TW202203939A - 包含陽離子脂質體的用於抑制皂素溶血的組成物 - Google Patents

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Abstract

一種抑制由皂素引起的紅血球溶血的組成物，包含一陽離子脂質體以及一皂素，其中該陽離子脂質體含有一陽離子脂質以及一中性脂質。

Description

包含陽離子脂質體的用於抑制皂素溶血的組成物
本發明是關於一種具有抑制由皂素引起之紅血球溶血的效果的陽離子脂質體，特別是包含含有不飽和脂質的陽離子脂質體且抑制由皂素引起之紅血球溶血的組成物、包含抑制由皂素引起之紅血球溶血的組成物的用於免疫增強的組成物和用於藥物傳遞的組成物，以及包含含有不飽和脂質的陽離子脂質體的藥物傳遞載體和藥物載體複合物。
皂素(Saponin)是一種作為類固醇和三萜的次級代謝物產生的糖苷化合物。皂素展現出包括強而有效之免疫活性的廣泛藥理和生物活性，例如抗發炎活性等。通常，已知皂素具有提升免疫功能的效果，且皂素被使用作為疫苗的佐劑或抗癌劑(Newman MJ, et al., J. Immunol. 148:2357-2362, 1992; Sun HX, et al., Vaccine 27: 1787-1796, 2009)。然而，皂素會引起起泡作用和溶血作用，「溶血作用」意指紅血球被破壞且其內容物(細胞質)溶解在周圍的液體(例如血漿)中，這被稱作溶血反應或簡稱溶血(Hemolysis)。溶血發生起因於紅血球細胞膜中的膽固醇與皂素緊密結合從而破壞膜結構。
為了使用皂素作為藥用，由皂素引起的紅血球溶血需要被抑制，並且往往會使用膽固醇。通常，在生產藥品等產品時，動物性成分的膽固醇受到嚴格的管理標準，並且為了克服這個問題，近來已經開發出半合成或合成膽固醇用於藥品的製造，但其不利之處在於價格非常高昂。
長期以來，一直在研究安全高效地傳遞各種藥物的技術。包囊技術(Encapsulation technology)被使用以在製造、配送等期間保持藥物活性不發生變質。此技術可以藉由將藥物包裹在載體(如脂質體(Liposome))中而最大限度地減少藥物的變質和損失，並使其可能含有親水和親脂物質。在藥品中作為藥物傳遞載體和保護劑的一種膠囊配方在醫藥領域中被使用於基因治療和癌症化療，並且在化妝品領域中作為有效物質傳遞載體和水傳遞載體。包囊技術還能在控制釋放速率以及在穩態下儲存所含物質方面起著重要作用。
脂質體是一種自組裝的脂質雙層結構，且是一種具有疏水部分和親水部分的兩親分子。脂質體有傑出的生物相容性、製造簡單和能輸送水溶性和脂溶性藥物的優勢，因此對脂質體作為藥物載體在體內產生較少副作用的深入研究正在進行中(Kwang Jae Cho, Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 2007;50(7): 562-572)。脂質體化學性質穩定、無刺激性、無毒且結構近似皮膚生物脂膜。此外，因為可以透過各種方式改變表面性質來製造它，它可以用於多種用途如化妝品、藥物、佐劑、藥物傳遞系統等。
在這樣的技術背景下，發明人在利用皂素的治療功效或免疫增強功能的同時，努力抑制當施用皂素到體內時發生的溶血，並因此查明當皂素與包含不飽和陽離子脂質或中性脂質之陽離子脂質體混合時，單獨施用皂素時發生的溶血現象可被有效抑制，進而使本發明達到絕頂。
背景技術部分中描述的資訊僅用於增進對本發明背景的理解，並且不應該被解釋成包括形成本發明所屬技術領域中具有通常知識者已經知道的相關技術的資訊。
本發明的目的是提供一種用於抑制由皂素引起的紅血球溶血的組成物，包含陽離子脂質體，其具有抑制由皂素引起的紅血球溶血之能力。
本發明的另一目的是提供一種包含將組成物施用於受試體的抑制由皂素引起的紅血球溶血的方法、組成物在抑制由皂素引起的紅血球溶血的用途以及組成物在製備用於抑制由皂素引起的紅血球溶血之治療劑的用途。
本發明的另一目的是提供一種用於免疫增強的組合物，包含用於抑制由皂素引起的紅血球溶血的組成物。
本發明的又另一目的是提供一種包含將用於免疫增強的組成物施用於受試體的增強免疫的方法、用於免疫增強的組成物在增強免疫的用途以及用於免疫增強的組成物在製備用於免疫增強之治療劑的用途。
本發明的進一步目的是提供一種用於藥物傳遞的組成物，包含用於抑制由皂素引起的紅血球溶血的組成物。
本發明的再另一目的是提供一種包含含有陽離子脂質和中性脂質之陽離子脂質體的藥物傳遞載體，以及藥物載體複合物於其中藥物吸附至含有陽離子脂質以及中性脂質陽離子脂質體或被所述陽離子脂質體包裹。
為了達到上述目的，本發明提供一種用於抑制由皂素引起的紅血球溶血的組成物，包含陽離子脂質體，且陽離子脂質體含有陽離子脂質、中性脂質以及皂素。
此外，本發明提供一種包含將用於抑制由皂素引起的紅血球溶血的組成物施用於受試體的抑制由皂素引起的紅血球溶血的方法、用於抑制由皂素引起的紅血球溶血的組成物在抑制皂素引起的紅血球溶血的用途，以及用於抑制由皂素引起的紅血球溶血的組成物在製備用於抑制皂素引起的紅血球溶血之治療劑的用途。
此外，本發明提供一種用於免疫增強的組成物，包含用於抑制由皂素引起的紅血球溶血的組成物。
此外，本發明提供一種包含將用於免疫增強的組成物施用於受試體的增強免疫的方法、用於免疫增強的組成物在增強免疫的用途，以及用於免疫增強的組成物在製備用於免疫增強之治療劑的用途
此外，本發明提供一種用於藥物傳遞的組成物，包含用於抑制由皂素引起的紅血球溶血的組成物。
此外，本發明提供一種藥物傳遞載體，包含含有陽離子脂質以及中性脂質的陽離子脂質體。
此外，本發明提供一種藥物載體複合物，藥物於藥物載體複合物中吸附至陽離子脂質體或被陽離子脂質體包裹，其中所述陽離子脂質體含有陽離子脂質以及中性脂質。
除非另有定義，本發明所使用的所有技術和科學術語的含義與本發明所屬技術領域具有通常知識者典型理解的含義相同。實際上，此處使用的命名法和下面描述的測試方法在本技術領域中是眾所周知的並且是典型的。
脂質體根據表面電荷、尺寸、膜結構等性質有不同的分類。例如，脂質體的表面電荷由中性脂質、陽離子脂質、陰離子脂質等多種脂質材料的組合決定。
在本發明的一實施例中，開發出一種能夠抑制由皂素引起的紅血球溶血的陽離子脂質體，並且它被證實能有效適用於使用皂素的藥物傳遞載體之製造以及免疫增強配方，即使沒有使用通常為了抑制由皂素引起之溶血會使用的膽固醇。這保證了皂素在醫療和製藥目的上的安全使用。
因此，在一方面，本發明涉及一種包含陽離子脂質體和皂素的用於抑制由皂素引起的紅血球溶血的組合物，其中陽離子脂質體中含有陽離子脂質和中性脂質。
此處使用的術語「脂質」包含脂肪酸、磷脂、脂肪酸酯、類固醇及它們的類似物。術語「不飽和脂質」是指在脂質含有的脂肪酸鏈中包含至少一個碳-碳雙鍵的脂質。
在本發明中，陽離子脂質或中性脂質可包含至少一不飽和脂肪酸。
在本發明中，陽離子脂質或中性脂質可包含至少一個不飽和脂肪酸鏈，每個不飽和脂肪酸鏈具有10至20個碳原子，優選14至18個碳原子，並且每個脂肪酸鏈中含有的碳-碳雙鍵數為1至6個，優選1個。
根據本發明所述用於抑制溶血的組合物中含有的陽離子脂質和中性脂質其中任一者可以是不飽和脂質，剩餘的另一者可以是不飽和脂質或飽和脂質。
在本發明中，陽離子脂質可選自由1,2-二油醯基-3-(三甲基銨)丙烷(1,2-dioleoyl-3-(trimethylammonium)propane，DOTAP)、雙十八烷基二甲基溴化銨(dimethyldioctadecylammonium bromide，DDA)、3β-[N-(N',N'-二甲基胺基乙基)胺甲醯基]膽固醇(3β-[N-(N’,N’-dimethylaminoethane)carbamoyl]cholesterol，DC-Chol)、1,2-二油醯基-3-(二甲基銨)丙烷(1,2-dioleoyl-3-(dimethylammonium)propane，DODAP)、1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基銨丙烷(1,2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium propane，DOTMA)、1,2-二肉豆蔻烯醯基-sn -甘油-3-乙基磷膽鹼(1,2-dimyristoleoyl-sn -glycero-3-ethylphosphocholine，14:1 Ethyl PC)、1-棕櫚醯基-2-油醯基-sn -甘油-3-乙基磷膽鹼(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn -glycero-3-ethylphosphocholine，16:0-18:1 Ethyl PC)、1,2-二油醯基-sn -甘油-3-乙基磷膽鹼(1,2-dioleoyl-sn -glycero-3-ethylphosphocholine，18:1 Ethyl PC)、1,2-二硬脂醯基-sn -甘油-3-乙基磷膽鹼(1,2-distearoyl-sn -glycero-3-ethylphosphocholine，18:0 Ethyl PC)、1,2-二棕櫚醯基-sn -甘油-3-乙基磷膽鹼(1,2-dipalmitoyl-sn -glycero-3-ethylphosphocholine，16:0 Ethyl PC)、1,2-二肉豆蔻醯基-sn -甘油-3-乙基磷膽鹼(1,2-dimyristoyl-sn -glycero-3-ethylphosphocholine，14:0 Ethyl PC)、1,2-二月桂醯基-sn -甘油-3-乙基磷膽鹼(1,2-dilauroyl-sn -glycero-3-ethylphosphocholine，12:0 Ethyl PC)、N1-[2-((1S)-1-[(3-胺基丙基)胺基]-4-[二(3-胺基丙基)胺基]丁基甲醯胺基)乙基]-3,4-二[油烯基氧基]苯甲醯胺(N1-[2-((1S)-1-[(3-aminopropyl)amino]-4-[di(3-amino-propyl)amino]butylcarboxamido)ethyl]-3,4-di[oleyloxy]-benzamide，MVL5)、1,2-二肉豆蔻醯基-3-二甲基銨丙烷(1,2-dimyristoyl-3-dimethylammonium-propane，14:0 DAP)、1,2-二棕櫚醯基-3-二甲基銨丙烷(1,2-dipalmitoyl-3-dimethylammonium-propane，16:0 DAP)、1,2-二硬脂醯基-3-二甲基銨丙烷(1,2-distearoyl-3-dimethylammonium-propane，18:0 DAP)、N-(4-羧基苯甲基)-N,N-二甲基-2,3-雙(油醯氧基)丙烷-1-銨(N-(4-carboxybenzyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(oleoyloxy)propan-1-aminium，DOBAQ)、1,2-硬脂醯基-3-三甲基銨丙烷(1,2-stearoyl-3-trimethylammonium-propane，18:0 TAP)、1,2-二棕櫚醯基-3-三甲基銨丙烷(1,2-dipalmitoyl-3-trimethylammonium-propane，16:0 TA)、1,2-二肉豆蔻醯基-3-三甲基銨丙烷(1,2-dimyristoyl-3-trimethylammonium-propane，14:0 TAP)以及N4-膽固醇精胺(N4-cholesteryl-spermine，GL67)所組成的群組，但本發明並不以此為限。
陽離子脂質可包含於其中的陽離子官能基被引入膽固醇衍生物等的脂質。
在本發明中，中性脂質可選自由1,2-二肉豆蔻醯基-sn -甘油-3-磷脂醯膽鹼(1,2-dimyristoyl-sn -glycero-3-phosphatidylcholine，DMPC)、1,2-二油醯基-sn -甘油-3-磷膽鹼(1,2-dioleoyl-sn -glycero-3-phosphocholine，DOPC)、1,2-二油醯基-sn -甘油-3-磷乙醇胺(1,2-dioleoyl-sn -glycero-3-phosphoethanolamine，DOPE)、1,2-二棕櫚醯基-sn -甘油-3-磷膽鹼(1,2-dipalmitoyl-sn -glycero-3-phosphocholine，DPPC)、1,2-二硬脂醯基-sn -甘油-3-磷膽鹼(1,2-distearoyl-sn -glycero-3-phosphocholine，DSPC)、1,2-二亞麻油醯基-sn -甘油-3-磷膽鹼(1,2-dilinoleoyl-sn -glycero-3-phosphocholine，DLPC)、磷脂醯絲胺酸(phosphatidylserine，PS)、磷脂醯乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)、磷脂醯甘油(phosphatidylglycerol，PG)、磷酸(phosphoric acid，PA)以及磷脂醯膽鹼(phosphatidylcholine，PC)所組成的群組，但本發明並不以此為限。
優選地，陽離子脂質為DOTAP或DDA，且中性脂質為DMPC、DOPC、DOPE、DPPC或DSPC，但本發明並不以此為限。
在本發明中，陽離子脂質於陽離子脂質體中的重量比可為10%至100%，但不限於此。在本發明中，所使用的「重量比」與「量(Amount)」含義相同。
在本發明的一實施例中，可以確定在抑制皂素溶血的陽離子脂質體中，陽離子脂質DDA的量為30%至70%，陽離子脂質DOTAP的量為10%至100%。
在本發明中，脂質體還可包含醣脂，所述醣脂可以是由二半乳糖基甘油二酯(digalactosyldiglyceride)、半乳糖基甘油二酯硫酸酯(galactosyldiglyceride sulfuric acid ester)和鞘醣脂(sphingoglycolipid)所組成的群組中的至少其中一者，但不限於此。鞘醣脂例如為半乳糖基神經醯胺(galactosylceramide)、半乳糖基神經醯胺硫酸酯(galactosylceramide sulfuric acid ester)、乳糖基神經醯胺(lactosylceramide)、神經節苷脂(ganglioside)G7、神經節苷脂G6和神經節苷脂G4。
脂質體還可以包含固醇衍生物，且固醇衍生物可以是選自由膽固醇、二氫膽固醇(dihydrocholesterol)、膽固醇酯、植物固醇、穀固醇、豆固醇、菜油固醇、膽甾烷醇、羊毛甾醇、1-O-固醇葡糖苷(1-O-sterolglucoside)、1-O-固醇麥芽糖苷(1-O-sterolmaltoside)和1-O-固醇半乳糖苷(1-O-sterolgalactoside)所組成的群組中的至少其中一者，但並不以此為限。
脂質體還可進一步包含乙二醇衍生物，且乙二醇衍生物可以是選自由乙二醇、二甘醇、三甘醇、丙二醇、二丙二醇、1,3-丙二醇(trimethylene glycol)和1,4-丁二醇所組成的群組中的至少其中一者，但並不以此為限。
脂質體還可進一步包含脂族胺，且脂族胺可以是選自由硬脂胺、辛胺、油胺和亞油胺所組成的群組中的至少其中一者，但並不以此為限。
製造脂質體的方法可分類成「自上而下(top-down)的方法」及「自下而上(bottom-up)的方法」，其中「自上而下的方法」包含形成大尺寸脂質體然後將其分成小尺寸脂質體，「自下而上的方法」包含使用脂質單體組裝小尺寸脂質體。為了使用自上而下的方法製造脂質體，將脂質溶解在有機溶劑中、除去有機溶劑並且用水溶液再水合脂質。
製造脂質體的典型方法可包含膜再水合方法或脂質水合方法。使用這種方法形成大單室脂質體(LUV)，然後使用均質器、微流化器或高壓均質器對大單室脂質體進行物理破壞，從而製造出具有所需尺寸的脂質體。
本發明的陽離子脂質體可以採用薄膜法、注射法或冷凍乾燥法製造，但本發明不以此為限。
薄膜法是將脂質溶解在有機溶劑中，經乾燥後形成脂質膜，然後加入溶液以提供陽離子脂質體。注射法是用注射器滴下含有脂質的有機溶劑以提供陽離子脂質體。冷凍乾燥法是將脂質溶解在有機溶劑中並進行冷凍乾燥從而使有機溶劑揮發，然後用溶液將脂質再水合以提供陽離子脂質體。
在本發明中，如此製造的脂質體可選擇性地冷凍乾燥以易於儲存。經冷凍乾燥形成糕餅狀、斑塊狀或粉末狀的脂質體於使用時可用無菌水回溶之後施用。
使用本發明的方法製造的脂質體可用於藥物注射、經皮輸藥、經鼻輸藥和肺輸藥。這種配方和藥物上適當的載體、添加劑等所需要的技術是藥物技術領域具有通常知識者所普遍知道的。關於這方面的知識，可以參考Remington的《藥學科學》(Pharmaceutical Sciences)(第19版，1995)。
在本發明中，可透過靜電吸引將皂素吸附到陽離子脂質體上，但本發明不以此限。或者，皂素可能包含在陽離子脂質體中，或者皂素可與陽離子脂質體的脂質膜結合。
此處使用的術語「吸附」意指一種材料與脂質體的內部或外部結合，並且只要根據本發明的皂素能夠有效傳遞，結合的形式沒有特別限制。
在本發明中，皂素可以選自於由人參皂素Rb1、毛地黃皂素、β-七葉素、皂皮樹衍生粗皂素(Quillaja saponaria-derived crude saponin)及其部分、QS21、Quil A、QS7、QS18、QS17及其鹽類、類固醇皂素及三萜皂素所組成的群組，但本發明並不以此為限。類固醇皂素可包括毛地黃皂素或巴黎皂素VII，且三萜皂素可包括七葉素、α-常春藤素、常春藤皂配基、刺囊酸、Chrysanthellin A、Chrysanthellin B、貝萼皂素(bayogenin)、苜蓿酸、山楂酸，齊墩果酸，紅二醇，或積雪草酸(asiatic acid)。優選地，皂素為皂皮樹衍生粗皂素、QS21、毛地黃皂素、巴黎皂素VII、七葉素或α-常春藤素。
根據本發明的用於抑制由皂素引起的紅血球溶血的組成物可包含單獨陽離子脂質體的藥學上有效量，或是進一步包含至少一藥學上可接受載體、賦形劑或稀釋劑。所述「藥學上有效量」為足以抑制由皂素引起的紅血球溶血的量。
術語「藥學上可接受」意指在生理學上是可以接受的，當施用於人體時通常不會引起腸胃紊亂、過敏反應如頭暈或類似的反應。載體、賦形劑和稀釋劑的例子可包含乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤蘚醇、麥芽糖醇、澱粉、阿拉伯膠、藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、矽酸鈣、纖維素、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂和礦物油。此外，還可額外包含添加劑、防結塊劑、潤滑劑、潤濕劑、香料、乳化劑和防腐劑。
根據本發明的用於抑制由皂素引起的紅血球溶血的組成物可以使用本技術領域已知的方法配製，以便在施用於哺乳動物之後提供活性成分的快速、持續或延遲釋放。配方可以是粉末、顆粒、片劑、乳劑、糖漿、氣霧、軟的或硬的明膠膠囊、無菌注射溶液、凍乾粉末和無菌粉末的形式。
根據本發明的用於抑制由皂素引起的紅血球溶血的組成物可以通過各種途徑給藥，包含口服、經皮給藥、皮下注射、靜脈注射或肌肉注射，並且可根據給藥途徑、患者年齡、性別、體重、疾病嚴重程度等因素適當選擇活性成分的劑量。
另一方面，本發明涉及一種抑制由皂素引起的紅血球溶血的方法，包含將用於抑制由皂素引起的紅血球溶血的組成物施用於受試體。
另一方面，本發明涉及一種用於抑制由皂素引起的紅血球溶血的組成物在抑制由皂素引起的紅血球溶血的用途。
另一方面，本發明涉及一種用於抑制由皂素引起的紅血球溶血的組成物在製備用於抑制由皂素引起的紅血球溶血之治療劑的用途。
在本發明中，方法和用途包含上述用於抑制由皂素引起的紅血球溶血的組成物，因此與根據本發明的用於抑制溶血的組成物的上述內容重複之描述將被省略。
另一方面，本發明涉及一種用於免疫增強的組成物，包含用於抑制由皂素引起的紅血球溶血的組成物。
另一方面，本發明涉及一種增強免疫的方法，包含將用於免疫增強的組成物施用於受試體。
另一方面，本發明涉及一種用於免疫增強的組成物在增強免疫的用途。
另一方面，本發明涉及一種用於免疫增強的組成物在製備用於免疫增強之治療劑的用途。
在本發明中，用於免疫增強的組成物、增強免疫的方法以及用於免疫增強的組成物的用途包含上述用於抑制由皂素引起的紅血球溶血的組成物，因此與根據本發明的用於抑制溶血的組成物的上述內容重複之描述將被省略。
此處，使用的術語「免疫增強」意指引起初始的免疫反應或以可測定的程度增加對抗原的現有免疫反應。
在本發明中，用於增強免疫的組合物可單獨使用或與佐劑共同使用以形成醫藥組合物。
佐劑可包含例如選自由鎂、鈣、鍶、鋇及鐳組成之群組的第2族元素或其鹽；選自由鈦、鋯、鉿及鑪組成之群組的第4族元素；鋁鹽或其水合物；或是二甲基十八烷溴化銨(dimethyloctadecylammonium bromide)。鹽可以例如由氧化物、過氧化物、氫氧化物、碳酸鹽、磷酸鹽、焦磷酸鹽、磷酸氫鹽、磷酸二氫鹽、硫酸鹽和矽酸鹽形成。
另外，佐劑可包含例如模式識別受體(PRR)促效劑，其選自由類鐸受體(TLR)促效劑、類維甲酸誘導基因-I受體(RIG-I-like receptor，RLR)促效劑及類短鏈核疳酸結合及聚合區塊受體(NOD-like receptors，NLR)促效劑所組成的群組。
另一方面，本發明涉及一種用於藥物傳遞的組成物，包含用於抑制由皂素引起的紅血球溶血的組成物。
另一方面，本發明涉及一種藥物傳遞載體，包含陽離子脂質體，其中陽離子脂質體含有陽離子脂質和中性脂質。
另一方面，本發明涉及一種藥物載體複合物，藥物於藥物載體複合物中吸附至陽離子脂質體或被陽離子脂質體包裹於其中，且陽離子脂質體含有陽離子脂質以及中性脂質。
在本發明中，陽離子脂質或中性脂質可包含至少一不飽和脂肪酸。
在本發明中，用於藥物傳遞的組成物、藥物傳遞載體及藥物載體複合物包含前述含有陽離子脂質和中性脂質的陽離子脂質體，因此與根據本發明的含有陽離子脂質和中性脂質的陽離子脂質體的上述內容重複之描述將被省略。
在本發明中，只要藥物能夠使用例如蛋白質、核酸、胜肽、化合物、抗原或天然材料的本發明陽離子脂質體傳遞，如蛋白質、核酸、胜肽、化合物、抗原或天然材料的藥物可以不受限制地施用。
根據本發明的用於免疫增強的組成物或用於藥物傳遞的組成物可進一步包含常用於製造醫藥組合物的合適賦形劑和稀釋劑(Remington’s Pharmaceutical Science, Mack Publishing Co., Easton PA)。此外，組成物可按個別典型方法配製成粉末、顆粒、片劑、膠囊、懸浮液、乳劑、糖漿、氣霧等口服劑型以及無菌注射液形式。
用於免疫增強的組成物或用於藥物傳遞的組成物所包含的載體、賦形劑和稀釋劑之例子可包含乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、麥芽糖醇、澱粉、甘油、阿拉伯膠、藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、矽酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂和礦物油。
通常可用來配製組成物的稀釋劑或賦形劑例如為添加劑、增量劑、粘合劑、潤濕劑、崩散劑和界面活性劑等。口服用的固體配方可包含片劑、丸劑、粉末、顆粒、膠囊等，並且可使用例如澱粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖、明膠等至少一賦形劑製造此固體配方。除了簡單的賦形劑，也可使用硬脂酸鎂和滑石等潤滑劑。口服用的液體配方可使用懸浮液、內服液、乳劑、糖漿等。除了普遍使用水和液體石臘作為稀釋劑，當中可包含各種賦形劑如潤濕劑、甜味劑、香料、防腐劑等。非消化道給藥用的配方可包含無菌水溶液、非水配方、懸浮液、乳劑和凍乾配方。
對於非水性配方和懸浮液，可使用丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄欖油)、可注射酯類(如油酸乙酯)及它們的類似物。
根據本發明的用於免疫增強的組成物或用於藥物傳遞的組成物之劑量可根據受試體的年齡、性別、體重等而改變，且劑量可根據給藥途徑、疾病的嚴重程度、性別、體重、年齡等而增加或減少。
以下，本發明將參照實例更詳細地描述。然而，對本技術領域具通常之事者顯而易見的是這些實例僅被提供用於說明本發明，而不應解釋為限制本發明的範圍。
實例1：原料
作為以下實例中脂質體原料的脂質如下表1所示。
表1
脂質類型 脂肪酸 電荷 (pH 7.4) 結構
陽離子脂質 雙十八烷基二甲基溴化銨(DDA) 18：0 +1
Figure 02_image001
1,2-二油醯基-3-(三甲基銨)丙烷(DOTAP) 18：1 +1
Figure 02_image003
中性脂質 1,2-二肉豆蔻醯基-sn -甘油-3-磷脂醯膽鹼(DMPC) 14：0 0
Figure 02_image005
1,2-二棕櫚醯基-sn -甘油-3-磷膽鹼(DPPC) 16：0 0
Figure 02_image007
1,2-二硬脂醯基-sn -甘油-3-磷膽鹼(DSPC) 18：0 0
Figure 02_image009
1,2-二油醯基-sn -甘油-3-磷膽鹼(DOPC) 18：1 0
Figure 02_image011
1,2-二油醯基-sn -甘油-3-磷乙醇胺(DOPE) 18：1 0
Figure 02_image013
陰離子脂質 1,2-二肉豆蔻醯基-sn -甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(DMPG) 14：0 -1
Figure 02_image015
表1中，(18:0)、(18:1)、(14:0)、(16:0)等代表各脂質的飽和程度，「N：0」代表完全飽和的脂質，且「N：1」代表相對於N個碳原子的不飽和比例為1的脂質。
脂質的來源如下：
陽離子脂質：DOTAP(Merck)、DDA(Sigma-Aldrich)。
中性脂質：DMPC(Corden Pharma)、DOPC、DOPE、DSPC、DPPC(Avanti Polar Lipids)。
陰離子脂質：DMPG (Avanti Polar Lipids)。
實例2：不同極性的脂質體抑制粗皂素溶血的能力的比較
為了確認脂質體抑制粗皂素溶血的能力取決於其極性，利用冷凍乾燥法製造陽離子、中性和陰離子脂質體，並且進行溶血性分析。
實例2-1：脂質體的製造
本實例中使用的脂質體類型如下表2所示。
表2
編號 脂質體 重量比(%) 濃度(mg/mL)
1 DDA:DOPC 50:50 2
2 DOPC 100 2
3 DMPG:DOPC 50:50 2
使用下列方法製造表2所示的脂質體。
(1)DDA、DOPC和DMPG各取40毫克(mg)置於70 毫升(mL)玻璃小瓶中。
(2)每個小瓶中放入20毫升三級丁醇(t-butyl alcohol)以製備2毫克/毫升的脂質原液，然後在65°C水浴中加熱10分鐘，而使脂質完全溶解。
(3)各個脂質混合物由DDA、DOPC和DMPG混合在10毫升玻璃小瓶中製成，如下表3所示。
表3
DDA:DOPC DOPC DMPG:DOPC
DDA DOPC DOPC DMPG DOPC
5 mL 5 mL 10 mL 5 mL 5 mL
(4)每個小瓶的瓶口用密封帶覆蓋，之後渦旋混合(Vortex mixing)5秒，並用注射器針頭在密封帶上形成密集的孔。
(5)混合物在冰箱中以-70°C冷凍2小時後被轉移到冷凍乾燥機，然後以20帕(Pa)和-80°C冷凍乾燥約18小時，從而使有機溶劑揮發。
(6)將得到的糕餅狀脂質體冷藏保存直至使用，並且每個小瓶與10毫升蔗糖在HEPES緩衝液(ph7.4)中水合供實驗使用。
實例2-2：溶血性分析的方法
(1)HEPES緩衝液(pH 7.4)中的脂質體、皂素、蔗糖以及蒸餾水被放入96孔盤中，如下表4和表5所示。
表4
有皂素(脂質體濃度：2 mg/mL；皂素濃度：1 mg/mL)
組 脂質體濃度(μg/孔) 100%溶血性控制組 0%溶血性控制組
0 10 20 40 50 60 80 100
脂質體(μL) 0 5 10 20 25 30 40 50 0 0
皂素 (μL) 10 10 10 10 10 10 10 10 0 0
緩衝液(μL) 90 85 80 70 65 60 50 40 0 100
蒸餾水(μL) 0 0 0 0 0 0 0 0 100 0
表5
沒有皂素
組 脂質體濃度(μg/孔) 100%溶血性控制組 0%溶血性控制組
0 10 20 40 50 60 80 100
脂質體(μL) 0 5 10 20 25 30 40 50 0 0
皂素 (μL) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
緩衝液(μL) 90 85 80 70 65 60 50 40 0 100
蒸餾水(μL) 10 10 10 10 10 10 10 10 100 0
(2)使用迴轉式振盪機(Orbital Shaker)進行反應，在室溫下以300每分鐘轉數(rpm)進行30分鐘。
(3)3毫升的紅血球(RBCs)懸浮在10毫升的磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)中，在室溫下以1500rpm離心5分鐘，之後移除上清液。
(4)步驟(3)重複三次，進而洗滌紅血球。
(5)將紅血球沉澱物懸浮於1毫升PBS中並稀釋至1/100，隨後進行細胞計數。
(6)使用PBS將紅血球稀釋至1.5x109 個細胞/毫升，且按3x107 細胞/20微升(μL)/孔分配至上述步驟(2)的經測試原料處理的96孔盤中。
(7)使用迴轉式振盪機進行反應，在室溫下以300rpm進行1小時。
(8)96孔盤在室溫下以1500rpm離心5分鐘。
(9)將50微升上清液轉移到新的96孔盤上，以415 nm測量吸光度。
(10)使用以下公式計算溶血性(%)。 溶血性(%) = (樣本的光學密度(OD) - 0%溶血性的光學密度)/(100%溶血性的光學密度 - 0%溶血性的光學密度) x 100
實例2-3：溶血性分析的結果
確認脂質體極性對於抑制由10微克(μg)粗皂素引起之溶血的效果。
因此，中性脂質體(DOPC)和陰離子脂質體(DMPG：DOPC)對由粗皂素引起的溶血均無抑制作用(圖1)，而100微克陽離子脂質體(DDA：DOPC)對由粗皂素引起的溶血有85%的抑制作用(圖2)。
實例3：用於抑制由皂素引起的溶血的陽離子脂質體的篩選
為了確認陽離子脂質體對於抑制由皂素引起的溶血的效果取決於陽離子脂質和中性脂質的不飽和程度，採用脂膜法製造各種脂質體，並分析其溶血性和細胞毒性(HaCaT, L6, J774A.1)。
實例3-1：脂質體的製造
本實例中使用的脂質體類型如下表6所示。
表6
編號 脂質體 重量比(%) 濃度(mg/mL)
1 DDA：DMPC 50：50 2
2 DDA：DPPC
3 DDA：DSPC
4 DDA：DOPC
5 DOTAP：DMPC 50：50 2
6 DOTAP：DPPC
7 DOTAP：DSPC
8 DOTAP：DOPC
9 DOTAP：DOPE
使用下列方法製造表6中的脂質體。
(1)將陽離子脂質和中性脂質稱重並置於玻璃管中。
(2)加入氯仿(Daejung)使脂質濃度為2毫克/毫升，並在37o C下完全溶解10分鐘以得到脂質溶液。
(3)將陽離子脂質溶液和中性脂質溶液在圓底燒瓶中以1:1的重量比例混合製備各個脂質混合物。
(4)使用旋轉蒸發器，對含有DOTAP的脂質混合物在60o C下進行30分鐘的揮發，對含有DDA的脂質混合物在80o C下進行30分鐘揮發，觀察有無氯仿殘留以及在燒瓶壁上有無形成脂質膜層。
(5)將HEPES緩衝液(pH 7.4)中的蔗糖置於燒瓶中，使得脂質體濃度為2毫克/毫升，並在65o C下溶解脂質膜。
(6)如此製造的脂質體以500微升的量分配到每個玻璃小瓶中，用橡膠塞關閉小瓶的瓶口，並且將小瓶放入冷凍乾燥器(IlShinBioBase/ lyopho -pride10, SXX2)中後進行冷凍乾燥，如下表7所示。
表7
步驟 狀態 溫度(°C) 時間(hr) 真空度(mTorr)
1 預冷凍 -40 2 999
2 維持溫度 -40 27 50
3 上升溫度 -20 10 50
4 維持溫度 -20 2 50
5 上升溫度 20 10 50
6 維持溫度 20 13 50
(7)由此製造的脂質體被保存在4o C冰箱中直至測試。
實例3-2：溶血性分析的方法
(1)冷凍乾燥後，用225微升蒸餾水水合儲存於玻璃小瓶中的脂質體，在60°C下反應10分鐘使脂質體完全溶解。
(2)HEPES緩衝液(pH 7.4)中的脂質體、皂素、蔗糖以及蒸餾水被放入96孔盤中，如下表8和表9所示。
表8
有皂素(脂質體濃度：4.4 mg/mL；皂素濃度：0.25mg/mL)
組 脂質體濃度(μg/孔) 100%溶血性控制組 0%溶血性控制組
0 2 3 6 13 25 50 100
脂質體(μL) 0.0 0.4 0.7 1.4 2.8 5.6 11.3 22.5 0 0
皂素 (μL) 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 0 0
緩衝液(μL) 100.0 99.6 99.3 98.6 97.2 94.4 88.8 77.5 0 110
蒸餾水(μL) 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 110 0
表9
沒有皂素
組 脂質體濃度(μg/孔) 100%溶血性控制組 0%溶血性控制組
0 2 3 6 13 25 50 100
脂質體(μL) 0.0 0.4 0.7 1.4 2.8 5.6 11.3 22.5 0 0
皂素 (μL) 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0 0
緩衝液(μL) 100.0 99.6 99.3 98.6 97.2 94.4 88.8 77.5 0 110
蒸餾水(μL) 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 110 0
(3)使用迴轉式振盪機進行反應，在室溫下以300rpm進行30分鐘。
(4)3毫升的紅血球懸浮在10毫升的PBS中，在室溫下以1500rpm離心5分鐘，之後移除上清液。
(5)步驟(4)重複三次，進而洗滌紅血球。
(6)將紅血球沉澱物懸浮於1毫升PBS中並稀釋至1/100，隨後進行細胞計數。
(7)PBS將紅血球稀釋至1.5x109 個細胞/毫升，且按3×107 細胞/20微升/孔分配至上述步驟(3)的經試驗原料處理的96孔盤中。
(8)使用迴轉式振盪機進行反應，在室溫下以300rpm進行1小時。
(9)96孔盤在室溫下以1500rpm離心5分鐘。
(10)將50微升上清液轉移到新的96孔盤上，以415 nm測量吸光度。
(11)使用以下公式計算溶血性(%)。 溶血性(%) = (樣本的光學密度 - 0%溶血性的光學密度)/(100%溶血性的光學密度 - 0%溶血性的光學密度) x 100
實例3-3：引起溶血之皂素濃度的確認
基於皂皮樹衍生粗皂素(VET-SAP®, Desert King)和QS21(Desert King)的濃度決定溶血性的結果，當粗皂素或QS21的用量為2.5微克時，溶血性為100%(圖3和圖4)。
實例3-4：陽離子脂質體對於抑制由皂素引起之溶血的效果的確認
觀察抑制由2.5微克粗皂素或QS21引起的溶血的陽離子脂質體類型和濃度。
因此，發現DDA：DMPC、DDA：DPPC和DDA：DSPC對於由粗皂素或QS21引起的溶血沒有達到100%抑制(圖5至圖7)。另一方面，當使用25微克的DDA：DOPC(脂質體：皂素= 10：1)、50微克的DOTAP：DMPC (脂質體：皂素=20：1)、50微克的DOTAP：DPPC(脂質體：皂素=20：1)、50微克的DOTAP：DSPC (脂質體：皂素=20：1)、25微克的DOTAP：DOPC (脂質體：皂素= 10：1)或12.5微克的DOTAP：DOPE (脂質體：皂素= 5：1)時，由粗皂素或QS21引起的溶血被100%抑制(圖8至圖13)。
另外，使用IC50 (抑制50%溶血的脂質體濃度)和IC100 (抑制100%溶血的脂質體濃度)確認抑制由2.5微克粗皂素或QS21引起之溶血的陽離子脂質體的量(表10和表11)。
表10
陽離子脂質體 抑制由2.5微克粗皂素引起之溶血的陽離子脂質體的量(μg)
類型 脂質 IC50 IC100
陽離子 中性
DDA：DMPC 18：0 14：0 199.9 -
DDA：DPPC 18：0 16：0 - -
DDA：DSPC 18：0 18：0 - -
DDA：DOPC 18：0 18：1 4.4 25.0
DOTAP：DMPC 18：1 14：0 2.8 50.0
DOTAP：DPPC 18：1 16：0 2.7 50.0
DOTAP：DSPC 18：1 18：0 3.3 50.0
DOTAP：DOPC 18：1 18：1 3.3 25.0
DOTAP：DOPE 18：1 18：1 2.9 12.5
表11
陽離子脂質體 抑制由2.5微克QS21引起之溶血的陽離子脂質體的量(μg)
類型 脂質 IC50 IC100
陽離子 中性
DDA：DMPC 18：0 14：0 74.4 -
DDA：DPPC 18：0 16：0 75.5 -
DDA：DSPC 18：0 18：0 53.9 -
DDA：DOPC 18：0 18：1 4.4 25.0
DOTAP：DMPC 18：1 14：0 3.8 50.0
DOTAP：DPPC 18：1 16：0 3.9 50.0
DOTAP：DSPC 18：1 18：0 4.8 50.0
DOTAP：DOPC 18：1 18：1 3.8 25.0
DOTAP：DOPE 18：1 18：1 4.3 12.5
因此，不同於僅含有中性脂質的中性脂質體，含有陽離子脂質的陽離子脂質體被證實具有溶血抑制活性，且脂質體的溶血抑制活性隨陽離子脂質體中所含脂質的飽和程度的組合而顯著變化。具體而言，可以證實陽離子脂質體中不飽和脂肪酸含量越高，抑制由皂素引起之溶血的效果越好(圖14)。
實例4：脂質體之細胞毒性的分析
實例4-1：分析方法
(1)人類皮膚角質細胞(HaCaT)(高葡萄糖DMEM培養基、10%胎牛血清、1%青黴素-鏈黴素)在37°C和5%二氧化碳的培養箱中培養。
(2)當細胞在100公釐培養皿中達到80-90%的生長密度(confluency)時，透過抽吸移除細胞培養基，且用5毫升PBS洗滌細胞。
(3)將5毫升胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(trypsin-EDTA)溶液放入100公釐培養皿中，在37°C和5%二氧化碳下反應3到6分鐘，在這之後加入5毫升細胞培養基，並且將細胞懸浮液轉移到15毫升管中，然後以1500 rpm在室溫下離心3分鐘，隨後移除上清液。
(4)細胞懸浮在10毫升PBS中，並以1500 rpm在室溫下離心3分鐘，在這之後移除上清液。
(5)上述步驟重複兩次，從而洗滌細胞。
(6)將由此獲得的細胞與3毫升細胞培養基一起加入以懸浮細胞，隨後進行細胞計數以透過台盼藍(trypan blue)染色確定細胞數和存活率。
(7)確認細胞存活率為85%以上，在這之後使用培養基將細胞懸浮液調整至1x105 個細胞/毫升，以100微升/孔分配於96孔盤中，並且在37o C和5%二氧化碳下培養24小時。
(8)冷凍乾燥之後，用225微升蒸餾水水合儲存於玻璃小瓶中的脂質體，並使脂質體在60o C下反應10分鐘，以使脂質體完全溶解(脂質體濃度：4.4毫克/毫升)。
(9)取22.5微升的脂質體、10微升(0.25毫克/毫升)的皂素和67.5微升的緩衝液混合於96孔盤中，用迴轉式振盪機以300 rpm在室溫下反應30分鐘。
(10)以20微升/孔將脂質體和皂素的混合物分配至96孔盤中，在37o C和5%二氧化碳下培養18小時。
(11)將細胞活力檢測套組(Ez-Cytox)與細胞培養基按7:3的比例混合，以50微升/孔分配至24孔盤中，並使其在37o C和5%二氧化碳下反應3小時。
(12)將96孔盤在室溫下以1500rpm離心5分鐘。
(13)將100微升上清液轉移到新的96孔盤上，以450 nm測量吸光度。
(14)用以下公式計算細胞毒性(%)。 細胞毒性(%) = 100 - [(樣本的光學密度/緩衝液的光學密度) x 100]
實例4-2：結果
如圖15所示，陽離子脂質體中不飽和脂肪酸含量越高，細胞毒性越低。
基於此處的結果和實例3的結果合併來看，可以證實使用含有不飽和脂肪酸的陽離子脂質體展現出較低的細胞毒性，並且能100%抑制由皂素引起的溶血。
實例5：用於抑制由各種皂素引起的溶血的篩選
除了皂皮樹衍生粗皂素和QS21之外，採用不同的皂素評估陽離子脂質體對由皂素引起之溶血的抑制效果。
實例5-1：方法
採用脂膜法製造各種脂質體，並進行溶血性分析。
本實例中使用的皂素和陽離子脂質體的類型分別如下表12和表13所示。
表12
皂素
類別 類型 量(μg)
類固醇皂素 毛地黃皂素 2.5
巴黎皂素VII 1.25
三萜皂素 七葉素 2.5
α-常春藤素 1.25
從表12所示的量中，選擇了會引起60%溶血的皂素濃度，因為可使用的脂質體量有所限制。
表13
陽離子脂質體
類型 脂質 量(μg)
陽離子 中性
DDA：DMPC 18：0 14：0 400、200、100、50、25、13、6、0
DDA：DOPC 18：0 18：1
DOTAP：DMPC 18：1 14：0 400、200、100、50、25、13、6、0
DOTAP：DOPC 18：1 18：1
實例5-2：脂質體的製造
使用以下方法製造本實例中用的脂質體。
(1)將陽離子脂質和中性脂質稱重並置於玻璃管中。
(2)加入氯仿使脂質濃度為4毫克/毫升，並在37o C下完全溶解10分鐘以得到脂質溶液。
(3)將陽離子脂質溶液和中性脂質溶液在圓底燒瓶中以1:1的重量比例混合製備各個脂質混合物。
(4)使用旋轉蒸發器，對含有DOTAP的脂質混合物在60o C下進行30分鐘的揮發，對含有DDA的脂質混合物在80o C下進行30分鐘揮發，進而觀察有無氯仿殘留以及在燒瓶壁上有無形成脂質膜層。
(5)將HEPES緩衝液(pH 7.4)中的蔗糖置於燒瓶中，使得脂質體濃度為4毫克/毫升，並在65o C下溶解脂質膜。
(6)由此製造的脂質體被保存在4o C冰箱中直至測試。
實例5-3：溶血性分析的方法
(1)HEPES緩衝液(pH 7.4)中的脂質體、皂素、蔗糖以及蒸餾水被放入96孔盤中，如下表14和表15所示。
表14
有皂素(脂質體濃度：4 mg/mL；皂素濃度(毛地黃皂素：0.25 mg/mL、巴黎皂素VII：0.125 mg/mL、七葉素：0.25 mg/mL、α-常春藤素：0.125 mg/mL))
組 脂質體濃度(μg/孔) 100%溶血性控制組 0%溶血性控制組
0 3 6 13 25 50 100 200 400
脂質體(μL) 0.0 0.8 1.6 3.1 6.3 12.5 25.0 50.0 100.0 0 0
皂素 (μL) 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 0 0
緩衝液(μL) 100.0 99.2 98.4 96.9 93.8 87.5 75.0 50.0 0.0 0 110
蒸餾水(μL) 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 110 0
表15
沒有皂素
組 脂質體濃度(μg/孔) 100%溶血性控制組 0%溶血性控制組
0 3 6 13 25 50 100 200 400
脂質體(μL) 0.0 0.8 1.6 3.1 6.3 12.5 25.0 50.0 22.5 0 0
皂素 (μL) 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0 0
緩衝液(μL) 100.0 99.2 98.4 96.9 93.8 87.5 75.0 50.0 77.5 0 110
蒸餾水(μL) 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 110 0
(2)使用迴轉式振盪機(Orbital Shaker)進行反應，在室溫下以300rpm進行30分鐘。
(3)3毫升的紅血球懸浮在10毫升的PBS中，在室溫下以1500rpm離心5分鐘，之後移除上清液。
(4)步驟(3)重複三次，進而洗滌紅血球。
(5)將紅血球沉澱物懸浮於1毫升PBS中並稀釋至1/100，隨後進行細胞計數。
(6)使用PBS將紅血球稀釋至1.5x109 個細胞/毫升，且按3x107 細胞/20微升/孔分配至上述步驟(2)的經測試原料處理的96孔盤中。
(7)使用迴轉式振盪機進行反應，在室溫下以300rpm進行1小時。
(8)將96孔盤在室溫下以1500rpm離心5分鐘。
(9)將50微升上清液轉移到新的96孔盤上，以415 nm測量吸光度。
(10)使用以下公式計算溶血性(%)。 溶血性(%) = (樣本的光學密度(OD) - 0%溶血性的光學密度)/(100%溶血性的光學密度 - 0%溶血性的光學密度) x 100
實例5-4：抑制由類固醇皂素引起之溶血的效果確認
基於毛地黃皂素或巴黎皂素VII造成溶血性100%之濃度的測量結果，當毛地黃皂素的量為10微克或巴黎皂素VII的量為5微克時觀察到溶血性100%，並且當毛地黃皂素的量為2.5微克或巴黎皂素VII的量為1.25微克時觀察到溶血性60%(圖16)。
因此，基於抑制由2.5微克的毛地黃皂素引起之溶血的DDA(18：0)：DMPC(14：0)和DDA(18：0)：DOPC(18：1)濃度的測量結果，DDA：DMPC沒有抑制由毛地黃皂素引起之溶血，且當DDA：DOPC為400微克(脂質體：皂素= 160：1)時100%抑制由毛地黃皂素引起之溶血(圖17)。
基於抑制由2.5微克的毛地黃皂素引起之溶血的DOTAP(18：1)：DMPC(14：0)和DOTAP(18：1)：DOPC(18：1)濃度的測量結果，當DOTAP：DMPC為400微克(脂質體：皂素= 160：1)時100%抑制由毛地黃皂素引起之溶血，且當DOTAP：DOPC為200微克(脂質體：皂素= 80：1)時100%抑制由毛地黃皂素引起之溶血(圖18)。
此外，基於抑制由1.25微克的巴黎皂素VII引起之溶血的DDA(18：0)：DMPC(14：0)和DDA(18：0)：DOPC(18：1)濃度的測量結果，DDA：DMPC沒有抑制由巴黎皂素VII引起之溶血，且當DDA：DOPC為400微克時50%抑制由巴黎皂素VII引起之溶血(圖19)。
基於抑制由1.25微克的巴黎皂素VII引起之溶血的DOTAP(18：1)：DMPC(14：0)和DOTAP(18：1)：DOPC(18：1)濃度的測量結果，當DOTAP：DMPC為400微克(脂質體：皂素= 320：1)時100%抑制由巴黎皂素VII引起之溶血，且當DOTAP：DOPC為400微克時100%抑制由巴黎皂素VII引起之溶血(圖20)。
實例5-5：抑制由三萜皂素引起之溶血的效果確認
基於七葉素或α-常春藤素造成溶血性100%之濃度的測量結果，當七葉素為5微克或α-常春藤素為10微克時觀察到溶血性100%，且當七葉素為2.5微克或α-常春藤素為1.25微克時觀察到溶血性60%(圖21)。
因此，基於抑制由2.5微克的七葉素引起之溶血的DDA(18：0)：DMPC(14：0)和DDA(18：0)：DOPC(18：1)濃度的測量結果，DDA：DMPC沒有抑制由七葉素引起之溶血，且當DDA：DOPC為400微克(脂質體：皂素= 160：1)時100%抑制由七葉素引起之溶血(圖22)。
基於抑制由2.5微克的七葉素引起之溶血的DOTAP(18：1)：DMPC(14：0)和DOTAP(18：1)：DOPC(18：1)濃度的測量結果，當DOTAP：DMPC和DOTAP：DOPC為200微克(脂質體：皂素= 80：1)時100%抑制由七葉素引起之溶血(圖23)。
此外，基於抑制由1.25微克的α-常春藤素引起之溶血的DDA(18：0)：DMPC(14：0)和DDA(18：0)：DOPC(18：1)濃度的測量結果，DDA：DMPC沒有抑制由α-常春藤素引起之溶血，且當DDA：DOPC為13微克(脂質體：皂素= 10.4：1)時100%抑制由α-常春藤素引起之溶血(圖24)。
基於抑制由1.25微克的α-常春藤素引起之溶血的DOTAP(18：1)：DMPC(14：0)和DOTAP(18：1)：DOPC(18：1)濃度的測量結果，當DOTAP：DMPC和DOTAP：DOPC為13微克(脂質體：皂素= 10.4：1)時100%抑制由α-常春藤素引起之溶血(圖25)。
實例5-6：結果
抑制由各種皂素引起之溶血的脂質體量如下表16所示。
表16
脂質體 類固醇皂素 三萜皂素
類型 脂質 毛地黃皂素 巴黎皂素VII 七葉素 α-常春藤素
陽離子 中性 IC50 IC100 IC50 IC100 IC50 IC100 IC50 IC100
DDA：DMPC 18：0 14：0 - - - - - - - -
DDA：DOPC 18：0 18：1 198.9 400.0 256.2 - 222.5 400.0 8.3 12.5
DOTAP：DMPC 18：1 14：0 105.4 400.0 219.8 400.0 88.9 200.0 7.5 12.5
DOTAP：DOPC 18：1 18：1 64.4 200.0 188.3 400.0 66.1 200.0 6.1 12.5
IC50 ：抑制50%溶血的脂質體濃度。
IC100 ：抑制100%溶血的脂質體濃度。
從上述結果可以明顯看出，當陽離子脂質體中含有不飽和脂肪酸時，其對由皂素引起之溶血的抑制效果是優秀的。
實例6：在抑制由皂素引起之溶血的陽離子脂質體中之陽離子脂質和中性脂質的比例確認
為了確認抑制由皂素引起之溶血的陽離子脂質體中的陽離子脂質與中性脂質的比例，使用冷凍乾燥法以陽離子脂質和中性脂質的各種比例製備陽離子脂質體，並進行溶血性分析。
實例6-1：脂質體的製造
本實例中使用的脂質體如下表17所示。
表17
編號 脂質體 重量比(%) 濃度(mg/mL)
1 DDA：DOPC 0：100、10：90、20：80、30：70、40：60、50：50、60：40、70：30、80：20、90：10、100：0 2
2 DOTAP：DMPC 2
3 DOTAP：DOPC 2
使用下列方法製造表17中的脂質體。
(1)DDA、DOPC、DOTAP和DMPC各取240毫克並置於70毫升玻璃小瓶中。
(2)每個小瓶中放入60毫升三級丁醇以製備4毫克/毫升的脂質原液，然後加熱10分鐘使脂質完全溶解。
(3)各個脂質混合物由DDA、DOPC、DOTAP和DMPC混合在10毫升玻璃小瓶中製成，如下表18所示。
表18
重量比(%) DDA：DOPC DOTAP：DMPC DOTAP：DOPC
DDA DOPC DOTAP DMPC DOTAP DOPC
0：100 0.0 5.0 0.0 5.0 0.0 5.0
10：90 0.5 4.5 0.5 4.5 0.5 4.5
20：80 1.0 4.0 1.0 4.0 1.0 4.0
30：70 1.5 3.5 1.5 3.5 1.5 3.5
40：60 2.0 3.0 2.0 3.0 2.0 3.0
50：50 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5
60：40 3.0 2.0 3.0 2.0 3.0 2.0
70：30 3.5 1.5 3.5 1.5 3.5 1.5
80：20 4.0 1.0 4.0 1.0 4.0 1.0
90：10 4.5 0.5 4.5 0.5 4.5 0.5
100：0 5.0 0.0 5.0 0.0 5.0 0.0
(4)每個小瓶的瓶口用密封帶覆蓋，之後渦旋混合5秒，且用注射器針頭在密封帶上形成密集的孔。
(5)混合物在冰箱中以-70o C冷凍2小時後被轉移到冷凍乾燥機，隨後以20帕和-80o C冷凍乾燥約18小時，從而使有機溶劑揮發。
(6)將得到的糕餅狀脂質體冷藏保存直至使用，並且每個小瓶與10毫升蔗糖在HEPES緩衝液(ph7.4)中水合供實驗使用。
實例6-2：溶血性分析的方法
(1)HEPES緩衝液(pH 7.4)中的脂質體、皂素、蔗糖以及蒸餾水被放入96孔盤中，如下表19和表20所示。
表19
有皂素(脂質體濃度：4 mg/mL；皂素濃度：(毛地黃皂素：0.25 mg/mL、α-常春藤素：0.125 mg/mL、粗皂素：0.25 mg/mL、QS21：0.25 mg/mL)
組 脂質體(陽離子脂質：中性脂質) 100%溶血性控制組 0%溶血性控制組
0:100 10:90 20:80 30:70 40:60 50:50 60:40 70:30 80:20 90:10 100:0
脂質體(μL) 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 0 0
皂素 (μL) 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 0 0
緩衝液(μL) 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0 110
蒸餾水(μL) 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 110 0
表20
沒有皂素
組 脂質體(陽離子脂質：中性脂質) 100%溶血性控制組 0%溶血性控制組
0:100 10:90 20:80 30:70 40:60 50:50 60:40 70:30 80:20 90:10 100:0
脂質體(μL) 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 0 0
皂素 (μL) 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0 0
緩衝液(μL) 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0 110
蒸餾水(μL) 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 110 0
(2)使用迴轉式振盪機進行反應，在室溫下以300rpm進行30分鐘。
(3)3毫升的紅血球懸浮在10毫升的PBS中，在室溫下以1500rpm離心5分鐘，之後移除上清液。
(4)步驟(3)重複三次，進而洗滌紅血球。
(5)將紅血球沉澱物懸浮於1毫升PBS中並稀釋至1/100，隨後進行細胞計數。
(6)使用PBS將紅血球稀釋至1.5x109 個細胞/毫升，且按3x107 細胞/20微升/孔分配至上述步驟(2)的經測試原料處理的96孔盤中。
(7)使用迴轉式振盪機進行反應，在室溫下以300rpm進行1小時。
(8)96孔盤在室溫下以1500rpm離心5分鐘。
(9)將50微升上清液轉移到新的96孔盤上，以415 nm測量吸光度。
(10)使用以下公式計算溶血性(%)。 溶血性(%) = (樣本的光學密度(OD) - 0%溶血性的光學密度)/(100%溶血性的光學密度 - 0%溶血性的光學密度) x 100
實例6-3：基於溶血性分析的結果確認在陽離子脂質體中之陽離子脂質和中性脂質的比例
(1)抑制皂素溶血之DDA(18:0)：DOPC(18:1)的脂質比例
當DDA：DOPC中的DDA含量為40%至60%時由2.5微克毛地黃皂素引起之溶血被100%抑制，且當DDA：DOPC中的DDA含量為30%至70%時由1.25微克的α-常春藤素引起之溶血被100%抑制(圖26)。
當DDA：DOPC中的DDA含量為30%至70%時由2.5微克粗皂素引起之溶血被100%抑制，且當DDA：DOPC中的DDA含量為30%至70%時由2.5微克的QS21引起之溶血被100%抑制(圖27)。
(2)抑制皂素溶血之DOTAP(18:1)：DMPC(14:0)的脂質比例
當DOTAP：DMPC中的DOTAP含量為40%或更多時由2.5微克毛地黃皂素引起之溶血被100%抑制，且當DOTAP：DMPC中的DOTAP含量為40%至90%時由1.25微克的α-常春藤素引起之溶血被100%抑制(圖28)。
當DOTAP：DMPC中的DOTAP含量為30%或更多時由2.5微克粗皂素引起之溶血被100%抑制，且當DOTAP：DMPC中的DOTAP含量為30%或更多時由2.5微克的QS21引起之溶血被100%抑制(圖29)。
(3)抑制皂素溶血之DOTAP(18:1)：DOPC(18:1)的脂質比例
當DOTAP：DOPC中的DOTAP含量為40%或更多時由2.5微克毛地黃皂素引起之溶血被100%抑制，且當DOTAP：DOPC中的DOTAP含量為20%或更多時由1.25微克的α-常春藤素引起之溶血被100%抑制(圖30)。
當DOTAP：DOPC中的DOTAP含量為10%或更多時由2.5微克粗皂素引起之溶血被100%抑制，且當DOTAP：DOPC中的DOTAP含量為10%或更多時由2.5微克的QS21引起之溶血被100%抑制(圖31)。
實例6-4：結果
如實例6-3所述，基於針對各種皂素之各種陽離子脂質體中陽離子脂質和中性脂質比例的測量結果，當陽離子脂質體中陽離子脂質和中性脂質的比例為10至100%時，可有效抑制由皂素引起的溶血(表21)。
表21
抑制由各種皂素引起之溶血的陽離子脂質體中的陽離子脂質比例
皂素 脂質體 陽離子脂質體中的陽離子脂質比例(%，重量比)
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
毛地黃皂素 DDA(18:0)： DOPC(18:1)         ○ ○ ○        
α-常春藤素       ○ ○ ○ ○ ○      
粗皂素       ○ ○ ○ ○ ○      
QS21       ○ ○ ○ ○ ○      
毛地黃皂素 DOTAP(18:1)：DMPC(14:0)         ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
α-常春藤素         ○ ○ ○ ○ ○ ○  
粗皂素       ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
QS21       ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
毛地黃皂素 DOTAP(18:1)：DOPC(18:1)         ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
α-常春藤素     ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
粗皂素   ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
QS21   ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
皂素 脂質體 陽離子脂質體中的陽離子脂質比例(%，莫耳比)
0 14 28 39 50 60 69 78 86 93 100
毛地黃皂素 DDA(18:0)： DOPC(18:1)         ○ ○ ○        
α-常春藤素       ○ ○ ○ ○ ○      
粗皂素       ○ ○ ○ ○ ○      
QS21       ○ ○ ○ ○ ○      
皂素 脂質體 陽離子脂質體中的陽離子脂質比例(%，莫耳比)
0 15 27 39 50 60 69 78 86 93 100
毛地黃皂素 DOTAP(18:1) ：DMPC(14:0)         ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
α-常春藤素         ○ ○ ○ ○ ○ ○  
粗皂素       ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
QS21       ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
毛地黃皂素 DOTAP(18:1) ：DOPC(18:1)         ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
α-常春藤素     ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
粗皂素   ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
QS21   ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
○：由皂素引起的溶血被抑制
產業利用性
皂素展現出包括強而有效之免疫活性的廣泛藥理和生物活性，例如抗發炎活性等，因此在醫學和藥學上得到了有效利用，但其缺點是會造成紅血球溶血。通常，皂素會與膽固醇等一起使用以抑制皂素溶血，但在本發明中，證實由皂素引起的紅血球溶血可使用陽離子脂質體來抑制，這對於抑制由皂素引起的溶血更加有效和經濟。因此，根據本發明，皂素可以更有用地應用於免疫增強劑、藥物傳遞載體等物的製造。
儘管已經如上述詳細揭露本發明的具體實施例，但是對於本領域具通常知識者來說，顯而易見的是該描述僅僅是優選的示例性實施例，而不應被解釋為限制本發明的範圍。因此，本發明的實質保護範圍將由請求項及其均等物定義。
無
圖1和圖2表示脂質體抑制由粗皂素引起的溶血能力與脂質體極性的關係圖。 圖3和圖4表示皂皮樹衍生粗皂素和QS21濃度與紅血球溶血(%)的關係圖。 圖5至圖13表示脂質體對2.5微克粗皂素和QS21的溶血之抑制效果的關係圖。 圖14表示抑制由皂素引起之溶血的效果與陽離子脂質體中的陽離子脂質或中性脂質是否存在不飽和脂肪酸的關係圖。 圖15表示細胞毒性與陽離子脂質體中的陽離子脂質或中性脂質是否存在不飽和脂肪酸的關係圖。 圖16表示紅血球溶血(%)與類固醇皂素濃度的關係圖。 圖17至圖20表示脂質體對由類固醇皂素引起之溶血的抑制效果的關係圖。 圖21表示紅血球溶血(%)與三萜皂素濃度的關係圖。 圖22至圖25表示脂質體對由三萜皂素引起之溶血的抑制效果的關係圖。 圖26至圖31為確認陽離子脂質體對皂素引起之溶血的抑制效果與陽離子脂質體中陽離子和中性脂質比例的結果。

Claims (14)

  1. 一種抑制由皂素引起的紅血球溶血的組成物，包含一陽離子脂質體以及一皂素，其中該陽離子脂質體含有一陽離子脂質以及一中性脂質。
  2. 如請求項1所述之組成物，其中該陽離子脂質或該中性脂質包含至少一不飽和脂肪酸。
  3. 如請求項1所述之組成物，其中該陽離子脂質選自於由1,2-二油醯基-3-(三甲基銨)丙烷(DOTAP)、雙十八烷基二甲基溴化銨(DDA)、3β-[N-(N',N'-二甲基胺基乙基)胺甲醯基]膽固醇(DC-Chol)、1,2-二油醯基-3-(二甲基銨)丙烷(DODAP)、1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基銨丙烷(DOTMA)、1,2-二肉豆蔻烯醯基-sn -甘油-3-乙基磷膽鹼(14:1 Ethyl PC)、1-棕櫚醯基-2-油醯基-sn -甘油-3-乙基磷膽鹼(16:0-18:1 Ethyl PC)、1,2-二油醯基-sn -甘油-3-乙基磷膽鹼(18:1 Ethyl PC)、1,2-二硬脂醯基-sn -甘油-3-乙基磷膽鹼(18:0 Ethyl PC)、1,2-二棕櫚醯基-sn -甘油-3-乙基磷膽鹼(16:0 Ethyl PC)、1,2-二肉豆蔻醯基-sn -甘油-3-乙基磷膽鹼(14:0 Ethyl PC)、1,2-二月桂醯基-sn -甘油-3-乙基磷膽鹼(12:0 Ethyl PC)、N1-[2-((1S)-1-[(3-胺基丙基)胺基]-4-[二(3-胺基丙基)胺基]丁基甲醯胺基)乙基]-3,4-二[油烯基氧基]苯甲醯胺(MVL5)、1,2-二肉豆蔻醯基-3-二甲基銨丙烷(14:0 DAP)、1,2-二棕櫚醯基-3-二甲基銨丙烷(16:0 DAP)、1,2-二硬脂醯基-3-二甲基銨丙烷(18:0 DAP)、N-(4-羧基苯甲基)-N,N-二甲基-2,3-雙(油醯氧基)丙烷-1-銨(DOBAQ)、1,2-硬脂醯基-3-三甲基銨丙烷(18:0 TAP)、1,2-二棕櫚醯基-3-三甲基銨丙烷(16:0 TA)、1,2-二肉豆蔻醯基-3-三甲基銨丙烷(14:0 TAP)以及N4-膽固醇精胺(GL67)所組成的群組。
  4. 如請求項1所述之組成物，其中該中性脂質選自於由1,2-二肉豆蔻醯基-sn -甘油-3-磷脂醯膽鹼(DMPC)、1,2-二油醯基-sn -甘油-3-磷膽鹼(DOPC)、1,2-二油醯基-sn -甘油-3-磷乙醇胺(DOPE)、1,2-二棕櫚醯基-sn -甘油-3-磷膽鹼(DPPC)、1,2-二硬脂醯基-sn -甘油-3-磷膽鹼(DSPC)、1,2-二亞麻油醯基-sn -甘油-3-磷膽鹼(DLPC)、磷脂醯絲胺酸(PS)、磷脂醯乙醇胺(PE)、磷脂醯甘油(PG)、磷酸(PA)以及磷脂醯膽鹼(PC)所組成的群組。
  5. 如請求項1所述之組成物，其中該陽離子脂質為由1,2-二油醯基-3-(三甲基銨)丙烷(DOTAP)或雙十八烷基二甲基溴化銨(DDA)，且該中性脂質為選自於由1,2-二肉豆蔻醯基-sn -甘油-3-磷脂醯膽鹼(DMPC)、1,2-二油醯基-sn -甘油-3-磷膽鹼(DOPC)、1,2-二油醯基-sn -甘油-3-磷乙醇胺(DOPE)、1,2-二棕櫚醯基-sn -甘油-3-磷膽鹼(DPPC)以及1,2-二硬脂醯基-sn -甘油-3-磷膽鹼(DSPC)所組成的群組中的任一者。
  6. 如請求項1所述之組成物，其中該陽離子脂質於該陽離子脂質體中的重量比為10%至100%。
  7. 如請求項1所述之組成物，其中該皂素為皂皮樹衍生粗皂素、QS21、含有QS21的部分、類固醇皂素或三萜皂素。
  8. 一種用於免疫增強的組成物，包含如請求項1至7中任一項所述之組成物。
  9. 如請求項8所述之組成物，更包含一佐劑。
  10. 一種用於藥物傳遞的組成物，包含如請求項1至7中任一項所述之組成物。
  11. 一種藥物傳遞載體，包含一陽離子脂質體，其中該陽離子脂質體含有一陽離子脂質以及一中性脂質。
  12. 如請求項11所述之藥物傳遞載體，其中該陽離子脂質或該中性脂質包含至少一不飽和脂肪酸。
  13. 一種藥物載體複合物，藥物於該藥物載體複合物中吸附至一陽離子脂質體或被該陽離子脂質體包裹，其中該陽離子脂質體含有一陽離子脂質以及一中性脂質。
  14. 如請求項13所述之藥物載體複合物，其中該陽離子脂質或該中性脂質包含至少一不飽和脂肪酸。
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