CN110461355A - 包含免疫调控剂和阳离子脂质体的免疫增强的组合物及其用途 - Google Patents
包含免疫调控剂和阳离子脂质体的免疫增强的组合物及其用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及免疫增强的组合物，该免疫增强的组合物包含具有新颖结构的免疫应答调节剂，且更具体地，涉及免疫增强的组合物及其用途，其中该免疫增强的组合物包含具有降低的毒性的脂多糖(LPS)类似物，和阳离子脂质体。本发明克服脂质体的物理化学不稳定性，在产生、转运、和贮存方面是有利的，且提高稳定性，因此作为免疫递送系统是有益的。此外，本发明包含抗原、免疫应答调节剂、和阳离子脂质体，且因此与仅使用免疫应答调节剂的情况相比，表现出增强的免疫提高的作用。
Description
技术领域
本发明涉及用于增强免疫的组合物，该组合物包含具有新颖结构的免疫调节剂。更具体地，本发明涉及用于增强免疫的组合物及其用途，该组合物包含具有降低的毒性的脂多糖(LPS)的类似物和阳离子脂质体。
发明背景
脂质体具有表现出极好的生物相容性、易于制造、且能够递送水溶性和脂溶性药物的优势，且因此已经积极地对如在体内具有较少副作用的药物递送系统的脂质体进行了研究。当脂质体在水溶液中作为分散相贮存时，因为其系统本身是物理和化学不稳定的，所以常见的脂质体具有导致磷脂的聚集、融合、水解，包封的药物的氧化、渗漏等的缺点。因此，当脂质体贮存很长时间时，脂质体本身的稳定性的缺点需要经确保。为了克服这些缺点，已经积极地进行了研究以通过以细粉形式贮存脂质体以试图克服脂质体的物理化学不稳定性来提高脂质体的稳定性。然而，使用冻干过程以将脂质体转换为细粉。在此类过程中，当仅使用脂质体时，脂质体的稳定性和均质性恶化，且其物理和化学特性因此而变化。结果，不利地，脂质体作为药物递送和其免疫活性的功能恶化，且毒性出现。因此，正在对有利于生产、贮存、和递送的组合物进行研究，同时通过添加冷冻保护剂等以在冷冻干燥期间防止脂质体的变性来最大化脂质体的优点。
脂多糖(LPS)是革兰氏阴性细菌的外膜的主要组分，且促进各种免疫细胞的活化，特别是固有免疫应答。LPS通过分泌细胞因子，表达共刺激分子和诱导抗原递呈而活化抗原递呈细胞，且它使固有免疫应答与适应性免疫应答关联(Akira S,Uematsu S,Takeuchi O,Cell 124:783-801(2006)；Schnare M,Barton GM,Holt AC,Takeda K,Akira S等NatImmunol 2:947-950(2001))。
LPS由三个域组成，即两亲性域(脂质A)、核心寡糖(OS)、和O-抗原(或O-抗原性多糖)。已知脂质A在LPS的内毒素活性中起作用且通过各种类型的免疫细胞的TLR4(toll样受体4)信号传导表现出免疫刺激性作用(Raetz CR,Whitfield C,Annu Rev Biochem 71:635-700(2002))。已经靶向表现出降低的毒性的脂质A衍生物用于开发人疫苗免疫佐剂。单磷酰脂质A(MPL)是从明尼苏达沙门氏菌(Salmonella minnesota)粗菌株中分离的LPS的无毒性衍生物。此外，铝盐和MPL的组合已被批准作为用于抗HBV(乙型肝炎病毒)和HPV(人乳头瘤病毒)的疫苗的免疫佐剂。
自20世纪50年代以来，已知LPS具有抗癌作用，但由于毒性能够导致因败血症而死亡(即使在纳克(ng)水平的污染的情况下)，其尚未适合使用。因此，已经稳步地进行了研究以降低LPS的毒性且已经成功地降低了LPS的毒性，特别是通过去除多糖链或脂质A的脱酰作用(Katz SS等,J Biol Chem.Dec 17；274(51):36579-84 1999)。特别地，通过去除LPS的多糖链获得的，通过脂质A的磷酸化作用获得的MPL已经开发为无LPS毒性的免疫抗癌药剂，但已知其作用是不足的。
作为努力开发能够表现出极好的免疫刺激活性同时降低毒性(其已经是通过使用常规LPS引起的问题)的LPS类似物，且克服脂质体的物理和化学不稳定性的结果，本发明人发现了具有降低的毒性的具有新颖结构的EG-免疫调节剂(EG-IM)，该降低的毒性通过分离和纯化来自从人肠中发现的大肠杆菌(E.coli)菌株的不具有O-抗原位点的LOS，并使其脱酰而获得，且鉴定出含有该免疫调节剂和阳离子脂质体的疫苗组合物表现出极好的免疫刺激活性。基于该发现，已经完成了本发明。
技术问题
因此，本发明的一个目的是提供用于增强免疫的组合物，该组合物包含：(a)由下式1表示的免疫调节剂；和(b)阳离子脂质体：
式1
其中Glc是葡萄糖，GlcN是葡糖胺，HEP是庚糖，KDO是2-酮-3-脱氧-辛酸，GlcNAc是N-乙酰葡糖胺，且A至F是磷酸盐可结合的位置。
本发明的另一目的是提供疫苗组合物，该疫苗组合物包含(a)抗原和(b)作为活性成分的用于增强免疫的组合物。
本发明的另一目的是提供用于制备用于增强免疫的组合物的方法，该方法包括：(a)制备含有由式1表示的免疫调节剂的溶液：(b)在有机溶剂中溶解脂质以制备脂质混合的溶液；(c)使步骤(b)的脂质混合的溶液冻干以去除该有机溶剂；且(d)使在步骤(c)中获得的物质再水合，然后使该物质与步骤(a)的溶液混合，从而形成用于增强免疫的组合物。
本发明的另一目的是提供用于制备疫苗组合物的方法，该方法包括：(a)制备含有由式1表示的免疫调节剂的溶液；(b)在有机溶剂中溶解脂质以制备脂质混合的溶液；(c)使步骤(b)的脂质混合的溶液冻干以去除该有机溶剂；(d)使在步骤(c)中获得的物质再水合，从而形成脂质体；且(e)添加步骤(a)的溶液和抗原至步骤(d)的脂质体，随后再次冻干。
技术方案
为了实现上述目的，本发明提供了用于增强免疫的组合物，该组合物包含：(a)由下列式1表示的免疫调节剂；和(b)阳离子脂质体：
式1
其中Glc是葡萄糖，GlcN是葡糖胺，HEP是庚糖，KDO是2-酮-3-脱氧-辛酸，GlcNAc是N-乙酰葡糖胺，且A至F是磷酸盐可结合的位置。
本发明还提供疫苗组合物，该疫苗组合物包含：(a)抗原和(b)作为活性成分的用于增强免疫的组合物。
本发明还提供用于制备用于增强免疫的组合物的方，该方法包括：(a)制备含有由式1表示的免疫调节剂的溶液；(b)在有机溶剂中溶解脂质以制备脂质混合的溶液；(c)使步骤(b)的脂质混合的溶液冻干以去除该有机溶剂；且(d)使在步骤(c)中获得的物质再水合，然后使该物质与步骤(a)的溶液混合，从而形成用于增强免疫的组合物。
本发明还提供用于制备疫苗组合物的方法，该方法包括：(a)制备含有由式1表示的免疫调节剂的溶液；(b)在有机溶剂中溶解脂质以制备脂质混合的溶液；(c)使步骤(b)的脂质混合的溶液冻干以去除该有机溶剂；(d)使在步骤(c)中获得的物质再水合，从而形成脂质体；且(e)添加步骤(a)的溶液和抗原至步骤(d)的脂质体，随后再次冻干。
本发明还提供用于预防免疫疾病的方法，该方法包括用由式1表示的免疫调节剂治疗患者，和该免疫调节剂用于预防免疫疾病的用途。
附图简述
图1A显示通过电泳和银染鉴定经提取的LOS的结果，且图1B显示指示EG-IM的大小降低的结果，基于当用碱处理LOS时通过降解脂质A提取的LOS，其中M表示标记物，泳道1表示脱酰作用前的LOS，且泳道2表示免疫调节剂(EG-IM)。
图2显示根据本发明的EG-免疫调节剂(EG-IM)的结构，其中Glc是葡萄糖，GlcN是葡糖胺，HEP是庚糖，KDO是2-酮-3-脱氧-辛酸，GlcNAc是N-乙酰葡糖胺，且A至F是磷酸可结合的位置。
图3是显示脂质溶解步骤中脂质体大小分布的图表，且图4是显示使糖脂和脂质体简单地混合的步骤中脂质体大小分布的图表。
图5是显示脂质体EG-IM对免疫细胞的增殖的作用的图示。
图6是显示脂质体EG-IM对诱导TNF-α分泌的作用的图示。
图7是显示脂质体EG-IM对细胞毒性减轻的作用的图示。
图8显示证明含有脂质体EG-IM的疫苗的形成是通过静电吸引形成的结果，其中LP表示脂质体，S表示上清液且P表示沉淀物(微球)。
图9是显示脂质体EG-IM募集免疫细胞的作用的图示。
图10显示通过流式细胞术分析含有脂质体EG-IM的疫苗的摄取作用的结果，且图11是显示通过单核细胞的摄取作用的图示，其中图11A显示分析dLN中荧光标记的gE蛋白特异性细胞的结果，图11B显示分析肌肉组织中荧光标记的gE蛋白特异性细胞的结果，图11C显示测量dLN中荧光标记的gE蛋白特异性单核细胞的结果，且图11D显示测量肌肉组织中荧光标记的gE蛋白特异性单核细胞的结果。
图12显示含有脂质体EG-IM的疫苗的储库(depot)作用。
图13显示含有脂质体EG-IM的寨卡病毒疫苗的寨卡病毒抗原特异性抗体滴度。
图14A显示含有脂质体EG-IM的日本脑炎疫苗的JEV特异性抗体滴度，且图14B显示在施用该日本脑炎疫苗后分泌的IFN-γ细胞因子的量。
图15A显示含有脂质体EG-IM的结核疫苗的TB特异性抗体滴度，图15B显示在施用结核疫苗后分泌的IFN-γ细胞因子的量，且图15C显示分析含有脂质体EG-IM的结核疫苗的杀菌作用的结果。
图16A显示含有脂质体EG-IM的百日咳疫苗的TB特异性抗体滴度，且图16B显示分析百日咳疫苗的CD4+T细胞增殖的结果。
图17A是显示在施用百日咳疫苗后IFN-γ细胞因子分泌的量的图示，其中白色图示显示脾脏细胞的结果，且黑色图示显示肺细胞的结果。图17B和17C分别显示一经施用该百日咳疫苗，诱导IFN-γ和IL-17的能力。
图18显示在施用含有脂质体EG-IM的水痘-带状疱疹病毒疫苗后的IFN-γ细胞因子分泌的量。
图19至21显示分析一经添加脂质成分至含有脂质体EG-IM的水痘-带状疱疹病毒疫苗的协同作用的结果，其中图19显示一经添加胆固醇的结果，图20显示一经添加角鲨烷的结果，且图21显示一经添加三癸酸甘油酯的结果。
图22显示一经添加基于皂苷的免疫佐剂成分至含有脂质体EG-IM的水痘-带状疱疹病毒疫苗的协同作用。
图23显示根据含有脂质体EG-IM的水痘-带状疱疹病毒疫苗的最终配制物的免疫原性分析。图23A显示分泌的IL-5细胞因子的量，且图23B和23C显示分泌的IFN-γ细胞因子的量，其中NP-A表示DDA/DOPC，NP-B表示DOTAP/DMPC，NP-C表示DOTAP/DMPC/鲨烯，NP-D表示DOTAP/DMPC/三癸酸甘油酯，+表示简单混合的配制物，且/表示混合的和冻干的配制物。
发明详述
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域中的技术人员所理解的相同的含义。通常，本文使用的命名法和以下所述的实验方法是本领域中所熟知的，且是通常使用的。
本发明的一个实施方案中，脂质体EG-IM通过下列制备：使含有DMPC和DOTAP的混合物的脂质混合的溶液与EG-免疫调节剂(EG-IM)溶液混合以制备含有EG-IM的脂质混合的溶液，随后再水合，使用小鼠巨噬细胞系鉴定该脂质体EG-IM对免疫细胞的增殖和细胞毒性的降低的作用。
因此，在一个方面中，本发明涉及用于增强免疫的组合物，该组合物包含：(a)由下列式1表示的EG-免疫调节剂(EG-IM)；和(b)阳离子脂质体：
式1
其中Glc是葡萄糖，GlcN是葡糖胺，HEP是庚糖，KDO是2-酮-3-脱氧-辛酸，GlcNAc是N-乙酰葡糖胺，且A至F是磷酸盐可结合的位置。
在另一方面中，本发明涉及用于制备用于增强免疫的组合物的方法，且该用于增强免疫的组合物可通过下列步骤制备：
(a)制备含有由式1表示的免疫调节剂的溶液：
式1
其中Glc是葡萄糖，GlcN是葡糖胺，HEP是庚糖，KDO是2-酮-3-脱氧-辛酸，GlcNAc是N-乙酰葡糖胺，且A至F是磷酸盐可结合的位置；
(b)在有机溶剂中溶解脂质以制备脂质混合的溶液；
(c)使步骤(b)的脂质混合的溶液冻干以去除该有机溶剂；
(d)使在步骤(c)中获得的物质再水合，然后使该物质与步骤(a)的溶液混合，从而形成用于增强免疫的组合物。
根据本发明的EG-免疫调节剂(EG-IM)可以由下列式1表示。
式1
其中Glc是葡萄糖，GlcN是葡糖胺，HEP是庚糖，KDO是2-酮-3-脱氧-辛酸，GlcNAc是N-乙酰葡糖胺，且A至F是磷酸盐可结合的位置。
如本文所用的，术语“LOS(脂低聚糖，lipooligosaccharide)”指LPS(脂多糖)的变体，该变体比天然LPS具有更短的糖链，且因此具有较低分子量。脱酰作用前的LOS优选地具有5,000至10,000Da的分子量，更优选为3,000至4,000Da。术语“脱酰的LOS”指其中经由-C(O)O-键连接至脂质A的葡糖胺的脂肪酸由此去除且相较于LOS毒性大大降低的LOS。该脂肪酸经由-C(O)O-和-C(O)NH-键与脂质A的葡糖胺连接。本发明的脱酰的LOS是其中通过使脂质A脱酰去除经由-C(O)O-键连接的脂肪酸的LOS。
该EG-IM可通过多种方法制备，但可依照本发明人的之前的专利中公开的方法制备，即韩国专利号0456681；WO 2004/039413；韩国专利号0740237；和WO 2006/121232。例如，通过用强碱(例如0.2N NaOH)处理以从脂质A中去除一些脂肪酸来使LPS脱酰，从而使LPS脱毒。
根据本发明，该EG-IM可与2至6个磷酸基团，优选为3至4个磷酸基团连接，但不限于此。此外，式1中磷酸基团的数目和位置可与下表1中示例的那些相同。
表1
这些磷酸盐在选自下组的位置处结合：式1的AB、AC、AD、AE、AF、BC、BD、BE、BF、CD、CE、CF、DE、DF、EF、ABC、ABD、ABE、ABF、ACD、ACE、ACF、ADE、ADF、AEF、BCD、BCE、BCF、BDE、BDF、BEF、CDE、CDF、CEF、DEF、ABCD、ABCE、ABCF、ABDE、ABDF、ABEF、ACDE、ACDF、ADEF、BCDE、BCDF、BCEF、BDEF、CDEF、ABCDE、ABCEF和ABCDEF。
根据本发明，式1中的糖选自下组：己糖、己糖胺、N-乙酰己糖胺、庚糖和Kdo(2-酮-3-脱氧-辛酸)。
如本文所用的，术语“己糖”意指在分子中包括六个碳原子的单糖，且其实例包括但不限于己酮糖(阿洛酮糖、果糖、山梨糖、塔格糖)、己醛糖(阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖、塔罗糖)和脱氧糖(岩藻糖、墨角藻糖、鼠李糖)。
根据本发明，该己糖是己醛糖，且在具体的实例中，该己醛糖是葡萄糖或半乳糖。
如本文所用的，术语“庚糖”指在分子中含有七个碳原子的单糖，且可根据官能团(醛基和酮基)的位置分类为庚醛糖(位置1)和庚酮糖(位置2)。该庚醛糖是，例如，L-甘油基-D-甘露-庚糖，但不限于此。该庚酮糖是，例如，景天庚酮糖和甘露庚酮糖，但不限于此。
根据本发明，该己糖胺是葡糖胺、半乳糖或甘露糖胺，且在具体的实例中，该己糖胺是葡糖胺。
根据本发明，该N-乙酰己糖胺是N-乙酰葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺或N-乙酰甘露糖胺，且在具体的实例中，该N-乙酰己糖胺是N-乙酰葡糖胺。
本发明的EG-IM比野生型LPS具有更少的糖。根据本发明，该EG-IM可包含5至7个糖。在具体的实例中，该EG-IM包含6或7个糖，但不限于此。
本发明的EG-IM不具有O-连接的脂肪酸。
本发明的EG-IM的特征在于其具有显著降低的毒性，因为脂肪酸(例如，C14脂肪酸)从脂质A中去除(脱酰)。该脂肪酸经由-C(O)O-或-C(O)NH-键与脂质A中的葡糖胺连接。在本发明中，脱酰作用意指去除经由-C(O)O-键连接的脂肪酸。
该脱酰作用可通过用碱处理LOS进行，且该碱包括NaOH、KOH、Ba(OH)2、CsOH、Sr(OH)2、Ca(OH)2、LiOH、RbOH、和Mg(OH)2，更优选为NaOH、KOH、Ba(OH)2、Ca(OH)2、LiOH和Mg(OH)2，甚至更优选为NaOH、KOH和Mg(OH)2，且最优选为NaOH。
根据本发明，本发明的EG-IM衍生自大肠杆菌，且该大肠杆菌是大肠杆菌(Escherichia coli)EG0024(登录号：KCTC 12948BP)。该菌株于2015年11月19日以保藏号KCTC 12948BP保藏在韩国生物科学和生物技术研究所的韩国典型培养物保藏中心中。
本发明的EG-IM特别适合于本发明的疫苗组合物，因为相较于常见的免疫佐剂，其表现出极好的免疫刺激作用和降低的毒性。本发明的EG-IM的毒性低于通过脂质A的磷酸化获得的MPL(单磷酰脂质A)，本发明的EG-IM通过去除LPS的多糖链以去除LPS的毒性来获得。
根据本发明的阳离子脂质体是选自下组的阳离子脂质：二甲基双二十八烷基溴化铵(DDA)、1,2-二油酰基-3-三甲胺丙烷(DOTAP)、3β-[N-(N′,N′-二甲基胺乙基)氨基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)、1,2-二油酰基氧基-3-二甲胺丙烷(DODAP)、1,2-二-O-十八烯基-3-三甲胺丙烷(DOTMA)、1,2-二肉豆蔻烯酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(14:1乙基PC)，1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(16:0-18:1乙基PC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(18:1乙基PC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(18:0乙基PC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(16:0乙基PC)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(14:0乙基PC)、1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(12:0乙基PC)、N1-[2-((1S)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基-丙基)氨基]丁基酰胺)乙基]-3,4-二[油酰基氧基]-苯甲酰胺(MVL5)、1,2-二肉豆蔻酰-3-二甲胺丙烷(14:0DAP)、1,2-二棕榈酰基-3-二甲胺丙烷(16:0DAP)、1,2-二硬脂酰基-3-二甲胺丙烷(18:0DAP)、N-(4-苄氧羰基)-N,N-二甲基-2,3-双(油酰基氧基)丙烷-1-铵(DOBAQ)、1,2-硬脂酰-3-三甲胺丙烷(18:0TAP)、1,2-二棕榈酰基-3-三甲胺丙烷(16:0TA)、1,2-二肉豆蔻酰-3-三甲胺丙烷(14:0TAP)和N4-胆甾醇基-精胺(GL67)。该阳离子脂质体可单独使用或与中性脂质组合使用，该中性脂质选自下组：1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、磷酯酰丝氨酸(PS)、磷酸乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、磷酸(PA)、和磷脂酰胆碱(PC)。在本发明的一个实施方案中，主要使用DOTAP和DMPC(DOTAP:DMPC)的组合、DDA和DOPC(DDA:DOPC)的组合物、和DDA和DMPC(DDA:DMPC)的组合。
如本文所用的，术语“免疫刺激”指诱导对抗原的初始免疫应答或增强对抗原的常规免疫应答至可测量的程度。
在本发明的另一实施方案中，脂质体EG-IM通过使含有DMPC和DOTAP的混合物的脂质混合的溶液与EG-免疫调节剂(EG-IM)溶液混合以制备含有EG-IM的脂质混合的溶液，随后再水合，然后通过添加抗原至该脂质体EG-IM制备疫苗，且，为了鉴定该疫苗的功效，通过使该脂质体EG-IM与重组寨卡病毒包膜蛋白、日本脑炎病毒(JEV)抗原、重组结核抗原(即Ag85A、ESAT-6和HspX)、非细胞百日咳疫苗(aP)抗原、和重组水痘-带状疱疹病毒(VZV)gE抗原中的每一种混合制备的疫苗施用至小鼠，测量其抗体滴度，且分析细胞因子。结果，发现每种疫苗均具有极好的抗体介导的免疫功效和/或细胞免疫功效。
因此，在另一方面中，本发明涉及疫苗组合物，该疫苗组合物包含抗原和作为活性成分的该用于增强免疫的组合物。
在另一方面中，本发明涉及用于制备该疫苗组合物的方法，且该疫苗组合物可通过下列步骤制备：
(a)制备含有由下列式1表示的免疫调节剂的溶液：
式1
其中Glc是葡萄糖，GlcN是葡糖胺，HEP是庚糖，KDO是2-酮-3-脱氧-辛酸，GlcNAc是N-乙酰葡糖胺，且A至F是磷酸盐可结合的位置；
(b)在有机溶剂中溶解脂质以制备脂质混合的溶液；
(c)使步骤(b)的脂质混合的溶液冻干以去除该有机溶剂；
(d)使在步骤(c)中获得的物质再水合，从而形成脂质体；且
(e)添加步骤(a)的溶液和抗原至步骤(d)的脂质体，随后再次冻干。
如本文所用的，术语“抗原”指诱导受体的免疫应答的物质。因此，在本发明中，可使用表现出诱导免疫应答的此类活性的任何物质而无限制。
本发明的抗原可以是肽、蛋白、核酸、糖、病原体、减毒的病原体、灭活的病原体、病毒、病毒样颗粒(VLP)、细胞或细胞片段。
在本发明中，该抗原可以是寨卡病毒的抗原、日本脑炎病毒的抗原、结核分支杆菌的抗原、百日咳的抗原、水痘-带状疱疹病毒的抗原、流感嗜血杆菌B型(HIB)的抗原、中东呼吸综合征(MERS)病毒的抗原、绿脓假单胞菌的抗原、炭疽的抗原、甲型肝炎病毒(HAV)的抗原、乙型肝炎病毒(HBV)的抗原、丙型肝炎病毒(HCV)的抗原、人免疫缺陷病毒病毒(HIV)的抗原、单纯疱疹病毒(HSV)的抗原、脑膜炎萘瑟氏菌的抗原、白喉棒状杆菌的抗原、百日咳博德特氏菌的抗原、破伤风梭菌的抗原、人乳头瘤病毒(HPV)的抗原、肠球菌的抗原、金黄色葡萄球菌的抗原、肺炎克雷伯氏菌的抗原、鲍氏不动杆菌的抗原、肠杆菌的抗原、幽门螺旋杆菌的抗原、疟疾的抗原、登革热病毒的抗原、恙虫病东方体的抗原、严重发热伴血小板减少综合征本雅病毒(SFTS本雅病毒)的抗原、重症急性呼吸综合征-冠状病毒(SARS-CoV)的抗原、流感病毒的抗原、埃博拉病毒的抗原和肺炎双球菌的抗原。本发明的一个实施方案中，本发明的免疫原性增强作用通过寨卡病毒的抗原、日本脑炎病毒的抗原、结核分支杆菌的抗原、百日咳的抗原和水痘-带状疱疹病毒的抗原鉴定。
根据本发明的水痘-带状疱疹病毒的抗原可包含选自下组的至少一种：gB(gpII)、gC(gpV)、gE(gpI)、gH(gpIII)、gI(gpIV)、gK和gL(gpVI)抗原。
根据本发明的疫苗可用于预防或治疗疾病，且该疫苗可以是灭活的疫苗、减毒的疫苗、亚单位疫苗、结合疫苗、重组疫苗、单价疫苗、多价疫苗、或混合的疫苗的形式。
此外，根据本发明的疫苗可以是寨卡疫苗、日本脑炎疫苗、结核疫苗、百日咳疫苗、水痘-带状疱疹病毒(VZV)疫苗、水痘疫苗、流感嗜血杆菌B型疫苗、MERS疫苗、绿脓假单胞菌疫苗、癌症疫苗、炭疽疫苗、HAV疫苗、HBV疫苗、HCV疫苗、HIV疫苗、脑膜炎球菌疫苗、白喉疫苗、破伤风疫苗、多药物抗性细菌疫苗、肠球菌疫苗、金黄色葡萄球菌疫苗、肺炎克雷伯氏菌疫苗、鲍氏不动杆菌疫苗、肠杆菌属疫苗、幽门螺旋杆菌疫苗、疟疾疫苗、登革热病毒疫苗、恙虫病东方体疫苗、严重发热伴血小板减少综合征本雅病毒(SFTS本雅病毒)疫苗、重症急性呼吸综合征-冠状病毒(SARS-CoV)疫苗、埃博拉病毒疫苗、流感病毒疫苗、或肺炎双球菌疫苗。
该癌症疫苗可选自下组：纤维肉瘤、膀胱癌、垂体腺瘤、胶质瘤、脑肿瘤、鼻咽癌、喉癌、胸腺瘤、间皮瘤、乳腺癌、肺癌、胃癌、食管癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌、胰腺内分泌肿瘤、胆囊癌、阴茎癌、输尿管癌、肾细胞癌、前列腺癌、非霍奇金氏淋巴瘤、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、白血病、儿科癌症、皮肤癌、卵巢癌、或宫颈癌的疫苗，但不限于此。
根据本发明的疫苗可以是简单混合物配制物或冻干的配制物。
根据本发明的疫苗可在一个容器中含有上述的抗原、由式1表示的免疫调节剂和阳离子脂质体(一体化疫苗)。基于此特征，该疫苗可制备成随时可用的形式。优选地，该水痘带状疱疹病毒疫苗，即该带状疱疹疫苗或水痘疫苗，可制备成随时可用的形式。
此外，本发明的疫苗可进一步含有本领域中可接受的脂质成分，且在本发明的一个实施方案中，制备进一步含有胆固醇、鲨烯或三癸酸甘油酯的疫苗，且鉴定其免疫原性增强作用(图19至21)。
此外，本发明的疫苗可进一步含有本领域中可接受的作为免疫佐剂的皂苷、QuilA、QS21等。在本发明的一个实施方案中，制备含有Quil A、皂苷衍生的物质的疫苗，且鉴定其免疫原性增强作用(图22)。
本发明的疫苗组合物可含有药物可接受的载剂，且可含有通常用于配制物的成分，如乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟苯甲酯、羟苯丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油，但不限于此。除上述成分外，本发明的疫苗组合物可进一步含有润滑剂、湿润剂、增甜剂、香料、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。合适的药物可接受的载剂和配制物详细描述于Remington’s Pharmaceutical Sciences(第19版，1995)。
本发明的疫苗组合物可口服或胃肠外施用。在胃肠外施用的情况中，该疫苗组合物可通过静脉内注射、皮下注射、肌内注射、腹膜内注射、经皮施用等施用。
本发明的疫苗组合物的合适剂量可基于如下因素可变地规定，如配制方法、施用方法、和患者的年龄、体重、性别、病理情况、食物、施用时间、施用途径、排泄速率和响应性。
本发明的疫苗组合物可制备成单剂量形式或可根据本发明所属领域中的普通技术人员可容易地实施的方法使用药物可接受的载剂和/或赋形剂通过配制来置入多剂量小瓶中。此时，该配制物可为溶液、混悬液或油性或水性介质中的乳液的形式，或为提取物、粉末、颗粒、片剂或胶囊的形式，且可额外地含有分散剂或稳定剂。
在下文中，将参考下列实施例更详细地描述本发明。然而，对于本领域技术人员显而易见的是，提供这些实施例仅用于说明本发明，且不应解释为限制本发明的范围。
制备实施例：制备免疫调节剂(EG-IM)
1.制备干燥的菌株细胞
在30g/L的TSB(胰酶大豆培养液，Difco)培养基中以80rpm或更低的摇动在37℃培养大肠杆菌20小时，且使用离心机收集该细胞。收集的细胞与乙醇混合，且经离心以获得沉淀物。然后将丙酮添加至所获得的沉淀物，彻底混合然后经离心以获得沉淀物。将乙醚添加至所获得的沉淀物，彻底混合然后经离心以获得沉淀物。所获得的沉淀物在干燥箱中在60℃干燥以制备干燥的细菌细胞。
2.LOS提取
在测量该干燥的细菌细胞的重量后，每1g的重量添加7.5mL的PCP(苯酚、氯仿、石油醚)提取溶液以从该细菌细胞中分离LOS。通过使用旋转蒸发仪的方法在高温从该LOS提取物中去除有机溶剂。剩下的提取物在高温经离心以获得沉淀物，且用乙醚洗涤该沉淀物。然后将纯化的水添加至此以形成沉淀物。形成的沉淀物经离心，且从上清液中分离，且用乙醇洗涤剩下的沉淀物，从而收集该沉淀物。该沉淀物在高温干燥箱中彻底干燥，且将该沉淀物溶解在纯化的水中以提取LOS。
3.去除LOS毒性
在测定该LOS提取物的含量后，将该LOS提取物的浓度调整至3mg/mL，且将该LOS提取物与0.2N NaOH以1:1的体积比混合。使反应在60℃的恒温水浴中进行120分钟，并使用涡旋混合器每10分钟搅拌5秒。然后，将1N乙酸添加至此，其量为0.2N NaOH的初始量的约1/5。然后，通过乙醇沉淀获得免疫调节剂EG-IM。
4.定量且鉴定LOS和EG-IM
通过使用2-硫代巴比土酸的KDO(2-酮-3-二氧辛酸)测定法测量LOS和EG-IM的含量，测量其浓度，且通过SDS-PAGE基于大小分离LOS和EG-IM并通过银染鉴定，且示于图1中。图1A显示通过电泳和银染鉴定该提取的LOS的结果。图1B显示基于当用碱处理LOS时通过脂质A的降解提取的LOS而指示EG-IM的大小降低的结果，其中M表示标记物(参见Plus2预染标准物，Invitrogen，LC5952)，泳道1表示脱酰作用前提取的LOS，且泳道2表示EG-IM(脱酰的LOS)。
实施例1：免疫调节剂(EG-IM)的结构分析
经纯化的样品适当地用纯化的水稀释。CU18反相柱(ACQUITY BEH300 C18 1.7um2.1X 150mm)安装于该仪器(UPLC，Water)上，然后使用流动相A(50mM甲酸铵pH 4.5)和流动相B(100％乙腈)以35至95％的浓度梯度分离该样品。用质谱仪(VELOS PRO，Thermo)进行MS分析和MS/MS分析。分析具有100至3,000m/z的分子量的分子。在MS分析后，再次分析经鉴定的具有50至2,000m/z的分子量的分子。将具有2,372m/z的分子量的分子鉴定为主要成分，且通过分析每个峰获得的结构示意图示于图2中。
制备实施例2：制备含有EG-IM的脂质体(脂质体EG-IM)
1.制备EG-IM溶液和MPL溶液
(1)制备0.3％(v/v)含有EG-IM的三乙胺溶液
制备0.3％(v/v)含有1mg/mL的EG-IM三乙胺溶液并保存在-20℃。
(2)制备10％(w/v)含有EG-IM的蔗糖溶液
制备10％(w/v)含有1mg/mL的EG-IM的蔗糖溶液。
(3)制备0.3％(v/v)含有MPL的三乙胺溶液
将5mL的0.3％(v/v)三乙胺添加至含有5mg的MPL的药水瓶，剧烈涡旋并超声处理10分钟以制备均质的MPL溶液。制备的溶液以1mg/mL等分到硅酮管中并保存在-20℃。
2.制备脂质体EG-IM
(1)脂质溶解且通过与糖脂混合制备样品
使用正丁醇作为溶剂制备1mg/mL DMPC或DOTAP溶液并涡旋混合。1mL的制备的DMPC溶液和1mL的DOTAP溶液分配至药水瓶中已制备脂质混合的溶液，其中DMPC和DOTAP以1:1(v/v)的比例混合。
脂质混合的溶液与0.3％(v/v)含有EG-IM的三乙胺混合以制备含有6mol％、3mol％或1mol％的EG-IM的混合脂质溶液，且该脂质混合的溶液与0.3％(v/v)含有MPL的三乙胺混合以制备含有6mol％、3mol％或1mol％的MPL的脂质混合的溶液。然后，含有该脂质混合的溶液的药水瓶在-70℃的深度冰箱中预先冷冻1小时，然后使其冻干12小时或更长以制备脂质混合物块状物。
(2)通过再水合过程制备脂质体
在存在该脂质混合物块状物的情况下，将1mL的10％(w/v)蔗糖溶液添加至单纯脂质混合物药水瓶和含有EG-IM或MPL的脂质混合物药水瓶，随后涡旋混合以制备脂质体。
(3)通过使糖脂与脂质体简单地混合制备样品
将10％(w/v)含有EG-IM的蔗糖溶液与各自剂量的脂质体溶液混合以制备含有脂质体和6mol％、3mol％或1mol％的EG-IM的简单混合物的样品。
0.3％(v/v)含有MPL的三乙胺溶液与脂质体溶液混合以制备含有脂质体和6mol％、3mol％或1mol％的MPL的简单混合物的样品。
实施例2:分析脂质体EG-IM的物理特性
1.脂质体大小分析
(1)分析脂质体大小变化率
1mL的脂质溶解步骤的每种样品和1mL的通过使制备实施例2-(3)的糖脂与脂质体简单地混合获得的样品添加至比色皿，且使用动态光散射仪(Malvern仪器，ZSP nano)测量水合大小(表2)。
表2
因此，观察到当与脂质体简单地混合时，MPL的大小有增加的趋势。在另一方面，当以高含量/简单混合的方式时，EG-IM略微增加大小，但少于1μm，且含量和制备方法并不影响大小的变化。因此，脂质体EG-IM(含有EG-IM的脂质体)可制备成各种方式，如包封型或吸附型，因为制备后大小变的化率小，且还可制备成300至600nm(<1μm)的纳米大小。
(2)分析脂质体大小均质性
1mL的脂质溶解步骤的每种样品和1mL的通过使制备实施例2-(3)的糖脂与脂质体简单地混合获得的样品添加至比色皿，且使用动态光散射仪(Malvern仪器，ZSP nano)分析水合大小和分布(表3，图3和4)。图3是显示脂质增溶步骤中脂质体大小分布的图表，且图4是显示使糖脂与脂质体简单地混合的步骤中脂质体大小分布的图表。
表3
因此，发现MPL的分散性根据浓度而增加。在另一方面，无论含量如何，EG-IM的分散性保持均匀。
当糖脂在脂质溶解期间并入，形成脂质体，其中该糖脂经包封(图3)。发现，至于MPL，制备的脂质体的大小分布不是均匀的，且形成MPL自身的微粒(图3A、3C和3E)。在其他方面中，至于EG-IM，可发现制备的脂质体是均质地制备的，以因此形成单个峰(图3B、3D、和3F)。因此，发现EG-IM可均匀地制备包封的脂质体。
脂质体与糖脂的简单混合形成脂质体，其中该糖脂吸附在该脂质体的表面上(图4)。至于MPL，发现制备的脂质体的大小分布不是均匀的(表3)且形成MPL自身的微粒(图4A、4C和4E)。在其他方面中，至于EG-IM，发现该脂质体是均匀制备的以形成单个峰(图4B、4D和4F)。因此，发现EG-IM也可均匀地制备吸附的脂质体。
2.脂质体表面电荷分析
1mL的脂质溶解步骤的每种样品和1mL的通过使制备实施例2-(3)的糖脂与脂质体简单地混合获得的样品上样于比色皿中，用于测量表面电荷(zeta电位)，且使用动态光散射仪(Malvern仪器，ZSP nano)测量表面电荷(表4)。
表4
因此，至于EG-IM，无论含量如何，表面电荷以55mV保持均匀。在其他方面，至于MPL，当以6mol％的高含量混合时，表面电荷急剧下降。
实施例3：分析脂质体EG-IM机制
1.脂质体EG-IM对免疫细胞增殖和细胞毒性减轻的作用
(1)脂质体EG-IM对免疫细胞增殖的作用
小鼠巨噬细胞系(J774A.1)细胞用EG-IM(0.025、0.05、0.1、0.5或1.0μg/ml)和各种浓度的脂质体(1.25、2.5、5、25或50μg/ml作为阳离子脂质)或其混合物处理。在用试验试剂处理该细胞后24小时，该细胞用CCK-8溶液处理，且使其反应一小时。在完成该反应后，收集该细胞培养物，在450nm处测量吸光度，基于用培养溶液处理的组的100％的吸光度(阴性对照组)，计算每个测试组的细胞活力。
NP是仅用脂质体处理的组，NP+EG-IM是用EG-IM和液体脂质体的简单混合物处理的组，且NP/EG-IM是通过使脂质体和EG-IM的混合物冻干获得的配制物。
NP-A表示DDA:DOPC脂质体，NP-B表示DOTAP:DMPC脂质体，NP-C表示DOTAP:DMPC:鲨烯脂质体且NP-D表示DOTAP:DMPC:三癸酸甘油酯脂质体。
因此，发现，当EG-IM与各种浓度的阳离子脂质体混合时，免疫细胞的生长增加(图5)。
(2)脂质体EG-IM对TNF-α分泌的作用
小鼠巨噬细胞系(J774A.1)细胞用EG-IM(0.025、0.05、0.1、0.5、或1.0μg/ml)和各种浓度的脂质体(1.25、2.5、5、25或50μg/ml作为阳离子脂质)，或其混合物处理。该细胞用试验试剂处理且培养24小时，通过夹心ELISA测量细胞培养基中的TNF-α细胞因子分泌水平。
NP是仅用脂质体处理的组，NP+EG-IM是用EG-IM和液体脂质体的简单混合物处理的组，且NP/EG-IM是通过使脂质体和EG-IM的混合物冻干获得的配制物。
NP-A表示DDA:DOPC脂质体，NP-B表示DOTAP:DMPC脂质体，NP-C表示DOTAP:DMPC:鲨烯脂质体且NP-D表示a DOTAP:DMPC:三癸酸甘油酯脂质体。
因此，发现当EG-IM与各种浓度的阳离子脂质体混合时，诱导了TNF-α分泌活性(图6)。
(3)脂质体EG-IM对细胞毒性减轻的作用
通常已知阳离子脂质体导致细胞毒性。测定所制备的脂质体EG-IM是否具有通过EG-IM来减轻阳离子脂质体的细胞毒性的作用。脂质体EG-IM的细胞毒性使用成纤维细胞MRC-5细胞测量。根据胆固醇的存在或缺少和均质化方法，和免疫刺激物质(EG-IM)的存在或缺少，评估制备的脂质体(由DDA:DMPC组成的阳离子脂质体)的细胞毒性。通过不同浓度的每种物质的处理刺激MRC-5细胞，且通过MTT测定法评估细胞毒性。
A表示不含有胆固醇的脂质体，B表示含有胆固醇的脂质体，1表示使用挤压机的脂质体均质化的组，且2表示使用超声的脂质体均质化的组。
因此，发现该细胞毒性(其以DDA:DMPC浓度依赖的方式表示)通过EG-IM混合物缓解(图7)。
2.含有脂质体EG-IM的疫苗的形成机制：通过静电吸引的吸附
脂质体(LP)、重组VZV gE蛋白和EG-IM经混合且离心(4℃，100,000xg，1小时)，以测定脂质体EG-IM的形成机制是否是通过静电吸引的吸附。分离上清液(S)和沉淀物(微球，P)后，该沉淀物通过超声在与上清液相同体积的PBS中完全悬浮。对具有相同体积的样品电泳，且对其进行银染。
因此，当仅重组VZV gE蛋白进行超速离心时，该重组gE蛋白在上清液中检测到。然而，至于脂质体EG-IM疫苗(LP:gE:EG-IM混合物)，该重组gE蛋白从沉淀物中检测到(图8)。由于该脂质体和该重组gE蛋白是吸附的，所以认为在沉淀物中观察到该重组gE蛋白。
3.含有脂质体EG-IM的疫苗的免疫作用
(1)脂质体EG-IM的募集免疫细胞作用
该脂质体EG-IM经由肌肉内途径施用至6周龄雌性BALB/c小鼠，且在施用后3小时和24小时，在注射位点从肌肉组织中去除该细胞。为了表征经分离的细胞的免疫细胞，该细胞使用抗CD11b Ab(FITC)、抗CD11c Ab(FITC)、抗Ly6C Ab(PE)、抗Ly6G Ab(PE)、抗F4/80Ab(PE)、抗MHCII Ab(PE)和抗CD3Ab(PE)进行免疫组化染色，且通过流式细胞术分析。
因此，发现CD11b+免疫细胞(单核细胞、粒细胞)、DC、单核细胞、巨噬细胞和粒细胞的迁移在注射位点上通过该脂质体EG-IM增强(图9)。这指示募集免疫细胞通过该脂质体EG-IM来起始，固有免疫应答可通过该脂质体EG-IM诱导，且脂质体EG-IM的通过免疫细胞的摄取可增强。
(2)含有脂质体EG-IM的疫苗的摄取作用
该gE蛋白用荧光物质(Alexa647)标记，树突细胞(DC)用该gE蛋白处理，且可检测到荧光的DC通过流式细胞术分析。
因此，当仅使用该gE蛋白或EG-IM时，未观察到荧光DC，但当脂质体EG-IM用作佐剂系统时，可检测到荧光DC(图10)。这指示含有脂质体EG-IM的疫苗增强了DC的抗原摄取效率。
此外，该重组VZV gE蛋白用荧光物质(Alexa647)标记，然后与脂质体EG-IM混合以制备疫苗。制备的疫苗施用至小鼠大腿三角肌，且在施用后4小时和24小时，免疫细胞的表面标记荧光染色使用引流淋巴结(dLN)和肌肉组织进行，且通过流式细胞术分析。分析结果在图11中显示。图11A显示分析dLN中的荧光标记的gE蛋白特异性细胞的结果，图11B显示分析肌肉组织中荧光标记的gE蛋白特异性细胞的结果，图11C显示测量dLN中荧光标记的gE蛋白特异性单核细胞的结果，且图11D显示测量肌肉组织中荧光标记的gE蛋白特异性单核细胞的结果。
因此，当该脂质体EG-IM用作佐剂系统时，将细胞募集至dLN和肌肉组织，且相较于仅使用该重组VZV gE蛋白或EG-IM时的情况，该疫苗的通过单核细胞的摄取是经积极诱导的(图11)。
(3)含有脂质体EG-IM的疫苗的储库作用
该gE蛋白荧光物质(Alexa647)标记且与脂质体EG-IM混合以制备疫苗。在该制备的疫苗施用至小鼠大腿三角肌后20分钟和24小时，对体内荧光图像拍摄(A)且测量从该小鼠分离的淋巴结的荧光(B)。
因此，在注射位点检测到荧光长达24小时，且这也发生在仅施用gE蛋白(抗原)的情况中和施用含有脂质体EG-IM(VAC)疫苗的情况中。在每个淋巴结中分析荧光。因此，在腰部和肌腘肌中检测到相对高的强度的荧光。当仅施用该抗原时，在24小时后，该荧光强度减半，但当施用含有脂质体EG-IM的疫苗时，该荧光强度未减半(图12)。这指示含有脂质体EG-IM的疫苗增强储库作用。
实施例4.分析寨卡疫苗中脂质体EG-IM的免疫原性
使用重组寨卡病毒包膜蛋白以鉴定寨卡疫苗中脂质体EG-IM的免疫原性增强作用。重组寨卡病毒包膜糖蛋白，与作为各种免疫佐剂的明矾(氢氧化铝；Brenntag，德国)、EG-IM和脂质体EG-IM的混合物以两周的间隔两次肌肉内施用至6周龄BALB/c小鼠(SLC，日本)。关于施用量，该重组寨卡病毒包膜糖蛋白以2μg/小鼠施用，该明矾以25μg/小鼠施用，该EG-IM以0.5μg/小鼠施用，且脂质体EG-IM以25μg/小鼠施用。在最后施用后两周，麻醉小鼠，且脾脏组织经提取且分离成单个细胞。该经分离的脾脏细胞用5μg/ml的抗原刺激且培养72小时。然后，细胞培养基中分泌的IFN-γ细胞因子的水平使用ELISA试剂盒(R&D系统，Millipore)分析。
因此，相较于仅使用明矾或仅使用脂质体的测试组(图13)，使用该脂质体EG-IM的测试组增强IFN-γ分泌。因此，发现含有该脂质体EG-IM的寨卡疫苗具有极好的诱导细胞免疫的能力。
实施例5：分析日本脑炎病毒疫苗中脂质体EG-IM的免疫原性
使用日本脑炎病毒(JEV)抗原以鉴定日本脑炎病毒疫苗中脂质体EG-IM的免疫原性增强作用。灭活的JEV抗原，与作为免疫佐剂的EG-IM和脂质体EG-IM的混合物以两周的间隔两次肌肉内施用至6周龄BALB/c小鼠(SLC，日本)。关于施用量，该灭活的JEV抗原以0.5μg/小鼠施用，该EG-IM以0.5μg/小鼠施用，且该脂质体EG-IM以25μg/小鼠施用。
1.测量JEV抗原特异性抗体滴度
在最后施用后四周，麻醉小鼠，且从其中收集心脏血以制备血液样品。免疫后，使用终点稀释酶联免疫吸附测定方法以测量血清中JEV抗原特异性抗体的滴度。稀释该JEV抗原至浓度为1μg/ml，以100μl/孔包覆在96孔板上(在4℃过夜)并用300μl的1％BSA(牛血清白蛋白)封闭(室温，1小时)。封闭后，用含有0.05％吐温20的PBS洗涤三次，且免疫后获得的血清通过10倍系列稀释进行稀释且使100μl的每个稀释的血清反应(37℃，2小时)。为了鉴定该JEV抗原特异性抗体，使辣根过氧化物酶缀合的抗小鼠IgG抗体(Jackson，115-035-003)、辣根过氧化物酶缀合的抗小鼠IgG1抗体(Serotec，STAR132P)、和辣根过氧化物酶缀合的抗小鼠IgG2a抗体(Serotec，STAR133P)反应，然后向其添加TMB(四甲基联苯胺，BD Bioscience，55555214)，且用1N H2SO4终止该反应。试验结果通过测量450nm处的吸光度和测量IgG、IgG1和IgG2a抗体的滴度来获得。
因此，在使用脂质体EG-IM的测试组中，相较于仅使用EG-IM或仅使用脂质体的测试组，产生该JEV抗原特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体的水平增加(图14A)。因此，本发明的含有脂质体EG-IM的日本脑炎疫苗显示极好的免疫功效，即疫苗功效。
2.细胞因子分析
在最后施用后两周，麻醉小鼠，脾脏组织经提取并分离成单个细胞，且用1μg/ml的重组JEV糖蛋白刺激该细胞。24小时后，分泌IFN-γ细胞因子的细胞通过ELISPOTELISA(Millipore)分析。
因此，相较于仅使用脂质体的测试组，使用脂质体EG-IM的测试组增加分泌IFN-γ细胞因子的细胞的数目(图14B)。因此，该含有脂质体EG-IM的日本脑炎疫苗具有极好的诱导细胞免疫的能力。
实施例6：分析结核疫苗中脂质体EG-IM的免疫原性
作为重组结核抗原，仅使用Ag85A、ESAT-6或HspX，或这三种抗原的混合物，以鉴定结核(TB)疫苗中脂质体EG-IM的免疫原性增强作用。该重组结核抗原与作为免疫佐剂的EG-IM和脂质体EG-IM混合物以两周的间隔三次肌肉内施用至6周龄BALB/c小鼠(SLC，日本)。关于施用量，该重组结核抗原以5μg/小鼠施用，该EG-IM以0.5μg/小鼠施用，且脂质体EG-IM以250μg/小鼠施用。
1.测量TB抗原特异性抗体滴度
在最后施用后三周，麻醉小鼠，且从其中收集心脏血以制备血液样品。使用终点稀释酶联免疫吸附测定方法以测量血清中TB抗原特异性抗体的滴度。试验结果通过测量450nm处的吸光度和测量免疫后收集的血液中IgG抗体的滴度来获得。
因此，当仅使用Ag85A、ESAT-6、或HspX，或这三种抗原的混合物时，在使用脂质体EG-IM的测试组中，相较于仅使用EG-IM的测试组，产生该重组TB抗原特异性IgG抗体的水平增加(图15A)。因此，本发明的含有该脂质体EG-IM的结核疫苗表现出极好的免疫功效，即疫苗功效。
2.细胞因子分析
在最后施用后三周，麻醉小鼠，脾脏组织经提取并分离成单个细胞，且该细胞用1μg/m的重组TB gE蛋白刺激且培养24小时。然后，分泌IFN-γ细胞因子的细胞通过ELISPOTELISA(Millipore)分析。
因此，在使用Ag85A、ESAT-6、或HspX抗原的所有情况中，相较于仅使用EG-IM的测试组，使用该脂质体EG-IM的测试组增加细胞分泌IFN-γ的细胞的数目(图15B)。因此，本发明的含有该脂质体EG-IM的结核疫苗表现出诱导细胞免疫的能力。
3.分析杀菌作用
来自经免疫的小鼠的脾脏细胞与BCG感染的巨噬细胞共培养。培养后七天，该细胞经回收、裂解并置于含有Middlebrook OADC Enrichment(Difco)的Middlebrook7H11Bacto琼脂平板(Difco)上。在37℃培养4周后，对产生的细菌菌落的数目计数。
因此，发现相较于仅使用该EG-IM的测试组，使用该脂质体EG-IM的测试组具有极好的BCG杀菌作用(图15C)。
实施例7：分析百日咳疫苗中脂质体EG-IM的免疫原性
使用非细胞百日咳(aP)疫苗抗原以鉴定百日咳疫苗中脂质体EG-IM的免疫原性增强作用。该费细胞百日咳(aP)疫苗抗原和作为免疫佐剂的EG-IM、脂质体和脂质体EG-IM的混合物以两周的间隔肌肉内两次施用至6周龄BALB/c小鼠(SLC，日本)。关于施用量，该aP抗原以5μg/小鼠施用，该脂质体以25μg/小鼠施用，该EG-IM以0.5μg/小鼠施用，且该脂质体EG-IM以25μg/小鼠施用。
1.测量aP抗原特异性抗体滴度
在最后施用后两周，麻醉小鼠，且从其中收集心脏血以制备血液样品。使用终点稀释酶联免疫吸附测定方法以测量免疫后血清中aP抗原特异性抗体的滴度。试验结果通过测量450nm处的吸光度和测量免疫后收集的血液中IgG抗体的IgG抗体滴度来获得。
因此，在使用该脂质体EG-IM的测试组中，相较于仅使用该EG-IM或脂质体的测试组，产生该aP抗原特异性IgG抗体的水平增加(图16A)。因此，本发明的含有该脂质体EG-IM的百日咳疫苗表现出极好的免疫功效，即疫苗功效。
2.CD4T细胞生长测定
在最后施用后两周，麻醉小鼠，且脾脏组织经提取，用5μg的aP抗原刺激，且培养0、4、和8天。然后，CD4+T细胞的生长通过流式细胞术鉴定。
因此，发现在使用该脂质体EG-IM的测试组中，CD4+T细胞的生长效率最优于仅使用该EG-IM或脂质体的测试组中的生长效率(图16B)。
3.细胞因子分析
在最后施用后两周，麻醉小鼠，脾脏和肺组织经提取并分离成单个细胞，且该细胞用5μg/ml的aP抗原刺激并培养24小时。然后，分泌IFN-γ细胞因子的细胞通过ELISPOTELISA(Millipore)分析。白色图示显示脾脏细胞的结果，且黑色图示肺细胞结果。此外，脾脏细胞用5μg/ml的aP抗原刺激并培养72小时，且分泌的IFN-γ细胞因子的量使用夹心ELISA(R&D系统)分析。
因此，相较于仅使用EG-IM或脂质体的测试组，使用脂质体EG-IM的测试组增加了分泌IFN-γ的细胞的数目(图17A)。此外，使用该脂质体EG-IM的测试组具有极好的分泌IFN-γ和IL-17细胞因子的能力(图17B和17C)。此外，本发明的含有该脂质体EG-IM的百日咳疫苗具有极好的诱导细胞免疫的能力。
实施例8：分析水痘-带状疱疹病毒疫苗中脂质体EG-IM的免疫原性
使用重组水痘-带状疱疹疫苗(VZV)gE抗原以鉴定水痘-带状疱疹病毒疫苗中脂质体EG-IM的免疫原性增强作用。减毒的VZV皮下施用至6周龄C57BL/6小鼠(SLC，日本)以制备触发模型。4周后，通过使该重组VZV gE抗原与作为免疫佐剂的明矾、EG-IM和脂质体EG-IM混合制备的水痘-带状疱疹病毒(VZV)疫苗以两周的间隔肌肉内两次施用至6周龄BALB/c小鼠(Koatec，Korea)。关于施用量，该重组VZV gE抗原以5μg/小鼠施用，该EG-IM以2或3μg/小鼠施用，且该脂质体EG-IM以50μg/小鼠施用。作为对照组，使Zostavax(默克，美国)(一种可商购的疫苗)稀释至人剂量的1/10且施用至该小鼠一次。此外，在该脂质体(其是脂质体EG-IM的成分)的组合物比例改变为DOTAP:DMPC＝1:1或DOTAP:DMPC＝1:2的条件下进行该比较。
1.细胞因子分析
在最后施用后四周，麻醉小鼠，脾脏组织经提取并分离成单个细胞，且该细胞用1,000PFU/mL的Zostavax(减毒的病毒)或4μg/ml的gE肽混合物刺激并培养72小时。然后，细胞培养物中IFN-γ细胞因子分泌的量使用ELISA试剂盒(R&D系统)分析。此外，脾脏细胞用1,000PFU/mL的Zostavax(减毒的病毒)或4μg/ml的a gE肽混合物刺激。24小时后，分泌IFN-γ细胞因子的细胞通过ELISPOT ELISA(Millipore)分析。
因此，相较于仅使用EG-IM的测试组，使用该脂质体EG-IM的测试组增加了IFN-γ的分泌，且相较于Zostavax(默克，美国)(一种可商购的疫苗)，使用该脂质体EG-IM的测试组增加了IFN-γ的分泌(图18)。因此，本发明的含有该脂质体EG-IM的水痘-带状疱疹病毒疫苗具有极好的诱导细胞免疫的能力。
2.通过添加脂质组合物分析协同作用
使胆固醇(chol)、鲨烯和三癸酸甘油酯进一步混合，其作为脂质成分添加至该脂质体EG-IM的组合物，以鉴定协同作用是否发生。每种该疫苗以2周的间隔两次肌肉内注射，在最后施用后2周或4周，麻醉小鼠，且脾脏组织经提取，用10μg/ml的重组VZV gE刺激，且培养72小时。然后，细胞培养物中分泌的IFN-γ细胞因子的量通过ELISA试剂盒(R&D系统)分析。此外，脾脏细胞用4μg/ml的gE肽混合物刺激并培养24小时。然后，分泌IFN-γ细胞因子的细胞使用ELISPOT试剂盒(Millipore)分析。
因此，在脂质体EG-IM中IFN-γ分泌增强，该脂质体EG-IM进一步含有胆固醇(图19)、鲨烯(图20)和三癸酸甘油酯(图21)。因此，发现相较于仅使用该脂质体EG-IM的情况，除该脂质体EG-IM外，进一步含有胆固醇、鲨烯和三癸酸甘油酯作为额外的脂质成分的疫苗具有出众的诱导细胞免疫的能力。
3.通过添加免疫佐剂分析协同作用
当进一步添加Quil A、基于皂苷的物质作为额外的佐剂至脂质体EG-IM时，观察到是否发生协同作用。每种疫苗以2周的间隔两次肌肉内注射。在最后施用后4周，麻醉小鼠，且脾脏组织经收集并分离成单个细胞。该细胞用4μg/ml的重组VZV gE肽混合物或1,000PFU/mL的Zostavax刺激并培养24小时。然后，分泌IFN-γ细胞因子的细胞使用ELISPOT试剂盒(Millipore)分析。
结果，在脂质体EG-IM中IFN-γ分泌增强，该脂质体EG-IM进一步含有皂苷衍生的物质Quil A(图22)。因此，发现相较于仅使用EG-IM的情况，除该脂质体EG-IM外，进一步含有该皂苷衍生的物质作为额外的免疫增强剂的疫苗具有出众的诱导细胞免疫的能力。
4.分析取决于配制物的协同作用
为了测定取决于该水痘-带状疱疹病毒(VZV)疫苗的最终配制物的免疫原性的差异，对简单混合的疫苗(+)和混合且冻干的疫苗(/)进行试验。每种疫苗组合物以两周的间隔两次肌肉内施用至七周龄BALB/c小鼠(SLC，日本)。在最后施用后两周，麻醉小鼠且脾脏组织经提取并分离成单个细胞。该细胞用5μg/ml的重组VZV gE抗原刺激且培养72小时。然后，通过夹心ELISA(R&D系统，DY485；DY405)分析细胞培养溶液中分泌的IL-5和IFN-γ细胞因子的水平。
在图23中，NP-A表示DOTAP/DOPC，NP-B表示DOTAP/DMPC，NP-C表示DOTAP/DMPC/鲨烯，NP-D表示DOTAP/DMPC/三癸酸甘油酯，+表示简单混合的配制物，且/表示混合且冻干的配制物。
因此，通过使该脂质体EG-IM和该抗原冻干获得的配制物增强了IFN-γ分泌最多，但几乎不增强IL-5分泌(图23)。因此，发现，通过使该脂质体EG-IM和该抗原冻干获得的配制物具有极好的诱导Th1型细胞免疫的能力。
工业实用性
本发明克服了脂质体的物理化学不稳定性，且因此，就产生、递送和贮存而言，其是有利的，且由于提高的稳定性，作为免疫传递系统具有益处。此外，本发明含有所有的抗原、免疫调节剂和阳离子脂质体，从而相较于仅使用免疫调节剂的情况时，发挥提高的免疫增强功效。
Claims (15)
1.一种用于增强免疫的组合物，其包含：
(a)由下列式1表示的免疫调节剂：
式1
其中Glc是葡萄糖，GlcN是葡糖胺，HEP是庚糖，KDO是2-酮-3-脱氧-辛酸，GlcNAc是N-乙酰葡糖胺，且A至F是磷酸盐可结合的位置；和
(b)阳离子脂质体。
2.根据权利要求1的组合物，其中每个磷酸盐在选自下组的位置处结合：式1的AB、AC、AD、AE、AF、BC、BD、BE、BF、CD、CE、CF、DE、DF、EF、ABC、ABD、ABE、ABF、ACD、ACE、ACF、ADE、ADF、AEF、BCD、BCE、BCF、BDE、BDF、BEF、CDE、CDF、CEF、DEF、ABCD、ABCE、ABCF、ABDE、ABDF、ABEF、ACDE、ACDF、ADEF、BCDE、BCDF、BCEF、BDEF、CDEF、ABCDE、ABCEF和ABCDEF。
3.根据权利要求1的组合物，其中该阳离子脂质体是选自下组的阳离子脂质体：二甲基双二十八烷基溴化铵(DDA)、1,2-二油酰基-3-三甲胺丙烷(DOTAP)、3β-[N-(N′,N′-二甲基胺乙基)氨基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)、1,2-二油酰基氧基-3-二甲胺丙烷(DODAP)、1,2-二-O-十八烯基-3-三甲胺丙烷(DOTMA)、1,2-二肉豆蔻烯酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(14:1乙基PC)、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(16:0-18:1乙基PC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(18:1乙基PC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(18:0乙基PC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(16:0乙基PC)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(14:0乙基PC)、1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(12:0乙基PC)、N1-[2-((1S)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基-丙基)氨基]丁基酰胺)乙基]-3,4-二[油酰基氧基]-苯甲酰胺(MVL5)、1,2-二肉豆蔻酰-3-二甲胺丙烷(14:0DAP)、1,2-二棕榈酰基-3-二甲胺丙烷(16:0 DAP)、1,2-二硬脂酰基-3-二甲胺丙烷(18:0DAP)、N-(4-苄氧羰基)-N,N-二甲基-2,3-双(油酰基氧基)丙烷-1-铵(DOBAQ)、1,2-硬脂酰-3-三甲胺丙烷(18:0 TAP)、1,2-二棕榈酰基-3-三甲胺丙烷(16:0 TA)、1,2-二肉豆蔻酰-3-三甲胺丙烷(14:0 TAP)和N4-胆甾醇基-精胺(GL67)。
4.根据权利要求3的组合物，其中该阳离子脂质体进一步包含选自下组的中性脂质：1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DMPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、磷酯酰丝氨酸(PS)、磷酸乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、磷酸(PA)、和磷脂酰胆碱(PC)。
5.一种疫苗组合物，其包含：
(a)抗原；和
(b)根据权利要求1的用于增强免疫的组合物，作为活性成分。
6.根据权利要求5的疫苗组合物，其中该抗原选自下组：肽、蛋白、核酸、糖、病原体、减毒的病原体、灭活的病原体、病毒、病毒样颗粒(VLP)、细胞或细胞片段。
7.根据权利要求5的疫苗组合物，其中该抗原选自下组：寨卡病毒的抗原、日本脑炎病毒的抗原、结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的抗原、百日咳的抗原、水痘-带状疱疹病毒的抗原、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)B型(HIB)的抗原、中东呼吸综合征(MERS)病毒的抗原、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的抗原、炭疽的抗原、甲型肝炎病毒(HAV)的抗原、乙型肝炎病毒(HBV)的抗原、丙型肝炎病毒(HCV)的抗原、人免疫缺陷病毒(HIV)的抗原、单纯疱疹病毒(HSV)的抗原、脑膜炎萘瑟氏菌(Neisseriameningitides)的抗原、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)的抗原、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)的抗原、破伤风梭菌(Clostridium tetani)的抗原、人乳头瘤病毒(HPV)的抗原、肠球菌的抗原、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抗原、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的抗原、鲍氏不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)的抗原、肠杆菌(Enterobacter)的抗原、幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)的抗原、疟疾的抗原、登革热病毒的抗原、恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi)的抗原、严重发热伴血小板减少综合征本雅病毒(SFTS本雅病毒)的抗原、重症急性呼吸综合征-冠状病毒(SARS-CoV)的抗原、流感病毒的抗原、埃博拉病毒的抗原和肺炎双球菌(Diplococcus pneumonia)的抗原。
8.根据权利要求5的疫苗组合物，其中该疫苗是灭活的疫苗、减毒的疫苗、亚单位疫苗、缀合物疫苗、重组疫苗、单价疫苗、多价疫苗、或混合的疫苗。
9.根据权利要求5的疫苗组合物，其中该疫苗选自下组：寨卡疫苗、日本脑炎疫苗、结核疫苗、百日咳疫苗、水痘-带状疱疹病毒(VZV)疫苗、水痘疫苗、流感嗜血杆菌B型疫苗、MERS疫苗、绿脓假单胞菌疫苗、癌症疫苗、炭疽疫苗、HAV疫苗、HBV疫苗、HCV疫苗、HIV疫苗、脑膜炎球菌疫苗、白喉疫苗、破伤风疫苗、多药抗性细菌疫苗、肠球菌疫苗、金黄色葡萄球菌疫苗、肺炎克雷伯氏菌疫苗、鲍氏不动杆菌疫苗、肠杆菌疫苗、幽门螺旋杆菌疫苗、疟疾疫苗、登革热病毒疫苗、恙虫病东方体疫苗、严重发热伴血小板减少综合征本雅病毒(SFTS本雅病毒)疫苗、重症急性呼吸综合征-冠状病毒(SARS-CoV)疫苗、埃博拉病毒疫苗、流感病毒疫苗和肺炎双球菌疫苗。
10.根据权利要求5的疫苗组合物，其中该疫苗是冻干的配制物。
11.根据权利要求9的疫苗组合物，其中该水痘-带状疱疹病毒(VZV)疫苗是随时可用的形式。
12.根据权利要求5的疫苗组合物，其中该疫苗进一步包含胆固醇、鲨烯或三癸酸甘油酯。
13.根据权利要求5的疫苗组合物，其中该疫苗进一步包含皂苷、作为皂苷衍生物质的QuilA或QS21。
14.一种用于制备根据权利要求1的用于增强免疫的组合物的方法，该方法包括：
(a)制备含有由下列式1表示的免疫调节剂的溶液：
式1
其中Glc是葡萄糖，GlcN是葡糖胺，HEP是庚糖，KDO是2-酮-3-脱氧-辛酸，GlcNAc是N-乙酰葡糖胺，且A至F是磷酸盐可结合的位置；
(b)在有机溶剂中溶解脂质以制备脂质混合的溶液；
(c)使步骤(b)的脂质混合的溶液冻干以去除该有机溶剂；且
(d)使在步骤(c)中获得的物质再水合，然后使该物质与步骤(a)的溶液混合，由此形成用于增强免疫的组合物。
15.一种用于制备根据权利要求5的疫苗组合物的方法，该方法包括：
(a)制备含有由下列式1表示的免疫调节剂的溶液：
式1
其中Glc是葡萄糖，GlcN是葡糖胺，HEP是庚糖，KDO是2-酮-3-脱氧-辛酸，GlcNAc是N-乙酰葡糖胺，且A至F是磷酸盐可结合的位置；
(b)在有机溶剂中溶解脂质以制备脂质混合的溶液；
(c)使步骤(b)的脂质混合的溶液冻干以去除该有机溶剂；
(d)使在步骤(c)中获得的物质再水合，从而形成脂质体；且
(e)添加步骤(a)的溶液和抗原至步骤(d)的脂质体，随后再次冻干。
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