 것을 특징으로 하는 양이온 지질로 이루어진 리포솜들을 안정화하는 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 특유의 당지질의 몰 백분율은 2.5 내지 20 몰%인 것을 특징으로 하는 양이온 지질로 이루어진 리포솜들을 안정화하는 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 특유의 당지질의 몰 백분율은 5 내지 18 몰%인 것을 특징으로 하는 양이온 지질로 이루어진 리포솜들을 안정화하는 방법.
  12. 상기 제1항 내지 11항 중 어느 한 항의 방법에 의하여 안정화된 리포솜 산물.
  13. 제12항에 있어서,
    항원 화합물은 상기 리포솜들 내에 캡슐화되는 것을 특징으로 하는 리포솜 산물.
  14. 제12항에 있어서,
    약물 전달에 사용되는 것을 특징으로 하는 리포솜 산물.
  15. 제13항에 있어서,
    보강제로서 사용되는 것을 특징으로 하는 리포솜 산물.
  16. 제12항에 따른 리포솜 산물을 포함하는 백신 보강제.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 보강제는 모노포스포릴 지질 A(MPL), 모노포스포릴 지질 A(MPL)의 유도체, 폴리이노신 폴리시티딜산(poly-IC), 무라밀 디펩티드(MDP), 무라밀디펩티드(MDP)의 유사체, 지모산, 이중가닥 RNA (ds RNA), DC-Chol, CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 및 타목시펜으로 구성되는 군으로부터 선택되는 면역조절제를 추가로 포함하는 백신 보강제.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 백신 보강제는 무라밀 디펩티드 (MDP) 및/또는 폴리이노신 폴리시티딜산(poly-IC)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 보강제.
  19. 제16항에 있어서,
    클라미디아, 말라리아 또는 결핵 백신에 사용되는 것을 특징으로 하는 보강제.
  20. 제16항에 따른 보강제를 포함하는 클라미디아, 말라리아 또는 결핵에 대해 사용되는 백신.
  21. 제12항에 따른 리포솜 산물을 포함하는 전달 시스템.
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