WO2014101356A1 - 一种蟾毒灵脂质体及其制备方法和应用 - Google Patents

一种蟾毒灵脂质体及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
WO2014101356A1
WO2014101356A1 PCT/CN2013/073466 CN2013073466W WO2014101356A1 WO 2014101356 A1 WO2014101356 A1 WO 2014101356A1 CN 2013073466 W CN2013073466 W CN 2013073466W WO 2014101356 A1 WO2014101356 A1 WO 2014101356A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
liposome
cancer
preparation
pharmaceutical composition
freeze
Prior art date
Application number
PCT/CN2013/073466
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
曹蔚
王四旺
李瑛�
谢艳华
杨倩
Original Assignee
中国人民解放军第四军医大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 中国人民解放军第四军医大学 filed Critical 中国人民解放军第四军医大学
Priority to US14/653,234 priority Critical patent/US9814734B2/en
Publication of WO2014101356A1 publication Critical patent/WO2014101356A1/zh

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/58—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids containing heterocyclic rings, e.g. danazol, stanozolol, pancuronium or digitogenin
    • A61K31/585—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids containing heterocyclic rings, e.g. danazol, stanozolol, pancuronium or digitogenin containing lactone rings, e.g. oxandrolone, bufalin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/58—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids containing heterocyclic rings, e.g. danazol, stanozolol, pancuronium or digitogenin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers with substantial amounts of non-phosphatidyl, i.e. non-acylglycerophosphate, surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1277—Processes for preparing; Proliposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/20—Pills, tablets, discs, rods
    • A61K9/2004—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/2013—Organic compounds, e.g. phospholipids, fats
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/20—Pills, tablets, discs, rods
    • A61K9/2004—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/2013—Organic compounds, e.g. phospholipids, fats
    • A61K9/2018—Sugars, or sugar alcohols, e.g. lactose, mannitol; Derivatives thereof, e.g. polysorbates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/20—Pills, tablets, discs, rods
    • A61K9/2004—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/2022—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/205—Polysaccharides, e.g. alginate, gums; Cyclodextrin
    • A61K9/2059—Starch, including chemically or physically modified derivatives; Amylose; Amylopectin; Dextrin

Definitions

  • Liposide liposome preparation method and application thereof
  • the invention belongs to the technical field of medicine, and relates to a scorpion venom liposome and a preparation method and application thereof. Background technique
  • Cancer is one of the most morbid diseases in the world. According to WHO data, the number of cancer deaths in 2008 was as high as 760 million, of which 60% came from low- or middle-income countries, and this number will continue to increase in the future. Among more than 200 cancers, breast cancer, lung cancer, colon cancer and pancreatic cancer accounted for 54% of all new cases. At present, the treatment of cancer depends on the type and stage of cancer, mainly including surgery, radiotherapy, chemotherapy and the combination of the above methods. Among them, there are many types of clinical chemotherapy drugs, and the mechanism of action is mainly to kill cells against the characteristics of rapid division of tumor cells.
  • the drug when killing rapidly dividing cancer cells, the drug can also kill other normal rapidly dividing cells, such as bone marrow, digestive tract and cells in hair follicles, which cause serious side effects and damage normal tissues. Accordingly, it is necessary to develop new therapeutic drugs with low side effects and high anti-tumor efficacy. Increasing the drug's selectivity for tumors and reducing its distribution in normal tissues are the main strategies for the development of new anti-tumor drugs.
  • ⁇ poisoning (3 ⁇ ,14-dihydroxy-5 ⁇ ,20(22)-decadienyl lactone, 5 ⁇ ,20(22)-decadienyl hydroxylactone-3 ⁇ , 14-diol) is a traditional Chinese medicine
  • the main anti-tumor component is a white serum secreted by the posterior glands of the Chinese giant salamander or black box, which can be extracted from the clams.
  • Synthetic synthesis can also be carried out according to patents US 3,134,772 and US 3,687,944. It is an immunologically active component of digoxin-like, showing various biological activities such as cardiotonic, anesthetic and stimulating blood vessels.
  • scorpion venom Since the anti-tumor effect of scorpion venom in 1994 (Numazawa S, et al. J Cell Physiol, 1994, 160(1): 113-20), a large number of studies have been carried out and found to have a broad-spectrum anti-tumor effect. In addition, scorpion venom is used in combination with other chemotherapeutic drugs, such as sorafenib, to show sensitizing effects on tumor cells (Gao Y, et al. Mol Biol Rep. 2012, 39(2): 1683-9) .
  • chemotherapeutic drugs such as sorafenib
  • scorpion venom can induce apoptosis and inhibit the proliferation of various cancer cells, such as liver cancer, osteoma, colon cancer, lung cancer, pancreatic cancer, ovarian cancer, gastric cancer, prostate cancer and leukemia cells.
  • various cancer cells such as liver cancer, osteoma, colon cancer, lung cancer, pancreatic cancer, ovarian cancer, gastric cancer, prostate cancer and leukemia cells.
  • scorpion venom can be used as a chemotherapy drug for the treatment of cancer.
  • scorpion venom due to its high toxicity, poor water solubility, short half-life, narrow therapeutic window, and close proximity to toxic doses and therapeutic doses, scorpion venom severely restricts its clinical application (Gong LL et al. Food and Drug. 2007, 9(10) :51-3).
  • scorpion venom due to its wide distribution in the body, it causes other clinical side effects such as vascular irritation, anaphylactic shock, hyperthermia, sinus bradycardia, etc. (Dasgupta A, et al. Life Sci. 1998, 63(9) B78, ed., Beck RJ, et al.
  • Huachansu injection prepared by dissolving medlar in physiological saline has been used in clinical cancer treatment in China. It has been reported that gemcitabine oxaliplatin combined with scutellarin can enhance chemotherapy in patients with advanced gallbladder cancer (Qin TJ, et al. World J Gastroenterol. 2008, 14(33): 5210-6). Another study showed that for patients with liver cancer and pancreatic cancer, 8 times the standard dose (20 ml / m 2 / or 20 ⁇ 25 ml / person / day, containing scorpion venom 14.3 ⁇ 0.03 ng / ml) of Huachansu injection The fluid did not produce significant toxicity (Meng Z. et al. Cancer.
  • Liposomes are a closed phospholipid bimolecular structure of the internal aqueous phase.
  • liposomes as a drug carrier for scorpion venom, which can solve the problem of poor water solubility by loading scorpion venom through the phospholipid membrane.
  • PEG-modified liposomes can passively target scorpion venom to tumor sites and reduce their toxic side effects.
  • Liposomes have been widely used for encapsulating anti-tumor drugs for nearly 20 years.
  • anti-tumor liposome drugs for clinical or upcoming clinical use, such as doxorubicin liposomes (Doxil/Caelyx Sold by Alza/Johnson and Johnson in the United States or Schering-Plough in other countries), daunorubicin liposomes (DaunoXome, Gilead), cytarabine liposomes (DepoCyte, produced by Skye Pharma/Enzon/Mundipharma), Cisplatin liposomes (Lipoplatin, produced by Regulon), wherein cytarabine liposomes can be used to treat meningeal lymphoma.
  • Liposomes can improve the solubility of poorly water-soluble anticancer drugs through the phospholipid membrane structure, achieve passive targeting of tumors by PEG modification, and achieve active targeting of tumors by binding vectors.
  • liposomes can be rapidly captured by macrophages, their residence time in the body is only a few hours after administration.
  • a glycolipid or a hydrophilic polymer such as PEG can be applied to the liposome.
  • the biocompatible polymer PEG is bound to the liposome to provide a protective hydrophilic surface known as "secondary liposome” or "invisible liposome".
  • PEG forms a steric effect on the surface of liposomes, which blocks the adsorption of opsonin and plasma proteins, and reduces the binding of macrophage receptors to phosphate groups on phospholipid membranes, thereby delaying their retention time in the blood circulation.
  • the pharmacokinetic properties of the liposomes can be altered by chemically modifying phospholipid groups or binding proteins, polypeptides or other macromolecules on the surface of the liposome.
  • PEG liposome binding vectors such as small molecules, peptides or monoclonal antibodies have been widely used in tumor therapy, such as daunorubicin and doxorubicin liposomes that bind folic acid (p an XQ, Lee RJ. Anticancer Res. 2005, 25(1 ⁇ ): 343-6; Shmeeda H, et al. Mol Cancer Ther. 2006, 5(4): 818-24) Layered viscous liposome (Zalipsky S, et al. Bioconjug Chem. 1995, 6(6): 705-8) or a liposome that binds to the OV-TL3 monoclonal antibody (Vingerhoeds MH, et al. Br J Cancer. 1996, 74(7): 1023-9).
  • a first object of the present invention is to provide a scorpion venom liposome, thereby further enhancing scorpion venom The efficacy of the preparation, promote the application of scorpion venom in cancer prevention and treatment.
  • the present invention uses the following technical solutions:
  • a scorpion venom liposome composed of a liposome bilayer and scorpion venom
  • the scorpion venom liposome bilayer of the present invention preferably comprises both a phospholipid, a sterol and a PEG modification.
  • the phospholipid content is 20 to 80%, preferably 40 to 60%, based on the total weight of the liposome bilayer.
  • Optional phospholipids are lecithin, phosphatidylcholine (PC), phosphatidylethanolamine (PE), phosphatidylglycerol (PG), phosphatidylinositol, phosphatidylserine, sphingomyelin (SM), dipalmitoylphosphatidyl Choline (DPPC), dipalmitoylphosphatidylethanolamine (DPPE), distearoylphosphatidylcholine (DSPC) or a mixture of one or more of the foregoing.
  • PC phosphatidylcholine
  • PE phosphatidylethanolamine
  • PG phosphatidylglycerol
  • phosphatidylinositol phosphatidylserine
  • SM sphingomyelin
  • DPPC dipalmitoylphosphatidyl Choline
  • DPPE dipalmitoylphosphatidylethanolamine
  • the sterol content of the present invention is 10 to 30%, preferably 15 to 20%, based on the total weight of the liposome bilayer.
  • the preferred sterols are cholesterol, epicholinol, ergosterol or stigmasterol, preferably the sterol used is cholesterol.
  • the PEG modification of the present invention is 2 to 50%, preferably 20-40%, based on the total weight of the liposome bilayer.
  • the optional PEG modification is PEG-PE, methoxypolyethylene glycol (mPEG).
  • mPEG methoxypolyethylene glycol
  • a PE a PEG modification of cholesterol
  • DSPE distearoylphosphatidylethanolamine
  • the weight ratio of the scorpion venom liposome lipid bilayer and scorpion venom of the present invention is (5-20): 1 , preferably (8 ⁇ 12): 1.
  • a second object of the present invention is to provide a process for the preparation of the above-mentioned scorpion venom liposome.
  • the scorpion venom liposome of the present invention can be prepared by a conventional method, but in view of the influence of the preparation process on the preparation itself, the present invention preferably uses a film method, an injection method, a film method, a freeze-thaw method, and an injection method. Prepared by any method in the freeze-thaw method.
  • the preparation of the thin film method of the present invention comprises the steps of: dissolving scorpion venom and liposome bilayer material (ie, phospholipid, sterol and PEG modifier) separately or simultaneously in a non-polar or weakly polar solvent, mixing Uniformly, remove the organic solvent under reduced pressure with a rotary evaporator to form a uniform film on the wall of the bottle, and then hydrate the film by adding distilled water or a buffer solution, followed by homogenization, stirring, vortexing and/or ultrasonication to obtain scorpion venom. Platinum.
  • the homogenization, agitation, vortexing and ultrasound can be carried out simultaneously, or only some of the operations can be selected.
  • the rotary evaporation temperature is 20 to 60 °C.
  • the hydration time is 15 to 240 min, and the hydration temperature is 20 to 65 °C.
  • the ultrasonic time is 5 to 60 min; preferably, the rotary evaporation temperature is 30 to 40 °C.
  • the hydration time is 60-90 min and the hydration temperature is 35-50 °C.
  • the ultrasonic time is 20-40 min.
  • the mass to volume ratio of the scorpion venom and the organic solvent in the present invention is 0.1 to 1 mg/ml, and the non-polar or weakly polar solvent is methanol, ethanol, chloroform, ethyl acetate, n-hexane, acetonitrile or the above. One or more mixtures. It is preferably chloroform and/or methanol.
  • the pH of the buffer solution is 6.4-7.4.
  • the injection method of the present invention comprises the steps of: dissolving the liposome bilayer material (phospholipid, sterol and PEG modification) and scorpion venom in an organic solvent, dissolving it completely, and injecting it into distilled water or buffering with a syringe.
  • the solution is stirred at 20 to 60 ° C for 0.5 to 4 hours to remove the organic solvent to obtain the scorpion venom lipid.
  • the solvent mainly includes an ethanol injection method and an ether injection method.
  • the ethanol injection method comprises the steps of: dissolving the liposome bilayer material (phospholipid, sterol and PEG modification) and scorpion venom in ethanol, dissolving it completely, injecting it into distilled water or buffer solution with a syringe, stirring After the ethanol is removed, optional homogenization, stirring, vortexing or sonication may be performed to obtain a lipid ether injection method comprising the steps of: dissolving the liposome bilayer material (phospholipid, sterol and PEG modification) and scorpion venom In a mixture of diethyl ether or diethyl ether and methanol, after completely dissolving, a distilled water or a buffer solution is injected with a syringe, and the diethyl ether is removed by stirring, and further homogenization, stirring, vortexing or ultrasonication may be selected to obtain a liposome.
  • the upper buffer solution is physiological saline, phosphate buffered saline (PBS), trisaminomethane hydrochloride (Tris-HCl) solution, 4-hydroxyethylpiperazineethanesulfonic acid (HEPES) solution or mannitol solution.
  • PBS phosphate buffered saline
  • Tris-HCl trisaminomethane hydrochloride
  • HEPES 4-hydroxyethylpiperazineethanesulfonic acid
  • the present invention can also prepare a scorpion venom liposome by a membrane method plus freeze-thaw method and an injection method plus freeze-thaw method.
  • the film method plus freeze-thaw method and the injection method plus freeze-thaw method according to the present invention comprise the following steps:
  • the liposomes prepared by the thin film method or the injection method are frozen in a refrigerator or liquid nitrogen at 0 ⁇ -80 ° C for 2 to 24 h, dissolved at room temperature, and then placed in a refrigerator or liquid at 0 ⁇ -80 ° C Freeze in nitrogen, dissolve at room temperature, repeat 2 to 8 times, and obtain the freeze-thawed scorpion venom liposome.
  • the liposome prepared by the thin film method or the injection method is frozen in a refrigerator or liquid nitrogen at -20 to 40 ° C for 5-10 h, dissolved at room temperature, and then placed in -20 ⁇ - Freeze in a refrigerator or liquid nitrogen at 40 °C, dissolve at room temperature, and repeat 4-6 times.
  • the aqueous phase may be distilled water or a buffer solution such as physiological saline, PBS, Tris-HCl solution, HEPES solution or mannitol solution.
  • the pH of the buffer is between 5.0 and 9.5.
  • the particle size distribution can be controlled by extrusion through the membrane.
  • Liposomes of corresponding particle sizes can be obtained by 5 ⁇ , ⁇ , 100 nm, 200 nm or other membranes of the desired pore size. Specific operations are within the skill of the art.
  • a third object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition comprising the above-mentioned scorpion venom liposome.
  • the scorpion venom liposome of the present invention can prepare a cancer therapeutic drug.
  • a cancer therapeutic drug for example, tablets, capsules, granules, pills, syrups, aqueous solutions or suspensions are prepared for oral administration.
  • the tablet of the present invention comprises a liposome, a diluent, a binder, and a lubricant.
  • the binder is selected from one or more of the group consisting of dextrin, PVP glue, and gelatin.
  • the diluent is selected from one or more of microcrystalline cellulose, starch, and lactose.
  • the lubricant is selected from one of talc and magnesium stearate.
  • the weight ratio of each raw material is preferably: scorpion venom liposome: starch: lactose: dextrin: magnesium stearate is 0.1 to 10: 0.5 to 50: 0.4-40: 0.1-20: 0.1- 2, wherein the weight of the scorpion venom liposome is calculated based on the scorpion venom material.
  • the tablet of the present invention can be obtained by the preparation method of the prior art, but more desirably, it is prepared by the following method:
  • the liposome is dissolved in an appropriate amount of water, freeze-dried, and then added with starch, lactose , evenly mixed, add soft material of dextrin aqueous solution, sieve and granulate, dry at 50 ° C, add granules to add magnesium stearate, mix evenly, and compress.
  • the "appropriate amount” herein will be understood by those skilled in the art, and the present invention is preferably used in g/ml, preferably in an amount of from 2 to 10 times by volume of water.
  • the scorpion venom liposome is prepared by using 5 g of scorpion venom as a raw material, and it is dissolved in 50 ml of water during the preparation.
  • specific freeze-drying, tableting, and the like are known to those skilled in the art, and the present invention is not particularly limited thereto.
  • the composition may further be a lyophilized powder injection composed of a scorpion venom liposome, a dispersing agent, and a lyophilized adjuvant.
  • the dispersing agent is selected from one of borosam, Tween-80, and Span-65, preferably poloxamer.
  • the lyophilized adjuvant is selected from one or more of mannitol, lactose for injection, glucose for injection, dextran, and sucrose, preferably sucrose.
  • the weight ratio of each raw material is preferably: scorpion venom liposome: poloxamer: sucrose is 0.1 ⁇ 20: 0.4 ⁇ 40: 0.1 ⁇ 40, wherein scorpion venom
  • the weight of the plastid is based on the scorpion venom material.
  • the above lyophilized powder injection may be preferably, but not limited to, prepared by the following method: taking the scorpion venom liposome, dissolving in an appropriate amount of water, adding a dispersing agent and a lyophilized auxiliary material, and dissolving completely, using a microporous membrane Filtration, dispensing, nitrogen filling, potting is available.
  • the dispersing agent and lyophilized adjuvant are preferably poloxamer, sucrose.
  • physiological saline can be used as a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • Other solvents include distilled water, buffer, 0.3% glycine solution, and the like.
  • the preparation can be sterilized by sterilizing by a conventional method such as ultraviolet irradiation or film transfer, and lyophilized.
  • a pharmaceutically acceptable pH adjuster and a pressure regulator such as sodium chloride, sodium acetate or potassium salt.
  • a phospholipidation inhibitor including a vitamin or a derivative thereof, a butylhydroxytoluene (BHT), a chroman, a ferrioxamine or the like, in a mixture of one or more of the above, in reference to the patents US5605703 and EP1325739.
  • BHT butylhydroxytoluene
  • polysaccharide polymers may also be added including chitosan, starch, dextran, pullulan, pectin or a mixture of one or more of the foregoing.
  • the present invention further claims the use of the above-mentioned scorpion venom liposome in the preparation of a medicament for treating cancer.
  • Quercetin is an effective anticancer drug, but its toxicity is limited to the application.
  • the inventors first discovered that scorpion venom liposomes can enhance anticancer effects while reducing toxicity. Intravenous injection, intraperitoneal injection, intramuscular injection, subcutaneous injection or oral administration to mammals, the anti-cancer effect of scorpion venom liposome is higher than that of scorpion venom monomer, and the side effects are reduced.
  • the scorpion venom liposome of the present invention can be used for treating cancer such as liver cancer, lung cancer, ovarian cancer, prostate cancer, colon cancer, pancreatic cancer, gastric cancer or leukemia.
  • the dose of the drug should be administered according to the diagnosis of the disease and the judgment of the clinician.
  • the present invention provides a scorpion venom liposome, a preparation method, a composition and use thereof.
  • the scorpion venom liposome has good stability and can significantly improve its curative effect in cancer prevention compared with scorpion toxic monomer or other preparations.
  • the preparation method of the invention is simple, the production cost is low, and the utility model is favorable for popularization and application. detailed description
  • the prepared liposome was dialyzed in 1 L of water for 24 hours, and a small amount of liposome was added with methanol to break the emulsion, and the encapsulation efficiency was measured by HPLC.
  • the entrapment efficiency of the scorpion venom liposome was 58.7%. (Encapsulation rate is the ratio of the amount of drug encapsulated in the phospholipid to the total amount of the drug added)
  • Example 2 Compared with Example 1, the only difference is that in this example, physiological saline was used instead of PBS, and the entrapment efficiency of the scorpion liposome was 57.3%.
  • Example 2 Compared with Example 1, the only difference is that in this example, 6% mannitol aqueous solution was used instead of PBS, and the entrapment efficiency of the scorpion venom liposome was 38.4%.
  • the difference is only that the volume of the PBS (5 mM, pH 6.4-7.4) added in this example is 40 ml, and the hydration at 60 ° C for 3 h, the encapsulation efficiency of the scorpion venom liposome is 49.3%. .
  • Example 5 Thin film method 4 mg of scorpion venom, 5 mg of cholesterol, 40 mg of soybean phospholipid and 5 mg of mPEG-PE were dissolved in 10 ml of chloroform:methanol (2:1), and the solution was evaporated to remove residual organic solvent under reduced pressure, and 1 ml of PBS (5 mM, pH 6.4 ⁇ ) was added. 7.4), vigorous vortex, ultrasonic in the ice bath for 20min. The entrapment efficiency of the scorpion venom liposome was 52.5%.
  • Example 5 Compared with Example 5, the difference is only that the amount of soybean phospholipid in the present embodiment is 10 mg, and the entrapment efficiency of the scorpion venom liposome is 38.64%.
  • Example 5 Compared with Example 5, the only difference is that the phospholipid of this example is egg yolk lecithin, and the entrapment efficiency of the scorpion venom liposome is 51.45%.
  • Example 5 Compared with Example 5, the only difference is that in this example, the PEG modification (CHEMS-PEG) of cholesterol succinic acid monoester salt was used instead of mPEG-PE, and the entrapment efficiency of the scorpion venom liposome was 54.08%.
  • PEG modification CHEMS-PEG
  • mPEG-PE cholesterol succinic acid monoester salt
  • Example 5 Compared with Example 5, the only difference is that the weight ratio of the liposome bilayer and scorpion venom in the present embodiment is 8:1, specifically 6.25 mg of scorpion venom, 5 mg of cholesterol, 40 mg of soybean phospholipid and 5 mg of mPEG. -PE, the entrapment efficiency of the scorpion venom liposome was 65.47%.
  • Example 5 Compared with Example 5, the only difference is that the weight ratio of the liposome bilayer and scorpion venom in the present embodiment is 12:1, specifically 4.17 mg of scorpion venom, 5 mg of cholesterol, 40 mg of soybean phospholipid and 5 mg of mPEG. -PE, the entrapment efficiency of the scorpion venom liposome was 53.86%.
  • Example 5 Compared with Example 5, the only difference is that the weight ratio of the liposome bilayer and scorpion venom in the present embodiment is 5:1, specifically 10 mg scorpion venom, 5 mg cholesterol, 40 mg soybean phospholipid and 5 mg mPEG- PE, the entrapment efficiency of the scorpion venom liposome was 34.39%.
  • Example 5 Compared with Example 5, the only difference is that the weight ratio of the liposome bilayer and scorpion venom in the present embodiment is 20:1, specifically 2.5 mg scorpion venom, 5 mg cholesterol, 40 mg soybean phospholipid and 5 mg. mPEG-PE, the entrapment efficiency of the scorpion venom liposome was 30.54%.
  • the liposome prescription in this example is: scorpion venom 4 mg, stigmasterol 6 mg, lecithin 30 mg, mPEG-PE 5 mg.
  • the entrapment efficiency of the scorpion venom liposome was 45.2%.
  • Example 19 Compared with Example 18, the only difference is that in the present embodiment, the amount of each raw material is: ⁇ liposome: poloxamer: sucrose is 1:4:50.
  • Example 18 Compared with Example 18, the only difference is that in the present embodiment, the amount of each raw material is: ⁇ Liposomes: poloxamer: sucrose is 2:4:4.
  • Example 18 Compared with Example 18, the only difference is that in the present embodiment, the amount of each raw material is: scorpion venom liposome: Span-65: mannitol is 1:2:40.
  • Example 18 Compared with Example 18, the only difference is that in the present embodiment, the amount of each raw material is: scorpion venom liposome: Tween-80: mannitol is 2:3:4.
  • Example 24 Compared with Example 24, the only difference is that the prescription of this example is: ⁇ liposome: starch: lactose: dextrin: magnesium stearate is 0.5: 20: 0.4: 6: 2.
  • Example 26 Compared with Example 24, the only difference is that the formulation of this example is: scorpion venom liposome: starch: lactose: dextrin: magnesium stearate is 10: 50: 40: 20: 2.
  • Example 24 Compared with Example 24, the only difference is that the prescription of this example is: ⁇ liposome: starch: lactose: dextrin: magnesium stearate is 5: 12: 20: 10: 1.
  • Example 24 Compared with Example 24, the only difference is that the prescription of this example is: ⁇ liposome: starch: lactose: gelatin slurry: magnesium stearate is 5: 30: 10: 10: 0.5.
  • Example 24 Compared with Example 24, the only difference is that the prescription of this example is: ⁇ liposome: starch: microcrystalline cellulose: PVP glue: talc powder is 5: 33: 5: 6: 1.5.
  • Test Example 1 Antimicrobial stability test of scorpion venom
  • the scorpion venom liposome obtained in Example 1 was placed at 4 ° C and 37 ° C, and after various times, each index was measured. The changes in various indicators are shown in Table 1. It can be seen from the results that the liposome of scorpion venom was placed at 4 ° C and 37 ° C for 24 h, respectively, and the stability was good; 75% humidity, stored at 37 ° C for 3 months, no significant change in particle size and surface potential, The sealing rate is slightly reduced and the overall stability is good.
  • Test Example 2 Inhibition of tumor cell growth by scorpion venom and scorpion venom liposome
  • Human cervical cancer HeLa, lung cancer A549, gastric cancer SGC7901, liver cancer HepG2, myeloid leukemia HL-60 and colon cancer SW1116 cells were placed in DMEM or RPMI 1640 medium (containing 10% inactivated fetal bovine serum, 100 U.mr 1 penicillin) And 100 mg.r 1 streptomycin), cultured in a 37 ° C, 5 % CO 2 incubator. Cells in logarithmic growth phase were seeded in 96-well plates at a density of 3 ⁇ 10 3 /well, 100 ⁇ M per well, and cultured for 24 h at 37 ° C, 5 % C0 2 saturated humidity. The test was set up with a negative control group (culture medium) and a different concentration administration group.
  • the IC 50 drug concentration at 50% inhibition of cell proliferation values were calculated mathematically. Data are expressed as Y ⁇ SEM, and statistical analysis was performed using t test or analysis of variance. PO.05 indicates a significant difference between the two groups.
  • Test Example 3 Evaluation of acute toxicity of scorpion venom and scorpion venom liposomes
  • mice Male Balb / c mice (20-25 g) were purchased from the Experimental Animal Center of the Fourth Military Medical University. It is first dissolved in absolute ethanol and diluted to 0.2 mg/ml with normal saline (final concentration of ethanol is less than 1%). The scorpion venom liposome (prepared according to the method of Example 1) was directly dissolved in physiological saline to obtain a solution of 0.2 mg/ml.
  • Test Example 4 Comparison of in vivo therapeutic effects of scorpion venom, Huachansu injection and scorpion venom liposome on liver cancer
  • Human hepatoma HepG2 cells were cultured in DMEM medium (containing 10% inactivated fetal bovine serum, 100 U-ml " 1 penicillin and 100 mg 1 streptomycin) in a 37 ° C, 5 % CO 2 incubator.
  • Male BALB/c nude mice (6 weeks old) were housed under the condition of no specific pathogens.
  • the scorpion venom liposome was prepared according to the method of Example 1. The cells in the logarithmic growth phase were made into cell suspensions with PBS. The right back of the rat was inoculated with 0.2 ml (2 ⁇ 10 7 ).
  • mice When the tumor grew to 100 mm 3 (about 1 week), the mice were randomly divided into 4 groups, 8 rats in each group, and 0.9% normal saline was injected intraperitoneally every day (control) Group), the same dose of scorpion venom or scorpion venom liposome (Example 1, 1 mg / kg, the dose is the amount of scorpion venom in liposome, the actual amount of liposome needs to be encapsulated Rate conversion), Huachansu injection (lml/kg, which is the clinically used dose converted to the dose of mice). From the beginning of the injection of drugs, observe the diet, activity and body weight of the mice every 2 days.
  • V ( mm 3 ) (long diameter X short diameter 2 ) /2
  • V ( mm 3 ) (long diameter X short diameter 2 ) /2
  • scorpion venom liposome has stronger anti-tumor effect than the scorpion venom monomer and the Huachansu injection.
  • monitoring of mouse body weight and toxicity of lung, liver and kidney showed that this dose of scorpion venom liposome had no significant toxicity.
  • Test Example 5 Comparison of the therapeutic effects of scorpion venom, cinobufine injection and scorpion venom liposome on L1210 leukemia tumor-bearing mice
  • the murine L1210 leukemia cell line was passaged in the peritoneal cavity of ICR mice.
  • the scorpion venom liposome was prepared as in Example 1.
  • the mice were inoculated intraperitoneally with lxlO 5 L1210 leukemia cell suspensions under sterile conditions, and randomly divided into 4 groups, 10 in each group. After 24 h, each group was intraperitoneally injected with 0.9% normal saline (control group), the same dose of scorpion venom or scorpion venom liposome (1 mg/kg, the dosage is liposome).
  • Life extension rate (%) (average survival time of the administration group / mean survival time of the control group - 1 ) xl00. Data were expressed as Y SEM, and statistical analysis was performed using t test or analysis of variance. PO.05 indicates a significant difference between the two groups.
  • the results are shown in Table 6.
  • the average survival time of the model group animals was only 16.7 ⁇ 1.9 days.
  • the survival time of Huaqisu injection, scorpion venom and scorpion venom liposome group was significantly prolonged, which were 40.7, 36.5 and 58.1%, respectively; the average survival time was 23.5 ⁇ 3.8, 22.8 ⁇ 3.1 and 26.4 ⁇ 3.6 days respectively. . ⁇
  • the plastids have a stronger life-prolonging effect on L1210 leukemia-bearing mice than scorpion venom and Huachansu injection.
  • the present invention provides a scorpion venom liposome comprising a liposome bilayer and scorpion venom comprising phospholipids, sterols and PEG modifications.
  • the liposome of the present invention can be used for the treatment of tumors, particularly liver cancer, lung cancer, ovarian cancer, prostate cancer, colon cancer, pancreatic cancer, gastric cancer or leukemia.
  • the preparation process provided by the invention is simple, and the prepared scorpion venom liposome can increase the anti-tumor effect and reduce the toxic and side effects, and has good industrial applicability as compared with the scorpion venom monomer.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明提供了一种蟾毒灵脂质体，由脂质体双分子层和蟾毒灵组成，所述脂质体双分子层中包含磷脂、甾醇和PEG修饰物。本发明所述的脂质体可用于肿瘤的治疗，尤其是肝癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、胰腺癌、胃癌或白血病的治疗。本发明提供的制备工艺简单，所制得蟾毒灵脂质体与蟾毒灵单体相比，可增加抗肿瘤作用，同时减小毒副作用，具有广泛的应用前景。

Description

一种蟾毒灵脂质体及其制备方法和应用 技术领域
本发明属于医药技术领域， 涉及一种蟾毒灵脂质体及其制备方法和应用。 背景技术
癌症是全球发病率最高的疾病之一。 WHO数据显示， 仅 2008年癌症病 死人数就高达 7.6亿， 其中 60%来自低收入或中等收入国家， 且该数字在未 来将继续增加。 在超过 200种癌症中， 乳腺癌、 肺癌、 肠癌及胰腺癌患者数 占所有新增病例的 54%。 目前， 癌症的治疗方法根据癌症的类型及阶段， 主 要包括手术、 放疗、 化疗及以上方法联合运用等。 其中， 临床化疗药物种类 较多， 作用机制主要为针对肿瘤细胞快速分裂的特性杀死细胞。 因此药物在 杀死快速分裂的癌细胞时， 也能杀死其它正常的快速分裂的细胞， 如骨髓、 消化道及毛囊中的细胞， 产生了严重的副作用， 损伤了正常组织。 据此， 亟 需研发毒副作用小、 抗肿瘤疗效高的新型治疗药物。 提高药物对肿瘤的选择 性， 减少其在正常组织的分布是抗肿瘤新药研发的主要策略。
蟾毒灵（3β,14-二羟 -5β,20(22)-蟾蜍二烯羟基内酯， 5β,20(22)-蟾蜍二烯羟 基内酯 -3β, 14-二醇）是中药蟾酥的主要抗肿瘤成分， 是中华大蟾蜍或黑框蟾 蜍的耳后腺分泌的白色浆液，可从蟾酥中提取。还可根据专利 US 3134772 和 US 3687944进行人工合成。 蟾毒灵是一种类地高辛的免疫活性成分， 显示出 各种生物活性， 如强心、 麻醉和刺激血管等。 自 1994年蟾毒灵抗肿瘤作用发 现至今 ( Numazawa S, et al. J Cell Physiol, 1994,160(1): 113-20 ) , 已进行了大 量研究， 发现其具有广谱抗肿瘤作用。 此外， 蟾毒灵与其他化疗药物联用， 如索拉菲尼等， 对肿瘤细胞显示出化疗增敏作用 （ Gao Y, et al. Mol Biol Rep. 2012, 39(2): 1683-9 ) 。 近年来， 更多的研究发现蟾毒灵可诱导细胞凋亡从而 抑制多种癌细胞的增殖， 如肝癌、 骨瘤、 结肠癌、 肺癌、 胰腺癌、 卵巢癌、 胃癌、 前列腺癌及白血病细胞等 （Han KQ, et al. World J Gastroenterol. 2007,13(24):3374-9; Amano Y, et al. J Steroid Biochem Mol Biol. 2009,114(3-5): 144-51; Li D, et al. Anticancer Drugs. 2009,20(l):59-64; Yu CH, et al. Cancer Sci. 2008,99(12):2467-76; Takai N, et al. Int J Mol Med. 2008,21(5):637-43; Yeh JY, et al. Prostate. 2003,54(2): 112-24; Yin JQ, et al. Acta Pharmacol Sin. 2007,28(5):712-20; Zhu Z et al. Int. J. Mol. Sci. Int J Mol Sci. 2012, 13(2) :2025-35; Xie CM, et al. Free Radic Biol Med. 2011,51(7): 1365-75 ) 。 蟾毒灵可通过激活细胞死亡受体及线粒体通路触发癌细胞凋亡 （Sun L, et al. Evid Based Complement Alternat Med. Epub 2011 Jim 18 )。 这些研究提示蟾毒 灵可作为化疗药物用于癌症的治疗。 然而， 蟾毒灵由于毒性大、 水溶性差、 半衰期短、 治疗窗窄， 毒性剂量与治疗剂量接近等问题， 严重制约了其临床 应用 ( Gong LL et al. Food and Drug. 2007,9(10):51-3 ) 。 此外， 由于其在体内 的广泛分布， 更引起了其它临床副作用， 如血管刺激性、 过敏性休克、 高热、 窦性心动过缓等 ( Dasgupta A, et al. Life Sci. 1998,63(9):781-8; Bick RJ, et al. Life Sci. 2002,72(6) :699-709; Kostakis C, Byard RW. Forensic Sci Int. 2009,188:el-e5 ) 。
目前， 将蟾酥溶于生理盐水制得的华蟾素注射液已在中国用于临床癌症 的治疗。已有报道吉西他滨 奥沙利铂与华蟾素合用可增强晚期胆囊癌病人的 化疗作用 ( Qin TJ, et al. World J Gastroenterol. 2008,14(33):5210-6 ) 。 另有研 究显示， 对肝癌及胰腺癌病人使用 8倍于标准剂量 （20 ml/m2/或 20〜25 ml/ 人 /天，含蟾毒灵 14.3±0.03 ng/ml )的华蟾素注射液未产生明显毒性（Meng Z. et al. Cancer. 2009,115(22):5309-18 ) , 这意味着成年病人每天耐受的蟾毒灵有 效治疗剂量可高达 2.3 μ§。 但是， 华蟾素注射液是蟾酥中生物碱的混合物溶 液， 并且因为蟾毒灵水溶性较差， 含有的蟾毒灵含量很低。
因此， 研发延长蟾毒灵在肿瘤病灶内持续时间、 提高肿瘤靶向性、 减少 毒副作用的新剂型十分必要。脂质体是一种内水相的封闭的磷脂双分子结构， 我们使用脂质体作为蟾毒灵的药物载体， 可通过磷脂膜装载蟾毒灵解决其水 溶性差的问题。此外，用 PEG修饰的脂质体可将蟾毒灵被动靶向至肿瘤部位， 减小其毒副作用。
近 20年来， 脂质体已经被广泛用于包载抗肿瘤药物。 已有多种用于临床 或即将用于临床的抗肿瘤脂质体药物， 如阿霉素脂质体（ Doxil/Caelyx 分别 由 Alza/Johnson and Johnson在美国或 Schering-Plough在其他国家销售）、 柔 红霉素脂质体（DaunoXome, Gilead ) 、 阿糖胞苷脂质体（ DepoCyte, Skye Pharma/Enzon/Mundipharma出品 )、顺钼脂质体 ( Lipoplatin, Regulon出品 ) , 其中阿糖胞苷脂质体可用于治疗脑膜淋巴瘤。 脂质体可通过磷脂膜结构提高 水溶性差的抗癌药物的溶解度， 通过 PEG修饰实现肿瘤的被动靶向及通过结 合载体实现肿瘤的主动靶向。
传统的脂质体， 是通过磷脂分散在水相中形成的， 因此两亲性及脂溶性 药物可插入脂质体的磷脂膜结构中， 而亲水性药物则是直接包入脂质体的内 部水相。 脂质体载体对所包含药物的药代动力学、 组织分布及毒副作用都产 生较大的影响。 如， 临床实验证明在保持抗肿瘤活性的同时使用阿霉素脂质 体比阿霉素单体的毒性作用明显减小 （ Safra T. Oncologist. 2003,8 Suppl 2: 17-24 ) 。
但由于脂质体可被巨噬细胞快速捕获， 给药后其在体内的停留时间只有 几小时。 为了提高脂质体在体内循环的半衰期， 可将糖脂或亲水性聚合物如 PEG应用于脂质体。 将生物相容性的聚合物 PEG结合在脂质体上， 使其具有 保护性的亲水的表面， 被称为 "二代脂质体 "或"隐形脂质体"。 PEG在脂质体 表面形成了位阻效应， 可阻碍调理素及血浆蛋白的吸附， 减少巨噬细胞受体 与磷脂膜上磷酸基团的结合， 从而延迟其在血液循环中的保留时间。
此外， 通过化学修饰磷脂基团或者结合蛋白、 多肽或其他大分子在脂质 体表面， 可改变脂质体的药代动力学属性。 PEG脂质体结合载体如小分子、 肽类或单克隆抗体已广泛的用于肿瘤治疗， 如结合叶酸的柔红霉素和阿霉素 脂质体（ pan XQ, Lee RJ. Anticancer Res. 2005,25(1Α):343-6; Shmeeda H, et al. Mol Cancer Ther. 2006,5(4):818-24 ) 层粘性蛋白脂质体 ( Zalipsky S, et al. Bioconjug Chem. 1995,6(6):705-8 ) 或结合了 OV-TL3 单克隆抗体的脂质体 ( Vingerhoeds MH, et al. Br J Cancer. 1996,74(7): 1023-9 ) 。
目前尚未见任何关于蟾毒灵脂质体的报道。 有鉴于此， 特提出本发明。 发明内容
本发明的第一目的在于提供一种蟾毒灵脂质体， 从而进一步提高蟾毒灵 制剂的疗效， 推广蟾毒灵在肿瘤防治中的应用。
为实现第一目的， 本发明釆用如下技术方案：
一种蟾毒灵脂质体， 由脂质体双分子层和蟾毒灵组成， 所述脂质体双分
Figure imgf000005_0001
本发明的蟾毒灵脂质体双分子层优选同时包含磷脂、甾醇和 PEG修饰物。 其中磷脂的含量占脂质体双分子层总重量的 20〜80 %, 优选 40-60%。 可选用 的磷脂为卵磷脂、磷脂酰胆碱（ PC )、磷脂酰乙醇胺（ PE )、磷脂酰甘油（ PG )、 磷脂酰肌醇、 磷脂酰丝氨酸、 鞘磷脂 （SM ) 、 二棕榈酰磷脂酰胆碱 (DPPC)、 二棕榈酰磷脂酰乙醇胺 (DPPE)、 二硬脂酰磷脂酰胆碱 (DSPC) 或上述一种或 多种的混合物。
本发明所述甾醇的含量占脂质体双分子层总重量的 10〜30% , 优选 15-20%。 可选用的甾醇为胆固醇、 表胆甾醇、 麦角固醇或豆甾醇， 优选所用 的甾醇为胆固醇。
本发明所述 PEG修饰物的含量占脂质体双分子层总重量的 2〜50%,优选 20-40%, 可选用的 PEG修饰物为 PEG-PE、 甲氧基聚乙二醇（ mPEG)-PE、 胆 固醇的 PEG修饰物、 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 (DSPE)-PEG或上述一种或多种 的混合物。
本发明的蟾毒灵脂质体脂质双分子层和蟾毒灵的重量比为（5 ~ 20 ) ： 1 , 优选 ( 8〜12 ) ： 1。
本发明的第二目的在于提供上述蟾毒灵脂质体的制备方法。
本发明的蟾毒灵脂质体可釆用常规方法来制备得到， 但考虑到制备工艺 对制剂本身的影响， 本发明优选釆用薄膜法、 注入法、 薄膜法加冻融法、 注 入法加冻融法中任一种方法制备。
本发明所述薄膜法制备包括下述步骤： 将蟾毒灵和脂质体双分子层材料 (即磷脂、 甾醇和 PEG修饰物）分别或同时溶解于非极性或弱极性溶剂中， 混合均匀， 用旋转蒸发仪减压除去有机溶剂以在瓶壁形成均匀薄膜， 再加入 蒸馏水或缓冲溶液对薄膜进行水化， 后经匀质、 搅拌、 涡旋和 /或超声， 得到 蟾毒灵脂质体。 其中匀质、 搅拌、 涡旋和超声即可同时进行， 也可仅选择其中的部分操 作。上述操作中，所述的旋转蒸发温度为 20〜60 °C。所述的水化时间为 15〜240 min, 水化温度为 20〜65 °C。 所述的超声时间为 5〜60min; 优选所述的旋转蒸 发温度为 30 -40°C。 所述的水化时间为 60-90 min, 水化温度为 35-50 °C。 所 述的超声时间为 20-40min。
本发明所述的蟾毒灵与有机溶剂的质量体积比为 0.1〜lmg/ml, 所述的非 极性或弱极性溶剂为甲醇、 乙醇、 氯仿、 乙酸乙酯、 正己烷、 乙腈或上述一 种或多种混合液。 优选为氯仿和 /或甲醇。 所述缓冲溶液的 pH值为 6.4-7.4。
本发明所述注入法包括下述步骤： 将脂质体双分子层材料（磷脂、 甾醇 和 PEG修饰物）和蟾毒灵溶于有机溶剂中， 溶解完全后用注射器将其注入至 蒸馏水或缓冲溶液， 20〜60 °C搅拌 0.5〜4h将有机溶剂除尽， 得到蟾毒灵脂质 其中， 将有机溶剂除尽后也可以进一步匀质、搅拌、 涡旋和 /或超声处理, 以提高包封率。
具体地， 依据溶剂的种类又主要包括乙醇注入法和乙醚注入法。
乙醇注入法包括下述步骤： 将脂质体双分子层材料（磷脂、 甾醇和 PEG 修饰物） 和蟾毒灵溶于乙醇中， 溶解完全后用注射器将其注入至蒸馏水或缓 冲溶液， 搅拌将乙醇除尽， 可选进一步匀质、 搅拌、 涡旋或超声， 得到脂质 乙醚注入法包括下述步骤： 将脂质体双分子层材料（磷脂、 甾醇和 PEG 修饰物） 和蟾毒灵溶于乙醚或乙醚、 甲醇混合物中， 溶解完全后用注射器注 入蒸馏水或缓冲溶液， 搅拌将乙醚除尽， 可选进一步匀质、 搅拌、 涡旋或超 声， 得到脂质体。
上缓冲溶液为生理盐水、 磷酸盐缓冲液 （PBS ) 、 三氨基甲烷盐酸盐 ( Tris-HCl ) 溶液、 4-羟乙基哌嗪乙磺酸 (HEPES)溶液或甘露醇溶液。
为了进一步增加包封率， 本发明还可以釆用薄膜法加冻融法和注入法加 冻融法来制备蟾毒灵脂质体。
本发明所述的薄膜法加冻融法和注入法加冻融法包括下述步骤： 将以所 述薄膜法或注入法制备得到的蟾毒灵脂质体， 在 0 ~ -80°C冰箱或液氮中冷冻 2〜24 h, 置室温溶解， 再放入 0 ~ -80°C冰箱或液氮中冷冻， 置室温溶解， 重 复 2 ~ 8次， 得到冻融后的蟾毒灵脂质体。 优选将以所述薄膜法或注入法制备 得到的蟾毒灵脂质体， 在 -20〜- 40°C冰箱或液氮中冷冻 5-10 h, 置室温溶解， 再放入 -20〜- 40 °C冰箱或液氮中冷冻， 置室温溶解， 重复 4-6次。
上述方法中， 水相可以是蒸馏水或缓冲液溶液， 如生理盐水、 PBS、 Tris-HCl溶液、 HEPES溶液或甘露醇溶液等。 缓冲液 pH 为 5.0-9.5之间。
本发明所述脂质体制备完后可通过挤压过膜控制其粒径分布。 可通过 5μιη、 Ιμιη, lOO nm, 200 nm或其它所需孔径的膜得到相应粒径的脂质体。 具 体的操作为本领域技术人员所掌握。
本发明的第三目的在于提供含有上述蟾毒灵脂质体的药物组合物。
本发明的蟾毒灵脂质体可制备癌症治疗药物。 如， 制成片剂、 胶囊剂、 颗粒剂、 丸剂、 糖浆剂、 水剂或混悬剂用于口服给药。
本发明所述的片剂由蟾毒灵脂质体、 稀释剂、 粘合剂、 润滑剂组成。 所 述粘合剂选自糊精、 PVP胶浆、 明胶浆中的一种或多种。 所述稀释剂选自微 晶纤维素、 淀粉、 乳糖中的一种或多种。 所述润滑剂选自滑石粉、 硬脂酸镁 中的一种。
上述片剂中， 优选各原料的重量比为： 蟾毒灵脂质体： 淀粉： 乳糖： 糊 精： 硬脂酸镁为 0.1〜10： 0.5〜50： 0.4-40: 0.1-20: 0.1-2, 其中， 蟾毒灵脂 质体的重量以蟾毒灵原料计。
本发明所述片剂可以釆用现有技术的制备方法得到， 但更理想地， 釆用 如下方法制备而成： 取蟾毒灵脂质体溶于适量水中， 冷冻干燥， 后加入淀粉, 乳糖， 混合均匀， 再加入糊精水溶液制软材， 筛滤制粒， 置 50°C条件下干燥, 再整粒加入硬脂酸镁， 混合均匀， 压片， 即得。 此处的 "适量" 为本领域技 术人员可以理解，本发明以 g/ml计，优选釆用蟾毒灵的重量 2-10倍体积的水。 如以 5g蟾毒灵作为原料制备蟾毒灵脂质体， 制剂过程中将其溶于 50ml水。 此外， 具体的冷冻干燥、 压片等为本领域技术人员所掌握， 本发明对此不作 特别限定。 作为本发明的另一种实施方式， 所述组合物还可以为冻干粉针剂， 所述 冻干粉针剂由蟾毒灵脂质体、 分散剂和冻干辅料组成。 所述分散剂选自伯罗 沙姆、 吐温 -80、 司盘 -65 中的一种， 优选伯罗沙姆。 所述冻干辅料选自甘露 醇、 注射用乳糖、 注射用葡萄糖、 右旋糖酐、 蔗糖中的一种或多种， 优选蔗 糖。
本发明所述冻干粉针剂中， 优选各原料的重量比为： 蟾毒灵脂质体： 伯 罗沙姆： 蔗糖为 0.1〜20： 0.4〜40： 0.1〜40, 其中， 蟾毒灵脂质体的重量是以蟾 毒灵原料计。
上述冻干粉针剂可优选但并不局限于釆用如下方法制备而成： 取蟾毒灵 脂质体， 溶于适量水中， 加入分散剂和冻干辅料， 溶解完全后， 用微孔滤膜 过滤， 分装， 充氮， 灌封即得。 所述的分散剂和冻干辅料优选为伯罗沙姆、 蔗糖。
对于非肠道给药或静脉注射、 腹腔注射、 肌肉注射或皮下注射给药， 生 理盐水可作为药学上可接受的溶媒。 其他溶媒包括蒸馏水、 缓冲液、 0.3%甘 氨酸溶液等。 该制剂可通过紫外照射或过膜等常规方法灭菌后， 冻干保存。 为了达到生理环境要求， 还需加入药学上可接受的 pH调节剂及压力调节剂， 如氯化钠、 醋酸钠或钾盐等。
为了提高脂质体稳定性，还可参考专利 US5605703和 EP1325739加入磷 脂氧化抑制剂， 包括维生素或其衍生物、 丁基羟基甲苯（BHT ) , chroman, ferrioxamine等上述一种或多种的混合物。
为了提高口服生物利用度， 还可加入多糖高分子包括壳聚糖、 淀粉、 葡 聚糖、 普鲁兰多糖、 果胶或上述一种或多种的混合物。
此外， 本发明进一步要求保护上述的蟾毒灵脂质体在制备治疗癌症药物 中的应用。
蟾毒灵是一种有效的抗癌药物， 但其毒性较大限制了应用。 发明人首次 发现蟾毒灵脂质体能增强抗癌作用的同时减少毒性。 经静脉注射、 腹腔注射、 肌肉注射、 皮下注射或口服的方式作用于哺乳动物， 蟾毒灵脂质体较蟾毒灵 单体抗癌作用增强， 毒副作用减少。 本发明所述的蟾毒灵脂质体可被用来治疗癌症， 如肝癌、 肺癌、 卵巢癌、 前列腺癌、 结肠癌、 胰腺癌、 胃癌或白血病。
药物的剂量需依据疾病的诊断情况及临床医师的判断给药， 一般为
0.01〜50mg/kg, 最好在 0.1〜5mg/kg。
釆用上述技术方案， 本发明得到了一种蟾毒灵脂质体、 其制备方法、 组 合物及应用。 所述蟾毒灵脂质体具有良好的稳定性， 较蟾毒灵单体或其他制 剂能够显著提高其在防治癌症中的疗效。 此外， 本发明所述制备方法简单， 生产成本低， 有利于推广应用。 具体实施方式
以下实施例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。
实施例 1 薄膜法
5mg蟾毒灵溶于 5ml乙醇中， 40mg磷脂， 15mg胆固醇， 5mgDSPE-PEG 溶于氯仿中， 将有机溶液混合于圆底烧瓶中， 30°C减压旋转蒸发除去残留有 机溶剂以在瓶壁形成均匀薄膜。 向该均匀薄膜中再加入 5ml PBS ( 5 mM, pH 6.4-7.4 ) , 50°C水化 lh后超声 0.5h, 即得。
制得的脂质体在 1L水中透析 24h, 取少量脂质体加甲醇破乳， 用 HPLC 法测量包封率。 该蟾毒灵脂质体包封率为 58.7%。 （包封率即磷脂中包入的 药量占加入总药量的比例）
实施例 2 薄膜法
与实施例 1相比， 区别点仅在于本实施例用生理盐水代替 PBS, 该蟾毒 灵脂质体包封率为 57.3%。
实施例 3 薄膜法
与实施例 1相比，区别点仅在于本实施例用 6% 甘露醇水溶液代替 PBS, 该蟾毒灵脂质体包封率为 38.4%。
实施例 4 薄膜法
与实施例 1相比， 区别点仅在于本实施例加入 PBS ( 5 mM, pH 6.4-7.4 ) 的体积为 40ml, 60°C水化 3h, 该蟾毒灵脂质体包封率为 49.3%。
实施例 5 薄膜法 4mg蟾毒灵、 5mg胆固醇、 40mg大豆磷脂及 5mg mPEG-PE溶解在 10ml 氯仿： 甲醇（2 : 1 )中，将溶液减压旋转蒸发除去残留有机溶剂，加入 lml PBS ( 5 mM, pH 6.4〜7.4 ) , 剧烈涡旋， 冰浴中超声 20min即得。 该蟾毒灵脂质体 包封率为 52.5%。
实施例 6 薄膜法
与实施例 5相比， 区别点仅在于本实施例大豆磷脂用量为 10mg, 该蟾毒 灵脂质体包封率为 38.64%。
实施例 7 薄膜法
与实施例 5相比， 区别点仅在于本实施例磷脂为蛋黄卵磷脂， 该蟾毒灵 脂质体包封率为 51.45%。
实施例 8 薄膜法
与实施例 5相比， 区别点仅在于本实施例用胆固醇琥珀酸单酯盐的 PEG 修饰物 （CHEMS-PEG )代替 mPEG-PE, 该蟾毒灵脂质体包封率为 54.08%。
实施例 9 薄膜法
与实施例 5相比， 区别点仅在于本实施例中脂质体双分子层和蟾毒灵的 重量比为 8 : 1 , 具体为 6.25mg蟾毒灵、 5mg胆固醇、 40mg大豆磷脂及 5mg mPEG-PE, 该蟾毒灵脂质体包封率为 65.47%。
实施例 10 薄膜法
与实施例 5相比， 区别点仅在于本实施例中脂质体双分子层和蟾毒灵的 重量比为 12 : 1 , 具体为 4.17mg蟾毒灵、 5mg胆固醇、 40mg大豆磷脂及 5mg mPEG-PE, 该蟾毒灵脂质体包封率为 53.86%。
实施例 11 薄膜法
与实施例 5相比， 区别点仅在于本实施例中脂质体双分子层和蟾毒灵的 重量比为 5 : 1 , 具体为 10mg蟾毒灵、 5mg胆固醇、 40mg大豆磷脂及 5mg mPEG-PE, 该蟾毒灵脂质体包封率为 34.39%。
实施例 12 薄膜法
与实施例 5相比， 区别点仅在于本实施例中脂质体双分子层和蟾毒灵的 重量比为 20 : 1 , 具体为 2.5mg蟾毒灵、 5mg胆固醇、 40mg大豆磷脂及 5mg mPEG-PE, 该蟾毒灵脂质体包封率为 30.54%。
实施例 13 注入法
将 4mg蟾毒灵、 6mg胆固醇、 30mg磷脂及 4mg mPEG-PE溶解在 10ml 乙醇中， 超声 20min至溶解完全。 溶液用注射器注入 20ml PBS (5 mM, pH 6.4〜7.4)中， 50 °C搅拌 3h, 除去乙醇， 即得。该蟾毒灵脂质体包封率为 83.3%。
实施例 14 注入法
4mg蟾毒灵、 15mg胆固醇、 40mg磷脂及 5mg mPEG-PE溶解在 10ml乙 醚中，超声 20min溶解完全。溶液用注射器注入 20ml 6%甘露醇溶液中， 50 °C 搅拌 3h, 除去乙醚， 即得。 该蟾毒灵脂质体包封率为 56.8%。
实施例 15 薄膜法 +冻融法
4mg蟾毒灵、 6mg胆固醇、 30mg磷脂及 4mg mPEG-PE溶解在 10ml氯 仿： 甲醇（2 : 1 )中，将溶液减压旋转蒸发除去残留有机溶剂，加入 lml PBS(5 mM, pH 6.4-7.4) , 剧烈涡旋， 冰浴中超声 20min。 -20°C冰箱冷冻 5 h, 放置 室温溶解，再放入冰箱冷冻，重复 4次，即得。该蟾毒灵脂质体包封率为 61.8%。
实施例 16 注入法 +冻融法
4mg蟾毒灵、 15mg胆固醇、 40mg磷脂及 5mg mPEG-PE溶解在 10ml乙 醚中，超声 20min溶解完全。溶液用注射器注入 20ml 6%甘露醇溶液中， 50 °C 搅拌 3h, 除去乙醚。 -80°C冰箱冷冻 4 h, 放置室温溶解， 再放入冰箱冷冻， 重复 2次， 即得。 该蟾毒灵脂质体包封率为 56.8%。
实施例 17
与实施例 16 相比， 区别点仅在于： 本实施例中脂质体处方为： 蟾毒灵 4mg、 豆甾醇 6mg、 卵磷脂 30mg, mPEG-PE5mg。 该蟾毒灵脂质体包封率 为 45.2%。
实施例 18粉针剂
取 5g蟾毒灵， 按实施例 1所述的方法制备脂质体， 定容于 1000ml水中， 加入 20g伯罗沙姆， 100g蔗糖， 溶解完全后， 过 0.22μηι微孔滤膜， 分装成 500瓶， 每瓶 2ml, 冷冻干燥， 充氮， 灌封即得。
实施例 19 与实施例 18相比， 区别点仅在于本实施例中， 各原料的用量为： 蟾毒灵 脂质体：伯罗沙姆：蔗糖为 1： 4 : 50。
实施例 20
与实施例 18相比， 区别点仅在于本实施例中， 各原料的用量为： 蟾毒灵 脂质体：伯罗沙姆：蔗糖为 2 : 4 : 4。
实施例 21
与实施例 18相比， 区别点仅在于本实施例中， 各原料的用量为： 蟾毒灵 脂质体： 司盘 -65 : 甘露醇为 1 : 2 : 40。
实施例 21
与实施例 18相比， 区别点仅在于本实施例中， 各原料的用量为： 蟾毒灵 脂质体： 吐温 -80： 甘露醇为 2 : 3 : 4。
实施例 22 注射剂
取 5g蟾毒灵， 按实施例 1所述的方法制备脂质体， 定容于 10000ml生理 盐水中， 过 0.22μηι微孔滤膜， 分装成 100瓶， 每瓶 100 ml, 充氮， 灌封即得。
实施例 23颗粒剂
取 5g蟾毒灵， 按实施例 1所述的方法制备脂质体， 定容于 50ml水中， 冷冻干燥， 加入 50g淀粉， 35g糖粉， 混合均匀， 后加入混合均匀的乙醇、 糊精、 水（40 : 2 : 60 )粘合（含 5g糊精）， 制软材， 过 16目筛， 50°C烘干， 整粒， 分装成 100袋， 即得。
实施例 24 片剂
取 5g蟾毒灵， 按实施例 1所述的方法制备脂质体， 定容于 50ml水中， 冷冻干燥， 加入 40g淀粉， 10 g 乳糖， 混合均匀， 后加入 2%糊精的水溶液 共 150ml制软材， 20目筛制粒， 50°C干燥， 20目筛整粒， 加入 0.2g硬脂酸 镁， 混合均匀， 压成 100片， 即得。
实施例 25
与实施例 24相比， 区别点仅在于， 本实施例处方为： 蟾毒灵脂质体： 淀 粉： 乳糖： 糊精：硬脂酸镁为 0.5： 20： 0.4： 6： 2。
实施例 26 与实施例 24相比， 区别点仅在于， 本实施例处方为： 蟾毒灵脂质体： 淀 粉： 乳糖： 糊精：硬脂酸镁为 10： 50： 40： 20： 2。
实施例 27
与实施例 24相比， 区别点仅在于， 本实施例处方为： 蟾毒灵脂质体：淀 粉：乳糖：糊精：硬脂酸镁为 5： 12： 20： 10： 1。
实施例 28
与实施例 24相比， 区别点仅在于， 本实施例处方为： 蟾毒灵脂质体：淀 粉：乳糖： 明胶浆：硬脂酸镁为 5： 30： 10： 10： 0.5。
实施例 29
与实施例 24相比， 区别点仅在于， 本实施例处方为： 蟾毒灵脂质体：淀 粉：微晶纤维素： PVP胶浆：滑石粉为 5： 33： 5： 6： 1.5。
以下通过试验例来进一步阐明本发明所述脂质体稳定性及对癌症的治疗 效果。
试验例 1： 蟾毒灵脂质体稳定性实验
将实施例 1制得的蟾毒灵脂质体置于 4°C及 37°C条件下， 经过不同时间 后， 测定各指标。 各指标变化情况如表 1。 从结果可见， 蟾毒灵脂质体 4°C及 37°C分别放置 24 h, 稳定性 ^好； 75%湿度， 37°C保存 3个月， 粒径和表面 电位均无明显变化， 包封率略有降低， 总 稳定性较好。
Figure imgf000013_0001
温度 /时间 lh 2h 4h 8h 24h
4°C 粒径 (nm) 187土 10 180土 7.2 185土 11 197±4.7 188土 10 电位（mV ) -14.4土 3.3 -13.3土1.3 -13.7±1.8 -13.3土1.8 -12.9土 1.2
37°C 粒径 (nm) 183土 9.2 179土 12 189土 6.8 190土 5.8 183土 0.8 电位（mV ) -15.7土 0.4 -14.3土0.7 -13.2土 3 -13.7土 1.4 -13土 2.8 将实施例 1制得的蟾毒灵脂质体置于 37°C条件下， 75%RH (湿度)， 经过 不同时间后， 测定各指标。 各指标变化情况如表 2。
表 2: 性质 /时间 （月） 0 1 2 3 粒径 ( nm ) 184±7.5 179土 5.3 182土 3.7 180土 4.8 电位 (mV) -14.8土 3.1 -14.3土 2.9 -13.9土 4.1 -14.5±5.2 包封率 67.3% 64.7% 65.2% 61.9% 对其他实施例重复上述稳定性试验， 结果表明， 本发明所制备的蟾毒灵 脂质体总体稳定性均良好， 其中实施例 1的效果最佳。
试验例 2: 蟾毒灵和蟾毒灵脂质体对肿瘤细胞的生长抑制作用
人宫颈癌 HeLa、 肺癌 A549、 胃癌 SGC7901、 肝癌 HepG2、 髓性白血病 HL-60和结肠癌 SW1116细胞置于 DMEM或 RPMI 1640培养液（含 10 %灭 活的胎牛血清、 100 U.mr1青霉素和 100 mg.r1链霉素） 中， 37 °C、 5 %C02 孵箱中培养。 取对数生长期的细胞， 以 3χ103 /孔的密度接种于 96孔板， 每孔 100 μΐ, 在 37°C、 5 % C02饱和湿度条件下培养 24h。 试验设阴性对照组 （培 养液） 、 不同浓度给药组。 每个培养孔加入 1〜300 nmol/1的蟾毒灵或蟾毒灵 脂质体（按实施例 1方法制备） ， 37 °C、 5 %C02饱和湿度孵箱内培养 48h 后， 每孔加入 MTT液（5 g/l ) 20 μ1, 培养 4 h后， 离心， 吸弃培养液， 每孔 加入 150 μΐ二甲基亚砜， 轻度振荡溶解结晶，置自动酶标仪 570 nm波长处测 OD 值， 按下列公式计算细胞生长的抑制率： 细胞生长抑制率 /%= (给药组 OD值-空白对照 OD值） / (对照组 OD值-空白对照 OD值 ) xl00。 IC50 (细 胞增殖 50%抑制时药物浓度）值由数学方法计算所得。 数据以 Y ±SEM表 示， 釆用 t检验或方差分析进行统计学处理， PO.05表示两组间具有显著性 差异。
从表 3、 4结果可见， 在 l〜300 nmol/l浓度范围内， 蟾毒灵或蟾毒灵脂质 体均能明显抑制 6种肿瘤细胞的增殖， 抑制作用具有浓度依赖性。 蟾毒灵和 蟾毒灵脂质体的 IC5Q值差异不明显， 表明蟾毒灵和蟾毒灵脂质体的体外抗肿 瘤作用相当。
表 3 蟾毒灵对肿瘤细胞增殖的抑制作用
浓度 抑制率 （％)
(nmol/1) HeLa A549 SGC-7901 HepG2 HL60 SW1116 0 0.0±0.0 0.1±0.6 0.4±0.3 0.2±0.7 0.1±0.8 0.1±0.6
1 3.8±2.0 2.0±0.2 3.1±0.5 5.3±2.2* 1.6±0.1 1.9±0.3
3 9.6±8.2* 8.5±1.0* 3.9±0.8* 6.1±2.3* 4.4±0.7* 2.7±0.1 *
10 33.9±4.5* 25.3±3.8* 23.7±3.6* 30.2±2.9* 33.8±6.1 * 18.0±3.9*
30 56.3±8.2* 44.2±7.1 * 45.9±6.5* 49.8±8.3* 52.4±8.0* 42.7±6.3*
100 90.3±10.7* 52.3±8.3* 85.6±10.2* 69.8±7.5* 88.7±9.8* 73.1±8.8*
300 95.1±6.9* 63.8±7.9* 97.9±11.3* 87.7±9.6* 98.0±10.2* 99.4±11.6*
IC50 17.1 78.8 23.5 33.0 21.1 30.6
*尸<0.05 , 与 Ο ηι tno l/l组比较。
表 4 蟾毒灵脂 t体对肿瘤细胞增殖的抑制作用
浓度 抑制率 （％)
(nmol/1) HeLa A549 SGC-7901 HepG2 HL60 SW1116
0 1.0±0.3 0.2±0.3 0.0±0.1 0.3±0.6 1.1±0.5 0.5±0.7
1 5.7±0.9 3.8±0.7 3.6±0.9 7.2±1.1 * 2.3±0.1 2.2±0.3
3 11.1±0.2* 6.6±1. " 4.7±0.9* 9.9±1.8* 6.2±0.8* 12.7±0.9*
10 38.3±5." 29.4±3.5 * 20.2±2. " 35.8±6.0* 28.0±3.7* 20.6±4.5*
30 62.7±7.3* 41.1±6.8 * 47.3±5." " 45.6±3.4* 44.1±6.7* 46.7±6.3*
100 94.1±11.5 * 55.2±7.3: * 87.3±9. ^ 73.3±8.6* 79.9±8.2* 81.6±9.8*
300 98.3±10.1 * 67.0±8.7 * 96.4±12.0 * 90.5±10.3: * 94.5±10.5* 99.3±11.2*
IC50 14.1 72.2 24.8 26.5 27.8 23.0
* <0.05 , 与 O ni tno 1/1组比较。
试验例 3: 蟾毒灵和蟾毒灵脂质体的急性毒性评价
雄性 Balb / c小鼠 （20-25克） ， 购自第四军医大学实验动物中心。 蟾蜍 灵先用无水乙醇溶解， 再用生理盐水稀释至 0.2 mg/ml, (乙醇终浓度小于 1 % )。蟾毒灵脂质体（按实施例 1方法制备）直接溶于生理盐水得到 0.2 mg/ml 的溶液。 每组 10只动物分别以 0.5 , 1 , 2, 4和 6 mg/kg剂量腹腔注射蟾毒灵 或蟾毒灵脂质体（所述剂量为脂质体中蟾毒灵的量， 脂质体的实际用量需经 包封率换算所得） ， 观察小鼠的死亡率， 毒性作用， 和其它不良反应， 如腹 泻、体重减轻和行为变化，连续观察 7天。使用 Bliss法计算半致死剂量（ LD50 )。 结果表明， 蟾毒灵和蟾毒灵脂质体的 LD5Q的分别为 2.0 mg/kg和 4.2 mg/kg; 蟾蜍灵脂质体的毒性和致死率低于蟾蜍灵。
试验例 4: 蟾毒灵、 华蟾素注射液和蟾毒灵脂质体对肝癌的体内治疗作 用比较
人肝癌 HepG2细胞置于 DMEM培养液（含 10 %灭活的胎牛血清、 100 U-ml"1青霉素和 lOO mg 1链霉素）中， 37 °C、 5 %C02孵箱中培养。雄性 BALB / c裸鼠 （6周龄） ， 饲养于无特殊病原体条件下。 蟾毒灵脂质体按实施例 1 方法制备。 取对数生长期的细胞， 用 PBS制成细胞悬液， 每鼠右后背部接种 0.2 ml ( 2xl07 个） 。 待肿瘤长至 100 mm3 ( 1周左右） 时， 小鼠随机分为 4 组， 每组 8只， 每天分别腹腔注射 0.9%生理盐水（对照组） 、 相同剂量的蟾 毒灵或蟾毒灵脂质体（实施例 1 , 1 mg/kg, 所述剂量为脂质体中蟾毒灵的量， 脂质体的实际用量需经包封率换算所得） ， 华蟾素注射液 （lml/kg, 该剂量 为临床常用剂量换算为小鼠给药剂量所得） 。 自注射药物开始， 每 2天观察 小鼠饮食、 活动及体质量等一般状况， 用圆规和游标卡尺测量瘤块的最长径 和与其垂直的短径， 按照公式： V ( mm3 ) = (长径 X短径 2 ) /2计算瘤体积。 14天后， 用戊巴比妥钠麻醉过量致死， 完整剥离瘤体并称重， 计算抑瘤率， 肿瘤抑制率（％)= (对照组平均瘤重一给药组平均瘤重） /对照组平均瘤重 χΐοο。 数据以 士 SEM表示， 釆用 t检验或方差分析进行统计学处理， PO.05表示 两组间具有显著性差异。
结果如表 5所示： 给药前， 三组的肿瘤体积没有明显差异。 但 14天时， 对照组小鼠肿瘤生长迅速， 肿瘤体积平均达到 4097.2±821.6 mm3; 比较而言， 华蟾素注射液、 蟾毒灵、 蟾毒灵脂质体可显著性降低肿瘤的生长， 肿瘤体积 分别为 3191.5士 551.8、 3205.6士 711.5、 2356.1士 503.3 mm3 ( P < 0.05 ) 。 华蟾素 注射液、 蟾毒灵和蟾毒灵脂质体的抑瘤率分别为 22.1%、 21.8 %和42.5 %。 可见， 蟾毒灵脂质体比蟾毒灵单体和华蟾素注射液具有更强的抗肿瘤作用。 此外， 通过小鼠体重的监测和肺、 肝脏和肾脏的毒性观察， 表明此剂量的蟾 毒灵脂质体无明显的毒性。
表 5 蟾毒灵、 华蟾素注射液和蟾毒灵脂质体对 HepG2肝癌的体内治疗 治疗时间 肿瘤体积 （m m3)
(天） 蟾毒灵 蟾毒灵脂质体 对照组 华罎素注射液
0 410.5±75.3 421.2±76.8 413.8±87.2 405.2±63.8
2 1055.8±203.0 879.3±168.9 1215.5±286.7 989.6±179.3
4 1621.0±303.8 1327.9±296.8* 1870.2±379.3 1493.2±225.7
6 2215.9±338.1 * 1576.3±315.2* 2853.5±492.1 2026.0±286.1
8 2115.7±349.7* 1328.6±300.8* 2966.0±415.3 2090.8±315.3
10 2565.4±385.2* 1807.7±349.8* 3417.1±519.8 2397.1±320.0
12 2691.9±407.1 * 1889.5±387.2* 3402.9±534.8 2673.8±397.9
14 3205.6±711.5* 2356.1±503.3* 4097.2±821.6 3191.5±551.8
*尸 <0.05 , 与对照组比较。
试验例 5: 蟾毒灵、 华蟾素注射液和蟾毒灵脂质体对 L1210 白血病荷瘤 小鼠的治疗作用比较
鼠系 L1210 白血病细胞瘤株于 ICR小鼠腹腔传代。蟾毒灵脂质体按实施 例 1方法制备。 雄性 ICR小鼠， 体重 20±2g, 每笼 5只， 饲养于 12小时光 照和 12小时黑暗交替动物房中， 25°C恒温， 自由摄食。 小鼠无菌条件下分别 腹腔接种 lxlO5个 L1210 白血病细胞悬液， 随机分成 4组， 每组 10只。 24 h 后各组每天分别腹腔注射 0.9%生理盐水（对照组） 、 相同剂量的蟾毒灵或蟾 毒灵脂质体（实施例 1所得， l mg/kg, 所述剂量为脂质体中蟾毒灵的量， 脂 质体的实际用量需经包封率换算所得） ， 华蟾素注射液 （lml/kg, 该剂量为 临床常用剂量换算为小鼠给药剂量所得）。 观察并记录小鼠 35天内的生存情 况， 计算生命延长率。 生命延长率（％ ) = (给药组平均生存时间 /对照组平 均生存时间 - 1 ) xl00。 数据以 Y 士 SEM表示， 釆用 t检验或方差分析进行 统计学处理， PO.05表示两组间具有显著性差异。
结果见表 6, 模型组动物的平均生存时间仅为 16.7±1.9天。 华蟾素注射 液、 蟾毒灵和蟾毒灵脂质体组动物的生存时间明显延长， 分别为 40.7、 36.5 和 58.1%; 平均生存时间分别为 23.5±3.8、 22.8士 3.1和 26.4士 3.6天。 蟾毒灵脂 质体比蟾毒灵单体和华蟾素注射液对 L1210 白血病荷瘤小鼠具有更强的生 命延长作用。
表 6 蟾毒灵、 华蟾素注射液和蟾毒灵脂质体对 L1210白血病荷瘤小鼠 的平均生存时间和生命延长率的影响
组别 平均生存时间 （天） 生命延长率 （％)
对照组 16.7±1.9 - 蟾毒灵 22.8±3.1 * 36.5
蟾毒灵脂质体 26.4±3.6* 58.1
华蟾素注射液 23.5±3.8* 40.7
*尸<0.05 , 与对照组比较。
以其他实施例得到的产品重复上述试验， 得到相同结论， 此处由于篇幅 所限， 不再一一赘述。 虽然， 上文中已经用一般性说明、 具体实施方式及试验， 对本发明作了 详尽的描述， 但在本发明基础上， 可以对之作一些修改或改进， 这对本领域 技术人员而言是显而易见的。 因此， 在不偏离本发明精神的基础上所做的这 些修改或改进， 均属于本发明要求保护的范围。
工业实用性
本发明提供了一种蟾毒灵脂质体， 由脂质体双分子层和蟾毒灵组成， 所 述脂质体双分子层中包含磷脂、 甾醇和 PEG修饰物。 本发明所述的脂质体可 用于肿瘤的治疗， 尤其是肝癌、 肺癌、 卵巢癌、 前列腺癌、 结肠癌、 胰腺癌、 胃癌或白血病的治疗。 本发明提供的制备工艺简单， 所制得蟾毒灵脂质体与 蟾毒灵单体相比， 可增加抗肿瘤作用， 同时减小毒副作用， 具有良好的工业 实用性。

Claims

权 利 要 求 书
1、 一种蟾毒灵脂质体，其特征在于：由脂质体双分子层和蟾毒灵组成， 所述脂质体双分子层包含磷脂、 甾醇和 PEG修饰物。
2、 根据权利要求 1所述的蟾毒灵脂质体， 其特征在于： 所述的磷脂选 自卵磷脂、 磷脂酰胆碱、 磷脂酰乙醇胺、 磷脂酰甘油、 磷脂酰肌醇、 磷脂酰 丝氨酸、 鞘磷脂、 二棕榈酰磷脂酰胆碱、 二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、 二硬脂酰 磷脂酰胆碱或上述一种或多种的混合物。
3、 根据权利要求 2所述的蟾毒灵脂质体， 其特征在于： 所述的磷脂选 自卵磷脂、 磷脂酰胆碱或二硬脂酰磷脂酰胆碱。
4、 根据权利要求 2或 3所述的蟾毒灵脂质体， 其特征在于： 所述的磷 脂其含量占脂质体双分子层总重量的 20 ~ 80%。
5、 根据权利要求 1所述的蟾毒灵脂质体， 其特征在于： 所述的甾醇选 自胆固醇、 表胆甾醇、 麦角固醇或豆甾醇。
6、 根据权利要求 5所述的蟾毒灵脂质体， 其特征在于： 所述的甾醇为 胆固醇。
7、 根据权利要求 5或 6所述的蟾毒灵脂质体， 其特征在于： 所述的甾 醇含量占脂质体双分子层总重量的 10 ~ 40%。
8、 根据权利要求 1 所述的蟾毒灵脂质体， 其特征在于： 所述的 PEG 修饰物选自 PEG-磷脂酰乙醇胺、 mPEG-磷脂酰乙醇胺、 胆固醇的 PEG修饰 物、 DSPE-PEG或上述一种或多种的混合物。
9、 根据权利要求 1 或 8所述的蟾毒灵脂质体， 其特征在于： 所述的 PEG修饰物含量占脂质体双分子层总重量的 2 ~ 50%。
10、 根据权利要求 1所述的蟾毒灵脂质体， 其特征在于： 所述脂质体双 分子层和蟾毒灵的重量比为 （5 ~ 20 ) ： 1。
11、 根据权利要求 10所述的蟾毒灵脂质体， 其特征在于： 所述脂质体 双分子层和蟾毒灵的重量比为 （8 ~ 12 ) ： 1。
12、 根据权利要求 11所述的蟾毒灵脂质体， 其特征在于： 所述脂质体 双分子层和蟾毒灵的重量比为 10： 1。
13、 权利要求 1-12任一项所述的蟾毒灵脂质体的制备方法， 其特征在 于： 所述的制备方法选自薄膜法、 注入法、 薄膜法加冻融法、 注入法加冻融 法中任一种。
14、 根据权利要求 13所述的制备方法， 其特征在于： 所述薄膜法制备 包括下述步骤： 将蟾毒灵和脂质体双分子层材料分别或同时溶解于非极性或 弱极性有机溶剂中， 混合均匀， 用旋转蒸发仪减压除去有机溶剂以在瓶壁形 成均匀薄膜， 再加入蒸馏水或缓冲溶液对薄膜进行水化， 后经匀质、 搅拌、 涡旋和 /或超声， 得到蟾毒灵脂质体。
15、 根据权利要求 14所述的制备方法， 其特征在于： 所述的旋转蒸发 温度为 20〜60 °C。
16、 根据权利要求 14所述的制备方法， 其特征在于： 所述的水化时间 为 15〜240 min, 水化温度为 20〜65 °C。
17、 根据权利要求 14或 16所述的制备方法， 其特征在于： 所述的超声 时间为 5〜60min。
18、 根据权利要求 14或 16所述的制备方法， 其特征在于： 所述的蟾毒 灵与有机溶剂的质量体积比为 0.1〜lmg/ml。
19、 根据权利要求 14或 16所述的制备方法， 其特征在于： 所述的非极 性或弱极性溶剂为甲醇、 乙醇、 氯仿、 乙酸乙酯、 正己烷、 乙腈或上述一种 或多种混合液。
20、 根据权利要求 14或 16所述的制备方法， 其特征在于： 所述的缓冲 溶液为生理盐水、 磷酸盐缓冲液、 Tris-HCl溶液、 HEPES溶液或甘露醇溶液， 所述缓冲溶液的 pH值为 6.4-7.4。
21、 根据权利要求 14或 16所述的制备方法， 其特征在于： 所述蟾毒灵 与缓冲溶液的质量体积比为 0.1〜10 mg/ml。
22、 根据权利要求 13所述的制备方法， 其特征在于： 所述注入法包括 下述步骤： 将脂质体双分子层材料和蟾毒灵溶于有机溶剂中， 溶解完全后用 注射器将其注入至蒸馏水或缓冲溶液， 20〜60 °C搅拌 0.5〜4h将有机溶剂除尽， 得到蟾毒灵脂质体。
23、 根据权利要求 22所述的制备方法， 其特征在于： 所述的有机溶剂 为乙醇、 乙醚或甲醇的一种或两种。
24、 根据权利要求 13所述的制备方法， 其特征在于： 所述的薄膜法加 冻融法和注入法加冻融法包括下述步骤： 将以所述薄膜法或注入法制备得到 的蟾毒灵脂质体， 在 0 ~ -80°C冰箱或液氮中冷冻 2〜24 h, 置室温溶解， 再放 入 0 ~ -80°C冰箱或液氮中冷冻， 置室温溶解， 重复 2 ~ 8次， 得到冻融后的蟾 毒灵脂质体。
25、 含有权利要求 1-12任一项所述蟾毒灵脂质体的药物组合物。
26、 根据权利要求 25所述的药物组合物， 其特征在于： 所述的药物组 合物为注射剂、 粉针、 片剂、 胶囊剂、 颗粒剂、 丸剂、 糖浆剂、 水剂或混悬 剂。
27、 根据权利要求 26所述的药物组合物， 其特征在于： 所述药物组合 物为片剂， 所述片剂由蟾毒灵脂质体、 稀释剂、 粘合剂、 润滑剂组成。
28、 根据权利要求 27所述的药物组合物， 其特征在于： 所述粘合剂选
29、 根据权利要求 27或 28所述的药物组合物， 其特征在于： 所述稀释 剂选自微晶纤维素、 淀粉、 乳糖中的一种或多种。
30、 根据权利要求 27或 28所述的药物组合物， 其特征在于： 所述润滑 剂选自滑石粉、 硬脂酸镁中的一种。
31、 根据权利要求 27所述的药物组合物， 其特征在于： 所述片剂中， 各原料的重量比为： 蟾毒灵脂质体： 淀粉： 乳糖： 糊精： 硬脂酸镁为 0.1〜10： 0.5-50: 0.4-40: 0.1-20: 0.1-2, 其中， 蟾毒灵脂质体的重量以蟾毒灵原料计。
32、 根据权利要求 27或 31所述的药物组合物， 其特征在于： 所述片剂 的制备方法为： 取蟾毒灵脂质体溶于水中， 冷冻干燥， 加入淀粉， 乳糖， 混 合均匀； 再加入糊精水溶液制软材， 筛滤制粒， 置 50°C条件下干燥， 再整粒 加入硬脂酸镁， 混合均匀， 压片， 即得。
33、 根据权利要求 26所述的药物组合物， 其特征在于： 所述药物组合 为冻干粉针剂， 所述冻干粉针剂由蟾毒灵脂质体、 分散剂和冻干辅料组成。
34、 根据权利要求 33所述的药物组合物， 其特征在于： 所述分散剂选 伯罗沙姆、 吐温 -80、 司盘 -65中的一种。
35、 根据权利要求 34所述的药物组合物， 其特征在于： 所述分散剂为 罗沙姆。
36、 根据权利要求 33或 34所述的药物组合物， 其特征在于： 所述冻干 料选自甘露醇、 注射用乳糖、 注射用葡萄糖、 右旋糖酐、 蔗糖中的一种或
37、 根据权利要求 36所述的药物组合物， 其特征在于： 所述冻干辅料 为蔗糖。
38、 根据权利要求 33所述的药物组合物， 其特征在于： 所述冻干粉针 剂中，各原料的重量比为： 蟾毒灵脂质体：伯罗沙姆： 蔗糖为 0.1〜20： 0.4-40: 0.1-40, 其中， 蟾毒灵脂质体的重量以蟾毒灵原料计。
39、 根据权利要求 33所述的药物组合物， 其特征在于： 所述冻干粉针 剂的制备方法为： 取蟾毒灵脂质体， 溶于水中， 加入分散剂和冻干辅料， 溶 解完全后， 用微孔滤膜过滤， 分装， 充氮， 灌封即得。
40、 权利要求 1-12任一项所述的蟾毒灵脂质体在制备治疗癌症药物中 的应用。
41、 根据权利要求 40所述的应用， 其特征在于： 所述癌症包括但不限 于肝癌、 肺癌、 卵巢癌、 前列腺癌、 结肠癌、 胰腺癌、 食管癌、 胃癌或白血 病。
PCT/CN2013/073466 2012-12-26 2013-03-29 一种蟾毒灵脂质体及其制备方法和应用 WO2014101356A1 (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14/653,234 US9814734B2 (en) 2012-12-26 2013-03-29 Bufalin liposome, preparation method therefor and application thereof

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201210570744.8A CN103083239B (zh) 2012-12-26 2012-12-26 一种蟾毒灵脂质体及其制备方法和应用
CN201210570744.8 2012-12-26

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2014101356A1 true WO2014101356A1 (zh) 2014-07-03

Family

ID=48196726

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/CN2013/073466 WO2014101356A1 (zh) 2012-12-26 2013-03-29 一种蟾毒灵脂质体及其制备方法和应用

Country Status (3)

Country Link
US (1) US9814734B2 (zh)
CN (1) CN103083239B (zh)
WO (1) WO2014101356A1 (zh)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103462897A (zh) * 2013-08-06 2013-12-25 南京中医药大学 一种治疗肺癌的蟾毒灵脂质体制剂及其制备方法
CN105561304A (zh) * 2014-10-15 2016-05-11 常熟浸大科技有限公司 一种蟾酥靶向脂质体及其制备方法和应用
CN105854023A (zh) * 2015-01-19 2016-08-17 上海中医药大学附属普陀医院 一种基于聚乙二醇的水溶性蟾毒灵大分子前药的制备方法
CN104987504B (zh) * 2015-04-23 2018-05-01 南京明臻医药科技有限公司 聚乙二醇化拉帕替尼及其注射剂和制备方法
CN105687251A (zh) * 2016-01-21 2016-06-22 中国人民解放军第四军医大学 蟾酥提取物在制备治疗人脑胶质瘤药物中的应用
CN117205094A (zh) * 2017-05-23 2023-12-12 大江生医股份有限公司 乳化脂质体组合物用于制备耐高温的脂质体的用途
US20210169805A1 (en) * 2017-05-23 2021-06-10 Tci Co., Ltd. Emulsified liposome composition and preparation process thereof
CN107189074B (zh) * 2017-05-26 2021-02-09 西安电子科技大学 基于脂质体膜的金属有机骨架材料的表面功能化修饰方法
CN108096286A (zh) * 2018-02-27 2018-06-01 张显英 一种蟾毒液提取工艺
CN109464469A (zh) * 2018-10-19 2019-03-15 江苏浦金药业有限公司 一种蟾酥的提取方法
CN111773185A (zh) * 2020-08-14 2020-10-16 上海市普陀区中心医院 一种透明质酸修饰的载蟾毒灵纳米脂质体及其制备方法和应用
CN113662987A (zh) * 2021-09-17 2021-11-19 黑龙江省蟾宝生物科技发展有限公司 一种用于肝癌的食蟾虫脂质体的制备方法
CN115624631B (zh) * 2021-12-14 2024-10-01 盐城工学院 一种蟾毒灵前药自组装纳米粒及其制备方法与应用
CN114432247A (zh) * 2022-01-18 2022-05-06 南京中医药大学 一种蟾蜍色胺脂质体及其制备方法与应用
CN114432265B (zh) * 2022-02-17 2023-09-05 湖南万欧科技有限公司 负载日蟾蜍他灵的仿生纳米递送系统及其制备方法和应用
CN114916651B (zh) * 2022-05-19 2024-03-29 成都科建生物医药有限公司 一种芥末精油脂质体及其制备方法与应用
CN117126696B (zh) * 2023-09-15 2024-10-08 中国中医科学院中药研究所 一种蟾蜍油及其制备方法和应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101732349A (zh) * 2008-11-14 2010-06-16 上海医药工业研究院 一种蟾酥纳米长循环脂质体及其制备方法
CN102038690A (zh) * 2010-11-02 2011-05-04 暨南大学 沙蟾毒精在制备抗肿瘤药物制剂中的应用
CN102302475A (zh) * 2011-06-02 2012-01-04 江苏省中医药研究院 一种脂蟾毒配基干粉吸入剂及其制备方法、应用
CN102600180A (zh) * 2012-02-15 2012-07-25 南京中医药大学 治疗乳腺癌和肺癌的中药活性成分复方制剂及其制备方法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3134772A (en) 1961-05-01 1964-05-26 Kondo Heisaburo Method of synthesis of bufalin
US3687944A (en) 1970-05-08 1972-08-29 George R Pettit Process for the preparation of bufalin and related compounds
ES2072223B1 (es) 1993-11-25 1996-03-16 Lipotec Sa Liposomas encapsulando doxorubicina.
GB9814527D0 (en) * 1998-07-03 1998-09-02 Cyclacel Ltd Delivery system
ES2186484B1 (es) 2000-10-10 2004-07-01 Lipotec, S.A. Liposomas encapsulando farmacos anticancerosos y uso de los mismos en el tratamiento de tumores malignos.
US8932627B2 (en) * 2004-09-09 2015-01-13 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Liposomal compositions of glucocorticoid and glucocorticoid derivatives
JP2006248978A (ja) * 2005-03-10 2006-09-21 Mebiopharm Co Ltd 新規なリポソーム製剤
CN107261110A (zh) * 2010-06-19 2017-10-20 健康科学西部大学 Peg化脂质体包封的糖肽抗生素的新制剂
US20120231066A1 (en) * 2011-01-24 2012-09-13 Henry John Smith Multi-drug liposomes to treat tumors

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101732349A (zh) * 2008-11-14 2010-06-16 上海医药工业研究院 一种蟾酥纳米长循环脂质体及其制备方法
CN102038690A (zh) * 2010-11-02 2011-05-04 暨南大学 沙蟾毒精在制备抗肿瘤药物制剂中的应用
CN102302475A (zh) * 2011-06-02 2012-01-04 江苏省中医药研究院 一种脂蟾毒配基干粉吸入剂及其制备方法、应用
CN102600180A (zh) * 2012-02-15 2012-07-25 南京中医药大学 治疗乳腺癌和肺癌的中药活性成分复方制剂及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20150328234A1 (en) 2015-11-19
US9814734B2 (en) 2017-11-14
CN103083239B (zh) 2015-11-25
CN103083239A (zh) 2013-05-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2014101356A1 (zh) 一种蟾毒灵脂质体及其制备方法和应用
Zhu et al. Multifunctional ginsenoside Rg3-based liposomes for glioma targeting therapy
CN1840193B (zh) 聚乙二醇化磷脂包载的蒽环类抗肿瘤抗生素的纳米胶束制剂
WO2004017940A2 (en) Pharmaceutically active lipid based formulation of sn38
WO2008080367A1 (fr) Composition de liposome et son procédé de préparation
Liu et al. Effective co-encapsulation of doxorubicin and irinotecan for synergistic therapy using liposomes prepared with triethylammonium sucrose octasulfate as drug trapping agent
US9457082B2 (en) Liposome including complex of hydrophobic active ingredient and polypeptide and use of the liposome
WO2012072006A1 (zh) 一种水溶性药物的脂质体冻干组合物及其制备方法
Widjaya et al. Tumor-permeable smart liposomes by modulating the tumor microenvironment to improve the chemotherapy
CN106798923B (zh) 功能靶向性载体材料二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-聚乙烯亚胺化合物及其修饰的脂质体
CN106821987B (zh) 一种载含酚羟基难溶性药物的脂质体及制备方法和应用
Ren et al. Resolving hepatic fibrosis via suppressing oxidative stress and an inflammatory response using a novel hyaluronic acid modified nanocomplex
WO2023029041A1 (zh) 靶向动脉粥样硬化脂质体纳米载体递送系统及其制备方法
Lu et al. Ginsenoside Rb1 stabilized and paclitaxel/protopanaxadiol co-loaded nanoparticles for synergistic treatment of breast tumor
EP2384743A1 (en) Siosomal formulation for intracellular delivery and targeting of therapeutic agents
CN104368011B (zh) 一种药物甜菜碱缀合物、其药物组合物及应用
CA3001699A1 (en) Liposome composition co-encapsulating doxorubicin and a prodrug of mitomycin c
JP2023529330A (ja) エチレンジアミン四酢酸又はその塩を含有するエリブリン又はその薬用可能な塩リポソーム
CN102614182B (zh) 一种复方氨酚肾素药物组合物脂质体固体制剂
CN110548006B (zh) 一种科罗索酸脂质体及其制备方法和用途
CN104546722B (zh) 米铂脂质体和制法
Kang et al. Mixed micelles with galactose ligands for the oral delivery of berberine to enhance its bioavailability and hypoglycemic effects
CN112370529B (zh) 一种治疗肺动脉高压的复方制剂与制备方法
WO2019024841A1 (zh) 一种用于治疗造血系统增殖性疾病的纳米脂质微粒组合物及药物组合物
TWI786706B (zh) 包含陽離子脂質體的組成物於抑制皂素溶血的用途

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 13869391

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14653234

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 13869391

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1