CN115087435A - 包含阳离子脂质体的用于抑制皂素溶血的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种具有抑制由皂素诱导的红血球溶血的效果的阳离子脂质体，特别是包含含有不饱和脂质的阳离子脂质体且抑制由皂素引起的红血球溶血的组合物、包含抑制由皂素引起的红血球溶血的组合物的用于免疫增强的组合物和用于药物传递的组合物，以及包含含有不饱和脂质的阳离子脂质体的药物传递载体和药物载体复合物。皂素展现出包括强而有效的免疫活性的广泛药理和生物活性，例如抗发炎活性，因此可以在医学和药学上有效，但其缺点是引起红血球溶血。因此，皂素通常与胆固醇等一起使用，从而抑制其溶血作用，但在本发明中已确定，由皂素诱导的红血球溶血可以使用阳离子脂质体来抑制，这对于抑制由皂素诱导的红血球溶血更经济有效。因此，根据本发明，皂素可以更有效地用于制备免疫刺激剂、药物传递载体等。

Description

包含阳离子脂质体的用于抑制皂素溶血的组合物
技术领域
本发明涉及一种具有抑制由皂素引起的红血球溶血的效果的阳离子脂质体，特别是包含含有不饱和脂质的阳离子脂质体且抑制由皂素引起的红血球溶血的组合物、包含抑制由皂素引起的红血球溶血的组合物的用于免疫增强的组合物和用于药物传递的组合物，以及包含含有不饱和脂质的阳离子脂质体的药物传递载体和药物载体复合物。
背景技术
皂素(Saponin)是一种作为类固醇和三萜的次级代谢物产生的糖苷化合物。皂素展现出包括强而有效的免疫活性的广泛药理和生物活性，例如抗发炎活性等。通常，已知皂素具有提升免疫功能的效果，且皂素被使用作为疫苗的佐剂或抗癌剂(Newman MJ,et al.,J.Immunol.148:2357-2362,1992；Sun HX,et al.,Vaccine 27:1787-1796,2009)。然而，皂素会引起起泡作用和溶血作用，“溶血作用”意指红血球被破坏且其内容物(细胞质)溶解在周围的液体(例如血浆)中，这被称作溶血反应或简称溶血(Hemolysis)。溶血发生起因于红血球细胞膜中的胆固醇与皂素紧密结合从而破坏膜结构。
为了使用皂素作为药用，由皂素引起的红血球溶血需要被抑制，并且往往会使用胆固醇。通常，在生产药品等产品时，动物性成分的胆固醇受到严格的管理标准，并且为了克服这个问题，近来已经开发出半合成或合成胆固醇用于药品的制造，但其不利之处在于价格非常高昂。
长期以来，一直在研究安全高效地传递各种药物的技术。包囊技术(Encapsulation technology)被使用以在制造、配送等期间保持药物活性不发生变质。此技术可以通过将药物包裹在载体(如脂质体(Liposome))中而最大限度地减少药物的变质和损失，并使其可能含有亲水和亲脂物质。在药品中作为药物传递载体和保护剂的一种胶囊制剂在医药领域中被使用于基因治疗和癌症化疗，并且在化妆品领域中作为有效物质传递载体和水传递载体。包囊技术还能在控制释放速率以及在稳态下储存所含物质方面起着重要作用。
脂质体是一种自组装的脂质双层结构，且是一种具有疏水部分和亲水部分的两亲分子。脂质体有杰出的生物兼容性、制造简单和能输送水溶性和脂溶性药物的优势，因此对脂质体作为药物载体在体内产生较少副作用的深入研究正在进行中(Kwang Jae Cho,Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 2007；50(7):562-572)。脂质体化学性质稳定、无刺激性、无毒且结构近似皮肤生物脂膜。此外，因为可以透过各种方式改变表面性质来制造它，它可以用于多种用途如化妆品、药物、佐剂、药物传递系统等。
在这样的技术背景下，发明人在利用皂素的治疗功效或免疫增强功能的同时，努力抑制当施用皂素到体内时发生的溶血，并因此查明当皂素与包含不饱和阳离子脂质或中性脂质的阳离子脂质体混合时，单独施用皂素时发生的溶血现象可被有效抑制，进而使本发明得以完成。
背景技术部分中描述的信息仅用于增进对本发明背景的理解，并且不应该被解释成包括形成本发明所属技术领域的普通技术人员已知的相关技术的信息。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于抑制由皂素引起的红血球溶血的组合物，包含阳离子脂质体，其具有抑制由皂素引起的红血球溶血的能力。
本发明的另一目的是提供一种包含将组合物施用于受试体的抑制由皂素引起的红血球溶血的方法、组合物在抑制由皂素引起的红血球溶血的用途以及组合物在制备用于抑制由皂素引起的红血球溶血的治疗剂的用途。
本发明的另一目的是提供一种用于免疫增强的组合物，包含用于抑制由皂素引起的红血球溶血的组合物。
本发明的又另一目的是提供一种包含将用于免疫增强的组合物施用于受试体的增强免疫的方法、用于免疫增强的组合物在增强免疫的用途以及用于免疫增强的组合物在制备用于免疫增强的治疗剂的用途。
本发明的进一步目的是提供一种用于药物传递的组合物，包含用于抑制由皂素引起的红血球溶血的组合物。
本发明的再另一目的是提供一种包含含有阳离子脂质和中性脂质的阳离子脂质体的药物传递载体，以及药物载体复合物于其中药物吸附至含有阳离子脂质以及中性脂质阳离子脂质体或被所述阳离子脂质体包裹。
为了达到上述目的，本发明提供一种用于抑制由皂素引起的红血球溶血的组合物，包含阳离子脂质体，且阳离子脂质体含有阳离子脂质、中性脂质以及皂素。
此外，本发明提供一种包含将用于抑制由皂素引起的红血球溶血的组合物施用于受试体的抑制由皂素引起的红血球溶血的方法、用于抑制由皂素引起的红血球溶血的组合物在抑制皂素引起的红血球溶血的用途，以及用于抑制由皂素引起的红血球溶血的组合物在制备用于抑制皂素引起的红血球溶血的治疗剂的用途。
此外，本发明提供一种用于免疫增强的组合物，包含用于抑制由皂素引起的红血球溶血的组合物。
此外，本发明提供一种包含将用于免疫增强的组合物施用于受试体的增强免疫的方法、用于免疫增强的组合物在增强免疫的用途，以及用于免疫增强的组合物在制备用于免疫增强的治疗剂的用途
此外，本发明提供一种用于药物传递的组合物，包含用于抑制由皂素引起的红血球溶血的组合物。
此外，本发明提供一种药物传递载体，包含含有阳离子脂质以及中性脂质的阳离子脂质体。
此外，本发明提供一种药物载体复合物，药物于药物载体复合物中吸附至阳离子脂质体或被阳离子脂质体包裹，其中所述阳离子脂质体含有阳离子脂质以及中性脂质。
附图说明
图1和图2表示脂质体抑制由粗皂素引起的溶血能力与脂质体极性的关系图。
图3和图4表示皂皮树衍生粗皂素和QS21浓度与红血球溶血(％)的关系图。
图5至图13表示脂质体对2.5微克粗皂素和QS21的溶血的抑制效果的关系图。
图14表示抑制由皂素引起的溶血的效果与阳离子脂质体中的阳离子脂质或中性脂质是否存在不饱和脂肪酸的关系图。
图15表示细胞毒性与阳离子脂质体中的阳离子脂质或中性脂质是否存在不饱和脂肪酸的关系图。
图16表示红血球溶血(％)与类固醇皂素浓度的关系图。
图17至图20表示脂质体对由类固醇皂素引起的溶血的抑制效果的关系图。
图21表示红血球溶血(％)与三萜皂素浓度的关系图。
图22至图25表示脂质体对由三萜皂素引起的溶血的抑制效果的关系图。
图26至图31为确认阳离子脂质体对皂素引起的溶血的抑制效果与阳离子脂质体中阳离子和中性脂质比例的结果。
具体实施方式
除非另有定义，本发明所使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属技术领域具有通常知识者典型理解的含义相同。实际上，此处使用的命名法和下面描述的测试方法在本技术领域中是众所周知的并且是典型的。
脂质体根据表面电荷、尺寸、膜结构等性质有不同的分类。例如，脂质体的表面电荷由中性脂质、阳离子脂质、阴离子脂质等多种脂质材料的组合决定。
在本发明的一实施方案中，开发出一种能够抑制由皂素引起的红血球溶血的阳离子脂质体，并且它被证实能有效适用于使用皂素的药物传递载体的制造以及免疫增强制剂，即使没有使用通常为了抑制由皂素引起的溶血会使用的胆固醇。这保证了皂素在医疗和制药目的上的安全使用。
因此，在一方面，本发明涉及一种包含阳离子脂质体和皂素的用于抑制由皂素引起的红血球溶血的组合物，其中阳离子脂质体中含有阳离子脂质和中性脂质。
此处使用的术语“脂质”包含脂肪酸、磷脂、脂肪酸酯、类固醇及它们的类似物。术语“不饱和脂质”是指在脂质含有的脂肪酸链中包含至少一个碳-碳双键的脂质。
在本发明中，阳离子脂质或中性脂质可包含至少一个不饱和脂肪酸。
在本发明中，阳离子脂质或中性脂质可包含至少一个不饱和脂肪酸链，每个不饱和脂肪酸链具有10至20个碳原子，优选14至18个碳原子，并且每个脂肪酸链中含有的碳-碳双键数为1至6个，优选1个。
根据本发明所述用于抑制溶血的组合物中含有的阳离子脂质和中性脂质其中任一者可以是不饱和脂质，剩余的另一者可以是不饱和脂质或饱和脂质。
在本发明中，阳离子脂质可选自1,2-二油酰基-3-(三甲基铵)丙烷(1,2-dioleoyl-3-(trimethylammonium)propane，DOTAP)、双十八烷基二甲基溴化铵(dimethyldioctadecylammonium bromide，DDA)、3β-[N-(N',N'-二甲基氨基乙基)胺甲酰基]胆固醇(3β-[N-(N’,N’-dimethylaminoethane)carbamoyl]cholesterol，DC-Chol)、1,2-二油酰基-3-(二甲基铵)丙烷(1,2-dioleoyl-3-(dimethylammonium)propane，DODAP)、1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(1,2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammoniumpropane，DOTMA)、1,2-二肉豆蔻烯酰基-sn-甘油-3-乙基磷胆碱(1,2-dimyristoleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine，14:1Ethyl PC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-乙基磷胆碱(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine，16:0-18:1EthylPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-乙基磷胆碱(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine，18:1Ethyl PC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-乙基磷胆碱(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine，18:0Ethyl PC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-乙基磷胆碱(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine，16:0EthylPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-乙基磷胆碱(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine，14:0Ethyl PC)、1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-乙基磷胆碱(1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine，12:0Ethyl PC)、N1-[2-((1S)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基丙基)氨基]丁基甲酰氨基)乙基]-3,4-二[油烯基氧基]苯甲酰胺(N1-[2-((1S)-1-[(3-aminopropyl)amino]-4-[di(3-amino-propyl)amino]butylcarboxamido)ethyl]-3,4-di[oleyloxy]-benzamide，MVL5)、1,2-二肉豆蔻酰基-3-二甲基铵丙烷(1,2-dimyristoyl-3-dimethylammonium-propane，14:0DAP)、1,2-二棕榈酰基-3-二甲基铵丙烷(1,2-dipalmitoyl-3-dimethylammonium-propane，16:0DAP)、1,2-二硬脂酰基-3-二甲基铵丙烷(1,2-distearoyl-3-dimethylammonium-propane，18:0DAP)、N-(4-羧基苯甲基)-N,N-二甲基-2,3-双(油酰氧基)丙烷-1-铵(N-(4-carboxybenzyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(oleoyloxy)propan-1-aminium，DOBAQ)、1,2-硬脂酰基-3-三甲基铵丙烷(1,2-stearoyl-3-trimethylammonium-propane，18:0TAP)、1,2-二棕榈酰基-3-三甲基铵丙烷(1,2-dipalmitoyl-3-trimethylammonium-propane，16:0TA)、1,2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基铵丙烷(1,2-dimyristoyl-3-trimethylammonium-propane，14:0TAP)以及N4-胆固醇精胺(N4-cholesteryl-spermine，GL67)，但本发明并不以此为限。
阳离子脂质可包含于其中的阳离子官能基被引入胆固醇衍生物等的脂质。
在本发明中，中性脂质可选自1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine，DMPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷胆碱(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，DOPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷乙醇胺(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine，DOPE)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷胆碱(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，DPPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷胆碱(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，DSPC)、1,2-二亚麻油酰基-sn-甘油-3-磷胆碱(1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，DLPC)、磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)、磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)、磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol，PG)、磷酸(phosphoric acid，PA)以及磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine，PC)，但本发明并不以此为限。
优选地，阳离子脂质为DOTAP或DDA，且中性脂质为DMPC、DOPC、DOPE、DPPC或DSPC，但本发明并不以此为限。
在本发明中，阳离子脂质于阳离子脂质体中的重量比可为10％至100％，但不限于此。在本发明中，所使用的“重量比”与“量(Amount)”含义相同。
在本发明的一实施方案中，可以确定在抑制皂素溶血的阳离子脂质体中，阳离子脂质DDA的量为30％至70％，阳离子脂质DOTAP的量为10％至100％。
在本发明中，脂质体还可包含醣脂，所述醣脂可以是由二半乳糖基甘油二酯(digalactosyldiglyceride)、半乳糖基甘油二酯硫酸酯(galactosyldiglyceridesulfuric acid ester)和鞘醣脂(sphingoglycolipid)所组成的群组中的至少一种，但不限于此。鞘醣脂例如为半乳糖基神经酰胺(galactosylceramide)、半乳糖基神经酰胺硫酸酯(galactosylceramide sulfuric acid ester)、乳糖基神经酰胺(lactosylceramide)、神经节苷脂(ganglioside)G7、神经节苷脂G6和神经节苷脂G4。
脂质体还可以包含固醇衍生物，且固醇衍生物可以是选自胆固醇、二氢胆固醇(dihydrocholesterol)、胆固醇酯、植物固醇、谷固醇、豆固醇、菜油固醇、胆甾烷醇、羊毛甾醇、1-O-固醇葡糖苷(1-O-sterolglucoside)、1-O-固醇麦芽糖苷(1-O-sterolmaltoside)和1-O-固醇半乳糖苷(1-O-sterolgalactoside)中的至少一种，但并不以此为限。
脂质体还可进一步包含乙二醇衍生物，且乙二醇衍生物可以是选自乙二醇、二甘醇、三甘醇、丙二醇、二丙二醇、1,3-丙二醇(trimethylene glycol)和1,4-丁二醇中的至少一种，但并不以此为限。
脂质体还可进一步包含脂族胺，且脂族胺可以是选自硬脂胺、辛胺、油胺和亚油胺中的至少一种，但并不以此为限。
制造脂质体的方法可分类成“自上而下(top-down)的方法”及“自下而上(bottom-up)的方法”，其中“自上而下的方法”包含形成大尺寸脂质体然后将其分成小尺寸脂质体，“自下而上的方法”包含使用脂质单体组装小尺寸脂质体。为了使用自上而下的方法制造脂质体，将脂质溶解在有机溶剂中、除去有机溶剂并且用水溶液再水合脂质。
制造脂质体的典型方法可包含膜再水合方法或脂质水合方法。使用这种方法形成大单室脂质体(LUV)，然后使用均质器、微流化器或高压均质器对大单室脂质体进行物理破坏，从而制造出具有所需尺寸的脂质体。
本发明的阳离子脂质体可以采用薄膜法、注射法或冷冻干燥法制造，但本发明不以此为限。
薄膜法是将脂质溶解在有机溶剂中，经干燥后形成脂质膜，然后加入溶液以提供阳离子脂质体。注射法是用注射器滴下含有脂质的有机溶剂以提供阳离子脂质体。冷冻干燥法是将脂质溶解在有机溶剂中并进行冷冻干燥从而使有机溶剂挥发，然后用溶液将脂质再水合以提供阳离子脂质体。
在本发明中，如此制造的脂质体可选择性地冷冻干燥以易于储存。经冷冻干燥形成糕状、斑块状或粉末状的脂质体于使用时可用无菌水回溶之后施用。
使用本发明的方法制造的脂质体可用于药物注射、经皮输药、经鼻输药和肺输药。这种制剂和药物上适当的载体、添加剂等所需要的技术是药物技术领域具有通常知识者所普遍知道的。关于这方面的知识，可以参考Remington的《药学科学》(PharmaceuticalSciences)(第19版，1995)。
在本发明中，可透过静电吸引将皂素吸附到阳离子脂质体上，但本发明不限于此。或者，皂素可能包含在阳离子脂质体中，或者皂素可与阳离子脂质体的脂质膜结合。
此处使用的术语“吸附”意指一种材料与脂质体的内部或外部结合，并且只要根据本发明的皂素能够有效传递，结合的形式没有特别限制。
在本发明中，皂素可以选自人参皂素Rb1、毛地黄皂素、β-七叶素、皂皮树衍生粗皂素(Quillaja saponaria-derived crude saponin)及其部分、QS21、Quil A、QS7、QS18、QS17及其盐类、类固醇皂素及三萜皂素，但本发明并不以此为限。类固醇皂素可包括毛地黄皂素或巴黎皂素VII，且三萜皂素可包括七叶素、α-常春藤素、常春藤皂配基、刺囊酸、Chrysanthellin A、Chrysanthellin B、贝萼皂素(bayogenin)、苜蓿酸、山楂酸，齐墩果酸，红二醇，或积雪草酸(asiatic acid)。优选地，皂素为皂皮树衍生粗皂素、QS21、毛地黄皂素、巴黎皂素VII、七叶素或α-常春藤素。
根据本发明的用于抑制由皂素引起的红血球溶血的组合物可包含单独阳离子脂质体的药学上有效量，或是进一步包含至少一药学上可接受载体、赋形剂或稀释剂。所述“药学上有效量”为足以抑制由皂素引起的红血球溶血的量。
术语“药学上可接受”意指在生理学上是可以接受的，当施用于人体时通常不会引起肠胃紊乱、过敏反应如头晕或类似的反应。载体、赋形剂和稀释剂的例子可包含乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。此外，还可额外包含添加剂、防结块剂、润滑剂、润湿剂、香料、乳化剂和防腐剂。
根据本发明的用于抑制由皂素引起的红血球溶血的组合物可以使用本技术领域已知的方法配制，以便在施用于哺乳动物之后提供活性成分的快速、持续或延迟释放。制剂可以是粉末、颗粒、片剂、乳剂、糖浆、气雾、软的或硬的明胶胶囊、无菌注射溶液、冻干粉末和无菌粉末的形式。
根据本发明的用于抑制由皂素引起的红血球溶血的组合物可以通过各种途径给药，包含口服、经皮给药、皮下注射、静脉注射或肌肉注射，并且可根据给药途径、患者年龄、性别、体重、疾病严重程度等因素适当选择活性成分的剂量。
另一方面，本发明涉及一种抑制由皂素引起的红血球溶血的方法，包含将用于抑制由皂素引起的红血球溶血的组合物施用于受试体。
另一方面，本发明涉及一种用于抑制由皂素引起的红血球溶血的组合物在抑制由皂素引起的红血球溶血的用途。
另一方面，本发明涉及一种用于抑制由皂素引起的红血球溶血的组合物在制备用于抑制由皂素引起的红血球溶血的治疗剂的用途。
在本发明中，方法和用途包含上述用于抑制由皂素引起的红血球溶血的组合物，因此与根据本发明的用于抑制溶血的组合物的上述内容重复的描述将被省略。
另一方面，本发明涉及一种用于免疫增强的组合物，包含用于抑制由皂素引起的红血球溶血的组合物。
另一方面，本发明涉及一种增强免疫的方法，包含将用于免疫增强的组合物施用于受试体。
另一方面，本发明涉及一种用于免疫增强的组合物在增强免疫的用途。
另一方面，本发明涉及一种用于免疫增强的组合物在制备用于免疫增强的治疗剂的用途。
在本发明中，用于免疫增强的组合物、增强免疫的方法以及用于免疫增强的组合物的用途包含上述用于抑制由皂素引起的红血球溶血的组合物，因此与根据本发明的用于抑制溶血的组合物的上述内容重复的描述将被省略。
此处，使用的术语“免疫增强”意指引起初始的免疫反应或以可测定的程度增加对抗原的现有免疫反应。
在本发明中，用于增强免疫的组合物可单独使用或与佐剂共同使用以形成医药组合物。
佐剂可包含例如选自Mg、Ca、Sr、Ba和Ra的第2族元素或其盐；选自Ti、Zr、Hf和Rf的第4族元素；铝盐或其水合物；或是二甲基十八烷溴化铵(dimethyloctadecylammoniumbromide)。盐可以例如由氧化物、过氧化物、氢氧化物、碳酸盐、磷酸盐、焦磷酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、硫酸盐和硅酸盐形成。
另外，佐剂可包含例如模式识别受体(PRR)激动剂，其选自类铎受体(oll-likereceptor,TLR)激动剂、类维甲酸诱导基因-I受体(RIG-I-like receptor，RLR)激动剂及类短链核疳酸结合及聚合区块受体(NOD-like receptors，NLR)激动剂。
另一方面，本发明涉及一种用于药物传递的组合物，包含用于抑制由皂素引起的红血球溶血的组合物。
另一方面，本发明涉及一种药物传递载体，包含阳离子脂质体，其中阳离子脂质体含有阳离子脂质和中性脂质。
另一方面，本发明涉及一种药物载体复合物，药物于药物载体复合物中吸附至阳离子脂质体或被阳离子脂质体包裹于其中，且阳离子脂质体含有阳离子脂质以及中性脂质。
在本发明中，阳离子脂质或中性脂质可包含至少一个不饱和脂肪酸。
在本发明中，用于药物传递的组合物、药物传递载体及药物载体复合物包含前述含有阳离子脂质和中性脂质的阳离子脂质体，因此与根据本发明的含有阳离子脂质和中性脂质的阳离子脂质体的上述内容重复的描述将被省略。
在本发明中，只要药物能够使用例如蛋白质、核酸、胜肽、化合物、抗原或天然材料的本发明阳离子脂质体传递，如蛋白质、核酸、胜肽、化合物、抗原或天然材料的药物可以不受限制地施用。
根据本发明的用于免疫增强的组合物或用于药物传递的组合物可进一步包含常用于制造医药组合物的合适赋形剂和稀释剂(Remington’s Pharmaceutical Science,Mack Publishing Co.,Easton PA)。此外，组合物可按个别典型方法配制成粉末、颗粒、片剂、胶囊、悬浮液、乳剂、糖浆、气雾等口服剂型以及无菌注射液形式。
用于免疫增强的组合物或用于药物传递的组合物所包含的载体、赋形剂和稀释剂的例子可包含乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、淀粉、甘油、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。
通常可用来配制组合物的稀释剂或赋形剂例如为添加剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩散剂和表面活性剂等。口服用的固体制剂可包含片剂、丸剂、粉末、颗粒、胶囊等，并且可使用例如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖、明胶等至少一赋形剂制造此固体制剂。除了简单的赋形剂，也可使用硬脂酸镁和滑石等润滑剂。口服用的液体制剂可使用悬浮液、内服液、乳剂、糖浆等。除了普遍使用水和液体石腊作为稀释剂，当中可包含各种赋形剂如润湿剂、甜味剂、香料、防腐剂等。非消化道给药用的制剂可包含无菌水溶液、非水制剂、悬浮液、乳剂和冻干制剂。
对于非水性制剂和悬浮液，可使用丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)、可注射酯类(如油酸乙酯)及它们的类似物。
根据本发明的用于免疫增强的组合物或用于药物传递的组合物的剂量可根据受试体的年龄、性别、体重等而改变，且剂量可根据给药途径、疾病的严重程度、性别、体重、年龄等而增加或减少。
以下，本发明将参照实施方案更详细地描述。然而，对本技术领域普通技术人员显而易见的是这些实施方案仅被提供用于说明本发明，而不应解释为限制本发明的范围。
实施例1：原料
作为以下实施例中脂质体原料的脂质如下表1所示。
表1
Figure BDA0003635120090000101
Figure BDA0003635120090000111
表1中，(18:0)、(18:1)、(14:0)、(16:0)等代表各脂质的饱和程度，“N：0”代表完全饱和的脂质，且“N：1”代表相对于N个碳原子的不饱和比例为1的脂质。
脂质的来源如下：
阳离子脂质：DOTAP(Merck)、DDA(Sigma-Aldrich)。
中性脂质：DMPC(Corden Pharma)、DOPC、DOPE、DSPC、DPPC(Avanti PolarLipids)。
阴离子脂质：DMPG(Avanti Polar Lipids)。
实施例2：不同极性的脂质体抑制粗皂素溶血的能力的比较
为了确认脂质体抑制粗皂素溶血的能力取决于其极性，利用冷冻干燥法制造阳离子、中性和阴离子脂质体，并且进行溶血性分析。
实施例2-1：脂质体的制造
本实施例中使用的脂质体类型如下表2所示。
表2
编号 脂质体 重量比(％) 浓度(mg/mL)
1 DDA:DOPC 50:50 2
2 DOPC 100 2
3 DMPG:DOPC 50:50 2
使用下列方法制造表2所示的脂质体。
(1)DDA、DOPC和DMPG各取40毫克(mg)置于70毫升(mL)玻璃小瓶中。
(2)每个小瓶中放入20毫升三级丁醇(t-butyl alcohol)以制备2毫克/毫升的脂质原液，然后在65℃水浴中加热10分钟，而使脂质完全溶解。
(3)各个脂质混合物由DDA、DOPC和DMPG混合在10毫升玻璃小瓶中制成，如下表3所示。
表3
Figure BDA0003635120090000121
(4)每个小瓶的瓶口用密封带覆盖，之后涡旋混合(Vortex mixing)5秒，并用注射器针头在密封带上形成密集的孔。
(5)混合物在冰箱中以-70℃冷冻2小时后被转移到冷冻干燥机，然后以20帕(Pa)和-80℃冷冻干燥约18小时，从而使有机溶剂挥发。
(6)将得到的糕状脂质体冷藏保存直至使用，并且每个小瓶与10毫升蔗糖在HEPES缓冲液(ph7.4)中水合供实验使用。
实施例2-2：溶血性分析的方法
(1)HEPES缓冲液(pH 7.4)中的脂质体、皂素、蔗糖以及蒸馏水被放入96孔盘中，如下表4和表5所示。
表4
Figure BDA0003635120090000122
Figure BDA0003635120090000131
表5
Figure BDA0003635120090000132
(2)使用回转式振荡机(Orbital Shaker)进行反应，在室温下以300每分钟转数(rpm)进行30分钟。
(3)3毫升的红血球(RBCs)悬浮在10毫升的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)中，在室温下以1500rpm离心5分钟，之后移除上清液。
(4)步骤(3)重复三次，进而洗涤红血球。
(5)将红血球沉淀物悬浮于1毫升PBS中并稀释至1/100，随后进行细胞计数。
(6)使用PBS将红血球稀释至1.5x109个细胞/毫升，且按3x107细胞/20微升(μL)/孔分配至上述步骤(2)的经测试原料处理的96孔盘中。
(7)使用回转式振荡机进行反应，在室温下以300rpm进行1小时。
(8)96孔盘在室温下以1500rpm离心5分钟。
(9)将50微升上清液转移到新的96孔盘上，以415nm测量吸亮度。
(10)使用以下公式计算溶血性(％)。
溶血性(％)＝(样本的光学密度(OD)-0％溶血性的光学密度)/(100％溶血性的光学密度-0％溶血性的光学密度)x 100
实施例2-3：溶血性分析的结果
确认脂质体极性对于抑制由10微克(μg)粗皂素引起的溶血的效果。
因此，中性脂质体(DOPC)和阴离子脂质体(DMPG：DOPC)对由粗皂素引起的溶血均无抑制作用(图1)，而100微克阳离子脂质体(DDA：DOPC)对由粗皂素引起的溶血有85％的抑制作用(图2)。
实施例3：用于抑制由皂素引起的溶血的阳离子脂质体的筛选
为了确认阳离子脂质体对于抑制由皂素引起的溶血的效果取决于阳离子脂质和中性脂质的不饱和程度，采用脂膜法制造各种脂质体，并分析其溶血性和细胞毒性(HaCaT,L6,J774A.1)。
实施例3-1：脂质体的制造
本实施例中使用的脂质体类型如下表6所示。
表6
Figure BDA0003635120090000141
使用下列方法制造表6中的脂质体。
(1)将阳离子脂质和中性脂质称重并置于玻璃管中。
(2)加入氯仿(Daejung)使脂质浓度为2毫克/毫升，并在37℃下完全溶解10分钟以得到脂质溶液。
(3)将阳离子脂质溶液和中性脂质溶液在圆底烧瓶中以1:1的重量比例混合制备各个脂质混合物。
(4)使用旋转蒸发器，对含有DOTAP的脂质混合物在60℃下进行30分钟的挥发，对含有DDA的脂质混合物在80℃下进行30分钟挥发，观察有无氯仿残留以及在烧瓶壁上有无形成脂质膜层。
(5)将HEPES缓冲液(pH 7.4)中的蔗糖置于烧瓶中，使得脂质体浓度为2毫克/毫升，并在65℃下溶解脂质膜。
(6)如此制造的脂质体以500微升的量分配到每个玻璃小瓶中，用橡胶塞关闭小瓶的瓶口，并且将小瓶放入冷冻干燥器(IlShinBioBase/lyopho-pride10,SXX2)中后进行冷冻干燥，如下表7所示。
表7
Figure BDA0003635120090000151
(7)由此制造的脂质体被保存在4℃冰箱中直至测试。
实施例3-2：溶血性分析的方法
(1)冷冻干燥后，用225微升蒸馏水水合储存于玻璃小瓶中的脂质体，在60℃下反应10分钟使脂质体完全溶解。
(2)HEPES缓冲液(pH 7.4)中的脂质体、皂素、蔗糖以及蒸馏水被放入96孔盘中，如下表8和表9所示。
表8
Figure BDA0003635120090000152
表9
Figure BDA0003635120090000153
Figure BDA0003635120090000161
(3)使用回转式振荡机进行反应，在室温下以300rpm进行30分钟。
(4)3毫升的红血球悬浮在10毫升的PBS中，在室温下以1500rpm离心5分钟，之后移除上清液。
(5)步骤(4)重复三次，进而洗涤红血球。
(6)将红血球沉淀物悬浮于1毫升PBS中并稀释至1/100，随后进行细胞计数。
(7)PBS将红血球稀释至1.5x109个细胞/毫升，且按3×107细胞/20微升/孔分配至上述步骤(3)的经试验原料处理的96孔盘中。
(8)使用回转式振荡机进行反应，在室温下以300rpm进行1小时。
(9)96孔盘在室温下以1500rpm离心5分钟。
(10)将50微升上清液转移到新的96孔盘上，以415nm测量吸亮度。
(11)使用以下公式计算溶血性(％)。
溶血性(％)＝(样本的光学密度-0％溶血性的光学密度)/(100％溶血性的光学密度-0％溶血性的光学密度)x 100
实施例3-3：引起溶血的皂素浓度的确认
基于皂皮树衍生粗皂素(
Figure BDA0003635120090000162
Desert King)和QS21(Desert King)的浓度决定溶血性的结果，当粗皂素或QS21的用量为2.5微克时，溶血性为100％(图3和图4)。
实施例3-4：阳离子脂质体对于抑制由皂素引起的溶血的效果的确认
观察抑制由2.5微克粗皂素或QS21引起的溶血的阳离子脂质体类型和浓度。
因此，发现DDA：DMPC、DDA：DPPC和DDA：DSPC对于由粗皂素或QS21引起的溶血没有达到100％抑制(图5至图7)。另一方面，当使用25微克的DDA：DOPC(脂质体：皂素＝10：1)、50微克的DOTAP：DMPC(脂质体：皂素＝20：1)、50微克的DOTAP：DPPC(脂质体：皂素＝20：1)、50微克的DOTAP：DSPC(脂质体：皂素＝20：1)、25微克的DOTAP：DOPC(脂质体：皂素＝10：1)或12.5微克的DOTAP：DOPE(脂质体：皂素＝5：1)时，由粗皂素或QS21引起的溶血被100％抑制(图8至图13)。
另外，使用IC50(抑制50％溶血的脂质体浓度)和IC100(抑制100％溶血的脂质体浓度)确认抑制由2.5微克粗皂素或QS21引起的溶血的阳离子脂质体的量(表10和表11)。
表10
Figure BDA0003635120090000171
表11
Figure BDA0003635120090000172
Figure BDA0003635120090000181
因此，不同于仅含有中性脂质的中性脂质体，含有阳离子脂质的阳离子脂质体被证实具有溶血抑制活性，且脂质体的溶血抑制活性随阳离子脂质体中所含脂质的饱和程度的组合而显著变化。具体而言，可以证实阳离子脂质体中不饱和脂肪酸含量越高，抑制由皂素引起的溶血的效果越好(图14)。
实施例4：脂质体的细胞毒性的分析
实施例4-1：分析方法
(1)人类皮肤角质细胞(HaCaT)(高葡萄糖DMEM培养基、10％胎牛血清、1％青霉素-链霉素)在37℃和5％二氧化碳的培养箱中培养。
(2)当细胞在100公厘培养皿中达到80-90％的生长密度(confluency)时，透过抽吸移除细胞培养基，且用5毫升PBS洗涤细胞。
(3)将5毫升胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(trypsin-EDTA)溶液放入100公厘培养皿中，在37℃和5％二氧化碳下反应3到6分钟，在这之后加入5毫升细胞培养基，并且将细胞悬浮液转移到15毫升管中，然后以1500rpm在室温下离心3分钟，随后移除上清液。
(4)细胞悬浮在10毫升PBS中，并以1500rpm在室温下离心3分钟，在这之后移除上清液。
(5)上述步骤重复两次，从而洗涤细胞。
(6)将由此获得的细胞与3毫升细胞培养基一起加入以悬浮细胞，随后进行细胞计数以透过台盼蓝(trypan blue)染色确定细胞数和存活率。
(7)确认细胞存活率为85％以上，在这之后使用培养基将细胞悬浮液调整至1x105个细胞/毫升，以100微升/孔分配于96孔盘中，并且在37℃和5％二氧化碳下培养24小时。
(8)冷冻干燥之后，用225微升蒸馏水水合储存于玻璃小瓶中的脂质体，并使脂质体在60℃下反应10分钟，以使脂质体完全溶解(脂质体浓度：4.4毫克/毫升)。
(9)取22.5微升的脂质体、10微升(0.25毫克/毫升)的皂素和67.5微升的缓冲液混合于96孔盘中，用回转式振荡机以300rpm在室温下反应30分钟。
(10)以20微升/孔将脂质体和皂素的混合物分配至96孔盘中，在37℃和5％二氧化碳下培养18小时。
(11)将细胞活力检测套组(Ez-Cytox)与细胞培养基按7:3的比例混合，以50微升/孔分配至24孔盘中，并使其在37℃和5％二氧化碳下反应3小时。
(12)将96孔盘在室温下以1500rpm离心5分钟。
(13)将100微升上清液转移到新的96孔盘上，以450nm测量吸亮度。
(14)用以下公式计算细胞毒性(％)。
细胞毒性(％)＝100-[(样本的光学密度/缓冲液的光学密度)x 100]
实施例4-2：结果
如图15所示，阳离子脂质体中不饱和脂肪酸含量越高，细胞毒性越低。
基于此处的结果和实施例3的结果合并来看，可以证实使用含有不饱和脂肪酸的阳离子脂质体展现出较低的细胞毒性，并且能100％抑制由皂素引起的溶血。
实施例5：用于抑制由各种皂素引起的溶血的筛选
除了皂皮树衍生粗皂素和QS21之外，采用不同的皂素评估阳离子脂质体对由皂素引起的溶血的抑制效果。
实施例5-1：方法
采用脂膜法制造各种脂质体，并进行溶血性分析。
本实施例中使用的皂素和阳离子脂质体的类型分别如下表12和表13所示。
表12
Figure BDA0003635120090000191
Figure BDA0003635120090000201
从表12所示的量中，选择了会引起60％溶血的皂素浓度，因为可使用的脂质体量有所限制。
表13
Figure BDA0003635120090000202
实施例5-2：脂质体的制造
使用以下方法制造本实施例中用的脂质体。
(1)将阳离子脂质和中性脂质称重并置于玻璃管中。
(2)加入氯仿使脂质浓度为4毫克/毫升，并在37℃下完全溶解10分钟以得到脂质溶液。
(3)将阳离子脂质溶液和中性脂质溶液在圆底烧瓶中以1:1的重量比例混合制备各个脂质混合物。
(4)使用旋转蒸发器，对含有DOTAP的脂质混合物在60℃下进行30分钟的挥发，对含有DDA的脂质混合物在80℃下进行30分钟挥发，进而观察有无氯仿残留以及在烧瓶壁上有无形成脂质膜层。
(5)将HEPES缓冲液(pH 7.4)中的蔗糖置于烧瓶中，使得脂质体浓度为4毫克/毫升，并在65℃下溶解脂质膜。
(6)由此制造的脂质体被保存在4℃冰箱中直至测试。
实施例5-3：溶血性分析的方法
(1)HEPES缓冲液(pH 7.4)中的脂质体、皂素、蔗糖以及蒸馏水被放入96孔盘中，如下表14和表15所示。
表14
Figure BDA0003635120090000211
表15
Figure BDA0003635120090000212
(2)使用回转式振荡机(Orbital Shaker)进行反应，在室温下以300rpm进行30分钟。
(3)3毫升的红血球悬浮在10毫升的PBS中，在室温下以1500rpm离心5分钟，之后移除上清液。
(4)步骤(3)重复三次，进而洗涤红血球。
(5)将红血球沉淀物悬浮于1毫升PBS中并稀释至1/100，随后进行细胞计数。
(6)使用PBS将红血球稀释至1.5x109个细胞/毫升，且按3x107细胞/20微升/孔分配至上述步骤(2)的经测试原料处理的96孔盘中。
(7)使用回转式振荡机进行反应，在室温下以300rpm进行1小时。
(8)将96孔盘在室温下以1500rpm离心5分钟。
(9)将50微升上清液转移到新的96孔盘上，以415nm测量吸亮度。
(10)使用以下公式计算溶血性(％)。
溶血性(％)＝(样本的光学密度(OD)-0％溶血性的光学密度)/(100％溶血性的光学密度-0％溶血性的光学密度)x 100
实施例5-4：抑制由类固醇皂素引起的溶血的效果确认
基于毛地黄皂素或巴黎皂素VII造成溶血性100％的浓度的测量结果，当毛地黄皂素的量为10微克或巴黎皂素VII的量为5微克时观察到溶血性100％，并且当毛地黄皂素的量为2.5微克或巴黎皂素VII的量为1.25微克时观察到溶血性60％(图16)。
因此，基于抑制由2.5微克的毛地黄皂素引起的溶血的DDA(18：0)：DMPC(14：0)和DDA(18：0)：DOPC(18：1)浓度的测量结果，DDA：DMPC没有抑制由毛地黄皂素引起的溶血，且当DDA：DOPC为400微克(脂质体：皂素＝160：1)时100％抑制由毛地黄皂素引起的溶血(图17)。
基于抑制由2.5微克的毛地黄皂素引起的溶血的DOTAP(18：1)：DMPC(14：0)和DOTAP(18：1)：DOPC(18：1)浓度的测量结果，当DOTAP：DMPC为400微克(脂质体：皂素＝160：1)时100％抑制由毛地黄皂素引起的溶血，且当DOTAP：DOPC为200微克(脂质体：皂素＝80：1)时100％抑制由毛地黄皂素引起的溶血(图18)。
此外，基于抑制由1.25微克的巴黎皂素VII引起的溶血的DDA(18：0)：DMPC(14：0)和DDA(18：0)：DOPC(18：1)浓度的测量结果，DDA：DMPC没有抑制由巴黎皂素VII引起的溶血，且当DDA：DOPC为400微克时50％抑制由巴黎皂素VII引起的溶血(图19)。
基于抑制由1.25微克的巴黎皂素VII引起的溶血的DOTAP(18：1)：DMPC(14：0)和DOTAP(18：1)：DOPC(18：1)浓度的测量结果，当DOTAP：DMPC为400微克(脂质体：皂素＝320：1)时100％抑制由巴黎皂素VII引起的溶血，且当DOTAP：DOPC为400微克时100％抑制由巴黎皂素VII引起的溶血(图20)。
实施例5-5：抑制由三萜皂素引起的溶血的效果确认
基于七叶素或α-常春藤素造成溶血性100％的浓度的测量结果，当七叶素为5微克或α-常春藤素为10微克时观察到溶血性100％，且当七叶素为2.5微克或α-常春藤素为1.25微克时观察到溶血性60％(图21)。
因此，基于抑制由2.5微克的七叶素引起的溶血的DDA(18：0)：DMPC(14：0)和DDA(18：0)：DOPC(18：1)浓度的测量结果，DDA：DMPC没有抑制由七叶素引起的溶血，且当DDA：DOPC为400微克(脂质体：皂素＝160：1)时100％抑制由七叶素引起的溶血(图22)。
基于抑制由2.5微克的七叶素引起的溶血的DOTAP(18：1)：DMPC(14：0)和DOTAP(18：1)：DOPC(18：1)浓度的测量结果，当DOTAP：DMPC和DOTAP：DOPC为200微克(脂质体：皂素＝80：1)时100％抑制由七叶素引起的溶血(图23)。
此外，基于抑制由1.25微克的α-常春藤素引起的溶血的DDA(18：0)：DMPC(14：0)和DDA(18：0)：DOPC(18：1)浓度的测量结果，DDA：DMPC没有抑制由α-常春藤素引起的溶血，且当DDA：DOPC为13微克(脂质体：皂素＝10.4：1)时100％抑制由α-常春藤素引起的溶血(图24)。
基于抑制由1.25微克的α-常春藤素引起的溶血的DOTAP(18：1)：DMPC(14：0)和DOTAP(18：1)：DOPC(18：1)浓度的测量结果，当DOTAP：DMPC和DOTAP：DOPC为13微克(脂质体：皂素＝10.4：1)时100％抑制由α-常春藤素引起的溶血(图25)。
实施例5-6：结果
抑制由各种皂素引起的溶血的脂质体量如下表16所示。
表16
Figure BDA0003635120090000231
Figure BDA0003635120090000241
IC50：抑制50％溶血的脂质体浓度。
IC100：抑制100％溶血的脂质体浓度。
从上述结果可以明显看出，当阳离子脂质体中含有不饱和脂肪酸时，其对由皂素引起的溶血的抑制效果是优秀的。
实施例6：在抑制由皂素引起的溶血的阳离子脂质体中的阳离子脂质和中性脂质的比例确认
为了确认抑制由皂素引起的溶血的阳离子脂质体中的阳离子脂质与中性脂质的比例，使用冷冻干燥法以阳离子脂质和中性脂质的各种比例制备阳离子脂质体，并进行溶血性分析。
实施例6-1：脂质体的制造
本实施例中使用的脂质体如下表17所示。
表17
Figure BDA0003635120090000242
使用下列方法制造表17中的脂质体。
(1)DDA、DOPC、DOTAP和DMPC各取240毫克并置于70毫升玻璃小瓶中。
(2)每个小瓶中放入60毫升三级丁醇以制备4毫克/毫升的脂质原液，然后加热10分钟使脂质完全溶解。
(3)各个脂质混合物由DDA、DOPC、DOTAP和DMPC混合在10毫升玻璃小瓶中制成，如下表18所示。
表18
Figure BDA0003635120090000251
(4)每个小瓶的瓶口用密封带覆盖，之后涡旋混合5秒，且用注射器针头在密封带上形成密集的孔。
(5)混合物在冰箱中以-70℃冷冻2小时后被转移到冷冻干燥机，随后以20帕和-80℃冷冻干燥约18小时，从而使有机溶剂挥发。
(6)将得到的糕状脂质体冷藏保存直至使用，并且每个小瓶与10毫升蔗糖在HEPES缓冲液(ph7.4)中水合供实验使用。
实施例6-2：溶血性分析的方法
(1)HEPES缓冲液(pH 7.4)中的脂质体、皂素、蔗糖以及蒸馏水被放入96孔盘中，如下表19和表20所示。
表19
Figure BDA0003635120090000252
Figure BDA0003635120090000261
表20
Figure BDA0003635120090000262
(2)使用回转式振荡机进行反应，在室温下以300rpm进行30分钟。
(3)3毫升的红血球悬浮在10毫升的PBS中，在室温下以1500rpm离心5分钟，之后移除上清液。
(4)步骤(3)重复三次，进而洗涤红血球。
(5)将红血球沉淀物悬浮于1毫升PBS中并稀释至1/100，随后进行细胞计数。
(6)使用PBS将红血球稀释至1.5x109个细胞/毫升，且按3x107细胞/20微升/孔分配至上述步骤(2)的经测试原料处理的96孔盘中。
(7)使用回转式振荡机进行反应，在室温下以300rpm进行1小时。
(8)96孔盘在室温下以1500rpm离心5分钟。
(9)将50微升上清液转移到新的96孔盘上，以415nm测量吸亮度。
(10)使用以下公式计算溶血性(％)。
溶血性(％)＝(样本的光学密度(OD)-0％溶血性的光学密度)/(100％溶血性的光学密度-0％溶血性的光学密度)x 100
实施例6-3：基于溶血性分析的结果确认在阳离子脂质体中的阳离子脂质和中性脂质的比例
(1)抑制皂素溶血的DDA(18:0)：DOPC(18:1)的脂质比例
当DDA：DOPC中的DDA含量为40％至60％时由2.5微克毛地黄皂素引起的溶血被100％抑制，且当DDA：DOPC中的DDA含量为30％至70％时由1.25微克的α-常春藤素引起的溶血被100％抑制(图26)。
当DDA：DOPC中的DDA含量为30％至70％时由2.5微克粗皂素引起的溶血被100％抑制，且当DDA：DOPC中的DDA含量为30％至70％时由2.5微克的QS21引起的溶血被100％抑制(图27)。
(2)抑制皂素溶血的DOTAP(18:1)：DMPC(14:0)的脂质比例
当DOTAP：DMPC中的DOTAP含量为40％或更多时由2.5微克毛地黄皂素引起的溶血被100％抑制，且当DOTAP：DMPC中的DOTAP含量为40％至90％时由1.25微克的α-常春藤素引起的溶血被100％抑制(图28)。
当DOTAP：DMPC中的DOTAP含量为30％或更多时由2.5微克粗皂素引起的溶血被100％抑制，且当DOTAP：DMPC中的DOTAP含量为30％或更多时由2.5微克的QS21引起的溶血被100％抑制(图29)。
(3)抑制皂素溶血的DOTAP(18:1)：DOPC(18:1)的脂质比例
当DOTAP：DOPC中的DOTAP含量为40％或更多时由2.5微克毛地黄皂素引起的溶血被100％抑制，且当DOTAP：DOPC中的DOTAP含量为20％或更多时由1.25微克的α-常春藤素引起的溶血被100％抑制(图30)。
当DOTAP：DOPC中的DOTAP含量为10％或更多时由2.5微克粗皂素引起的溶血被100％抑制，且当DOTAP：DOPC中的DOTAP含量为10％或更多时由2.5微克的QS21引起的溶血被100％抑制(图31)。
实施例6-4：结果
如实施例6-3所述，基于针对各种皂素的各种阳离子脂质体中阳离子脂质和中性脂质比例的测量结果，当阳离子脂质体中阳离子脂质和中性脂质的比例为10至100％时，可有效抑制由皂素引起的溶血(表21)。
表21
Figure BDA0003635120090000281
Figure BDA0003635120090000291
产业利用性
皂素展现出包括强而有效的免疫活性的广泛药理和生物活性，例如抗发炎活性等，因此在医学和药学上得到了有效利用，但其缺点是会造成红血球溶血。通常，皂素会与胆固醇等一起使用以抑制皂素溶血，但在本发明中，证实由皂素引起的红血球溶血可使用阳离子脂质体来抑制，这对于抑制由皂素引起的溶血更加有效和经济。因此，根据本发明，皂素可以更有用地应用于免疫增强剂、药物传递载体等物的制造。
尽管已经如上述详细揭露本发明的具体实施方案，但是对于本领域具通常知识者来说，显而易见的是该描述仅仅是优选的示例性实施方案，而不应被解释为限制本发明的范围。因此，本发明的实质保护范围将由权利要求及其均等物定义。

Claims (14)

1.一种抑制由皂素引起的红血球溶血的组合物，包含阳离子脂质体以及皂素，其中所述阳离子脂质体含有阳离子脂质以及中性脂质。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述阳离子脂质或所述中性脂质包含至少一个不饱和脂肪酸。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述阳离子脂质选自1,2-二油酰基-3-(三甲基铵)丙烷(DOTAP)、双十八烷基二甲基溴化铵(DDA)、3β-[N-(N',N'-二甲基氨基乙基)胺甲酰基]胆固醇(DC-Chol)、1,2-二油酰基-3-(二甲基铵)丙烷(DODAP)、1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)、1,2-二肉豆蔻烯酰基-sn-甘油-3-乙基磷胆碱(14:1Ethyl PC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-乙基磷胆碱(16:0-18:1Ethyl PC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-乙基磷胆碱(18:1Ethyl PC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-乙基磷胆碱(18:0Ethyl PC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-乙基磷胆碱(16:0Ethyl PC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-乙基磷胆碱(14:0Ethyl PC)、1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-乙基磷胆碱(12:0Ethyl PC)、N1-[2-((1S)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基丙基)氨基]丁基甲酰氨基)乙基]-3,4-二[油烯基氧基]苯甲酰胺(MVL5)、1,2-二肉豆蔻酰基-3-二甲基铵丙烷(14:0DAP)、1,2-二棕榈酰基-3-二甲基铵丙烷(16:0DAP)、1,2-二硬脂酰基-3-二甲基铵丙烷(18:0DAP)、N-(4-羧基苯甲基)-N,N-二甲基-2,3-双(油酰氧基)丙烷-1-铵(DOBAQ)、1,2-硬脂酰基-3-三甲基铵丙烷(18:0TAP)、1,2-二棕榈酰基-3-三甲基铵丙烷(16:0TA)、1,2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基铵丙烷(14:0TAP)以及N4-胆固醇精胺(GL67)。
4.如权利要求1所述的组合物，其中所述中性脂质选自1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DMPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷胆碱(DOPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷乙醇胺(DOPE)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷胆碱(DSPC)、1,2-二亚麻油酰基-sn-甘油-3-磷胆碱(DLPC)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、磷酸(PA)以及磷脂酰胆碱(PC)。
5.如权利要求1所述的组合物，其中所述阳离子脂质为由1,2-二油酰基-3-(三甲基铵)丙烷(DOTAP)或双十八烷基二甲基溴化铵(DDA)，且所述中性脂质选自1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DMPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷胆碱(DOPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷乙醇胺(DOPE)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷胆碱(DPPC)以及1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷胆碱(DSPC)中的任一种。
6.如权利要求1所述的组合物，其中所述阳离子脂质于所述阳离子脂质体中的重量比为10％至100％。
7.如权利要求1所述的组合物，其中该皂素为皂皮树衍生粗皂素、QS21、含有QS21的部分、类固醇皂素或三萜皂素。
8.一种用于免疫增强的组合物，包含如权利要求1至7中任一项所述的组合物。
9.如权利要求8所述的组合物，还包含佐剂。
10.一种用于药物传递的组合物，包含如权利要求1至7中任一项所述的组合物。
11.一种药物传递载体，包含阳离子脂质体，其中所述阳离子脂质体含有阳离子脂质以及中性脂质。
12.如权利要求11所述的药物传递载体，其中所述阳离子脂质或所述中性脂质包含至少一个不饱和脂肪酸。
13.一种药物载体复合物，其中药物被吸附至阳离子脂质体或被所述阳离子脂质体包裹，其中所述阳离子脂质体含有阳离子脂质以及中性脂质。
14.如权利要求13所述的药物载体复合物，其中所述阳离子脂质或所述中性脂质包含至少一个不饱和脂肪酸。
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