KR20220002091A

KR20220002091A - 양이온성 리포좀을 포함하는 사포닌의 용혈 억제용 조성물

Info

Publication number: KR20220002091A
Application number: KR1020210069237A
Authority: KR
Inventors: 조양제; 이나경; 김광성; 박신애; 안선영
Original assignee: 아이진 주식회사
Priority date: 2020-06-30
Filing date: 2021-05-28
Publication date: 2022-01-06
Also published as: CN115087435A; BR112022009764A2; EP4000603A4; TW202203939A; EP4000603A1; WO2022003443A1; TWI786706B; US20220287970A1

Abstract

본 발명은 사포닌에 의한 적혈구 용혈작용을 억제하는 효능을 가지는 양이온성 리포좀에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 불포화 지질이 함유된 양이온성 리포좀을 포함하는 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 조성물, 이를 포함하는 면역증강용 조성물과 약물 전달용 조성물 및 불포화 지질이 함유된 양이온성 리포좀을 포함하는 약물 전달체와 약물-전달체 복합체에 관한 것이다.
사포닌은 강력하고 효과적인 면역학적 활성을 포함하여 항염증 등 광범위한 약리학적, 생물학적 활성을 나타내어 의학적, 약학적으로 유용하게 이용될 수 있으나, 적혈구에 대해 용혈현상을 일으키는 단점이 있다. 이에 일반적으로 콜레스테롤 등을 함께 사용하여 사포닌의 용혈작용을 억제하나, 본 발명에서는 사포닌의 용혈 억제능에 있어 보다 효과적이고, 경제적인 양이온성 리포좀을 이용하여 사포닌의 적혈구 용혈작용을 억제할 수 있음을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따르면, 면역증강제, 약물전달체 제조 등에 있어서, 사포닌을 보다 유용하게 사용할 수 있다.

Description

양이온성 리포좀을 포함하는 사포닌의 용혈 억제용 조성물{Composition for Inhibiting Hemolysis of Saponin Comprising Cationic Liposomes}

본 발명은 사포닌에 의한 적혈구 용혈작용을 억제하는 효능을 가지는 양이온성 리포좀에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 불포화 지질이 함유된 양이온성 리포좀을 포함하는 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 조성물, 이를 포함하는 면역증강용 조성물과 약물 전달용 조성물 및 불포화 지질이 함유된 양이온성 리포좀을 포함하는 약물 전달체와 약물-전달체 복합체에 관한 것이다.

사포닌(saponin)은 스테로이드 및 트리테르펜의 2차 대사산물로서 생성되는 글리코시드(glycosides) 화합물이다. 사포닌은 강력하고 효과적인 면역학적 활성을 포함하여 항염증 등 광범위한 약리학적, 생물학적 활성을 나타낸다. 일반적으로 사포닌의 면역기능 증가 효과가 알려져 있으며, 사포닌은 백신의 면역보조제(adjuvant)나, 항암제로 이용되고 있다(Newman MJ, et al. J Immunol 148;2357-2362, 1992; Sun HX, et al. Vaccine, 27: 1787-1796, 2009). 다만, 사포닌은 거품 작용 및 용혈작용(hemolysis)이 있으며, 용혈작용이란 적혈구가 파괴되어 내용물(세포질)이 주변 액체(예를 들면, 혈장) 안으로 용해되는 것을 말한다. 용혈반응 또는 간단히 용혈이라고도 한다. 적혈구막 속의 콜레스테롤이 사포닌과 강하게 결합하여 막 구조가 파괴되기 때문에 발생한다.

사포닌을 의약적 용도로 이용하기 위해서는, 사포닌의 적혈구 용혈을 억제해야 하고, 이를 위해 통상적으로는 콜레스테롤(cholesterol)을 사용한다. 일반적으로 콜레스테롤은 동물 유래 성분으로서 의약품 등의 제조 시 관리 기준이 엄격하며, 이를 극복하기 위해 최근 반합성 또는 합성 콜레스테롤이 개발되어 의약품 제조에 사용되고 있지만 단가가 매우 높은 단점이 있다.

여러 약물들의 안전하고 효율적인 전달 기술은 오랫동안 연구되어 왔다. 제조, 유통과정 등에서 변질되지 않고 활성을 유지시키기 위해 캡슐화(capsulation) 제형 기술이 이용되고 있다. 이는 리포좀과 같은 운반체 내에 약물을 내포함으로써 약물의 변질과 손실을 최소화할 수 있으며, 친수성 및 친유성 물질을 모두 내포시킬 수 있다. 의약품에서는 약물전달체 및 보호체로서의 역할을 하며, 의약 분야에서는 유전자 치료 및 암 화학요법, 화장품 분야에서는 효능물질 전달체 및 수분 전달체로서의 역할을 한다. 캡슐화 기술은 내포된 물질을 안정한 상태로 보관하는 역할뿐만 아니라 방출 속도를 조절하는 역할을 할 수 있다.

리포좀(liposome)은 지질로 된 이중층의 자가결집(self-assembled) 구조체로서, 소수성(hydrophobic)을 띠는 부분과 친수성(hydrophilic)을 보이는 부분을 동시에 가지고 있는 양친매성(amphipathic)분자이다. 리포좀은 생체적합성이 우수하고, 제법이 간편하며, 수용성 및 지용성 약물을 운반할 수 있는 장점이 있어 체내에서의 부작용이 적은 약물전달체로서 연구가 활발히 진행되고 있다(Kwang Jae Cho, Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 2007;50(7): 562-572). 리포좀은 화학적으로 안정하며, 무자극 무독성으로 피부 생체 지질 막과 구조적으로 유사하다. 또한 표면 성질을 다양하게 변화시켜 제조할 수 있어 화장품, 의약, 어쥬번트, 약물전달 등에 다양하게 이용될 수 있다.

이러한 기술적 배경하에서, 본 발명자들은 사포닌의 치료 효능 또는 면역증강 기능을 활용하는데 있어서, 사포닌을 체내에 투여했을 경우 발생하는 용혈현상을 억제하고자 예의 노력한 결과, 불포화(unsaturation) 양이온성 지질 또는 중성 지질을 포함하는 양이온성 리포좀과 사포닌을 혼합한 경우, 사포닌 단독 투여시 발생하는 용혈현상이 효과적으로 억제되는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.

본 발명의 목적은 사포닌의 적혈구 용혈 억제능을 가지는 양이온성 리포좀을 포함하는 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 사포닌의 적혈구 용혈 억제 방법, 사포닌의 적혈구 용혈 억제를 위한 상기 조성물의 용도 및 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 약제 제조를 위한 상기 조성물의 사용을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 조성물을 포함하는 면역증강용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 면역증강용 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 면역증강방법, 면역증강을 위한 상기 면역증강용 조성물의 용도 및 면역증강용 약제 제조를 위한 상기 면역증강용 조성물의 사용을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 조성물을 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 양이온성 지질 및 중성 지질을 함유하는 양이온성 리포좀을 포함하는 약물전달체 및 양이온성 지질 및 중성 지질을 함유하는 양이온성 리포좀에 약물이 흡착 또는 봉입되어 있는 약물-전달체 복합체를 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 양이온성 지질 및 중성 지질을 함유하는 양이온성 리포좀, 및 사포닌을 포함하는 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 사포닌의 적혈구 용혈 억제 방법, 사포닌의 적혈구 용혈 억제를 위한 상기 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 조성물의 용도 및 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 약제 제조를 위한 상기 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 조성물의 사용을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 조성물을 포함하는 면역증강용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 면역증강용 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 면역증강방법, 면역증강을 위한 상기 면역증강용 조성물의 용도 및 면역증강용 약제 제조를 위한 상기 면역증강용 조성물의 사용을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 조성물을 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 양이온성 지질 및 중성 지질을 함유하는 양이온성 리포좀을 포함하는 약물전달체를 제공한다.

본 발명은 또한, 양이온성 지질 및 중성 지질을 함유하는 양이온성 리포좀에 약물이 흡착 또는 봉입되어 있는 약물-전달체 복합체를 제공한다.

사포닌은 강력하고 효과적인 면역학적 활성을 포함하여 항염증 등 광범위한 약리학적, 생물학적 활성을 나타내어 의학적, 약학적으로 유용하게 이용될 수 있으나, 적혈구에 대해 용혈현상을 일으키는 단점이 있다. 이에 일반적으로 콜레스테롤 등을 함께 사용하여 사포닌의 용혈작용을 억제하나, 본 발명에서는 사포닌의 용혈 억제능에 있어 보다 효과적이고, 경제적인 양이온성 리포좀을 이용하여 사포닌의 적혈구 용혈작용을 억제할 수 있음을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따르면, 면역증강제, 약물전달체 제조 등에 있어서, 사포닌을 보다 유용하게 사용할 수 있다.

도 1 및 도 2는 리포좀의 극성에 따른 crude saponin에 의한 hemolysis의 억제능을 비교한 그래프이다.
도 3 및 도 4는 Quillaja Saponaria 유래 crude saponin 및 QS21의 농도에 따른 적혈구 용혈(%)을 나타낸 그래프이다.
도 5 내지 도 13은 2.5μg crude saponin 및 QS21의 용혈작용에 대한 리포좀의 억제 효과를 확인한 그래프이다.
도 14는 양이온성 리포좀 내 양이온성 지질 또는 중성 지질 중 불포화 지방산의 유무에 따른 사포닌에 의한 용혈작용에 대한 억제 효과를 비교한 그래프이다.
도 15는 양이온성 리포좀 내 양이온성 지질 또는 중성 지질 중 불포화 지방산의 유무에 따른 세포독성을 비교한 그래프이다.
도 16은 Steroidal saponin의 농도에 따른 적혈구 용혈(%)을 나타낸 그래프이다.
도 17 내지 도 20은 리포좀의 Steroidal saponin에 의한 용혈 작용 억제 효과를 확인한 그래프이다.
도 21은 Triterpenoidal saponin의 농도에 따른 적혈구 용혈(%)을 나타낸 그래프이다.
도 22 내지 도 25는 리포좀의 Triterpenoidal saponin에 의한 용혈 작용 억제 효과를 확인한 그래프이다.
도 26 내지 도 31은 사포닌에 의한 용혈을 억제하는 양이온성 리포좀 내 양이온성 및 중성 지질의 비율에 따른 효과를 확인한 결과이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

리포좀(liposome)은 표면 전하, 사이즈, 막 구조 등의 성질에 따라 다양하게 분류된다. 예를 들어, 리포좀의 표면 전하는 중성 지질, 양이온성 지질, 음이온성 지질 등 다양한 지질 원료 조합에 의해 결정된다.

본 발명의 일 실시예에서는, 사포닌의 적혈구 용혈작용을 억제할 수 있는 양이온성 리포좀을 개발하였으며, 사포닌에 의한 용혈현상을 억제시키기 위해 일반적으로 사용되는 콜레스테롤의 사용 없이도 사포닌을 이용한 면역증강용 제제 및 약물전달체 제조에 있어서 효과적으로 이용될 수 있음을 확인하였다. 이는 사포닌을 안전하게 의학적, 약학적 용도로 사용할 수 있음을 시사한다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 양이온성 리포좀 및 사포닌을 포함하는 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 조성물에 있어서, 상기 양이온성 리포좀은 양이온성 지질 및 중성 지질을 함유하는 것을 특징으로 하는 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, '지질'은 지방산, 인지질, 지방산 에스터 및 스테로이드 등을 포함한다. '불포화 지질'은 지질에 포함된 지방산 사슬에 탄소-탄소 이중결합이 하나 이상 포함된 지질을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 양이온성 지질 또는 중성 지질은 하나 이상의 불포화 지방산을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 양이온성 지질 또는 중성 지질은 불포화 지방산 사슬을 1개 이상 포함할 수 있으며, 각 불포화 지방산 사슬의 탄소수는 10 내지 20이고, 바람직하게는 14 내지 18이며, 각 지방산 사슬에 포함된 탄소-탄소 이중결합 수는 1 내지 6이고, 바람직하게는 1일 수 있다.

본 발명에 따른 용혈 억제용 조성물에 포함되는 양이온성 지질 또는 중성 지질 중 어느 하나가 불포화 지질이고, 다른 하나는 불포화 지질 또는 포화 지질일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 양이온성 지질(cationic lipid)은 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄프로페인(1,2-dioleoyl-3-(trimethylammonium)propane; DOTAP), 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드(dimethyldioctadecylammonium bromide; DDA), 3β-[N-(N′,N′-디메틸아미노에테인 카바모일 콜레스테롤(3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane) carbamoyl cholesterol; DC-Chol), 1,2-디올레오일-3-디메틸암모늄프로페인(1,2-dioleoyl-3-(dimethylammonium)propane; DODAP), 1,2-디-O-옥타데세닐-3-트리에틸암모늄 프로페인(1,2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium propane; DOTMA), 1,2-디미리스토레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-dimyristoleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine; 14:1 Ethyl PC), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine; 16:0-18:1 Ethyl PC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine; 18:1 Ethyl PC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholin; 18:0 Ethyl PC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine; 16:0 Ethyl PC), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine; 14:0 Ethyl PC), 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholin; 12:0 Ethyl PC), N1-[2-((1S)-1-[(3-아미노프로필)아미노]-4-[디(3-아미노-프로필)아미노]부틸카복사미도)에틸]-3,4-디[올레일옥시]-벤자마이드(N1-[2-((1S)-1-[(3-aminopropyl)amino]-4-[di(3-amino-propyl)amino]butylcarboxamido)ethyl]-3,4-di[oleyloxy]-benzamide, MVL5), 1,2-디미리스토일-3-디메틸암모늄-프로페인(1,2-dimyristoyl-3-dimethylammonium-propane; 14:0 DAP), 1,2-디팔미토일-3-디메틸암모늄-프로페인(1,2-dipalmitoyl-3-dimethylammonium-propane; 16:0 DAP), 1,2-디스테아로일-3-디메틸암모늄-프로페인(1,2-distearoyl-3-dimethylammonium-propane; 18:0 DAP), N-(4-카복시벤질)-N,N-디메틸-2,3-비스(올레오일옥시)프로판-1-아미늄(N-(4-carboxybenzyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(oleoyloxy)propan-1-aminium; DOBAQ), 1,2-스테아로일-3-트리메틸암모늄-프로페인(1,2-stearoyl-3-trimethylammonium-propane; 18:0 TAP), 1,2-디팔미토일-3-트리메틸암모늄-프로페인(1,2-dipalmitoyl-3-trimethylammonium-propane; 16:0 TA), 1,2-디미리스토일-3-트리메틸암모늄-프로페인(1,2-dimyristoyl-3-trimethylammonium-propane; 14:0 TAP) 및 N4-콜레스테릴-스퍼민(N4-Cholesteryl-Spermine; GL67)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 양이온성 지질에는 콜레스테롤 유도체에 양이온성 작용기가 도입된 지질 등이 포함될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 중성 지질(neutral lipid)은 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린(1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphorylcholine; DMPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine; DOPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine; DOPE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine; DPPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine; DSPC), 1,2-디리노레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine; DLPC), 포스파티딜세린(phosphatidylserine; PS), 포스포에탄올라민(phosphatidylethanolamine; PE), 포스파티딜글리세롤(phosphatidylglycerol; PG), 포스포릭액시드(phosphoric acid; PA) 및 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine; PC)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

바람직하게는, 상기 양이온성 지질은 DOTAP 또는 DDA이고, 중성 지질은 DMPC, DOPC, DOPE, DPPC 또는 DSPC인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 양이온성 리포좀 내 양이온성 지질의 중량비(%)는 10 내지 100%인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서, 상기 중량비는 함량과 동일한 의미로 사용된다.

본 발명의 일 실시예에서, 사포닌의 용혈을 억제하는 양이온성 리포좀 내 양이온성 지질의 함량은 양이온성 지질 DDA는 30%~70%, 양이온성 지질 DOTAP은 10%~100%인 것을 확인할 수 있었다.

본 발명에 있어서, 상기 리포좀은 글리코리피드(glycolipid)를 더 포함할 수 있으며, 상기 글리코리피드는 digalactosyldiglyceride, galactosyldiglyceride sulfuric acid ester, galactosylceramide와 같은 sphingoglycolipids, galactosylceramide sulfuric acid ester, lactosylceramide, ganglioside G7, ganglioside G6 및 ganglioside G4로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 리포좀은 스테롤 유도체를 더 포함할 수 있으며, 상기 스테롤 유도체는 cholesterol, dihydrocholesterol, cholesterol ester, phytosterol, sitosterol, stigmasterol, campesterol, cholestanol, lanosterol, 1-O-sterolglucoside, 1-O-sterolmaltoside 및 1-O-sterolgalactoside와 같은 스테롤 유도체로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 리포좀은 글리콜(glycol) 유도체를 더 포함할 수 있으며, 상기 글리콜 유도체는 ethylene glycol, diethylene glycol, triethylene glycol, propylene glycol, dipropylene glycol, trimethylene glycol 및 1,4-butanediol로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나일 수 있으나, 반드시 이에 제한되지는 않는다.

상기 리포좀은 지방성 아민(aliphatic amine)을 더 포함할 수 있으며, 상기 지방성 아민은 stearylamine, octylamine, oleylamine 및 linoleylamine으로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나일 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.

리포좀 제조법은 큰 사이즈의 리포좀을 만든 뒤 작은 사이즈로 분할하는 'top-down methods'와 지질 단량체를 이용해 작은 사이즈 리포좀을 조립하는 'bottom-up methods'로 구분할 수 있다. Top-down method로 리포좀을 만들기 위해서는 지질을 유기용매에 용해시킨 후 유기용매를 제거하고 수용액으로 지질을 재수화하는 과정을 거치게 된다.

일반적으로 사용하는 리포좀 제조법은 film-rehydration method 또는 lipid hydration method 등이 있다. 이 방식을 통하면 LUV가 형성되며 이를 homogenizer, microfluidizer, 혹은 고압균질기 등을 이용해 물리적으로 파쇄시킴으로써 목적하는 사이즈의 리포좀을 제조할 수 있다.

본 발명의 양이온성 리포좀은 thin film method, injection method 또는 freeze-drying method의 방법으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 thin film method는 유기용매에 지질을 녹이고 건조시켜 생성되는 막에 용액을 넣어 제조하는 방법이며, 상기 injection method는 지질을 함유한 유기용매를 syringe로 떨어뜨려 제조하는 방법이고, 상기 freeze-drying method는 유기용매에 지질을 녹이고 동결건조하여 유기용매를 휘발시킨 후 용액으로 지질을 재수화하여 제조하는 방법이다.

본 발명에 있어서, 상기 제조된 리포좀은 보관의 용이성을 위해 선택적으로 동결건조를 수행할 수 있다. 리포좀을 동결건조하여 형성된 케이크, 플라그, 또는 분말은 사용시 멸균수로 재구성하여 투여할 수 있다.

상기 본 발명의 방법에 따라 제조된 리포좀은 주사제, 경피, 경비, 및 폐로의 약물송달에 사용될 수 있다. 이러한 제제화에 필요한 기술 및 약제학적으로 적절한 담체, 첨가제 등에 관해서는 당해 제제학 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 널리 알려져 있으며, 이와 관련하여 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)를 참조할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 양이온성 리포좀에 사포닌이 정전기적 인력에 의해 흡착된 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 양이온성 리포좀의 내부에 사포닌이 내포되거나, 양이온성 리포좀의 지질막에 사포닌이 결합될 수 있다.

본 발명의 용어 '흡착'은 리포좀 내부 또는 외부에 물질이 결합되는 것을 의미하며, 본 발명에 따른 사포닌이 효과적으로 전달될 수 있는 형태라면 특별히 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 사포닌은 Ginsenoside Rb1, 디지토닌, β-에스킨 Quillaja Saponaria 유래 조 사포닌(crude saponin) 및 이의 분획물, QS21, Quil A, QS7, QS18, QS17 및 이의 염, 스테로이드성 사포닌(steroidal saponin) 및 트리테르페노이드 사포닌(triterpenoid saponin)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 스테로이드성 사포닌에는 Digitonin 또는 Paris VII이 포함되고, 상기 트리테르페노이드 사포닌에는 Aescin, α-Hederin, Hederagenin, Echinocystic acid, Chrysanthellin A, Chrysanthellin B, Bayogenin, Medicagenic acid, Maslinic acid, Oleanolic acid, Erythroidal, Asiatic acid가 포함될 수 있다. 바람직하게는, 상기 사포닌은 Quillaja Saponaria 유래 조 사포닌(crude saponin), QS21, Digitonin, Paris VII, Aescin 또는 α-Hederin인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 따른 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 상기 양이온성 리포좀을 단독으로 포함하거나, 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 사포닌의 적혈구 용혈작용을 억제하기에 충분한 양을 말한다.

상기 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 의미한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 조성물은 인간을 제외한 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 동결건조 분말, 멸균 분말의 형태일 수 있다.

본 발명의 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 사포닌의 적혈구 용혈 억제 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 사포닌의 적혈구 용혈 억제를 위한 상기 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 조성물의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 약제 제조를 위한 상기 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 조성물의 사용에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 방법, 용도, 사용은 상술한 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 조성물을 포함하기 때문에, 상술한 본 발명의 용혈 억제용 조성물과 중복된 내용은 그 기재를 생략한다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 조성물을 포함하는 면역증강용 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 면역증강용 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 면역증강방법에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 면역증강을 위한 상기 면역증강용 조성물의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 면역증강용 약제 제조를 위한 상기 면역증강용 조성물의 사용에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 면역증강용 조성물, 면역증강방법, 면역증강용 조성물의 용도 및 사용은 상술한 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 조성물을 포함하기 때문에, 상술한 본 발명의 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 조성물과 중복된 내용은 그 기재를 생략한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "면역증강"은 초기 면역반응을 유도하거나 항원에 대한 기존의 면역반응을 측정 가능할 정도로 증가시키는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 면역증강용 조성물은 단독 또는 추가의 면역보조제(adjuvant)를 포함하여 약학적 조성물로 제형화할 수 있다.

상기 면역보조제는 예를 들어 Mg, Ca, Sr, Ba 및 Ra으로 구성된 군으로부터 선택되는 제2족 원소 또는 이의 염; Ti, Zr, Hf 및 Rf로 구성된 군으로부터 선택되는 제4족 원소; 알루미늄의 염 또는 그의 수화물; 또는 디메틸옥타데실암모니윰 브로마이드를 포함할 수 있다. 상기 염은, 예를 들면, 옥사이드, 퍼옥사이드, 하이드록사이드, 카보네이트, 포스페이트, 파이로포스페이트, 하이드로겐포스페이트, 다이하이드로겐포스페이트, 설페이트 또는 실리케이트와 함께 형성된다.

또한, 상기 면역보조제는 예를 들어, TLRs(Toll-like receptors) agonist, RLRs(RIG-I-like receptors) agonist 및 NLRs(NOD-like receptors) agonist로 구성된 군에서 선택되는 PRRs(pattern recognition receptors) agonist를 포함할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 조성물을 포함하는 약물 전달용 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 양이온성 지질 및 중성 지질을 함유하는 양이온성 리포좀을 포함하는 약물전달체에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 양이온성 지질 및 중성 지질을 함유하는 양이온성 리포좀에 약물이 흡착 또는 봉입되어 있는 약물-전달체 복합체에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 약물 전달용 조성물, 약물전달체 및 약물-전달체 복합체는 상술한 양이온성 지질 및 중성 지질을 함유하는 양이온성 리포좀을 포함하기 때문에, 상술한 본 발명의 양이온성 지질 및 중성 지질을 함유하는 양이온성 리포좀과 중복된 내용은 그 기재를 생략한다.

본 발명에 있어서, 상기 약물은 단백질, 유전자, 펩타이드, 화합물, 항원 또는 천연소재 등 본 발명에 따른 양이온성 리포좀을 이용하여 전달될 수 있는 것이라면 제한 없이 적용 가능하다.

본 발명에 따른 면역증강용 조성물, 약물 전달용 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishig Co., Easton PA). 또한, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

상기 면역증강용 조성물 또는 약물 전달용 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 희석제로는 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 글리세린, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 슈크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 사용할 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비 경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다.

비수용성제제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 면역증강용 조성물 또는 약물 전달용 조성물은 투여대상의 나이, 성별, 체중 등에 따라 투여량이 달라질 수 있고, 투여 경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서도 투여량이 증감될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 재료

하기 실시예들에서 사용된 리포좀의 재료인 lipids를 하기 표 1에 나타내었다.

상기 표 1에서 (18:0), (18:1), (14:0), (16:0) 등은 각 지질의 포화도(saturation)를 나타낸 것으로, “N:0”은 모두 saturated된 지질을 의미하며, “N:1”은 N개의 탄소당 1개의 비율로 unsaturated된 지질을 의미한다.

각 지질의 출처는 다음과 같다:

Cationic lipid: DOTAP(Merck), DDA(Sigma-Aldrich)

Neutral lipid: DMPC(Corden pharma), DOPC, DOPE, DSPC, DPPC(Avanti plolar lipids)

Anionic lipid: DMPG(Avanti polar lipids)

실시예 2: 리포좀 극성에 따른 crude saponin의 용혈작용( hemolysis ) 억제능 비교

리포좀 극성에 따른 crude saponin의 용혈작용 억제능을 확인하고자 Freezing-drying method로 양이온성, 중성, 음이온성 리포좀을 제조하고 hemolysis 분석을 수행하였다.

실시예 2-1: 리포좀 제조

본 실시예에서 사용된 리포좀의 종류를 하기 표 2에 나타내었다.

No.	Liposome	Weight ratio(%)	Conc.(mg/mL)
1	DDA:DOPC	50:50	2
2	DOPC	100	2
3	DMPG:DOPC	50:50	2

상기 표 2의 리포좀은 하기의 방법으로 제조하였다:

1) 70mL 유리 용기에 40mg의 DDA, DOPC, DMPG를 칭량하여 넣는다.

2) 각각의 용기에 20mL의 t-butyl alcohol을 넣어 2mg/mL의 lipid stock solution을 제조하고 10분간 65℃에서 중탕하여 lipid를 완전히 용해시킨다.

3) 하기 표 3과 같이, 10mL 유리용기에 DDA, DOPC, DMPG를 혼합하여 lipid mixture를 만든다.

DDA:DOPC		DOPC	DMPG:DOPC
DDA	DOPC	DOPC	DMPG	DOPC
5mL	5mL	10mL	5mL	5mL

4) 각 vial의 입구를 sealing tape로 감은 뒤 5초 동안 vortex mix하여 혼합하고, 주사기 바늘을 이용해 sealing tape에 촘촘하게 구멍을 낸다.

5) -70℃ 냉동고에서 2시간 동안 동결한 후 동결 건조기로 옮겼다. 20 Pa, -80℃ 조건에서 약 18시간 동안 동결 건조하여 유기 용매를 휘발시킨다.

6) 리포좀 케이크는 사용 전까지 냉장 보관하고, vial 당 10mL의 sucrose in HEPES buffer(pH 7.4)로 수화하여 실험에 사용한다.

실시예 2-2: Hemolysis 분석 방법

1) 96 well plate에 liposome, saponin, sucrose in HEPES buffer(pH 7.4) 및 정제수를 하기 표 4 및 표 5에 기재된 바와 같이 넣는다.

with Saponin(Liposome 농도 2mg/mL, Saponin 농도 1mg/mL)
Group	Liposome conc .( μg /well)								100% Hemolysis control	0% Hemolysis control
Group	0	10	20	40	50	60	80	100	100% Hemolysis control	0% Hemolysis control
Liposome(μl)	0	5	10	20	25	30	40	50	0	0
Saponin(μl)	10	10	10	10	10	10	10	10	0	0
Buffer(μl)	90	85	80	70	65	60	50	40	0	100
D.W.(μl)	0	0	0	0	0	0	0	0	100	0

without Saponin
Group	Liposome conc .( μg /well)								100% Hemolysis control	0% Hemolysis control
Group	0	10	20	40	50	60	80	100	100% Hemolysis control	0% Hemolysis control
Liposome(μl)	0	5	10	20	25	30	40	50	0	0
Saponin(μl)	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
Buffer(μl)	90	85	80	70	65	60	50	40	0	100
D.W.(μl)	10	10	10	10	10	10	10	10	100	0

2) Orbital shaker에서 상온, 300rpm 조건으로 30분 동안 반응시킨다.

3) 3mL의 RBC를 10mL의 PBS로 suspension 하고 상온, 1500rpm 조건으로 5분 동안 원심분리한 후 상층액을 제거하였다.

4) 2)-3) 과정을 3회 반복하여 RBC를 washing한다.

5) RBC pellet을 1mL의 PBS로 suspension하고 1/100로 희석한 후 cell counting한다.

6) PBS를 이용하여 RBC를 1.5 x 10⁹ cells/mL이 되도록 희석하고, 상기 2)의 시험물질이 처리된 96 well plate에 3 x 10⁷cells/20μL/well씩 처리한다.

7) Orbital shaker를 이용해 상온, 300rpm 조건으로 1시간 동안 반응시킨다.

8) 96 well plate를 상온, 1500rpm 조건으로 5분 동안 원심분리한다.

9) 상층액 50μL를 새 96 well plate로 옮긴 뒤 415nm에서 흡광도를 측정한다.

10) 다음의 공식으로 hemolysis %를 계산한다.

Hemolysis (%) = (샘플의 OD - 0% Hemolysis의 OD)/(100% Hemolysis의 OD - 0% Hemolysis의 OD)x100

실시예 2-3: Hemolysis 분석 결과

10μg의 Crude saponin에 의한 용혈 효과를 억제하는 리포좀 극성을 확인하였다.

그 결과, 중성 리포좀(DOPC) 및 음이온성 리포좀(DMPG:DOPC)은 Crude saponin에 의한 Hemolysis를 억제하지 못한 반면(도 1), 100μg의 양이온성 리포좀(DDA:DOPC)은 Crude saponin에 의한 Hemolysis를 85% 억제하였다(도 2).

실시예 3: 양이온성 리포좀의 사포닌에 의한 용혈작용( hemolysis ) 억제 스크리닝

양이온성 및 중성 리피드의 불포화도에 따른 양이온성 리포좀의 사포닌 용혈 억제 효과를 확인하기 위하여, Lipid film법으로 다양한 리포좀을 제조하고 hemolysis 및 cytotoxicity(HaCat, L6, J774A.1)를 분석하였다.

실시예 3-1: 리포좀 제조

본 실시예에서 사용된 리포좀의 종류를 하기 표 6에 나타내었다.

No.	Liposome	Weight ratio(%)	Conc.(mg/mL)
1	DDA:DMPC	50:50	2
2	DDA:DPPC
3	DDA:DSPC
4	DDA:DOPC
5	DOTAP:DMPC	50:50	2
6	DOTAP:DPPC
7	DOTAP:DSPC
8	DOTAP:DOPC
9	DOTAP:DOPE

상기 표 6의 리포좀은 하기의 방법으로 제조하였다:

1) Glass tube에 양이온성 지질 및 중성 지질을 각각 칭량하여 넣는다.

2) Lipid 농도가 2mg/mL이 되도록 chloroform(Daejung)을 넣고, 37℃에서 10분간 완전히 용해시켜 lipid solution을 만든다.

3) 둥근 바닥 플라스크에 cationic lipid solution과 neutral lipid solution을 각각 1:1(중량비)로 혼합하여 lipid mixture를 만든다.

4) Rotary evaporator로 DOTAP을 함유하는 lipid mixture는 60℃, DDA를 함유하는 lipid mixture는 80℃에서 30분간 휘발을 진행하여 chloroform이 남아있지 않고 플라스크 벽면에 지질막 필름이 형성되는지 확인한다.

5) 리포좀의 농도가 2mg/mL이 되도록 플라스크에 sucrose in HEPES buffer(pH 7.4)를 넣고 65℃에서 지질막을 녹였다.

6) 제조된 리포좀을 glass vial에 500μL씩 분주하고 고무전을 vial 입구에 올린 후, 동결건조기(Ilshinbiobase/Lyoph-pride10, SXX2)에 넣고 하기 표 7과 같이 동결건조하였다.

Step	상태	온도(℃)	시간(hr)	진공도(mTorr)
1	예비동결	-40	2	999
2	유지	-40	27	50
3	승온	-20	10	50
4	유지	-20	2	50
5	승온	20	10	50
6	유지	20	13	50

7) 제조된 리포좀은 시험 전까지 4℃ 냉장고에 보관하였다.

실시예 3-2: Hemolysis 분석 방법

1) 동결건조 후 Glass vial에 보관된 리포좀에 225μL의 정제수를 넣어 수화하고, 60℃에서 10분간 반응시켜 리포좀을 완전히 용해시킨다.

2) 96 well plate에 liposome, saponin, sucrose in HEPES buffer(pH 7.4) 및 정제수를 하기 표 8 및 표 9와 같이 넣는다.

with Saponin(Liposome 농도 4.4mg/mL, Saponin 농도 0.25mg/mL)
Group	Liposome conc .( μg /well)								100% Hemolysis control	0% Hemolysis control
Group	0	2	3	6	13	25	50	100	100% Hemolysis control	0% Hemolysis control
Liposome(μl)	0.0	0.4	0.7	1.4	2.8	5.6	11.3	22.5	0	0
Saponin(μl)	10.0	10.0	10.0	10.0	10.0	10.0	10.0	10.0	0	0
Buffer(μl)	100.0	99.6	99.3	98.6	97.2	94.4	88.8	77.5	0	110
D.W.(μl)	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	110	0

without Saponin
Group	Liposome conc .( μg /well)								100% Hemolysis control	0% Hemolysis control
Group	0	2	3	6	13	25	50	100	100% Hemolysis control	0% Hemolysis control
Liposome(μl)	0.0	0.4	0.7	1.4	2.8	5.6	11.3	22.5	0	0
Saponin(μl)	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0	0
Buffer(μl)	100.0	99.6	99.3	98.6	97.2	94.4	88.8	77.5	0	110
D.W.(μl)	10.0	10.0	10.0	10.0	10.0	10.0	10.0	10.0	110	0

3) Orbital shaker에서 상온, 300rpm 조건으로 30분 동안 반응시킨다.

4) 3mL의 RBC를 10mL의 PBS로 suspension하고 상온, 1500rpm 조건으로 5분 동안 원심분리한 후 상층액을 제거하였다.

5) 3)-4)의 과정을 3회 반복하여 RBC를 washing한다.

6) RBC pellet을 1mL의 PBS로 suspension하고 1/100로 희석한 후 cell counting한다.

7) PBS를 이용하여 RBC를 1.5 x 10⁹cells/mL이 되도록 희석하고, 상기 2)의 시험물질이 처리된 96 well plate에 3 x 10⁷cells/20μL/well씩 처리한다.

8) Orbital shaker를 이용해 상온, 300rpm 조건으로 1시간 동안 반응시킨다.

9) 96 well plate를 상온, 1500rpm 조건으로 5분 동안 원심분리한다.

10) 상층액 50μL를 새 96 well plate로 옮긴 뒤 415nm에서 흡광도를 측정한다.

11) 다음의 공식으로 hemolysis %를 계산한다.

실시예 3-3: 사포닌 별 용혈 농도 확인

Quillaja Saponaria 유래 crude saponin(VET-SAP^®, Desert King) 및 QS21(Desert King)의 농도에 따른 용혈현상을 확인한 결과, crude saponin은 2.5 μg일 때, QS21은 2.5μg일 때, 100% Hemolysis가 나타나는 것을 확인하였다(도 3 및 도 4).

실시예 3-4: 양이온성 리포좀의 사포닌에 의한 용혈현상 억제 효과 확인

2.5μg의 crude saponin 및 QS21에 의한 용혈을 억제하는 양이온성 리포좀과 그 농도를 확인하였다.

그 결과, DDA:DMPC, DDA:DPPC 및 DDA:DSPC는 Crude saponin, QS21에 의한 hemolysis를 100%까지 억제하지는 못하였다(도 5 내지 도 7). 반면, crude saponin, QS21에 의한 Hemolysis가 100% 억제되는 용량은, DDA:DOPC는 25μg일 때(Liposome:Saponin = 10:1), DOTAP:DMPC는 50μg일 때(Liposome:Saponin = 20:1), DOTAP:DPPC는 50μg일 때(Liposome:Saponin = 20:1), DOTAP:DSPC는 50μg일 때(Liposome:Saponin = 20:1), DOTAP:DOPC는 25μg일 때(Liposome:Saponin = 10:1), DOTAP:DOPE는 12.5μg일 때(Liposome:Saponin = 5:1)임을 확인할 수 있었다(도 8 내지 도 13).

또한, 2.5μg crude saponin 및 QS21에 의한 Hemolysis를 억제하는 양이온성 리포좀의 LP 함량을 IC₅₀(Liposome concentration to inhibit 50% of hemolysis) 및 IC₁₀₀(Liposome concentration to inhibit 100% of hemolysis)을 이용하여 확인하였다(표 10 및 표 11).

양이온성 리포좀			2.5μg의 crude saponin에 의한 Hemolysis를 억제하는 양이온성 리포좀의 함량(μg)
종류	지질		IC₅₀	IC₁₀₀
종류	양이온성	중성	IC₅₀	IC₁₀₀
DDA:DMPC	18:0	14:0	199.9	-
DDA:DPPC	18:0	16:0	-	-
DDA:DSPC	18:0	18:0	-	-
DDA:DOPC	18:0	18:1	4.4	25.0
DOTAP:DMPC	18:1	14:0	2.8	50.0
DOTAP:DPPC	18:1	16:0	2.7	50.0
DOTAP:DSPC	18:1	18:0	3.3	50.0
DOTAP:DOPC	18:1	18:1	3.3	25.0
DOTAP:DOPE	18:1	18:1	2.9	12.5

양이온성 리포좀			2.5μg의 QS21에 의한 Hemolysis를 억제하는 양이온성 리포좀의 함량(μg)
종류	지질		IC₅₀	IC₁₀₀
종류	양이온성	중성	IC₅₀	IC₁₀₀
DDA:DMPC	18:0	14:0	74.4	-
DDA:DPPC	18:0	16:0	75.5	-
DDA:DSPC	18:0	18:0	53.9	-
DDA:DOPC	18:0	18:1	4.4	25.0
DOTAP:DMPC	18:1	14:0	3.8	50.0
DOTAP:DPPC	18:1	16:0	3.9	50.0
DOTAP:DSPC	18:1	18:0	4.8	50.0
DOTAP:DOPC	18:1	18:1	3.8	25.0
DOTAP:DOPE	18:1	18:1	4.3	12.5

결과적으로, 중성 지질만을 포함하는 중성 리포좀과 달리, 양이온성 지질을 포함하는 양이온성 리포좀의 경우 용혈억제능을 갖는 것을 확인하였으며, 양이온성 리포좀에 포함되는 지질의 saturation 조합에 따라서 리포좀의 용혈억제능에 현저한 차이가 있음을 확인할 수 있었다. 즉, 양이온성 리포좀 내 불포화 지방산의 함량이 높을수록 사포닌에 의한 용혈작용에 대한 억제 효과가 뛰어난 것을 확인할 수 있었다(도 14).

실시예 4: 리포좀의 세포독성( cytotoxicity ) 분석

실시예 4-1: 분석 방법

1) HaCat(Human keratinocyte)(High glucose DMEM, 10% FBS, 1% Penicillin-streptomycin)을 각각 37℃, 5% CO₂ incubator에서 배양한다.

2) 각각의 세포가 100mm dish의 80~90%의 confluency를 나타낼 때, 세포 배양액을 suction하여 제거하고, PBS 5mL로 세포를 세척한다.

3) 상기 100mm dish에 Trypsin-EDTA solution 5mL을 넣고 37℃, 5% CO₂ 조건에서 3~6분 동안 반응시킨 후, 세포 배양 배지 5mL을 추가하고, 세포 부유액을 15mL tube로 옮겨 1,500rpm, 상온, 3분 조건으로 원심분리한 후 상층액을 제거한다.

4) 상기 세포를 10mL의 PBS로 suspension 하고 1,500rpm, 상온, 3분 조건으로 3분 원심분리한 후 상층액을 제거한다.

5) 상기 과정들을 2회 반복하여 세포를 washing한다.

6) 수득한 세포에 세포 배양 배지 3mL을 넣어 세포를 부유시킨 후 trypan blue staining하여 세포수와 viability를 확인하기 위한 cell counting을 한다.

6) 세포의 viability가 85% 이상임을 확인하고, 배양 배지를 사용하여 세포부유액의 농도를 1x10⁵cells/mL로 맞춰 96 well plate에 100μL/well로 분주하고, 37℃, 5% CO₂ 조건에서 24시간 동안 배양한다.

7) 동결건조 후 리포좀이 보관된 glass vial에 225μL의 정제수를 넣어 수화하고, 60℃에서 10분간 반응시켜 리포좀을 완전히 용해한다(리포좀 농도: 4.4mg/mL).

8) 96 well plate에 22.5μL 리포좀, 10μL 사포닌(0.25mg/mL), 67.5μL buffer를 혼합하고 Orbital shaker에서 상온, 300rpm 조건으로 30분 동안 반응시킨다.

9) 리포좀과 사포닌 혼합물을 96 well plate에 20μL/well로 분주하고, 37℃, 5% CO₂ 조건에서 18시간 동안 배양한다.

10) Ez-cytox와 세포 배양 배지를 7:3으로 혼합한 후 24 well plate에 50μL/well씩 분주하고 37℃, 5% CO₂ 조건에서 3시간 동안 반응시킨다.

11) 96 well plate를 1500rpm, 상온, 5분 조건으로 원심분리 한다.

12) 상층액 100μL를 새 96 well plate로 옮긴 뒤 450nm에서 흡광도를 측정한다.

13) 다음의 공식으로 cytotoxicity %를 계산한다.

Cytotoxicity (%) = 100 - [(샘플의 OD/Buffer의 OD)x100]

실시예 4-2: 결과

도 15에 나타난 바와 같이, 양이온성 리포좀 내 불포화 지방산의 함량이 높을수록 적은 cytotoxicity를 나타내었다.

실시예 3의 결과와 종합하면, 불포화 지방산을 함유하는 양이온성 리포좀을 사용할 경우 적은 cytotoxicity를 나타내면서 사포닌에 의한 hemolysis를 100% 억제할 수 있음을 확인할 수 있다.

실시예 5: 다양한 사포닌 용혈 억제 스크리닝

양이온성 리포좀의 사포닌에 의한 용혈 억제 효과를 Quillaja Saponaria 유래 crude saponin 및 QS21 외의 다양한 사포닌에서 확인하고자 하였다.

실시예 5-1: 방법

Lipid film법으로 다양한 리포좀을 제조하였으며, hemolysis 분석을 수행하였다.

본 실시예에서 사용된 사포닌 및 양이온성 리포좀의 종류는 각각 하기 표 12 및 표 13에 나타내었다.

사포닌
분류	종류	함량(μg)
Steroidal saponin	Digitonin	2.5
Steroidal saponin	Paris VII	1.25
Triterpenoidal saponin	Aescin	2.5
Triterpenoidal saponin	α-Hederin	1.25

상기 표 12의 함량에 있어서, 사용 가능한 리포좀 함량에 한계가 있기 때문에 60% hemolysis를 일으키는 사포닌 농도를 선택하였다.

양이온성 리포좀
종류	지질		함량(μg)
	양이온성	중성
DDA:DMPC	18:0	14:0	400, 200, 100, 50, 25, 13, 6, 0
DDA:DOPC	18:0	18:1
DOTAP:DMPC	18:1	14:0	400, 200, 100, 50, 25, 13, 6, 0
DOTAP:DOPC	18:1	18:1

실시예 5-2: 리포좀 제조

본 실시예에서 사용된 리포좀은 하기의 방법으로 제조하였다:

2) Lipid 농도가 4mg/mL이 되도록 chloroform을 넣고, 37℃에서 10분간 완전히 용해시켜 lipid solution을 만든다.

5) 리포좀의 농도가 4mg/mL이 되도록 플라스크에 sucrose in HEPES buffer(pH 7.4)를 넣고 60℃에서 지질막을 녹였다.

6) 제조된 리포좀은 시험 전까지 4℃ 냉장고에 보관하였다.

실시예 5-3: Hemolysis 분석 방법

1) 96 well plate에 liposome, saponin, sucrose in HEPES buffer(pH 7.4) 및 정제수를 하기 표 14 및 표 15에 기재된 바와 같이 넣는다.

with Saponin(Liposome 농도 4mg/mL, Saponin 농도(Digitonin 0.25mg/mL, Paris VII 0.125mg/mL, Aescin 0.25mg/mL, α-Hederin 0.125mg/mL)
Group	Liposome conc .( μg /well)									100% Hemolysis control	0% Hemolysis control
Group	0	3	6	13	25	50	100	200	400	100% Hemolysis control	0% Hemolysis control
Liposome(μl)	0.0	0.8	1.6	3.1	6.3	12.5	25.0	50.0	100.0	0	0
Saponin(μl)	10.0	10.0	10.0	10.0	10.0	10.0	10.0	10.0	10.0	0	0
Buffer(μl)	100.0	99.2	98.4	96.9	93.8	87.5	75.0	50.0	0.0	0	110
D.W.(μl)	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	110	0

without Saponin
Group	Liposome conc .( μg /well)									100% Hemolysis control	0% Hemolysis control
Group	0	3	6	13	25	50	100	200	400	100% Hemolysis control	0% Hemolysis control
Liposome(μl)	0.0	0.8	1.6	3.1	6.3	12.5	25.0	50.0	22.5	0	0
Saponin(μl)	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0	0
Buffer(μl)	100.0	99.2	98.4	96.9	93.8	87.5	75.0	50.0	77.5	0	110
D.W.(μl)	10.0	10.0	10.0	10.0	10.0	10.0	10.0	10.0	10.0	110	0

4) 2)-3) 과정을 3회 반복하여 RBC를 washing한다.

5) RBC pellet을 1mL의 PBS로 suspension 하고 1/100로 희석한 후 cell counting한다.

6) PBS를 이용하여 RBC를 1.5 x 10⁹cells/mL이 되도록 희석하고, 상기 2)의 시험물질이 처리된 96 well plate에 3 x 10⁷ cells/20μL/well씩 처리한다.

10) 다음의 공식으로 hemolysis %를 계산한다.

실시예 5-4: Steroidal saponin에 의한 용혈 작용( hemolysis ) 억제 효과 확인

100% hemolysis를 일으키는 Digitonin, Paris VII의 농도를 확인한 결과, Digitonin은 10μg, Paris VII는 5μg일 때 100% hemolysis가 나타났으며, Digitonin이 2.5μg, Paris VII이 1.25μg일 때 60% hemolysis가 나타났다(도 16).

이에 따라, 2.5μg의 Digitonin에 의한 용혈 효과를 억제하는 DDA(18:0):DMPC(14:0), DDA(18:0):DOPC(18:1)의 농도를 확인한 결과, DDA:DMPC는 Digitonin에 의한 hemolysis를 억제하지 못하였으며, DDA:DOPC는 400μg일 때(Liposome:Saponin = 160:1) Digitonin에 의한 hemolysis를 100% 억제함을 확인하였다(도 17).

2.5μg의 Digitonin에 의한 용혈 효과를 억제하는 DOTAP(18:1):DMPC(14:0), DOTAP(18:1):DOPC(18:1)의 농도를 확인한 결과, DOTAP:DMPC가 400μg일 때(Liposome:Saponin = 160:1) Digitonin에 의한 hemolysis가 100% 억제되었으며, DOTAP:DOPC가 200μg일 때(Liposome:Saponin = 80:1) Digitonin에 의한 hemolysis가 100% 억제됨을 확인하였다(도 18).

또한, 1.25μg의 Paris VII에 의한 용혈 효과를 억제하는 DDA(18:0):DMPC(14:0), DDA(18:0):DOPC(18:1)의 농도를 확인한 결과, DDA:DMPC는 Paris VII에 의한 hemolysis를 억제하지 못하였고, DDA:DOPC는 400μg일 때 Paris VII에 의한 hemolysis가 50% 억제됨을 확인하였다(도 19).

1.25μg의 Paris VII에 의한 용혈 효과를 억제하는 DOTAP(18:1):DMPC(14:0), DOTAP(18:1):DOPC(18:1)의 농도를 확인한 결과, DOTAP:DMPC가 400μg일 때(Liposome:Saponin = 320:1) Paris VII에 의한 hemolysis가 100% 억제되었고. DOTAP:DOPC가 400μg일 때 Paris VII에 의한 hemolysis가 100% 억제됨을 확인하였다(도 20).

실시예 5-5: Triterpenoidal saponin에 의한 용혈 작용( hemolysis ) 억제 효과 확인

100% Hemolysis를 일으키는 Aescin, α-Hederin의 농도를 확인한 결과, Aescin은 5μg, α-Hederin은 10μg일 때 100% hemolysis가 나타났으며, Aescin 2.5μg, α-Hederin 1.25μg일 때 60% hemolysis가 나타났다(도 21).

이에 따라, 2.5μg의 Aescin에 의한 용혈 효과를 억제하는 DDA(18:0):DMPC(14:0), DDA(18:0):DOPC(18:1)의 농도를 확인한 결과, DDA:DMPC는 Aescin에 의한 hemolysis를 억제하지 못하였고, DDA:DOPC는 400μg일 때(Liposome:Saponin = 160:1) Aescin에 의한 hemolysis를 100% 억제하였다(도 22).

2.5μg의 Aescin에 의한 용혈 효과를 억제하는 DOTAP(18:1):DMPC (14:0), DOTAP(18:1):DOPC(18:1)의 농도를 확인한 결과, DOTAP:DMPC, DOTAP:DOPC는 각각 200μg일 때(Liposome:Saponin = 80:1) Aescin에 의한 hemolysis를 100% 억제함을 확인하였다(도 23).

또한, 1.25μg의 α-Hederin에 의한 용혈 효과를 억제하는 DDA(18:0):DMPC(14:0), DDA(18:0):DOPC(18:1)의 농도를 확인한 결과, DDA:DMPC는 α-Hederin에 의한 hemolysis를 억제하지 못하였고, DDA:DOPC는 13μg일 때(Liposome:Saponin = 10.4:1) α-Hederin에 의한 hemolysis가 100% 억제되었다(도 24).

1.25μg의 α-Hederin에 의한 용혈 효과를 억제하는 DOTAP(18:1):DMPC(14:0), DOTAP(18:1):DOPC(18:1)의 농도를 확인한 결과, DOTAP:DMPC, DOTAP:DOPC는 각각 13μg일 때(Liposome:Saponin = 10.4:1) α-Hederin에 의한 hemolysis가 100% 억제되었다(도 25).

실시예 5-6: 결과

다양한 saponin에 의한 hemolysis를 억제하는 리포좀의 함량은 하기 표 16에 나타난 바와 같다.

Liposome			Steroidal saponin				Triterpenoidal saponin
종류	지질		Digitonin		Paris VII		Aescin		α-Hederin
종류	양이온성	중성	IC₅₀	IC₁₀₀	IC₅₀	IC₁₀₀	IC₅₀	IC₁₀₀	IC₅₀	IC₁₀₀
DDA:DMPC	18:0	14:0	-	-	-	-	-	-	-	-
DDA:DOPC	18:0	18:1	198.9	400.0	256.2	-	222.5	400.0	8.3	12.5
DOTAP:DMPC	18:1	14:0	105.4	400.0	219.8	400.0	88.9	200.0	7.5	12.5
DOTAP:DOPC	18:1	18:1	64.4	200.0	188.3	400.0	66.1	200.0	6.1	12.5

IC₅₀: Liposome concentration to inhibit 50% of hemolysis.

IC₁₀₀: Liposome concentration to inhibit 100% of hemolysis.

그 결과, 양이온성 리포좀 내 불포화 지방산이 존재하는 경우 사포닌에 의한 용혈 효과 억제 효과가 뛰어난 것을 확인할 수 있다.

실시예 6: 사포닌에 의한 용혈( hemolysis )을 억제하는 양이온성 리포좀 내 양이온성 및 중성 지질의 비율 확인

사포닌에 의한 용혈 효과를 억제하는 양이온성 리포좀 내 양이온성 지질과 중성 지질의 비율을 확인하고자, Freeze-drying method로 양이온성 지질 및 중성 지질의 비율별 양이온성 리포좀을 제조하고 hemolysis 분석을 수행하였다.

실시예 6-1: 리포좀 제조

본 실시예에서 사용된 리포좀의 종류를 하기 표 17에 나타내었다.

No.	Liposome	Weight ratio(%)	Conc.(mg/mL)
1	DDA:DOPC	0:100, 10:90, 20:80, 30:70, 40:60, 50:50, 60:40, 70:30, 80:20, 90:10, 100:0	2
2	DOTAP:DMPC		2
3	DOTAP:DOPC		2

상기 표 17의 리포좀은 하기의 방법으로 제조하였다:

1) 70mL 유리 용기에 240mg의 DDA, DOPC, DOTAP, DMPC를 칭량하여 넣는다.

2) 각각의 용기에 60mL의 t-butyl alcohol을 넣어 4mg/mL의 lipid stock solution을 제조하고 10분간 가열하여 lipid를 완전히 용해시킨다.

3) 하기 표 18과 같이, 10mL 유리용기에 DDA, DOPC, DMPG를 혼합하여 lipid mixture를 만든다.

Weight ratio(%)	DDA:DOPC		DOTAP:DMPC		DOTAP:DOPC
Weight ratio(%)	DDA	DOPC	DOTAP	DMPC	DOTAP	DOPC
0:100	0.0	5.0	0.0	5.0	0.0	5.0
10:90	0.5	4.5	0.5	4.5	0.5	4.5
20:80	1.0	4.0	1.0	4.0	1.0	4.0
30:70	1.5	3.5	1.5	3.5	1.5	3.5
40:60	2.0	3.0	2.0	3.0	2.0	3.0
50:50	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5
60:40	3.0	2.0	3.0	2.0	3.0	2.0
70:30	3.5	1.5	3.5	1.5	3.5	1.5
80:20	4.0	1.0	4.0	1.0	4.0	1.0
90:10	4.5	0.5	4.5	0.5	4.5	0.5
100:0	5.0	0.0	5.0	0.0	5.0	0.0

5) -70℃ 냉동고에서 2시간 동안 동결한 후 동결 건조기로 옮겼다. 20Pa, -80℃ 조건에서 약 18시간 동안 동결 건조하여 유기 용매를 휘발시킨다.

실시예 6-2: Hemolysis 분석 방법

1) 96 well plate에 liposome, saponin, sucrose in HEPES buffer(pH 7.4) 및 정제수를 하기 표 19 및 표 20에 기재된 바와 같이 넣는다.

with Saponin(Liposome 농도 4mg/mL, Saponin 농도(Digitonin 0.25mg/mL, α-Hederin 0.125mg/mL, Crude saponin 0.25mg/mL, QS21 0.25mg/mL)
Group	Liposome ( 양이온성 지질:중성 지질)											100% Hemolysis control	0% Hemolysis control
Group	0:100	10:90	20:80	30:70	40:60	50:50	60:40	70:30	80:20	90:10	100:0	100% Hemolysis control	0% Hemolysis control
Liposome (μl)	100.0	100.0	100.0	100.0	100.0	100.0	100.0	100.0	100.0	100.0	100.0	0	0
Saponin(μl)	10.0	10.0	10.0	10.0	10.0	10.0	10.0	10.0	10.0	10.0	10.0	0	0
Buffer(μl)	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0	110
D.W. (μl)	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	110	0

without Saponin
Group	Liposome ( 양이온성 지질:중성 지질)											100% Hemolysis control	0% Hemolysis control
Group	0:100	10:90	20:80	30:70	40:60	50:50	60:40	70:30	80:20	90:10	100:0	100% Hemolysis control	0% Hemolysis control
Liposome (μl)	100.0	100.0	100.0	100.0	100.0	100.0	100.0	100.0	100.0	100.0	100.0	0	0
Saponin(μl)	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0	0
Buffer(μl)	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0	110
D.W. (μl)	10.0	10.0	10.0	10.0	10.0	10.0	10.0	10.0	10.0	10.0	10.0	110	0

3) 3mL의 RBC를 10mL의 PBS로 suspension하고 상온, 1500rpm 조건으로 5분 동안 원심분리한 후 상층액을 제거하였다.

4) 2)-3) 을 3회 반복하여 RBC를 washing한다.

10) 다음의 공식으로 hemolysis %를 계산한다.

실시예 6-3: Hemolysis 분석 결과에 따른 양이온성 리포좀 내 양이온성 및 중성 지질의 비율 확인

1) 사포닌의 용혈 효과를 억제하는 DDA(18:0):DOPC(18:1)의 지질 비율

2.5μg Digitonin에 의한 hemolysis는 DDA:DOPC 내 DDA의 함량이 40% ~ 60%일 때 100% 억제되었으며, 1.25μg α-Hederin에 의한 hemolysis는 DDA:DOPC 내 DDA의 함량이 30% ~ 70%일 때 100% 억제되었다(도 26).

2.5μg Crude saponin에 의한 hemolysis는 DDA:DOPC 내 DDA의 함량이 30% ~ 70%일 때 100% 억제되었으며, 2.5μg QS21에 의한 hemolysis는 DDA:DOPC 내 DDA의 함량이 30% ~ 70%일 때 100% 억제되었다(도 27).

2) 사포닌의 용혈 효과를 억제하는 DOTAP(18:1):DMPC (14: 0)의 지질 비율

2.5μg Digitonin에 의한 hemolysis는 DOTAP:DMPC 내 DOTAP의 함량이 40% 이상일 때 100% 억제되었으며, 1.25μg α-Hederin에 의한 hemolysis는 DOTAP:DMPC 내 DOTAP의 함량이 40% ~ 90%일 때 100% 억제되었다(도 28).

2.5μg Crude saponin에 의한 hemolysis는 DOTAP:DMPC 내 DOTAP의 함량이 30% 이상일 때 100% 억제되었으며, 2.5μg QS21에 의한 hemolysis는 DOTAP:DMPC 내 DOTAP의 함량이 30% 이상일 때 100% 억제되었다(도 29).

3) 사포닌의 용혈 효과를 억제하는 DOTAP(18:1):DOPC(18:1)의 지질 비율

2.5μg Digitonin에 의한 hemolysis는 DOTAP:DOPC 내 DOTAP의 함량이 40% 이상일 때 100% 억제되었으며, 1.25μg α-Hederin에 의한 hemolysis는 DOTAP:DOPC 내 DOTAP의 함량이 20% 이상일 때 100% 억제되었다(도 30).

2.5μg Crude saponin에 의한 hemolysis는 DOTAP:DOPC 내 DOTAP의 함량이 10% 이상일 때 100% 억제되었으며, 2.5μg QS21에 의한 hemolysis는 DOTAP:DOPC 내 DOTAP의 함량이 10% 이상일 때 100% 억제되었다(도 31).

실시예 6-4: 결과

상기 실시예 6-3에 기재된 바와 같이, 다양한 사포닌에 대한 다양한 양이온성 리포좀 내의 양이온성 지질 및 중성 지질의 비율을 확인한 결과, 양이온성 리포좀 내 양이온성 지질의 비율이 10 ~ 100%일 때 사포닌에 의한 hemolysis가 효과적으로 억제되었다(표 21).

다양한 Saponin에 의한 Hemolysis를 억제하는 양이온성 리포좀 내 양이온성 지질의 비율

Saponin

Liposome

Cationic liposome 내 cationic lipid의 비율
( % , weight ratio)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Digitonin

DDA(18:0):
DOPC(18:1)

○

α-Hederin

○

Crude saponin

○

QS21

○

Digitonin

DOTAP(18:1)
:DMPC(14:0)

○

α-Hederin

○

Crude saponin

○

QS21

○

Digitonin

DOTAP(18:1)
:DOPC(18:1)

○

α-Hederin

○

Crude saponin

○

QS21

○

Saponin

Liposome

Cationic liposome 내 cationic lipid의 비율
( % , molar ratio)

0

14

28

39

50

60

69

78

86

93

100

Digitonin

DDA(18:0):
DOPC(18:1)

○

α-Hederin

○

Crude saponin

○

QS21

○

Saponin

Liposome

0

15

27

39

50

60

69

78

86

93

100

Digitonin

DOTAP(18:1)
:DMPC(14:0)

○

α-Hederin

○

Crude saponin

○

QS21

○

Digitonin

DOTAP(18:1)
:DOPC(18:1)

○

α-Hederin

○

Crude saponin

○

QS21

○

○: 사포닌에 의한 hemolysis가 억제됨.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

양이온성 리포좀 및 사포닌을 포함하는 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 조성물에 있어서, 상기 양이온성 리포좀은 양이온성 지질 및 중성 지질을 함유하는 것을 특징으로 하는 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 양이온성 지질 또는 중성 지질은 하나 이상의 불포화 지방산을 포함하는 것을 특징으로 하는 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 양이온성 지질은 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄프로페인(1,2-dioleoyl-3-(trimethylammonium)propane; DOTAP), 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드(dimethyldioctadecylammonium bromide; DDA), 3β-[N-(N′,N′-디메틸아미노에테인 카바모일 콜레스테롤(3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane) carbamoyl cholesterol; DC-Chol), 1,2-디올레오일-3-디메틸암모늄프로페인(1,2-dioleoyl-3-(dimethylammonium)propane; DODAP), 1,2-디-O-옥타데세닐-3-트리에틸암모늄 프로페인(1,2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium propane; DOTMA), 1,2-디미리스토레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-dimyristoleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine; 14:1 Ethyl PC), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine; 16:0-18:1 Ethyl PC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine; 18:1 Ethyl PC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholin; 18:0 Ethyl PC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine; 16:0 Ethyl PC), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine; 14:0 Ethyl PC), 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholin; 12:0 Ethyl PC), N1-[2-((1S)-1-[(3-아미노프로필)아미노]-4-[디(3-아미노-프로필)아미노]부틸카복사미도)에틸]-3,4-디[올레일옥시]-벤자마이드(N1-[2-((1S)-1-[(3-aminopropyl)amino]-4-[di(3-amino-propyl)amino]butylcarboxamido)ethyl]-3,4-di[oleyloxy]-benzamide, MVL5), 1,2-디미리스토일-3-디메틸암모늄-프로페인(1,2-dimyristoyl-3-dimethylammonium-propane; 14:0 DAP), 1,2-디팔미토일-3-디메틸암모늄-프로페인(1,2-dipalmitoyl-3-dimethylammonium-propane; 16:0 DAP), 1,2-디스테아로일-3-디메틸암모늄-프로페인(1,2-distearoyl-3-dimethylammonium-propane; 18:0 DAP), N-(4-카복시벤질)-N,N-디메틸-2,3-비스(올레오일옥시)프로판-1-아미늄(N-(4-carboxybenzyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(oleoyloxy)propan-1-aminium; DOBAQ), 1,2-스테아로일-3-트리메틸암모늄-프로페인(1,2-stearoyl-3-trimethylammonium-propane; 18:0 TAP), 1,2-디팔미토일-3-트리메틸암모늄-프로페인(1,2-dipalmitoyl-3-trimethylammonium-propane; 16:0 TA), 1,2-디미리스토일-3-트리메틸암모늄-프로페인(1,2-dimyristoyl-3-trimethylammonium-propane; 14:0 TAP) 및 N4-콜레스테릴-스퍼민(N4-Cholesteryl-Spermine; GL67)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 중성 지질은 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린(1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphorylcholine; DMPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine; DOPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine; DOPE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine; DPPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine; DSPC), 1,2-디리노레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine; DLPC), 포스파티딜세린(phosphatidylserine; PS), 포스포에탄올라민(phosphatidylethanolamine; PE), 포스파티딜글리세롤(phosphatidylglycerol; PG), 포스포릭액시드(phosphoric acid; PA) 및 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine; PC)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 양이온성 지질은 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄프로페인(1,2-dioleoyl-3-(trimethylammonium)propane; DOTAP) 또는 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드(dimethyldioctadecylammonium bromide; DDA)이고, 중성 지질은 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린(1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphorylcholine; DMPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine; DOPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine; DOPE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine; DPPC) 및 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine; DSPC)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 양이온성 리포좀 내 양이온성 지질의 중량비(%)는 10 내지 100%인 것을 특징으로 하는 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 사포닌은 Quillaja Saponaria 유래 조 사포닌(crude saponin), QS21 및 QS21을 포함하는 분획물, 스테로이드성 사포닌(steroidal saponin) 또는 트리테르페노이드 사포닌(triterpenoid saponin)인 것을 특징으로 하는 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 면역증강용 조성물.
제8항에 있어서, 면역보조제(adjuvant)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 면역증강용 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 약물 전달용 조성물.
양이온성 리포좀을 포함하는 약물전달체에 있어서, 상기 양이온성 리포좀은 양이온성 지질 및 중성 지질을 함유하는 것을 특징으로 하는 약물전달체.
제11항에 있어서, 상기 양이온성 지질 또는 중성 지질은 하나 이상의 불포화 지방산을 포함하는 것을 특징으로 하는 약물전달체.
양이온성 리포좀에 약물이 흡착 또는 봉입되어 있는 약물-전달체 복합체에 있어서, 상기 양이온성 리포좀은 양이온성 지질 및 중성 지질을 함유하는 것을 특징으로 하는 약물-전달체 복합체.
제13항에 있어서, 상기 양이온성 지질 또는 중성 지질은 하나 이상의 불포화 지방산을 포함하는 것을 특징으로 하는 약물-전달체 복합체.