CN105687251A - 蟾酥提取物在制备治疗人脑胶质瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量大于90%的蟾酥提取物在制备治疗人脑胶质瘤药物中的应用，所述蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量比为2：3：5，蟾酥提取物制备成纳米制剂。本发明蟾毒配基纳米制剂可增加蟾毒配基在脑中的分布，而避免被心脏摄取，从而提高了药物的脑靶向性而降低了心脏毒性。与普通的蟾酥提取物溶液剂相比，蟾毒配基纳米制剂脑胶质瘤治疗效果更强，副作用更少，从而提升了蟾毒配基的使用价值，为胶质瘤的治疗提供了一种新的药物。

Description

蟾酥提取物在制备治疗人脑胶质瘤药物中的应用

技术领域

本发明涉及基于蟾酥提取物的纳米制剂在制备治疗人脑胶质瘤药物中的应用，属于医药技术领域。

背景技术

人脑胶质瘤是由于大脑和脊髓胶质细胞癌变所产生的一种最常见的原发性颅脑肿瘤，约占颅内肿瘤的35%~61%，其侵袭性强，预后差，是病死率和致残率都较高的恶性肿瘤。人脑胶质瘤在发病之初，通常没有典型的症状，并且由于胶质瘤位于重要功能区及深部的侵袭性生长特征，使其难以全切，对放化疗也不甚敏感，非常容易复发。而化学药物和一般的抗肿瘤中药，因很难同时具有杀伤人脑胶质瘤细胞和透过血脑屏障两方面作用，疗效也不理想，导致人脑胶质瘤至今仍是全身肿瘤中预后最差的肿瘤之一。因此，研发相对高效低毒的新型抗人脑胶质瘤化疗药物成为临床上亟待解决的问题，同时也是当前世界研究的前沿课题和热点领域。

蟾酥一词来源于《本草衍义》，是由两栖纲无尾目蟾蜍科动物中华大蟾蜍（Bufobufo gargarizans Cantor）或黑眶蟾蜍（Bufo melanostictus Schneider）等的耳后腺及皮肤腺分泌的白色浆液经加工干燥而成。蟾酥包含多种化学成分，按溶解性质分为两大类，一类为水溶性部分，包括一定量的吲哚类生物碱（5-羟色胺、蟾蜍色胺、蟾酥季胺等）、多糖类、有机酸和氨基酸等成分；一类为脂溶性部分，约占20%，具有甾体结构，统称为蟾蜍甾类，蟾蜍甾类又分为与辛二酰精氨酸结合的酯即蟾蜍毒素以及游离的蟾毒配基两大类。我国第一部本草专著《神农本草经》中就记载“蟾酥味辛、寒，主邪气，破庙坚血，痈肿，阴疮，服之不患热病”，有解毒、止痛、开窍醒神、抗肿瘤等功效。

发明内容

本发明的目的在于提供基于蟾酥提取物的抗人脑胶质瘤药物——蟾毒配基纳米制剂(bufadienolides nano preparation, BU-NP)在制备治疗人脑胶质瘤药物中的应用。

本发明实现过程如下：

蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量大于90%的蟾酥提取物在制备治疗人脑胶质瘤药物中的应用，所述蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量比为2：3：5。

蟾毒配基包括蟾毒灵、蟾毒它灵、蟾毒它里定、华蟾酥毒基、华蟾毒它灵、脂蟾毒配基、日蟾毒素、日蟾蜍毒配基、沙蟾毒精、远华蟾毒精及南美蟾毒精等20余种蟾毒配基。

蟾毒配基很不稳定，在水中几乎不溶，加之其毒性较大，给药后半衰期短，消除迅速，体内分布广泛，同时会引起室性早搏等心脏不良反应，导致蟾酥制剂的开发具有一定难度。为解决上述问题，本发明将蟾酥提取物制备成纳米制剂，包括蟾毒配基固体脂质纳米粒、蟾毒配基纳米脂质体、蟾毒配基亚微乳、蟾毒配基纳米囊、蟾毒配基纳米球、蟾毒配基纳米乳或蟾毒配基聚合物胶束，纳米制剂的粒子尺寸为1~1000nm。

本发明纳米制剂中含蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的浓度和为0.001~5mg/ml。

纳米制剂具有双重杀伤肿瘤细胞的能力，除诱导细胞凋亡外，还可作为细胞自噬促进剂，通过诱导细胞凋亡和自噬两种方式共同作用杀伤人脑胶质瘤细胞。本发明纳米制剂通过产生ROS介导JNK的活化诱导人脑胶质瘤细胞的自噬。

本发明采用人脑胶质瘤细胞裸鼠原位移植模型进行体内实验，BU-NP静脉注射后可与大脑毛细血管内的内皮细胞结合，将药物透膜传递入脑或是通过吸附介导包吞转运作用，提高药物的脑靶向性，使蟾毒配基在脑中的分布进一步增加，从而显著延长裸鼠的带瘤生存期，且具有良好的量效关系。通过活体动物体内荧光成像技术检测肿瘤的信号强度、核磁共振扫描技术检测肿瘤的体积大小，结果表明BU-NP体内抑瘤效果优于等剂量普通的蟾酥提取物溶液剂(bufadienolides solution, BU-S)而心脏毒性低于BU-S，且与临床目前正应用的药物比无显著性差异。以上证实了蟾毒配基纳米制剂具有优于普通的蟾酥提取物溶液剂抗人脑胶质瘤的优势，可用于制备治疗人脑胶质瘤的药物，对人脑胶质瘤的治疗及预后可起到良好的效果。

通过流式细胞术和western blot方法分别测定经BU-NP处理后U87-MG细胞内ROS产生以及LC3，p-JNK 和JNK表达的变化，确定了BU-NP可作为细胞自噬促进剂，通过诱导细胞自噬杀伤人脑胶质瘤细胞，并且作用机制与ROS的产生及JNK的活化有关。

用JNK抑制剂（SP600125）或抗氧化剂（NAC）预先处理U87-MG细胞后再给与BU-NP，流式细胞术检测细胞内ROS水平，western blot方检测定p-JNK，JNK及LC3的表达，最终确定了ROS能介导JNK的活化，BU-NP诱导的U87-MG细胞自噬是通过增加ROS 从而激活JNK实现的。

本发明的优点在于：①本发明提供了基于蟾酥提取物的抗人脑胶质瘤药物——蟾毒配基纳米制剂，其中抗肿瘤活性成分蟾毒配基的纯度大于90%，蟾毒配基浓度高达5mg/ml，这是目前上市的蟾酥制剂所达不到的。②本发明提供的蟾毒配基纳米制剂可增加蟾毒配基在脑中的分布，而避免被心脏摄取，从而提高了药物的脑靶向性而降低了心脏毒性。与普通的蟾酥提取物溶液剂相比，蟾毒配基纳米制剂脑胶质瘤治疗效果更强，副作用更少，从而提升了蟾毒配基的使用价值，为胶质瘤的治疗提供了一种新的药物。③本发明打破了目前人们对“蟾毒配基杀伤脑胶质瘤细胞的作用仅是通过诱导细胞凋亡实现的”这一局限性的认识，证明了蟾毒配基纳米制剂具有双重杀伤人脑胶质瘤细胞的能力，除诱导细胞凋亡外，还可作为细胞自噬的促进剂，通过诱导细胞凋亡和过度自噬两种方式共同作用杀伤人脑胶质瘤细胞。④本发明拓宽了蟾毒配基的作用机制，除阐明蟾毒配基纳米制剂诱导的U87-MG细胞自噬与产生ROS、活化JNK有关外，还揭示了ROS和JNK的上下游关系，明确了BU-NP诱导的U87-MG细胞自噬是通过增加ROS 从而介导JNK的活化实现的。这将在研究脑胶质瘤的发病机理、临床诊断以及临床治疗的个体化用药方面发挥重要作用。

附图说明

图1 为本发明不同给药组裸鼠治疗后的体重变化比较图，图中横坐标为不同给药组，从左到右依次为模型组，蟾毒配基纳米乳低、中、高剂量组，蟾酥提取物水溶液组和阳性药temozolomide（TMZM）组，每组均包括造模前裸鼠体重，造模后14天裸鼠体重及连续给药10天后裸鼠体重；纵坐标表示不同组别裸鼠的体重变化；

图2 为本发明不同给药组裸鼠的带瘤生存期比较图，图中横坐标为不同给药组，从左到右依次为模型组，蟾毒配基纳米乳低、中、高剂量组，蟾酥提取物水溶液组和阳性药TMZM组，纵坐标表示不同组裸鼠带瘤的生存时间；

图3为本发明活体动物体内荧光成像检测不同给药组裸鼠体内肿瘤信号强度图，图中横坐标为不同给药组，从左到右依次为模型组，蟾毒配基纳米乳低、中、高剂量组，蟾酥提取物水溶液组和阳性药TMZM组，纵坐标表示荧光成像检测出的不同组别裸鼠体内肿瘤信号强度；

图4为本发明不同给药组裸鼠的肿瘤抑制率图，图中横坐标为不同给药组，从左到右依次为模型组，蟾毒配基纳米乳低、中、高剂量组，蟾酥提取物水溶液组和阳性药TMZM组，纵坐标表示不同组别裸鼠的抑瘤率；

图5为本发明不同给药组人脑胶质瘤的病理学检查图（HE染色，×200），图中从左到右依次为模型组，蟾毒配基纳米乳低、中、高剂量组，蟾酥提取物水溶液组和阳性药TMZM组；

图6为本发明人脑胶质瘤S-100和GFAP蛋白的免疫组化染色图（×400），图中S-100（-）和GFAP（-）为正常脑组织中S-100和GFAP蛋白的表达，S-100（+）和GFAP（+）为肿瘤组织中S-100和GFAP蛋白的表达；

图7为本发明蟾毒配基纳米脂质体和蟾酥提取物水溶液对人脑胶质瘤U87-MG细胞的增殖抑制作用示意图， 图中横坐标是蟾毒配基纳米脂质体和蟾酥提取物水溶液的药物浓度，纵坐标是对U87-MG细胞生长的抑制率，图中的三条趋势线从下往上依次为不同浓度药物作用24h、48h和72h；

图8 为本发明蟾毒配基纳米球对U87-MG细胞凋亡的影响在双变量流式细胞仪的散点图，其中，横坐标是 Annexin V，纵坐标是PI，左下象限是活细胞，右下象限是凋亡早期细胞，右上象限是凋亡晚期细胞及自噬坏死细胞，细胞总死亡率为右下及右上象限之和。四幅图依次是蟾毒配基纳米球低、中、高剂量组和对照组；

图9 为本发明蟾毒配基纳米囊对U87-MG细胞LC3-II和Beclin-1蛋白表达的影响，图中从左到右依次为对照组，蟾毒配基纳米囊低、中、高剂量组，蟾酥提取物水溶液组，从上到下依次是LC3-II、Beclin-1和β-actin 蛋白的表达；

图10 为本发明蟾毒配基固体脂质纳米粒对自噬体形成的影响，图A为透射电镜下观察所见对照组细胞，Ba为蟾毒配基固体脂质纳米粒处理细胞后透射电镜下可见凋亡小体，Bb为蟾毒配基固体脂质纳米粒处理细胞后透射电镜下可见自噬体；

图11 为本发明蟾毒配基固体脂质纳米粒对U87-MG细胞产生ROS的影响, 图中横坐标是蟾毒配基固体脂质纳米粒对U87-MG细胞的作用时间，从左到右依次为0、12、24、48h，纵坐标是产生ROS的相对荧光相对密度；

图12 为本发明蟾毒配基固体脂质纳米粒对U87-MG细胞JNK及其磷酸化水平表达的影响，图中从左到右蟾毒配基固体脂质纳米粒对U87-MG细胞的作用时间，依次是0、12、24、48h，从上到下依次是p-JNK、JNK和β-actin 蛋白的表达；

图13为本发明SP600125或NAC预处理后蟾毒配基固体脂质纳米粒对U87-MG细胞ROS产生的影响，图中横坐标依次表示溶剂预处理组、SP600125预处理组和NAC预处理组，每组又包括空白制剂组和蟾毒配基固体脂质纳米粒组，纵坐标是产生ROS的相对荧光相对密度；

图14为本发明SP600125或NAC预处理后蟾毒配基固体脂质纳米粒对U87-MG细胞JNK表达及其磷酸化水平的影响，图中从左到右前两列表示溶剂预处理组，中间两列表示NAC预处理组，最后两列表示SP600125预处理组，每两列依次分别为空白制剂组和蟾毒配基固体脂质纳米粒组，从上到下依次是p-JNK、JNK和β-actin 蛋白的表达；

图15 为本发明蟾毒配基固体脂质纳米粒预处理对U87-MG细胞产生LC3 蛋白的影响，图中从左到右前两列表示溶剂预处理组，后两列表示NAC预处理组，每两列依次分别为空白制剂组和蟾毒配基固体脂质纳米粒组，从上到下依次是LC3-I、LC3-II和β-actin蛋白的表达；

图16为本发明SP600125预处理对U87-MG细胞产生LC3 蛋白的影响，图中从左到右前两列表示溶剂预处理组，后两列表示SP600125预处理组，每两列依次分别为空白制剂组和蟾毒配基固体脂质纳米粒组，从上到下依次是LC3-I、LC3-II和β-actin蛋白的表达。

具体实施方式

以下给出具体的实验例以对本发明作进一步的详细描述，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。熟悉本领域的技术人员在不脱离本发明权利要求所保护的范围的情况下，根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实验例1 高纯度蟾毒配基提取物的分离纯化

将蟾酥药材敲碎并用粉碎机打成粗粉，过60目筛，称取200g，加入2L体积浓度80%的乙醇，水浴中加热回流2 h，放置室温后，抽滤，滤液蒸干，得到粗提物。

称取蟾酥粗提物20g，加入200mL蒸馏水，超声混悬，再加入200mL乙酸乙酯重复萃取3次，合并全部乙酸乙酯层减压浓缩至干，得萃取物。将萃取物溶于体积比为1:1的氯仿和甲醇混合液中，其中氯仿和甲醇混合液的质量为萃取物的质量的1.5倍，滤去不溶物，得澄清液；将澄清液边加边搅拌于硅胶中拌样，其中硅胶的质量为澄清液的质量的5倍，放置待完全干燥，进行硅胶柱色谱分离。

称取蟾酥萃取物10 g，溶于150 mL体积比为1:1氯仿和甲醇混合液中，滤去不溶物，得澄清液；将澄清液边加边搅拌于50 g硅胶中拌样，放置待完全干燥。进行硅胶柱色谱分离时，先用体积比为10:1的环己烷-丙酮混合液洗脱3次，再用体积比为5:1的环己烷-丙酮混合液洗脱5次，然后用丙酮洗脱1次，最后用甲醇洗脱1次。洗脱过程中，分段收集馏分，利用减压蒸馏对馏分进行浓缩，采用薄层色谱法对浓缩物进行鉴别，合并经鉴别较纯的B、C和R组分，即得蟾酥提取物。采用高效液相色谱法测定蟾酥提取物中蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量，计算蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的纯度。本实施例的蟾酥提取物中，蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量和为95.6%，三者的含量比为2：3：5。

实验例2 蟾毒配基纳米结构脂质载体的制备

处方：(以重量比例计) 本实验例采用实验例1制备的蟾酥提取物。

制备工艺：称取处方量的脂质材料和蟾酥提取物置于75℃水浴加热下磁力搅拌溶解，得到透明均一的油相；将处方量Lipoid E80®、Pluronic F68及脱氧胆酸钠加到适量注射用水中，500rpm磁力搅拌下加热至75℃，分散溶解得到水相；在磁力搅拌下，趁热将水相滴加入相同温度油相中，磁力搅拌5min，再超声分散10min，搅拌条件下冰水浴冷却，无菌条件下，用0.22μm滤膜滤过除菌，即得蟾毒配基纳米结构脂质载体。

实验例3 蟾毒配基亚微乳制剂的制备

处方：(以重量比例计) 本实验例采用实验例1制备的蟾酥提取物。

制备工艺：称取处方量的中链三酰甘油和长链三酰甘油，依次加入Lipoid E80®和蟾酥提取物，75℃加热搅拌30 min至溶解，得到澄清的含药的油相；将处方量的PluronicF68、油酸钠和甘油加入适量注射用水中，70℃下加热搅拌使溶解制得水相；在高速分散机12,000rpm的搅拌下，将油相缓慢加入至水相中，继续搅拌3min，制得初乳；将初乳用0.1mol·L^-1盐酸溶液调节pH值至6.0，用注射用水定容至100mL，冷却，转移至高压均质机中，以800 bar压力均质8次，装瓶，充氮气，封口，121℃高压蒸汽灭菌10 min，取出后于冷水浴降温，即得蟾毒配基亚微乳制剂。

实验例4 蟾毒配基纳米乳的抗人脑胶质瘤药效实验

（一）细胞培养：将人脑胶质瘤U87-MG细胞分装于数只底面积为75cm²的培养瓶中，按常规方法培养，即用含体积浓度10%胎牛血清的氨基酸和葡萄糖的培养基（DMEM），置37℃、CO₂体积浓度为5%的恒温恒湿培养箱中培养。在细胞处于对数生长期时，以质量浓度0.25%胰酶消化，收集消化液，离心后去除上清液，用Hanks液洗2次后制成细胞悬液，调节细胞浓度为每5μl含2.5×10⁵个U87-MG细胞的悬液用于裸鼠接种。

（二）造模、分组与给药：

整个接种过程在层流超净台进行。裸鼠用质量浓度0.8％戊巴比妥钠（0.2ml/10 g）腹腔注射麻醉后，俯卧位将其头部固定于脑立体定向仪上；用体积浓度75%酒精消毒头顶部皮肤后，先于颅中线处眼裂后开一个垂直切口，暴露前囟，在前囟中点前 l mm、矢状缝向右旁开2.5 mm处用直径为1mm的动物颅骨钻小心钻穿颅骨，然后用吸有5μl瘤细胞悬液的微量进样器经孔垂直进入脑白质区中，进针深度为针尖距颅骨表面3.5 mm，注射前将针稍微退回约0.5mm，以0.5μl/min注射速度将瘤细胞悬液缓慢注入，除针前停留2 min后再缓慢拔针，用骨蜡封闭骨孔，生理盐水冲洗术野，缝合头皮，最后用碘酒消毒。术后先将裸鼠置于37℃恒温板上保温，待苏醒后再放回笼中。常规饲养，每天观察其生活状态，包括其精神、饮食、排便、体重和活动等情况。

造模后第14天，选取经核磁共振扫描技术和活体动物体内荧光成像技术确认均成功造模的裸鼠，随机分为六组，每组15只，按照给药体积/裸鼠体重（0.1ml/10g）分别经静脉注射给予低中高浓度的蟾毒配基纳米乳（0.05mg/ml、0.1mg/ml和0.2mg/ml），BU-S(0.1mg/ml)，阳性药替莫唑胺（TMZM，2.5mg/ml）和空白纳米乳制剂，每日1次，连续给药10日，每组留6只，观察带瘤生存期。其余分别于停药后的第 2d先用活体动物体内荧光成像及核磁共振扫描技术，检测各组裸鼠脑内肿瘤的信号强度及大小，计算抑瘤率，然后断头处死，分离肿瘤，10%甲醛固定，常规包埋蜡块，切片进行HE染色及免疫组化染色，光镜下观察肿瘤细胞数量、密度及坏死情况。

（三）实验结果如下：

1、不同给药组裸鼠体重的变化

结果如图1所示，造模14天后，裸鼠体重均显著增加（P<0.01），而给药后每组裸鼠体重均有不同程度的下降，并且高剂量BU-NP组与阳性药组体重显著下降（P<0.05与P<0.01）。这可能是因为每天静脉给药对裸鼠来说是一种外来刺激，加之抗肿瘤药本身可能具有一定的副作用，因此给药开始裸鼠体重有减轻趋势，但高剂量BU-NP组没有阳性药组下降程度高，说明BU-NP的毒副作用可能小于阳性药组。

2、不同给药组裸鼠的带瘤生存期

结果如图2所示，给药组裸鼠的带瘤生存期均比对照组长，存在显著性差异（P<0.01），且相同剂量时BU-NP middle组比BU-S组带瘤生存期延长（P<0.05）。

3、活体动物体内荧光成像检测各组裸鼠体内肿瘤的信号强度

活体动物体内荧光成像检测到的荧光强度和肿瘤细胞的数量具有非常好的线性关系，可由荧光强度反映出细胞的数量。由图3可知，连续给药10天后，各给药组检测到的荧光强度均比模型组显著减少（P<0.01），相同剂量的BU-NP组的荧光强度比BU-S组低，且有统计学意义（P<0.01）。表明BU-NP在体内发挥抗人脑胶质瘤作用，在实验的数据范围内成剂量依赖性，且BU-NP的抗人脑胶质瘤作用比BU-S强。

4、不同给药组裸鼠的肿瘤体积和抑瘤率比较

采用核磁共振扫描技术检测各给药组裸鼠脑内肿瘤体积，无论矢状面、冠状面和横断面，给药组的肿瘤大小均较模型组小，且随着BU-NP给药剂量的增加，肿瘤越来越小。由图4抑瘤率结果可知，中剂量组的抑瘤率显著大于低剂量组和溶液剂组（P<0.01），高剂量组和阳性药组的抑瘤率无统计学差异，且均大于中剂量组且有统计学意义（P<0.01）。表明BU-S和BU-NP在裸鼠体内均有抗人脑胶质瘤生长的作用，同等剂量BU-NP比BU-S抗人脑胶质瘤作用更强,且BU-NP在实验范围内对肿瘤的生长抑制呈剂量依赖性。

5、移植瘤的病理组织切片

HE染色结果如图5所示，胶质瘤模型组细胞密集排列，成团状聚集，细胞核较大而深，呈浸润性生长，细胞异型性明显，细胞核分裂相可见，瘤组织血管形成不规则，小血管成团存在于瘤组织周围。BU-NP low组胶质瘤细胞束状密集排列，可见瘤巨细胞及明显病理性核分裂相，新生血管丰富，可见小灶状坏死。BU-NP middle和BU-S组尚见少量病理性核分裂相，出现灶状凝固性坏死，坏死成分较BU-NP low组增多，血管生成明显。BU-NP high和TMZM组呈大片坏死，细胞结构崩解，仅残存少量细胞及细胞核碎片。说明给药组均可杀死肿瘤细胞，且BU-NP给药组随药物浓度增大，肿瘤坏死成分增多，体积逐渐缩小。

6、移植瘤的免疫组化染色

如图6所示，对造模14天后的瘤组织行免疫组化染色，检测脑肿瘤诊断的免疫学标记S-100和GFAP的表达，结果均为阳性，结合生物发光信号成像以及核磁共振扫描结果，证明裸鼠造模成功。

实验例5 蟾毒配基纳米脂质体对人脑胶质瘤细胞U87-MG体外增殖的抑制作用

采用四甲基偶氮唑蓝法（MTT）法。U87-MG细胞悬液（1*10⁵cells/ml）接种于96孔培养板，置37℃、CO₂体积浓度为5%的恒温恒湿培养箱中24h后，加入不同浓度的BU-NP或BU-S使药物终浓度为0.0192ug/ml、0.096ug/ml、0.48ug/ml、2.4ug/ml和12ug/ml，每组设5个复孔，每孔终体积为200μl，分别培养细胞24，48，72h后每孔加入MTT（5 mg/ml）25μl，继续孵育4h后吸弃上清，每孔加入200μl DMSO，用酶标仪于570nm波长条件下测定吸光度值。

结果如图7所示，BU-NP和BU-S对U87-MG细胞增殖均有抑制作用，该作用呈明显的时间－剂量依赖性，且作用相同时间时等浓度的BU-NP对U87-MG细胞的增殖抑制作用比BU-S强。

实验例6 蟾毒配基纳米球诱导了U87-MG细胞凋亡

采用流式细胞术（Flowing cell micmspectrofluorimetry, FCM）检测细胞的凋亡。U87-MG细胞悬液（1*10⁵cells/ml）接种于6孔培养板，置37℃、CO₂体积浓度为5%的恒温恒湿培养箱中24h后，加入BU-NP使药物浓度为3ug/ml、6ug/ml和12ug/ml，继续培养细胞48h。用质量百分比0.25%胰蛋白酶和质量百分比0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）消化细胞，加入含血清的完全培养基终止反应，800rpm离心5min收集细胞，弃去上清，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞2次，后续步骤按照AnnexinV-FITC试剂盒说明书进行操作，用流式细胞仪定量分析细胞凋亡水平。

结果如图8所示，3ug/ml、6ug/ml和12ug/ml BU-NP作用于U87-MG细胞24h后，AnnexinV/PI分析各给药组细胞凋亡率依次为（9.6%±1.1）%、（22.2%±1.7）%和（26.9%±2.4）%，随药物剂量的增加而升高，且均明显高于同期空白对照组（0.5%±0.02）%，各给药组较对照组均有显著性差异（P<0.01），说明BU-NP可通过诱导U87-MG细胞的凋亡杀伤细胞。

实验例7 蟾毒配基纳米囊诱导了U87-MG细胞发生自噬

采用western blot法对BU-NP作用后细胞自噬的特异分子指标LC3-II和Beclin-1进行检测。分别收集未处理组及BU-NP处理组细胞，将其裂解于200μl 含有蛋白酶抑制剂(100μg/ml PMSF，2μg /ml Aprotitin)的RIPA 裂解液中，4℃裂解40min，15000r /min离心20min，取上清，Lowry 法进行蛋白定量。与3 ×样品缓冲液混合后，煮沸5min。将样品在12%的SDS-聚丙烯凝胶中进行电泳，然后转印至硝酸纤维素膜上(电压: 2mV/cm2；时间: 40min) 。用5%脱脂牛奶封闭2h后，加入既定的一抗，4℃过夜。TTBS洗4次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温作用30min。ECL 法显色，GIS 凝胶图像分析系统照相并分析处理。结果如图9所示。LC3是自噬标志物，自噬形成时LC3-I 会酶解掉一小段多肽，转变为LC3-II。BU-NP能呈剂量依赖性地使U87-MG细胞中LC3-II和Beclin-1的表达不断增加，且与BU-S相比，等浓度的BU-NP处理后LC3-II和Beclin-1的表达增加更多。

用胰酶消化收集未处理组和BU-NP处理组细胞，2.5%的戊二醛缓冲液固定，再用1%的四氧化锇缓冲液固定。细胞包埋后切片，经乙酸双氧铀和枸橼酸铅染色，在透射电子显微镜下观察自噬体的存在。结果如图10所示。经BU-NP处理后的细胞电镜下可观察到凋亡小体和自噬体的出现，进一步确认了 BU-NP除诱导细胞调往外，还引起了细胞自噬的形成。

实验例8 蟾毒配基固体脂质纳米粒通过增高ROS并激活JNK通路引发U87-MG细胞自噬

6μg/ml BU-NP处理脑胶质瘤U87-MG细胞0、12、24和48h后，收集细胞，无血清培养基清洗3次，重悬于1mL的DCFH-DA探针中，37℃暗室孵育30min，每隔3-5min颠倒混匀1次，使探针和细胞充分接触。用无血清细胞培养液洗涤细胞3次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA后，使用488nm激发波长，525nm发射波长细胞流式仪观察细胞内的荧光强度，结果如图11所示。可见BU-NP可诱导U87-MG细胞产生ROS，且ROS产生量随BU-NP 给药时间的延长显著性增加。

6μg/ml BU-NP处理脑胶质瘤U87-MG细胞0、12、24和48h后，收集细胞，采用实验例6中western blot方法检测p-JNK，JNK的表达，结果如图12所示。可见BU-NP能诱导U87-MG细胞中JNK磷酸化水平升高，且随BU-NP 给药时间的延长JNK磷酸化水平升高越多。

为了解BU-NP 诱导 U87-MG细胞的自噬过程中ROS及JNK的上下游关系，用JNK抑制剂（SP600125）或抗氧化剂（NAC）预先处理U87-MG细胞45min，再加入BU-NP孵育细胞48h，流式细胞术检测细胞内的 ROS 水平，western blot方法检测p-JNK，JNK及LC3的表达，结果如图13-16所示。可见抗氧化剂 NAC 能显著降低ROS 产生量，也能显著下调JNK的磷酸化以及LC3-II水平，而JNK抑制剂SP600125只能显著下调JNK的磷酸化以及LC3-II水平，而不能降低ROS 产生量，表明ROS是JNK的上游， BU-NP诱导的U87-MG细胞自噬是通过产生ROS 从而介导JNK的活化实现的。

实验例9 发明人用蟾毒配基纳米制剂中的任何一种重新进行实验例4-8的实验步骤，结果均一致。

Claims (7)

1.蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量大于90%的蟾酥提取物在制备治疗人脑胶质瘤药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量比为2：3：5。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：蟾酥提取物制备成纳米制剂蟾毒配基固体脂质纳米粒、蟾毒配基纳米脂质体、蟾毒配基亚微乳、蟾毒配基纳米囊、蟾毒配基纳米球、蟾毒配基纳米乳或蟾毒配基聚合物胶束。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：纳米制剂的粒子尺寸为1~1000nm。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：纳米制剂中含蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的浓度和为0.001~5mg/ml。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：纳米制剂具有双重杀伤肿瘤细胞的能力，除诱导细胞凋亡外，还可作为细胞自噬促进剂，通过诱导细胞凋亡和自噬两种方式共同作用杀伤人脑胶质瘤细胞。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：纳米制剂通过产生ROS介导JNK的活化诱导人脑胶质瘤细胞的自噬。