CN107124869A - 包含含有单磷酰脂质a(mpla)的脂质体组合物和皂苷的无毒佐剂制剂 - Google Patents
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Abstract
本文提供的是包含含有单磷酰脂质A(MPLA)的脂质体组合物与皂苷(例如QS‑21)的佐剂制剂,其中所述脂质体组合物包含i)包含磷脂的脂质双层,其中烃链具有在水中≥23℃的熔融温度,和ii)以大于约50%(摩尔/摩尔)、优选约55%至约71%(摩尔/摩尔)、或更优选约55%(摩尔/摩尔)的摩尔百分比浓度的胆固醇。佐剂制剂展示脂质A或皂苷的最低限度毒性。
Description
与相关申请的交叉参考
本申请要求享有于2014年3月25日提交的美国临时申请号61/970,118的利益,所述美国临时申请以其整体并入本文。
美国政府权利
在本公开内容的实施方案的开发期间执行的部分工作利用了通过美国国防部拨款号(United States Department of Defense Grant No.)W81XWH-07-2-0067的美国政府基金。美国政府在本发明中拥有一定权利。
领域
本文描述的涉及包含含有单磷酰脂质A(MPLA)的脂质体和至少一种皂苷例如QS-21的组合物。脂质体包含i)包含磷脂的脂质双层,其中烃链具有在水中≥ 23℃的熔融温度(melting temperature),和ii)以大于约50%(摩尔/摩尔)的摩尔百分比浓度的胆固醇。
背景
许多现代疫苗的最佳有利效应要求使用疫苗佐剂,其在注射后增强免疫应答,同时维持全身性安全和最低限度的副反应。脂多糖(LPS)是革兰氏阴性菌的外膜的外小叶中的主要表面分子,并且专一地在革兰氏阴性菌的外膜的外小叶中出现。LPS阻碍通过血清补体和吞噬细胞的细菌破坏,并且涉及用于定植的粘附。LPS是一组大约10,000道尔顿的结构上相关的复杂分子,其含有其为LPS最内部区域的脂质A,所述脂质A充当疏水锚且包含携带长链脂肪酸的磷酸化葡糖胺二糖单位。
LPS的生物活性例如致死毒性、致热原性和佐剂性已显示与脂质A部分相关。LPS和脂质A两者长久以来均因其强佐剂效应而已知,但这些分子的高毒性已限制其在疫苗制剂中的使用。显著的科学努力已朝向减少LPS或脂质A的毒性同时维持其佐剂性发生。
其他常用的非人佐剂是皂皮树属(Quillaja)皂苷,其是从皂树(Quillaja saponaria)的树皮中提取的两亲三萜糖苷的混合物。粗皂苷已用作兽医学佐剂。Quil‐A是皂皮树属皂苷材料的部分纯化的水提取物,并且QS-21是Quil A的HPLC纯化级分。产生QS-21(称为QA21)的方法公开于美国专利号5,057,540中。然而,使用皂苷例如QS-21的主要副作用之一是其细胞毒性。具体地,尽管确切细胞毒性机制目前未知,但皂苷引起溶血,这是红血细胞的破裂或裂解。
需要的是疫苗递送组合物,其包括用于支持免疫应答的佐剂,但不含相关细胞毒性。
概述
相应地,本领域存在开发更有力同时更安全的佐剂制剂的需要。本文提供的是包含含有单磷酰脂质A(MPLA)的脂质体(L(MPLA))组合物和皂苷的佐剂制剂,其中所述佐剂制剂展示脂质A或皂苷的最低限度毒性。
相应地,提供的是包含含有单磷酰脂质A(MPLA)的脂质体组合物和至少一种皂苷的佐剂制剂,其中所述脂质体组合物包含i)包含磷脂的脂质双层,其中烃链具有在水中≥23℃的熔融温度,和ii)以大于约50%(摩尔/摩尔)的摩尔百分比浓度的胆固醇。皂苷可以选自QS-7、QS-18、QS-21或其混合物。优选地,皂苷可以是QS-21。
在一个方面,佐剂制剂的脂质体组合物可以包含以约55%至约71%(摩尔/摩尔)、或优选约55%(摩尔/摩尔)的摩尔百分比浓度的胆固醇。佐剂制剂的脂质体组合物可以包含选自下述的磷脂酰胆碱(PC):二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)。可替代地,佐剂制剂的脂质体组合物可以包含选自下述的磷脂酰甘油(PG):二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)和二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)。佐剂制剂的脂质体组合物可以具有约0.5:1、约1:1、约2:1、约3:1、约4:1、约5:1、约6:1、约7:1、约8:1、约9:1、约10:1、约11:1、约12:1、约13:1、约14:1或约15:1的PC与PG比率(摩尔/摩尔)。佐剂制剂的脂质体组合物可以包含多层囊泡(MLV)或小单层囊泡(SUV),其中小单层囊泡为直径约50至约100 nm,并且其中多层囊泡为直径约1至约4 µm。
在另一个方面,佐剂制剂的脂质体组合物可以包含约5 mg或更少、约4 mg或更少、约3 mg或更少、约2 mg或更少、约1 mg或更少、约0.9 mg或更少、约0.8 mg或更少、约0.7 mg或更少、约0.6 mg或更少、约0.5 mg或更少、约0.4 mg或更少、约0.3 mg或更少、约0.2 mg或更少、约0.1 mg或更少、约0.09 mg或更少、约0.08 mg或更少、约0.07 mg或更少、约0.06 mg或更少、约0.05 mg或更少、约0.04 mg或更少、约0.03 mg或更少、约0.02 mg或更少、或者约0.01 mg或更少的MPLA(总重量/ml脂质体悬浮液)。佐剂制剂的脂质体组合物可以具有约1:5.6至约1:880、或约1:88至约1:220的MPLA:磷脂摩尔比。
在一个进一步的方面,佐剂制剂可以具有约1 mg或更少、约0.9 mg或更少、约0.8mg或更少、约0.7 mg或更少、约0.6 mg或更少、约0.5 mg或更少、约0.4 mg或更少、约0.3 mg或更少、约0.2 mg或更少、约0.1 mg或更少、约0.09 mg或更少、约0.08 mg或更少、约0.07mg或更少、约0.06 mg或更少、约0.05 mg或更少、约0.04 mg或更少、约0.03 mg或更少、约0.02 mg或更少、或者约0.01 mg或更少的皂苷含量(总重量/ml脂质体悬浮液)。
还提供的是包含免疫原和佐剂制剂的免疫原性组合物。免疫原性组合物通常可以包含生理学上可接受的媒介物。免疫原性组合物的免疫原可以选自天然存在或人工制造的蛋白质、重组蛋白质、糖蛋白、肽、碳水化合物、半抗原、全病毒、细菌、原生动物和病毒样颗粒。优选地,免疫原性组合物的免疫原可以是HIV-1包膜蛋白。还提供的是使动物免疫的方法,所述方法包括施用免疫原性组合物。
进一步提供的是减少皂苷作为佐剂的毒性或制备佐剂制剂的方法,其包括将含有单磷酰脂质A(MPLA)的脂质体组合物添加至皂苷,其中所述脂质体组合物包含i)包含磷脂的脂质双层,其中烃链具有在水中≥ 23℃的熔融温度,和ii)以大于约50%(摩尔/摩尔)的摩尔百分比浓度的胆固醇。皂苷可以选自QS-7、QS-18、QS-21及其混合物。优选地,皂苷可以是QS-21。脂质体组合物可以包含以约55%至约71%(摩尔/摩尔)、优选约55%(摩尔/摩尔)的摩尔百分比浓度的胆固醇。
附图简述
将所附的附图并入公开内容且提供各种实施方案的非限制性阐明。
图1描述了如实施例1中所述,具有各种QS‐21浓度(图1A: 10 μg/ml QS-21;图1B:50 μg/ml QS-21)的脂质体组合物的溶血活性。
图2描述了如实施例1中所述,通过与脂质体预温育的QS-21的红细胞溶血。QS-21在22℃下与含有总共5 μmol磷脂的DMPC/DMPG脂质体混合。脂质体还含有33.7、43或55摩尔% Chol。
图3描述了如实施例1中所述,通过与脂质体预温育的皂苷的红细胞溶血。
图4描述了通过脂质体MPLA抑制QS-21与脂质体Chol的结合。实验如实施例2中所述进行。显示了关于L的14个独立的脂质体分批以及L(MPLA)的4个独立分批的平均值±S.D.。
图5描述了磷脂脂肪酰链长对脂质体Chol结合QS-21的可接近性的作用。实验如实施例2中所述进行。图5A阐明了具有33.7摩尔% Chol且不含MPLA的脂质体的结果。图5B阐明了具有55摩尔% Chol且不含MPLA的脂质体的结果。图5C阐明了具有55摩尔% Chol和MPLA的脂质体的结果。
图6描述了通过MPLA抑制在DMPC/DMPG脂质体之间的Chol转移。Chol转移通过QS-21与不含MPLA(图6A)或含有MPLA(MPLA:磷脂 = 1:5.6)(图6B)的脂质体结合进行检测。
图7描述了通过增加脂质体Chol含量压制DMPC/DMPG/Chol/MPLA脂质体的LAL阳性。LAL与含有33.7摩尔% Chol的脂质体结合的结果显示于图7A中,而LAL与含有55摩尔%Chol的脂质体结合的结果显示于图7B中。
图8描述了如在QS-21(ALFQ)的不存在(图8A)和存在(图8B)下,通过ALF SUV和ALFMLV的光散射测量的通常尺寸分布。在图8A中,两个SUV曲线包含具有1:88或1:5.6的MPLA:磷脂比率的脂质体。两个MLV曲线包含(从左到右):具有1:220或1:88的MPLA:磷脂比率的脂质体。在图8B中,曲线代表ALFQ,其中初始ALF分别包含(从左到右):具有1:220的MPLA:磷脂比率的MLV;以及具有1:88和1:5.6的MPLA:磷脂比率的SUV。
图9描述了对gp140的IgG终点滴度。小鼠用含有所示MPLA:磷脂摩尔比的ALF+CNgp140(图9A)和ALFQ+CN gp140(图9B)进行免疫,其中20 µg MPLA存在于各制剂中。血清来自第9周,并且通过ELISA进行测定。值是6只动物/组的平均值±标准差。
图10描述了如实施例4和材料与方法中所述的抗gp140抗血清的IgG亚型概况。小鼠用ALF+gp140(图10A)或ALFQ+gp140(图10B)进行免疫。ELISA板用gp140进行包被。进行亚型分析并且由标准曲线计算值。每个小图代表来自一组免疫小鼠的第9周的合并血清。
图11描述了在初次免疫后9周,通过来自小鼠的脾细胞的IFN-γ(图11A)和IL-4(图11B)生产。将脾细胞铺板且用gp140 CN54刺激18小时,并且通过ELISPOT确定细胞因子生产细胞的数目。垂直线代表6只动物/组的平均值(首次用于实验的:未免疫的对照小鼠)。
图12描述了通过合并抗血清的HIV中和。疫苗制剂在x轴上指出。ID50值代表在初次免疫后9周,在来自小鼠的血清样品的所示稀释时,假病毒MW965.26PV(图12A)和GS015PV(图12B)的50%中和。对照是来自未免疫小鼠的血清。ID50值<20被视为本底。MuLV PV被用作测定阴性对照(数据未示出)。
详述
1. 定义和缩写
1.1. 缩写和首字母缩写
ABTS 2,2'-连氮基 - 双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)
ALF Army脂质体制剂
ALFQ ALF加上QS-21
BCIP 5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸酯
Chol 胆固醇
cRPMI 完全 RPMI 1640培养基
DMEM 达尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)
DMPC 二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱
DMPG 二肉豆蔻酰磷脂酰甘油
DPPC 二棕榈酰磷脂酰胆碱
DSPC 二硬脂酰磷酸胆碱
ELISA 酶联免疫吸附测定
ELISPOT 酶联免疫斑点
FBS 胎牛血清
HRP 辣根过氧化物酶
ID50 血清的50%抑制稀释度
IFN-γ 干扰素-γ
IL-4 白细胞介素-4
L(MPLA) 含有单磷酰脂质A(MPLA)的脂质体
LAL 鲎变形细胞裂解产物
LPS 脂多糖
MLV 多层囊泡
MPLA 单磷酰脂质A
MuLV 鼠白血病病毒
NBT 氮蓝四唑
PBS 磷酸盐缓冲盐水
PC 磷脂酰胆碱
PG 磷脂酰甘油
PHA 植物血细胞凝集素
SUV 小单层囊泡。
1.2. 定义
“免疫原”是能够诱导体液和/或细胞介导的免疫应答的试剂。如本文描述的免疫原可以是抗原、半抗原或灭活的病原体。如本文描述的免疫原性组合物可以是例如疫苗制剂。
如本文使用的,“脂质体”指含有截留水性体积的闭合双层膜。脂质体还可以是具有单一膜双层的单层囊泡或具有多重膜双层的多层囊泡,各自通过水性层与下一膜双层分开。所得到的膜双层的结构是这样的,使得脂质的疏水(非极性)尾部朝向双层的中心,而亲水(极性)头部朝向水相。如脂质体最初使用的,它们由近晶中间相组成,并且可以由磷脂或非磷脂近晶中间相组成。近晶中间相由Small,Handbook of Lipid Research,第4卷,Plenum,NY,1986,第49-50页最精确地描述。根据Small,“当给定分子被加热而不是直接熔融成各向同性液体时,相反,它可以通过称为中间相或液晶的中间状态,特征在于在一些方向上的残留次序,但在其他方向上缺乏次序……一般而言,液晶的分子略微长于它们广泛且沿分子长度的某处具有极性或芳香族部分。分子形状和极性-极性、或芳香族相互作用允许分子在部分有序的阵列中对齐……这些结构特征性出现在一个端部处具有极性基团的分子中。在分子的纵轴方向上具有长程次序的液晶被称为近晶、分层或薄层液晶……在近晶状态中,分子可以在单层或双层中,正交或倾斜于层的平面,并且具有冷冻或熔融的脂肪族链。”。
脂质A是一组复杂的重度酰化和酰胺化的二葡糖胺二磷酸酯分子,并且是来自革兰氏阴性菌的所有脂多糖(LPS;也称为内毒素)共有的脂质部分。LPS覆盖所有革兰氏阴性菌的基本上整个外表面,并且脂质A将LPS锚定到细菌的外部脂质表面内。野生型光滑菌中的LPS的O-多糖部分连接至在粗糙突变体中表达的相对保守的核心寡糖,并且这依次又通过高度保守的2-酮-3-脱氧辛酸糖连接至脂质A,所述2-酮-3-脱氧辛酸糖为有时是细菌生存所需的独特的化学结构,并且仅在LPS中发现。参见例如,Alving等人,2012,Expert Rev. Vaccines 11: 733-44。“单磷酰脂质A”是其中极性头部基团上的葡糖胺-1-磷酸基团已被去除的脂质A同类物(congener)。还存在MPLA的众多同类物。
如本文使用的,脂质体组合物的“胆固醇的摩尔百分比浓度”指在脂质体组合物的制备中最初使用的Chol:总磷脂(即磷脂酰胆碱和磷脂酰甘油)的比率。
如本文使用的,“生理学上可接受的媒介物”指适合于体内施用(例如经口、经皮或肠胃外施用)或体外使用(即,细胞培养)的媒介物。示例性的生理学上可接受的媒介物可以是如美国专利号4,186,183和4,302,459中公开的那些生理学上可接受的脂质体的组成成分。
如本文使用的,“优选的”和“优选地”应解释为仅用于欧洲的权利要求结构的目的。该术语应从它们在其中出现用于美国权利要求结构目的的句子和段落结构读出或省略。
如本文使用的,术语“约”指参考值的± 5%。
除非另有定义,否则本文使用的所有技术和科学术语具有如由本领域普通技术人员通常理解相同的含义。必须指出如本文使用的,单数形式“一个/种”、“和”和“所述”包括复数参考,除非上下文另有明确说明。因此,例如提及“抗体”包括多个此类抗体,并且提及“剂量”包括对一个或多个剂量及其对于本领域技术人员已知的等价物的提及等等。
2. 皂苷
对于本文实施方案,合适的皂苷是Quil A、其衍生物或其任何纯化组分(例如QS-7、QS-18、QS-21或其混合物)。Quil A是从南美树木莫利那肥皂草皂树(Quillaja Saponaria Molina)分离的皂苷制剂,并且首次发现具有佐剂活性。Dalsgaard等人,1974,Archiv. für die gesamte Virusforschung,44: 243-254。Quil A的纯化片段已通过HPLC进行分离(EP0 362 278),包括例如QS-7和QS-21(也分别被称为QA7和QA21)。QS-21已显示诱导CD8+细胞毒性T细胞(CTL)、Th1细胞和占优势的IgG2a抗体应答。
3. 含有单磷酰脂质A(MPLA)的脂质体(L(MPLA))
脂质体是含有截留的水性体积的闭合双层膜。脂质体还可以是具有单个膜双层的单层囊泡或具有多重膜双层的多层囊泡,各自通过水性层与下一膜双层分开。所得到的膜双层的结构是这样的,使得脂质的疏水(非极性)尾部朝向双层的中心,而亲水(极性)头部朝向水相。用于包围脂质体的合适亲水聚合物包括但不限于PEG、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯基甲基醚、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羟丙基噁唑啉、聚羟丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚羟丙基甲基丙烯酸酯、聚羟乙基丙烯酸酯、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、聚乙二醇、聚天冬酰胺和亲水性肽序列,如美国专利号6,316,024;6,126,966;6,056,973;和6,043,094中所述。脂质体可以无需亲水聚合物进行制备。因此,脂质体制剂可以含有或不含亲水聚合物。
脂质体可以由本领域已知的任何脂质或脂质组合组成。例如,囊泡形成脂质可以是天然存在的或合成脂质,包括磷脂,例如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇和鞘磷脂,如美国专利号6,056,973和5,874,104中公开的。
囊泡形成脂质还可以是糖脂、脑苷脂或阳离子脂质,例如1,2-二油基氧基-3-(三甲基氨基)丙烷(DOTAP);N-[1-(2,3,-双十四烷氧基)丙基]-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE);N-[1-[(2,3-二油氧基)丙基]-N,N-二甲基-N-羟基乙基溴化铵(DORIE);N-[1-(2,3-二油氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA);3 [N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇(DCChol);或二甲基双十八烷基铵(DDAB),同样如美国专利号6,056,973中公开的。胆固醇还可以以适当范围存在,以对脂质体囊泡赋予稳定性,如美国专利号5,916,588和5,874,104中公开的。另外的脂质体技术在美国专利号6,759,057;6,406,713;6,352,716;6,316,024;6,294,191;6,126,966;6,056,973;6,043,094;5,965,156;5,916,588;5,874,104;5,215,680;和4,684,479中描述。这些专利描述了脂质体和脂质包被微泡,及其制造方法。因此,考虑到本公开内容和这些其他专利的公开内容两者,本领域技术人员可以产生用于本文实施方案目的的脂质体。对于本文实施方案,脂质体组合物通常含有约 1 mM至约150 mM磷脂。
上文示例性脂质体中的任一种均包括单磷酰脂质A(MPLA),或可以与其他脂质体和脂质A(MPLA)组合。MPLA单独对于人和动物可以是有毒的。然而,当存在于脂质体中时,毒性是无法检测的。参见例如Alving等人,2012。用于制备如本文描述的具有MPLA的脂质体的示例性程序至少在Alving等人,2012中教导。MPLA充当有力佐剂,且作用于提高脂质体以及与脂质体结合的肽、蛋白质或半抗原的免疫原性。
对于本文实施方案,含有单磷酰脂质A(MPLA)的通常脂质体(L(MPLA))是作为疫苗佐剂最初被称为Walter Reed脂质体,但目前称为Army脂质体制剂(ALF)的那种。参见例如Alving等人,2012。ALF佐剂脂质体包含(1)包含磷脂的脂质双层,其中烃链具有在水中≥23℃的熔融温度,通常为二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)和二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG);(2)作为稳定剂的胆固醇;和(3)作为免疫刺激剂的单磷酰脂质A(MPLA)。在人临床试验中,ALF型脂质体佐剂证明在针对疟疾、HIV-1和癌症的候选疫苗中是安全有效的。参见例如Fries等人,1992,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,89: 358-62;Alving,2002,Vaccine,20:S56-64。QS-21加入其中以形成ALFQ的ALF的特定组合物包含以大于约50%(摩尔/摩尔)、优选约55%至约71%(摩尔/摩尔)、或更优选约55%(摩尔/摩尔)的摩尔百分比浓度的胆固醇。
对于本文实施方案,L(MPLA)可以包含选自下述的磷脂酰胆碱(PC):二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)。L(MPLA)还可以包含选自下述的磷脂酰甘油(PG):二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)和二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)。脂质体的PC与PG比率(摩尔/摩尔)可以是约0.5:1、约1:1、约2:1、约3:1、约4:1、约5:1、约6:1、约7:1、约8:1、约9:1、约10:1、约11:1、约12:1、约13:1、约14:1或约15:1。脂质体可以具有约5 mg或更少、约4 mg或更少、约3 mg或更少、约2mg或更少、约1 mg或更少、约0.9 mg或更少、约0.8 mg或更少、约0.7 mg或更少、约0.6 mg或更少、约0.5 mg或更少、约0.4 mg或更少、约0.3 mg或更少、约0.2 mg或更少、约0.1 mg或更少、约0.09 mg或更少、约0.08 mg或更少、约0.07 mg或更少、约0.06 mg或更少、约0.05 mg或更少、约0.04 mg或更少、约0.03 mg或更少、约0.02 mg或更少、或者约0.01 mg或更少的MPLA含量(总重量/ml脂质体悬浮液)。可替代地,脂质体可以具有约1:5.6至约1:880、优选约1:88至约1:220的MPLA:磷脂摩尔比。脂质体可以包含多层囊泡(MLV)或小单层囊泡(SUV)。小单层囊泡可以是直径约50至约100 nm,而多层囊泡可以是直径约1至约4 µm。
4. 包含脂质体和皂苷的佐剂制剂
称为AS01(也称为AS01B或AS01E)的佐剂制剂先前通过GlaxoSmithKline引入。在AS01中,脂质双层包含在室温下是“非结晶的”中性脂质,例如二油酰基磷脂酰胆碱、胆固醇、MPLA和QS-21。参见美国公开专利申请号2011/0206758。在AS01制造期间,首先制备小单层脂质体囊泡(SUV),并且随后将纯化的QS-21加入SUV中。QS-21赋予独特特性,因为它与脂质体胆固醇结合,它在其中引起脂质体中的穿孔(洞)或其他永久结构改变。参见例如Paepenmuller等人,2014,Int. J. Pharm.,475: 138-46。减少量的游离QS-21推测导致通过由游离QS-21引起的减少的局部注射疼痛。参见例如Waite等人,2001,Vaccine,19:3957-67;Mbawuike等人,2007,Vaccine,25: 3263-69。AS01B制剂被制备“用于其中需要诱导更强的T细胞介导的免疫应答的疫苗”。参见Garçon等人,2007,Expert. Rev. Vaccines,6: 723-39。AS01制剂被开发作为用于各种疫苗的佐剂。参见Garcon & Mechelen,2011,Expert. Rev. Vaccines,10: 471-86。如美国公开专利申请号2011/0206758中所述的AS01制剂可以含有以1-50%(摩尔/摩尔)、优选20-25%(摩尔/摩尔)的摩尔百分比浓度的胆固醇(固醇)。
如本公开内容中所述,QS-21对ALF脂质体的添加(导致ALF加上QS-21,或“ALFQ”)导致脂质体膜的膜生物化学和物理结构中的复杂变化。因素例如MPLA:磷脂比率以及QS-21、MPLA和胆固醇的相对摩尔浓度和比率影响MPLA和胆固醇的可见性。这些因素还影响加入的QS-21的相对毒性,如通过邻近红细胞的溶血测定的。
对于本文实施方案,佐剂制剂包含含有单磷酰脂质A(MPLA)的脂质体组合物和至少一种皂苷,其中所述脂质体组合物包含i)包含磷脂(例如二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)和/或二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG))的脂质双层,其中烃链具有在水中≥ 23℃的熔融温度,和ii)以大于约50%(摩尔/摩尔)、或优选约55%至约71%(摩尔/摩尔)、或更优选约55%(摩尔/摩尔)的摩尔百分比浓度的胆固醇。至少这两个特征不同于如上文讨论的AS01的那些。皂苷可以选自QS-7、QS-18、QS-21或其混合物,或皂苷优选可以是QS-21。佐剂制剂可以含有约1 mg或更少、约0.9 mg或更少、约0.8 mg或更少、约0.7 mg或更少、约0.6 mg或更少、约0.5 mg或更少、约0.4 mg或更少、约0.3 mg或更少、约0.2 mg或更少、约0.1 mg或更少、约0.09 mg或更少、约0.08 mg或更少、约0.07 mg或更少、约0.06 mg或更少、约0.05 mg或更少、约0.04 mg或更少、约0.03 mg或更少、约0.02 mg或更少、或者约0.01 mg或更少的皂苷/ml脂质体悬浮液。
本文实施方案的佐剂制剂可以用于与免疫原混合,以获得免疫原性组合物,例如疫苗制剂。免疫原性组合物可以包含生理学上可接受的媒介物,例如美国专利号5,888,519中描述的那些中的任何一种。免疫原性组合物可以包含天然存在或人工制造的蛋白质、重组蛋白质、糖蛋白、肽、碳水化合物、半抗原、全病毒、细菌、原生动物或病毒样颗粒作为免疫原。免疫原性组合物可以是HIV-1包膜蛋白例如gp140。免疫原性制剂可以适当地用作用于流感、HIV-1、甲型肝炎、乙型肝炎、人乳头瘤病毒、脑膜炎球菌A型脑膜炎、脑膜炎球菌B型脑膜炎、脑膜炎球菌C型脑膜炎、破伤风、白喉、百日咳、脊髓灰质炎、B型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)、登革热、手足口病、伤寒、肺炎球菌、日本脑炎病毒、炭疽、带状疱疹、疟疾、诺罗病毒或癌症的疫苗。
实施例
提供下述实施例,以便证实且进一步阐明本公开内容的某些代表性实施方案和方面,并且不应解释为限制说明书或权利要求的范围。
材料与方法
液体、皂苷及其他试剂
二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)和合成单磷酰脂质A(MPLA)(PHAD™)购自Avanti Polar Lipids(Alabaster,AL,USA)。使DMPC和Chol溶解于新鲜蒸馏的氯仿中,并且使DMPG和MPLA溶解于氯仿:甲醇(9:1)中。使纯化的QS-21(DesertKing International San Diego,CA,USA)以1 mg/ml溶解于PBS中。皂苷购自Sigma-Aldrich(St. Louis,MO,USA)。
辣根过氧化物酶(HRP)连接的绵羊抗小鼠IgG HRP购自The Binding Site(目录号AP272)。HRP连接的山羊抗小鼠IgG1(A90-105P)、HRP连接的山羊抗小鼠IgG2a(A90-107P)、HRP连接的山羊抗小鼠IgG2b(A90-109P)、HRP连接的山羊抗小鼠IgG3(A90-111P),以及纯化的小鼠IgG1(MI10-102)、IgG2a(MI10-103)、IgG2b(MI10-104)和IgG3(MI10-105)购自Bethyl Laboratories(Montgomery,TX,USA)。未缀合的山羊抗小鼠IgG Fab(1015-01)来自Southern Biotech(Birmingham,AL,USA)。纯化的抗小鼠IFN-γ(51-2525KZ)、纯化的大鼠抗小鼠IL-4(BVD4-1D11)、生物素标记的抗小鼠IFN-γ(51-1818KA)和生物素标记的大鼠抗小鼠IL-4(BVD6-24G2)购自BD Biosciences(Franklin Lakes,NJ,USA)。
含有10%胎牛血清(FBS)、100单位/ml青霉素、100 µg/ml链霉素和2 mM L-谷氨酰胺的达尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)用于培养TZM.bl细胞和HIV-1中和测定。含有10%FBS、100单位/ml青霉素、100 µg/ml链霉素和2 mM L-谷氨酰胺的完全RPMI 1640培养基(cRPMI)用于培养小鼠脾淋巴细胞和ELISPOT分析。
脂质体的制备
如Matyas等人,2003,Methods Enzymol.,373: 34–50中先前描述的制备脂质体。对于实施例1-3,将脂质混合,在真空下干燥,并且随后以50 mM或1.272 mM总磷脂的最终浓度在PBS,pH:7.4中形成脂质体。脂质体磷脂酰胆碱和磷脂酰甘油以9:1的摩尔比。脂质体Chol如所示的改变。当使用MPLA时,MPLA:总磷脂的摩尔比如所示的为45:1或5.6:1。脂质体Chol的摩尔百分比浓度基于在脂质体制备中最初使用的Chol:总磷脂(即磷脂酰胆碱和磷脂酰甘油)的比率。
为了评估佐剂效力,通过如Matyas等人,2003中所述的脂质沉积方法,制备含有DMPC、DMPG、Chol和MPLA的Army脂质体制剂(ALF)。对于实施例4,将脂质混合且通过旋转蒸发干燥。通过将PBS,pH 7.4以50 mM、或20 mM、或2 mM总磷脂的最终浓度加入水性脂质体悬浮液中形成多层囊泡(MLV)。总共20 µg MPLA用于每种脂质体制备物,并且MPLA和磷脂制剂之间的摩尔比分别为1:220、1:88和1:5.6。脂质体磷脂酰胆碱和磷脂酰甘油为9:1的摩尔比。脂质体Chol浓度在缺乏QS-21的所有ALF制剂中为43摩尔%。脂质体使用MicrofluidicsLV1低体积高剪切微流化器(ATS Scientific Inc.,Burlington,Ontario,加拿大)以30,000 psi进行微流体化,以形成SUV。脂质体的直径尺寸分布通过Horiba LB-550粒度分析仪(Horiba Scientific,New Jersey,NJ)进行测量。Army脂质体制剂加上QS-21(ALFQ)通过将其中Chol浓度为55摩尔%的MLV或SUV脂质体与QS-21混合进行制备。QS-21在这些条件下不可逆地结合脂质体中的Chol,其中在缓冲液中不存在可检测的游离QS-21。用于免疫的每种ALFQ制剂中的QS-21总量为10 µg。
10 µg HIV-1进化枝C CN54 gp140包膜抗原(Polymun Scientific Inc.,Klosterneuberg,奥地利)的总注射剂量与ALF或ALFQ脂质体的每种制剂在PBS中混合。制备四种不同的ALF-gp140制剂,具有对于MLV为1:220或1:88,和对于SUV为1:88或1:5.6的脂质体MPLA:磷脂比率。通过将QS-21加入ALF SUV或MLV中,制备三种不同的ALFQ-gp140制剂,其中MLV具有1:220或1:88的MPLA:磷脂比率,和ALF SUV具有1:5.6的MPLA:磷脂比率。
胆固醇分析
通过确立的方法分析胆固醇含量,以证实胆固醇以及间接的脂质体制剂的磷脂浓度。参见例如Zlatkis等人,1953,J. Lab. Clin. Med.,41: 486–492。简言之,将5至200 µl脂质体加入水中至200 µl的最终体积。加入三ml冰乙酸,随后加入2 ml在冰乙酸中的0.1%氯化铁。在将样品混合且随后使样品平衡至室温后,吸光度在560 nm处进行读数。由胆固醇标准曲线确定脂质体的胆固醇浓度。
溶血测定
红血细胞的溶血用作在所示实验条件下游离QS-21的相对量和QS-21的毒性两者的量度。根据由独立的机构审查委员会,人类受试者司(Institutional Review Board,Division of Human Subjects)审批的沃尔特里德陆军研究所(Walter Reed ArmyInstitute of Research)方案,人红血细胞购自Research Blood Components LLC(Boston,MA,USA)。红细胞用PBS进行洗涤,并且通过Beckman Coulter计数器型号ACT10(Indianapolis IN,USA)进行定量。在该研究的每个测定中,连同或不连同脂质体一起温育的QS-21的溶血活性在220 μl体积中进行测定,并且测定的每个步骤在室温下(22℃)下执行。一百微升QS-21稀释物与100 μl脂质体、或仅PBS一起在Daigger Rocker(VernonHills,IL,USA)上温育15分钟。在混合脂质体后,将在20 μl PBS中的2 × 107红细胞加入混合物中,并且在Daigger Rocker上温育另外30分钟。板以800 ×g离心6分钟。将上清液转移至聚苯乙烯96孔板中,并且吸光度在541 nm处进行读数。通过与脂质体Chol结合的QS-21的溶血表示为通过游离QS-21的最大限度溶血%。
鲎变形细胞裂解产物测定
鲎变形细胞裂解产物(LAL)测定用作探针,以检查磷脂链长和Chol的摩尔分数对MPLA的脂质体表面表达的作用。含有凝血蛋白质的来自美洲鲎(Limulus polyphemus)(大西洋鲎)血液的变形细胞的裂解产物广泛用作用于检测LPS或脂质A的内毒素活性的替代探针。参见例如Brandenburg等人,2009,Curr. Med. Chem.,16: 2653–2660。尽管鲎蛋白质与之结合的脂质A(或MPLA)的确切分子表位或结构仍未完全明了,但脂质A掺入脂质体双层内极大地掩蔽内毒素和LAL活性。参见例如Harmon等人,1997,Anal. Biochem.,250: 139–146。据信LAL活性的掩蔽是由于脂质A的“鲎反应性”基团在脂质体脂质双层中的隔离,导致鲎蛋白质与脂质A结合的抑制。然而,“鲎阳性”(即反应性)和“鲎阴性”(非反应性)脂质体可以通过将脂质体脂质A的浓度分别改变为更高或更低的量进行制备。参见Richardson等人,1983,Infect. Immun.,39: 1385–1391。与其他脂质体脂质一样,脂质A可以自结合以形成富含脂质A的结构域,并且这些可以是薄层或非薄层的。参见例如Kubiak等人,2011,Biophys. J.,100: 978–986;Brandenburg等人,1998,Chem. Phys. Lipids,91: 53–69。高浓度的脂质体脂质A推测导致自结合或相分离,伴随脂质A的鲎反应性基团的表面可见性增加。
鲎变形细胞裂解产物(LAL)Kinetic-QCL测定购自Lonza(Allendale,NJ,USA)。使用在37℃下的SoftMax Pro Chromo-LAL方案,使用下述参数,在Spectramax M5(MolecularDevices)平台上执行测定:Δt = 150秒,测量滤波器= 405 nm,ΔOD = 0.2,读取数量=40。结果以EU/ml单位呈现。
小鼠的免疫
通过在0、3和6周时在交替的后大腿中注射,雌性Balb/c小鼠(Charles RiverLaboratories,Indianapolis,IN,USA)(5–6周龄;6只/组)用0.05 ml疫苗进行肌内(IM)免疫。四个小鼠组用上文列出的ALF+gp140制剂进行免疫,并且三个组用ALFQ+gp140制剂进行免疫。一个小鼠组不进行免疫,并且用作用于免疫学研究的阴性对照。动物在第一次免疫之前以及初次免疫后3和6周进行放血。在第9周时,动物进行终末放血,并且收集脾。
通过ELISA检测在疫苗接种后的抗体应答
为了确定IgG抗体的终点滴度,将gp140蛋白质(在PBS中0.1 μg/0.1 ml/孔)加入Immulon 2HB平底板(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)中。在4℃下温育过夜后,所有进一步步骤均在室温下进行。板用250 µl在PBS(阻断缓冲液)中的0.5%乳/0.1%Tween 20中阻断2小时。样品以1:400稀释度开始进行连续两倍稀释,并且将100 µl稀释的血清样品加入板中。使板温育1小时,并且用Tris缓冲盐水/0.1% Tween 20洗涤4次。将HRP连接的绵羊抗小鼠IgG(在100 µl阻断缓冲液中0.1 μg)加入每个孔中,并且使板温育1小时,随后洗涤。将一百µl ABTS 2-组分底物(Kirkegaard and Perry Laboratories,Gaithersburg,MD,USA)加入每个孔中,并且使板温育1小时。通过加入100 µl/孔的1% SDS停止显色。吸光度在405 nm处进行读取。终点滴度定义为在其下吸光度为本底两倍的稀释度。
IgG亚型确定由Glenn等人,1995,Immunol. Let. 47: 73-78进行修饰。标准曲线通过使用未缀合的山羊抗小鼠IgG(Fab)进行制备。将一百µl Fab(在PBS中1 µg/ml)加入96孔Immulon 2HB平底板的孔中,并且使板在4℃下温育过夜。板用在PBS中的0.05% Tween 20(洗涤缓冲液)洗涤3次,用250 µl/孔在PBS中的0.5%脱脂乳(阻断缓冲液)进行阻断,并且在室温下(RT)下温育1小时。在洗涤后,将100 µl阻断缓冲液加入每个孔中。纯化的小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3从200 ng/ml阻断缓冲液开始进行两倍稀释。将一百µl每个稀释度加入板中。使板在室温下温育2小时,并且洗涤3次。将一百µl HRP连接的山羊抗小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3(在阻断缓冲液中的1:1000稀释度)加入相应的孔中,并且使板在室温下温育1小时。将板洗涤且加入100 µl ABTS。用100 µl/孔的1% SDS停止显色。吸光度在405nm处进行读数。对于亚类分析,如对于标准ELISA,每组中的合并小鼠血清加入gp140包被的板中。加入HRP连接的山羊抗小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3,并且ELISA连同标准曲线进行。使用标准曲线计算每组的合并血清的免疫球蛋白亚类的浓度。
用于INF-γ和IL-4的酶联免疫斑点测定
使用注射器的活塞,使来自实施安乐死的小鼠的脾按压通过100-μm尼龙细胞滤器(Thomas Scientific,Swedesboro,NJ,USA,目录号4620F05)。脾细胞悬浮液收集在cRPMI培养基中,并且用cRPMI培养基洗涤3次。ELISPOT如Rao等人,2002,J. Virol.,76: 9176-85中所述进行。在收获脾之前,multiScreen 96孔微量滴定板(EMD Millipore,Billerica,MA,USA)用70%乙醇进行预处理,用PBS洗涤3次,并且以100 µl/孔用5 µg/ml在PBS中稀释的捕获IFN-γ特异性IgG或2 µg/ml在PBS中稀释的捕获IL-4特异性IgG进行包被。使板在4℃下温育过夜,随后用cRPMI洗涤2次,并且用200 µl/孔cRMPI在RT下阻断2小时。五十µl小鼠细胞悬浮液(8 × 106细胞/ml)一式两份铺平板,用于每种细胞因子测定。50 µl用于未受刺激细胞的cRPMI或10 µg/ml用于刺激细胞的gp140 CN54、或作为阳性对照的50 µl 10 µg/ml Con-A或作为阴性对照的50 µl 2 µg/ml PHA加入相应的孔中。板在37℃下在CO2温箱中温育18小时。板用含有0.002% Tween 20的PBS(洗涤缓冲液)洗涤3次。将一百µl 2 μg/ml在PBS中的生物素标记的检测INF-γ或IL-4抗体加入每个孔中。板在室温下温育3小时,且随后洗涤3次。将在PBS/5%FCS/ 0.001%Tween)中1:1000稀释的一百µl链霉亲和素-碱性磷酸酶溶液(Southern Biotech,目录号7100-04)加入每个孔中,并且使板在室温下在黑暗中温育1小时。将板洗涤3次,并且加入100 µl/孔的BCIP/NBT生色底物(Kirkegaard & Perry,目录号50-81-07)。在斑点发展后,板用蒸馏水充分冲洗。使用BioReader 3000 ElispotReader(Bio-Sys GmbH,Karben,德国)测量IFN-γ和IL-4生产细胞的频率。数据表示为平均斑点数目。
中和测定
如先前描述的,通过使用基于萤光素酶的病毒中和测定与TZM.bl细胞,测量针对两种tier 1 HIV-1 Env假病毒的中和抗体应答。参见例如Brown等人,2007,J. Virol.,81:2087-91。血清的50%抑制稀释度(ID50)计算为在扣除细胞对照相对发光单位后,与病毒对照孔相比较,导致相对发光单位中的50%减少的血清稀释度。简言之,血清样品在25 μl中的4倍连续稀释度在96孔平底板中在10%达尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)中一式两份地进行测定。将HIV进化枝C、GS015 PV和MW965.26 PV(25 µl)加入每个孔中,并且使板在37℃下温育1小时。随后加入在含有DEAE-右旋糖的10% DMEM中以50 μl体积的TZM.bl细胞(104细胞/孔),并且如先前在Brown等人,2008中所述确定中和抗体滴度。鼠白血病病毒(MuLV)阴性对照包括在所有测定中。
统计分析
使用GraphPad Prism执行统计分析。对于抗体亚型定量,使用S形4参数非线性回归曲线拟合。使用单因素ANOVA、Kruskal-Wallis检验与Dunn’s校正执行多个组之间的统计比较。使用不成对t检验(曼-怀二氏检验)执行列比较分析。
实施例1 - 脂质体Chol对共温育的QS-21的溶血活性的作用的表征
具有QS-21的脂质体组合物的溶血活性首先通过改变QS-21浓度进行表征。简言之,将含有33.7%、43%和55%胆固醇的五十毫摩尔磷脂脂质体混合,并且在室温下与10 μg/ml和50μg/ml QS‐21一起温育20分钟。将红血细胞加入脂质体-QS-21的混合物中,并且温育30分钟。游离QS-21充当阳性对照。将细胞离心并且上清液的光密度在541 nm处进行测量,以反映溶血水平。如图1中呈现的结果提示通过具有QS-21的脂质体组合物的溶血水平取决于脂质体中的胆固醇浓度。
具有QS-21的脂质体组合物的溶血活性通过改变脂质体Chol的摩尔%进一步表征。发现通过QS-21引起的红细胞损害程度与脂质体Chol的摩尔%反相关,所述脂质体Chol已与QS-21一起预温育(图2)。虽然游离QS-21在大约2 μg时引起最大限度溶血,但当QS-21与含有33.7或43摩尔% Chol的脂质体一起预温育时,最大限度溶血在大约4 μg QS-21时出现(图2)。具有55摩尔% Chol的脂质体完全阻断最高达200 μg的QS-21的溶血效应(图2)。对于含有不同浓度的皂苷的脂质体组合物观察到类似结果(图3)。当脂质体含有55摩尔%胆固醇时,对于最高达500 μg/ml皂苷未检测到溶血。
实施例2 – QS-21和脂质体Chol之间的相互作用的表征
QS-21与含有0.127 μmol总磷脂和50摩尔% Chol的DMPC/DMPG/Chol脂质体的结合与还含有0.025 μmol MPLA 的相同脂质体(DMPC/DMPG/Chol/MPLA)相比较。简言之,QS-21与脂质体一起预温育,所述脂质体由总共0.127 μmol磷脂(DMPC/DMPG,9/1)、50摩尔% Chol组成,且缺乏或含有MPLA、(L)或L(MPLA)(MPLA:磷脂 = 1:5.6)。随后测量溶血活性。如图4中所示,不含MPLA(L)的50摩尔% Chol脂质体仅在25 μg QS-21的浓度时达到100%溶血。对于具有MPLA的脂质体(L(MPLA)),溶血在5 μg QS-21时达到最大限度水平,这类似于游离QS-21的溶血曲线。因此明确的是当与缺乏MPLA的那些脂质体相比较时,50% Chol在含有MPLA的脂质体中对于QS-21较不可见。
含有0.114 μmol磷脂酰胆碱,分别由DMPC、DPPC和DSP连同0.0127 μmol DMPGC组成,且含有33.7%或55% Chol连同或不连同2.85 nmol MPLA的三种脂质体组合物与QS-21一起预温育(图5)。随后评估溶血活性。如图5中所示,对于最高达10 μg QS-21,很少的QS-21或无QS-21与具有33.7摩尔% Chol的DMPC、DPPC或DSPC脂质体结合。然而,使脂质体Chol增加至55%(图5B)增加QS-21与DSPC脂质体且尤其是DMPC脂质体中的Chol的结合。相比之下,具有55% Chol的DPPC脂质体比DMPC或DSPC脂质体结合少得多的QS-21(图5B)。MPLA的存在抑制QS-21与具有55% Chol的DMPC脂质体的结合,但不抑制与DPPC或DSPC脂质体的结合(图5C)。
此外,通过使用QS-21作为探针检测从含有66% Chol的脂质体到缺乏Chol的脂质体的Chol转移(图6)。QS-21与[L(0% Chol)+ L(66% Chol)]的预温育导致QS-21的溶血活性在QS-21与L(0% Chol)或L(66% Chol)分开预温育后观察到的溶血活性中间(图6A)。QS-21与含有MPLA且含有或缺乏Chol的脂质体的相等混合物 [L(0% Chol + MPLA)+ L(66% Chol+ MPLA)]的预温育还导致由于QS-21的中等水平的溶血(图6B)。然而,当与缺乏MPLA的脂质体[L(0%Chol)+ L(66%Chol)](图6A)相比较时,图6B中所示的[L(0% Chol + MPLA)+ L(66%Chol + MPLA)]的曲线朝向更大的溶血活性转变。因此明确的是脂质体中MPLA的存在抑制脂质体之间的Chol转移或屏蔽脂质体的混合物中的Chol的可见性。
实施例3 - 通过增加脂质体Chol的量压制DMPC/DMPG/Chol/MPLA脂质体的鲎变形细胞裂解产物识别
对于含有不同量的Chol的DMPC/DMPG/Chol/MPLA脂质体进行鲎变形细胞裂解产物(LAL)测定。图7A显示通过LAL测定检测到含有33.7摩尔% Chol的DMPC/DMPC/Chol/MPLA、DPPC/DMPC/Chol/MPLA或DSPC/DMPC/Chol/MPLA脂质体中的MPLA。在含有33.7% Chol的脂质体中通过LAL的MPLA识别与磷脂酰胆碱的饱和脂肪酰基链的长度成比例,其中LAL结合以DSPC > DPPC > DMPC的次序。然而,在55摩尔% Chol时,LAL检测脂质体各自中的MPLA的能力急剧减少(图7B)。
实施例4 - 包含L(MPLA)和皂苷的制剂的佐剂效力的表征
为了测试脂质体尺寸对佐剂效力的作用,构建各自是ALF脂质体类型(即含有MPLA)的大MLV和SUV。如图8中所示,基于光散射分析,ALF SUV颗粒的直径尺寸范围为50至100 nm,并且ALF MLV为1至4 µm。尽管关于MLV的后面这个结果指示光散射分析检测许多大颗粒,但MLV还含有在双曲线分布中的众多小颗粒,如通过电子粒径分析显示的。参见例如Alving等人,1975,Biochim. Biophys. Acta.,394: 157-65。因此,使用光散射分析,存在于MLV中的小颗粒被大颗粒遮蔽。在任何情况下,每个测量的颗粒群体是狭窄的且仅具有一个中值峰。在ALF SUV的情况下,这指示均质群体的存在。即使在高MPLA:磷脂比率时,ALF SUV也形成小颗粒的单一分布。然而,与缺乏QS-21的脂质体形成对比,与初始ALF颗粒是SUV还是MLV无关,所有含有QS-21的ALF脂质体(ALFQ)的中值大小在微米范围内进行测量(图8B)。如上所示,这不排除小颗粒的同时群体的可能性。在ALFQ颗粒的总体尺寸范围内,出现具有略微不同的中值尺寸的大ALFQ的独特个别亚群,取决于MPLA:磷脂比率(图8B)。
抗体生产由免疫的小鼠进行测量,使用如材料与方法中所述的各种组合物,并且结果在图9中汇集。如图9A中所示,含有以1:88比率的MPLA:磷脂比率的ALF SUV以统计上显著的方式在小鼠中诱导比具有相同MPLA:磷脂比率的ALF MLV更高的IgG抗gp140结合抗体生产。具有1:5.6的MPLA:磷脂比率的ALF SUV诱导更高滴度的结合抗体。图9B显示所有ALFQ佐剂化的制剂均诱导比ALF MLV佐剂化的制剂中的任一种显著更高的针对gp140的结合抗体。所有ALFQ佐剂化的组中的总gp140特异性IgG结合抗体水平看起来不依赖于脂质体的大小或相对磷脂浓度。
进行IgG亚型测定以进一步表征抗体生产。用ALF + gp140免疫的所有小鼠组揭示中等或高滴度的针对gp140的IgG1结合抗体(图10A)。ALF MLV诱导占优势的IgG1亚类,而ALF SUV诱导IgG1和IgG2a生产之间的平衡,并且还诱导IgG2b生产。增加MPLA:磷脂比率导致所有亚类的更高的抗体应答(图10A)。如图10B中所示,在ALFQ组中,IgG1的血清浓度恒定很高;并且所有亚型均被诱导,但这些不依赖于最初用于制备ALFQ的ALF SUV或ALF MLV的MPLA:磷脂比率。
为了比较Th1相对于Th2免疫应答,对来自用佐剂化gp140免疫的小鼠的新鲜分离的脾淋巴细胞执行ELISPOT分析。如图11中所示,所有ALF佐剂化的制剂均诱导IFN-γ生产脾淋巴细胞的增殖,其比用首次用于实验的对照观察到的更高。ALFQ制剂诱导比ALF显著更高数目的IFN-γ阳性细胞(图11A)。所有免疫小鼠均显示出高IL-4生产,其显著高(p<0.0001)于首次用于实验的小鼠(图11B)。在免疫组中未观察到IL-4生产细胞数目的显著差异。考虑到上述结果,看起来ALFQ脂质体引起IFN-γ分泌的独特诱导,其不依赖于MPLA:磷脂比率。因此,ALFQ脂质体可能是用于诱导Th1型免疫的潜在有用的佐剂。
尽管针对HIV-1包膜蛋白的非中和结合抗体据报道与III期功效试验中的保护关联,但中和抗体广泛视为对于针对HIV-1的预防疫苗是重要的。由于这点,检查ALF和ALFQ充当诱导针对模型gp140包膜蛋白的中和抗体的佐剂的能力。小鼠组的合并血清样品针对两列1,进化枝C HIV初级分离物进行测试。如图12中所示,一个ALF佐剂化和两个ALFQ佐剂化的疫苗组诱导以高ID50中和MW965.26PV(图12A)和GS015PV(图12B)两者的抗gp140抗血清。具有1:5.6的MPLA:磷脂比率的ALF诱导最高的中和滴度,而具有1:88和1:220的MPLA:磷脂比率的ALFQ也诱导中和抗体,但具有略微更低的滴度。
Claims (22)
1.一种佐剂制剂,其包含含有单磷酰脂质A(MPLA)的脂质体组合物和至少一种皂苷,其中所述脂质体组合物包含i)包含磷脂的脂质双层,其中烃链具有在水中≥ 23℃的熔融温度,和ii)以大于约50%(摩尔/摩尔)的摩尔百分比浓度的胆固醇。
2.权利要求1的佐剂制剂,其中所述皂苷选自QS-7、QS-18、QS-21或其混合物。
3.权利要求1或权利要求2的佐剂制剂,其中所述皂苷是QS-21。
4.权利要求1-3中任一项的佐剂制剂,其中所述脂质体组合物包含以约55%至约71%(摩尔/摩尔)的摩尔百分比浓度的胆固醇。
5.权利要求1-4中任一项的佐剂制剂,其中所述脂质体组合物包含以约55%(摩尔/摩尔)的摩尔百分比浓度的胆固醇。
6.权利要求1-5中任一项的佐剂制剂,其中所述脂质体包含选自下述的磷脂酰胆碱(PC):二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)。
7.权利要求6的佐剂制剂,其中所述脂质体组合物进一步包含选自下述的磷脂酰甘油(PG):二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)和二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)。
8.权利要求7的佐剂制剂,其中所述PC与所述PG的比率(摩尔/摩尔)为约0.5:1、约1:1、约2:1、约3:1、约4:1、约5:1、约6:1、约7:1、约8:1、约9:1、约10:1、约11:1、约12:1、约13:1、约14:1或约15:1。
9.权利要求1-8中任一项的佐剂制剂,其中所述脂质体组合物包含约5 mg或更少、约4mg或更少、约3 mg或更少、约2 mg或更少、约1 mg或更少、约0.9 mg或更少、约0.8 mg或更少、约0.7 mg或更少、约0.6 mg或更少、约0.5 mg或更少、约0.4 mg或更少、约0.3 mg或更少、约0.2 mg或更少、约0.1 mg或更少、约0.09 mg或更少、约0.08 mg或更少、约0.07 mg或更少、约0.06 mg或更少、约0.05 mg或更少、约0.04 mg或更少、约0.03 mg或更少、约0.02mg或更少、或者约0.01 mg或更少的MPLA(总重量/ml脂质体悬浮液)。
10.权利要求1-9中任一项的佐剂制剂,其中所述脂质体组合物具有约1:5.6至约1:880、或约1:88至约1:220的MPLA:磷脂摩尔比。
11.权利要求1-10中任一项的佐剂制剂,其中所述皂苷的含量(总重量/ml脂质体悬浮液)为约1 mg或更少、约0.9 mg或更少、约0.8 mg或更少、约0.7 mg或更少、约0.6 mg或更少、约0.5 mg或更少、约0.4 mg或更少、约0.3 mg或更少、约0.2 mg或更少、约0.1 mg或更少、约0.09 mg或更少、约0.08 mg或更少、约0.07 mg或更少、约0.06 mg或更少、约0.05 mg或更少、约0.04 mg或更少、约0.03 mg或更少、约0.02 mg或更少、或者约0.01 mg或更少。
12.权利要求1-11中任一项的佐剂制剂,其中所述脂质体组合物包含多层囊泡(MLV)或小单层囊泡(SUV),其中小单层囊泡为直径约50至约100 nm,并且其中多层囊泡为直径约1至约4 µm。
13.一种免疫原性组合物,其包含免疫原和权利要求1-12中任一项的佐剂制剂。
14.权利要求13的免疫原性组合物,其进一步包含生理学上可接受的媒介物。
15.权利要求13或权利要求14的免疫原性组合物,其中所述免疫原选自天然存在或人工制造的蛋白质、重组蛋白质、糖蛋白、肽、碳水化合物、半抗原、全病毒、细菌、原生动物和病毒样颗粒。
16.权利要求15的免疫原性组合物,其中所述免疫原是HIV-1包膜蛋白。
17.一种使动物免疫的方法,其包括施用权利要求13-16中任一项的免疫原性组合物。
18.一种减少皂苷作为佐剂的毒性或制备佐剂制剂的方法,其包括将含有单磷酰脂质A(MPLA)的脂质体组合物加入所述皂苷中,其中所述脂质体组合物包含i)包含磷脂的脂质双层,其中烃链具有在水中≥ 23℃的熔融温度,和ii)以大于约50%(摩尔/摩尔)的摩尔百分比浓度的胆固醇。
19.权利要求18的方法,其中所述皂苷选自QS-7、QS-18、QS-21及其混合物。
20.权利要求18或权利要求19的方法,其中所述皂苷是QS-21。
21.权利要求18-20中任一项的方法,其中所述脂质体组合物包含以约55%至约71%(摩尔/摩尔)的摩尔百分比浓度的胆固醇。
22.权利要求18-21中任一项的方法,其中所述脂质体组合物包含以约55%(摩尔/摩尔)的摩尔百分比浓度的胆固醇。
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