WO2012072006A1

WO2012072006A1 - 一种水溶性药物的脂质体冻干组合物及其制备方法

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Publication number: WO2012072006A1
Application number: PCT/CN2011/082958
Authority: WO
Inventors: 卢智俊
Original assignee: 广州朗圣药业有限公司
Priority date: 2010-11-29
Filing date: 2011-11-25
Publication date: 2012-06-07
Also published as: US20130315987A1; CN102018672A; CN102018672B

Description

一种水溶性药物的脂盾体冻干组合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及医药领域，特别涉及一种水溶性药物脂质体冻干组合物及其制备方法。

背景技术

脂质体是由磷脂分子构成的双分子层嚢泡。可分为单层脂质体和多层脂质体。它的结构在很多文献及专著中均有所描述。脂质体作为药物载体，能够满足药物制剂治疗上的许多要求，具有许多优点，脂质体能够包封药物，并将药物带至病灶；通过脂质体给药，能够控制药物在体内组织中的分布，降低药物在血液中的含量，降低毒性。

脂质体的制备方法也很多，在很多文献以及专著中均有所介绍，如 Szoka and apahadjopoulos, Ann. Re. Biophysics Bioeng. 9 : 467-508 (1980) 、 Liposome Technology, Preparation of Liposome, Vol I, Gregor iadis (Ed) , CRC Press, Inc. (1984)、《现代药物新剂型与新技术》等。在一些专利中也描述了脂质体包裹技术，如美国专利 US4, 235, 871和 US4, 016， 100。

如下表所示，脂质体技术已经成功运用到表中的几个药物的包裹，并实现工业化生产（下表中产品为目前已经批准上市的脂质体产品）。具体来说，在美国专利 US5213804描述了一种脂质体组合物，成功应用于包裹蒽环类药物如盐酸多柔比星等。且用该技术所制备的盐酸多柔比星脂质体注射液（doxi l) 已成功上市，主要用于治疗艾滋病、以及肿瘤等，由于，脂质体具有靶向性，从而显著地提高了疗效，降低了毒性。

表. 目前已经批准上市的脂质体产品介绍活性成 S家

有效

生产厂商适应症（或地区）及备注份

期

上市情况 1 水溶生药盐酸多 20个

I Doxil Sequus 艾滋病、癌症欧美 1995 物 , 液体柔比星月

制剂

1 柠檬酸水溶生药

Dauno 18个 \ 柔红霉 Nexstar 艾滋病、癌症欧美 1996 物 , 液体 xome

1 月

素制剂水溶生药

；阿糖胞 Depo 急性粒细胞 1999年上 18个

Depotech 物 , 液体

1 苷 cyt 白血病市月

制剂

NeXstar 水不溶性两性霉 Ambio 1990年上 36个

Pharma 抗真菌感染药物，冻素 B some

ceuticals 市月

干制剂目前上市的各种脂质体产品中，大多为液体制剂。然而，脂质体在水性介质中易发生聚集、融合、磷脂水解及药物渗漏等一系列问题，导致储存期缩短。尤其是，水溶性药物与脂质体膜之间的相互作用较弱，这便使得药品的长期稳定性问题更为突出。如上表所示，目前大多数脂质体制剂的有效期仅为 18-20个月。而在实际应用中，如果药品的有效期短于 2年，将给流通和使用环节带来很多不便。正因如此，关于脂质体液体制剂的研究非常多，但是真正上市并且广泛应用的只有上述几个药物。为了提高脂质体的有效期，使得脂质体能够得到更为广泛的应用，研发人员作了艮多尝试。 1978年 Van 1 eb er ghe (药物冻干制剂技术的设计及应用）首次报道了釆用冷冻干燥法提高脂质体的贮存稳定性。 1990研发人员发现可以通过冻干技术使如两性霉素 B等水不溶性药物的脂质体制剂稳定性得到提高，该技术已经成功应用并且实现工业化生产于 1990年成功上市（商品名： Ambiosome ) , 该品的有丈期能够长达三年。

自此，研发人员开始尝试对其它药物用脂质体包裹进行冻干保护。然而，发现脂质体在冷冻过程中，水晶的形成、渗透压的改变、相分离及相转变等因素均可导致脂质膜折叠、融合、破裂及药物渗漏，水溶性药物由于其与脂质体膜之间的相互作用较弱，冻干过程中更容易渗漏，因此从技术上更难实现冻干，目前尚未有任何水溶性药物能够制成冻干脂质体并长期保存（有效期> 18个月）。为了解决脂质体混悬液长期稳定性差，而冻干过程中容易造成脂质体渗漏，包封率降低的难题，研发人员发现在冻干前加入适当的冻干保护剂，可以防止脂质体在冷冻干燥过程中芯材的渗漏及粒子间的相互聚集融合，这便实现了单层脂质体转变为多层脂质体这一改变。近二十年来，寻找合适的冻干保护剂，实现脂质体以冻干形式的长期稳定保存（有效期> 20个月 ) , 成为脂质体领域的研究热点之一。研发人员为解决脂质体冻干，以及寻找适合的冻干保护剂进行着不断的努力与研究。美国专利 US431172公开了一种冻干脂质体，该冻干脂质体由两亲性磷脂和至少一种能溶解于有机溶中的脂溶性药物组成。按照该专利的说明书所制备的冻干品在复溶后药物的包封率仅约为 80%。

但是，目前并没有研究表明通过釆用现有的这些冻干保护剂能够制备包封率 > 90%, 有效期 > 20个月以上的水溶性药物冻干脂质体。

发明内容

本发明目的之一是提供一种用于药物脂质体制备的冻干保护剂组合物，该冻干保护剂组合物含有糖类冻干保护剂以及环糊精或环糊精衍生物冻干保护剂，该冻干保护剂组合物尤其适用于水溶性药物脂质体的制备。本发明冻干保护剂组合物中糖类与环糊精或环糊精衍生物的重量比为 50-90： 5-35 , 优选为 70-80 : 5-15。本发明冻干保护剂组合物可通过将糖类与环糊精或环糊精衍生物混合制备。

本发明的另一目的是提供一种水溶性药物的脂质体冻干组合物，克服现有技术中水溶性药物的脂质体分散液不能长期稳定保存，而在对其冻干过程中容易造成水溶性药物渗漏、粒子间聚集融合以及包封率低的难题，提供了一种稳定性好、有效期 > 24个月，包封率 > 90%的水溶性药物冻干脂质体。本发明还提供了这种冻干脂质体的制备方法。

本发明脂质体冻干组合物是通过以下技术方案实现，一种水溶性药物脂质体冻干组合物，包含如下原辅料：水溶性药物、磷脂、聚乙二醇衍生化磷月旨、胆固醇、糖类冻干保护剂以及环糊精或环糊精衍生物冻干保护剂。

进一步地，优选上述脂质体冻干组合物中所包含的各原辅料的重量百分含量如下：水溶性药物 0.5 ~ 10%、磷脂 1 ~ 10%、聚乙二醇衍生化磷脂 1 ~ 12%、胆固醇 1 ~ 15%、糖类冻干保护剂 50 ~ 90%, 以及环糊精或环糊精衍生物冻干保护剂 5 ~ 35%。在本发明脂质体冻干组合物的一种优选的实施方式中，该脂质体冻干组合物中各原辅料的重量百分含量如下：水溶性药物 0.5 ~ 10%、碑脂 1~ 10%、聚乙二醇衍生化碑脂 1 ~ 12%、胆固醇 1 ~ 15%、糖类冻干保护剂 70 ~ 80%, 以及环糊精或环糊精衍生物冻干保护剂 5 ~ 15%。

在本发明中可以使用的糖类冻干保护剂包括但不限于海藻糖、木醇糖、葡萄糖、半乳糖、甘露醇、麦芽糖、蔗糖、乳糖、果糖，其中优选选自 D- 葡萄糖、乳糖、 D-甘露醇、麦芽糖、蔗糖中的一种或多种。优选地，在脂质体冻干组合物制备过程中，糖类冻干保护剂添加在空白脂质体或者包裹了水溶性药物的脂质体的外相分散液中，起到冻干保护的作用。

进一步地，上述糖类冻干保护剂优选乳糖和蔗糖。

环糊精、 Y-环糊精、羟丙基 -α-环糊精、羟丙基 -β-环糊精、 2-羟丙基 -β- 环糊精、羟丙基 -Υ-环糊精、羟乙基 -α-环糊精、羟乙基 -β-环糊精、 2-羟乙基 -β-环糊精、羟乙基 -Υ-环糊精，其中优选选自羟丙基 -α-环糊精、羟丙基 -β-环糊精、 2-羟丙基 -β-环糊精、羟丙基 -Υ-环糊精中的一种或多种。优选地，在脂质体冻干组合物制备过程中，环糊精或环糊精衍生物添加在已经包裹了水溶性药物的脂质体的外相分散液中，起到冻干保护的作用。

进一步地，上述的环糊精或环糊精衍生物优选自羟丙基 -a-环糊精、羟丙基 -β-环糊精、 2-羟丙基 -β-环糊精、和羟丙基 -Υ-环糊精中的一种或多种。

进一步地，上述的环糊精或环糊精衍生物更优选自羟丙基- β -环糊精或 2-羟丙基 -β-环糊精。在本发明中可以使用的磷脂选自蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、二硬酯酰碑脂酰甘油（ dipalmitoylphosphatidylglycerol, 简称 DSPG)、氢化大豆碑脂酰胆碱 ( Hydrogenated Soya Phosphatidyl Choline , 简称 HSPC) 、二油酰碑脂酰胆碱（dioleoylphosphatidylcholine , 简称 D0PC)、二软酯酰胆碑脂 (dipalmitoylphosphatidylglycerol , 简称 DPPG)、二硬脂酰碑脂酰乙醇胺 ( phosphatidylethanolamine pegol , 简称 DSPE)中的一种。在本发明中可以使用的聚乙二醇衍生化磷脂的结构中的磷脂部分选自大豆卵磷脂、二硬酯酰碑脂酰甘油、氢化大豆磷脂酰胆碱、二油酰碑脂酰胆碱、二软酯酰胆碑脂、二硬脂酰碑脂酰乙醇胺中的一种。其中优选聚乙二醇衍生化磷脂中所使用的聚乙二醇的分子量为 200-4000。更为优选地，聚乙二醇衍生化磷脂中所使用的聚乙二醇的分子量为 2000。例如：二硬脂酰碑脂酰乙醇胺-聚乙二醇 2000 ( DSPE-mPEG2000 ) 、二软酯酰胆碑脂-聚乙二醇 2000 ( DPPG-mPEG2000 )、氢化大豆磷脂酰胆碱-聚乙二醇 2000 ( HSPC -mPEG2000 )、二油酰磷脂酰胆碱-聚乙二醇 2000 ( D0PC-mPEG2000 ) 。

在本发明中可以使用的所述的水溶性药物选自抗肿瘤药物、抗感染药物或激素类药物。优选地，水溶性药物为抗肿瘤药物时，优选自多柔比星、柔红霉素、吡柔比星、表柔比星及这些药物的盐中的一种或多种。本发明的水溶性药物脂质体冻干组合物还可选择性包含一定量的其它辅料如组氨酸、甘氨酸、谷氨酸等。

本发明优选的一种水溶性药物脂质体冻干组合物，其包含重量比为 1-3% 的盐酸多柔比星、 5-8%的氢化大豆磷脂（HSPC)、 2-7%的聚乙二醇衍生化磷脂为 DSPE-mPEG2000、 1-7%的胆固醇、 70-80%的蔗糖和 5-15%的羟丙基- β -环糊精。

本发明优选的另一种水溶性药物脂质体冻干组合物，其包含重量比为

1-3%的盐酸柔红霉素、 5-8%的氢化大豆磷脂（HSPC)、 2-7%的聚乙二醇衍生化碑脂为 DSPE-mPEG2000、 1-7%的胆固醇、 70-80%的蔗糖和 5-15%的羟丙基- β - 环糊精。

同时本发明还提供了本发明水溶性药物冻干组合物的制备方法，包括如下步骤：将磷脂、聚乙二醇衍生化磷脂、胆固醇，溶解于有机溶剂中，得到透明溶液 Α；在 50-80 °C水浴条件下，边搅拌边向透明溶液 A中加入第一緩冲液，将制得物挤压，得到平均粒径为 10-500nm左右的空白脂质体 D ; 向空白脂质体 D中加入第二緩冲液置换出第一緩冲液，得到空白脂质体 E;将水溶性药物和糖类冻干保护剂用第二緩冲液溶解，得到溶液 B; 将空白脂质体 E与溶液 B 混合，在 40-120°C包封 5-60分钟后在常温下放冷，优选包封温度为 40-100 °C , 优选包封时间为 8-15分钟，放冷后得到包裹了水溶性药物的脂质体 F,在脂质体 F中加入环糊精或环糊精衍生物冻干保护剂，进行分装；放入冻干机冻干，即得水溶性药物的脂质体冻干组合物。本发明水溶性药物冻干组合物还可以用以下方法制备：将磷脂、聚乙二醇衍生化磷脂、胆固醇，溶解于有机溶剂中，得到透明溶液 A; 在 50-8CTC水浴条件下，边搅拌边向透明溶液 A中加入第一緩冲液，将制得物挤压，得到平均粒径为 10-500讓左右的空白脂质体 D；向空白脂质体 D中加入第二緩冲液置换出第一緩冲液，得到空白脂质体 E; 将水溶性药物用第二緩冲液溶解，得到溶液 B;将空白脂质体 E与溶液^'昆合，在 40-12CTC包封 5-60分钟后在常温下放冷，优选包封温度为 40-100 °C , 优选包封时间为 8-15分钟，放冷后得到包裹了水溶性药物的脂质体 F, 在脂质体 F中加入糖类和环糊精或环糊精衍生物冻干保护剂，进行分装；放入冻干机冻干，即得水溶性药物的脂质体冻干组合物。

在本发明中提到的名词， "脂质体的外相" 定义为：在分散液中，脂质体与脂质体之间的所有空间称为脂质体的外相。本发明中的水溶性药物是指

25 °C下， 1克溶质能在不到 1000ml水中溶解的药物，优选的水溶性药物为抗肿瘤药物。空白脂质体：指尚未包裹药物的脂质体。

本发明中由于联合使用糖类冻干保护剂以及环糊精或环糊精衍生物冻干保护剂，尤其是限定了糖类冻干保护剂以及环糊精或环糊精衍生物冻干保护剂的配伍比例，使得其产生相互协同作用，达到了显著效果。

另外，本发明人经过长期试验，最终确定在上述的制备方法中，在得到了空白脂质体 E之后 ,将糖类冻干保护剂和环糊精或环糊精衍生物冻干保护剂加入到体系中，使糖类冻干保护剂和环糊精或环糊精衍生物冻干保护剂都处于包裹了水溶性药物的脂质体 F的外相 ,从而保证了糖类冻干保护剂和环糊精冻干保护剂在最终得到的脂质体结构中发挥保护剂的作用 , 达到了本发明所述的效果。本发明由于釆用糖类和环糊精或环糊精衍生物作为脂质体的冻干保护剂，使最终得到的水溶性药物脂质体冻干组合物冻干前后的包封率及粒径变化最小，并且能够稳定保存 24个月以上。进一步地，上述的有机溶剂选自氯仿、乙醇、异丙醇、曱醇中的一种或多种。

进一步地，优选上述制备方法中的第一緩冲液为铵盐溶液，铵盐选自磷酸铵、碳酸铵、氯化铵、硫酸铵、乙酸铵中的一种或多种。

进一步地，优选上述的第二緩冲液为磷酸盐、柠檬酸盐、组氨酸溶液中的一种或多种，其中磷酸盐选自磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠中的一种或多种。

脂质体分散液给药系统作为一种具有显著的临床治疗优势的药物，其能够控制药物在体内组织中的分布，降低药物在血液中的含量，降低毒性。然而其有效期较短，并不利于药物的流通和使用，为了能够将脂质体技术更广泛地推广应用，本申请发明人对脂质体冻干保护剂以及冻干制备方法进行了大量的研究，惊奇地发现将糖类和环糊精或环糊精衍生物联合用作脂质体分散液的冻干保护剂，能够防止脂质体分散液在冻干过程中脂质受到破坏，从而得到包封率高、粒径变化小的脂质体，且釆用糖类和环糊精或环糊精衍生物联合用作脂质体分散液的冻干保护剂所制备的冻干组合物，在储存 0月、 6 月、 9月、 12月、 18月、 24个月后复溶，脂质体的粒径和包封率无显著性变化。实现了水溶性药物冻干脂质体组合物的长期稳定有效保存。

本发明产生的有益效果如下：本发明水溶性药物脂质体冻干组合物釆用糖类和环糊精或环糊精衍生物联合作为水溶性药物脂质体分散液的冻干保护剂，通过这样的技术方案能避免水溶性药物脂质体分散液在冻干过程中脂质体变形与破裂所导致的药物泄漏，在保证水溶性药物的质量的基础上，提高冻干组合物的稳定性、以及有效期。本发明水溶性药物脂质体冻干组合物的包封率 90%, 粒径在 l(T500nm之间，各项指标均符合质量标准要求，有效期 24个月。本发明所提供的水溶性药物脂质体冻干组合物更有利于具有明显治疗优势的脂质体剂型得到更好的应用，为水溶性药物脂质体的推广提供了更好的基础。

具体实施方式：

以下结合具体实施例对本发明进行详细说明，本发明所提供的实施例仅用于帮助理解本发明所提供的技术方案，而不构成对本发明保护范围的限制；本发明可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。

实施例 1

原辅药：水溶性药物为盐酸多柔比星 0.2g、磷酯为 HSPCO.9g、聚乙二醇衍生化碑脂为 DSPE-mPEG2000 0.4g、胆固醇 0.25g、糖类冻干保护剂为蔗糖 14.0g, 环糊精或环糊精衍生物冻干保护剂为羟丙基- β -环糊精 1.25g。

制备方法如下：

将磷脂、聚乙二醇衍生化磷脂、胆固醇，溶解于 500ml有机溶剂 99.5%乙醇中，得到透明液 A; 将透明液 A放入 60°C水浴中，将 250ml第一緩冲液硫酸铵溶液（ 250mM ) 边搅拌边加入到透明液 A中，将制得物用高压勾质机挤压得到平均粒径为 90nm左右的空白脂质体 D；在所得到的空白脂质体 D中加入第二緩冲液组氨酸（10mM) 5000ml置换空白脂质体 D外相的第一緩冲液硫酸铵，得到空白脂质体 E; 将水溶性药物和蔗糖用 200ml第二緩冲液组氨酸（10mM) 200ml溶解，得到溶液 B; 将溶液 B和空白脂质体 E混合，在 40°C包封 12分钟后在常温下放冷，得到包裹了水溶性药物的脂质体 F; 在脂质体 F中加入羟丙基- β-环糊精，分装成 10瓶，冻干，即得本发明的水溶性药物脂质体冻干组合物。

制备三批产品，得到产品分别为实施例 1-1, 实施例 1-2, 实施例 1-3。实施例 2

原辅药：盐酸柔红霉素 0.2g、 HSPC1.2g、 DSPE-mPEG2000 0.6g、胆固醇 1.0g、蔗糖 13. Og, 羟丙基 _β-环糊精 2.5g制备方法：同实施例 1, 其中，水浴温度为 76 °C , 包封温度为 105 °C。

制备三批产品，得到产品分别为实施例 2-1, 实施例 2-2, 实施例 2-3。实施例 3

原辅药：盐酸多柔比星 0.2g、 HSPC O.32g、 DSPE- mPEG20000.18g、胆固醇 0.2g、蔗糖 13.9g, 羟丙基 -α-环糊精 0.78g。

制备方法：同实施例 1, 有机溶剂替换为 99.5%曱醇（1000ml), 第二緩冲液替换为柠檬酸盐（ 10mM) 250ml; 其它成分不变；同时水浴温度为 65°C, 包封温度为 80°C：。制备三批产品，得到产品分别为实施例 3-1, 实施例 3-2, 实施例 3-3。实施例 4

原辅药：盐酸多柔比星 0.2g、 HSPC O.7g、 DSPE- mPEG20000.8g、胆固醇 0.4g、 D-半乳糖 6.7g, 2-羟丙基 -β-环糊精 4.6g。

制备方法：同实施例 1, 有机溶剂替换为 99.5%异丙醇 500ml, 第一緩冲液替换为醋酸铵（400mM) 300ml; 其它成分不变；同时水浴温度为 55°C, 包封温度为 100°C：。

制备三批产品，得到产品分别为实施例 4-1, 实施例 4-2, 实施例 4-3。实施例 5

原辅药：盐酸柔红霉素 0.16g、 DSPG 1.5g、 DPPG -mPEG2000 0.18g、胆固醇 0.36g、 D-葡萄糖 10. Og, 2-羟丙基 -β-环糊精 3.0g。

制备方法：同实施例 1, 其中，水浴温度为 57°C, 包封温度为 115°C。制备三批产品，得到产品分别为实施例 5-1, 实施例 5-2, 实施例 5-3。实施例 6

原辅药：盐酸吡柔比星 1.5g、 D0PC0.9g、 HSPC -mPEG20000.4g、胆固醇

0.60g、麦芽糖 9.6g, 2-羟丙基 -β-环糊精 2.0g。

制备方法：同实施例 1, 有机溶剂为曱醇 1000ml, 第一緩冲液替换为醋酸铵 350mM、 200ml, 第二緩冲液为碑酸二氢钾 5mM、 350ml; 其它成分不变；同时水浴温度为 52 °C, 包封温度为 90°C：。

制备三批产品，得到产品分别为实施例 6-1, 实施例 6-2, 实施例 6-3。实施例 7

原辅药：盐酸表柔比星 0.08g、 DPPGO.2g、 D0PC-mPEG2000共 0.18g、胆固醇 0.2g、麦芽糖 10. Og, 2-羟丙基 -β-环糊精 4.0g。

制备方法：同实施例 1, 有机溶剂替换为 99.7%异丙醇 600ml, 第二緩冲液替换为柠檬酸盐 8mM、 250ml; 其它成分不变；同时水浴温度为 63°C, 包封温度为 112°C。

制备三批产品，得到产品分别为实施例 7-1, 实施例 7-2, 实施例 7-3。实施例 8

原辅药：盐酸多柔比星 0.2g、 HSPC O.9g、 DSPE- mPEG20000.4g、胆固醇 0.25g、 D-甘露醇 9. Og, 羟丙基 -Y-环糊精 2.0g。

制备方法：同实施例 1, 有机溶剂替换为 99.0%氯仿（100ml) , 第一緩冲液替换为醋酸铵（ 300mM ) , 第二緩冲液替换为磷酸钠（10mM) 230ml; 其它成分不变；同时水浴温度为 50°C, 包封温度为 60°C：。

制备三批产品，得到产品分别为实施例 8-1, 实施例 8-2, 实施例 8-3。实施例 9

原辅药：盐酸吡柔比星 0. lg、 HSPCO.5g、 HSPC-mPEG2000 0.9g、胆固醇 1.0g、 D-甘露醇 10. Og, 羟丙基 _β-环糊精 3.0g。

制备方法：同实施例 1, 其中，有机溶剂替换为 99.0%氯仿 180ml, 第一緩冲液替换为醋酸铵 200mM、 300ml; 其它成分不变；同时水浴温度为 75°C, 包封温度为 98°C。

制备三批产品，得到产品分别为实施例 9-1, 实施例 9-2, 实施例 9-3。实施例 10

原辅药：盐酸多柔比星 0. lg、 D0PC0.7g、 DSPE- mPEG20001.36g、胆固醇 1.09g、蔗糖 8.65g, 羟丙基 - Y-环糊精 1.75g。

制备方法同实施例 1, 其中水浴温度为 68°C, 包封温度为 90°C：。

按实施例 1的方法制备三批，得到产品分别为实施例 10-1 , 实施例 10-2, 实施例 10-3。

实施例 11

原辅药：盐酸吡柔比星 1.0g、 HSPCO.9g、 DSPE- mPEG2000 0.5g、胆固醇 0.25g、 D-葡萄糖 11.5g, a-环糊精 2g。

制备方法：同实施例 1; 其它成分不变；同时水浴温度为 63°C, 包封温度为 80°C。

按实施例 1的方法制备三批产品，得到产品分别为实施例 11-1, 实施例 11-2, 实施例 11-3。实施例 12

原辅料：组分和重量同实施例 1

制备方法：将磷脂、聚乙二醇衍生化磷脂、胆固醇，溶解于有机溶剂异丙醇中，得到透明溶液 A; 在 50°C水浴条件下，边搅拌边向透明溶液 A中加入第一緩冲液硫酸铵，将制得物挤压，得到平均粒径为 10-500nm左右的空白脂质体 D;向空白脂质体 D中加入第二緩冲液组氨酸置换出第一緩冲液硫酸铵，得到空白脂质体 E; 将水溶性药物用第二緩冲液组氨酸溶解，得到溶液 B; 将空白脂质体 E与溶液 B混合，在 40°C包封 15分钟后在常温下放冷，得到包裹了水溶性药物的脂质体 F, 在脂质体 F中加入糖类和环糊精冻干保护剂，分装成 10瓶；冻干，即得水溶性药物的脂质体冻干组合物。

制备三批产品，得到产品分别为实施例 12-1, 实施例 12-2, 实施例 12-3。实施例 13

原辅药：组份和重量同实施例 1。

制备方法：同实施例 1, 其中，包封温度为 60°C, 包封时间为 40分钟。制备三批产品，得到产品分别为实施例 13-1, 实施例 13-2, 实施例 13-3。实施例 14

原辅药：组份和重量同实施例 1。

制备方法：同实施例 1, 其中，包封时间为 60分钟。

制备三批产品，得到产品分别为实施例 14-1, 实施例 14-2, 实施例 14-3。实施例 15

原辅药：组份和重量同实施例 1。

制备方法：同实施例 1, 其中，包封温度为 80°C, 包封时间为 8分钟。制备三批产品，得到产品分别为实施例 15-1, 实施例 15-2, 实施例 15-3。实施例 16

原辅药：组份和重量同实施例 1。

制备方法：同实施例 1, 其中，包封温度为 70°C, 包封时间为 45分钟。制备三批产品，得到产品分别为实施例 16-1 , 实施例 16-2 , 实施例 16-3。对比例 1

市售产品盐酸多柔比星脂质体注射液（doxil , 生产厂家 Ben Venue Laboratories, Inc. , 批号 071844224, 有效期 20个月）。

对比例 2

原辅料：除包裹了水溶性药物的脂质体的外相分散液中不加入环糊精或环糊精衍生物外，其余组份和量同实施例 1 。

制备方法：除不在脂质体 F中加入羟丙基- β环糊精外，其余同实施例 1 . 所制得的产品为对比例 2 。

对比例 3

原辅料：除空白脂质体外相分散液中不加入蔗糖外，其余组份和量同实施例 1 。

制备方法：除不将蔗糖用第二緩冲液组氨酸溶解外，其余同实施例 1，所制得的产品为对比例 2.

将由本发明实施例 1至实施例 16所制备的冻干组合物以及由对比例 1至对比例 3所制备的冻干组合物，进行质量、稳定性、有效期限进行测试，测试方法为本领域技术人员所使用的常规测试方法。

一、对根据本发明实施例 1至实施例 16所制备的产品以及对比产品 2所制备的产品冻干前与冻干后复溶得到的冻干脂质体进行包封率及粒径变化的进行检测，结果如表 1。表 1 本发明实施例 1至实施例 16产品与对比例 2冻千前与冻千后复溶后的包封率(％)及平均粒径（nm )

冻干前冻干复溶后 0小时

样品平均粒径包封率平均粒径

包封率（％)

( nm) ( % ) ( nm)

实施例 1-1 97. 6 78. 5 96. 5 81. 0

实施例 1-2 97. 8 78. 9 96. 3 82. 2

实施例 1-3 98. 5 78. 0 96. 9 81. 8

实施例 2-1 96. 9 82. 5 95. 4 85. 0

如 1所示，由本发明实施例 1至实施例 16所制备的脂质体冻干组合物，冻干复溶后包封率及粒径与冻干前相比基本相同。

对比例 2在加入糖类冻干保护剂而不加环糊精或环糊精衍生物冻干保护剂情况下，冻干后脂质体的包封率仅为 60. 5%,远低于脂质体药物要求的 80%, 更低于冻干前脂质体的包封率（95. 6% ) 。

对比例 3在加入环糊精冻干保护剂而不加糖类冻干保护剂的情况下，包封率和粒径均发生显著变化，冻干前的包封率为 88. 4% , 而冻干后即下降为 50. 6%, 粒径也由 84. 3变为 163. 2nm。

通过对比研究可知，本发明通过将糖类和环糊精或环糊精衍生物联合作为冻干保护剂，可以防止脂质体药物在冻干过程中脂质体变形或破裂，进而防止芯材从脂质体大量泄漏。本发明提供的脂质体冻干组合物冻干前后脂质体包封率均 > 90%, 粒径在 50-500nm，更重要的是，包封率和粒径冻干前后均无明显变化。

二、稳定性分析将根据本发明实施例 1至实施例 16所制备的脂质体冻干组合物与对比例 1 所提供的产品进行稳定性加速试验。因为对比例 2及 3的产品在冻干后已不能满足脂质体的质量要求，因此未再进行稳定性分析。

( 1 ) 25 °C环境下稳定性测试：将根据实施例 1至实施例 16所制备的样品以及市购的对比例 1产品在 25 °C环境下储存 0、 1、 2、 3、 6月，并测试样品在 0、 1、 2、 3、 6月时水溶性药物的含量（％)及有关物质（％) 的变化情况，结果列人表 2。表 2 本发明实施例 1至实施例 16所制备的样品与对比例 1产品 25 °C环境下稳定性加速试验结果

、

'

由表 2所示，对比 25°C保存 6个月后水溶 J含量弓显变少，且有关物质明显增加。而根据本发明实施例 1至实施例 16所制备的水溶性药物脂质体冻干组合物中水溶性药物的含量以及有关物质的含量物的变化幅度较小，符合质量要求。由此推测，本发明所提供的水溶性药物脂质体冻干组合物的长期稳定性明显好于对比例 1中所提供的产品。

(2)低温 2-10°C环境下稳定性测试：将根据实施例 1至实施例 16所制备的样品以及市购的对比例 1产品在低温 2-10°C环境下储存 0、 6、 9、 12、 20、 24个月，并进行如下测试：

1)测试样品在 0、 6、 9、 12、 20、 24月后冻干复溶后的包封率（％) , 结果列入表 3。

2) 测试样品在 0、 6、 9、 12、 20、 24月后冻干复溶后的粒径（ nm ) 变化情况，结果列入表 4。

3)测试样品在 0、 6、 9、 12、 20、 24月后冻干复溶后的含量（％)及有关物质（％) 变化情况，将结果列入表 5。

4)测试样品在 0、 6、 9、 12、 20、 24月后脂质体冻干组合物释放度变化情况，结果列入表 6。表 3本发明实施例 1至实施例 16所制备的产品与对比例 1产品在 2-10°C低温保存后长期稳定性考察包封率（％) 变化情况

0月 6月 9月 12月 20月 24月对比例 1 98.0 97.8 98.0 97.5 97.0 96.5 实施例 1-1 96.5 96.5 96.6 96.5 96.8 95.8 实施例 1-2 96.3 96.8 96.8 96.5 96.6 96.8 实施例 1-3 96.9 97.0 97.2 96.1 96.5 97.1 实施例 2-1 95.4 95.7 95.5 95.5 95.3 95.5 实施例 2-2 96.1 96.5 96.3 96.2 96.4 96.5 实施例 2-3 95.5 95.4 95.5 95.3 95.5 95.5 实施例 3-1 92.2 92.5 92.4 92.4 92.4 92.3 实施例 4-1 94.2 94.4 94.6 94.6 94.2 94.4 实施例 5-1 90.8 90.0 90.3 90.9 90.5 90.1 实施例 6-1 91.5 91.6 91.7 91.7 91.7 91.7 实施例 7-1 90.1 90.8 90.9 90.9 90.9 90.9 实施例 8-1 92.5 92.7 92.8 92.8 92.8 92.8 实施例 9-1 94, 3 94, 1 94, 2 94, 2 94, 2 94, 2 实施例 10-1 93.0 93.0 93.1 93.1 93.1 93.1 实施例 11-1 90. 6 90. 8 90. 9 90. 9 90. 9 90. 9 实施例 12-1 96. 4 96. 5 96. 6 96. 5 96. 8 95. 8 实施例 13-1 97. 5 97. 5 97. 4 97. 2 97. 2 97. 1 实施例 14-1 97. 1 97. 0 97. 1 96. 9 96. 7 96. 5 实施例 15-1 94. 7 94. 7 94. 5 94. 2 94. 1 93. 8 实施例 16-1 98. 3 98. 4 98. 3 98. 0 98. 1 97. 8

由表 3所示，对比产品 1及本发明实施例 1至实施例 16所制备的样品长期低温保存后包封率均无显著变化。表 4本发明实施例 1至实施例 16所制备的产品与对比例 1产品在 2-10°C低温保存后长期稳定性考察粒径变化（nm) 变化情况

由表 4所示，本发明实施例 1至实施例 16所制备的产品与对比例 1低温长期保存后粒径均无显著变化。表 5本发明实施例 1至实施例 16所制备的样品与对比例 1产品在 2-10°C低温保存后长期稳定性考察含量及有关物质变化情况。

储存后含量及有关物质变化均不明显，但是，相比而言，本发明实施例 1至实施例 16所制备的产品与对比例 1所制备的产品的稳定性更好，产品质量更力定均一。

表 6本发明实施例产品与对比产品 2- 10 °C低温保存后长期释放度（％) 变化情况

由表 6所示：对比例 1所提供的产品在 24月时释放度不满足质量标准中关于释放度的要求，质量标准中要求为药物 0. 5h内释放度不得大于 70%,推测这是对比例 1有效期仅为 20个月的重要原因。而本发明产品储存 24个月后释放度无显著变化，始终满足质量标准的要求。

综上所述，本发明水溶性药物脂质体冻干组合使用糖类和环糊精或环糊精衍生物共同作为冻干保护剂，优选地，糖类添加在空白脂质体或者包裹了水溶性药物的脂质体的的外相，环糊精添加在包裹了药物的脂质体的外相，糖类和环糊精或环糊精衍生物共同组成药物的冻干保护剂，能够成功实现将含水溶性药物的脂质体分散液冻干，冻干前后包封率和粒径没有显著变化，低温储存 24个月后各项质量指标均无显著变化，满足质量标准要求。本发明提供的水溶性药物脂质体冻干组合物能够稳定储存 24个月以上，相对现有水溶性药物脂质体产品如对比例 1 18-20个月的有效期，具有显著的进步及临床意义。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

权利要求书

1. 一种用于药物脂质体制备的冻干保护剂组合物，含有糖类冻干保护剂以及环糊精或环糊精衍生物冻干保护剂。

2. 权利要求 1所述的组合物，用于水溶性药物脂质体的制备，其中糖类与环糊精或环糊精衍生物的重量比为 50-90:5-35。

3. 一种水溶性药物脂质体冻干组合物，其特征在于包含如下原辅料：水溶性药物、磷脂、聚乙二醇衍生化磷脂、胆固醇、糖类冻干保护剂以及环糊精或环糊精衍生物冻干保护剂。

4. 根据权利要求 3所述的脂质体冻干组合物，其特征在于所述脂质体冻干组合物中所包含的各原辅料的重量百分含量如下：水溶性药物 0.5 ~ 10%、磷脂 1 ~ 10%、聚乙二醇衍生化磷脂 1 ~ 12%、胆固醇 1 ~ 15%、糖类冻干保护剂 50 ~ 90%, 以及环糊精或环糊精衍生物冻干保护剂 5~35%。

5. 根据权利要求 4所述的脂质体冻干组合物，其特征在于所述脂质体冻干组合物中各原辅料的重量百分含量如下：水溶性药物 0.5 ~ 10%、磷脂 1 ~ 10%、聚乙二醇衍生化磷脂 1 ~ 12%、胆固醇 1 ~ 15%、糖类冻干保护剂 70 ~ 80%, 以及环糊精或环糊精衍生物冻干保护剂 5~15%。

6. 根据权利要求 1-4任一所述的组合物，其特征在于，

所述的糖类选自 D -葡萄糖、 D -半乳糖、 D -甘露醇、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、木醇糖中的一种或多种；

所述的环糊精或环糊精衍生物选自羟丙基- α -环糊精、羟丙基- β -环糊精、 2-羟丙基 - β -环糊精、和羟丙基 - Υ -环糊精中的一种或多种。

7. 根据权利要求 3或 4所述的脂质体冻干组合物，其特征在于，所述碑脂选自蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、二硬酯酰碑脂酰甘油、氢化大豆磷脂酰胆碱、二油酰碑脂酰胆碱、二软酯酰胆磷脂、二硬脂酰碑脂酰乙醇胺中的一种；

所述聚乙二醇衍生化磷脂的结构中的磷脂部分选自二硬酯酰碑脂酰甘油、氢化大豆磷脂酰胆碱、二油酰磚脂酰胆碱、二软酯酰胆磚脂、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺中的一种。

8. 根据权利要求 7所述的脂质体冻干组合物，其特征在于所述聚乙二醇衍生化磷脂中所使用的聚乙二醇的分子量为 200-4000。

9. 根据权利要求 8所述的脂质体冻干组合物，其特征在于，所述聚乙二醇衍生化磷脂中所使用的聚乙二醇的分子量为 2000。

10. 根据权利要求 3或 4所述的脂质体冻干组合物，其特征在于，所述水溶性药物选自多柔比星、柔红霉素、表柔比星、吡柔比星及这些药物的盐中的一种或多种。

11. 根据权利要求 4所述的脂质体冻干组合物，其特征在于所述脂质体冻干组合物中各原辅料的重量百分含量如下： 1-3%的盐酸多柔比星、 5-8% 的氢化大豆碑脂 (HSPC)、 2-7%的聚乙二醇衍生化磷脂为 DSPE-mPEG2000、 1-7%的胆固醇、 70-80%的蔗糖和 5-15%的羟丙基- β -环糊精。

12. 根据权利要求 4所述的脂质体冻干组合物，其特征在于所述脂质体冻干组合物中各原辅料的重量百分含量如下： 1-3%的盐酸柔红霉素、 5-8%的氢化大豆磷脂 (HSPC)、 2-7%的聚乙二醇衍生化磷脂为 DSPE-mPEG2000、 1-7% 的胆固醇、 70-80%的蔗糖和 5-15%的羟丙基 - β -环糊精。

13. 一种权利要求 3-10中任一项所述的脂质体冻干组合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将磷脂、聚乙二醇衍生化磷脂、胆固醇，溶解于有机溶剂中，得到透明溶液 Α;

在 50-80°C水浴条件下，边搅拌边向透明溶液 A中加入第一緩冲液，将制得物挤压，得到平均粒径为 10-500nm左右的空白脂质体 D；

向空白脂质体 D中加入第二緩冲液置换出第一緩冲液，得到空白脂质体

E;

将水溶性药物和糖类冻干保护剂用第二緩冲液溶解，得到溶液 B; 将空白脂质体 E与溶液 B混合，在 40-100°C包封 5-60分钟后在常温下放冷，得到内相包裹了水溶性药物的脂质体 F; 在脂质体 F中加入环糊精或环糊精衍生物冻干保护剂，进行分装；冻干，即得水溶性药物的脂质体冻干组合物。

14. 一种权利要求 3-10中任一项所述的脂质体冻干组合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将磷脂、聚乙二醇衍生化磷脂、胆固醇，溶解于有机溶剂中，得到透明溶液 A;

E; 将水溶性药物用第二緩冲液溶解，得到溶液 B;

将空白脂质体 E与溶液 B混合，在 40-100 °C包封 5-60分钟后在常温下放冷，得到内相包裹了水溶性药物的脂质体 F；

在脂质体 F中加入糖类冻干保护剂和环糊精或环糊精衍生物冻干保护剂，进行分装；冻干，即得水溶性药物的脂质体冻干组合物。

15. 根据权利要求 12或 13所述的制备方法，其特征在于，所述的有机溶剂选自氯仿、乙醇、异丙醇、曱醇中的一种。

16. 根据权利要求 12或 13所述的制备方法，其特征在于，

所述的第一緩冲液为铵盐溶液，铵盐选自磷酸铵、碳酸铵、氯化铵、硫酸铵、乙酸铵中的一种或多种；

所述的第二緩冲液为磷酸盐、柠檬酸钠、柠檬酸、组氨酸溶液中的一种或多种，其中磷酸盐选自磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠中的一种或多种。