JP2007308472A - オリゴ糖を表面に有するリポソームを含むアレルギー治療剤 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明の課題はアレルゲン投与によるアレルギー治療法（減感作療法）において、治療効果の向上を実現し、アナフィラキシーなどの副作用が改善されたアレルギー治療剤を提供することである。
【解決手段】抗原提示細胞由来のレクチンに結合することができ、かつ２〜１１個の糖残基から成るオリゴ糖を表面に有するリポソームを含む治療剤であって、前記リポソームにアレルゲンが内封されてなることを特徴とするアレルギー治療剤。
【選択図】なし

Description

本発明は、抗原提示細胞由来のレクチンに結合するオリゴ糖を表面に有するリポソームにアレルゲンなどを封入したアレルギー治療剤に関する。

スギ花粉症などのアレルギーの患者の治療には抗ヒスタミン薬、ケミカルメディエイター遊離抑制薬、ＴＸＡ２受容体拮抗薬、ＬＴ拮抗薬、ステロイド薬などが主に用いられているが、何れも根本治癒には至らない対症療法薬に過ぎない。

一方で微量のアレルゲン（スギ花粉エキスなど）をアレルギー治療薬として１〜２週に一度の頻度で皮下注射し、それを反復しつつ徐々に負荷量を増大させ、最終的にアレルゲン（スギ花粉など）に対する症状の発症を抑える根本治療として、減感作療法がある。しかしながら、従来のアレルゲンのみを成分とするアレルギー治療薬は作用が弱く、有効率が低いことや、効果を得るまでに数年間もの長い期間にわたって投与が必要であることから、根本治療法であるにも拘わらず臨床で利用される割合が低い。また、アレルギー患者にアレルゲンを投与することから、患者のＩｇＥが増加したり、アナフィラキシーが生じうるなどの副作用の問題がある（本発明の実施例においても、アレルゲン単独投与により、逆にアレルギー反応が増強されることを確認している）。これらアレルギー治療薬の問題点を克服したアレルギー治療薬の有用性は極めて高い。

減感作療法におけるアレルギー治療のメカニズムは不明であるが、抗原刺激に対するＴｈ２細胞からのサイトカイン産生を特異的に抑制し（Ｔｈ２反応とＴｈ１反応のバランス改善）、アレルギー症状の原因となる抗原特異的なＩｇＥの産生を抑制（イムノグロブリンクラス産生バランスの改善）することができれば、有用性が向上することが期待できると考えられている。したがって、抗原により免疫を誘導するという概念上は共通するものの、液性免疫および細胞性免疫を誘導することにより有効性の向上が期待できるワクチン療法とは根本的に発想を異にするものである。

Ｕｃｈｉｄａらは表面にアレルゲンを結合したリポソームを投与することでＩｇＥの産生抑制が得られることを見いだしている（非特許文献１）。しかしながらリポソーム表面にアレルゲンが露出していることからアナフィラキシーなどの副作用の懸念がある。また、Ｇａｎｇａｌらには、アレルゲンをリポソームに内封することでアナフィラキシーを抑制しつつ、アレルゲン特異的なＩｇＥの産生抑制やＩｇＧ産生誘導効果が得られること（非特許文献２）が開示されているが、マンノース受容体を介して抗原提示細胞に取り込まれる本発明のリポソームの有用性をなんら類推させるものではない。また、一般的なリポソームにアレルゲンを封入したアレルギー治療（減感作療法）薬の効果は、依然、不十分であり、このことは本発明者らが動物実験で確認している通りである（後記する実施例５および６参照）。

ワクチンや免疫療法などのアジュバントとして開発されたマンナンのような高分子多糖体にて被覆したリポソームには、強い細胞性免疫誘導能のあることが報告されている（特許文献１、非特許文献３）。しかし、マンナンは異なる大きさのポリマンノースの混合物であり、また、生体に強い毒性を示すことが知られているため（非特許文献４）医薬品としては不向きである。すなわち、マンナンはマンノース残基が５０〜１００個よりなる大きな多糖体で、分子量の点でも不均一であり、また糖の結合様式など構造的にも未知である。この多糖体は、動物に接種すると抗体を産生し（抗原性を有する）、また、上述したように強い毒性のあることも知られている。

一方で、水落らは２〜１１個の糖残基から成り抗原提示細胞由来のレクチンに結合するオリゴ糖を表面に有するリポソームに抗原を封入することで、糖の毒性や抗原性を除き、ワクチンとしての効果が高まることを報告している（特許文献２）。また、この特許文献２においては、オリゴ糖を表面に有するリポソームに封入された抗原に対する細胞性免疫が効率良く誘導できることも開示されている。

オリゴ糖を表面に有するリポソームはマンノース受容体を介して抗原提示細胞に貪食され、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子を介して抗原を提示することにより、抗原特異的なＴ細胞の活性化やＴｈ１由来サイトカインを誘導すると考えられている。しかしながら、マンノース受容体およびＭＨＣ分子を介した免疫反応の誘導はＴｈ１型の免疫応答だけを誘導するとは限らず、マンノース受容体およびＭＨＣクラスＩＩ分子を介する抗原提示においてＴｈ２由来サイトカインを誘導することが知られている（非特許文献５、非特許文献６）。アレルギー患者においては、アレルゲンに対するＴｈ２反応が見られることから、特許文献２のオリゴ糖を表面に有するリポソームを減感作療法をはじめとするアレルギー治療に応用することが有用性の向上につながるかどうかについては、疑問視されていた。

また、アレルギーの治療において最も重要であるＩｇＥ産生抑制は細胞性免疫を担うＴｈ１型応答の誘導に必ずしも直結していないことが知られていることからも（非特許文献７）、オリゴ糖を表面に有するリポソームがＩｇＥ産生を抑制する効果を有するかどうかは不明であった。

国際公開第９２／０４８８７号パンフレット 特許第２８２８３９１号公報 Ｕｃｈｉｄａら Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２ １６９：４２４６−４２５２ Ｇａｎｇａｌら Ａｓｉａｎ Ｐａｃ Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８ １６：８７−９１ Ｎｏｇｕｃｈｉら Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８９ １４３：３７３７−３７４２ Ｍｉｋａｍｉら 第１５回糖質シンポジウム抄録、１９９３ ４３−４４ Ａｐｏｓｔｏｌｏｐｏｕｌｏｓら Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９５ ９２（２２）:１０１２８−１０１３２ Ａｐｏｓｔｏｌｏｐｏｕｌｏｓら Ｖａｃｃｉｎｅ．１４（９）：９３０−９３８． Ｕｃｈｉｄａら Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ Ｉｍｍｕｎｅ Ｅｎｄｏｃｒ Ｍｅｔａｂｏｌ Ｄｉｓｏｒｄ．２００３ ３：１１９−１３５

本発明の課題はアレルゲン投与によるアレルギー治療法（減感作療法）において、治療効果の向上を実現しアナフィラキシーなどの副作用が改善されたアレルギー治療剤を提供することである。

本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、抗原提示細胞由来のレクチンに結合するオリゴ糖を表面に有するリポソームにアレルゲンを封入することで、アレルゲンに対するＴｈ１型反応とＴｈ２型反応の高度なバランス改善効果、及び高いＩｇＥ産生の抑制効果、が得られることを見いだした。また、同リポソームにアレルゲンを封入することでイムノグロブリンとの反応が抑えられることも見いだした。本発明は、係る知見に基づくものである。

本発明によれば、下記のものが提供される。
〔１〕 抗原提示細胞由来のレクチンに結合することができ、かつ２〜１１個の糖残基から成るオリゴ糖を表面に有するリポソームを含む治療剤であって、前記リポソームにアレルゲンが内封されてなることを特徴とするアレルギー治療剤。
〔２〕 オリゴ糖が３〜５個の糖残基から成るものである、〔１〕に記載の治療剤。
〔３〕 オリゴ糖がマンノースを含む糖残基から成るものである、〔１〕ないし〔２〕のいずれかに記載の治療剤。
〔４〕 アレルゲンが花粉抗原である、〔１〕ないし〔３〕のいずれかに記載の治療剤。
〔５〕 花粉抗原がスギ花粉抗原である、〔４〕に記載の治療剤。
〔６〕 〔１〕ないし〔５〕のいずれかに記載の治療剤を含み、皮下、皮内、または経鼻投与により処置するためのアレルギー治療剤。
〔７〕 抗原提示細胞由来のレクチンに結合することができ、かつ２〜１１個の糖残基から成るオリゴ糖を表面に有するリポソームであって、花粉抗原が内封されてなることを特徴とするリポソーム。
〔８〕 オリゴ糖が３〜５個の糖残基から成るものである、〔７〕に記載のリポソーム。
〔９〕 オリゴ糖がマンノースを含む糖残基から成るものである、〔７〕ないし〔８〕のいずれかに記載のリポソーム。
〔１０〕 花粉抗原がスギ花粉抗原である、〔７〕ないし〔９〕のいずれかに記載のリポソーム。

本発明で提供されるアレルギー治療剤は、高い治療効果を有すると同時に副作用の危険性が低減されている。そのため、減感作療法に用いることにより、従来の減感作療法と異なり、短期間で高率かつ安全なアレルギーの根本治癒が可能となる。

本発明のアレルギー治療剤は、抗原提示細胞由来のレクチンに結合することができ、かつ２〜１１個の糖残基から成るオリゴ糖を表面に有するリポソームを含む治療剤であって、前記リポソームにアレルゲンが内封されてなることを特徴とする。

本発明において、リポソームとは、脂質で形成された内部に空洞を有する分子を意味する。
本発明においてリポソームは、多重層タイプ（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）であってもよく、また単層タイプ（ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）であってもよい。これらは既知の常法に従って作製することができ、また常法に従って一方のタイプを他方のタイプに、例えば多重層タイプのリポソームを単層タイプのリポソームに転換することもできる。本発明において用いられるリポソームの粒径は特に限定されないが、必要により常法に従って、例えば所望の孔サイズのフィルターにより濾過することにより、粒径を整えることができる。好ましい粒径は５０ｎｍ〜３μｍである。

本発明で用いる抗原提示細胞由来のレクチンに結合することができ、かつ２〜１１個の糖残基から成るオリゴ糖を表面に有するリポソームはその表面に、抗原提示細胞由来のレクチンを結合することができ、且つ２〜１１個の糖残基から成るオリゴ糖を有している。このリポソームを、本発明においてはオリゴ糖リポソームと称する場合がある。ここで、抗原提示細胞は、マクロファージ、デンドリティック細胞等を意味する。また、抗原提示細胞由来のレクチンとは、上記のごとき抗原提示細胞の表面に存在するレクチン、例えばマンノース・レセプター等を意味する。本発明において、２〜１１個の糖残基から成るオリゴ糖は、上述のレクチンと結合する性質を有するものを適宜選択することができる。オリゴ糖を構成する糖残基としては、Ｄ−マンノース（Ｄ−Ｍａｎ）、Ｌ−フコース（Ｌ−Ｆｕｃ）、Ｄ−アセチルグルコサミン（Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ）、Ｄ−グルコース（Ｄ−Ｇｌｃ）、Ｄ−ガラクトース（Ｄ−Ｇａｌ）、Ｄ−アセチルガラクトサミン（Ｄ−ＧａｌＮＡｃ）、Ｄ−ラムノース（Ｄ−Ｒｈａ）などの単糖が挙げられ、これらの混合オリゴ糖を用いることができるが、中でもＤ−マンノースを含む糖残基から成るものが好ましく、中でもＤ−マンノースから成るものやＤ−マンノースとＤ−アセチルグルコサミンとからなるものが好ましく、特にＤ−マンノースから成るものが好ましい。Ｄ−マンノースから成るオリゴ糖としては、マンノビオース（Ｍａｎ２）、マンノトリオース（Ｍａｎ３）、マンノテトラオース（Ｍａｎ４）、マンノペンタオース（Ｍａｎ５）、マンノヘキサオース（Ｍａｎ６）、マンノヘプタオース（Ｍａｎ７）を挙げることができる。オリゴ糖を構成する各糖残基の結合様式としては、α１→２結合、α１→３結合、α１→４結合、α１→６結合、β１→４結合等を挙げることができ、これらのうち１種類或いは複数種類が含まれていてもよい。また、各糖残基は１つずつ直鎖状に結合していてもよいし、１つの残基に２つ以上の糖鎖が結合しいわゆる枝状に結合しているものであってもよい。糖残基の数は、２〜１１個であり、好ましくは３〜１１個、中でも３〜５個である。より具体的には、下式で示される構造からなるＭ３（式（１））、Ｍ５（式（２））およびＲＮ（式（３））などを挙げることができ、このうち好ましいものはＭ３（式（１））及びＭ５（式（２））であり、中でも好ましくはＭ３（式（１））である。尚、下記の式（３）において、式中、α１→２結合しているマンノース（Ｍａｎ）は、それぞれ独立に、存在してもよく存在しなくてもよい。

リポソームの量に対するオリゴ糖の量はオリゴ糖の種類、封入しようとするアレルゲンの種類、リポソームの組合せ構造等により異なるが、一般に、リポソームを構成する脂質１ｍｇに対して０．５μｇ〜５００μｇである。

リポソームを構成する脂質は、リポソームを構成することが知られている通常の脂質であればよく、これらを単独でまたは複数組み合わせて使用することができる。そのような脂質としては、例えば、卵黄、大豆、またはその他の動植物などの天然物由来の脂質やこれらを水素添加によって不飽和度を低下したもの、あるいは化学合成したものが挙げられる。より具体的には、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、３β−［Ｎ−（ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、Ｎ−（トリメチルアンモニオエチル）カルバモイルコレステロール（ＴＣ−Ｃｈｏｌ）などのステロール類；ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）などのホスファチジルエタノールアミン類；ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）などのホスファチジルコリン類；ジパルミトイルホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ）、ジステアロイルホスファチジルセリン（ＤＳＰＳ）などのホスファチジルセリン類；ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、ジステアロイルホスファチジン酸（ＤＳＰＡ）などのホスファチジン酸類等が挙げられる。尚、ここで例示した化合物名の後ろの（ ）内のアルファベットは、各化合物の略号であり、以下これらの略号を使用する。

リポソームへの上記のオリゴ糖の導入にあたっては、後述のように、上記のオリゴ糖と脂質を結合して調製した人工糖脂質を用いることができる。人工糖脂質の調製方法としては、上記のオリゴ糖を用いる場合を例に取ると以下の方法を例示することができる。上記のオリゴ糖は、いずれも１個の還元末端アルデヒド基を有する。そこで、このアルデヒド基を、オリゴ糖をリポソーム表面に導入するため、アミノ基を有するリン脂質と反応させてシッフ塩基を形成し、次にこのシッフ塩基を、常法に従って、還元、好ましくは化学還元、例えばＮａＢＨ₃ＣＮにより還元することにより、オリゴ糖と、脂質とを結合することができる（水落次男、糖質工学、２２４−２３２頁、産業調査会バイオテクノロジー情報センター、１９９２）。ここで、脂質としては、上述のリポソームを構成する脂質を用いることができ、特にリン酸エステル及びＣ−Ｐ結合を含むものを好ましく用いることができる。また、結合する脂質は必ずしもリン酸を含む必要はなく、ステロールなどの脂質も用いることができる。このようにして得られた、オリゴ糖と脂質との結合物を、本発明においては人工糖脂質と称する。

オリゴ糖をリポソームの表面に導入するためには、例えば前記の人工糖脂質を利用する場合には次の２つの方法のいずれかによることができる。前記の人工糖脂質が水溶性で有機溶剤に十分溶解しない場合、例えば、人工糖脂質として前記のＲＮとＤＰＰＥとの結合物（ＲＮ−ＤＰＰＥ）を用いるときには、これら（ＲＮ−ＤＰＰＥ）の水性溶液を調製し、これを形成されたリポソームと混合して、例えば４℃ないし８０℃（好ましくは内封物質が変性しない温度）、室温もしくは相転移温度において０．５〜１２０時間、例えば約２４時間インキュベーションすればよい。他方、人工糖脂質が有機溶剤に溶解する場合には、当該人工糖脂質を、リポソーム構成用脂質と共に、リポソーム製造過程において前記のごとき有機溶剤に溶解し、以後、常法に従ってリポソームを形成すればよい。尚、オリゴ糖がリポソーム表面に結合していることは、糖に該当するレクチンを添加してリポソームの凝集反応で調べることができる。

本発明のアレルギー治療剤は、リポソームにアレルゲンが内封されてなることを特徴とする。内封されるアレルゲンの量は、リポソームに用いる脂質１ｍｇに対して０．１μｇ〜５００μｇであることが望ましいが、特に限定されず、投与経路などによって適宜調節することが可能である。内封されるアレルゲンの形態は特に限定されず、精製した天然のアレルゲン、合成ペプチド、組み換えタンパク質、粗抽出物、多糖・糖鎖、これらの混合物、分解物、修飾物で有り得る。また、アレルゲンは天然物及び合成物に限らず、分解断片、組換えタンパク質、Ｔ細胞エピトープを含むペプチド、合成ペプチドを含む。

アレルゲンの種類は、アレルギーの原因となる物質であれば特に限定されない。具体的には樹木花粉アレルゲン、草花粉アレルゲン、ダニアレルゲン、ハウスダスト、動物アレルゲン、食品アレルゲンなどを含むが、これに限るものではなく、新たに同定されたアレルゲンも含む。これらの中ではスギ花粉、ブタクサ、カモガヤ、ヨモギ等の花粉類、米、小麦、ソバ、牛乳、卵黄、卵白等の飲食品類、犬毛、猫毛、羽毛等の表皮類、カンジダ、アスペルギルス等の真菌類などのアレルギー抗原が好ましく使用できる。このうち代表的なものとしては花粉のアレルギー抗原（花粉抗原）、特にスギ花粉のアレルギー抗原（スギ花粉抗原）を挙げることができる。

アレルゲンの調製は、アレルゲンを含む天然物、例えば花粉から一般的なカラムワークで精製を行う方法によることができ、さらに得られたアレルゲンの糖鎖除去部分分解、修飾等の工程を適宜追加して行ってもよい。大腸菌などの微生物や動物細胞、植物を使用し、アレルゲン遺伝子全体を導入・発現して組み換えタンパク質を調製する方法、或いは部分配列や、Ｔ細胞エピトープを含むペプチド断片をタンパク質工学的に、或いはペプチド合成により作製してもよい。

本発明のアレルギー治療剤をスギ花粉症患者の治療薬として用いる場合に、オリゴ糖リポソームに内封されるのに適したアレルゲンはスギ花粉抽出物、またはＣｒｙｊ １抗原、Ｃｒｙｊ ２抗原、若しくは新たに精製されたスギ花粉抗原、若しくはこれらの混合物であり得る。このうち、特にスギ花粉抽出物及びＣｒｙｊ １抗原が好ましい。

本発明において、アレルゲンの内封されたリポソームの作製には、公知の方法、例えばＤ．Ｗ．Ｄｅｅａｍｅｒ，Ｐ．Ｓ．Ｕｓｔｅｒ，“Ｌｉｐｏｓｏｍｅ”ｅｄ．ｂｙ Ｍ．Ｊ．Ｏｓｔｒｏ，ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．Ｂａｓｅｌ，１９８３，ｐ２７〜記載の方法（ボルテックス法および超音波法）、エタノール注入法、エーテル法、逆相蒸発法などが適用でき、これらを組み合せて適用することも可能である。

本発明のアレルギー治療剤は、上記のようにアレルゲンが内封されてなるリポソームを含むことから、該治療剤をアレルギー患者に投与することによって、リポソームに内封されたアレルゲンに対するアレルギー症状を治療または予防することができる。本発明の有用性は、実施例記載の方法、非特許文献１、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉらの方法（Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １９８９ ８９：１３６−１４２）によって確認することができるが、必ずしもこれらに限定されない。本発明を適用するアレルギー疾患とは、通常、樹木花粉アレルゲン、草花粉アレルゲン、ダニアレルゲン、ハウスダスト、動物アレルゲン、食品アレルゲン等のアレルゲンによって鼻炎、皮膚炎、結膜炎、気管支炎、咳、くしゃみなどの症状が誘発される疾患である。具体的には、スギ花粉、ブタクサ、カモガヤ、ヨモギ等の花粉類、米、小麦、ソバ、牛乳、卵黄、卵白等の飲食品類、犬毛、猫毛、羽毛等の表皮類、カンジダ、アスペルギルス等の真菌類などのアレルゲンによって鼻炎などの症状が誘発される疾患であるが、特に限定はされず、新たに同定されたアレルゲンによって誘発されるアレルギー疾患も含まれる。これらの中でも特に好ましいアレルギー疾患は花粉アレルギー症であり、代表的なものとしてスギ花粉による花粉アレルギー症を挙げることができる。

本発明のアレルギー治療剤の患者への投与は、生理食塩水などのバッファーへのけん濁液、もしくは自体公知の薬理学に許容される担体、賦形剤などと混合した医薬組成物として経口または非経口に投与することができる。非経口投与の場合の投与方法として、好ましくは、皮下、皮内、筋肉注射が用いられる。非経口投与のための剤型としては、例えば、点眼剤、軟膏剤、注射剤、湿布剤、坐薬、経鼻吸収剤、経肺吸収剤、経皮吸収剤、局所徐放剤などがあげられる。製剤中に安定化剤としてヒト血清アルブミン、ヒト免疫グロブリン、α２ マクログロブリン、アミノ酸、糖類などを添加することができ、また分散剤あるいは吸収促進剤として生理活性を損なわない範囲でアルコール、糖アルコール、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤などを添加することができる。また、微量金属や有機酸塩も必要に応じて加えることができる。また、本発明はアレルギーの対症療法薬との併用が可能である。本発明のアレルギー治療剤における１回の投与量は、一般にはアレルゲンの量として１ｐｇ〜２００μｇの範囲で適宜定めることができるが、必ずしも限定されるものではなく、患者の症状、投与経路、投与間隔などにより適宜選択される。

以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、これらはあくまでも例示するためのものであり、いかなる意味においても本発明を限定するものではない。

実施例１：人工糖脂質の調製
Ｍａｎα１→６（Ｍａｎα１→３）Ｍａｎという構造を有するマンノトリオース（Ｍａｎ３）２．５〜５ｍｇに６００μｌの蒸留水を加えて攪拌溶解してオリゴ糖溶液を調製した。他方、クロロホルム／メタノール（１：１体積比）混合液にＤＰＰＥを５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解してＤＰＰＥ溶液を調製した。また、メタノールに、ＮａＢＨ₃ＣＮを１０ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解してＮａＢＨ₃ＣＮ溶液を調製した。前記オリゴ糖溶液６００μｌに前記ＤＰＰＥ溶液９．４ｍｌ及び前記ＮａＢＨ₃ＣＮ溶液１ｍｌを加えて攪拌混合した。この反応混合液を６０℃にて１６時間インキュベートし、人工糖脂質を生成せしめた。この反応混合液をシリカゲルカラム及びＣ１８逆相カラムにより精製することにより人工糖脂質Ｍ３−ＤＰＰＥを得た。

実施例２：抽出エキスの調製、及びアレルゲンの精製
スギ花粉抽出エキスの調製、及びスギ花粉症の主要アレルゲンのＣｒｙｊ １の精製は、公知の方法（Ｈ．Ｙａｓｕｅｄａ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｅｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７１，７７−８６，Ｍ．Ｓａｋａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（１９９０），４５，３０９−３１２）に準じて実施した。スギ花粉１５０ｇから０．１２５Ｍ炭酸水素ナトリウムで抽出を行い、硫酸アンモニウムを加えて濃縮した。硫酸アンモニウム沈殿をＰＢＳ（−）に対して透析したものをスギ花粉抽出エキスとして使用した。Ｃｒｙｊ １の精製は硫酸アンモニウム沈殿を０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．８に対して透析し、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムの素通り画分を回収し、１０ｍＭ Ａｃｅｔａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ５．０に透析後、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘに吸着させ、溶出は０．１Ｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ７．２，０．３Ｍ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡで行い、スギ花粉主要抗原（ＳＢＰ）を得た。ＳＢＰを０．１Ｍ Ａｃｅｔａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ５．０で透析後、Ｍｏｎｏ Ｓカラムを用いてＳＢＰからＣｒｙｊ １とＣｒｙｊ ２を分離し、最終的に精製Ｃｒｙｊ １ １２ｍｇが得られた。

実施例３：Ｃｒｙｊ １あるいはスギ花粉抽出エキス封入リポソームの調製
コレステロール、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、実施例１で作製したマンノトリオースジパルミトイルホスフファチジルエタノールアミン（Ｍ３−ＤＰＰＥ）をモル比で１０：１０：１、あるいは、コレステロール、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）をモル比１：１で混合し、クロロホルム２ｍｌに溶解し、１０ｍｌのナシフラスコ内で脂質フィルムを作製した。次に脂質フィルムに３．７５ｍｇ／ｍｌの実施例２で得られたＣｒｙｊ １、あるいは抽出エキス（Ｃｒｙｊ １含量０．３７５ｍｇ／ｍｌ）を加え、４０℃の水槽でＶｏｒｔｅｘにて、リポソームを作製した。次にこのリポソームを整粒装置のエクストルーダーを用いて、１μｍのフィルターに０．２〜１ＭＰａの範囲で加圧しながら５回整粒を行った。次にリポソーム液を遠心法にて回収後、ＰＢＳ（−）で３回懸濁、遠心、上清除去することでリポソームに封入されなかった抗原を除去した。得られたリポソームの分析は、コレステロール量、Ｃｒｙｊ １の測定をそれぞれ市販のキット、コレステロールＥテストワコー（和光純薬、４３９−１７５０１）、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｌｏｗｒｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ、２３２４０）を用いて行った。脂質の回収率は１００％に近く、Ｃｒｙｊ １は２−５％であり、封入混合液のＣｒｙｊ １濃度と分析値とに相関があった。

実施例４：Ｃｒｙｊ １封入リポソームと抗Ｃｒｙｊ １イムノグロブリンの反応性
リポソームの外水相（外層）に存在するＣｒｙｊ １に結合活性のあるイムノグロブリンと、封入したリポソームのＣｒｙｊ １との反応性を確認するため、実施例３でＣｒｙｊ １を封入して作製したリポソームのリポソームけん濁液を用いてサンドイッチＥＬＩＳＡを行った。プレートの底面に先ず抗Ｃｒｙｊ １ウサギ抗体（林原生化学研究所、ＨＢＬ−Ａｂ−１−０００）を固相し、リポソームけん濁液、標準物質としてリポソームに封入していないＣｒｙｊ １溶液を反応させた。２次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗Ｃｒｙｊ １モノクローナル抗体０５３（林原生化学研究所、０ＨＢＬ−Ａｂ−１−０５３Ｐ）を用いて検出を行った。その結果、リポソームの外側に検出されたＣｒｙｊ １は、リポソーム内側のＣｒｙｊ １に比べ０．１％以下であった。リポソーム製造時に３回の洗浄操作を行うことで、リポソームの外層のＣｒｙｊ １は除去されており、また、保存中、測定中にリポソームからＣｒｙｊ １が漏出していないと判断できる。よって、Ｃｒｙｊ １封入リポソームを用いることにより、オリゴ糖リポソームに封入をしないＣｒｙｊ １溶液に比べ、アレルギー患者が持つＣｒｙｊ １に対するイムノグロブリンが投与薬剤中のＣｒｙｊ １と反応して、アナフィラキシーなどの副作用を生じる危険性が大きく低下することが期待できる。

実施例５：オリゴ糖リポソーム処置によるＴｈ１型免疫誘導効果の確認
以下の実施例で使用されているリポソーム封入体の略記について、「Ｃｒｙｊ １／Ｍ３−Ｌ」とはリポソーム作製時の条件としてＣｒｙｊ １濃度３．７５ｍｇ／ｍｌで作製したオリゴ糖（Ｍａｎ３）を表面に持つリポソームであることを示し、「Ｃｒｙｊ １／Ｌ」とはオリゴ糖（Ｍａｎ３）を有さないリポソームにＣｒｙｊ １濃度３．７５ｍｇ／ｍｌで封入したものである。また、「Ｃｒｙｊ １」とはリポソームに封入せずにＣｒｙｊ １を直接投与したことを示す。

６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスにＣｒｙｊ １、Ｃｒｙｊ １／Ｌ、Ｃｒｙｊ １／Ｍ３−Ｌを１週間間隔で２回それぞれ（投与Ｃｒｙｊ １蛋白量２．５μｇ／ｈｅａｄ、腹空内）投与した。被検物質の最後の処置から１週間後、各個体の脾臓を摘出し、懸濁液を調製した（５×１０⁶ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、ＲＰＭＩ１６４０ ｍｅｄｉｕｍ）。各個体の脾細胞懸濁液を、Ｃｒｙｊ １存在下（終濃度５０μｇ／ｍｌ）、ＣＯ₂インキュベータ内にて７２時間培養し、培養上清を回収した。回収した培養上清中のＩＦＮ−γ（Ｔｈ１反応指標）をＥＩＡ法により測定した。また、被検物質処置後に採血を行い、血清中の抗原特異的なＩｇＧ２ａ（Ｔｈ１反応指標）及びＩｇＧ１（Ｔｈ２反応指標）を測定し、これらの測定値比を算出した値をＴｈ１／Ｔｈ２バランスとし、被検物質のＴｈ１反応誘導効果の評価を行った（図１Ａ）。また、対照として、上記封入体の代わりにＰＢＳのみを投与して同様に評価を行った。

その結果、Ｃｒｙｊ １／Ｍ３−Ｌ処置群のＩＦＮ−γがＣｒｙｊ １処置群及びＣｒｙｊ １／Ｌ処置群よりも大きく増加していることが確認できた（図３）。また、各処置群の抗原特異的ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ１の測定値比（ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１）において、Ｃｒｙｊ １／Ｍ３−Ｌ処置群は他処置群よりも高い値を示した（図４）。

これらのことから、アレルゲン封入オリゴ糖リポソームは、アレルゲン単独処置およびアレルゲン封入リポソームと比較して、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＴｈ１反応誘導効果が高く、更に、Ｔｈ２反応の誘導を伴わないことが分かった。

実施例６：マウスにおけるオリゴ糖リポソーム処置によるＩｇＥ産生抑制効果試験
６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに１週間間隔でＣｒｙｊ １、Ｃｒｙｊ １／Ｌ、Ｃｒｙｊ １／Ｍ３−Ｌ、を３回投与した（投与抗原蛋白量１μｇ／ｈｅａｄ、皮内投与）。被検物質の最後の処置から１週間後、全てのマウスにＣｒｙｊ １及びアラムの混合液を１週間隔で２回腔内投与し（投与抗原蛋白量１０μｇ／ｈｅａｄ）、Ｔｈ２反応の惹起を行った。被検物質処置前、Ｃｒｙｊ １・アラム混合液投与前及びＣｒｙｊ １・アラム混合液投与後に眼底採血を行い、各処置個体の血清を得た。Ｃｒｙｊ １・アラム処置後の経時的採血を行った後、各個体の脾臓を摘出・ホモジネートし、脾細胞懸濁液を調製した（５×１０⁶ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、ＲＰＭＩ１６４０ ｍｅｄｉｕｍ）。各個体の脾細胞懸濁液は、Ｃｒｙｊ １存在下（終濃度５０μｇ／ｍｌ）、ＣＯ₂インキュベータ内にて７２時間の培養を行い、培養上清を回収した。回収した培養上清中のインターロイキン（ＩＬ）−５（Ｔｈ２反応指標）、および、血清中の総ＩｇＥ量をＥＩＡ法により測定した（図１Ｂ）。

脾細胞のＩＬ−５産生量を測定した結果、Ｃｒｙｊ １／Ｌ投与時にはＣｒｙｊ １単独、あるいは無処置の場合と同様のＩＬ−５産生量が有るにも拘わらず、Ｃｒｙｊ １／Ｍ３−Ｌ処置群においてはＩＬ−５産生量が抑制されていることを確認した（図６）。
更に、無処置群において増加するアレルゲン・アラム混合液投与後のＩｇＥ産生を、Ｃｒｙｊ １、Ｃｒｙｊ １／Ｌ処置では抑制できなかったのに対し、Ｃｒｙｊ １／Ｍ３−Ｌ処置群では最終的にアレルゲン・アラム混合液投与を行わなかった群と同レベルまで抑制する効果があった（図５）。

これらのことから、アレルゲンを封入したオリゴ糖リポソームは、アレルゲンに暴露された時のＴｈ２反応、ＩｇＥ産生を、公知のアレルゲン単独投与や通常のリポソーム内封アレルゲン投与の技術と比較して、より強力に抑制する効果を有することが分かった。本発明のアレルゲン内封オリゴ糖リポソームは、花粉症などのアレルギー患者のアレルギー症状の発症を抑えることが期待できる。

実施例７：マウスにおけるアレルギー治療効果試験
６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスにＣｒｙｊ １及びアラム混合液を１回腹腔内投与することによりＴｈ２反応の惹起を行った。惹起から８週間後、２週間間隔でＣｒｙｊ １およびＣｒｙｊ １／Ｍ３−Ｌを３回投与（投与Ｃｒｙｊ １蛋白量１μｇ／ｈｅａｄ、皮内投与）した。被検物質の最後の処置から１週間後に採血を行い、各処置個体の血清中の総ＩｇＥ量をＥＩＡ法により測定した（図２）。Ｃｒｙｊ １／Ｍ３−Ｌは、Ｃｒｙｊ １単独処置群と比較してＩｇＥ産生を抑制していた（図７）。アレルゲン封入オリゴ糖リポソームは、Ｔｈ２型反応の偏向などアレルギー状態が形成された個体に対して、これを改善し、さらにＩｇＥ産生抑制効果を有することを見いだした。

実施例８：マウスにおけるスギ花粉抽出エキス封入オリゴ糖リポソーム処置によるＩｇＥ産生抑制効果試験
６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに１週間間隔でＰＢＳ（−）、スギ花粉抽出エキス、スギ花粉抽出エキス封入オリゴ糖リポソームを３回投与した（投与抗原蛋白量（総蛋白量）０．３μｇ／ｈｅａｄ、皮内投与）。被検物質の最後の処置から１週間後、全てのマウスにスギ花粉抽出エキス及びアラムの混合液を１週間間隔で２回腹腔内投与し（投与抗原蛋白量１μｇ／ｈｅａｄ）、Ｔｈ２反応の惹起を行った。被検物質処置前、スギ花粉抽出エキス・アラム混合液投与前及びスギ花粉抽出エキス・アラム混合液投与後に眼底採血を行い、各処置個体の血清を得た（図１ｂ）。得られた血清中の抗原特異的ＩｇＥ量およびＩｇＧ２ａ量をＥＩＡ法により測定した（図８および図９）。

ＰＢＳ（−）処置群において増加するアレルゲン・アラム混合液投与後のＩｇＥ産生を、スギ花粉抽出エキス処置群では抑制できなかったのに対し、スギ花粉抽出エキス封入オリゴ糖リポソーム処置群ではＩｇＥ産生を抑制した（図８）。スギ花粉抽出エキス封入オリゴ糖リポソーム処置群における血清中の抗原特異的ＩｇＧ２ａは、ＰＢＳ（−）またはスギ花粉抽出エキス処置群よりも誘導されることを確認した（図９）。
これらのことから、スギ花粉抽出エキスを封入したオリゴ糖リポソームは、実施例９と同様に、ＩｇＥ産生を抑制する効果を有することが分かった。したがって、本発明のアレルゲン内封オリゴ糖リポソームには、Ｃｒｙ ｊ １のような精製抗原タンパクだけでなく、抽出エキスを用いることができることを確認した。

実施例９：マウスにおけるＣｒｙｊ１封入オリゴ糖リポソームの経鼻投与によるＩｇＥ産生抑制効果試験
６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに１週間間隔でＣｒｙｊ１およびＣｒｙｊ１封入オリゴ糖リポソームを経鼻投与により３回投与した（投与抗原蛋白量（総蛋白量）１μｇ／ｈｅａｄ）。被検物質の最後の処置から１週間後、全てのマウスにＣｒｙｊ１及びアラムの混合液を腹腔内投与し（投与抗原蛋白量１μｇ／ｈｅａｄ）、Ｔｈ２反応の惹起を行った。Ｃｒｙｊ１・アラム混合液投与前及びＣｒｙｊ１・アラム混合液投与後に眼底採血を行い、各処置個体の血清を得た。得られた血清中の総ＩｇＥ量をＥＩＡ法により測定した（図１０）。

Ｃｒｙｊ１経鼻投与群においてアレルゲン・アラム混合液投与後のＩｇＥ産生を抑制できなかったのに対し、Ｃｒｙｊ１封入オリゴ糖リポソーム経鼻投与群ではＩｇＥ産生を抑制した（図１０）。

これらのことから、花粉抗原を封入したオリゴ糖リポソームは、経鼻投与によりＩｇＥ産生を抑制する効果を有することが分かった。したがって、本発明のアレルゲン内封オリゴ糖リポソームは、皮内または皮下投与だけでなく、経鼻投与により治療効果を得ることができることを確認した。

本発明で提供されるアレルギー治療剤は、高い治療効果を有すると同時に副作用の危険性が低減されている。そのため、減感作療法に用いることにより、従来の減感作療法と異なり、短期間で高率かつ安全なアレルギーの根本治癒が可能となる。

マウスにおけるＴｈ１反応誘導効果評価試験（実施例５：Ａ）及びＩｇＥ産生抑制効果評価試験（実施例６および実施例８：（Ｂ）の方法を示した図である。 マウスにおける治療効果評価試験（実施例７）の方法を示した図である。 実施例５において、被検物質処置を行ったマウスの脾細胞をＣｒｙｊ １存在下にて培養し、培養上清中のＩＦＮ−γ産生量を測定した結果を示すグラフである。 実施例５において、被検物質処置を行ったマウスにおける血清中抗原特異的ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ１の測定値比（ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１）を示したグラフである。 実施例６において、被検物質処置及びＣｒｙｊ １・アラム混合液投与を行ったマウスの経時的な採血を行い、血清中総ＩｇＥ濃度を測定した結果を示すグラフである。 実施例６において、各被検物質処置及びＣｒｙｊ １・アラム混合液投与を行ったマウスの脾細胞をＣｒｙｊ １存在下にて培養し、培養上清中のＩＬ−５の産生量を測定した結果を示すグラフである。 実施例７において、Ｃｒｙｊ １・アラム感作及び各被検物質処置を行ったマウスから採血を行い、血清中総ＩｇＥ濃度を測定した結果を示すグラフである。 実施例８において、スギ花粉抽出エキス・アラム感作及び各被検物質処置を行ったマウスから採血を行い、血清中抗原特異的ＩｇＥを測定した結果を示すグラフである。 実施例８において、スギ花粉抽出エキス・アラム感作及び各被検物質処置を行ったマウスから採血を行い、血清中抗原特異的ＩｇＧ２ａを測定した結果を示すグラフである。 実施例９において、Ｃｒｙｊ１・アラム感作及び各被検物質処置を行ったマウスから採血を行い、血清中総ＩｇＥを測定した結果を示すグラフである。

Claims (10)

1. 抗原提示細胞由来のレクチンに結合することができ、かつ２〜１１個の糖残基から成るオリゴ糖を表面に有するリポソームを含む治療剤であって、前記リポソームにアレルゲンが内封されてなることを特徴とするアレルギー治療剤。
2. オリゴ糖が３〜５個の糖残基から成るものである、請求項１に記載の治療剤。
3. オリゴ糖がマンノースを含む糖残基から成るものである、請求項１ないし２のいずれかに記載の治療剤。
4. アレルゲンが花粉抗原である、請求項１ないし３のいずれかに記載の治療剤。
5. 花粉抗原がスギ花粉抗原である、請求項４に記載の治療剤。
6. 請求項１ないし５のいずれかに記載の治療剤を含み、皮下、皮内、または経鼻投与により処置するためのアレルギー治療剤。
7. 抗原提示細胞由来のレクチンに結合することができ、かつ２〜１１個の糖残基から成るオリゴ糖を表面に有するリポソームであって、花粉抗原が内封されてなることを特徴とするリポソーム。
8. オリゴ糖が３〜５個の糖残基から成るものである、請求項７に記載のリポソーム。
9. オリゴ糖がマンノースを含む糖残基から成るものである、請求項７ないし８のいずれかに記載のリポソーム。
10. 花粉抗原がスギ花粉抗原である、請求項７ないし９のいずれかに記載のリポソーム。

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