CN1980638A - 用糖脂稳定基于脂质的佐剂制剂的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及物理学稳定的脂质体制剂。特别地,本发明涉及通过在脂质体中掺入糖脂而立体稳定阳离子脂质体。稳定的脂质体能作为抗原成分的佐剂或作为药物递送系统。特别地,当终产物是稳定的时候,本发明涉及用于免疫接种的在水性介质中具有佐剂的疫苗。
Description
技术领域
本发明涉及物理学稳定的脂质体制剂。本发明尤其涉及通过独特的膜方法立体稳定阳离子的脂质体,其中脂质体中掺入糖脂。稳定的脂质体能作为抗原成分的佐剂或作为药物递送系统。特别地,当终产物是稳定的时候,本发明涉及用于免疫接种在水性介质中具有佐剂的疫苗。
背景技术
在人类中使用的用于对感染疾病产生免疫性的最初的疫苗由活的、减弱的病原组成。减弱的形式或者是与有机体密切相关天然发生的或者是通过在培养中系列传代获得的。一个例子是结核,其通过牛分枝杆菌(BCG疫苗)减弱的但活性的菌株对抗。然而这种方法的有效性并不是在所有的人群中提供对结核的满意的抗性。所以需要新的和有效的方法,以对结核和其它感染疾病产生免疫性。一种特别有希望的进展是分离和使用重组形式的免疫显性(immunodominant)抗原作为疫苗,例如早期分泌型抗原靶(early secretory antigenic target)(ESAT-6)和抗原85(Ag85)。这些疫苗被很好地限定并且副作用是最小化的。然而,许多高纯度的物质,例如重组的纯化蛋白质,不是非常免疫原性的并且不产生有效的免疫应答以抵御真正的感染疾病。这种事实是已知的并且做了很多努力以增强免疫性质,通过所谈论的物质和所谓的佐剂结合。根据病原,预防可能需要或者体液的或者细胞介导的免疫应答占优势。能通过佐剂的选择确定免疫应答(体液的或细胞介导的)的特定种类的开发。
对于抵抗例如M.结核的细胞内病原的预防性免疫需要细胞介导的免疫应答,用于针对TB的亚单位疫苗的合适佐剂应该增强Th1应答(Lindblad等,1997)。一般相信抗体在对TB的免疫中不起重要作用,而细胞介导的IFN-γ(干扰素γ)的释放是预防中最重要的细胞因子(Collins &Kaufmann,2001)。
多种诱导细胞介导的免疫应答的佐剂被建议,但是一般没有任何佐剂对所有的应答都适合。
一种对促进细胞介导的免疫应答特别有效的佐剂类型是季铵化合物,例如二甲基双十八烷基铵(dimethyldioctadecylammonium)(DDA)(Hilgers和Snippe,1992)。DDA是合成的两亲物,其包括亲水的带正电的二甲基铵头部基团和两个长的疏水烷基链。在水环境中,DDA自我装配形成泡状双层,与从天然磷脂制备的脂质体相似。已经描述了DDA与其它免疫调节剂的结合。在人类给药包括DDA的Arquad 2HT是有希望的并且不引起明显的副作用(Stanfield等1973)。基于来自M.结核的培养滤液的蛋白质和DDA的实验性疫苗在小鼠中对TB产生免疫应答(Andersen,1994)。用M.结核蛋白质ESAT-6和Ag85B的融合蛋白以及DDA/MPL作为佐剂对小鼠接种疫苗提供的预防作用与通过BCG接种疫苗获得的相似(Olsen等2001)。这些研究显示,与例如铝相反,基于DDA的佐剂在小鼠中能诱导针对TB的免疫应答。而且,DDA已经被用于佐剂用于针对伪狂犬病病毒的DNA疫苗,以增强T细胞应答和抗病毒免疫(van Rooij等2002)。
Woodard等研究(1980)加入TDM(α,α’-海藻糖6,6′-二霉菌酸酯)油乳剂到DDA溶液作为佐剂用于基于加热杀死的细菌的流产杆菌(Brucellaabortus)疫苗。单独DDA或DDA和TDM的混合物都不能诱导预防。在另一个基于溶解性蛋白质提取物的流产杆菌的亚单元疫苗的研究中,DDA和TDM也联合作为佐剂(Dzata等1991),发现混合物增强免疫应答(抗体水平、皮肤测试应答、和IL-2水平),与观察到的单独使用DDA相比。Holten-Andersen等(2004)研究DDA脂质体和TDB(α,α′-海藻糖6,6′-二山萮酸酯(dibehenate))悬浮液结合,并且ESAT-6抗原与这样的佐剂混合物一起给药,发现诱导对结核强的预防性免疫应答,其比在DDA脂质体中给药ESAT-6显著提高。
不幸地,如上所述的两亲季铵化合物的悬浮液,例如单独DDA或DDA和MPL的混合物、TDM或TDB是物理学不稳定的,并且在4℃长期的储存中没有聚集和沉淀的发生是不可能的。因为沉淀会妨碍制剂的临床使用,DDA制剂稳定性的缺乏目前是在人类进行任何应用的主要障碍。
在英国专利No.2147263-A中,Takahashi和Tsujii描述来自季铵化合物的小囊泡的稳定,通过将两种季铵化合物混合在一起或向季铵化合物加入多种去污剂。
在美国专利No.5,026,546,Hilgers和Weststrate描述了DDA佐剂悬浮液的稳定,通过用丙烯酸和聚al-lyl-蔗糖的交联聚合物。
Li等(2000)描述了用于细胞转染的阳离子的脂质-鱼精蛋白-DNA复合物的冻干法。评价了添加例如单糖和双糖的常用的冷冻保护剂的作用,发现双糖比单糖更好地保护粒度。并且具有10%蔗糖的非冻干的脂质-鱼精蛋白-DNA复合物在4℃储存8周后维持稳定的粒度,但是转染效率冻干的高于非冻干的样品。
美国专利No.5922350描述了长期储存脂质体的方法,例如基于磷脂通过在脂质体脱水之前加入例如海藻糖和蔗糖等糖类。另外,专利描述了预形成的和储存的脂质体的延迟负载通过浓度梯度和脱水-再水合的过程的结合是可行的。
用聚乙二醇衍生物稳定的用于药物递送的磷脂脂质体(致融脂质体)描述于WO 96/10392中。描述于WO 02/03959中的另外的药物递送制剂公布了一种制剂,其包括阳离子的脂质体和中性脂质体,其中每个脂质体基团负载相同或不同的治疗剂。
用于做脂质体制备的优选的方法由Bangham(Bangham等1965)描述。这种制备包括在有机溶剂中溶解磷脂,其然后被蒸发以干燥,在试管内部留下薄的脂质膜。干的脂质膜然后在合适量的水相中水化并且混合物被加热到脂质相转变温度以上以允许“膨胀”。得到的由多层的小囊泡(MLV)组成的脂质体通过振荡试管分散。组成包括泡状的双层膜的脂质被组织,以至疏水的碳氢化合物“尾部”定向双层的中心,而亲水的“头部”分别定向水相的内部和外部。这种制备提供通过例如超声处理(Papahadjopoulos等1967)或由Cullis等描述在美国专利No.5,008,050的挤出的方法生产单层小囊泡(UV)的基础。
用于制备小囊泡的其它技术是由Szoka和Papahadjopoulos(Szoka和Papahadjopoulos,1978;美国专利No.4,235,871)介绍的反相蒸发法。这样的方法包括在有机溶剂中形成脂质的油包水乳剂以及包括被胶囊化物质的缓冲水溶液。在减压的条件下去除有机溶剂产生粘稠的胶。当这样的胶崩溃,形成脂质小囊泡的水性悬浮物。
由Carmona-Ribeiro和Chaimovich(Carmona-Ribeiro and Chaimovich,1983)描述的另一种方法包括向缓冲水溶液注入期望脂质的例如氯仿、甲醇、乙醇的有机溶液,其中当溶剂蒸发时脂质自发形成脂质体。
脂质体也能通过液体加热方法制备,如由Holten-Andersen等(2004)为DDA描述的,通过其在水缓冲液中的形成脂质体化合物的悬浮物被加热到例如80℃,通过间歇振荡20分钟然后冷却到室温。
以上提到的由Woodard等(1980)、Dzata等(1991)和Holten-Andersen等(2004)使用和描述的“水性加热方法”不稳定DDA和TDB的溶液。
在一个特别优选的方法中,蛋白质抗原被捕获在预形成的小囊泡中,通过脱水-再水化的方法(Kirby和Gregoriadis,1984),在其中在水相中存在的寡核苷酸、肽或蛋白质通过冷冻干燥捕获,然后冻干的脂质体被再水化。
替代地,抗原通过使用由Pick(Pick,1981)和由Bally等在美国专利No.4,975,282描述的冷冻和融解技术掺入。在此技术中,小囊泡与蛋白质抗原混合,并且反复迅速在液氮中冷冻和加热到相关脂质主相转变温度以上。小囊泡可通过进一步的处理以除去任何未捕获的抗原,例如通过洗和离心。
已经显示例如TDB和从分枝杆菌细胞壁分离的索状因子TDM抑制磷脂小囊泡的融合(Spargo等1991和Crowe等1994)。亲水的海藻糖部分可能固化在小囊泡的表面,因此,增加水合力,其是对于融合主要的障碍。替代地,固化的海藻糖部分可作为融合的立体障碍(Spargo等1991)。
来自磷脂的脂质体(无TDB)现在实验上作为例如流感疫苗的佐剂(Ben-Yehuda等2003)。另一个例子是对抗流感的IMUXENTM脂质体疫苗(Lipoxen Technologies Ltd.;Gregoriadis等1999)。
因为季铵化合物特别是DDA是用于有效疫苗佐剂的非常有期望的候选,但有主要的不利,在水溶液中物理学不稳定,在储存的过程中形成聚集和沉淀,所以需要稳定形成的小囊泡。本发明描述了稳定包括例如DDA的阳离子脂质的佐剂制剂的新的方法。另外,通过这样方法,制剂的佐剂作用被增强。
发明概述
本发明公布用于稳定阳离子脂质体悬浮物的组合物和方法,通过掺入糖脂例如酰化糖苷如α,α′-海藻糖6,6′-二山萮酸酯(TDB)或α,α′-海藻糖6,6′-二霉菌酸酯(TDM)进入脂质体双层,其从两亲季铵化合物例如DDA、DODA、DOTAP、DODAP或DOTMA制备。糖脂的高度水化的糖类头部基团增加整个脂质体双层的水化,其防止由于阳离子小囊泡减低的电荷排斥引起的季铵头部基团的脱水和聚集。DDA的这种稳定作用不单单通过加入糖类如海藻糖或蔗糖或季铵化合物和糖脂的简单的混合而获得。本发明也公布这些稳定化的脂质体作为疫苗佐剂的用途。
发明详述
本发明公开了一种在水制剂中用糖脂稳定阳离子脂质体的新方法。例如由两亲季铵化合物制得的阳离子脂质体是用在脂质体膜里掺入糖脂来稳定的。
本发明优选的实施方案是当季铵化合物是二甲基双十八烷基铵(DDA)或者二甲基双十八烯基铵(DODA)的溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐或者乙酸盐化合物。
其它优选的季铵化合物是1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)、1,2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基铵丙烷、1,2-二棕榈酰基-3-三甲基铵丙烷、1,2-二硬脂酰基-3-三甲基铵丙烷、和二油酰基-3-二甲基铵丙烷(DODAP)和N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵(DOTMA)。
用于稳定脂质体的糖脂优选α,α′-海藻糖6,6′二山萮酸酯(TDB)或者α,α′-海藻糖6,6′-二霉菌酸酯(TDM)。制剂中糖脂的摩尔百分数可从0.5到95摩尔%,但优选2.5到大约20摩尔%,更优选从大约5到大约18摩尔%。
本发明还公开了这些被稳定的脂质体作为佐剂的应用,例如用于疫苗组合物。尤其是当终产物是稳定的时候,本发明涉及在水性介质中具有佐剂的用于免疫接种的疫苗。
本发明还公开了依照上述方法稳定的用作疫苗佐剂的脂质体产物,其中的疫苗可以对抗任何疾病,例如结核、疟疾、衣原体等。
″脂质体″是封闭的小囊泡结构,由一个或多个脂质双层体围绕着水性核心而构成。每个脂质双层体由两个脂质单层体组成,其中每个单层体有一个疏水的“尾部”区域和一个亲水的“头部”区域。在双层体中,脂质单层体的疏水“尾部”指向双层体内部,亲水“头部”朝向双层体外部。脂质体可具有多种物理化学性质,例如大小、脂质组成、表面电荷、流动性、双分子膜的数量。根据脂质双层体的数量,脂质体可归类为单层小囊泡(UV)或者多层小囊泡(MLV),单层小囊泡是由单一脂质双层体构成,多层小囊泡是由两个或多个同心的双层体构成且双层体彼此被水层间隔分离。水溶性化合物被捕获入脂质体的水相/核,相反的,亲脂性化合物被捕获入脂质双层膜的核心。
“微粒”是在界限明确的浓度即临界微粒浓度(CMC)下产生的两亲分子的胶态集合体。微粒中聚集分子的典型数目(聚集数)是50到100。微粒在含有表面活性剂分子作用下可能是球形的,碳氢化合物的尾指向中心,极性的头部指向外部水环境。其它可能的结构包括反相微粒和柱型微粒。
术语″阳离子脂质″是指包括任何两亲脂质,包括合成的脂质和脂质类似物,具有疏水和极性头部基团部分,在生理PH具有净正电荷,并且本身在水中能自发地形成双分子层小囊泡或者微粒。
本发明中用的阳离子脂质特别优选的是通式NR1R2R3R4-X的季铵化合物,其中R1和R2分别独立地是具有1至3个碳原子的短链烷基基团,R3独立地是氢或者甲基或者具有12至20个碳原子的烷基基团,优选14至18个碳原子,R4独立地是具有12至20个碳原子的碳氢化合物基团,优选具有14至18个碳原子。X是药物上允许的阴离子,本身无毒性。这样阴离子的例子是卤素阴离子,氯化物、溴化物和碘化物。也可使用无机阴离子例如硫酸盐和磷酸盐,或者由简单有机酸如乙酸衍生而来的有机阴离子。R1和R2基团可以是甲基、乙基、丙基和异丙基,而R3可以是氢、甲基或者十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基和二十烷基(eicocyl)基团,R4可以是十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基和二十烷基基团。然而其它C12-C20碳氢化合物基团也是可能的,因为尽管R3和R4基团优选无分支侧链的饱和基团,但是它们在较少程度上可能带有支链,例如甲基和乙基侧链。R3和R4也可能有较少量的不饱和,例如每个含有1至3个双键,但是优选饱和烷基基团。阳离子脂质最优选二甲基双十八烷基溴化铵或氯化铵(DDA-B或DDA-C),或者其硫酸盐、磷酸盐或者乙酸盐(DDA-X),或者二甲基双十八烯基溴化铵或氯化铵(DODA-B或DODA-C),或者其硫酸盐、磷酸盐或者乙酸盐(DODA-X)。应用于本发明的其它优选的阳离子脂质包括但不局限于1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)、1,2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基铵丙烷、1,2-二棕榈酰基-3-三甲基铵丙烷、1,2-二硬脂酰基-3-三甲基铵丙烷、二油酰基-3-二甲基铵丙烷(DODAP)和N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵(DOTMA)。
通过结合糖脂到脂质体膜来稳定阳离子脂质体。通过结合是指将分子的疏水片段和亲水片段嵌入到膜、微粒、脂质体或双层体的相应的疏水和亲水的片段或部分的步骤方法。结合糖脂到脂质体的步骤方法可以是“薄膜方法”、“反相蒸发方法”和“有机溶液注射方法”,以及将来和目前未知的具有结合糖脂到脂质体膜同样效果的方法。所有目前已知的方法在发明的背景技术中介绍。本发明最优选的方法是薄膜方法。
糖脂是指含有一个或多个单糖残基的任何化合物,其中的单糖残基通过一个糖苷键与例如长链脂肪酸、酰基甘油、鞘氨基醇、神经酰胺、异戊烯基磷酸酯等疏水部分结合。本发明的糖脂可来源于合成、植物或源于例如分枝杆菌的微生物。
本发明用的一类糖脂是酰化(或烷基化)的糖苷,它们带有一个或两个糖残基与一个、两个甚至三个脂肪酸酯化。这些脂肪酸既可以是直链的包括饱和脂肪酸例如肉豆蔻酸C14:0、十五烷酸C:15、棕榈酸C16:0、十七烷酸C17:0、硬脂酸(steric acid)C18:0、十九烷酸C:19、二十烷酸C:20、二十一烷酸C21:0、二十二烷酸C:22,以及不饱和脂肪酸例如油酸C18:1n-9、亚油酸18:2n-6;又可以是复杂的支链脂肪酸例如霉菌酸、甲氧基霉菌酸、酮基霉菌酸、环氧霉菌酸和白喉菌酸。糖残基既可以是简单单糖例如葡萄糖和果糖,也可以是含有共价键接的两个单糖的二糖,例如含有葡萄糖和果糖的蔗糖,和海藻糖,其中的两个葡萄糖单元通过糖苷键连接。本发明用的一类糖脂是由分枝杆菌分离出的细胞壁糖脂,其带有的一个二糖,其或者与一个、两个或三个正十六烷酸C16:0、油酸C18:1n-9、亚油酸18:2n-6酯化,或者与链长是60至90个碳原子的复杂的羟基支链脂肪酸如霉菌酸残基酯化。本发明用的其它细菌糖脂具有更短的脂肪酸链,例如由Corynobacterium、诺卡氏菌分离出的白喉菌酸(22-36个碳原子)或者诺卡氏分枝霉菌酸(nocardomycolic acid)(44-60个碳原子)。优选的分枝杆菌糖脂是α,α′-海藻糖6,6′-二霉菌酸酯(TDM),常称作索状因子,它是分枝杆菌细胞壁最重要的免疫调节组分之一。在特别优选的实施方案中,糖脂包括与二个二十二烷脂肪酸(山萮酸)酯化的二糖α,α′-海藻糖,例如α,α′-海藻糖6,6′-二山萮酸酯(TDB),其是纯合成的TDM类似物。
本发明用的其它类糖脂包括但不局限于:
基于甘油的糖脂:这些脂包括单糖或低聚糖部分,其与甘油的羟基基团糖苷键接,其中甘油可与一个或二个脂肪酸酰化(或者烷基化)。另外,这些糖脂可以是不带电荷的,因此通常称为中性甘油糖脂,或者可以含有硫酸或磷酸基团。
基于神经酰胺的糖脂:根据糖部分的结构,鞘糖脂分为中性鞘糖脂和酸性鞘糖脂,中性鞘糖脂含有未取代的糖基基团,酸性鞘糖脂含有带有酸性的羧基、硫酸或磷酸基团的糖基基团。
脂多糖(LPS):这些复杂的化合物是内毒素的抗原,发现于革兰氏阴性细菌(S-脂多糖)的细胞壁中。脂部分(脂A)与多糖通过糖苷键形成络合物。脂A包括b-1,6-氨基葡萄糖-氨基葡萄糖主链,其在氨基葡萄糖I的1位和氨基葡萄糖II的4位具有2个磷脂基团。氨基葡萄糖II的3位与长链多糖形成易于酸化的糖苷键。如其它羟基化的脂肪酸例如羟基肉豆蔻酸酯(两个酯键和两个酰胺键)和正常脂肪酸(月桂酸酯),其它基团被羟基化的脂肪酸取代(在大肠杆菌中)。本发明特别优选的脂多糖是脂A的单磷酸衍生物(MPL),其是无毒的并且具有出色的佐剂性能。
甾醇的糖苷:此家族包括一种糖类单元与一种甾醇分子的羟基基团键接。确定甾醇部分包括多种甾醇:胆固醇、菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇、菜子甾醇和二氢谷甾醇。糖部分包括葡萄糖、木糖和甚至阿拉伯糖。
脂肪酸或脂肪醇的糖苷:许多的简单糖脂发现于细菌、酵母菌和低等生物体(海绵)内。这些化合物由与脂肪醇或羟基脂肪酸的羟基基团键接的或者与脂肪酸的羧基基团键接(酯键)的糖基部分(一个或几个单元)而组成的。这些化合物常常具有值得注意的物理或生物学性质。他们中的一些(烷基糖苷)因为具有清洁性能而工业化生产。
烷基链是指脂肪族碳氢化合物链,它可以是直链的或者支链的。该链可以是饱和的,或者可以是不饱和的例如含有一个或多个双键。
酰基链是指烷基-OC(O)基团,其中的烷基基团如上述定义。
脂肪酸链是指支链的或非支链、饱和的或不饱和的带有烷基或酰基基团的烃链。
术语药学上可接受的是指不会干扰有效成分的效力或者生物活性的物质,并且对宿主或患者没有毒性。
相转变温度或Tm是一种温度,在此温度脂质体双层体从低温度的胶相,其特征在于有序的脂肪酸链(有序的固体相),到高温流体相,在其中脂肪酸链有高度构象无序(液体无序相),如通过差示扫描量热法(DSC)测量的。
通过药物制剂的稳定性,意思是制剂在产品的贮存期限过程中在限定的范围内制剂维持的能力。脂质体分散物显示化学和物理的稳定特点。
化学稳定性涉及化学降解,而物理稳定性涉及系统的胶体稳定性。
脂质体分散物的物理稳定性通过小囊泡间的相互作用而确定,其依赖吸引力和排斥力之间的平衡。胶体系统通过例如静电排斥和立体排斥的排斥力而稳定,由于在大量水中和相互作用区域水中的化学潜能的区别。
佐剂限定为非特异性地增强抗原免疫反应的物质。根据佐剂的天然特定,它能促进细胞介导的免疫应答、体液免疫应答或二者的混合。由于免疫应答的增强是非特异的,在本领域很能理解,同样的佐剂能与不同的抗原一起使用以促进对抗不同靶的应答,例如与来自M.结核的抗原一起促进对抗M.结核的应答,或与来自肿瘤的抗原一起促进对抗特异种类肿瘤的免疫性。
季铵化合物,例如二甲基双十八烷基溴化铵或、氯化铵或其其它有机的和无机的盐(DDA-B、DDA-C或DDA-X)、二甲基双十八烯基溴化铵、氯化铵或其其它有机的和无机的盐(DODA-C、DODA-B或DODA-X),或1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)、1,2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基铵丙烷、1,2-二棕榈酰基-3-三甲基铵丙烷、1,2-二硬脂酰基-3-三甲基铵丙烷、二油酰基-3-二甲基铵丙烷(DODAP)和N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵(DOTMA),当分散在水介质中,有能力形成脂质聚集体例如脂质双层体、各种类型的单层或多层的脂质体、微粒、和类似物。这些结构的脂质膜为包括其它例如糖脂的两亲化合物提供出色的基质,其显示稳定本发明的小囊泡分散物。
而且,例如TDB和TDM的糖脂它们自己具有免疫刺激性质,并且能与季铵化合物以协同的方式起作用,以增强免疫应答。另外,例如寡核苷酸、肽和蛋白质抗原的大分子能捕获在单层和多层脂质体的水相中。
例如TDB的疏水酰基链被期望嵌在从本发明的季铵化合物制备的脂质双层体的疏水区域之内,因此固定在疏水区域和大量水之间界面的亲水性海藻糖头部基团。高度水化的糖类头部基团增加整个界面的水化,引起水化力潜在地增加,其防止相对的双层体的近接触,这是小囊泡聚集和融合需要的。此外,作为界面水化的后果,双层体的流动性会增加,其也易于稳定小囊泡。
本发明的制剂中使用的分散物介质可以是任何合适的水溶剂。然而,脂质体制剂的稳定性显示对例如磷酸和硫酸离子的阴离子敏感。因此,优选地,本发明的佐剂组合物是在没有或低浓度的这样的离子中形成的。
当作为疫苗佐剂使用时,抗原组分被加入到佐剂溶液,可能与例如MPL(单磷酸脂A)或其衍生物、聚肌胞(poly-IC)、胞壁酰二肽(MDP)或其类似物、酵母多糖、双链RNA(dsRNA)、DC-Chol、CpG寡聚脱氧核苷酸和他莫昔芬等其它免疫调节因子一起。抗原组分或物质是分子,其与预先形成的抗体和/或T和B细胞上的特异受体反应。在疫苗接种方面,分子能刺激特异的T或B细胞的发育,引起免疫细胞的记忆群体的形成,如果免疫细胞第二次遇到所述抗原时其能促进更快的“记忆”应答。因为记忆群体很少克隆,在实践中这意思是,抗原是任何分子或分子的集合,当被来自之前暴露给它的个体的免疫细胞再遇上时,其能刺激免疫应答的增加。
抗原组分或物质能是多肽或多肽的一部分,其引起在动物中或人类中和/或通过在此描述的任何的生物分析确定的生物样品中的免疫应答。多肽的免疫原部分可以是T细胞表位或B细胞表位。为了确认在免疫应答中被识别的相关的T细胞表位,可能使用″强力″方法:因为T细胞表位是线性的,如果系统构建,多肽的缺失突变会揭示多肽的哪个区域对免疫识别是必需的,例如通过使这些缺失突变经受例如在此描述的IFN-γ分析。另一种方法使用由多肽衍生的寡聚肽重叠(优选地合成物具有例如20个氨基酸残基的长度)。这些肽能在生物分析中测试(例如在此描述的IFN-γ分析),并且这些中的一些会给出阳性应答(并因此免疫原的),如在肽中T细胞表位的存在证实的。线性B细胞表位能通过分析B细胞对覆盖例如描述于Harboe等1998中的感兴趣的多肽的重叠肽的识别而确定。
虽然T细胞表位的最短长度已经显示至少6个氨基酸,通常这样的表位包括更长伸展的氨基酸。因此,优选地,本发明的多肽片段具有至少7个氨基酸残基的长度,例如至少8个,至少9个,至少10个,至少12个,至少14个,至少16个,至少18个,至少20个,至少22个,至少24个,以及至少30个氨基酸残基。因此,本发明方法的重要实施方案中,优选地,多肽片段具有最多50个氨基酸残基的长度,例如最多40、35、30、25和20个氨基酸残基。期望具有10和20个氨基酸残基之间的长度的肽会证明是作为诊断工具最有效的,并因此特别优选用于本发明方法的多肽片段的长度是18,例如15、14、13、12并且甚至11个氨基酸。
疫苗被限定为死的、减弱的、或以其它方式修饰的微生物(细菌、病毒或立克次氏体)或其部分的悬浮物,用于接种以产生对疾病的免疫性。疫苗能被或者预防性的给药以预防疾病或者作为治疗性疫苗给药以对抗已经存在的疾病例如癌症或潜伏性的感染疾病但也与过敏和自身免疫疾病联系。疫苗可在合适的佐剂中乳化用于促进免疫应答。
疫苗是以与剂量制剂相容的形式给药的,并且在这样的剂量会是治疗有效的和免疫原的。给药的量根据治疗的受试者,包括例如到达免疫应答的个体免疫系统的能力和期望的预防程度。合适的剂量范围是每个接种疫苗几百个数量级微克的活性成分,具有优选的范围从大约0.1μg到1000μg,例如在从大约1μg到300μg的范围内,并且特别在从10μg到50μg的范围内。初次给药和加强给药的合适的用药法也是不同的,但典型地通过初次给药,然后相继接种或其它给药。
应用的形式可能很大不同。任何用于疫苗给药的传统方法是可用的。相信这些包括在固体生理上可接受的基质上的口腔的或粘膜的应用或在生理上可接受的悬浮物中,肠胃外的通过注射或类似的方法应用。疫苗的剂量根据给药的途径并且根据接种疫苗的人的年龄,少量程度上根据接种疫苗的人的尺寸而不同。
疫苗传统上通过胃肠外给药,通过注射,例如或者是皮下的或者是肌肉内的。适合其它给药模式的另外的制剂包括栓剂和在一些情况下口腔或粘膜制剂。对于栓剂,传统的粘合剂和载体可以包括例如聚烷醇(polyalkalene)或甘油三酯;这样的栓剂可以从混合物形成,混合物包括活性成分在范围0.5%到10%,优选地1-2%。口服制剂包括例如通常用作赋形剂的例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁和类似物。这些组合物采用溶液、悬浮物、片剂、药丸、胶囊、持续释放制剂或粉末的形式,并且有利地包括10-95%的活性成分,优选地25-70%。
选择的疫苗可以是例如:
蛋白质疫苗:包括多肽(或至少其一个免疫原部分)或融合多肽的疫苗组合物。
活的重组疫苗:在非病原微生物或病毒中在疫苗中相关抗原的表达。这样的微生物的很已知例子是牛分枝杆菌BCG、沙门氏菌和假单胞菌,以及病毒的例子是牛痘苗病毒和腺病毒。
对于所有这些疫苗的构建体,合适佐剂的加入已经引起增强的疫苗效力(Brandt等2000;van Rooij等2001;Wang等2002;Eriksson,2003)。
仍然,本发明的另一个实施方案是一种包括佐剂的递送系统。脂质体已经被在制药和医疗上用作递送系统,例如免疫佐剂、感染性疾病和炎症的治疗、癌症治疗和基因治疗(Gregoriadis,1995)。可能对脂质体的佐剂作用有影响的因子是脂质体大小、脂质组成和表面电荷。另外,抗原的位置也可能是重要的(例如是否它是被吸收或共价与脂质体表面结合或封闭于脂质体的水分隔中)。抗原对例如树突细胞的抗原递呈细胞的负载已经显示对产生具有抗肿瘤免疫的活性T细胞是有效的方法。
本发明的脂质体可通过本技术领域的多种已知的方法制备。
优选的阳离子脂质是季铵化合物,其具有二甲基铵的头部基团和两个长的疏水烷基链,其包括12到20个碳原子,例如二甲基双十八烷基溴化铵(DDA-B)、二甲基双十八烯基氯化铵(DODA-C)。其它优选类型的阳离子脂质包括但不限于1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)、1,2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基铵丙烷、1,2-二棕榈酰基-3-三甲基铵丙烷、1,2-二硬脂酰基-3-三甲基铵丙烷、和二油酰基-3-二甲基铵丙烷(DODAP)和甚至N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵(DOTMA)。
糖脂优选的是酰化糖苷,通过1个到3个脂肪酸酰化1个到2个糖类残基形成。脂肪酸或者是饱和的或非饱和的直链或络合支链脂肪酸。糖类能是单糖或双糖,其包括2个共价连接的单糖。在特别优选的实施方案中,糖脂包括海藻糖与具有1个或2个糖苷键连接的脂肪酸链,其包括14到90个碳原子,例如α,α′-海藻糖6,6′二山萮酸酯(TDB)或者α,α′-海藻糖6,6′-二霉菌酸酯(TDM)。
在一个实施方案中,本发明的脂质体包括形成阳离子脂质的双层体,优选地具有季铵头部基团和两条长的疏水烷基链。在特别优选的实施方案中,头部基团是二甲基铵和并且疏水链是十六烷基、十八烷基、十八烯基链。本发明的阳离子脂质能单独使用或以任何组合使用。而且,阳离子脂质或其混合物能与任何中性的磷脂组合,例如磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰甘油(PG)或任何其它形成双层体的天然或合成的静电中性的脂质。
通过使用膜方法在脂质体膜掺入糖脂稳定阳离子脂质体。相反,通过混合预形成的DDA和TDB溶液不会获得稳定作用,DDA和TDB是前面描述的制剂(Woodard等1980,Dzata等1991,Holten-Andersen等2004)。糖脂必须稳定地掺入脂质双层体,疏水部分嵌在双层体膜的疏水区域,并且它的极性头部定向膜的亲水表面。加入阳离子脂质体的糖脂的摩尔比例根据糖脂的性质以及在制剂中使用的潜在赋形剂。特别的糖脂的摩尔百分数能从0.5到大约95摩尔%,优选地从大约2.5到大约20摩尔%并且更优选地从大约5到大约18摩尔%。
在本发明特别优选的实施方案中,季铵化合物/阳离子脂质是DDA-B并且糖脂是TDB。脂质体制备通过溶解称量量的DDA-B和TDB于合适的有机溶剂中,以摩尔百分数5摩尔%或10摩尔%或15摩尔%,以总脂质浓度大约1mM、2mM、5mM或甚至10mM。溶剂被蒸发,在试管的内部留下薄的脂质膜。干的脂质膜然后在没有或低盐浓度的药学上可接受的缓冲液中水化。稳定的脂质体结构的制剂显示对离子的存在敏感,特别是例如磷酸和硫酸等阴离子。优选的有机缓冲液例如2-氨基-2-(羟基甲基)-1,3丙二醇(Trometamolum或简单的Tris)或2-Bis(2-羟基甲基)氨基-2-(羟基甲基)-1,3丙二醇(Bis-Tris),具有pH 6.0到8.0,并且更优选地具有pH6.5到7.5,通过在MiIIiQ水中溶解Tris或Bis-Tris碱并且然后通过加入HCl调节pH制备。缓冲液不限于Tris或Bis-Tris,而是可以是任何药学上可接受的缓冲液或甚至是没有添加缓冲物质的纯水。混合物被加热到脂质混合物相转变温度以上的温度20分钟,并且每5分钟剧烈振荡。所得的佐剂制剂包括MLV,其特征在于具有超过普通阳离子脂质体的显著改进的物理稳定性。
例如蛋白质或肽的抗原物质被加入并且与佐剂制剂混合。最优选的抗原物质是通过吸引的静电力或疏水相互作用与小囊泡结合。在本发明特别优选的实施方案中,对抗结核的终疫苗通过混合TDB稳定的包含DDA的脂质体的佐剂制剂和融合蛋白Ag85B-ESAT-6的溶液制备。佐剂根据本发明制备,包括DDA 2.50mg/ml(4mM)和TDB 0.25mg/ml(0.25mM),相应于TDB的浓度大约5摩尔%,在具有pH 7.4的10mM tris缓冲液中。大约4.5ml的这样的佐剂制剂与Ag85B-ESAT-6的0.5ml 1.0mg/ml Tris-缓冲液混合,以获得在随时可用的终疫苗中融合蛋白的100mg/ml的浓度。在另一个优选的实施方案中,抗原物质使用脱水-再水化方法封闭于小囊泡中,或替代地抗原使用冷冻和融解技术掺入。
附图说明
图1.此图显示在本发明中使用的一些阳离子脂质的结构。
图.2.在4℃储存2个月后的10mM DDA制剂的数字图像。(样品02)包括16摩尔%TDB,(样品03)包含12.5摩尔%TDB,(样品04)包含6摩尔%TDB,(样品05)包含2.5摩尔%TDB,(样品06)包含0.5摩尔%TDB,以及参考样品只包含DDA。从图示明显看出包含TDB的悬浮物更均一并且没有沉淀。
图.3.包括浓度增加的TDB(从上到下)的DDA-B的多层脂质体的DSC热解曲线,以30C/h的扫描速度获得。脂质体悬浮于pH 7.4的10mMTris缓冲液中。热解曲线明显的显示TDB嵌入DDA脂质体膜中。
图.4.包括浓度增加的抗原Ag85B-ESAT-6(从上到下)的DDA-B和TDB的多层脂质体的DSC热解曲线,以30C/h的扫描速度获得。脂质体分散于pH7.4的10mM Tris缓冲液中。热解曲线显示脂质体内掺入抗原不改变相转变温度。
图.5.DDA脂质体平均粒度的时间发展,DDA脂质体包括0摩尔%(-◆-)、6摩尔%(-▲-)、11摩尔%(-☆-)和20摩尔%(-■-)的TDB。脂质体分散于pH7.4的10mM Tris缓冲液中。在14天后观察到没有TDB的DDA脂质体的显著增加。
图.6.A.DDA脂质体(-◆-)和包含11摩尔%通过水加热的方法制备的TDB的DDA脂质体(-▲-)、通过膜方法制备的11摩尔%TDB(-■-)的平均粒度的时间发展。脂质体分散于调节在pH7.4的10mM Tris缓冲液中。在14天后观察到通过水加热方法制备的DDA脂质体和DDA/TDB脂质体的显著增加。
图.7.A.包含11摩尔%TDB(-■-)、10%(w/v)海藻糖(-●-)和10%(w/v)蔗糖(-X-)的DDA脂质体的平均粒度的时间发展。脂质体分散于调节在pH7.4的10mM Tris缓冲液中。包含海藻糖和蔗糖的DDA脂质体聚集到一种程度,使不可能进一步在14天后通过PCS测量。
图.7.B.10mM DDA制剂的数字图像,分别包括10%(w/v)海藻糖和11摩尔%TDB,在4℃储存14天后。在包含海藻糖的制剂中观察到严重聚集。
图.8.进行随时可用的终疫苗的超速离心的Ag85B-ESAT-6的上清液和再悬浮沉淀物的SDS-PAGE分析以观察抗原对阳离子脂质体的吸附。
图.9.来自血液淋巴细胞的IFN-γ的释放,血液淋巴细胞从用Ag85B-ESAT-6/DDA/TDB免疫的C57BI/6j小鼠分离,Ag85B-ESAT-6/DDA/TDB如本发明实施例1中描述的制备或Ag85B-ESAT-6/DDA/TDB按照Holten-Andersen等(2004)描述的制备。在第三次免疫后1周分离淋巴细胞,并且用5μg/ml的Ag85B-ESAT-6刺激。
图.10.来自血液淋巴 细胞的IFN-γ和IL-5的释放,血液淋巴细胞从用2μg的Ag85B-ESAT-6/DDA/TDB或500μg铝中的Ag85B-ESAT-6免疫的C57BI/6j小鼠分离。在第三次免疫后1周分离淋巴细胞,并且在体外用5μg/ml的Ag85B-ESAT-6刺激。
图.11.A.来自脾细胞的IFN-γ的释放,脾细胞从BALB/C小鼠分离,BALB/C小鼠用2μg的Ag85B-ESAT-6免疫,或者在250μg DDA/50μgTDB、100μg的Poly IC中,或者在250μg DDA/50μg TDB/100μg Poly IC中。在第三次免疫后3周分离脾细胞,并且在体外用5μg/ml的Ag85B-ESAT-6再刺激。
图.11.B.来自血液淋巴细胞的IFN-γ的释放,血液淋巴细胞从BALB/C小鼠分离,BALB/C小鼠用2μg的Ag85B-ESAT-6免疫,在250μg DDA/50μg TDB、25μg的MDP中,或在250μg DDA/50μg TDB/25μgMDP中。在第三次免疫后3周分离脾细胞,并且在体外用5μg/ml的Ag85B-ESAT-6再刺激。
图.12.包含11摩尔%TDB(-●-)、1摩尔%乳糖基酰基鞘氨醇(lactocylceramide)(-*-)和11摩尔%α-半乳糖神经酰胺(-X-)的DDA脂质体s(-◆-)和DDA脂质体的平均粒度的时间发展。脂质体分散于调节在pH 7.4的10mM Tris缓冲液中。在14天后观察到没有糖脂的DDA脂质体的显著的增高。提示除TDB的其它糖脂能稳定DDA。
具体实施方式
实施例1包含浓度增加的TDB的DDA小囊泡的制备
使用薄的脂质膜的方法制备包含TDB的DDA小囊泡。二甲基双十八烷基溴化铵(DDA-B,Mw=630.97)和D-(+)-海藻糖6,6′-二山萮酸酯(TDB,Mw=987.5)(Avanti Polar Lipids,Alabaster,Al)分别溶解在氯仿甲醇(9∶1)中到达10mg/ml的浓度。特定体积的每个单独的化合物在玻璃试管中混合。使用N2温和的蒸汽蒸发溶剂,并且在低压下脂质膜被干燥过夜以除去残留量的溶剂。干燥的脂质膜在Tris-缓冲液(10mM,pH=7.4)中水化,到达表1中特定的浓度,并且放在70℃水浴上20分钟,每5分钟剧烈振荡样品。
表1根据本发明制备的佐剂制剂的范围表
摩尔%TDB | 浓度DDA(mM) | TDB(mM) | DDA(mg/ml) | TDB(mg/ml) |
00.52.5612.51620 | 10101010101010 | 0.00.050.250.61.31.92.5 | 6.256.256.256.256.256.256.25 | 0.00.050.250.6251.251.8752.5 |
实施例2 TDB增加DDA制剂的长链稳定性
包括浓度增加的TDB的DDA-B小囊泡的制剂被储存在4℃,并且在一天后和2个月后再次评价不同制剂的视觉现象(图2和表2)。评价清楚地显示TDB稳定DDA小囊泡。没有TDB的DDA在缓冲水溶液中的悬浮物在1天后沉淀,而在包含多于10摩尔%TDB的DDA的悬浮物中没有沉淀形成。在具有低到6%的TDB浓度的悬浮物中,只有非常少量的沉淀形成,其能通过轻轻振荡而轻易再悬浮。
表2不同佐剂制剂范围的2个月的稳定性的描述
摩尔%TDB | 在4℃储存的时间 | |
1天 | 2个月 | |
00.52.56111620 | 沉淀沉淀无沉淀无沉淀无沉淀无沉淀无沉淀 | 沉淀,没有可能再悬浮沉淀,没有可能再悬浮沉淀,相分离,有可能再悬浮少量沉淀,能轻易再悬浮无沉淀无沉淀无沉淀 |
为促进长期储存,悬浮物在3000g离心30分钟。包含多于2.5摩尔%TDB的DDA-B悬浮物只形成非常少量的沉淀,其能通过振荡再悬浮。
实施例3 TDB掺入DDA小囊泡的脂质双层体中
从合成的二烷基二甲基铵形成的脂质双层体在特征性的相转变温度Tm经历从胶到液体晶体的主要相转变。相转变包括二烷基链在小囊泡双层体中的融化,并且链的组织改变,从高度构象有序为特征的状态到具有高度无序的状态。大量的转变焓与链的融化过程有关。这种在焓中的变化在热容量曲线中作为峰值而检测到,在转变温度Tm具有最大值。转变温度以及热容量曲线的形状依赖极性头部基团的特征、抗衡离子、和二烷基链的长度。一般Tm的值随链长度的减少和烷基链的不对称性的增加而下降。第二个二烷基表面活性剂对正温相行为的作用能对2种化合物间的相互作用提供有用的信息。
热容量曲线通过使用VP-DSC差示扫描微量热计(CalorimetrySciences Corp.,Provo)的具有0.34ml的孔体积的能量补偿型号而获得。0.34ml的样品的3个连续的上位扫描(upscan)以30C/h进行。样品在起始温度平衡50分钟。
显示在图3的包含DDA-B和TDB的2组分系统的DSC热解曲线显示增加TDB的摩尔浓度对脂质膜热力学的显著影响。在DDA脂质体的双层体中的TDB的膜嵌入通过主要的相转变温度Tm的降低而显示。纯DDA-B脂质体的从胶到液体的转变,其特征在于在48℃的狭窄的界限分明的热容量峰。增加TDB的浓度引起胶到液体相共存的加宽,其中胶和液体相同时都存在。
包含20摩尔%TDB的DDA-B脂质体的相转变温度比纯的DDA-B下降大约5℃。在DDA-B脂质体膜中嵌入TDB具有引起相转变峰分成2个的趋势。这最可能由于在胶到液体的转变过程中脂质膜中少量组分相的分离。热动力参数显示在表3。
TDB的稳定性作用最可能由于TDB的高度水化的海藻糖的头部基团嵌入DDA-B脂质体膜中,其防止小囊泡双层的脱水和融合。
表3.包含浓度增加的TDB的DDA-B脂质体的热动力参数,通过使用差示扫描量热法(DSC)以30℃/h的扫描速度获得。脂质体分散于pH7.4的10mM Tris缓冲液中并且总脂质浓度是5mM。
摩尔% | Tm(℃) | 面积 | ΔT1/2(℃) |
0 | 47.24 | 8932 | 0.33 |
1 | 46.92 | 10830 | 0.46 |
5 | 45.94 | 8009 | 1.79 |
10 | 43.18 | 11252 | 2.92 |
15 | 42.80 | 9793 | 1.13 |
20 | 43.55 | 14139 | 2.26 |
为评价蛋白质抗原的加入是否影响转变态,包含DDA和TDB的脂质体被加入浓度增加的分枝杆菌融合蛋白Ag85B-ESAT-6,并且通过差示扫描量热计分析制剂。如在图4中描述的,相转变温度不会由于蛋白质的掺入而变化。
实施例4包含TDB的DDA脂质体的粒度
实施例4A通过TDB的掺入增强DDA-B的稳定性
包含浓度增加的TDB和通过膜方法制备的DDA-B的颗粒的稳定性通过使用Malvern ZetaSizer 4(Malvern Instruments Ltd.UK)的动态光散射测量法测量。在第0天掺有0、6、11和20摩尔%的TDB的DDA-B颗粒的制剂被分散在pH7.4的10mM Tris缓冲液中。在制备后第0、14、28、42、56和105天进行测量(图5)。在时间过程中粒度稳定性的比较显示TDB的掺入稳定DDA-B颗粒并防止它们聚集。相反,只具有DDA的制剂在4℃储存几天后聚集并且在42天后由于聚集,没有可能测量到更多的粒度。这些数据支持如图2显示的DDA和DDA/TDB制剂的视觉印象。
实施例4B DDA-B粒度的稳定性通过掺入TDB提高而不是通过水加热方法混合两种组分或添加作为海藻糖的糖类部分
TDB掺入DDA-B颗粒以稳定它们的必要性通过使用MalvernZetaSizer4(Malvern Instruments Ltd.UK)的动态光散射测量法研究。通过膜方法制备的包含11摩尔%TDB的DDA-B颗粒的粒度与同11摩尔%TDB混合的DDA-B颗粒(由Holten-Andersen早先描述的水加热方法)比较。两种制剂都分散在pH7.4的10mM Tris缓冲液中。在制备后第0、14和28天进行测量(图6)。在时间过程中粒度稳定性的比较显示,与混合两种组分防止它们聚集相比,TDB的掺入稳定DDA-B颗粒。
为了研究是否TDB的脂质部分对稳定DDA-B颗粒是必需的,通过膜方法制备的包含11摩尔%TDB的DDA-B颗粒的粒度分别与包含10%(w/v)蔗糖和海藻糖的DDA-B颗粒比较。所有的制剂被分散在pH7.4的10mM Tris缓冲液中。在制备后第0、14、和28天进行测量(图7A)。在时间过程中粒度稳定性的比较显示TDB的脂质部分对稳定DDA-B脂质体是必需。TDB,而不是海藻糖和蔗糖,防止DDA-TDB脂质体聚集(图.7B)。
实施例5包含TDB的DDA小囊泡吸附抗原
进行随时可用的终疫苗的超速离心的Ag85B-ESAT-6的上清液和再次悬浮沉淀物的SDS-PAGE分析以观察抗原对阳离子脂质体的吸附。通过掺入15摩尔%的糖脂TDB,包含佐剂的阳离子脂质体包含稳定的DDA。在终疫苗中Ag85B-ESAT-6(Mw 45KDa)的浓度是40、80、160和200mg/ml,并且DDA和TDB的浓度分别是10和0.6mM。疫苗被超速离心(100.000g)30分钟,并且对上清液和再次悬浮于原体积Tris缓冲液中的沉淀物进行SDS-PAGE分析(图.8)。包含Ag85B-ESAT-6 50mg/ml的参考样品加载在第1泳道,以及分子量标记加载在第2泳道。通过考马斯染色观察蛋白质带。加载上清液的泳道没有观察到可见的蛋白质带,而在加载再次悬浮的沉淀的泳道中观察到在大约分子量45kDa的清楚的带,提示所有或多数抗原吸附到阳离子脂质体。
实施例6结合TDB的DDA促进对Ag85B-ESAT-6的有效免疫应答
通常认为佐剂对诱导某些类型的免疫应答具有一些选择性。由于基于IFN-γ产生的Th1细胞因子的释放的重要性已经显示在对抗TB中是关键的(Flynn等1993;Cooper等1993),包含20摩尔%TDB的DDA-B脂质体通过如本发明实施例1中描述的制备,并且用Ag85B-ESAT-6的Tris缓冲液混合为终疫苗。终疫苗中的浓度是250μg的DDA、100μgTDB和2μgAg85B-ESAT-6。为了比较,另一种疫苗被包括,其包括相同量的DDA和TDB,但是如先前描述的制备在DMSO中(Holten-Andersen等,2004),即没有用膜方法在脂质体中掺入TDB。小鼠被免疫三次,在第三次免疫后一周研究血液细胞特别的免疫应答(图9)。与先前描述的方法比较,用通过膜方法制备的DDA/TDB免疫后观察到非常更高的应答,显示与简单的混合DDA/TDB相比通过膜方法制备的DDA/TDB增强佐剂的作用。
相似地,通过膜方法制备的DDA/TDB的免疫应答与已经被批准的用于临床的基于铝的佐剂Alhydrogel相比。如图10所示,用DDA/TDB免疫引起高水平的IFN-γ和低水平的IL-5,而Alhydrogel免疫的小鼠显示相反的情况,很少的IFN-γ分泌和高水平的IL-5。
研究DDA/TDB产生体液应答的能力,通过在初次免疫后5周监测Ag85B-ESAT-6特异性IgG抗体的应答。终疫苗中的浓度是250μg的DDA、100μg TDB和2μg Ag85B-ESAT-6。一组小鼠接受在Alhydrogel中的Ag85B-ESAT-6用于比较。如表5所示,高滴度的特异性IgG存在于用在DDA/TDB中的Ag85B-ESAT-6接种疫苗的小鼠的血清中。与用Ag85B-ESAT-6/Alhydrogel免疫后获得的滴度相比,包含DDA/TDB的佐剂制剂诱导更高水平的特异性抗体。
表5来自Ag85B-ESAT-6免疫的小鼠的血清中的抗原-特异性抗体的中值滴度
总IgGa | |
天然对照 | <100 |
Ag85B-ESAT-6/Alhydrogel | 51600 |
Ag85B-ESAT-6/DDA/TDB | 218000 |
a在第一次免疫后5周通过ELISA检测的Ag85B-ESAT-6特异性IgG的水平
实施例6A通过在DDA/TDB组合中加入第三种组分增强免疫应答
最近Toll样受体(TLR)的配体被认为是包括在新的佐剂制剂中的有吸引力的靶。为了研究在DDA/TDB制剂中掺入例如TLR配体的其它免疫刺激组分的作用,小鼠用在250μg DDA/50μg TDB中的2μgAg85B-ESAT-6以及选定的免疫调节因子免疫。这些包括加入预形成的已知是TLR3的配体的DDA-TDB脂质体的100μg的Poly IC(Polyinosinic-polycytidylic acid,Sigma Aldrich)以及给予TLR2/TLR4活化的25μg的胞壁酰二肽(MDP)。在水化之前在DDA-TDB脂质膜中包括MDP。
在末次免疫后3周,从每个小鼠纯化脾细胞或血液细胞(如在附图描述中提示的),并且在体外用5μg/ml的Ag85B-ESAT-6再次刺激后测量IFN-γ释放的水平。与或者只用DDA/TDB或只用第三种组分(Poly IC和TDM)产生的免疫应答比较,包括所有三种组分的制剂引起增强的免疫应答,显示DDA/TDB和免疫调节因子之间的协同作用(图11a和b)。
实施例7 DDA-B颗粒的稳定性通过掺入TDB以外的其它糖脂有效的增强
举例说明DDA-B颗粒能被TDB以外的其它糖脂稳定,分别是11摩尔%β-D-乳糖基酰基鞘氨醇(β-LacCer)、11摩尔%β-半乳糖神经酰胺(β-GalCer)和44w/w%G(M1)神经节糖苷。制剂是通过膜方法制备并且在第0天分散在pH7.4的10mM Tris缓冲液中。粒度通过使用MalvernZetaSizer4(Malvern Instruments Ltd.UK)的动态光散射测量法测量。在制备后第0、14、28天进行测量(图12)。在时间过程中对粒度稳定性的比较显示糖脂的掺入稳定DDA。
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US5922350
Claims (18)
1.一种稳定在水制剂中的阳离子脂质体的方法,其通过在脂质体中掺入糖脂。
2.根据权利要求1所述的稳定阳离子脂质体的方法,其中所述阳离子脂质是两亲季铵化合物。
3.根据权利要求2所述的稳定脂质体的方法,其中所述两亲季铵化合物有一个或两个脂肪链。
4.根据权利要求2或3所述的稳定脂质体的方法,其中所述脂肪链各包括12-20个碳原子。
5.根据权利要求4所述的稳定脂质体的方法,其中所述两亲季铵化合物是DDA-B、DDA-C、DDA-X、DODA-B、DODA-C、DODA-X、DOTAP、DODAP或DOTMA。
6.根据权利要求1-5所述的稳定脂质体的方法,其中所述糖脂是酰化的糖苷,其由1个或高到3个脂肪烃基链和1个或2个糖类残基结合形成。
7.根据权利要求6所述的稳定脂质体的方法,其中所述糖脂是具有2个酰基链的双糖。
8.根据权利要求6-7所述的稳定脂质体的方法,其中所述酰基链包括15-90个碳原子。
9.根据权利要求8所述的稳定脂质体的方法,其中所述糖脂是α,α′-海藻糖6,6′二山萮酸酯(TDB)或α,α′-海藻糖6,6′-二霉菌酸酯(TDM)。
10.根据前述权利要求的任何所述的稳定脂质体的方法,其中具体的糖脂的摩尔百分数是从0.5到大约95摩尔%,优选地从大约2.5到大约20摩尔%,以及更优选地从大约5到大约18摩尔%。
11.一种脂质体产品,其经根据权利要求1-10所述的方法稳定化处理。
12.根据权利要求11所述的脂质体产品,其中一种抗原化合物封闭在所述脂质体中。
13.根据权利要求10或11所述的脂质体产品,其用于药物递送。
14.根据权利要求12所述的脂质体产品,其用于作为佐剂。
15.一种疫苗佐剂,其包括根据权利要求11所述的脂质体产品。
16.根据权利要求15所述的一种佐剂,其用于对抗衣原体、疟疾或结核的疫苗中。
17.一种对抗衣原体、疟疾或结核的疫苗,其包括根据权利要求15所述的佐剂。
18.一种递送系统,其包括根据权利要求11所述的脂质体产品。
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